JP2009507229A - 生物学的状態の診断及び／又は治療に有用なバイオマーカーを同定するための方法及び組成物 - Google Patents

生物学的状態の診断及び／又は治療に有用なバイオマーカーを同定するための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、生物学的状態を示すバイオマーカー、特に、転写因子バイオマーカーとそのような転写因子バイオマーカーにより調節され得る遺伝子を同定するための方法及び組成物に関する。本発明はまた、そのような転写因子及び被調節遺伝子における、生物学的状態を示唆する多型を同定することに関する。同定されるバイオマーカー及び多型は、診断及び治療のアプローチに使用を見出し、例えば、本発明のいくつかの態様は、気管支癌とそのリスクを検出するための方法及びキットを提供する。
【選択図】 なし

Description

発明の詳細な説明
相互参照
本出願は、そのいずれも２００５年９月２日に出願されて、そのいずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願番号６０／７１３，６２８、６０／７１３，６２９、及び６０／７１４，１３８の利益を主張する。
連邦支援の研究又は開発
本明細書に記載する研究は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）研究助成番号ＣＡ８５１４７、ＣＡ８１１２６、ＣＡ９５８０６、又はＣＡ１０３５９４下の米国政府資金提供により支援された。
参照による組込み
本明細書において言及するすべての刊行物及び特許出願は、それぞれ個別の刊行物又は特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれるように示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
背景技術
ＤＮＡ配列における特定の変異又は多型と、特定の状態へのリスクとの間の相関性を評価することは、多年の間、支配的なパラダイムとなっている。しかしながら、このような研究に共通する限界は、それらが単一の多型、又は稀には数個の多型の評価に関わることである。さらに、評価される多型は、典型的には、ある特定の生物学的状態に関連した遺伝子内に存在するが、研究のための多型の選択は、概ね経験的であり、例えば、既知の機能に基づいていない場合がある。異なる部位の多数の稀な多型がいずれもリスクに貢献する可能性があり、主要な多型は機能性試験を通して同定されない可能性があるので、統計学的に正しい評価には、非常に大きな（あまりに大きくて現実的ではない）試験集団が必要とされる場合がある。従って、望ましくない状態を診断して、治療標的として役立つ可能性があるバイオマーカーを同定するための新たなアプローチへのニーズが残っている。気管支癌（ＢＣ）は、そのような状態の例である。ＢＣは、米国における癌関連死の主因であり、すべての癌死亡の２８％を引き起こしている。喫煙が主要な危険因子であるが、この疾患を獲得するのは、ごく一部の重度喫煙者（ヘビースモーカー）なのである。喫煙の蔓延を抑えようとする、ますます有効な方法の利用により（Samet, 1991）、この患者の集団では、禁煙者の数が増えつつある。重要にも、ＢＣのリスクは、禁煙の後で経時的に減少するが、それは、喫煙したことのない人々の間で観測されるレベルに達することはなく（Halpern et al, 1993; Lubin and Blot, 1993; Sobue et al, 1993）、ＢＣは、今日、禁煙者の間で最も一般的に起こるのである（Strauss et al, 1994; Tong et al, 1996）。ＢＣは、通常進行性であり、診断の時点では、外科手術へさほど反応せず、外科的除去以外のどの療法に対してもほとんど応答せず、治癒率はきわめて低い（Sekido, 2001）。従って、この文脈において、定期的な胸部Ｘ線診断又は喀痰分析でのスクリーニング（Fontana et al, 1986; Tockman, 2000）のように、禁煙者においてＢＣを予防するための手段を開発すること、又はそれを外科的治癒が可能であるほど早期に検出することへの種々の努力が何年にもわたってなされてきた（Cohen and Khuri, 2003; Hong and Sporn, 1997）。これまでに得られたデータに基づけば、これらの有望な早期検出又は化学予防のアプローチは、決して費用効果的ではない（Wagner and Ruckdeschel, 1996）。ヘリカルＣＴでのスクリーニングは、より有望であるらしく、長期の研究が進行中である（Jett, J.R., 2005; Mulshine, 2005）。
早期スクリーニング及び化学予防の研究の効力を改善するための１つの重要なやり方は、試験集団に、最も高いリスクの個体のより高い分画を含めることであろう（Greenwald, 1996; Kelloff et al, 1996）。現在、そのような研究には、一般に、１日平均１パックのタバコを２０年以上吸っている、５０歳より上の個体が含まれる。しかしながら、喫煙はＢＣの主要な危険因子であるが、ＢＣを発症するのは、重度喫煙者（２０パック・年より大きい）の５〜１０％にすぎない。喫煙をより若いころに始めた、より高齢で、より重度の喫煙歴がある人々を含めることによって、より高いＢＣリスクの亜集団を同定することは可能であるが、このより小さな集団のＢＣ発症率は、せいぜい１５〜２０％へ上昇するだけである（Bach et al, 2003）。
喫煙は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような他の肺状態の主因でもある。ＣＯＰＤは、最も一般的な慢性状態の１つであり、米国で第４位の死因である。ＢＣ及び／又はＣＯＰＤへのリスクがより高い人々を同定することは、早期検出の方法及び組成物、並びにこの疾患を治療及び／又は予防するための方法及び組成物の開発を促進させる可能性がある。本発明は、ＢＣ及び／又はＣＯＰＤ、並びに他の生物学的状態（例えば、他の癌、及び／又は他の肺関連状態が含まれる）へのリスク状態にある個体を同定するための方法及び組成物に関する。
発明の簡単な説明
本発明の第一の側面は、生物学的状態を示す転写因子バイオマーカーを同定する方法であって、前記方法は、複数の対照試料において転写因子の発現レベル及び前記生物学的状態に関連している第一遺伝子の発現レベルをアッセイすること；複数の症例試料において前記転写因子及び前記第一遺伝子の発現レベルをアッセイすること；及び、前記転写因子の前記発現レベルが前記第一遺伝子の前記発現レベルに前記対照試料において相関するが前記症例試料においては相関しないかどうかを演繹して、それにより前記生物学的状態の転写因子バイオマーカーを同定することを含んでなる。
本発明の第二の側面は、生物学的状態を示すバイオマーカーを同定する方法であって、前記方法は、複数の対照試料において遺伝子及び第一転写因子の発現レベルをアッセイすること（前記第一転写因子は、前記生物学的状態に関連している）；複数の症例試料において前記遺伝子及び前記第一転写因子の発現レベルをアッセイすること；及び、前記遺伝子の前記発現レベルが前記第一転写因子の前記発現レベルに前記対照試料において相関するが前記症例試料においては相関しないかどうかを演繹して、それにより前記生物学的状態のバイオマーカーを同定することを含んでなる。
本発明の第三の側面は、生物学的状態を示す多型を同定する方法であって、前記方法は、転写因子の発現レベルが遺伝子の発現レベルと相関する複数の対照試料を入手すること；前記転写因子の発現レベルが前記遺伝子の発現レベルと相関しない複数の症例試料を入手すること；及び、前記対照試料の１以上と比較した前記症例試料の１以上において、前記転写因子及び／又は前記遺伝子にヌクレオチド変異を同定して、それにより前記生物学的状態を示す多型を同定することを含んでなる。
本発明の新規な特徴は、特許請求項において詳細に説明される。本発明の目的、特徴、及び利点のさらなる理解は、本発明の諸原理が利用される例示の態様と図面を説明する以下の詳細な説明を参照して得られる。
発明の詳しい説明
本発明は、生物学的状態を示すバイオマーカー、特に転写因子バイオマーカーとそのような転写因子バイオマーカーにより調節され得る遺伝子を同定するための方法及び組成物に関する。本発明はまた、生物学的状態を示唆するそのような転写因子と被調節遺伝子における多型を同定することに関する。同定されるバイオマーカー及び多型は、診断及び治療アプローチにおいて使用を見出し、例えば、いくつかの態様において、本発明は、気管支癌とそのリスクを検出するための方法及びキットを提供する。
Ｉ．バイオマーカーを同定するための方法及び組成物
Ａ．相関性の不足に基づくアプローチ
１つの側面において、本発明は、生物学的状態を示すバイオマーカーを同定するための方法に関する。いくつかの態様において、本方法は、所与の生物学的状態においてある転写因子と別の遺伝子との発現レベルの間の相関性の不足を同定することに関わる。いくつかの態様において、他の遺伝子は、所与の生物学的状態に関連していることが知られている遺伝子であり、本方法は、新しい転写因子バイオマーカーを同定することに関わる。いくつかの態様において、転写因子は、所与の生物学的状態に関連していることが知られていて、本方法は、他の遺伝子である新しいバイオマーカーを同定することに関わる。
本明細書に使用する「生物学的状態」は、あらゆる表現型の状態、例えば、臨床的に関連した表現型、又は他の注目すべき代謝状態を意味しうる。生物学的状態には、例えば、疾患表現型、疾患状態への素因、又は非疾患状態；治療薬への応答、又はそのような応答への素因、不都合な薬物応答（例、薬物毒性）又はそのような応答への素因、薬物への抵抗性、又はそのような抵抗性を示すことへの素因、等を含めてよい。いくつかの態様において、薬物は、抗腫瘍薬であり得る。
図１は、本明細書に開示するいくつかの態様におけるバイオマーカーを同定するための方法全体を例示する。工程１０１で、症例試料及び対照試料の代表的な試料セットを採取する。対照試料は、特定の正常の生物学的状態に対応する試料である。例えば、対照試料は、特定の正常状態を明示する個体より入手してよい。例えば、対照試料は、気管支癌又はＣＯＰＤのリスクが低い患者の正常な気管支上皮より入手してよい。逆に、症例試料は、気管支癌又はＣＯＰＤのリスクが高く、それ故にリスクが低い対照個体において観察される生物学的状態には対応しない生物学的状態を有する患者の正常な気管支上皮より入手してよい。あるいは、薬物への応答の不足に対応する生物学的状態の癌組織より対照試料を入手してよく、一方、症例試料は、薬物への応答に対応する生物学的状態の癌組織より入手してよい。
いくつかの態様では、複数の症例試料及び対照試料を使用する。複数とは、例えば、２以上を意味する。好ましくは、約１０より多い症例試料と約１０より多い対照試料を使用のために採取する。好ましくは、約２０より多い症例試料と約２０より多い対照試料、好ましくは、約５０より多い症例試料と約５０より多い対照試料、好ましくは、約１００より多い症例試料と約１００より多い対照試料を使用のために採取する。
症例／対照試料には、例えば、培養物のスワブ、ブラシ採取した上皮細胞、一つまみの組織、生検抽出物、又はバイアル量の生物学的体液を含めてよい。組織には、例えば、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈、細胞の塊、及び／又は個々の細胞を含めてよい。生物学的体液には、例えば、唾液、涙液、粘液、リンパ液、喀痰、大便、胸膜液、心膜液、肺吸入液、滲出液、腹膜液、血漿、血液、血清、白血球、脳脊髄液、滑液、羊水、乳、***、尿、等、並びに、細胞懸濁液、細胞培養物、又は細胞培養上清を含めてよい。試料は、粗製試料でも、処理済の試料でもよく、例えば、様々な加工又は調製の工程の後で入手してよい。例えば、様々な細胞分離法（例えば、磁気活性化細胞ソーティング）を適用して、血液のような生物学的体液中に目的の分析物を分離又は濃縮してよい。試料は、希釈液、例えば、希釈した血清、又は他の複合体及び／又はタンパク濃縮混合物の希釈液を含んでもよい。本発明の好ましい態様は、わずかな出発材料を使用して実施して、定量可能な結果を得ることができる。
工程１０２では、転写因子と少なくとも１つの他の遺伝子の発現レベルをアッセイする。発現レベルは、当該技術分野で知られている技術を使用して核酸転写物及び／又はタンパク翻訳産物の存在量を測定することによって定量することができる。例えば、いくつかの態様では、ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることによって発現レベルをアッセイする。好ましい態様では、米国特許第５，６３９，６０６号；米国特許第５，６４３，７６５号；米国特許第５，８７６，９７８号；米国特許出願番号１１／０７２，７００；及び米国仮特許出願番号６０／６４６，１５７に記載される１以上の方法を使用して、転写物レベルをアッセイする。
例えば、いくつかの態様において、ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることは、転写因子に対応する核酸をその競合鋳型に関して測定すること；別の遺伝子に対応する核酸をその競合鋳型とともに共同測定（co-measuring）すること；及び、この共同測定より得られる数値を比較する関係を入手することを含む。転写因子（又は他の遺伝子）に対応する核酸は、その転写因子（又は他の遺伝子）のｍＲＮＡ転写物、又はそのｍＲＮＡより得られるｃＤＮＡを意味しうる。得られる関係は、転写因子、その競合鋳型、他の遺伝子、及びその競合鋳型の数値の比較であり得る。好ましい態様では、例えば、米国特許出願番号１１／０７２，７００及び１１／１０３，３９７に記載のように、転写因子及び／又は他の遺伝子を参照核酸との関連で測定する。
