EA013911B1 - Конструкции-"шпильки" р15 и применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к генетически модифицированным вирусным последовательностям TGB-3, подходящим для индукции генного сайленсинга. В частности, доказано, что шпилечные конструкции, основанные на таких последовательностях, высокоэффективны при индукции механизма ПТГС (посттранскрипционного генного сайленсинга) и, таким образом, разрушения всей РНК2. Соответственно, когда растения трансформированы, распространение вируса в растении в значительной степени снижено или блокировано. Изобретение относится к шпилечным конструкциям, к их применению, а также к растениям, к растительным клеткам и растительным тканям, несущим эти конструкции.

Description

Настоящее изобретение относится к шпилечным конструкциям ДНК и к их применению для индукции посттранскрипционного генного сайленсинга (ПТГС) в растениях, и в наибольшей степени в растениях сахарной свеклы, с целью получения растений, проявляющих повышенную устойчивость или толерантность к вирусу, такому как вирус некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС). Кроме того, настоящее изобретение относится к трансгенным клеткам и растениям, которые проявляют повышенную устойчивость, например, к ВНПЖС, и к их потомству.

Предшествующий уровень техники

Областью глубокого интереса является придание растениям устойчивости или толерантности к вирусам. У сельскохозяйственных культур большие доли урожая могут быть потеряны вследствие вирусных инфекций.

Широко распространенное вирусное заболевание растения сахарной свеклы (Бе!а гифагЬ). названное ризоманией, вызвано фуровирусом, вирусом некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) (1, 2), который передается к корням свеклы почвенным грибом Ро1утуха Ье!ае (3).

Заболевание значительно поражает посевные площади районов, где выращивают сахарную свеклу для промышленного применения, в Европе, США и Японии, и все еще распространено в некоторых областях Западной Европы (4, 5).

С 1986 года в ряде докладов и публикаций описано применение изолированных вирусных нуклеотидных последовательностей, экспрессируемых в растениях для придания высокого уровня толерантности против специфичного инфекционного вируса или даже для придания широкого спектра устойчивости против ряда родственных вирусов (6, 7, 8). Одной из наиболее широко отраженных в документах стратегий вирусной устойчивости, основанных на генной инженерии, у многих видов культурных растений, таких как картофель, тыква, огурец или томат, является применение вирусной нуклеотидной последовательности, которая под контролем регуляторных элементов растения кодирует белок оболочки вируса-мишени (9).

Тем не менее, даже при устойчивости, опосредованной белком оболочки, экспрессия определенного уровня устойчивости в трансгенном растении может быть свойственна различным механизмам, таким как косупрессия РНК или устойчивость, опосредованная белком, запускаемая продукцией белковой последовательности.

Как правило, вирусную последовательность следует трансформировать в подходящую клеточную или тканевую культуру видов растений, используя систему трансформации, опосредованной ЛдтоЬае1етшт, или методом прямого переноса генов, в соответствии с ограничениями способа культивирования тканевой культуры или клеточной культуры, который может быть успешно применен у данных видов. Нужно регенерировать целое растение и охарактеризовать экспрессию трансгена.

Хотя сахарная свекла известна как растение, с трудом поддающееся культивированию клеток, что ограничивает степень применения практической генной инженерии для этого вида, в настоящее время все возрастает количество сообщений об успешной трансформации и регенерации целых растений (38). Также опубликовано несколько примеров генно-инженерной толерантности к ВНПЖС посредством трансформации и экспрессии последовательности белков оболочки ВНПЖС в геноме сахарной свеклы (11, ΑΘ91/13159), хотя в них редко приводят данные о полностью функциональных трансгенных растениях сахарной свеклы (12). В частности, в этих сообщениях показаны ограниченные данные относительно уровня действительной устойчивости, наблюдаемой в условиях инфекции, когда трансгенные растения сахарной свеклы трансформированы геном, кодирующим последовательность белка оболочки ВНПЖС (13, 14).

Полный технологический пакет, включающий способ трансформации сахарной свеклы и применение экспрессии последовательности белка оболочки ВНПЖС в качестве источника устойчивости в трансгенном растении сахарной свеклы, полученном указанным способом трансформации, описан в патентной заявке ΑΘ91/13159.

На основании опубликованной информации невозможно сделать заключение, что механизм устойчивости, опосредованный белком оболочки, обеспечивает какие-либо возможности для придания растению сахарной свеклы общего иммунитета к инфекции ВНПЖС в результате полного ингибирования механизмов размножения и диффузии вируса. Идентификация механизма устойчивости, который значительно блокирует распространение вируса на ранней стадии инфекционного процесса, могла бы быть главным критерием успеха развития такой трансгенной устойчивости. Кроме того, такая устойчивость могла бы разнообразить существующие механизмы устойчивости.

Поскольку показано, что заболевание распространяется во многих странах или областях со скоростью, зависящей от сочетания многочисленных местных особенностей окружающей среды и агрономических особенностей, основной интерес заключается во внесении многообразия и усовершенствования в механизмы генетической устойчивости, которые могут, отдельно или в комбинации, создавать стратегию стабильной и длительно действующей устойчивости настоящих и будущих сортов растений сахарной свеклы, выращиваемых для промышленного применения.

Геном фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) состоит из пяти плюс

- 1 013911 смысловых РНК, две из которых (РНК 1 и 2) кодируют функции, существенные для инфицирования всех растений, тогда как остальные три (РНК 3, 4 и 5) вовлечены в опосредованное вектором инфицирование корней сахарной свеклы (Вс1а уи1дап8). Межклеточный перенос ВНПЖС управляется набором трех последовательных, незначительно перекрывающихся вирусных генов на РНК2, известных как тройной блок генов (ТСВ), кодирующих в следующей последовательности вирусные белки Р42, Р13 и Р15 (генные продукты обозначены по их расчетным молекулярным массам (Мг) в килодальтонах).

В последующем описании гены ТСВ и соответствующие им белки определены следующими терминами ТСВ-1, ТСВ-2, ТСВ-3, либо по номерам кодируемых ими вирусных белков Р42, Р13 и Р15. Аналоги ТСВ присутствуют в других фуровирусах, а также в потекс-, карла- и гордеивирусах (15, 18, 19, 20, 21 и 22). Во вложенной таблице 1 представлены вирусы, имеющие последовательность ТСВ-3, молекулярная масса ТСВ-3 указанных вирусов, их хозяева и ссылки.

Ранее показано, что независимая экспрессия Р15 с репликационных видов вирусной РНК, известных как репликон, имеющих происхождение от РНК3 ВНПЖС, ингибирует инфицирование ВНПЖС посредством препятствования межклеточному переносу (16).

Для введения вируса, содержащего нуклеиново-кислотную последовательность ТСВ-3, в растительную клетку или в растение, предложено включение нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей указанную нуклеиново-кислотную последовательность ТСВ-3, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в указанном растении (\УО 98/07875).

Тем не менее, хотя экспрессия вирусной последовательности ТСВ-3 дикого типа в трансгенном растении дает возможность блокирования указанной вирусной инфекции, присутствие указанной последовательности дикого типа может вызывать вредные эффекты на агрономические свойства трансформированных растений или растительных клеток. Настоящее изобретение заключается в открытии того, что некоторые мутированные (генетически модифицированные) вирусные последовательности ТСВ-3, раскрытые в настоящем изобретении, являются весьма полезными в генной инженерии растений (сахарной) свеклы, устойчивых к ВНПЖС.

Цели изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка более надежных способов и средств придания растениям устойчивости к вирусам, например устойчивости к вирусу ВНПЖС, преимущественно чрезвычайной устойчивости к ВНПЖС, более конкретно растениям сахарной свеклы, путем генетической модификации или трансформации растительных клеток.

Кроме того, целью настоящего изобретения является разработка генетически модифицированных или трансформированных растительных клеток, которые могут быть получены таким образом, что их можно регенерировать в растения, проявляющие повышенную толерантность или устойчивость к растительному вирусу, например к ВНПЖС.

Еще одной целью является разработка устойчивого потомства, например потомства, устойчивого к ВНПЖС, семян и других репродуктивных органов или структур, имеющих происхождение от таких трансформированных растений и растительных клеток.

Краткое изложение сущности изобретения

Предполагают, что в функцию последовательности ТСВ-3 дикого типа при межклеточном переносе вовлечены, по меньшей мере частично, мостиковые взаимодействия между элементом растенияхозяина (предпочтительно компонентом плазмодесмы) и элементом вирусного происхождения (предпочтительно другим вирусным белком, вовлеченным в межклеточный перенос). Разрушение либо домена последовательности ТСВ-3 дикого типа (который предположительно взаимодействует с элементом хозяина), либо домена последовательности ТСВ-3 дикого типа (который предположительно взаимодействует с вирусным элементом) дает возможность ингибирования межклеточного переноса.

Кроме того, по-видимому, указанные специфичные мутации в последовательности ТСВ-3 дикого типа дают возможность получения мутантов, продуцирующихся в трансгенном растении, которые все же будут взаимодействовать с вирусным элементом, но не с элементом хозяина. Эти мутанты могут конкурировать за сайты связывания на вирусном элементе последовательности ТСВ-3 дикого типа, продуцируемой на начальной стадии вирусной инфекции, и прерывать инфицирование посредством ингибирования перемещения вируса к соседней клетке.

Предпочтительно замену по меньшей мере одной аминокислоты другой отличающейся аминокислотой указанной последовательности осуществляют в участках, богатых гидрофильными аминокислотами, обычно присутствующих на поверхности белка в своей нативной конфигурации.

Предпочтительно точечная(ые) мутация(и) дает возможность замены одной или двух аминокислот одной или двумя отличающимися аминокислотами.

Во вложенной табл. 1 описаны предпочтительные примеры указанных вирусов, имеющих вирусную последовательность ТСВ-3 дикого типа, молекулярная масса соответствующего ТСВ-3 пептида, их хозяева и ссылка. Также уже описаны специфичные нуклеотидные и аминокислотные последовательности Р15 ВНПЖС дикого типа (17, последовательности дикого типа, включено здесь путем ссылки).

Вышеописанные точечные мутации осуществляли общепринятыми способами, известными специалистам в данной области техники.

- 2 013911

Вышеупомянутые мутанты, содержащие точечную мутацию, тестировали на их способность к стимуляции межклеточного переноса вирусного мутанта (с дисфункциональной последовательностью ТСВ3, предпочтительно мутанта ВНПЖС с дисфункциональным геном р15) при экспрессии в трансположении по отношению к репликону. Эти мутанты были неспособны к стимуляции такого переноса, и они были протестированы на их способность к ингибированию инфекции совместно инокулированным вирусом ТСВ-3 дикого типа, предпочтительно совместно инокулированным ВНПЖС дикого типа, когда мутантная форма последовательности ТСВ-3, предпочтительно гена р15, была экспрессирована с репликона.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что способ генетической модификации по изобретению (предпочтительно точечную мутацию) можно использовать для получения модифицированной вирусной последовательности ТСВ-3 (предпочтительно модифицированной последовательности р15 ВНПЖС), которая способна блокировать вирусную инфекцию, не вызывая вредных эффектов при встраивании в геном растения или растительной клетки растения. К этому относится первый аспект изобретения.

Под способностью к блокированию вирусной инфекции в растении или в растительной клетке подразумевают возможность получения высокой степени толерантности растением или растительной клеткой, трансформированной указанной модифицированной вирусной последовательностью ТСВ-3, к указанной вирусной инфекции, в частности, возможность обеспечивать быстрое и полное блокирование механизмов размножения и диффузии вируса в растении, предпочтительно блокирование механизмов размножения и диффузии вируса ВНПЖС в растении сахарной свеклы (Ве!а νιιίμαπδ). включая кормовую свеклу, листовую свеклу и столовую свеклу, которые также могут быть подвержены указанной инфекции ВНПЖС.

Указанная толерантность или устойчивость могут быть легко измерены различными способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.

Предпочтительно генетические модификации в вирусной последовательности ТСВ-3 дикого типа представляют собой точечные мутации в участках указанной вирусной последовательности дикого типа, вовлеченной в механизмы вирусного межклеточного переноса.

Настоящее изобретение также относится к модифицированным вирусным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям ТСВ-3, полученным (выделенным) указанным способом (модификация и отбор), более предпочтительно к модифицированным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям Р15 ВНПЖС, полученным (выделенным) указанным способом.