このことは、転写因子に対応する核酸をその競合鋳型とともに共同増幅（co-amplification）させること；別の遺伝子に対応する核酸をその競合鋳型とともに共同増幅させること；及び、この共同増幅より得られる増幅産物を比較する関係を入手することを伴ってよい。転写因子（又は他の遺伝子）に対応する核酸は、その転写因子（又は他の遺伝子）のｍＲＮＡ転写物、又はそのｍＲＮＡより得られるｃＤＮＡを意味しうる。得られる関係は、転写因子、その競合鋳型、他の遺伝子、及びその競合鋳型の増幅量の比較であり得る。好ましい態様では、例えば、米国特許出願番号１１／０７２，７００及び１１／１０３，３９７に記載のように、転写因子及び／又は他の遺伝子を参照核酸に対して測定する。あるいは、共同測定は、各核酸由来のシグナル及び対応する内部標準を、分岐鎖増幅に使用されるような、配列特異的プローブの結合を介して増幅させることを含む場合がある。
解析される他の核酸の少なくとも１つは、参照核酸として役立つ可能性がある。本明細書に使用する「参照核酸」は、増幅される核酸、並びに解析される核酸を意味しうる。核酸は、参照核酸に対して「正規化」することができる。いくつかの態様において、参照核酸は、ローディングのための対照として（例えば、反応へロードされるｃＤＮＡのためのコントロールに）役立つ。例えば、いくつかの好ましい態様において、参照核酸は、所与の生物学的標本の間で、及び／又はある種の刺激に反応して変動する（又は有意に変動する）ことが予期されない核酸を含む。例えば、構成的に発現される遺伝子由来のｍＲＮＡは、参照核酸を提供する可能性がある。いくつかの態様において、既知の、又は潜在的なハウスキーピング遺伝子は、参照核酸を提供する可能性があり、限定されないが、ヒト、マウス及び／又はラットのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ又はＧＡＰＤＨ）、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ、及び／又は他のリボ核タンパク質の遺伝子が含まれる。遺伝子発現のノーザン分析における内部標準として使用されてきた他のハウスキーピング遺伝子も使用してよい。例えば、Devereux et al., nucleic acids Res. 12:387 (1984); Barbu et al., nucleic acids Res. 17:7115 (1989) を参照のこと。いくつかの態様において、参照核酸の競合鋳型は、ハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡの片方の鎖に類似した配列を有するが、上記に記載のような識別可能な特徴を有する核酸を含んでよい。
多くの異なる遺伝子が参照核酸を提供することができる。参照核酸の選択は、アッセイされる組織、及び／又は試験される生物学的状態に依ってよい。例えば、β−アクチンは、異なる正常気管支上皮細胞試料の間でほとんど変動しない（例えば、Crawford, E. L., Khuder, S. A., Durham, S. J., et al. (2000)「グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、及びグルタチオンペルオキシダーゼの正常な気管支上皮細胞発現は、気管支癌の被検者において低い（Normal bronchial epithelial cell expression of glutathione transferase Pl, glutathione transferase M3, and glutathione peroxidase is low in subjects with bronchogenic carcinoma）」Cancer Res. 60, 1609-1618 を参照のこと）が、それは、気管支上皮細胞のような異なる組織からの試料においては、リンパ球に比較して約１００倍以上変動する場合がある。いくつかの態様において、参照核酸は、すべて、又はほとんどすべての組織、又はすべての組織の大多数において発現されている；及び／又は、高い、実質的に高い、又は比較的高いレベルで発現されている遺伝子に対応する。
いくつかの態様では、競合鋳型を標準化混合物において提供する。本明細書に使用する「標準化混合物」は、いくつかの内部標準、例えば、いくつかの競合鋳型を含んでなる混合物を意味しうる。なおいくつかの態様では、一連の系列希釈標準化混合物を使用して、混合物中の分析物をアッセイする。「系列希釈標準化混合物」は、標準化混合物中の試薬の１以上が系列希釈されている、２以上の標準化混合物を意味しうる。いくつかの態様では、標準化混合物中の１以上の試薬を混合物中の試薬の異なる１以上に関して系列希釈する。例えば、標準化混合物の系列は、ある転写因子の競合鋳型を、別の遺伝子の競合鋳型に関して既知の濃度の系列で提供することができる。標準化混合物の調製及び使用については、米国特許出願番号１１／０７２，７００及び１１／１０３，３９７に記載されている。
ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイする他の方法も使用してよい。例えば、いくつかの態様では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及び／又はハイブリダイゼーションアッセイを使用し得る。例えば、関連の転写因子と他の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを当該技術分野で知られているハイブリダイゼーション技術において使用し得る。特異的なＲＮＡレベルを定量するためのどのハイブリダイゼーションフォーマットも使用してよく、限定されないが、ノーザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、及びオリゴヌクレオチドアレイ、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、並びに他の固相アプローチが含まれる。ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼーション条件の変動するストリンジェンシーの度合いによって評価することができる。
いくつかの態様では、タンパク質の存在量をアッセイすることによって発現レベルをアッセイする。特異的な翻訳産物（タンパク質）の発現レベルを評価するためには、そのタンパク質に特異的な抗体を容易に使用し得る。ここでも、特異的なタンパク質レベルを測定するための当該技術分野で知られたどのフォーマットも使用してよく、サンドイッチアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、及びウェスタンブロットが含まれる。このようなアッセイでは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、及び抗体断片のいずれも使用してよい。
さらに、いくつかの態様では、米国特許出願番号１１／１０３，３９７に提供する方法を使用し得る。この特許出願は、タンパク質コピー数、タンパク質−ＤＮＡハイブリッド、及び／又はタンパク質−タンパク質ハイブリッドを測定するために使用し得る、標準化されたイムノＰＣＲの方法及び組成物について記載する。簡潔に言えば、いくつかの態様では、きわめて特異的で、高アフィニティーのモノクローナル抗体へ等モル量でハイブリダイズした既知数の抗原（例、転写因子タンパク質）の分子を含む内部標準を使用し得る。次いで、このモノクローナル抗体を、ＰＣＲの鋳型として役立つ二本鎖ＤＮＡ分子へ共有結合させる。内部標準の標準化混合物（ＳＭＩＳ）においては、多重遺伝子のそれぞれについて既知量の内部標準を組み合わせることができる。ＰＣＲのシグナル増幅力により、いくつかの態様では、このＳＭＩＳの１ｍｇバッチを全世界のニーズに５〜１０年の間役立てることができる。
工程１０３では、相関性又はその不足を演繹する。即ち、本方法は、転写因子の発現レベルが対照及び／又は症例試料において他の遺伝子の発現レベルと相関するかどうかを演繹することを含む。いくつかの態様において、転写因子発現レベルは、野生型と突然変異体の両方の転写因子転写物の全体量を表す。注目の生物学的状態が疾患状態、例えば、癌関連状態である場合、転写因子と他の遺伝子の発現レベルは、対照試料において概ね相関するが、症例試料においては相関しない。
当業者は、１より多い転写因子及び／又は他の遺伝子をアッセイし得ることを理解されよう。例えば、転写因子バイオマーカーを探索する場合、生物学的状態に関連した１以上の追加遺伝子の発現レベルをアッセイすることができる。バイオマーカーとして役立ち得る他の遺伝子（推定の被調節遺伝子）を探索する場合、生物学的状態に関連した１以上の転写因子の発現レベルをアッセイすることができる。
「相関する」は、陽性又は陰性の相関性、好ましくは陽性の相関性を意味しうる。相関性は、例えば、実施例に記載する検定の１つを使用して、統計学的有意差に基づく場合がある。逆に、「相関しない」は、統計学的有意差の不足、例えば、症例試料において、ある転写因子の発現レベルと少なくとも１つの他の遺伝子の発現レベルとの間に統計学的に有意な相関性が不足していることに基づく場合がある。「相関しない」「相関性の不足」、及び他のその文法上のバリエーションは、例えば、対照に比較した症例試料において、２つの遺伝子の発現レベルの間のより少ないか又は低下した度合いの相関性（例えば、低いか又は比較的低い相関性）を意味するものである。相関性の喪失を検出することによって、新しいバイオマーカーを同定することができる。例えば、ある遺伝子が所与の生物学的状態に関連していることが知られている場合、症例試料における該遺伝子と所与の転写因子の発現レベル間の相関性の喪失により、該転写因子を別の生物学的状態のバイオマーカーとして同定することができる。別の例として、ある転写因子が所与の生物学的状態に関連していることが知られている場合、症例試料における該転写因子と所与の遺伝子の発現レベル間の相関性の喪失により、該遺伝子を別の生物学的状態のバイオマーカーとして同定することができる。
ある特定の理論又は仮説に限定されずに言えば、疾患状態、例えば癌関連状態における相関性の喪失は、転写因子による遺伝子の機能調節の喪失を示す可能性がある。本明細書に使用する「転写因子」又は「ＴＦ」は、別の遺伝子又は遺伝子産物の発現のレベルに影響を及ぼすことができる遺伝子又は遺伝子産物を意味しうる。いくつかの態様において、転写因子は、核酸結合タンパク質、例えば、他の遺伝子の調節要素へ結合し得るタンパク質である。転写因子には、例えば、トランス作用因子、例えば、ｃｉｓ調節要素（例、エンハンサー又はＴＡＴＡボックス）へ結合して、それにより直接的又は間接的に転写の開始に影響を及ぼすタンパク質を含めてよい。一般的な転写因子には、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターを認識することに役立つ真核タンパク質、並びに原核シグマ因子が含まれる。転写因子は、遺伝子発現を活性化及び／又は抑制することができて、アップ又はダウンレギュレーションをもたらす。
一般に、転写因子は、所与の遺伝子を対照試料においては調節するが、症例試料においては調節しない。そのような遺伝子は、「正常な被調節遺伝子」又は「推定の被調節遺伝子」、及び文法的に同様のバリエーションとして呼んでよく、「標的遺伝子」（ＴＧ）と呼んでもよい。調節は、様々な機序根拠により、直接的でも間接的でもよい。本発明の方法により、以下の実施例に記載するように、様々な機序根拠の探究が促進される。
本研究に使用するパラダイムによれば、ａ）正常な表現型は、１以上のＴＦによる、１群の遺伝子の被調節転写より生じ、ｂ）対応するリスク供与又は疾患の表現型は、これら同じ遺伝子間の最適下限の（sub-optimal）相互作用より生じ、そしてｃ）各表現型は、発現レベルをアッセイすることによって同定可能であり、識別可能である。従って、本明細書に提供する方法及び組成物は、ａ）正常な表現型に関連している１以上のＴＦによる１群の遺伝子の被調節転写、ｂ）対応するリスク供与又は疾患の表現型の原因になる、同じ遺伝子間の最適下限の相互作用を定量化すること、及びｃ）疾患又はリスク状態の表現型より正常な表現型を同定する発現レベルプロフィールを使用することに関わる。本明細書に提示するデータは、以下に提供するように、ＢＣのリスクに関連している遺伝子を同定する時のこのパラダイムの有用性を裏付ける。
気管支癌と他の癌関連状態のバイオマーカー