Предпочтительно указанные нуклеотидные и аминокислотные последовательности Р15 ВНПЖС выбраны из группы, состоящей из приведенных ниже нуклеотидных или соответствующих аминокислотных последовательностей:

ава ίο N0 1 .·

АТССТССТТаТСаТТОСМТАеСТТТАТСТААТЛТТСТЛТТОТЛСДТЛСТТЗСССОТТаТ б о

ΜνυννΛνΛ18ΜΧνΐ.ϊΐνΆΪ?Ο

СТТСТТСТСАЙТАТСТТСТАСТСАСССТТТТТСАОСААСОАтаТТАААССаТССАСЗСТАТ 12 0 ννν£ΜΕΥ£ΡΕΡευονΚΑ85Υ

СССЗССАССААТТГТТААССССАаСОЗСТСТАТСАТОеАСАСОААТТССТТТЙСТСААТТТ 18 0

АСА1ЕКС5аС1МСВН5РАСР

СССАЗТТСССАТАТТССАААССАТСТАСССаАСТССАТСАСТААССТТСССАССАААСАе 240

СЗСЮ1РКНУАЕ51ТК7АТКЕ

САССАТСТТСАСАТААТССТААААА'ЗС-ССС'ЗААСТОАСС'ЗТТСЗТатТС-ТЗАСТСТСАСС 3 00

ΗϋνΕΙΜνΚΚΘΕντνκννΤΙιΤ

САААСТАТТТТТАТААТАТТАТСТАаАТГаТТТССТТТОСССаТСТТТТТаТТСАТСАГА 360

ЕТ1Р11ЬЗНЬРОЬАУРЬГМ1

ТСТДТААТСТСТАТАСТТТО<ЗТТТТ<л<ЗТАТСАТА<ЗАТАА 399

ГД ОГО_ 3

АТССТССТТОТЗаТТАААОТАОАТТТАТСТААТАТТаТАТКЗТАСАТАСТТОССОСЗТТат 60

ΜνΕννΚνΏΕ8Κΐνΐ;ΥΐνΑ<30 <ЗГТОТТСЗТСАаТАТОТТСТАСТСАССОТТТТТСАаСААСОАТеТТАААССС?ГССАОСТАТ 12 0 ννν3ΗΓΥ3ΡΡΚ5ΝΓνΚΑ33Υ аССООАЗСААТТТТТААОСаСАСССЗОСТСТАТСАТССССОССААТТС&ТТТССТСААТТТ 18 0 АСА1?КС5<ЗС1 И А А N δ РАО Р

- 3 013911

ЗСбАЗТТЗСбАТАТТССАААОСАТСТАЭССеАСТССАТСАСТААбЗТТСССАССАААеАа 240

С5СР1РКНУАВе1ТКУАТКВ

САСОАтетТСАСАТААТОеТАААМСевстеААбТОАСССТТСОТСТТаТСАСТСТСАСС 3 00

ΗηνυίΜνκΒΟΕντνκνντι,τ еАААСТАТТТТтаТААТАТТАТСТАОАТТБТТТСаТТТОеСОЗтеТТТТТСТТСАТОАТА 360 ЕТ1Г11Ь0ДЬЕСЬАУЕЬРМ1

ТСТТТААТЗТСТАТАОТТТВСТТТТЗЗТЛТСАТАСАТАА 399

СЬМЗЗУИРИУНН*

ΞΕΰ П> ΝΟ 5 : АТОСТССТТатеОТТАААСТАЗАТТТАТСТААТАТТеТАТТБТАСАТАЙТТСЗССООТТаТ 6 о

МУЬУУКУ0Ь8Н1УЬУ1УАСС

ЗТтеТТЗТСАЗтаТЗТтеТАСТСАССЗТТТТТСАЗСААСЗАтеТТАААССеТССАеСТАТ 120 ννν5Μ1,Υ3ΡΕΡ0»ΏνΚΑ35Υ ЗСОССАбСААТТТТТААеЗвбАаСОбСЖЭТАТСАТОЗАСЛебААТТСОТТТеСТСААТТТ 180 Α6ΑΙΕΚ353ΒΙΜϋΚΝ5ΡΑζ5Γ БвСДЗТТеСеАТАТТССАААЗСАТЗТАЗССвАСТССАТСАСТААЗбТтеССАССАААвЛб 240 СЗСОТРКНУАЕЗ 1ТКУАТКЕ САССАтеТТеАСАТААТвЗТАААААЗСЗЗТЗААЗТСАСССТТССТЗТТаТЗАСТСТСАСС 3 00 ΗπνΒΙΜνΚΕΟΕντνΚννΤΙ,Τ

ЗАААСТАТТТТТАТААТАТТАТСТАЗАТТСТТТ06ТТТСЗАТ0АТТТТТТ0ТТСАТеАТА 3 50

ЕТ1Г11ЬВКЬ?ОЬБрРЪРМ1 ТЗТТТААТеТСтатаеТТТбЗТТТТОЗТАТСАТАСАТАА 395

СЬМ51УИРИУНЕ*

В последующем описании различные модифицированные последовательности ТСВ-3 ВНПЖС будут обозначены как мутанты р15, идентифицируемые приведенной ниже ссылкой: ΒΝΡ15-Α1α1, соответствующий 8Е0 ΙΌ ΝΟ 1; ΒΝΡ15-Α1α4, соответствующий 8ЕС ГО N0 3; ΒΝΡ15-Ακρ9, соответствующий 8Е0 ГО N0 5.

Нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности 8ЕС ГО N0 1, 8ЕС ГО N0 3 и 8Е0 ГО N0 5 можно сравнивать с 8ЕС ГО N0 7, которая представляет собой уже описанную нуклеотидную и аминокислотную последовательность (8ЕС ГО N0 8) ρ15 дикого типа (17).

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему указанную модифицированную нуклеотидную последовательность или ее фрагмент, возможно, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке. Предпочтительно указанный вектор представляет собой плазмиду, содержащую уже указанные регуляторные последовательности, активные в растении или в растительной клетке. Вектор также может представлять собой кассетную нуклеотидную последовательность, состоящую только из интересующей нуклеотидной последовательности, которую нужно встраивать в геном растения (в данном случае из модифицированной последовательности ТСВ-3 ВНПЖС или ее фрагмента), которая сцеплена с одним или более чем одним промотором, концевыми нуклеотидными последовательностями и, возможно, с регуляторной последовательностью, достаточной для получения эффективной экспрессии интересующих последовательностей, которые, кроме того, еще (по существу) свободны от других прокариотических или плазмидных нуклеотидных последовательностей (см. ЕР 1174513).

Настоящее изобретение также относится к способу индукции устойчивости к вирусу, содержащему последовательность ТСВ-3, предпочтительно к одному из вирусов, описанных во вложенной табл. 1, и более предпочтительно к вирусу ВНПЖС, где указанный способ включает следующие стадии:

получения нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей нуклеиново-кислотную последовательность, генетически модифицированную в соответствии со способом по изобретению, или содержащей фрагмент такой модифицированной последовательности, и оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке, трансформации растительной клетки этой нуклеиново-кислотной конструкцией и, возможно, регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.

- 4 013911

Предпочтительно указанный способ применяют для индукции устойчивости к ВНПЖС у растения сахарной свеклы или в клетке сахарной свеклы. Указанный способ включает следующие стадии:

получения нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей модифицированную нуклеиновокислотную последовательность, полученную способом по изобретению, или содержащей фрагмент такой модифицированной последовательности, предпочтительно получения нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей нуклеиново-кислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0 1, 8Е0 ГО N0 3 или 8Е0 ГО N0 5 или фрагмента любой из них, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении, трансформации растительной клетки сахарной свеклы этой нуклеиново-кислотной конструкцией и возможно, регенерации трансгенного растения сахарной свеклы из трансформированной растительной клетки сахарной свеклы.

Настоящее изобретение также относится к полученному (регенерированному) трансгенному растению или клетке трансгенного растения, устойчивому к инфицированию вирусом, содержащим последовательность ТСВ-3, предпочтительно одним из вирусов, описанных во вложенной табл. 1, более предпочтительно вирусом ВНПЖС, указанного растения или растительной клетки, содержащего нуклеиновокислотную конструкцию, имеющую модифицированную нуклеиново-кислотную последовательность ТОВ-3, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, способной быть активной в растении или в растительной клетке.

Предпочтительно указанная модифицированная нуклеиново-кислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0 1, 8Е0 ГО N0 3 и 8Е0 ГО N0 5, оперативно сцепленных с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке.

Предпочтительно клетка представляет собой устьичную клетку, а регуляторная последовательность включает промоторную последовательность и терминаторную последовательность, способную быть активной в растении. Указанная промоторная последовательность может быть конститутивной или может быть получена из чужеродной промоторной последовательности и предпочтительно выбрана из группы, состоящей из промотора 358 вируса мозаики цветной капусты и/или промотора полиубиквитина ЛгаЫάορκίδ Шайапа.

Преимущественно промоторная последовательность представляет собой промотор, специфичный для корня, который, в основном, способен быть активным в корневой ткани растений, в частности растений сахарной свеклы, такой как промотор раг или гена гемоглобина из Ретокроша апбеткопи.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к трансгенной растительной ткани, такой как плод, стебель, корень, клубень, семя трансгенного растения по изобретению, или к репродуктивной структуре (предпочтительно выбранной из группы, состоящей из каллюсов, почек или зародышей), полученной из трансгенного растения или из растительной клетки по изобретению.

Методики трансформации растений, тканевой культуры и регенерации, используемые в способе по изобретению, представляют собой методики, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие методики предпочтительно представляют собой методики, описанные в Международных патентных заявках \¥0 95/101778, \У0 91/13159 (соответствующей Европейской патентной публикации ЕР-В0517833), XV 0 98/07875, которые включены здесь путем ссылки. Протопласты замыкающих клеток являются предпочтительными тканями для трансформации растений сахарной свеклы.

Эти методики предпочтительно используют для получения трансгенных растений и растительных клеток сахарной свеклы по изобретению.

Среди растений сахарной свеклы, трансформированных мутированными или генетически модифицированными последовательностями ТОВ-3 (р15) по изобретению (8Е0 ГО N08 1, 3, 5), были обнаружены растения, которые четко проявляли сильную устойчивость к ВНПЖС в биологических анализах, и эти открытия были подтверждены в полевых испытаниях. Сильная устойчивость к ВНПЖС была, в частности, обнаружена среди растений, трансформированных 8Е0 ГО N0 3.

Оказывается, продукция мутированного белка р15 запускает устойчивость. Путем вестерн-блотанализа продемонстрировано, что экспрессия мутированного белка Р15 в высокоустойчивых растениях, трансформированных 8Е0 ГО N0 3, была сильно снижена, но, тем не менее, все же присутствовала, что указывает на то, что полученный механизм сайленсинга все же недостаточно эффективен, чтобы разрушить каждую мРНК Р15.

Количество Р15, продуцируемое трансгенными растениями со сверхсинтезом Р15, который не подвержен сайленсингу ПТГС, сравнивали с количеством Р15, продуцируемым устойчивыми растениями, где механизм ПТГС активен.

При более подробной молекулярной характеристике растительного материала продемонстрировано присутствие малых молекул РНК, комплементарных как смысловой, так и антисмысловой нитям последовательности ТОВ-3 (р15) ДТ (дикого типа) ВНПЖС. В целом полагают, что присутствие этих малых смысловых и антисмысловых РНК, несомненно, связано с механизмом устойчивости, индуцированным посттранскрипционным генным сайленсингом (ПТГС).

Путем нозерн-блот-анализа устойчивых растений, инфицированных вирусом ВНПЖС, было под

- 5 013911 тверждено отсутствие РНК2 ВНПЖС по сравнению с чувствительными контролями. Вследствие высокой зависимой от гомологии специфичности последовательности малых молекул РНК Р15, образующихся в устойчивых растениях, эти транскрипты активируют процесс деградации всей (целостной) РНК2.

У этих растений механизм ПТГС был сформирован без запуска посредством самой генетической конструкции, более вероятно, являясь результатом перестроек вставок.

Авторами изобретения было неожиданно сделано открытие, что шпилечные конструкции с мутированными последовательностями ТСВ-3 (р15) по изобретению или их фрагменты в смысловой и антисмысловой ориентации могут эффективно запускать ПТГС, направленный на деградацию РНК2, например, ВНПЖС. В частности, доказано, что мутированная последовательность ТСВ-3 8ЕС Ш N0 3 (возможно, дополнительно модифицированная, например, для ингибирования трансляции) и ее фрагменты или участки весьма эффективны при запуске ПТГС с высокой воспроизводимостью.

Еще один следующий аспект изобретения, таким образом, относится к этим двухцепочечным самокомплементарным молекулам РНК, к нуклеиново-кислотным конструкциям, в частности, конструкциям или нуклеотидным последовательностям ДНК, векторам или экспрессионным кассетам для их экспрессии в растительных клетках, к способам и применениям, основанным на них.

В настоящем изобретении предложена нуклеиново-кислотная конструкция, в частности конструкция ДНК, изменяющая экспрессию белка переноса ТСВ-3, где указанная нуклеиново-кислотная конструкция содержит первую последовательность ДНК, способную экспрессировать в клетке смысловой фрагмент мутированного ТСВ-3 ВНПЖС, имеющую, например, (модифицированную) 8ЕС ΙΌ N0 1, 3 или 5, либо фрагмент или участок (указанной модифицированной) 8ЕС ΙΌ N0 1, 3 или 5, и вторую последовательность ДНК, способную экспрессировать в указанной клетке антисмысловую последовательность указанного мутированного ТСВ-3 ВНПЖС, имеющую (модифицированную) 8ЕС ΙΌ N0 1, 3 или 5, либо участок или фрагмент (указанной модифицированной) 8ЕС ΙΌ N0 1, 3 или 5. Под экспрессией подразумевают прежде всего транскрипцию или образование фрагмента (м)РНК (см. следующий абзац). За транскрипцией может следовать трансляция. Кроме того, предпочтительно трансляция ингибирована (см. ниже). Под 'модифицированным' подразумевают, что исследуемая последовательность может быть дополнительно модифицирована, например, для ингибирования трансляции. Термин 8ЕС Ш N0 3, например, понимают как относящийся к 8ЕС ΙΌ N0 3 как таковой, а также к модифицированным последовательностям 8ЕС ΙΌ N0 3, таким как 8ЕС ΙΌ N0 10.

В настоящем изобретении предложена сама вирусная генетически модифицированная последовательность ТСВ-3, содержащая последовательность (модифицированной) 8ЕС Ш N0 3 или ее фрагмент, и содержащая антисмысловую последовательность указанной (модифицированной) 8ЕС Ш N0 3 или антисмысловую последовательность указанного (модифицированного) фрагмента 8ЕС ΙΌ N0 3, где вирусная последовательность ТСВ-3 при транскрипции в клетке способна к образованию двухцепочечной самокомплементарной молекулы РНК. Предложена, например, генетически модифицированная вирусная последовательность ТСВ-3, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 3 и антисмысловую последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 3; (б) нуклеотидной последовательности, включающей фрагмент 8ЕС ΙΌ N0: 3 и антисмысловую последовательность указанного фрагмента 8ЕС ΙΌ N0: 3; (в) нуклеотидной последовательности, включающей модифицированную 8ЕС ΙΌ N0: 3 и антисмысловую последовательность указанной модифицированной 8ЕС ΙΌ N0: 3; и (г) нуклеотидной последовательности, включающей фрагмент модифицированной 8ЕС ΙΌ N0:3 и антисмысловую последовательность указанного фрагмента модифицированной 8ЕС ΙΌ N0: 3, где указанная модифицированная вирусная последовательность при транскрипции в клетке способна образовывать двухцепочечную самокомплементарную молекулу РНК.