１つの特定の態様では、気管支癌（ＢＣ）の転写因子バイオマーカーを同定することができる。ＢＣに関連した遺伝子には、抗酸化（ＡＯ）及びＤＮＡ修復（ＤＮＡＲ）の遺伝子が含まれる。そのような遺伝子は、ＢＣの前駆細胞、正常気管支上皮細胞（ＮＢＥＣ）において発現され、喫煙の有害な効果に抗して防御すると考えられている（Willey JC, et al, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 19, 16-24, 1998）。これら遺伝子の機能における、遺伝される個体間の変異がＢＣのリスクを決定する上である役割を担うことが示されてきた（Spitz MR, Wei Q, Dong Q, Amos CI, Wu X, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 12, 689-98, 2003）。例えば、ＡＯ遺伝子の転写物存在量は、非ＢＣＩ（ＮＢＣＩ）に比べて気管支癌個体（ＢＣＩ）のＮＢＥＣにおいて低い場合があり、乏しい抗酸化保護に基づいてＢＣＩが選択されることを示唆する（Crawford, E.L. et al, Cancer Research, 60, 1609-1618, 2000）。例えば、Crawford の研究では、ＮＢＣＩには、ＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子のいくつかの対の間に転写物存在量が相関性へ向かう傾向があったが、ＢＣＩにはなかった。その観測に含まれた遺伝子対は、ＧＳＴＰ１／ＧＰＸ１、ＣＡＴ／ＧＰＸ３、及びＧＰＸ３／ＳＯＤ１である。
ある特定の理論又は仮説に限定されずに言えば、そのような重要なＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の１以上のＴＦによる調節には個体間変異が存在する可能性があり、最適下限の調節を有する個体を、彼らが喫煙者であるならば、ＢＣの発症について選択し得る。馴染みの様式を表示しない疾患のリスクにおける個体間変異は、例えば、個体は、細胞をＤＮＡ傷害より保護することにおいて重複する機能を有する遺伝子群からの閾値数の遺伝子で対立遺伝子を担うリスクについて異型接合又は同型接合でなければならないということで説明することができる。このことで、ＢＣや他の癌関連及び／又は肺関連の状態を発症するのが喫煙者の一部にすぎない理由を説明することができる。例えば、ＢＣの遺伝子リスクは、ＮＢＥＣにおけるＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の協調制御に反比例するのかもしれない。
本明細書に使用する「喫煙者」には、肺の状態に関連する１以上の製品（例えば、タバコ及び／又は噛みタバコのようなタバコ製品）を使用するか又は使用したことがある個体、並びに、受動喫煙に曝露されることのように、そのような製品へ間接的に曝露されているか又は曝露されたことがある個体が含まれる。喫煙者には、重度喫煙者と軽度喫煙者、又はその間の範囲を含めてよい。例えば、喫煙者には、タバコ１本／日、タバコ５本／日、タバコ１パック／日、又はそれより多くを吸う人々が含まれる。いくつかの態様では、遺伝学的に決定されるリスクにおいて最大の差を有する可能性がある個体を比較することができる。例えば、ＢＣを発症しているより若い軽度喫煙者又は非喫煙者より症例試料を入手し得る一方で、ＢＣのない高齢の重度喫煙者より対照試料を入手することができる。考慮される他の要因には、それぞれの気道の解剖学的構造、タバコの種類、吸入技術、気管支上皮における線毛及び粘膜細胞の機能、並びに間欠的な慢性気管支炎の増悪が含まれる。同定されるバイオマーカーは、ＢＣ、ＢＣのリスク、ＢＣの程度（例、転移しているか又は転移していない）及び／又は予後（例、特定の化学療法への応答の可能性及び／又は度合い）を示すことができる。
いくつかの態様において、例えば、本明細書に提供する方法は、ＣＥＢＰＧ転写因子の転写物存在量が、ＮＢＣＩのＮＢＥＣ中の重要な抗酸化（ＡＯ）又はＤＮＡ修復（ＤＮＡＲ）遺伝子と有意に（ｐ＜０．０１）相関するが、ＢＣＩでは相関しないことを示す。さらに、いくつかの重要な遺伝子では、この相関性がＢＣＩのＮＢＥＣにおいて有意に低い。これらの方法の詳細は、以下の実施例に提供する。簡潔に言えば、ＢＣに関連した遺伝子（例、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ１、ＣＡＴ、ＧＰＸ３、及びＳＯＤ１）に共通するＴＦ認識部位を配列解析、例えば in silico ＤＮＡ配列解析により同定することができる。Genomatix Software（GmbH, Munich, Germany, http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/）（Quandt K, Freeh K, Karas H, Wingender E, and Werner T, NAR, 23, 4878-4884. 1995）を使用するそのような配列解析により、例えば、ＥＶ１１とＣ／ＥＢＰ及びＥ２Ｆファミリーのメンバーが含まれる１１のＴＦについての部位が得られる。
１１の同定されたＴＦの発現レベルを、ＢＣの患者からのＮＢＥＣ症例試料と健常個体より入手される対照ＮＢＥＣ試料においてアッセイすることができる。例えば、標準化ＲＴ−ＰＣＲ試薬を調製して、例えば、「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）」（Shimkets, R. A. 監修）（ヒュマナプレス社、ニュージャージー州トトワ、2004）13-41中 Willey JC, et al に提供されるように、ＴＦや他の遺伝子について選好的に最適化することができる。多数のＮＢＥＣ試料の間で低い、及び／又は不変のレベルで発現されていることが判明したＴＦは、さらなる解析より除外してよい。残るＴＦについて、ＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子の拡張群（例えば、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、ＧＰＸ１、ＥＲＣＣ１、ＣＡＴ、ＧＳＴＺ１、及びＥＲＣＣ２が含まれる）との相関性を評価することができる。
以下の実施例において詳述するように、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、及びＧＰＸ１の発現レベルは、ＢＣＩと比較して、ＮＢＣＩにおいてＣＥＢＰＧの発現レベルと有意に、又はほとんど有意に相関する。ＮＢＣＩと比較したＢＣＩにおける相関性の喪失は、Ｅ２Ｆ１の発現レベルとＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、及びＳＯＤ１の発現レベルとの間でも観測することができる。
他のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子もアッセイすることができる。ＡＯ遺伝子の例には、発癌物質からの損傷を妨げるか又は抑えることが可能である酵素（グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ、例えば、ＧＳＴＴ１）及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨＰｘ、例えばＧＳＨＰｘＡ）のような）をコードするものが含まれる。いくつかのクラスのＧＳＴが存在し、1つのミクロソームクラス（ｍＧＳＴ）と少なくとも５つのサイトゾルクラス：ＧＳＴＡ、ＧＳＴＭ（例、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ３）、ＧＳＴＰ（例、ＧＳＴＰ１）、ＧＳＴＴ、及びＧＳＴＺが含まれる。例えば、Crawford et al., Cancer Res 60: 1609-1618 (2000); Hackett et al., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 29: 331-343 (2003); 及び Willey et al., ILSI Press, Washington, D.C., U. Heinrich and U. Mohr (Eds), pp. 79-96 (2000) も参照のこと。
ＤＮＡＲ遺伝子の例には、特異的なヌクレオチド改変、塩基ミス対合（mispairs）、及び二本鎖切れ目を認識及び／又は修復することができる酵素をコードするものが含まれる。哺乳動物細胞において同定されて、突然変異に抗する保護に重要な役割を担うＤＮＡＲ経路は：１）ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）、２）ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、３）塩基除去修復（ＢＥＲ）、４）０６−メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）による傷害逆転、５）相同的組換え（ＨＲ）、及び６）非相同的な末端結合（ＮＨＥＪ）である。
ある特定の理論又は仮説に限定されずに言えば、喫煙者は、少なくとも一部はＣＥＢＰＧによる最適下限のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子の調節によりＢＣを発症するように選択されるらしい。即ち、ＮＢＣＩでは、ＣＥＢＰＧがＮＢＣＩ中の重要なＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子の転写を調節し得るのに対し、ＢＣを発症する喫煙者では、ＣＥＢＰＧ調節がリスク増加をもたらすのに十分な数のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子にとって最適下限であるのかもしれない。例えば、ＢＣＩにおける相関性の喪失についての１つの可能な説明は、ＮＢＣＩにおける相関性の原因になる１以上のＴＦの機能における改変である。好ましい態様において、本明細書に提供する方法は、肺癌のリスクの理解を高めて、最も高いリスク状態にある人々への早期スクリーニングと化学予防を可能にし得る。
当業者は、本明細書に提供する方法が他の癌関連状態のバイオマーカーの同定にも適用し得ることを理解されよう。他の癌関連状態の例には、限定されないが、乳癌，皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝癌、肺癌、脳腫瘍、喉頭、胆嚢、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頚部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞癌、潰瘍状と乳頭状の両方の種類の扁平細胞癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網細胞肉腫、骨髄腫、巨大細胞腫、小細胞肺癌、胆石、島細胞腫、原発性脳腫瘍、急性及び慢性のリンパ球性及び顆粒球性腫瘍、毛様細胞腫、腺腫、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節神経腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン症候群（marfanoid habitus tumor）、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍、頚部異形成及び上皮内癌、神経芽細胞腫、網膜芽腫、柔組織肉腫、悪性カルチノイド、局所性皮膚病巣、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポシ肉腫、骨原性及び他の肉腫、悪性カルシウム過剰血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、多形性膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、表皮癌、並びに他の癌腫及び肉腫が含まれる。
いくつかの態様では、異なる段階の癌より症例及び対照試料を入手してよい。異なる段階の癌にある細胞には、例えば、所与の患者からの、疾患経過にわたる様々な時期での非癌性細胞、非転移性癌細胞、転移細胞が含まれる。様々な種類の癌の癌細胞を使用してよく、例えば、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、内分泌系癌、胃腸系の癌、婦人科系の癌、頭頚部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、転移癌、骨髄腫、新生物組織、小児癌、陰茎癌、前立腺癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、及び尿道癌が含まれる。好ましい態様では、例えば、特定の患者において、所与の種類の癌に対してどの化学療法剤が最もよく作用し得るかを予測するバイオマーカーを開発することができる。
いくつかの態様では、ＢＣのバイオマーカーを同定する方法を他の癌関連状態のバイオマーカーを同定することに適用し得る。例えば、これらの他の癌関連状態の１つに関連している遺伝子に共通のＴＦ認識部位を配列解析により同定することができる。癌関連状態に関連している遺伝子の例には、限定されないが、抗酸化（ＡＯ）、生体異物代謝酵素遺伝子（ＸＭＥ）、及びＤＮＡ修復（ＤＮＡＲ）遺伝子が含まれる。ＸＭＥ遺伝子の例には、限定されないが、シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）ＩＡ１、ＩＢ１、及び２Ｂ６（これらは、タバコの煙中の多環系芳香族炭化水素の癌原物質を代謝する）、エポキシドヒドロラーゼ、ＮＡＰＤＨオキシドレダクターゼ及びフェノロスルホトランスフェラーゼ（これらも、多環系芳香族炭化水素を代謝する）；並びにＣＹＰ２Ａ６／７及びＣＹＰ２Ｅ１（ニトロソアミンのようなニトロソ化合物を代謝する）のような、タバコの煙に存在する発癌物質及び／又は癌原物質を代謝するヒトＮＢＥＣにおいて発現されるものが含まれる。例えば、Willey et al., Am J Respir Cell MoI Biol 17(1): 114-124 (1997); 及び Willey et al., Am J. Respir Cell MoI Biol 14(3): 262-271 (1996) を参照のこと。
同定されたＴＦの発現レベルを、癌関連状態のある患者からの症例試料と健常個体より入手されるか又は異なる段階の癌より入手される対照試料においてアッセイすることができる。好ましい態様では、標準化ＲＴ−ＰＣＲ試薬を調製して、例えば、「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）」（Shimkets, R. A. 監修）（ヒュマナプレス社、ニュージャージー州トトワ、2004）13-41中 Willey JC, et al に提供されるように、ＴＦや他の遺伝子について選好的に最適化することができる。多数の対照試料の間で低い、及び／又は不変のレベルで発現されていることが判明したＴＦは、さらなる解析より除外してよい。残るＴＦについて、癌関連状態に関連していることが知られている遺伝子の拡張群との相関性を評価することができる。追加の詳細を以下の実施例に提供する。
慢性閉塞性肺疾患や他の肺関連状態のバイオマーカー
別の特定の態様では、ＣＯＰＤの転写因子バイオマーカーを同定することができる。ＣＯＰＤには、例えば、気腫（異質性気腫と均質性気腫の両方が含まれる）、喘息、気管支拡張症、及び慢性気管支炎が含まれる。ＣＯＰＤに関連する遺伝子には、ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子も含まれる。ある特定の仮説及び／又は理論に限定されずに言えば、重要なＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の１以上のＴＦによる調節には個体間変異が存在する可能性があり、最適下限の調節を有する個体は、特に彼らが喫煙者であるならば、ＣＯＰＤの発症について選択される可能性がある。同定されるバイオマーカーは、ＣＯＰＤ、ＣＯＰＤのリスク、ＣＯＰＤの程度（例、転移しているか又は転移していない）及び／又は予後（例、特定の療法への応答の可能性及び／又は度合い）を示すことができる。
いくつかの態様において、例えば、本明細書に提供する方法は、ＣＥＢＰＧ転写因子の転写物存在量が、健常個体より入手される対照試料においては重要な抗酸化（ＡＯ）又はＤＮＡ修復（ＤＮＡＲ）遺伝子と有意に（ｐ＜０．０１）相関するが、ＣＯＰＤ患者より入手される症例試料においては相関しないことを示す場合がある。ある所与の理論及び／又は仮説に限定されずに言えば、転写因子ＣＥＢＰＧによる最適下限のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子調節に基づいて、ＣＯＰＤを発症する喫煙者を選択することができる。
いくつかの態様において、例えば、ＣＯＰＤに関連する遺伝子（例えば、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ１、ＣＡＴ、ＧＰＸ３、及びＳＯＤ１）に共通するＴＦ認識部位を、例えば、Genomatix Software（GmbH, Munich, Germany, http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/）（Quandt K, Freeh K, Karas H, Wingender E, and Werner T, NAR, 23, 4878-4884. 1995）を使用する配列解析より同定することができる。同定されたＴＦの発現レベルを、ＣＯＰＤの患者からのＮＢＥＣ症例試料と健常個体より入手されるＮＢＥＣ対照試料においてアッセイすることができる。例えば、標準化ＲＴ−ＰＣＲ試薬を調製して、例えば、「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）」（Shimkets, R. A. 監修）（ヒュマナプレス社、ニュージャージー州トトワ、2004）13-41中 Willey JC, et al に提供されるように、ＴＦや他の遺伝子について選好的に最適化することができる。多数の対照試料の間で低い、及び／又は不変のレベルで発現されていることが判明したＴＦは、さらなる解析より除外してよい。残るＴＦについて、ＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子の拡張群（例えば、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１が含まれる）との相関性を評価することができる。転写因子Ｅ２Ｆ１についても同様の知見を得ることができる。
当業者は、本明細書に提供する方法が他の肺関連状態のバイオマーカーの同定にも適用し得ることを理解されよう。肺関連状態の例には、例えば、サルコイドーシス、肺線維症、気胸、フィステル、気管支胸膜フィステル、嚢胞性線維症、炎症状態、及び／又は他の呼吸障害が含まれる。肺関連状態には、肺への喫煙関連及び／又は加齢関連の変化、並びに外傷性イベント、感染病原体（例、細菌、ウイルス、真菌、ツベルクリン、及び／又はウイルス病原体）、毒素（例、化学療法剤、環境汚染物質、排気ガス、及び／又は殺虫剤）への曝露、及び／又は遺伝要因（例、肺の弾性及び／又は結合組織分解、及び／又は弾性及び／又は結合組織の合成障害、及び／又は弾性及び／又は結合組織の修復障害に関与する、α−１アンチトリプシン欠乏症や他の種類の遺伝障害）により引き起こされる肺障害が含まれる。
例えば、これらの他の肺関連状態の１つに関連している遺伝子に共通のＴＦ認識部位を配列解析より同定することができる。同定されたＴＦの発現レベルを、肺関連状態のある患者からの症例試料と健常個体より入手されるか又は異なる段階の肺関連状態より入手される対照試料においてアッセイすることができる。好ましい態様では、標準化ＲＴ−ＰＣＲ試薬を調製して、例えば、「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）」（Shimkets, R. A. 監修）（ヒュマナプレス社、ニュージャージー州トトワ、2004）13-41中 Willey JC, et al に提供されるように、ＴＦや他の遺伝子について選好的に最適化することができる。多数の対照試料の間で低い、及び／又は不変のレベルで発現されていることが判明したＴＦは、さらなる解析より除外してよい。残るＴＦについて、肺関連状態に関連していることが知られている遺伝子の拡張群との相関性を評価することができる。
Ｂ．多型の同定
別の側面において、本発明は、生物学的状態を示す多型を同定するための方法に関する。いくつかの態様において、本方法は、転写因子又は他の遺伝子における、症例試料及び対照試料の間のヌクレオチド変異を同定することを含み、ここで転写因子及び／又は他の遺伝子は、本明細書に提供する方法を使用して同定する。いくつかの態様は、例えば、転写因子の発現レベルが別の遺伝子の発現レベルと相関する複数の対照試料を入手すること；該転写因子の発現レベルが該遺伝子の発現レベルと相関しない複数の症例試料を入手すること；及び前記対照試料の１以上と比較した前記症例試料の１以上において、該転写因子及び／又は該遺伝子にヌクレオチド変異を同定することを含む場合がある。
例えば、いくつかの態様は、疾患及び／又は疾患のリスクに関連したＤＮＡ配列変異を同定するための方法を提供し、該方法は、ａ）ｉ）表現型を与えること、又はｉｉ）表現型を与えることに関与する遺伝子の転写を調節することに関与する遺伝子の発現レベルを決定すること、ｂ）発現レベルが、低リスク及び／又は非疾患の個体／組織における調節された遺伝子発現レベルと相関するが、リスク状態の個体、及び／又は疾患状態の個体／組織において正常に調節される遺伝子とは相関しない関連遺伝子を調節することの原因になる転写因子を同定すること、及びｃ）関与遺伝子の調節を決定することの原因になる１以上のＤＮＡ配列変異を同定することに関わる。
本明細書に使用する「多型」又は「ＤＮＡ配列変異」は、染色体上の所与の座（位置）のいくつかの代替可能形態のどの１つでも意味してよい。代替可能形態は、一塩基多型（ＳＮＰ）のような、単一の塩基対の差を伴う場合がある。いくつかの態様において、多型は、１より多い塩基対の変化を伴ってよく、例えばそれは、少なくとも約２、少なくとも約３、又は少なくとも約１０のヌクレオチドの違いを伴ってよい。いくつかの態様において、多型は、約５０未満、約１００未満、約２００未満、又は約５００未満のヌクレオチドの違いを伴ってよい。用語「多型」は、所与の遺伝子又は染色体セグメントにおける特定の対立遺伝子の組合せ、例えば２以上のＳＮＰを示すために使用してもよい。いくつかの態様では、例えば、１より多いヌクレオチド変異の同定により生物学的状態が同定される場合があり、例えば、特定の遺伝子での特異的な対立遺伝子の組合せが疾患状態のリスクを示す場合がある。
ヌクレオチド変異を同定することは、当該技術分野で知られたどの方法によっても（例えば、核酸の配列情報を決定するための様々な方法を使用して）達成することができる。例には、サンガーのジデオキシ末端法（例えば、Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 563-5467 (1977) を参照のこと）；マクサム−ギルバートの化学分解法（例えば、Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 74: 560-564 (1977) を参照のこと）；末端ヌクレオチドと会合する色素、ゲル電気泳動、及び自動化蛍光検出を使用するサンガーの拡張法；電気泳動の代わりに質量分析法を使用する技術；ピロリン酸放出技術（例えば、Ronaghi et al.,「リアルタイムピロリン酸に基づく配列決定法（A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate）」 Science 281:363-365 (1998)、及び Hyman，「ＤＮＡを配列決定する新たな方法（A New Method of Sequencing DNA）」 Anal. Biochem. 174: 423-436 (1988) を参照のこと）；エクソヌクレアーゼを利用して個別の蛍光標識塩基を連続放出させる単一分子配列決定技術（例えば、Goodwin et al.,「単一分子検出のＤＮＡ配列決定への応用（Application of Single Molecule Detection to DNA Sequencing）」 Nucleos. Nucleot. 16: 543-550 (1997) を参照のこと）;ＤＮＡを薄い液体膜より引き出して、それを消化するときに切断ヌクレオチドを空間的に分離させる技術（例えば、Dapprich et al., 「ビーズ置換によりモニターする微小構造における光学捕捉ビーズへのＤＮＡ付加（DNA Attachment to Optically Trapped Beads in Microstructures Monitored by Bead Displacement）」 Bioimaging 6: 25-32 (1998) を参照のこと）；走査原子プローブ顕微鏡法により固定及び延長ＤＮＡ分子の空間配列を決定する技術（例えば、Hansma et al.,「原子力顕微鏡を用いた液体下でのプラスミドＤＮＡの再現可能な造影及び精査（Reproducible Imaging and Dissection of Plasmid DNA Under Liquid with the Atomic Force Microscope）」 Science 256: 1180-1184 (1992) を参照のこと）；Cheeseman への米国特許第５，３０２，５０９号とＵ．Ｓ．２００３／００４４７８１（Korlach）に記載の技術；及び、例えば、米国特許公開公報番号２００５／０１４２５７７及び２００５／００４２６５４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に記載のような（実質的に）相補的なプローブのハイブリダイゼーションを使用する技術が含まれる。同定される多型は、例えば、以下により詳しく記載するように、疾患状態においてより高いか又は有意により高い率で表れるある種の対立遺伝子を含む場合がある。
いくつかの態様では、転写因子とその正常調節遺伝子の発現レベルの様式により、その転写因子及び／又は遺伝子の特定の領域に注目して、生物学的状態を示唆する多型を同定することが可能になる。例えば、いくつかの態様において、方法は、対照試料における遺伝子の発現レベルを転写因子の発現レベルと比較する第一の関係を入手すること；症例試料の１つにおける遺伝子の発現レベルを転写因子の発現レベルと比較する第二の関係を入手すること；第一及び第二の関係を比較すること；及び、前記ヌクレオチド変異を同定するために、前記比較に基づいて前記転写因子及び／又は前記遺伝子の領域を解析することをさらに含む。