Предпочтительно смысловая и антисмысловая последовательности включены в одну единую нуклеиново-кислотную последовательность, одну единую нить или молекулу ДНК. Тем не менее, они могут присутствовать в двух или на двух различных нуклеиново-кислотных последовательностях, нитях или молекулах ДНК, которые способны к спариванию оснований и, таким образом, к образованию двухцепочечной самокомплементарной молекулы РНК.

При транскрипции генетически модифицированная вирусная последовательность ТСВ-3 по изобретению позволяет получить молекулу РНК с нуклеотидной последовательностью или нуклеиновокислотной последовательностью, содержащей

1) смысловую нуклеотидную последовательность по меньшей мере примерно из 10 последовательных нуклеотидов (нт), предпочтительно по меньшей мере примерно из 15, 20, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, или даже еще более предпочтительно примерно из 400 последовательных нуклеотидов (нт), например, последовательность (модифицированную) 8ЕС ΙΌ N0 3 или ее фрагмент, имеющую идентичность последовательности примерно 75 и примерно 100% по меньшей мере с частью последовательности р 15 ВНПЖС ДТ (8ЕС ΙΌ N0 7), и

2) антисмысловую нуклеотидную последовательность, которая является достаточно комплементарной этой смысловой нуклеотидной последовательности. Как таковая, молекула РНК, которая экспрессируется (транскрибируется и предпочтительно не транслируется), способна к образованию двухцепочечной самокомплементарной молекулы РНК при экспрессии (транскрипции) в достаточных количествах,

- 6 013911 такой как искусственная шпилечная структура РНК, с образованием стебля двухцепочечной РНК за счет спаривания оснований между участками со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностью. Под достаточными количествами подразумевают количество, которое является достаточным для индукции ПТГС, предпочтительно для индукции полного генного сайленсинга.

На самокомплементарные шпилечные конструкции по изобретению также ссылаются, как на мутированные шпилечные конструкции р 15 (ВНПЖС) (Нр15).

Предпочтительно каждая из смысловой и антисмысловой нуклеотидных последовательностей комплементарны друг другу. Желательно, чтобы между смысловым и антисмысловым фрагментом РНК в комплементарном участке было менее чем примерно 50% ошибочного спаривания оснований, более желательно менее чем примерно 30% ошибочного спаривания оснований, предпочтительно менее чем примерно 20% ошибочного спаривания оснований, более предпочтительно менее чем примерно 10% ошибочного спаривания оснований, еще более предпочтительно менее чем примерно 5, 4, 3, 2 или 1% ошибочного спаривания оснований.

Предпочтительно общая длина смысловой нуклеотидной последовательности или последовательности ДНК составляет по меньшей мере примерно 10, 15 нт, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 20 нт, 25 нт, в частности по меньшей мере примерно 50 нт, более конкретно по меньшей мере примерно 100 нт, особенно по меньшей мере примерно 150 нт, более конкретно по меньшей мере примерно 200, 250, 300 нт, особенно по меньшей мере примерно 350 нт или примерно 400 нт.

Понятно, что, чем больше общая или полная длина смысловой нуклеотидной последовательности, тем менее строгими становятся требования к идентичности последовательности между общей или полной смысловой нуклеотидной последовательностью (в данном случае, в частности, последовательностью, соответствующей 5>ЕС Ш N0 3 или ее части) и соответствующей последовательностью в генемишени (в данном случае, например, последовательностью р15 ДТ ВНПЖС). Предпочтительно смысловая нуклеотидная последовательность должна обладать идентичностью последовательности по всей ее длине по меньшей мере примерно 75% с последовательностью р15 ВНПЖС ДТ или ее частью, в частности по меньшей мере примерно 80%, более конкретно по меньшей мере примерно 85%, особенно примерно 90%, особенно примерно 95%, особенно примерно 99% или даже более чем 99% (даже предпочтительно менее чем 100%). Предпочтительная мутированная последовательность ТСВ-3, р15-а1а4 (5>ЕС Ш N0 3), имеет три мутированных основания по сравнению с ДТ р15, что соответствует 99,24% гомологии или идентичности последовательностей. Другая предпочтительная последовательность по изобретению, 5>ЕО Ш N0 10, имеет пять мутированных оснований по сравнению с ДТ р15, что соответствует 98,74% гомологии или идентичности последовательностей (см. фиг. 8).

Тем не менее, предпочтительно, чтобы смысловая нуклеотидная последовательность всегда включала последовательность примерно из 10 последовательных нуклеотидов, в частности, примерно из 20 нт, более конкретно примерно из 50 нт, особенно примерно из 100 нт, особенно примерно из 150 нт со 100% идентичностью последовательности с соответствующей частью нуклеиновой кислоты-мишени (в данном случае, последовательности р15 ВНПЖС ДТ). Предпочтительно для расчета идентичности последовательности и дизайна соответствующей смысловой нуклеотидной последовательности число пробелов должно быть минимизировано, в частности, для более коротких смысловых нуклеотидных последовательностей.

Предпочтительно модифицированная смысловая последовательность ТСВ-3 содержит по меньшей мере следующие модификации по сравнению с последовательностью р15 ДТ (дикого типа): ген ДТр15 мутирован в положении 3 нуклеиновой кислоты, в котором С заменен на С, другая специфичная замена включает мутацию положения 158 нуклеиновой кислоты, в котором А заменен на С, дополнительные специфичные замены направлены на мутации в положениях 160 и 161, в которых пара АС заменена на СС, с добавлением дополнительной мутации в положении 397, в котором Т заменен на С (8ЕС Ш N0 10, см. также фиг. 8). Такая модификация в положении 3 ингибирует инициацию трансляции, а модификация в положении 397 разрушает стоп-сигнал трансляции. Другой предпочтительной модифицированной смысловой последовательностью ТСВ-3 по изобретению является 5>ЕС Ш N0 3, которая содержит следующие модификации по сравнению с геном р15 ДТ: мутацию в положении 158 нуклеиновой кислоты, где А заменен на С, а также другие специфичные замены, направленные на мутации в положениях 160 и 161, где пара АС заменена на СС.

Длина антисмысловой нуклеотидной последовательности в значительной степени определена длиной смысловой нуклеотидной последовательности и предпочтительно должна соответствовать длине последней последовательности. Тем не менее, можно использовать антисмысловую последовательность, которая отличается от смысловой нуклеотидной последовательности по длине примерно на 10-50%, более предпочтительно примерно на 10-15%.

Аналогично, нуклеотидная последовательность антисмыслового участка в значительной степени определена нуклеотидной последовательностью смыслового участка и предпочтительно идентична комплементу нуклеотидной последовательности смыслового участка. В частности, при более длинных антисмысловых участках, однако, возможно использование антисмысловых последовательностей с меньшей идентичностью последовательности комплементу смысловой нуклеотидной последовательности, пред

- 7 013911 почтительно по меньшей мере примерно с 75% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере примерно с 80%, особенно по меньшей мере примерно с 85%, более конкретно по меньшей мере примерно с 90% идентичностью последовательности, особенно по меньшей мере примерно с 95% идентичностью последовательности комплементу смысловой нуклеотидной последовательности.

Тем не менее, предпочтительно, чтобы антисмысловая нуклеотидная последовательность всегда включала последовательность примерно из 10, примерно из 15 последовательных нуклеотидов (нт), предпочтительно примерно из 20 нт, более предпочтительно примерно из 50 нт, особенно примерно из 100 нт, особенно примерно из 150 нт со 100% идентичностью последовательности комплементу соответствующей части смысловой нуклеотидной последовательности. Ясно, что длина отрезка из последовательных нуклеотидов со 100% идентичностью последовательности комплементу смысловой нуклеотидной последовательности не может быть больше, чем сама смысловая нуклеотидная последовательность. Опять же, предпочтительно, чтобы число пробелов было минимизировано, в частности, для более коротких антисмысловых последовательностей. Кроме того, также предпочтительно, чтобы антисмысловая последовательность имела между примерно 75 и 100% идентичности последовательности комплементу последовательности-мишени.

Порядок смысловой и антисмысловой нуклеотидных последовательностей в нуклеотидных последовательностях или конструкциях ДНК по изобретению, как полагают, не является критическим.

Предпочтительно смысловая и антисмысловая последовательности модифицированной вирусной последовательности ТОВ-3 по изобретению разделены линкерной или спейсерной нуклеотидной последовательностью, которая предпочтительно представляет собой интрон. Этот интрон предпочтительно представляет собой растительный интрон, более предпочтительно интрон (сахарной) свеклы. Предпочтительно используют интрон высоко транскрибируемых генов, более предпочтительно интрон высокотранскрибируемых генов сахарной свеклы. Предпочтительно высокотранскрибируемые гены представляют собой гены рибосомной РНК (24, 25).

Предпочтительно смысловой фрагмент ТОВ-3 в генетически модифицированной последовательности ТОВ-3 по изобретению включает (модифицированные) 8ЕО ΙΌ N0 1, 3 или 5, либо их участки или фрагменты. Например, генетически модифицированная вирусная последовательность ТОВ-3 по изобретению может включать по меньшей мере от нт 100 до нт 399, нт 150 до нт 399 или нт 163 до нт 399 (модифицированных) 8ЕО ΙΌ N0 1, 3 или 5 .

Наиболее предпочтительно смысловой фрагмент ТОВ-3 в генетически модифицированной последовательности ТОВ-3 по изобретению включает (модифицированную) 8Е0 ΙΌ N0 3 или ее участки или фрагменты. Например, генетически модифицированная вирусная последовательность ТОВ-3 по изобретению может включать по меньшей мере от нт 100 до нт 399, от нт 150 до нт 399 или от нт 163 до нт 399 (модифицированной) 8Е0 ΙΌ N0 3. Еще более предпочтительно смысловой фрагмент ТОВ-3 в конструкции ДНК по изобретению состоит из (модифицированной) 8Е0 ΙΌ N0 3 или ее участков (фрагментов), например, он может состоять по меньшей мере из нт 100 - нт 399, нт 150 - нт 399 или нт 163 - нт 399 (модифицированной) 8Е0 ΙΌ N0 3.

Преимущественно смысловой фрагмент ТОВ-3 в генетически модифицированной последовательности ТОВ-3 по изобретению дополнительно мутируют таким образом, чтобы он содержал по меньшей мере один стоп-кодон трансляции, с целью ингибирования трансляции. Преимущественно стоп-кодон(ы) указанного смыслового фрагмента ТОВ-3 в генетически модифицированной последовательности ТОВ-3 по изобретению разрушены. Стартовый кодон трансляции также может быть модифицирован, чтобы ингибировать инициацию трансляции. Например, стартовый кодон АТО 8Е0 ΙΌ N0 3 модифицирован до АТС, а стоп-кодон ТАА модифицирован до САА (см. фиг. 8). Эта конкретная последовательность названа модифицированной 8Е0 ΙΌ N0 3. Специалисты в данной области техники могут обдумать множество других возможностей.

Предпочтительными конструкциями по изобретению являются конструкции или нуклеотидные последовательности ДНК, где смысловой фрагмент ТОВ-3 в генетически модифицированной вирусной последовательности ТОВ-3 по изобретению содержит 8Е0 ΙΌ N0 10. Еще более предпочтительны конструкции ДНК, где смысловой фрагмент ТОВ-3 в генетически модифицированной вирусной последовательности ТОВ-3 по изобретению состоит из 8Е0 ΙΌ N0 10.

Предпочтительные генетически модифицированные последовательности ТОВ-3 по изобретению содержат 8Е0 ΙΌ N0 9 или 13. Еще более предпочтительны генетически модифицированные последовательности ТОВ-3, которые состоят из 8Е0 ΙΌ N0 9 или 13.

Преимущественно генетически модифицированная вирусная последовательность ТОВ-3 по изобретению оперативно сцеплена с промотором, предпочтительно с гетерологичным промотором, который активен в корнях. Предпочтительными промоторными последовательностями, активными в корневой ткани растений, являются промотор раг и промотор гена гемоглобина из Ретокроша апбеткопл. Наиболее предпочтительны специфичные промоторы для корней свеклы, которые активны в корнях растения свеклы. Возможно, участок ДНК, вовлеченный в терминацию транскрипции и/или в полиаденилирование, или другие регуляторные последовательности (например, последовательности, усиливающие транскрип

- 8 013911 цию), могут быть оперативно сцеплены с конструкцией ДНК по изобретению.

Далее само изобретение относится к вектору, в частности к экспрессионному вектору или экспрессионной кассете, содержащим генетически модифицированную последовательность ТСВ-3 по изобретению, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью.

Настоящее изобретение далее относится к двухцепочечной самокомплементарной молекуле РНК, экспрессируемой генетически модифицированной последовательностью ТСВ-3 по изобретению, либо вектором или экспрессионной кассетой по изобретению.

Другой аспект изобретения относится к клетке-хозяину, трансформированной генетически модифицированной последовательностью ТСВ-3 по изобретению и/или вектором по изобретению и/или молекулой РНК по изобретению. Клетка-хозяин предпочтительно представляет собой растительную клетку, более предпочтительно клетку свеклы и наиболее предпочтительно клетку сахарной свеклы.

Настоящее изобретение далее относится к трансформированному растению, предпочтительно к трансформированному растению свеклы, наиболее предпочтительно к трансформированному растению сахарной свеклы, содержащему в своем геноме конструкцию ДНК и/или вектор по изобретению, и/или содержащему в своих клетках молекулу РНК по изобретению.