本明細書に使用する「領域」は、好ましくは、遺伝子全体より少ない塩基対を伴う核酸配列を意味しうる。領域には、コーディング及び非コーディング、転写及び非転写、及び／又は翻訳及び非翻訳領域を含めてよい。例えば、遺伝子の領域には、コーディング領域の５’調節要素、例えばＴＦの認識部位を含めてよい。ＴＦの領域には、ＴＦの５’調節領域、３’ＵＴＲ及び／又はコーディング領域を含めてよい。本明細書に提供する方法は、生物学的状態を示唆する多型の同定において注目すべき特定領域を教示する。いくつかの態様において、領域は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約８０、又は少なくとも約１００の塩基に及ぶ。いくつかの態様において、領域は、約１５０未満、約２００未満、約２５０未満、約３００未満、又は約５００未満の塩基に及ぶ。
第一及び第二の関係は、数値間のあらゆる数学、グラフ、統計学の関係を意味しうる。いくつかの態様では、例えば、転写因子の発現レベルを他の遺伝子の発現レベルに対してプロットすることができる（ここで発現レベルは、対照試料においてアッセイする）。対照試料の数値を使用して、第一の関係としての回帰曲線を得ることができる。第二の関係は、転写因子発現レベルの、他の遺伝子の発現レベルに対する座標点（例えば、回帰曲線とともにプロットする）を含む場合があり、ここでその発現レベルは、所与の症例試料においてアッセイする。そのような態様において、第一及び第二の関係は、症例試料の座標点が前記回帰直線上に、その上方、又はその下方にあるかどうかに関して比較することができる。
いくつかの態様では、座標点が回帰直線の上方にある場合、転写因子の５’調節領域及び／又は３’ＵＴＲに注目する。いくつかの態様では、座標点が回帰直線の下方にある場合、転写因子のコーディング領域及び／又は他の遺伝子の転写因子の認識部位に注目する。座標点は、異なる個体で、回帰直線の上方、線上、又は下方にあり得て、座標点がどこにあるかにより、これらの個体に由来する核酸を解析するときに注目すべき領域が示される。症例試料における多型の頻度を決定して、対照における頻度に比較することができる。追加の説明、考察、及び詳細は、以下の実施例において、特にＮＢＣＩとＢＣＩに関連して提供する。
気管支癌と他の癌関連状態の多型
いくつかの態様では、本明細書に提供する方法を使用して、ＢＣを示す多型を同定することができる。例えば、ＣＥＢＰＧ及びＥ２Ｆ１転写因子のヌクレオチド配列を解析して、症例及び対照試料の間の変異を決定することができる。例えば、ＴＦの５’調節領域、３’ＵＴＲ及び／又はコーディング領域を解析することができる。いくつかの態様では、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のヌクレオチド配列を解析して、症例及び対照試料の間の変異を決定することができる。好ましくは、そのような遺伝子に共通のＴＦ認識部位、例えば、ＸＲＣＣ１の１１００ｂｐ調節領域（転写開始部位の１０００ｂｐ上流と１００ｂｐ下流）を解析する。ＮＣＢＩ中の各ＳＮＰでの各対立遺伝子の頻度を決定して、ＢＣＩ中の各ＳＮＰでの各対立遺伝子の頻度に比較することができる。当業者は、本明細書に提供する方法が他の癌関連状態の多型の同定に適用し得ることを理解されよう。
転写因子バイオマーカーの構造知識は、バイオマーカー多型を同定することに役立つ可能性がある。例えば、ＣＥＢＰＧは、トランケート型ＣＥＢＰ ＴＦであることが知られている（「肝臓遺伝子の発現（Liver Gene Expression）」（Yaniv M and Tranche F 監修）中、Johnson PF, and Williams SC, 231-258（R. G. Landes Company, 1994）。ＣＥＢＰＧは、ＤＮＡ結合とヘテロ二量体形成に必要な配列を保有するが、トランス活性化（transactivation）に必要な配列を欠く（Cooper C, Henderson A, Artandi S, Avitahl N, Calame K, NAR, 23, 4371-4377, 1995）。ＣＥＢＰＧは、他のＣＥＢＰファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成して、例えば、被調節遺伝子の増加（Hongwei G, Parkin S, Johnson PF, and Schwartz RC, JBC, 277, 38827-38837, 2002）又は減少（Cooper C, Henderson A, Artandi S, Avitahl N, Calame K, NAR, 23, 4371-4377, 1995）した転写をもたらすことができる。
好ましい態様において、解析して多型を提供するＤＮＡ領域には、転写調節、タンパク質機能、転写後プロセシング、及び／又はタンパク質−タンパク質結合に影響を及ぼす領域が含まれ、５’調節領域中の領域、３’ＵＴＲ中の領域、翻訳領域、及びコーディング領域の５’ＵＴＲが含まれる。例えば、ＤＮＡ結合及びヘテロ二量体形成の配列について、ＢＣを示唆する多型を解析することができる。具体的には、ＣＥＢＰＧのｂＺｉｐ領域中にある５０ｂｐの同一線上ストリング（string）についても、ＢＣを示唆する多型を解析することができる。さらに、リスクに関連していることが知られている領域について、多型を評価することができる。例えば、Ratnasinghe et al, Anticancer Res. 23: 627-32 (2003); Wang, DNA Repair (Amst). 2(8): 901-8 (2003)；及び Misra et al, Cancer Lett. 191: 171-8 (2003) に記載の領域を参照のこと。追加の詳細を以下の実施例に提供する。
ＣＥＢＰＧによるＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、及びＧＰＸ１の調節に影響を及ぼす多型の同定もバイオマーカーをもたらす可能性がある。ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の機能に影響を及ぼす多型と、調節に影響を及ぼす多型を組み合わせるバイオマーカーは、ＢＣのリスク状態にある個体を同定するためのいくつかの態様において好ましい。例えば、ＤＮＡ配列における１以上の変異に付随的なリスクの調節における機能改変に関連するバイオマーカーにより、リスクへ貢献する遺伝子に注目することが可能になる。このことにより、疫学的研究に含めなければならないはずの個体の数を顕著に減らすことが可能になり得る。
例えば、１つの態様において、多型は、ＸＲＣＣ１遺伝子中の−７７位にある（ＳＮＰ，ｒｓ３２１３２４５，−７７Ｔ＞Ｃ）。（Hao et al. Oncogene, 2006; 25: 3613-20 を参照のこと）。
上記に考察したように、特定のＢＣＩからのＴＧ及びＴＦの発現レベルの関係は、その特定のＢＣＩにおいて多型を解析すべき領域を示す場合がある。下記の実施例で詳述するように、ＣＥＢＰＧの５’調節領域、コーディング領域、及び／又は３’ＵＴＲについては、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＳＯＤ１、ＧＳＴＰ１及び／又はＧＰＸ１のような、標的遺伝子のＣＥＢＰＧ認識部位と同様に具体的に解析する。１つの態様では、本明細書に開示する組成物及び方法を利用して癌バイオマーカーを同定する。この癌バイオマーカーにより、ＣＥＢＰＧ及びＥＲＣＣ５中の多型部位での特定の対立遺伝子の遺伝は、ＮＢＥＣ中のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の最適下限の協調調節を引き起こすことによってＢＣへのリスク増加へ貢献する。癌のバイオマーカーを同定しようとするこれまでの試みは、限られた成功に留まり（Caporasb, 2002）、その結果は、臨床的に有用なバイオマーカーをもたらすのに十分強かったわけではない。これらの研究のほとんどは、１つ又は数個の生体異物代謝酵素遺伝子（ＸＭＥ）、抗酸化（ＡＯ）、及び／又はＤＮＡ修復（ＤＮＡＲ）遺伝子の機能又は調節のいずれかに影響を及ぼす、多型部位でのリスクを担う対立遺伝子の評価を伴うものであった（Dandara et al, 2002; Wang et al, 2003; Watson et al, 1998）。例えば、いくつかの疫学研究では、ＧＳＴＭ１ヌル遺伝子型又はある種のＧＳＴＰ１多型のある個体は、増加したＢＣリスクを有する（Seidegard et al, 1990; Nazar-Stewart et al, 1993）。しかしながら、他の研究の結果は、正反対である（Zhong et al, 1991）。突然変異や後続の無制御増殖から細胞を保護するように設計された経路（ＤＮＡ修復及び抗酸化機序が含まれる）は重複しているので、測定可能なリスク増加を引き起こすには多数の遺伝子変異体（それぞれが経路の１以上の遺伝子に影響を及ぼす）が必要であるらしいとする証拠が増えている（Caporaso,2002; Caporaso, 2003; Spitz et al, 2003; Xi et al, 2004）。しかしながら、多数の遺伝子を評価する研究であっても、成功が保証されるわけではない（Misra, et al, 2003）。これまでの研究の成功が限定されてきた１つのあり得る理由は、改変された遺伝子機能、遺伝子調節、又はリスク増加に特定の多型部位が関連している可能性があることを示す生物学的情報がほとんど、又はまったく無かったからである。特に初期の研究において、多型部位が解析に選択されたのは、それらが簡便に位置していて一般的であったからであり、ＢＣリスクに影響を及ぼすことが予測される生物学的効果を有することが知られていたからではない。
これまでの研究とは対照的に、本発明の利点は、疫学的な配列決定解析とＢＣリスクにおける役割を示す広汎な生物学的情報に基づく実験的な機序の検討の両方のために遺伝子と多型部位を選択したことである。具体的には、広汎な転写物存在量のプロファイリングを行って、ＮＢＥＣ、ＢＣの前駆細胞を非ＢＣ個体からＢＣ個体まで比較した。これらの解析の知見に基づけば、ＢＣ個体に比較した非ＢＣ個体における、ＣＥＢＰＧによるＸＲＣＣ１、ＳＯＤ１、ＧＰＸ１、ＧＳＴＰ１、及びＥＲＣＣ５遺伝子調節のより詳細な評価を通してＢＣリスクのバイオマーカーを捜すことには、強い合理的根拠がある。１つの例では、ＣＥＢＰＧによるＥＲＣＣ５調節の厳密な疫学的及び実験的評価を行なう。
哺乳動物細胞におけるＤＮＡ修復にはいくつかの異なる経路があり、それぞれがいくつかの異なるタンパク質に関与して、それぞれがある種類のＤＮＡ傷害に特異的である（Mohrenweiser and Jones, 1998）。ＥＲＣＣ５は、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路に参画する。ＮＥＲ経路には、２０を越えるタンパク質が関与して、ＵＶ照射により引き起こされるＤＮＡ傷害と、白金薬剤が含まれる多くの異なる化学品により引き起こされる付加物を修復する（Mohrenweiser and Jones, 1998; Seeberg, 1995）。傷害されたＤＮＡを同定して、２４〜３２ｂｐ領域中の傷害部分を囲む切断をＮＥＲ特異的な酵素によって行い、除去修復交差相補性齧歯動物の修復不足、相補性１群（ＥＲＣＣ１）及びＥＲＣＣ５が含まれる（de Laat et al., 1999; Griffin et al., 2005; Ura and Hayes, 2002）。次いで、一般的な複製因子がギャップを埋めて、それを連結する（Sancar et al., 2004）。さらに、選択した転写因子又は転写因子のファミリーにより標的遺伝子を調節する。
転写因子のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（ＣＥＢＰ）ファミリーとＣＥＢＰＧ。転写因子のＣＥＢＰファミリー（ＣＥＢＰＡ、−Ｂ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｇ及び−Ｚ）は、塩基性領域−ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）タンパク質である。ｂＺＩＰ領域は、Ｃ末端にある陽電荷の塩基性ＤＮＡ結合ドメインと７つのロイシンリピートを含有するＮ末端の二量体化ドメインを特徴とする（Landschulz et al, 1988b; Ramji and Foka, 2002; Vinson et al, 2002）。ＣＥＢＰタンパク質は、ＣＥＢＰＺを除くと、この領域において９０％より高い相同性を共有し、それらがコンセンサス回文ＤＮＡ認識部位配列へ結合することを可能にする（Cassel and Nord, 2003; Ramji and Foka, 2002）。これらタンパク質が二量体化すると、回文ＤＮＡ認識部位へ結合してＤＮＡ結合に必要である「鋏グリップ」又は逆Ｙ形を生じる（Landschulz et al., 1989; Ramji and Foka, 5 2002; Vinson et al., 1989）。すべてのＣＥＢＰタンパク質の組合せでは in vitro でのヘテロ二量体化が実証されてきたが、ジッパー中のロイシンが突然変異している場合は起こりえない（Cooper et al., 1995; Lekstrom-Himes and Xanthopoulos, 1998; Ramji and Foka, 2002）。ＣＥＢＰタンパク質のＮ末端は、２０％未満の相同性を共有し、短縮されてトランス活性化ドメインを欠くＣＥＢＰＧを例外として、転写調節の原因になるトランス活性化ドメインを含有する（Lekstrom-Himes and Xanthopoulos, 1998; Ramji and Foka, 2002; Takiguchi, 1998）。ＣＥＢＰタンパク質、特にＣＥＢＰＢ、−Ｄ、及び−Ｚは、翻訳後リン酸化により調節されることが実証されている（Lacorte et al., 1997; Nakajima et al., 1993）。
例えば、転写因子ＣＥＢＰＧは、普遍的に発現されて、他のファミリーメンバーからは、末端切断（truncated）されること、ＤＮＡ結合に必要な配列を保有すること、しかしＮ末端トランス活性化ドメインを欠くことによって異なる（Cooper et al., 1995; Roman et al., 1990）。このために、ＣＥＢＰＧは、ヘテロ二量体を完全に形成して、他のＣＥＢＰファミリーメンバーの優性ネガティブ調節因子である機能を遂行すると当初考えられていた（Cooper et al., 1995）。しかしながら、ａ）ＣＥＢＰＧは、他のＣＥＢＰファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成することによって転写のアクチベータとして作用し得ること、ｂ）この機能は、ｂＺＩＰ領域におけるヘテロ二量体の形成に依存すること、そしてｃ）この機能は、他のタンパク質の活性化ドメインの非存在時に明示し得ることが判明してきた（Gao et al., 2002）。ＣＥＢＰＢは、いくつかの細胞種において、ＣＥＢＰＧとのヘテロ二量体として高い量で存在することが示されてきて（Pan et al., 2000）（Wall et al., 1996）、ＣＥＢＰＧも、ＣＥＢＰＢと選好的に二量体化するらしい（Gao et al., 2002）。最後に、ＣＥＢＰＧヌルマウスは、誕生時は健常であるが、４８時間以内に死亡し始める（Kaisho et al., 1999）。これらのマウスは、ナチュラルキラー細胞の機能不全を明示して、組織学的検査によれば、気腫性の肺が明らかである（Kaisho et al., 1999）。ヒトでは、気腫のリスクは、抗酸化能力に関連していて（Repine et al., 1997）、気腫のリスクとＢＣのリスクの間には強い相関性がある（Schabath et al., 2005）。
以下の実施例７でより詳細に提供するように、ＢＣ個体により多く出現する対立遺伝子は、ＮＢＥＣと末梢血液細胞（ＰＢＣ）中のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子の最適下限のＣＥＢＰＧ調節に関連している。はじめに、１１０名の非ＢＣと１１０名のＢＣ個体中のＥＲＣＣ５について配列決定を実施して、ＥＲＣＣ５−２２２Ｇ対立遺伝子がＢＣ個体において有意に高い率で表れていることを確認する。この試料数からの配列情報は、０．０５のｐ値と８０％の検出力で有意差を証明することを可能にする。第二に、先の工程と同じ２２０名の個体の正常な気管支上皮細胞と末梢血液細胞（ＰＢＣ）において、ＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の発現レベルを測定した。それにより、ＥＲＣＣ５−２２２、−２２８、及び／又は他の多型部位がＣＥＢＰＧに対してより低いＥＲＣＣ５発現に関連しているのかどうかについての評価を提供する。さらに、ＣＥＢＰＧによるＥＲＣＣ５調節を検査して、多型部位での特定の対立遺伝子がこの調節に影響を及ぼすかどうかを決定した。提案した目的が成功裡に完了すれば、ＢＣリスクの候補バイオマーカーを提供して、ＢＣリスクの機序的な理解を高めるはずである（以下の実施例５を参照のこと）。故に、本発明は、ＢＣへのより優れた治療及び診断の選択肢を提供する、追加のＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子のバイオマーカーの同定を可能にする。
ＣＯＰＤと他の肺関連状態の多型
いくつかの態様では、本明細書に提供する方法を使用して、ＣＯＰＤを示す多型を同定することができる。例えば、ＢＣに関して記載したようにして、ＴＦ、ＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子の類似領域を解析することができる。所与の理論及び／又は仮説に限定されずに言えば、気腫のリスクとＢＣのリスクとの間には強い相関性があり、気腫のリスクはまた、ヒトの抗酸化能力に関連している（Repine JE, Bast A, and Lankhorst, I, Am. J. Respir. CHt. Care Med., 156, 341-357, 1997）。また、ＣＥＢＰＧ−／−ノックアウトマウスは、誕生の２４時間以内に死亡し始めて、組織学的検査で気腫性の肺を示す（Kaisho T, et al, J. Exp. Med., 190, 1573-1581, 1999）。
例えば、いくつかの態様では、ＣＥＢＰＧ及びＥ２Ｆ１転写因子のヌクレオチド配列について解析して、ＣＯＰＤ患者由来の症例試料と対照試料の間の変異を決定することができる。好ましくは、ＴＦの５’調節、コーディング、及び３’非翻訳領域について解析する。いくつかの態様では、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１又はＧＰＸ１のヌクレオチド配列について解析して、ＣＯＰＤ患者由来の症例試料と対照試料の間の変異を決定することができる。好ましくは、そのような遺伝子に共通のＴＦ認識部位について解析し、より好ましくは、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１及び／又はＧＰＸ１のＣＥＢＰＧ認識部位について解析する。上記に詳述したように、好ましい態様では、解析して多型を提供するＤＮＡ領域には、転写調節、タンパク質機能、転写後プロセシング、及び／又はタンパク質−タンパク質結合に影響を及ぼす領域が含まれ、上流の調節領域中の領域、３’ＵＴＲ中の領域、翻訳領域、及びコーディング領域の５’ＵＴＲが含まれる。当業者は、本明細書に提供する方法が他の肺関連状態のバイオマーカーの同定にも適用し得ることを理解されよう。
いくつかの態様はまた、ＣＯＰＤを示唆する多型を同定するための関連核酸配列からなるプローブを提供する。４つのそのようなプローブの例には、（ｉ）ＣＥＢＰＧの５’調節領域±約１００塩基からなる核酸配列を含んでなるプローブ；（ｉｉ）ＣＥＢＰＧの３’非翻訳領域±約１００塩基からなる核酸配列を含んでなるプローブ；（ｉｉｉ）ＣＥＢＰＧのｂＺｉｐ領域±約１００塩基からなる核酸配列を含んでなるプローブ；及び（ｉｖ）ＣＥＢＰＧ認識部位±約１００塩基からなる核酸配列を含んでなるプローブが含まれる。そのようなプローブは、支持体（例えば、アレイ中の）へ固定して、及び／又は、ＣＯＰＤ又はそのリスク（並びに、いくつかの態様では、他の肺関連状態）を同定することに使用のキットにおいて提供することができる。
ＩＩ．診断の方法及び組成物
Ａ．相関性の不足に基づくアプローチ
別の側面において、本発明は、対照に比較した２以上のバイオマーカー間の相関性の喪失を同定することによって生物学的状態を診断するための方法及び組成物に関する。いくつかの態様において、本方法は、転写因子と別の遺伝子の発現レベルの間の相関性の不足を同定することに関わる。一般に、他の遺伝子は、生物学的状態に関連している遺伝子、及び／又は対照において転写因子により調節される遺伝子である。
図２は、本明細書に開示するいくつかの態様において生物学的状態を診断するための全体の方法を例示する。工程２０１で、試料を被検者、例えば患者より採取する。試料は、例えば、上記に詳しく提供したどの組織又は生物学的体液も含んでよい。採取する試料の種類は、例えば、同定することが求められる生物学的状態に依存する場合がある。例えば、下記により詳しく記載するように、ＮＢＥＣ試料を入手して、ＢＣ及び／又はＣＯＰＤについて検査してよい。好ましい態様では、試料は、容易にアクセス可能な試料であり、例えば、非侵襲性又は軽度侵襲性の技術で入手し得るものである。そのような試料には、例えば、尿試料、血液試料、***試料、又はより好ましくは、唾液試料、頬内及び／又は鼻腔の上皮細胞試料が含まれる。
工程２０２では、（ｉ）転写因子と（ｉｉ）少なくとも１つの他の遺伝子の発現レベルについて、被検者より入手した試料を使用してアッセイする。例えば、上記に記載するような、発現レベルをアッセイするためのどの方法も使用してよい。好ましい態様では、例えば、米国特許出願番号１１／０７２，７００及び１１／１０３，３９７に記載のように、既知量の内部標準を含む試薬の標準化混合物を使用して発現レベルを測定する。
工程２０３では、発現レベルの数値をデータベースへ入れる。いくつかの態様において、データベースは、インターネット上でアクセスすることができる。いくつかの態様では、被検者に関する人口学情報を、採取試料に関する遺伝子発現測定値の結果とともに記録することができる。好ましくは、そのような情報は、同定情報とは別のデータベースに保存する。例えば、同定情報は、試料が研究所へ持ち込まれたらすぐに、試料及び人口学情報から分離することができる。好ましい態様において、データベースは、様々な発現測定値、例えば、異なる患者より得られる測定値、同じ又は異なる患者の経時的な（例えば、疾患の経過にわたる、及び／又は治療方式の経過にわたる）測定値の数値の収集を可能にする。好ましい態様において、これらのデータは、例えば、米国仮特許出願番号６０／６４６，１５７に教示されるように、ある種のＣＶ限界内で直接比較可能である。いくつかの態様において、このようなデータベースは、例えば下記に記載のように、臨床診断検査における遺伝子発現データとともに使用することができる。
工程２０４では、発現レベルが互いに相関するかしないかを識別するモデルを使用して、発現レベルを数学的に計算する。図２に例示されるように、いくつかの態様では、（ｉ）転写因子と（ｉｉ）他の遺伝子についてアッセイした発現レベルをデータベース２０３へ入れて、このデータベースからのデータをそのモデルで使用する。いくつかの態様では、（ｉ）転写因子と（ｉｉ）他の遺伝子についてアッセイした発現レベルをこのモデルで直接使用する。このモデルにより、（ｉ）が（ｉｉ）と相関するかしないかの識別が可能になる。被検者より入手される試料における相関性の不足が生物学的状態を示す可能性がある。なおいくつかの態様では、例えば、下記により詳しく考察するように、新たに同定されたバイオマーカーそのものを使用して、生物学的状態を同定することができる。
発現レベルが互いに相関するかしないかを識別するモデルは、どの手段によっても、例えば、生物統計学及び／又はバイオインフォマティクスの技術を使用して入手することができる。例えば、いくつかの態様では、複数の症例試料において転写因子と他の遺伝子の発現レベルをアッセイすること；複数の対照試料において転写因子と他の遺伝子の発現レベルをアッセイすること；及び、前記発現レベルを使用してモデルを計算することによって、モデルを入手した。
いくつかの態様では、二変量解析、多変量解析、遺伝子プログラミングソフトウェア解析、対数変換、ピアソン相関、ボンフェローニ補正法、フィッシャーのＺ変換検定、ｔ検定、両側検定、ＡＮＯＶＡ、及びダンカン検定より選択される少なくとも１つの技術を使用してモデルを計算する。モデルは、被検者の試行（training）セットを使用して導き、被検者の追加セットより得られる発現レベルを使用して評価することができて、試行セットにおける追加遺伝子の解析と追加セットにおけるバリデーションを介して、好適なモデルを精緻化することができる。追加の詳細を以下の実施例に提供する。
いくつかの態様において、モデルは、例えば、ＢＣを診断することについて下記に記載のように、転写因子と他の遺伝子の発現レベルの間の関係を含む。いくつかの態様において、関係は、比（例えば、対照の標的遺伝子の発現レベルに対して転写因子の発現レベルをプロットする回帰直線の勾配）、例えば、ＴＦ／ＴＧ又はＴＧ／ＴＦである。いくつかの態様では、試料より入手される発現レベルがその比と一致する（例えば、回帰直線に沿っている）場合、相関性が示され；試料より入手される発現レベルがその比と一致しない（例、回帰直線の有意に上方又は下方にある）場合、相関性の不足が示される。好ましい態様において、複数のＴＧのそれぞれのＴＧ／ＴＦ比は、回帰直線の比と一致しない。例えば、ＴＧ／ＴＦ比は、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約８０、又は少なくとも約１００のＴＧで一致しない。いくつかの態様において、ＴＧ／ＴＦ比は、約１５０未満、約２００未満、約３００未満、又は約５００未満のＴＧで回帰直線の比と一致しない。追加の詳細を以下の実施例に提供する。
好ましい態様では、高速コンピュータプログラムを使用して、多数の発現レベル値を（例えば、多数の線形及び非線形関数に従って）無作為なやり方で相互作用させることができる。これにより、（ａ）データに最適適合する数学規則の迅速な決定を可能にすること；及び（ｂ）様々な遺伝子について実験的に観察される機能への発現レベルの可能なスケーリングに関する情報を提供することができる（即ち、線形又は非線形の数学関数により特定遺伝子の発現レベルを他の遺伝子のそれへ支配的に関連付けられるかどうかに基づく）。この目的に使用することができるソフトウェアには、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩが含まれる。