Предпочтительно конструкцию ДНК, содержащую генетически модифицированную вирусную последовательность ТСВ-3 по изобретению и/или вектор, содержащий эту последовательность, используют для трансформации растительного материала, такого как растительные клетки и/или растительные ткани. Предпочтительно модифицированная последовательность ТСВ-3 по изобретению стабильно интегрирована в геном (растительной) клетки. Альтернативно она может присутствовать в эписомной форме.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к трансформированным или генетически модифицированным растительным клеткам, содержащим такую конструкцию ДНК и/или вектор и/или молекулу РНК по изобретению. Возможно также использовать молекулы РНК по изобретению сами по себе, чтобы придать устойчивость или толерантность к ВНПЖС (см. ниже).

Другой аспект настоящего изобретения относится к трансгенному растению, предпочтительно к растению сахарной свеклы, регенерированному из клетки-хозяина, предпочтительно из растительной клетки, трансформированной такой конструкцией ДНК, вектором и/или молекулой РНК по изобретению и проявляющей измененную экспрессию белка переноса ТСВ-3. Предпочтительно экспрессия молекулы (ВНПЖС) ТСВ-3 (р15) сильно снижена по сравнению с контролем (не трансформированным или не трансформированным шпилечной конструкцией р 15 по изобретению).

Здесь приведен пример для (сильно) сниженной экспрессии р15 ВНПЖС. Экспрессия р15 ВНПЖС в присутствии шпилечной молекулы РНК р15 по изобретению, таким образом, должна быть ниже, чем экспрессия в ее отсутствие, предпочтительно составляя только примерно 25%, в частности, только примерно 10%, более конкретно составляя только примерно 5% экспрессии в отсутствие шпилечной молекулы РНК р15 по изобретению или в отсутствие генетически модифицированной вирусной последовательности ТСВ-3, кодирующей эту молекулу.

Преимущественно экспрессия р15 ВНПЖС снижена до такого уровня, что она более не обнаружима. Присутствие белка Р15 может быть обнаружено с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против Р15. Альтернативно уровни этого белка могут быть определены с помощью массспектрометрии, что хорошо известно в данной области техники. Наиболее предпочтительно, чтобы белок Р15 или белковые фрагменты вообще не продуцировались, что означает, что все его мРНК разрушены или по меньшей мере инактивированы. Преимущественно экспрессия гена р15 ДТ с вируса подавлена в растительных клетках и в растениях, трансформированных посредством способов или средств по изобретению.

Преимущественно репликация вируса отсутствует в растении или в растительной клетке, трансформированной генетически модифицированной вирусной последовательностью ТСВ-3, конструкцией ДНК, вектором или молекулой РНК по изобретению.

Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к потомству трансформированных растений по изобретению, которое содержит в геноме по меньшей мере части своих клеток генетически модифицированную вирусную последовательность ТСВ-3 и/или вектор по изобретению, и/или которое содержит, по меньшей мере, в части своих клеток молекулу РНК по изобретению. Предпочтительно этот материал (модифицированная вирусная последовательность, вектор и/или молекула РНК) присутствует, по существу во всех клетках растения. Преимущественно потомство трансформированного растения по изобретению проявляет измененную экспрессию белка переноса ТСВ-3 (ВНПЖС). Такая же стратегия может быть применена к каждому вирусу, перечисленному в табл. 1, тем не менее, последовательность р15, описанная здесь, направлена только на вирус ВНПЖС. Примеры потомства представляют собой такие растительные ткани, как плод, стебель, корень, клубень и семя.

Еще один другой аспект изобретения относится к семенам трансформированного растения, предпочтительно трансформированного растения сахарной свеклы по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к (вегетативно) репродуктивным структурам, таким как каллюсы, почки, зародыши, происходящие от трансформированного растения по изобретению.

Преимущественно это потомство, семена, репродуктивные структуры и т.д. содержат в геноме, по

- 9 013911 меньшей мере, части своих клеток, предпочтительно, по существу, во всех клетках, генетически модифицированную вирусную последовательность ТОВ-3 и/или вектор по изобретению и/или молекулу РНК по изобретению. Преимущественно эти растительные материалы могут быть регенерированы до растений или растительных материалов, устойчивых к ВНПЖС.

Еще один другой аспект изобретения относится к применению таких семян или вегетативно репродуктивных структур для регенерации из них растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, устойчивое, например, к ВНПЖС, и/или проявляющее значительно повышенную толерантность к ВНПЖС.

Еще один другой аспект изобретения относится к способу изменения экспрессии целостной РНК2, и более конкретно белка переноса ТОВ-3 (ВНПЖС), в растении или растительной клетке, включающему стадии:

введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности ТОВ-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, изменяет экспрессию целостной РНК2, и более конкретно белка переноса ТОВ-3 (ВНПЖС) в указанном растении или растительной клетке, и преимущественно экспрессию любого другого вирусного белка, локализованного на той же РНК в указанном растении или в указанной клетке.

Еще один другой аспект изобретения относится к способу индукции посттранскрипционного генного сайленсинга целостной РНК2, и более конкретно белка переноса ТОВ-3 (ВНПЖС) в растении или в растительной клетке, включающему стадию введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности ТОВ-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, запускает механизм посттранскрипционного генного сайленсинга.

С помощью способа по изобретению, представленного в предыдущих абзацах, целостная РНК2 преимущественно разрушается.

Еще один другой аспект изобретения относится к способу придания растению или растительной клетке устойчивости или большей толерантности к вирусам растений, перечисленным в табл.1, например к ВНПЖС, включающему стадию введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности ТОВ-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, ответственна за устойчивость и/или повышенную толерантность указанного растения к вирусу растений, например, к ВНПЖС.

Еще один другой аспект изобретения относится к способу индукции чрезвычайной устойчивости (высоких уровней иммунитета) в растении или в растительной клетке, включающему стадию введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности ТОВ-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, способна индуцировать чрезвычайную устойчивость (высокие уровни иммунитета) в растениях, содержащих конструкцию ДНК и/или вектор по изобретению по меньшей мере в части, предпочтительно, по существу, во всех своих клетках.

Еще один другой аспект изобретения относится к способу (значительного) уменьшения или блокирования распространения вируса [предпочтительно одного из описанных в табл. 1, такого как ВНПЖС] в растении, включающему стадию введения в клетки растения, которое предпочтительно представляет собой растение сахарной свеклы, генетически модифицированной вирусной последовательности ТОВ-3 (конструкции ДНК) и/или вектора, содержащего эту последовательность, по изобретению с получением трансформированной растительной клетки, где экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, способной к образованию двухцепочечной молекулы РНК, способна уменьшать или блокировать распространение вируса в трансформированном таким образом растении или в растительной клетке. Распространение вируса может быть уменьшено/блокировано путем уменьшения/блокирования размножения вируса (во всех или в некоторых типах клеток), переноса вируса по растению (например, путем блокирования дистанционного переноса или межклеточного переноса), или путем ограничения распространения вируса только определенными тканями (например, сосудистой паренхимой и клетками, не относящимися к флоэме). Преимущественно распространение вируса уменьшено/блокировано до такой степени, что в корнях растений,

- 10 013911 трансформированных шпилечной конструкцией р15 по изобретению, измерено значение ΟΩ._ΐ05 (см. пример 7) 0,2 или менее. Более предпочтительно это значение максимально составляет 0,1. Наиболее предпочтительно это значение ΟΌ₄₀₅ максимально составляет 0,05, максимально 0,01 или даже близко к нулю (уровни ниже предела обнаружения).

Альтернативно молекула РНК по изобретению может быть введена в растительные клетки с целью изменения экспрессии белка переноса ТСВ-3 ВНПЖС, индуцирующего посттранскрипционный генный сайленсинг белка переноса ТСВ-3, придавая растению или растительной клетке устойчивость или большую толерантность к ВНПЖС, с целью индукции чрезвычайной устойчивости у растения или растительной клетки, либо с целью блокирования или уменьшения распространения вируса в растении.

Способ по изобретению может дополнительно включать стадию регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.

Способы по изобретению включают (по меньшей мере) стадию получения подходящей конструкции и трансформации растения (клетки) этой конструкцией для достижения одного из вышеописанных эффектов (см. абзац 36).

Обнаружено, что растения, трансформированные в соответствии с изобретением, преимущественно дают более высокие уровни устойчивости к ВНПЖС по сравнению с природными источниками толерантности/устойчивости к вирусу (такими как источники устойчивости, хорошо известные в области техники, Κίζοτ, Но11у или Ве!а тапйта подвид, тапйте, номер по каталогу \УВ42).

Оказывается, что трансформация растения генетически модифицированной последовательностью ТСВ-3 по изобретению, предпочтительно способной к образованию шпилечной структуры, блокирует и/или значительно уменьшает распространение вируса через корневую систему. Преимущественно таким образом можно предотвратить достижение вирусом системы дистанционного переноса. Преимущественно трансформация растения в соответствии с изобретением предотвращает и/или значительно уменьшает размножение вируса в коре. Способы по изобретению преимущественно снижают способность вируса к поддержанию инфекционного потенциала в почве.

Устойчивость патогенного происхождения по изобретению, кроме того, оказалась отличной от устойчивости, присутствующей в природных источниках. Устойчивость патогенного происхождения сама по себе может быть преимущественно объединена с природными механизмами устойчивости.

Преимущественно сочетание различных источников устойчивости (природной и патогенного происхождения) может привести к (дополнительно) повышенной стабильности сорта, устойчивого к ризомании, а также может способствовать обеспечению долгосрочной устойчивости к одному или более чем одному патотипу (по меньшей мере к одному патотипу).

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлена генетически модифицированная вирусная последовательность ТСВ-3 по изобретению (фиг. 1а и б, 8ЕО ГО ΝΟ 9) со смысловой мутированной нуклеотидной последовательностью р15 (8ЕЦ ГО ΝΟ 10, модификации по сравнению с ДТ здесь выделены жирным подчеркнутым шрифтом) и антисмысловой нуклеотидной последовательностью р15 (жирный курсив, 8ЕЦ ГО ΝΟ 12), разделенными интронной последовательностью из 91 п.о. (выделены жирным подчеркнутым шрифтом, 8ЕО ГО ΝΟ 11). Несколько нуклеотидов на фиг. 16 выделены курсивом (двойное подчеркивание). Они не принадлежат ни р15, ни интрону, но присутствуют как оставшиеся после стратегии клонирования, окружая сайты рестрикции. Конструкция, содержащая 8ЕО ГО ΝΟ 9, также названа конструкцией 2 1ιρ15.

На фиг. 2 представлена генетически модифицированная вирусная последовательность ТСВ-3 по изобретению (фиг. 2а и б, 8ЕО ГО ΝΟ 13) со смысловой мутантной нуклеотидной последовательностью р15 и антисмысловой нуклеотидной последовательностью р15 (жирный курсив), разделенными интронной последовательностью, состоящей из 550 п.о. (жирный подчеркнутый шрифт, 8ЕО ГО ΝΟ 14). Несколько нуклеотидов на фиг. 26 выделены курсивом (двойное подчеркивание). Они не принадлежат ни р15, ни интрону, но присутствуют как оставшиеся после стратегии клонирования, окружая сайты рестрикции. Смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности р15 представляют собой такие же последовательности, как те, которые продемонстрированы на фиг. 16. Конструкция, содержащая 8ЕО ГО ΝΟ 13, также названа конструкцией 3 1ιρ15.

На фиг. 3 представлена последовательность р15 ДТ (8ЕЦ ГО ΝΟ 7 и 8).

Фиг. 4 представляет собой схематическое изображение вектора рЕСС5 941, в который был введен ген В№15-а1а4 в смысловой и антисмысловой ориентации, разделенных интронной последовательностью гена синтазы А петунии (СН8А). Промотор СаМУ 358: промотор 358 СаМУ; ΟС83: сигнал полиаденилирования гена октопинсинтазы; МА83: сигнал полиаденилирования гена маннопинсинтазы; ВАК: ген гербицидной устойчивости Ва§!а; Кт: ген устойчивости к канамицину; КВ, ЬВ: левая и правая границы 1-ДНК.

Фиг. 5 представляет собой схематическое изображение векторов р8140 и р8142, в которые был введен ген ВNΡ15-а1а4 в смысловой и антисмысловой ориентации, разделенных интронной последовательностью свеклы из 550 нт (фиг. 5 А, р8140, конструкция 3) и 91 нт (фиг. 5Б, р8142, конструкция 2) соответственно. Промотор СаМУ 358: промотор 358 СаМУ; ΝΟ8 3': терминатор нопалинсинтазы; Кап: ген устойчивости к канамицину; КВ, ЬВ: левая и правая границы 1-ДНК.

- 11 013911

Фиг. 6 представляет собой статистический анализ данных по ПТГС, полученных для конструкции 1 (йр15 с интроном петунии). Каждая гистограмма представляет число (Υ) и размер (-Υ) повреждений на зараженный лист.

/: отсутствие повреждений; ν: вирус 811234, 1р: буфер; йр: шпилька. По оси Υ: 1, 10, 20, 30, 100. По оси -Υ: 4. По оси X, слева направо: ν; ν + буфер мА; ν + йрСЕ; ν + йр15.

Фиг. 7 представляет собой статистический анализ данных по ПТГС, полученных для конструкций 1, 2 и 3 соответственно. Каждая гистограмма представляет количество (Υ) и размер (-Υ) повреждений на зараженный лист.

/: отсутствие повреждений; ν: вирус 811234, 1р: буфер; йр: шпилька; йр15: конструкция 1; р8140: конструкция 3; р8142: конструкция 2. По оси Υ: 1, 10, 20, 30, 40. По оси -Υ: 4. По оси X, слева направо: ν; ν + буфер МА; ν + йрСЕ; ν + йр15 (конструкция 1); ν + р8140 (конструкция 3); ν + р8142 (конструкция 2).

На фиг. 8 подчеркнуты различия в 8ЕО Ш N0 10 в сравнении с последовательностью р15 ВНПЖС ДТ, представленной 8ЕО Ш N0 7.

На фиг. 9 приведены результаты теста твердофазного иммуноферментного анализа (ЭЛАИЗА) в качестве меры присутствия вирусных частиц в корнях растений, выращенных в почве, инфицированной ВНПЖС. Вю1еЧ Κ.ζ2007-001Λ. ТНРВ: трансформация, индуцированная полиэтиленгликолем (ПЭГ).

На фиг. 10 приведены результаты теста ЭЛАИЗА в качестве меры присутствия вирусных частиц в корнях растений, выращенных в почве, инфицированной ВНПЖС. Вю1е81 Βζ2007-002Λ. ТНРВ: трансформация, индуцированная ПЭГ. АдНР: трансформация Лдгойас1ег1ит.

На фиг. 11 представлен вектор р8138, использованный в экспериментах по прямой индуцированной ПЭГ трансформации гена.

На фиг. 12 представлен вектор р8143, использованный для трансформации, опосредованной ЛдгоЬаСсгшт.

Подробное описание изобретения

В предпочтительном воплощении изобретения смысловая и антисмысловая модифицированная нуклеотидная последовательность ТСВ-3 включены в одну молекулу, что означает, что смысловой мутированный фрагмент РНК ТСВ-3 и антисмысловой мутированный фрагмент РНК ТСВ-3 включены в одну единую молекулу РНК. Преимущественно молекула РНК по изобретению способна к такой укладке, что указанные фрагменты РНК, включенные в нее, образуют двухцепочечную шпилечную молекулу РНК.

Используемый здесь термин шпилечная РНК относится к двухцепочечной молекуле РНК, способной к самоотжигу. В самом простом виде шпилечная РНК состоит из двухцепочечного стебля, образованного отожженными нитями РНК, соединенными петлей одноцепочечной РНК, и ее также называют РНК в форме ручки сковородки. Тем не менее, в термин шпилечная РНК также следует включать более сложные вторичные структуры РНК, содержащие двухцепочечные последовательности РНК, способные к самоотжигу, а также внутренние выпячивания и петли. Конкретная адаптированная вторичная структура определяется свободной энергией молекулы РНК и может быть предсказана для различных ситуаций с использованием подходящего программного обеспечения, такого Ε0ΤΌΚΝΛ (23).

Альтернативно смысловая и антисмысловая модифицированные нуклеотидные последовательности ТСВ-3 могут присутствовать в двух или на двух отдельных молекулах или нуклеотидных последовательностях, которые могут быть введены в растительную клетку или предоставлены растительной клетке одновременно и/или последовательно, предпочтительно при не слишком большом промежутке времени между предоставлением первой и второй нуклеотидной последовательности, так что при транскрипции может образоваться двухцепочечная молекула РНК в результате спаривания оснований.

Предпочтительно последовательности ДНК по изобретению стабильно интегрированы в геном растительной клетки, трансформированной генетически модифицированными вирусными последовательностями ТСВ-3 по изобретению и/или вектором, содержащим их.

Альтернативно трансген, содержащий генетически модифицированную вирусную последовательность ТСВ-3 по настоящему изобретению, может быть локализован на эписоме или самореплицирующемся векторе. Примерами самореплицирующихся векторов являются вирусы, в частности геминивирусы.

Генетически модифицированная вирусная последовательность ТСВ-3 по настоящему изобретению также может быть трансформирована непосредственно в пластидный геном. Методика пластидной трансформации подробно описана в патентах США №№ 5451513, 5545817 и 5545818, в заявке РСТ № \У0 95/16783 и в МсВпйе е! а1. (1994) Ргос.№111. Лсаб. 8с1. И8Л 91: 73 01-73 05, которые включены здесь путем ссылки. Основная методика трансформации хлоропластов включает введение областей клонированной пластидной ДНК, фланкирующих селективный маркер вместе с интересующей нуклеотидной последовательностью в подходящую ткань-мишень, с использованием, например биолистики или трансформации протопластов (например, трансформации, опосредованной хлоридом кальция или полиэтиленгликолем (ПЭГ)). Фланкирующие области размером 1-1,5 кб способствуют гомологичной рекомбинации с пластидным геномом, и, таким образом, дают возможность для замещения или модификации специфичных областей пластома (генома хлоропласта).

- 12 013911

Способы трансформации и регенерации растений хорошо известны в данной области техники. Например, Т1-плазмидные векторы использованы как для доставки чужеродной ДНК, так и для прямого захвата ДНК, липосом, электропорации, микроинъекции и микрочастиц. Кроме того, для трансформации растительных клеток могут быть использованы бактерии рода АдгоЬас!епит.

Различные векторы для трансформации, доступные для трансформации растений, известны специалистам в данной области техники, и ДНК или нуклеотидные конструкции по данному изобретению (содержащие генетически модифицированную вирусную последовательность ТСВ-3) могут быть использованы в сочетании с любыми такими векторами. Выбор вектора зависит от предпочтительной методики трансформации.

Селективные маркеры, обычно используемые при трансформации, включают ген пр111. придающий устойчивость к канамицину и родственным антибиотикам (Меккшд & У1егга. Сепе 19: 259-268 (1982); Веуап е! а1., Ыа!иге '304: 184-187 (1983)), ген Ьаг, придающий устойчивость к гербициду фосфинотрицину (АУ1Ше е! а1., Иис1.Ас1бк Век 18: 1062 (1990), 8репсег е! а1. ТЬеог. Арр1. Сепе! 79: 625-631 (1990) ), ген ЬрЬ, придающий устойчивость к антибиотику гигромицину (В1осЫпдег & О1дде1тапп, Мо1 Се11 Вю1 4: 29292931), ген бЫг, придающий устойчивость к метотрексату (Воигошк е! а1. , ЕМВО 1. 2 (7) : 1099-1104 (1983)), ген ЕР8Р3, придающий устойчивость к глифосату (патенты США №№ 4940935 и 5188642), ген аас(6'), кодирующий устойчивость к гентамицину (АУО 94/01560), или гены ра! и 1т1, хорошо известные в данной области техники.

Множество векторов доступно для трансформации или генетической модификации растительных клеток с использованием АдгоЬас!епит !ите£ааепк. Эти векторы типично несут по меньшей мере одну пограничную последовательность Т-ДНК и включают векторы, такие как рВГЫ19 (Веуап, Ыис1. АсИк Век. (1984)). Типичные векторы, подходящие для трансформации с помощью АдгоЬас!егшт, включают бинарные векторы рС1В200 и рС1В2001, а также бинарный вектор рС1В10 и его производные для отбора по гигромицину (см., например, патент США № 5639949). Преимуществом использования методик с АдгоЬас!епит !ите£ас1епк для трансформации растений является присутствие низкой копийности и минимальных перестроек по сравнению с другими методиками.

Трансформация без применения АдгоЬас!егшт !ите£ас1епк позволяет избежать необходимости в последовательностях Т-ДНК в выбранном для трансформации векторе, и, следовательно, векторы, лишенные этих последовательностей, используют в дополнение к векторам, таким как описаны выше, содержащим последовательности Т-ДНК. Методики трансформации, которые не основаны на АдгоЬас!егшт, включают трансформацию путем прямого переноса генов, бомбардировку частицами, захват протопластом (например, посредством ПЭГ и электропорации), трансформацию, опосредованную пыльцой, трансформацию, опосредованную растительными РНК вирусами, микроинъекцию, трансформацию порезанных и/или расщепленных ферментами эмбриогенных тканей и/или незрелых зародышей, трансформацию, опосредованную липосомами и т.п. Выбор вектора в значительной степени зависит от предпочтительного выбора трансформируемого вида и используемого селективного маркера. Типичные векторы, подходящие для трансформации без АдгоЬас!егшт, включают рС1В3064, р8ОС19 и р8ОС35 (см., например, патент США № 5639949, включенный здесь путем ссылки).

Компоненты экспрессионной системы могут быть модифицированы, например, для усиления экспрессии смыслового и антисмыслового фрагментов РНК.

Используемый здесь термин экспрессионная кассета означает последовательность ДНК, способную направлять экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клеткехозяине, содержащую промотор, оперативно сцепленный с интересующей нуклеотидной последовательностью, которая оперативно сцеплена с сигналами терминации транскрипции.

Экспрессионная кассета, содержащая интересующую нуклеотидную последовательность, в настоящем случае генетически модифицированная вирусная последовательность ТСВ-3 по изобретению, может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из остальных компонентов. Экспрессионная кассета также может представлять собой встречающуюся в природе последовательность, но полученную в рекомбинантной форме, полезной для гетерологичной экспрессии. Тем не менее, обычно экспрессионная кассета является гетерологичной по отношению к хозяину, то есть конкретная последовательность ДНК экспрессионной кассеты в природе не встречается в клетке-хозяине и должна быть введена в клетку-хозяина или предшественник клетки-хозяина посредством события трансформации.

Экспрессионные кассеты также могут содержать любые дополнительные последовательности, необходимые или выбранные для экспрессии (и, возможно, для трансляции) трансгена. Такие последовательности, например, включают, но не ограничены ими, терминаторы транскрипции, чужеродные последовательности для усиления экспрессии, такие как интроны, жизненно важные последовательности и последовательности, предназначенные для направления генного продукта в конкретные органеллы и клеточные компартменты. Затем эти экспрессионные кассеты могут быть легко перенесены в векторы для трансформации растений, описанные выше. Ниже представлено описание различных компонентов типичных экспрессионных кассет.

Регуляторные элементы относятся к последовательностям, вовлеченным в придание способности

- 13 013911 к экспрессии нуклеотидной последовательности. Регуляторные элементы обычно включают промотор, оперативно сцепленный с интересующей нуклеотидной последовательностью, и сигналы терминации. Они также могут включать последовательности, требующиеся для правильной трансляции интересующей нуклеотидной последовательности. В настоящем случае трансляция смысловой нуклеотидной последовательности генетически модифицированной вирусной последовательности ТСВ-3 предпочтительно ингибирована в результате модификации предсказанного стартового и/или стоп-кодона трансляции (см. ниже).

Экспрессия нуклеотидной последовательности в экспрессионной кассете может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда клетка-хозяин подвергается какому-либо конкретному внешнему стимулу. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор также может быть специфичным для конкретной ткани или органа, либо стадии развития.

Промотор, оперативно сцепленный со смысловой и/или антисмысловой нуклеотидными последовательностями по изобретению, может представлять собой нативный промотор трансформируемой клетки. Альтернативно промотор может представлять собой гетерологичный промотор, например тканеспецифичный промотор, промотор, регулируемый в процессе развития, конститутивный промотор или индуцибельный промотор. Подходящие промоторы хорошо известны специалистам в данной области техники. В настоящем изобретении предпочтительны сильные гетерологичные промоторы, которые активны в корневых тканях или первично активны в них (когда экспрессия в других тканях нежелательна).

Для использования в экспрессионных кассетах имеется множество терминаторов транскрипции. Они ответственны за терминацию транскрипции за пределами трансгена и его правильное полиаденилирование. Подходящими терминаторами транскрипции являются те, которые известны как функционирующие в растениях, и они включают терминатор СаМУ 358, !т/терминатор, терминатор нопалинсинтазы и терминатор гЬс8 Е9 гороха и тому подобное.

Обнаружены многочисленные последовательности, усиливающие экспрессию гена в пределах транскрипционной единицы, и эти последовательности можно использовать в сочетании с генетически модифицированными последовательностями ТСВ-3 по изобретению для усиления их экспрессии в трансгенных растениях. Например, показано, что различные интронные последовательности, такие как интроны гена Л4111 кукурузы, усиливают экспрессию. Кроме того, также известно, что ряд нетранслируемых лидерных последовательностей, выделенных из вирусов, усиливает экспрессию.

Предпочтительно по меньшей мере один экспрессирующийся в растении промотор оперативно сцеплен со смысловой нуклеотидной последовательностью и/или антисмысловой нуклеотидной последовательностью (см. выше). Предпочтительно смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности в генетически модифицированной последовательности ТСВ-3 по изобретению находятся под контролем одного и того же промотора(ов).

Используемый здесь термин промотор, экспрессирующийся в растениях означает последовательность ДНК, которая способна регулировать (инициировать) транскрипцию в растительной клетке. Он включает любой промотор растительного происхождения, а также любой промотор не растительного происхождения, который способен направлять транскрипцию в растительной клетке или ткани, то есть некоторые промоторы вирусного или бактериального происхождения, такие как СаМУ358, промотор почвенного вируса клевера № 4 или № 7, или промоторы генов Т-ДНК.

Ниже описаны некоторые возможности в отношении выбора промоторов и расположения, зависящие от того, включены ли генетически модифицированные смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности ТСВ-3 по изобретению в единую нуклеотидную последовательность или нить ДНК.

Смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности в генетически модифицированной вирусной последовательности ТСВ-3 по изобретению предпочтительно находятся под контролем одного единого промотора, особенно, когда обе включены в единую нуклеотидную последовательность. Тем не менее, каждая из них также может находиться под контролем разных промоторов (например, при расположении на двух разных последовательностях). Или, другими словами, смысловая последовательность ДНК может быть оперативно сцеплена с первым промотором, а антисмысловая последовательность ДНК оперативно сцеплена со вторым промотором. Первый промотор и второй промотор могут представлять собой одинаковые промоторы или могут представлять собой разные промоторы. Промотор может представлять собой дивергентно транскрибируемый или двунаправленный промотор, способный инициировать транскрипцию последовательностей ДНК с каждой стороны промотора.

Когда смысловой фрагмент РНК и антисмысловой фрагмент РНК включены в две молекулы или экспрессируются в виде двух молекул РНК (двух отдельных нитей РНК), смысловая последовательность ДНК и антисмысловая последовательность ДНК могут быть, например, оперативно сцеплены с двунаправленным промотором. Альтернативно смысловая последовательность ДНК может быть оперативно сцеплена с первым промотором, а антисмысловая последовательность ДНК оперативно сцеплена со вторым промотором. Первый промотор и второй промотор могут представлять собой одинаковые промоторы или разные промоторы.