工程２０５では、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）が相関するかしないか、及び／又は同定されるバイオマーカーのレベルに基づいて、診断の決定を行うことができる。診断の決定は、疾患状態の同定、該状態の進行の段階又は程度、及び／又は様々な治療への応答の可能性を含む場合がある。図２に例示されるように、診断に関する情報は、被検者、例えば臨床現場の患者へ伝えることができる。
癌関連状態及び／又は肺関連状態の診断
いくつかの態様において、本発明は、癌関連状態（例、ＢＣ）及び／又は肺関連状態（例、ＣＯＰＤ）を診断するための方法及び組成物を提供する。例えば、ＢＣは、転写因子とＢＣに関連した遺伝子との間の相関性の（対照と比較した）不足を同定することによって診断することができる。例えば、いくつかの態様は、被検者より入手した試料におけるＣＥＢＰＧ及び／又はＥ２Ｆ１の発現レベルをアッセイすること；試料中の少なくとも１つの他の遺伝子の発現レベルをアッセイすること（ここで他の遺伝子は、ＢＣに関連している）；及び、この発現レベルが互いに相関するかしないかを識別するモデルを使用して、発現レベルを数学的に計算することを含む。被検者より入手した試料における相関性の不足は、ＢＣ、ＢＣのリスク、ＢＣの程度（例、転移しているか又は転移していない）、及び／又は予後（例、特定の化学療法への応答の可能性及び／又は度合い）を示すことができる。いくつかの態様は、例えば、個々の腫瘍のために試料を取ることによって、個々の腫瘍の化学療法剤への抵抗性を予測するための方法を提供する。
いくつかの態様では、転写因子とＣＯＰＤに関連した遺伝子との間の相関性の（対照と比較した）不足を同定することによってＣＯＰＤを診断することができる。例えば、いくつかの態様は、被検者より入手した試料におけるＣＥＢＰＧ及び／又はＥ２Ｆ１の発現レベルをアッセイすること；試料中の少なくとも１つの他の遺伝子の発現レベルをアッセイすること（ここで他の遺伝子は、ＣＯＰＤに関連している）；及び、この発現レベルが互いに相関するかしないかを識別するモデルを使用して、発現レベルを数学的に計算することを含む。被検者より入手した試料における相関性の不足は、ＣＯＰＤ、ＣＯＰＤのリスク、ＣＯＰＤの程度、及び／又は予後（例、特定の療法への応答の可能性及び／又は度合い）を示すことができる。当業者は、本明細書に記載のアプローチを使用して、他の癌関連状態及び／又は他の肺関連状態も診断することができることを理解されよう。
いくつかの態様において、入手される試料は、気管支上皮細胞、例えば、ＮＢＥＣを含む。好ましい態様では、上記に記載のように、試料は、限定されないが、鼻腔上皮細胞、頬内上皮細胞、又は血液細胞のような、容易にアクセス可能な細胞を含む。いくつかの態様において、被検者は、喫煙者、例えば、重度の喫煙歴を有する個体である。
いくつかの態様において、他の遺伝子は、ＡＯ遺伝子及びＤＮＡＲ遺伝子より選択され、限定されないが、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、ＧＰＸ１、ＥＲＣＣ１、ＣＡＴ、ＧＳＴＺ１、及び／又はＥＲＣＣ２が含まれる。一般に、他の遺伝子は、対照試料においてＣＥＢＰＧ及び／又はＥ２Ｆ１により調節される。発現レベルは、当該技術分野で知られているどの方法によっても、例えば、上記に提供した技術のいずれによってもアッセイすることができる。好ましくは、本発明の方法は、ＢＣ及び／又はＣＯＰＤの早期検出を可能にして、予防の効果を高める。本明細書に記載の方法はまた、より高いリスク状態にある個体だけをＢＣ及び／又はＣＯＰＤの治験に含めることを促進し得て、その結果、そのような試験の費用効果を高めることができる。
いくつかの態様において、ＢＣ及び／又はそのリスクを同定するために使用するモデルは、ＣＥＢＰＧと１以上のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子（例えば、ＢＣＩのＮＢＥＣには高い発生率で存在しているが、ＮＢＣＩには存在していないか又は低い発生率で存在する１以上のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子）の発現レベルの間の関係に関わる。例えば、いくつかの態様では、上記に考察したように、ＴＧ／ＴＦの比を使用する。いくつかの態様では、それぞれのＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子とＣＥＢＰＧの相関性の不足が、ＢＣに対してより感受性である個体由来のＮＢＥＣの特徴になる。即ち、ＴＧとＣＥＢＰＧの相関性の不足により、ＢＣリスクの増加を示すことができる。
ＣＥＢＰＧは、ＮＢＥＣにおけるＡＯ及び／又はＤＮＡＲ保護を制御することに重要な役割を担う可能性があるが、それぞれの個体では、数十又は数百の異なるＤＮＡ配列変異のどの組合せも、ＣＥＢＰＧと他の（正常に調節される）遺伝子の間の相関性の減少の原因になり得る。好ましい態様では、この解析を介して、多くの異なる遺伝子と遺伝子内の領域の機能に影響を及ぼすリスク関連対立遺伝子を検出することができる。いくつかの態様では、一組の遺伝子のＴＧ／ＣＥＢＰＧ比により、機能的に重要な変異体のＢＣリスクに対する効果を定量化して、例えば、増加リスクのモデルを提供することができる。そのような態様では、ＮＢＣＩについて観測される回帰直線に関して高いか又は低い（ＴＧ／ＣＥＢＰＧ）比を示す個体に相関性の不足が関連する。
例えば、いくつかの態様では、ＣＥＢＰＧのｂＺｉｐ領域にある５０ｂｐの同一線上ストリングのいずれにおいても生じるリスク対立遺伝子がリスクを高める。各ヌクレオチドの稀な対立遺伝子の出現率は約０．００１未満であり得るが、これらの稀な対立遺伝子の１つが５０ｂｐの同一線上ストリング中に生じる見込みは、５０ｘ約０．００１又は約０．０５であり、これは、重度喫煙者の間でのＢＣの測定リスクと一致する。本発明のいくつかの態様は、例えば、ＴＧ／ＣＥＢＰＧの比を使用して、このリスクの同定を可能にする。このようなモデルの決定及び応用の追加の詳細を以下の実施例に提供する。
いくつかの態様において、本発明は、生物学的状態を診断するためのキット、例えば、癌関連状態（例、ＢＣ）及び／又は肺関連状態（例、ＣＯＰＤ）を同定するためのキットを提供する。１つの態様において、そのようなキットは、転写因子の競合鋳型と少なくとも１つの他の遺伝子の競合鋳型を含んでなる標準化混合物を含み、ここで競合鋳型は、互いに対して既知の濃度で存在する。そのようなキットを使用して、転写因子及び／又は他の遺伝子の発現レベルを決定することができて、発現レベルを計算して、該状態を診断することができる。
例えば、癌関連状態及び／又は肺関連状態を診断するキットの１つの態様において、標準化混合物は、ＣＥＰＢＧの競合鋳型、例えば、配列番号１からなる核酸配列±約１００塩基を含んでなる競合鋳型；及び、少なくとも１つの他の遺伝子の競合鋳型を含み得る（他の遺伝子は、癌関連状態及び／又は肺関連状態に関連している）。癌関連状態及び／又は肺関連状態を診断するキットの別の態様において、標準化混合物は、Ｅ２Ｆ１の競合鋳型、例えば、配列番号２からなる核酸配列±約１００塩基を含んでなる競合鋳型；及び、少なくとも１つの他の遺伝子の競合鋳型を含み得る（他の遺伝子は、前記癌関連状態及び／又は肺関連状態に関連している）。他の遺伝子は、ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子、例えば、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、ＧＰＸ１、ＥＲＣＣ１、ＣＡＴ、ＧＳＴＺ１、及びＥＲＣＣ２より選択することができる。例えば、いくつかの特定の態様において、他の遺伝子の競合鋳型は、配列番号３〜７より選択される少なくとも１つの配列からなる核酸配列±約１００塩基を含み得る。好ましい態様では、キットを使用して、ＢＣ及び／又はＣＯＰＤのリスクを検査することができる。
いくつかの態様において、標準化混合物は、例えば、転写因子（試料由来）とその競合鋳型をともに増幅するためのプライマー対、及び／又は他の遺伝子（試料由来）とその競合鋳型をともに増幅するためのプライマー対をさらに含み得る。いくつかの特定の態様において、例えば、プライマー対は、表１に収載するプライマー対より選択することができる。
いくつかの態様において、本明細書に記載のキット及び方法は、従来法に比較して、ＢＣ及び／又はＣＯＰＤのリスク状態にある人々のより正確な同定を提供する。ＢＣのリスク状態の人々のより正確な同定と、そのような個体を化学予防及び／又は早期検出の試験に含めることにより、効果の改善をもたらすことができる。当業者は、本明細書に提供する方法が、他の癌関連状態及び／又は他の肺関連状態、例えば、本明細書に提供する他の癌関連状態及び肺関連状態の診断に適用し得ることを理解されよう。
Ｂ．多型アプローチ
なお別の側面において、本発明は、同定された多型を使用して生物学的状態を診断するための方法及び組成物に関する。好ましい態様において、同定された多型は、対照に比較して１以上のヌクレオチドの違いを含有するＤＮＡの特定領域からなる。ヌクレオチドの違いは、被検者ごとに異なる場合がある。しかしながら、その領域内の１以上の違いは、所与の生物学的状態を示唆する。
癌関連状態及び／又は肺関連状態の診断
例えば、いくつかの態様は、被検者より試料を入手すること（ここで試料は、関連の多型に対応する核酸領域を含む）、その領域を対照に見出される配列からなる核酸配列と比較すること、及び核酸の違いを同定することを含んでなる、癌関連状態又は肺関連状態を被検者において同定する方法を提供する。いくつかの態様において、対照からの配列は、例えば、複数の健常個体より入手されるコンセンサス配列である。好ましい態様において、入手する試料は、容易にアクセス可能な試料であり、例えば、非侵襲性又は軽度侵襲性の技術で入手し得るものである。そのような試料には、例えば、尿試料、血液試料、***試料、又はより好ましくは、唾液試料、頬内及び／又は鼻腔の上皮細胞試料が含まれる。例えば、同定される多型（複数）は、末梢血液及び／又は頬内スメア及び／又は鼻腔上皮細胞のような、より容易にアクセス可能な患者試料を使用する診断検査を可能にし得る。
いくつかの態様において、核酸領域は、ＣＥＢＰＧの５’調節領域であり；この領域をＣＥＢＰＧの５’調節領域±約１０、±約５０、±約１００、±約１５０、±約２００、±約５００、±約８００、又は±約１０００の塩基からなる（対照の）核酸配列と比較し、ここでヌクレオチドの違いは、癌又は肺関連の状態を示す。
いくつかの態様において、核酸領域は、ＣＥＢＰＧの３’非翻訳領域であり；この領域をＣＥＢＰＧの３’非翻訳領域±約１０、±約５０、±約１００、±約１５０、±約２００、±約５００、±約８００、又は±約１０００の塩基からなる（対照の）核酸配列と比較し、ここでヌクレオチドの違いは、癌又は肺関連の状態を示す。
いくつかの態様において、核酸領域は、ＣＥＢＰＧのｂＺｉｐ領域であり；この領域をＣＥＢＰＧのｂＺｉｐ領域±約１０、±約５０、±約１００、±約１５０、±約２００、±約５００、±約８００、又は±約１０００の塩基からなる（対照の）核酸配列と比較し、ここでヌクレオチドの違いは、癌又は肺関連の状態を示す。
いくつかの態様において、核酸領域は、ＣＥＢＰＧ認識部位であり；この領域をＣＥＢＰＧ認識部位±約１０、±約５０、±約１００、±約１５０、±約２００、±約５００、±約８００、又は±約１０００の塩基からなる（対照の）核酸配列と比較し、ここでヌクレオチドの違いは、癌又は肺関連の状態を示す。例えば、いくつかの態様において、ＣＥＢＰＧ認識部位は、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＳＯＤ１、ＧＳＴＰ１、及び／又はＧＰＸ１のＣＥＢＰＧ認識部位である。
いくつかの態様において、比較は、例えば、当該技術分野で知られている方法及び／又は本明細書に提供する方法を使用して、核酸領域中の少なくとも１つの塩基を同定することを伴う。例えば、いくつかの態様では、対照より入手する配列（又はその相補配列）からなるプローブと試料を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件の下で接触させること；及び、ハイブリダイゼーションが起こるか起こらないかを検出することによって、試料より入手する領域と対照より入手する配列を比較する。ハイブリダイゼーションの特異性は、当該技術分野で知られているように、ハイブリダイゼーション条件の様々な度合いのストリンジェンシーにより評価することができる。好適な条件の下で、ハイブリダイゼーションは、試料配列が対照配列と同じである、十分に同じである、有意に同じである、又は実質的に同じであることを示し、状態の不足又はその低いリスクを示すことができる。低下したハイブリダイゼーションは、試料配列が対照配列（プローブ）からは異なる、十分に異なる、有意に異なる、又は実質的に異なることを示し、その状態又はそのリスクを示す。さらに、適合オリゴヌクレオチドプローブを完成させるミスマッチの比較を使用して、結合の特異性を決定することができる。いくつかの態様において、癌関連状態は、気管支癌、そのリスク、又は化学療法剤への応答性である。いくつかの態様において、肺関連状態は、ＣＯＰＤ又はそのリスクである。