Антисмысловая последовательность может представлять собой нить ДНК, комплементарную смы

- 14 013911 словой модифицированной последовательности ТСВ-3 в указанной молекуле ДНК (в этом случае молекула ДНК имеет две нити). В этом случае возможно, чтобы промотор был оперативно сцеплен с указанной смысловой или указанной антисмысловой последовательностью ДНК, где первый сайт сайтспецифической рекомбинации находится между указанным промотором и указанной смысловой или указанной антисмысловой последовательностью ДНК, а второй сайт сайт-специфической рекомбинации находится на 3'-конце указанной смысловой или указанной антисмысловой последовательности ДНК, где указанный первый и указанный второй сайты сайт-специфической рекомбинации способны инвертировать указанную первую или вторую последовательность ДНК между указанным первым и указанным вторым сайтом рекомбинации в присутствии сайт-специфической рекомбиназы.

В результате указанного инвертирования указанный первый промотор способен экспрессировать указанную антисмысловую (или смысловую, в зависимости от того, какая последовательность ДНК исходно была сцеплена с промотором) последовательность ДНК. Растительная клетка предпочтительно дополнительно содержит сайт-специфическую рекомбиназу, способную распознавать указанные сайты сайт-специфической рекомбинации.

Конструкция или последовательность ДНК по изобретению, помимо смысловой и антисмысловой модифицированной вирусной последовательности ТСВ-3, преимущественно дополнительно содержит линкерную или спейсерную нуклеотидную последовательность между последовательностями ДНК, кодирующими смысловой и антисмысловой фрагменты РНК.

В отсутствие такой спейсерной последовательности молекула РНК все же должна быть способна к образованию двухцепочечной РНК, в частности, если смысловая и антисмысловая нуклеотидная последовательность длиннее, чем, примерно, 10 нуклеотидов, и часть смысловой и/или антисмысловой нуклеотидной последовательности будет использована для образования петли, дающей возможность для спаривания оснований между участками со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностью и образования двухцепочечной РНК. Ожидают, что не существует ограничений длины или требований к последовательности, связанной со спейсерным участком, до той степени, чтобы параметры не препятствовали способности участков РНК со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностями к образованию двухцепочечной РНК. В предпочтительном воплощении длина спейсерного участка варьирует от 5 до примерно 1000 п.о.

В предпочтительном воплощении шпилечная РНК, образованная смысловым и антисмысловым участками, и, если пригодно, спейсерным участком, представляет собой искусственную шпилечную РНК. Под искусственной шпилечной РНК или искусственной структурой РНК стебель-петля подразумевают, что такая шпилечная РНК естественно не встречается в природе.

Предпочтительная спейсерная или линкерная нуклеотидная последовательность представляет собой интронную последовательность, предпочтительно в смысловой ориентации, усиливающую эффективность снижения экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени, р15 ВНПЖС или РНК2 ВНПЖС в контексте настоящего изобретения. Усиление эффективности может быть выражено в повышении частоты растений, где имеет место сайленсинг, или в увеличении уровня снижения экспрессии р15 или РНК2 ВНПЖС.

Предпочтительные интронные нуклеотидные последовательности имеют происхождение из генов растений, подобных предсказанным генам рибосомной РНК или высоко транскрибируемым генам растений. Такие интроны могут иметь происхождение из любого растительного гена, но предпочтительно имеют происхождение из генов двудольных растений, например из генов петунии, наиболее предпочтительно они имеют происхождение из генов (сахарной) свеклы. Возможно также использовать только участок этих (растительных) интронов, например, по меньшей мере границы, содержащие сигналы сплайсинга (см. ниже). Все эти интроны и их участки в контексте изобретения названы фрагментами интронов или интронными последовательностями.

Предпочтительная длина для таких интронных нуклеотидных последовательностей составляет от примерно 5 до примерно 1000 п.о., предпочтительно от примерно 50 до примерно 600 п.о., более предпочтительно от примерно 90 до примерно 550 п.о. Предпочтительные интронные последовательности включают 8ЕО ΙΌ N0 11 или 14 или даже более предпочтительно состоят из 8ЕО ΙΌ N0 11 или 14.

Процессинг интронов зависит от правильных последовательностей 5' и 3' границ сплайсинга, и, по меньшей мере, они должны быть сохранены в интронной последовательности. Согласованные последовательности для этих границ выведены для мРНК как растений, так и животных, но только несколько нуклеотидов известны как инвариантные.

Обнаружено, что оба интрона свеклы, описанные ниже (8Е0 ΙΌ N0 11 и 14), в высокой степени пригодны, причем более короткая последовательность функционирует несколько лучше, чем более длинная последовательность.

Молекула РНК, содержащая смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, способная к образованию, например, шпилечной структуры, которая образуется в результате транскрипции химерных генов, также может быть введена непосредственно в растительную клетку. Такие молекулы РНК могут быть получены, например, путем клонирования под контролем промотора, пригодного для распознавания ДНК-зависимой РНК полимеразой в реакции транскрипции ίη νίίΓο, такого как, но не ограниченного им, промотора, специфичного для Т7-полимеразы, участка ДНК, способного транскрибиро

- 15 013911 ваться в молекулу РНК с нуклеотидной последовательностью, содержащей смысловую нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 10 последовательных нуклеотидов, обладающую 75 и 100% идентичностью последовательности по меньшей мере с частью нуклеотидной последовательности интересующей нуклеиновой кислоты, и антисмысловую нуклеотидную последовательность, включающую по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 15, 20 нт, в частности по меньшей мере примерно 50 нт, более конкретно по меньшей мере примерно 100 нт, особенно по меньшей мере примерно 150 нт, более конкретно по меньшей мере примерно 200, 250, 300 нт, особенно по меньшей мере примерно 350 нт или примерно 400 нт, и обладающую 75 и 100% идентичностью последовательности с комплементом по меньшей мере примерно из 10 последовательных нуклеотидов смысловой нуклеотидной последовательности, посредством чего РНК способна к образованию двухцепочечной РНК в результате спаривания оснований между участками со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностью, результатом чего является, например, образование шпилечной структуры РНК;

проведения реакции транскрипции ίη νίΐΓΟ путем добавления среди прочего подходящей ДНКзависимой РНК полимеразы, а также необходимых реагентов для образования молекул РНК; и выделения молекул РНК.

Способы транскрипции ίη νίΐΓΟ, также как и другие способы получения РНК ίη νίΐΓΟ, хорошо известны специалистам в данной области техники, и доступны имеющиеся в продаже наборы. Способы прямого введения РНК в растительные клетки также доступны для специалистов в данной области техники, и включают, но не ограничены ими, электропорацию, микроинъекцию и тому подобное.

Кроме того, в изобретении также предложено растение, обладающее устойчивостью или толерантностью к ВНПЖС, содержащее в геноме, по меньшей мере, части своих клеток, предпочтительно, по существу, во всех своих клетках, генетически модифицированную вирусную последовательность ТСВ-3 по изобретению и/или вектор, содержащий эту последовательность, которые при транскрипции дают молекулу РНК, которая запускает ПТГС и посредством этого разрушение РНК2 ВНПЖС. Также предложено растение, обладающее устойчивостью или толерантностью к ВНПЖС, которое содержит, по меньшей мере, в части своих клеток, предпочтительно во всех своих клетках, молекулу РНК по изобретению для достижения вышеописанного эффекта.

Растение относится к любому растению или части растения на любой стадии развития. В этот термин также включены черенки, клеточные или тканевые культуры и семена. При использовании в связи с настоящим изобретением термин растительная ткань включает, но не ограничен ими, целые растения, клетки растений, органы растений, семена растений, протопласты, каллюс, клеточные культуры, а также любые группы растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы. Последние также относятся к (вегетативно) репродуктивным структурам, подразумевая, что они могут быть регенерированы до целого растения.

Полученное трансформированное растение, растительные ткани и растительный материал может быть применен в общепринятом скрещивании и размножении растения или в общепринятых схемах регенерации для получения большего количества трансформированных растений с такими же свойствами (устойчивости или толерантности к вирусам) или для введения конструкции ДНК по настоящему изобретению в другие сорта того же вида или родственных видов растений.

Устойчивость или толерантность к вирусам здесь означает, что устойчивая или толерантная клетка или растение невосприимчива или обладает пониженной восприимчивостью к одному или более чем одному вирусу по сравнению с чувствительной клеткой или растением. В настоящем случае рассмотрена устойчивость и предпочтительно чрезвычайная устойчивость к инфекциям ВНПЖС. Устойчивость или толерантность, например, означает, что обычные симптомы вирусной инфекции, например инфекции ВНПЖС, отсутствуют или уменьшены, либо что накопление или репликация вируса в клетке предотвращена или уменьшена, либо что перенос вируса, например, от клетки к клетке, предотвращен или уменьшен.

Настоящее изобретение относится к способам регуляции, то есть изменения и предпочтительно значительного снижения или даже полного ингибирования экспрессии гена р15 вирусной (ВНПЖС) РНК2 в клетках, предпочтительно в растительных клетках, или в растениях. ПТГС должен ингибировать экспрессию каждого гена, расположенного на РНК2.

Было обнаружено, что обычно доступные способы не обладают предсказуемостью. Способы по настоящему изобретению облегчают эти проблемы и обеспечивают воспроизводимую и более эффективную регуляцию вирусной устойчивости у растений.

Далее изобретение описано путем ссылки на приведенные ниже подробные примеры.

Эти примеры приведены только в целях иллюстрации и не предназначены для какого-либо ограничения, если не указано иное.

Принципы, продемонстрированные здесь для ВНПЖС и Р15 ВНПЖС, в равной степени применимы к вирусам, перечисленным в табл.1.

- 16 013911

Примеры

Пример 1. Характеристика трансгенных растений, устойчивых к ВНПЖС.

Были созданы три независимых трансгенных линии Ве1а νιιΐριπδ. которые экспрессировали белок В№15-А1а4 (кодируемый 8Е0 Ш N0 3). Обнаружено, что две из трех линий устойчивы к ВНПЖС.

Было обнаружено, что экспрессия белка Р15 значительно выше в чувствительной линии, чем в устойчивых линиях. Были обнаружены миРНК (малые интерферирующие РНК), но только в растениях линии, устойчивой к ВНПЖС (табл. 2).

Таким образом, устойчивость к ВНПЖС, может запускаться посредством ПГТС. Для дальнейшей проверки этой гипотезы по одному листу от каждой линии инфицировали вирусным инокулумом (81газ 1234, обеспечивающий РНК1, РНК2, РНК3 и РНК4). На листьях устойчивых растений, инфицированных таким образом, развивалось от нескольких поражений до полного их отсутствия, в то время как на листьях чувствительных растений развились многочисленные поражения. В растениях линий, устойчивых к ВНПЖС, обнаружены Р 15-специфичные молекулы миРНК, но они не обнаружены ни в одном из чувствительных растений.

Невозможно было обнаружить никакой модификации последовательности гена р15 или в последовательности терминатора транскрипции.

Пример 2. Шпилечные конструкции Р15.

Для изучения функциональности (мутированной) последовательности Р15, индуцирующей ПТГС, был сконструирован бинарный вектор АдгоЬас1егшт, содержащий генетически модифицированный ген р15 (например, (модифицированная) 8Е0 Ш N0 3) в смысловой и антисмысловой ориентациях, разделенных интроном петунии или интроном сахарной свеклы.

Ниже представлены результаты, полученные с тремя конструкциями йр15 (см. фиг. 4, 5). Интронная последовательность в конструкции 1 получена из петунии (см. фиг. 4), тогда как интронная последовательность в конструкциях 2 и 3 получена из свеклы. Конструкции 2 и 3 различаются только по длине интронов: 550 нт в случае вектора р8140 и только 91 нт в случае вектора р8142 (фиг. 5 А и Б соответственно).

Создание конструкций ДНК по изобретению и клонирование этих конструкций в АдгоЬас1егшт !итеГааещ (например, (обезвреженном) штамме СУ3101) проводили в соответствии со способами и методиками, хорошо известными в данной области техники. Смысловые и антисмысловые фрагменты р15, а также интроны, были получены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающей специфичные сайты рестрикции на концах. При смешивании с векторным каркасом возможна только одна рекомбинация/вставка фрагментов, основанная на совместимости этих специфичных сайтов на концах фрагментов. Правый сайт рестрикции первого фрагмента был таким же, как левый сайт рестрикции второго фрагмента.

Для каждой из выше описанных конструкций был создан шпилечный гомолог, содержащий (первые 400 нт) последовательность СРР [вместо генетически модифицированной последовательности р15], и использован в качестве контроля (шпилечный контроль, названный йрСР). Буфер МА (10 мМ МдС1₂, 200 мкМ ацетосирингон) дополнительно служил в качестве контроля обработки.

Пример 3. Протоколы экспериментов.

Листовой материал Те1гадоша ехрепза, Ве1а тасгосагра и Ве1а гЫдагН (растения, выдерживающие искусственное заражение листьев ВНПЖС) был инфильтрирован агрономическим путем с последующим инфицированием ВНПЖС (81газ 1234 или 81газ 12 (обеспечивающие РНК1 и РНК2)). Протоколы см. ниже, а конструкции см. выше.

АдгоЬас1егшт ШтеГааепз, содержащую шпилечную конструкцию, выращивают в течение ночи при 28°С. Клетки осаждают центрифугированием (15 мин при 5000 д) и ресуспендируют в 10 мМ буфере МдС1₂, содержащем ацетосирингон (200 мкМ), и 0Ό _600нм доводят до 1. Клеточную суспензию хранят при комнатной температуре в течение 3 ч до инфильтрации.

Инфильтрацию агрономическим путем проводят с помощью впрыскивания раствора АдгоЬас1егшт в листья сеянцев (например, Ве1а тасгосагра, Ве1а уи1даг15, Тейгадоша ехрапза, Мсойаиа ЬепШатша, Сйепоробшт цшпоа) на стадии 4 листьев. Шприцом без иглы объемом 2 мл надавливают на верхнюю сторону проколотого иголкой листа. Инфильтрируют каждый лист за исключением семядолей.

Через четыре дня после инфильтрации агрономическим путем обработанные листья инфицировали механической инокуляцией путем втирания на предварительно опыленные карборундом листья 10-25 мкл раствора инокулума (1 мкг вирусной РНК (81газ 1234 или 81газ 12), 0,04% макалоида, 50 мМ калийфосфатного буфера, рН 7,5).

Ве(а тасгосагра

Ве(а уи1дапз

Те(гадота ехрапза

Мсойапа ЬепОуаттапа

Листья от Ве1а тасгосагра, Ве1а уи1дапз, Тейгадоша ехрапза и Мсойапа ЬепШатша обрабатывали таким же образом (см. выше) и наблюдали в них наличие симптомов ризомании в течение 10-13 спи (су10 мкл мкл мкл мкл инокуляционного раствора инокуляционного раствора инокуляционного раствора инокуляционного раствора на лист на лист на лист на лист

- 17 013911 ток после инокуляции).

Пример 4. Эффект экспрессии мРНК Нр15 на размножение ВНПЖС.

A. Конструкции с интроном петунии.

В приведенных ниже примерах описаны некоторые результаты, полученные на свекле с использованием конструкций 11р15 по изобретению.

Результаты, полученные с конструкцией 1 (фиг. 4), представлены на фиг. 6. На листьях Ве1а уи1дап£, которые были подвергнуты агрономической инфильтрации суспензией, экспрессирующей конструкцию ЬрСР, и на листьях, инфильтрированных буфером МА, обнаружены желтые хлоротические поражения. Эти поражения были подобны поражениям, наблюдаемым на листьях, которые не были инфильтрированы и инокулированы.

Такие поражения не развивались на листьях растений, которые были инфильтрированы агрономическим путем суспензией, экспрессирующей конструкцию Ир15 (конструкция 1). Если наблюдали вообще какие-либо поражения, они были гораздо меньше, и, как полагают, соответствовали зонам, где инфильтрация листьев не была оптимальной.

Эти предварительные результаты указывают на то, что конструкции Нр15 пригодны для индукции ПТГС в растениях В. уи1дап£ и могут вызывать устойчивость к ВНПЖС.

Б. Конструкции с интроном свеклы.

Вышеописанные эксперименты повторяли с большим числом растений свеклы и с использованием конструкций 2 и 3, которые различались только по длине интронов.

Было обнаружено, что все листья, инфильтрированные буфером МА или суспензией АдгоЬае1егшт ШтсГасасщ. экспрессирующей гомолог ИрСБ. проявляют большое поражений примерно 3-4 мм в диаметре. На листьях растений, инфильтрированных агрономическим путем Ир15 (конструкции 2 или 3) вообще не развивались поражения или очень малое число поражений с максимальным диаметром 1 мм. Результаты, представленные на фиг. 7, указывают на то, что конструкция 2 (с интроном свеклы, размером 91 нт), по-видимому, придает лучшую защиту против ВНПЖС.

B. Защита против инфекции изолята Р-типа.

Р-тип ВНПЖС, обнаруженный в районе Питивье во Франции, состоит из пяти плюс-смысловых РНК. Этот изолят является высоко патогенным для свеклы. Предполагают, что экспрессия белка Р26 ухудшает симптомы ризомании (26).

Результаты, описанные выше (в разделе Б), были повторены с использованием Р-типа ВНПЖС в качестве вирусного инокулума.

Никаких поражений не наблюдали на листьях растений, инфильтрированных агрономическим путем суспензией АдгоЬае1егшт 1итеГас1еи£, экспрессирующей конструкцию Ир15.

Таким образом, индукция ПТГС предшественником шпилечной конструкции, по-видимому, является хорошим источником устойчивости против вирусной инфекции, и, в частности, против ВНПЖС. Устойчивость у растений была получена даже против наиболее агрессивных изолятов.

Предполагают, что экспрессия конструкции Ир15 (в растениях) приводит к образованию днРНК, которая распознается и разрезается на фрагменты размером примерно 21-23 нт (миРНК) ферментом Эюег. Р 15-специфичные миРНК должны образовать комплекс с РИСК (РНК-индуцированным сайленсингкомплексом), который, в свою очередь, направлен на гомолог РНК, РНК2, а также некоторые субгеномные виды РНК ВНПЖС, и индуцирует расщепление этих РНК. Таким образом, вирус больше не способен к переносу от одной клетки к другой.

Пример 5. Конструкции Ир15 по изобретению блокируют размножение вируса в клетках коры.

Присутствие и распространение ВНПЖС (А, В, Р-типов) изучали в чувствительной диплоидной выращиваемой линии сахарной свеклы 4Ό6834 ('4Ό') в источниках природной устойчивости (Но11у-1-4, номер по каталогу ('Но') и Ве1а уи1дап$ 55р. тапрта УВ42 ('Вт')), и в растениях свеклы, трансформированных по изобретению.

В сосудистых тканях белок оболочки вируса обнаружен в пределах ситовидных элементов флоэмы и сосудистой паренхимы. Эти наблюдения подтверждают дистанционный перенос по флоэме. Подробные протоколы, например, по вирусной инфекции и иммунологическому обнаружению, см. Иоиее!, 2006, диссертация на соискание ученой степени кандидата наук, глава 5, включенная здесь путем ссылки.

Показано, что источники природной устойчивости, такие как 'Но', устойчивы только частично. Устойчивость 'Но' разрушалась, например, при наличии высоких титров вируса.

Устойчивые растения по изобретению и растения генотипов 'Вт' проявляли такое же ограничение распространения вируса. Важным различием между ними, тем не менее, является то, что 'Вт' все же дает возможность вирусу размножаться в клетках коры. Таким образом, вирусные частицы все же доступны для Р. Ье1ае (грибковый вектор), который, по-видимому, инфицирует преимущественно кору. Размножение вируса и, следовательно, поддержание инфекционного потенциала, даже если и в меньшей степени, чем у чувствительного сорта, возможно и поддерживает нарастание инфекционной популяции. Преимущество устойчивого генотипа по изобретению является следствием его способности предотвращать размножение вируса в коре. По сравнению с 'Вт' он должен снижать способность вируса к поддержанию инфекционного потенциала в почве.

- 18 013911

Пример 6. Общие выводы.

Из вышеприведенных примеров авторы изобретения могут заключить, что устойчивость к патогенам, опосредованная 1зр15 по изобретению, является высоко эффективной даже против более агрессивных изолятов ВНПЖС.

Конструкции 1зр15 по изобретению успешно индуцируют устойчивость растения патогенного происхождения. Все протестированные конструкции 1зр15 индуцируют разрушение РНК2 посредством ПТГС.

Гомологи йрОЕ никогда не запускают механизм ПТГС (визуальное наблюдение). В этом случае никогда не наблюдали разрушение РНК2 ВНПЖС (анализ путем нозерн-блоттинга).

Вышеописанные примеры относятся к конструкциям йр15, содержащим полноразмерную последовательность р15. Положительные результаты, тем не менее, также были получены, когда фрагмент (часть или участок) кодирующей последовательности р15 клонировали в подходящем векторе в смысловой и антисмысловой ориентациях. Например, конструкция, содержащая две трети гена р15 ВНПЖС, также представляла собой мишень миРНК (малых интерферирующих РНК).

Вышеописанное свидетельствует о том, что шпилечные конструкции Р15, содержащие генетически модифицированную последовательность ТОВ-3 ВНПЖС по изобретению или ее часть или фрагмент, высокопригодны для индукции ПТГС, который приводит в результате к появлению растений, устойчивых к ВНПЖС.

Трансформированные растения предпочтительно отбирают по следующим критериям для максимального успеха. Отбирают трансформанты, несущие однокопийную конструкцию, и растения анализируют на устойчивость к инфекции ВНПЖС. Растения, продуцирующие высокие уровни малых РНК, должны проявлять очень высокие и прочные уровни устойчивости. Трансформация АдтоЬае1егшт и/или трансформация растения в соответствии с принципами, описанными в ЕР 1174513, предпочтительны в качестве методики трансформации, поскольку эти методики минимизируют перестройки.

Пример 7. Скрининг трансформированных растений, выращенных в инфицированной почве, с помощью ЭЛАЙЗА.

Конструкции: вектор р8138 (фиг. 11) использовали для прямой трансформации гена с помощью ПЭГ; и вектор р8143 (фиг. 12) использовали для трансформации, опосредованной АдтоЬас1ейит. Обе плазмиды содержат шпилечную конструкцию Р15-4 (ΒΝΡ15-Α1α4) с короткой интронной последовательностью (91 п.о.), как показано на фиг. 1А и 1Б. В указанных конструкциях смысловая последовательность р15-4 соответствует 8ЕО Ш N0 3, антисмысловая последовательность р15-4 - 8Е0 Ш N0 12, а интрон - 8Е0 Ш N0 11.

Трансформация с помощью ПЭГ: трансформацию с помощью ПЭГ проводили на протопластах замыкающих клеток сахарной свеклы в соответствии со способом, описанным в \0 95/10178. Отбор протопласта и каллюса проводили на 0,2 нМ имазамоксе; всходы и растения отбирали на 20 нМ имазамоксе. Проростки, трансформированные с помощью ПЭГ, были отмечены как ТНРВххх.

Трансформация, опосредованная АдтоЬас1етшт: исходный материал для трансформаций, опосредованных АдтоЬас1егшт, состоял из каллюсов, полученных из протопластов замыкающих клеток сахарной свеклы, развивающихся на альгинатных дисках, выращиваемых на твердой среде Р01В (как описано в \\'0 95/10178).

Штамм АдтоЬас1етшт (НАТ 8000) выращивали в течение ночи на среде ЬВ с добавлением 25 мг/л стрептомицина и 2 мг/л тетрациклина. Перед трансформацией бактериальную культуру центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин, и осадок ресуспендировали в среде РОо с добавлением 100 мкМ ацетосирингона с получением плотности инокулума 0Э₅₅₀ 1,0.

Для инокуляции бактериальную суспензию выливают в чашку Петри с альгинатом, содержащим развивающиеся каллюсы, происходящие из замыкающих клеток устьиц. Через 10 мин альгинат удаляют и высушивают на фильтровальной бумаге, после чего помещают в среду для совместного культивирования (среда РО1В с добавлением 100 мкМ ацетосирингона и 0,9% агарозы 8еар1ас.|ие. рН 5,8). Культуры инкубировали в темноте при 27°С в течение 1-2 суток, после чего индивидуальные каллюсы переносили на селективную среду с добавлением 125 мг/л цефотаксима, 0,2 нМ имазамокса и 0,8% агарозы, рН 5,8. Две недели спустя выросшие каллюсы переносили в среду РВN с добавлением 0,2 нМ имазамокса и выращивали при свете при 25°С. Развивающиеся всходы и растения отбирали на 20 нМ имазамоксе.

Проростки, трансформированные посредством АдгоЬас1егшт, были отмечены как АдНРххх.

Скрининг ЭЛАЙЗА: для скрининга ЭЛАЙЗА использовали трансформанты, содержащие только 1 или 2 копии шпилечной конструкции. Проростки, полученные ίη νίΐτο, переносили на среду для укоренения. Через 6-8 недель трансформанты, укорененные ίη νίίτο, обладающие хорошо развитой корневой системой, переносили в смесь почвы с песком, зараженную Ро1утуха Ье!ае, содержащим ВНПЖС патотипа Р, собранную в районе Питивье (Франция).

После четырех недель инкубации при 18-19°С и 70% относительной влажности песок и почву отмывали от корней, и нижние части корней использовали для теста ЭЛАЙЗА. Кусочки корней высушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и переносили в микропробирки, которые замораживали при 60°С в течение одной ночи с последующей лиофилизацией в течение 2-3 суток. После лиофилизации

- 19 013911 образцы измельчали (2x1 мин при 30 об/с). Соответствующее количество экстракционного буфера добавляли в каждую пробирку. Пробирки встряхивали до тех пор, пока порошок не был ресуспендирован, и центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин. В анализе использовали 150 мкл надосадочной жидкости.

Содержание вируса в корнях каждого проростка анализировали с помощью иммуноферментного сэндвич-анализа с тремя антителами (ТЛ8-ЕЫ8Л), используя антитела, образованные против белка оболочки вируса от №одеп (\\л\лу.пеодеп.сот). Отсекаемым значением для устойчивых растений было принято значение 0Э₄₀₅. равное 0,2.

Результаты. Чем ниже значение ЭЛАИЗА, тем ниже количество вируса, присутствующего в корневой системе анализируемых растений. Результаты двух различных биотестов (Κζ2007-001Ά и Κζ2007002А) суммированы на фиг. 9 и 10. Следующие растения сахарной свеклы служили в качестве положительного и отрицательного контролей: 4Ό6834, чувствительный контроль; ΌΚΙ 8, устойчивый контроль, выделенный из коммерческого селекционного материала; ТМОС1867 и М0Х63М8Е1, растения, трансформированные конструкцией р15-АЬА4 (смысловая конструкция, не является шпилечной конструкцией).

У растений М0Х63М8Е1 были обнаружены фрагменты малых РНК. Таким образом, у этих растений был генерирован механизм ПТГС, не запускаемый самой по себе генетической конструкцией, более вероятно, в результате перестроек вставок. Это, возможно, объясняет высокий уровень устойчивости, наблюдаемый у этих растений.

Суммарно 20 из 29 линий, трансформированных шпилечной конструкцией р15 по изобретению, обеспечивали устойчивость к ризомании. Было обнаружено, что только следующие линии являются чувствительными: ТНРК82, ТНРК90, АдНр150, АдНр155, ТНРК12, ТНРК15, ТНРК53, ТНРК239 и ТНРК270.

Вышеописанные данные подтверждают еще раз, что устойчивость к патогенам, опосредованная 11р15 по изобретению, действительно является высоко эффективной даже против более агрессивных изолятов ВНПЖС. Высокие уровни иммунитета наблюдали, например, в следующих линиях трансформированных растений биотеста ΡΖ2007-002Λ: ТНРК26, ТНРК118, ТНРК222 и ТНРК289. Растения с высоким уровнем иммунитета преимущественно имеют значение 0И₄₀₀ ниже 0,05, более предпочтительно ниже 0,01 или близкое к 0 (нулю).

ССЫЛКИ

1. Татайа Т. & ВаЬа Т., Аппа1з оГ 1йе Рйу!ора1йо1од1са1 8ос1е1у оГ 1арап 39, рр. 325-332(1973).

2. Ки^а1а М.& РиЫ С, Аппак оГ Рйу!ора1йо1оду 9, рр. 435-446 (1977).

3. Кезкш В., АгсЫу Гиг М1кгоЬю1оду 49, рр. 348-374 (1964).

4. Азйег М.1.С., К1Юоташа Ιπ Тйе зидаг Ьее! сгор, ей. 10 И.А. Сооке апй К.К. 8со!!, Сйартап & На11, Ьопйоп, рр. 312-338 (1993).

5. К1сйагй-Мо1агй М., К1Юоташе Ы !п811(и( Ггапдак йе 1а Ьейегауе тйиз!йе11е. Сотр!е-гепйи йез йауаих ейес!иез еп 1994, ГГВ, Рапз рр. 225-229 (1995).

6. Ро\уе11 А.Р. е! а1., 8с1епсе 232, рр. 738-743 (1986).

7. Ргйсйеп РН. & Веасйу К.К, Апп. Кеу. М1сгоЬю1. 47, рр. 739-763 (1993).

8. №1коп Т.М.А., Ргос. ИаН. Асай. 8сР И8А 90, рр. 3134-3141 (1993).

9. Сопза1уез Ό. & 811дй!от РЬ., 8еттагз 1п Уйо1оду 4, рр. 397-405 (1993).

10. П'На11шп К. е! а1., В1о!есйпо1оду 10, рр. 309-314 (1992).

11. Ка11егйоГ I. е! а1., Р1ап! Се11 Керойз 9, рр. 224-228 25 (1990).

12. ЕЫегз и. е! а1., Тйеогейса1 апй Аррйей Сепейс 81, рр. 777-782 (1991).

13. Кгаиз I. е! а1., Е1е1й регГогтапсе оГ йапздешс зидаг Ьее! р1ап!з ехргеззтд ВХУ№ соа! рго!ет р1ап!з, Еоийй !п1егпа(1опа1 Сопдгезз оГ Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, Ш!. 8ос. Гог Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, Атз!егйат (1994).

14. Макз Е. е! а1., Ргосеейтдз оГ !йе ТЫгй !п1егпа(1опа1 8утрозшт оп 111е ВюзаГе1у Кези1!з оГ Е1е1й Тез!з оГ Сепейса11у МойШей Р1ап!з апй Мюгоогдашзтз, Моп!егеу, рр. 129-139 (1994).

15. Сйтег е! а1., Уйо1оду 189, рр. 40-47 (1992).

16. В1еуказ!еп-Сгоззйапз е! а1., Мо1. Р1ап!-М1сгоЬе тетас!. 10, рр. 240-246 (1997).

17. Во^оиЬаа е! а1., I. Сеп. Уйо1. 67, рр. 1689-1700 (1986).

18. Ккйагйз & Татайа, Аппи. Кеуепйкайоп. Рйу!ора1йо1., рр. 291-313 (1992).

19. Во^оиЬаа е! а1., I. Сеп. У1го1. 68, рр. 615-626 (1987).

20. Негеод е! а1., I. Сеп. Уйо1. 18, рр. 3147-3155 (1994).

21. 8со!! е! а1., I. Сеп. Уйо1. 75, рр. 3561-3568 (1994).

22. Коошп & Ио^а, Сгй. Кеуепйкайоп. Вюсйет. апй Мо1. Вю1. 28, рр. 375-430(1993).

23. ΖιιΙ^γ апй 8йед1ег, N^1. Ас1йз Кез. 9, рр. 133-148 (1981).

24. Н1ддшз, Епсус1орей1а оГ ЫГе 8с1епсез, рр. 1-10 (2001).

25. Казка е! а1., Вю1оду оГ 111е Се11 96, рр. 579-594 (2004).

- 20 013911

Таблица 1

Вирус	Размер ТОВ-3	Хозяин	Ссылка
Вирус растрескивания ствола яблони	8 «Да	яблоко	бе1ктап, 4. (Зеп. \Лго!. 75, 1535-1542 (1994)
Вирус пятнистости черники	7 кДа	черника	СауПеег βΐ а!., 3. (Зеп. У/го/. 75,711-720(1994)
Вирус картофеля М	7 кДа	картофель	Ζθνπβν е! а!., 4. Сел. Иго/. 72, 9-14(1991)
Вирус мозаики белого клевера	8 кДа	клевер	ΕοΓδΙβΓ е1 а1., ΝυοΙ. Ас/с/з Рез. 16,291-303(1988)
Вирус мозаики СутЫсНит	10 кДа	орхидея	Νθο е1 а1., Р1ап( ΜοΙ. ΒίοΙ. 18, 1027-1029(1992)
Вирус картофеля X	8 кДа	картофель	Киразоу е! а!., 4. Сел. νίίοΙ. 70, 1861-1869 (1994)
Вирус ложной штриховатости ячменя	17 «Да	ячмень	<Эиз(а(зоп е! а!., Ыис1. Ас/с/з Рез. 164, 3895-3909 (1986)
Вирус курчавости верхушки картофеля	21 кДа	картофель	8сой βΐ а1., 4. (Зеп. νίηοΙ. 75, 3561-3568 (1994)
Вирус кустистости земляного ореха	17 кДа	земляной орех	Неггод е! а!., 3. (Зеп. νϊΓοΙ. 75, 3147-3155(1994)
Передающийся через почву вирус свеклы	22 кДа	сахарная свекла	Коеп1де!а1., И'л7оду216, 202-207(1996)

Таблица 2. Выявление экспрессии белка Р15 Р 15-специфичных миРНК в трансгенных растениях К: линия растений, устойчивых к ВНПЖС; 8: линия растений, чувствительных к ВНПЖС, +: слабое обнаружение; ++: сильное обнаружение; -: не обнаружена

Claims (37)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Генетически модифицированная вирусная последовательность ТОВ-3, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 и антисмысловую последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3;

   (б) нуклеотидной последовательности, включающей фрагмент 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 и антисмысловую последовательность указанного фрагмента 8ЕЦ ΙΌ N0: 3;

   (в) нуклеотидной последовательности, включающей модифицированную 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 и антисмысловую последовательность указанной модифицированной 8ЕЦ ΙΌ N0: 3; и (г) нуклеотидной последовательности, включающей фрагмент модифицированной 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и антисмысловую последовательность указанного модифицированного фрагмента 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, где указанная модифицированная вирусная последовательность при транскрипции в клетке способна к образованию двухцепочечной самокомплементарной молекулы РНК.
2. 2. Вирусная последовательность ТОВ-3 по п.1, где смысловая и антисмысловая последовательности включены в одну последовательность нуклеиновой кислоты.

   - 21 013911
3. 3. Вирусная последовательность ТОВ-3 по п.1 или 2, дополнительно содержащая интронный фрагмент, разделяющий смысловую и антисмысловую последовательности, где вирусная последовательность ТОВ-3 при транскрипции в клетке способна к образованию шпилечной молекулы РНК.
4. 4. Вирусная последовательность ТОВ-3 по п.3, где интронный фрагмент имеет происхождение из гена растения.
5. 5. Вирусная последовательность ТОВ-3 по п.4, где ген растения представляет собой ген свеклы.
6. 6. Вирусная последовательность ТОВ-3 по п.3, где интронный фрагмент представляет собой интронный фрагмент высоко транскрибируемых генов.
7. 7. Вирусная последовательность ТОВ-3 по п.6, где высоко транскрибируемые гены представляют собой гены рибосомной РНК.
8. 8. Вирусная последовательность ТОВ-3 по п.6, где высоко транскрибируемые гены представляют собой высоко транскрибируемые гены сахарной свеклы.
9. 9. Вирусная последовательность ТОВ-3 по любому из пп.1-8, где в указанной модифицированной последовательности 8ЕО ΙΌ N0:3 стартовый и/или стоп-кодон трансляции последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3 модифицирован(ы) таким образом, чтобы ингибировать трансляцию.
10. 10. Вирусная последовательность ТОВ-3 по любому из пп.1-9, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 9 или 8Е0 ΙΌ N0: 13.
11. 11. Вирусная последовательность ТОВ-3 по любому из пп.1-10, состоящая из 8Е0 ΙΌ N0: 9 или 8ЕО ΙΌ N0: 13.
12. 12. Вектор, содержащий генетически модифицированную вирусную последовательность ТОВ-3 по любому из пп.1-11.
13. 13. Вектор по п.12, оперативно сцепленный с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растительной клетке.
14. 14. Двухцепочечная самокомплементарная молекула РНК, экспрессируемая вектором по п.12 или 13.
15. 15. Способ индукции устойчивости к вирусу в растении или в растительной клетке, включающий получение конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей генетически модифицированную вирусную последовательность ТОВ-3 по любому из пп.1-14, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке, и трансформацию растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, индуцируя посредством этого устойчивость к вирусу в растении или в растительной клетке.
16. 16. Способ по п.15, где вирус выбран из группы, состоящей из вируса растрескивания ствола яблони, вируса пятнистости черники, вируса картофеля М, вируса мозаики белого клевера, вируса мозаики СутЫбшт, вируса ложной штриховатости ячменя, вируса курчавости верхушки картофеля, вируса кустистости земляного ореха, передающегося через почву вируса свеклы и вируса ВНПЖС.
17. 17. Способ индукции посттранскрипционного генного сайленсинга целой РНК2, и более конкретно белка переноса ТОВ-3 в растении или в растительной клетке, включающий стадии получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей генетически модифицированную вирусную последовательность ТОВ-3 по любому из пп.1-16, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке, и трансформации растительной клетки нуклеиново-кислотной конструкцией, в результате чего экспрессия в указанных растительных клетках молекулы РНК, которая способна к образованию двухцепочечной молекулы РНК, запускает механизм посттранскрипционного генного сайленсинга.
18. 18. Способ по п.17, где растительная клетка представляет собой устьичную клетку.
19. 19. Способ по п.17 или 18, где растение выбрано из группы, состоящей из яблока, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя, земляного ореха или сахарной свеклы.
20. 20. Способ по любому из пп.17-19, дополнительно включающий регенерацию трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.
21. 21. Способ по любому из пп.17-20, где регуляторная последовательность включает промоторную последовательность или терминаторную последовательность, активную в растениях.
22. 22. Способ по п.21, где промоторная последовательность представляет собой конститутивную или чужеродную промоторную последовательность.
23. 23. Способ по п.21, где промоторная последовательность выбрана из группы, состоящей из промотора 358 вируса мозаики цветной капусты и полиубиквитинового промотора АгаЫборык ШаНапа.
24. 24. Способ по п.21, где промоторная последовательность представляет собой промотор, активный в корневой ткани растений.
25. 25. Способ по п.24, где промоторная последовательность представляет собой промотор, активный в корневой ткани растений свеклы.
26. 26. Способ по п.24, где указанный промотор, активный в корневой ткани растений, представляет собой промотор раг гена гемоглобина из Регокроша апбегкопи.
27. 27. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка, устойчивые к вирусу и содержащие конструкцию нуклеиновой кислоты, имеющую генетически модифицированную вирусную последова

    - 22 013911 тельность ТСВ-3 по любому из пп.1-11, оперативно сцепленную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или в растительной клетке, содержащие вектор по любому из пп.12-13 или содержащие двухцепочечную самокомплементарную молекулу РНК по п.14.
28. 28. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по п.27, где вирус выбран из группы, состоящей из вируса растрескивания стебля яблони, вируса пятнистости черники, вируса картофеля М, вируса мозаики белого клевера, вируса мозаики СутЬИшт, вируса картофеля X, вируса ложной штриховатости ячменя, вируса курчавости верхушки картофеля, вируса кустистости земляного ореха, передающегося через почву вируса свеклы и вируса ВНПЖС.
29. 29. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по п.27 или 28, выбранные из группы, состоящей из яблока, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя, земляного ореха или сахарной свеклы.
30. 30. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по любому из пп.27-29, где регуляторная последовательность включает промоторную последовательность и терминаторную последовательность, которые активны в растении.
31. 31. Трансгенное растение по п.30, где указанный промотор активен в корневой ткани растений.
32. 32. Трансгенное растение по п.30 или 31, где указанный промотор представляет собой промотор раг гена гемоглобина из Регокроша аи4ег8опи.
33. 33. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по любому из пп.27-32, где указанное трансгенное растение представляет собой сахарную свеклу и указанная трансгенная растительная клетка представляет собой клетку сахарной свеклы.
34. 34. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по любому из пп.27-33, где регуляторная последовательность(и) включает промоторную последовательность, которая представляет собой конститутивную или чужеродную растительную промоторную последовательность.
35. 35. Трансгенное растение или трансгенная растительная клетка по любому из пп.27-34, где промотор выбран из группы, состоящей из промотора 358 вируса мозаики цветной капусты и полиубиквитинового промотора ЛгаЬ14ор818 НзаНапа.
36. 36. Трансгенная растительная ткань, полученная из трансгенной растительной клетки по любому из пп.27-35, где указанная ткань выбрана из группы, состоящей из плода, стебля, корня, клубня и семени.
37. 37. Трансгенная репродуктивная структура, полученная из трансгенной растительной клетки по любому из пп.27-35, где указанная репродуктивная структура выбрана из группы, состоящей из каллусов, почек и зародышей.