いくつかの態様において、ヌクレオチドの違いは、一塩基多型である。いくつかの態様において、ヌクレオチドの違いは、領域内で連続的に、又は様々な位置での１より多い塩基対変化（例えば、領域内の２以上のＳＮＰ）を含む。例えば、ヌクレオチドの違いは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、又は少なくとも約５０のヌクレオチドの違いを伴う可能性がある。いくつかの態様において、ヌクレオチドの違いは、約８０未満、約１００未満、約１５０未満、約２００未満、約３００未満、約５００未満のヌクレオチドの違いを伴う。
なお他の態様では、１より多い領域を対照のそれと比較して、状態（又はそのリスク又は予後）を診断することができる。例えば、癌及び／又は肺関連状態を同定する場合、該方法は、ＣＥＢＰＧの５’調節領域、ＣＥＢＰＧの３’非翻訳領域；ＣＥＢＰＧのｂＺｉｐコーディング領域；及び、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＳＯＤ１、ＧＳＴＰ１、及び／又はＧＰＸ１のＣＥＰＢＧ認識部位より選択される２以上の核酸領域におけるヌクレオチドの違いを同定することを含み得る。
いくつかの態様は、関連核酸配列からなるプローブを、癌及び／又は肺関連状態を示唆する多型を同定することに提供する。４つのそのようなプローブの例には、（ｉ）ＣＥＢＰＧの５’調節領域±約１０、±約５０、±約１００、±約１５０、±約２００、±約５００、±約８００、又は±約１０００の塩基からなる核酸配列を含んでなるプローブ；（ｉｉ）ＣＥＢＰＧの３’非翻訳領域±約１０、±約５０、±約１００、±約１５０、±約２００、±約５００、±約８００、又は±約１０００の塩基からなる核酸配列を含んでなるプローブ；（ｉｉｉ）ＣＥＢＰＧのｂＺｉｐ領域±約１０、±約５０、±約１００、±約１５０、±約２００、±約５００、±約８００、又は±約１０００の塩基からなる核酸配列を含んでなるプローブ；及び（ｉｖ）ＣＥＢＰＧ認識部位±約１０、±約５０、±約１００、±約１５０、±約２００、±約５００、±約８００、又は±約１０００の塩基からなる核酸配列を含んでなるプローブが含まれる。１以上のそのようなプローブは、支持体（例えば、アレイ中の）へ固定して、及び／又は、癌及び／又は肺関連状態（例、ＢＣ及び／又はＣＯＰＤ）、そのリスク、治療への予測される応答、等を同定することに使用のキットにおいて提供することができる。
ＩＩＩ．治療の方法及び組成物
本発明のなお別の側面は、例えば、転写因子と遺伝子の間の相関性の不足を「補う」薬剤を提供することによって、生物学的状態を治療するための方法及び組成物に関する。例えば、いくつかの態様は、同定された相関性の不足；及び／又は同定されたバイオマーカー又はバイオマーカー（複数）の組合せに基づいて治療剤を投与することを含む。一般に、本発明は、動物被検者の治療のための方法、医薬組成物、及びキットを提供する。本明細書に使用する用語「動物被検者」には、ヒトだけでなく他の哺乳動物も含まれる。用語「治療剤」は、動物被検者を治療するために使用し得るあらゆる薬剤を意味してよい。
本明細書に使用する用語「治療すること」には、治療利益及び／又は予防利益を達成することが含まれる。治療利益とは、治療される根源的な障害の完治又は改善を意味する。例えば、ＢＣ患者では、治療利益には、根源的な癌の完治又は改善が含まれる。また、治療利益は、根源的な障害に関連した生理学的症状の１以上の完治又は改善で達成されるので、根源的な障害に患者がまだ罹患している可能性があるという事実にもかかわらず、患者において改善が改善される。例えば、ＢＣに関して言えば、治療は、空咳、呼吸困難、喀血、及び／又は閉塞性肺炎のような、ＢＣに伴う他の障害及び／又は不快症状に関して患者において改善が観察されるときに、治療利益を提供することができる。予防利益のためには、疾患状態、例えばＢＣ及び／又はＣＯＰＤを発症するリスク状態の患者へ、又はそのような状態の生理学的症状の１以上が報告されている患者へ、たとえ診断が下されていないとしても、治療薬を投与してよい。
癌関連状態及び／又は肺関連状態の治療
いくつかの態様において、本発明は、癌関連状態（例、ＢＣ）及び／又は肺関連状態（例、ＣＯＰＤ）を治療するための方法及び組成物を提供する。上記に示したように、本発明の方法及び組成物は、診断の決定をするときに使用し得て、適用される場合に治療薬を投与することができる。例えば、癌関連及び／又は肺関連状態を治療するときに投与することができる治療薬の例には、限定されないが、シスプラチン、アルキル化剤（ブスルファン、シスプラチン、マイトマイシンＣ、及びカルボプラチンのような）；有糸***阻害剤（コルヒチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、及びドセタキセルのような）；トポＩ阻害剤（カンプトテシン及びトポテカンのような）；トポＩＩ阻害剤（ドキソルビシン及びエトポシドのような）；ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗薬（５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、及びメトトレキセートのような）；ＤＮＡ代謝拮抗薬（５−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン、ａｒａ−Ｃ、ヒドロキシ尿素、及びチオグアニンのような）；ＥＧＦＲ阻害剤（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）及びＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）のような）；プロテオソーム阻害剤；抗体（カンパス［campath］、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシツズマブ）、又はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）のような）が含まれる。使用し得る他の治療剤には、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ビンクリスチン、ミトグアゾン、エピルビシン、アクラルビシン、ブレオマイシン、ミトザントロン、エリプチニウム、フルダラビン、オクトレオチド、レチノール酸、タモキシフェン、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）、及びアラノシンが含まれる。例えば、Ｕ．Ｓ．２００５／０１３７２１３を参照のこと。例えば、癌関連及び／又は肺関連状態を治療するときに投与し得る治療薬の例にはまた、限定されないが、エルロチニブ、カネルチニブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、トラスツズマブ、イマチニブ、ＳＵｌ１２７４、ＰＨＡ６６５７５２、ＡＰ２３５７３、ＲＡＤＯＯｌ、ＣＣＩ−７７９、ベバシズマブ、バタラニブ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、フラボピリドール、オブリメルセン、ＶＥＧＦ阻害剤、セレン、１５−ＰＧＤＨ及び／又は１５−ＰＧＤＨアクチベータ（例、インドメタシンのようなＮＳＡＩＤ）、Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤（例、デグエリン及びミオイノシトール）、ＰＰＡＲ−γ及び／又はＰＰＡＲ−γアクチベータ（例、ｐ２１アップレギュレータ、Ｅ−カドヘリンアップレギュレータ、ゲルゾリンアップレギュレータ、サイクリンＤ及びＥダウンレギュレータ、ＭＵＣ１ダウンレギュレータ、ＭＭＰ２ダウンレギュレータ、及びα５−インテグリンダウンレギュレータ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ−１阻害剤、ＨＤＡＣ及びメチルトランスフェラーゼ阻害剤、プロスタグランジンＥ２阻害剤、プロスタサイクリン及び／又はプロスタサイクリンアクチベータ、５−ＬＯＸ阻害剤、ＣＯＸ阻害剤、ＬＯＸ−ＣＯＸ阻害剤、１２−ＬＯＸ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ変調剤、シクロオキシゲナーゼ−１変調剤、抗酸化薬、カロチノイド、レチノイド（エトレチネート、イソトレチノイン、β−カロテン、フェンレチニド、アネソールジチオチオン、９−ｃｉｓ−レチノール酸、レチノール、ブデソニド、α−トコフェロール、レチニルパルミテートのような）、等が含まれる。例えば、Hahn et al., Hematol Oncol Clin N Am 19: 343-367 (2005) 及び Hirsch et al, J. Clinical Oncology 23(14): 3186-3179 (2005) を参照のこと。また、例えば、Cohen et al., Cancer Control. 10: 315-324 (2003) 及び Hong et al Science 278: 1073-1077 (1997) を参照のこと。
所与の設計及び／又は理論に限定されずに言えば、ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子転写調節のよりよい理解は、改善された化学予防及び化学療法の医薬品、並びに応答を予測する付随のバイオマーカーの設計を可能にし得る。両群の治療薬剤の性能は、ＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子の機能により影響を受ける可能性がある。ＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子のＣＥＢＰＧによる調節に標的指向する医薬品を開発することは、癌予防、癌治療、並びに炎症及び／又は免疫が含まれる、多くの健康分野において生産的な方途になり得る。
同定された多型を使用して、治療薬剤、例えば、癌関連及び／又は肺関連状態を治療及び／又は予防するための治療薬剤を開発することもできる。例えば、ヘテロ二量体タンパク質及び／又はＤＮＡ認識部位への転写因子の結合に干渉するか又はそれを増強することによって治療効果を有するペプチド分子を開発することができる。例えば、Vassilev et al, Science (303): 844-848 (2004) を参照のこと。そのような同定される治療薬剤の１以上を、適用される場合に、例えば、単独で、又は他の既知の治療薬剤（例、例えば、上記に提供したような、癌関連及び／又は肺関連状態を治療することで知られる他の治療薬剤）と組み合わせて投与することができる。
実施例１
ＮＢＣＩ及びＢＣＩ試料の採取
正常気管支上皮細胞（ＮＢＥＣ）及び末梢血液の試料を患者より入手し得て、各試料の一部を本明細書に記載の実施例において使用し得る。個体は、診断用気管支鏡検査法を受けている患者の間から登録することができる。気管支鏡検査法の適応症には、吐血混じりの空咳、慢性の咳、抗生物質抵抗性の肺炎、及び異物を除去する必要性が含まれる。これら患者の何人かは気管支癌（ＢＣＩ）と診断される場合があるが、他の患者は、非新生物の状態（ＮＢＣＩ）を有する場合がある。これらの患者の年齢は、ほぼ２０歳〜９０歳に及んでよく、ほとんどの参加者は、約６０歳と約７５歳の間である。先に記載の方法に従って、ＮＢＥＣ試料を入手する。例えば、Benhamou S. et al., Carcinogenesis, 8: 1343-1350 (2002) を参照のこと。
各患者より、例えば、先に記載のように（Willey et al, 1997; Crawford et al, 2000）、ＮＢＥＣ試料と２０ｍｌの末梢血液を採取して処理することができる。三次気管支付近の正常に見える粘膜よりほぼ１０〜１５ブラシの生検を入手し得る。患者が肺炎、外傷、又はＢＣのような局部の病理状態を有するならば、ブラシは、反対側より取ってよい。
それぞれの気管支鏡検査のブラシ生検の後で、このブラシをほぼ３ｍｌの氷冷生理食塩水中で旋回させて、細胞を追い出して回収することができる。各ブラシでほぼ５００，０００〜百万個の細胞を入手し得る。従って、１０回のブラシでは、約５００〜１，０００万個の細胞を得ることができる。３ｍｌの氷冷生理食塩水中のこれらの細胞をＲＮＡ及びタンパク質の抽出とＩＨＣ及びＦＩＳＨのスライドの作製のために分割することができる。ほぼ５百万個の細胞を核抽出物のタンパク抽出に使用することができる（例えば、Dignam et al, Nucleic Acid Research 11 : 1475-1489 (1983) を参照のこと）。これにより、ＥＭＳＡ及びウェスタン・ハイブリダイゼーション分析用にほぼ１００μｇの核抽出物を得ることができる。ほぼ百万個の細胞を発現レベル測定用のＲＮＡ抽出に使用することができる。
２０ｍｌの末梢血液は、ほぼ１〜２ｘ１０８個の白血球細胞を含有する場合がある。これらの細胞のほとんどを使用して、下記に記載の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験用の核抽出物を産生することができる。約１〜２百万個の細胞を発現レベル測定用のＲＮＡ抽出に使用し得て、別の約１〜２百万個を配列決定試験用のＤＮＡ抽出に使用し得る。
頬内及び鼻腔の上皮試料もＢＣＩ及びＮＢＣＩより採取し得て、ＳＮＰ用の気管支鏡検査ブラシ試料及び末梢血液試料を提供する。頬内及び鼻腔の上皮試料は、口又は鼻の内側のブラッシングによって入手し得る。ＢＣＩ及びＮＢＣＩ由来の頬内上皮細胞試料は、上記に提供したように、ＮＢＥＣ試料と同じやり方で処理することができる。
実施例２
（ａ）ＢＣの転写因子バイオマーカーとしてのＣＥＢＰＧ及びＥ２Ｆ１の同定
ＧＳＴＰ１／ＧＰＸ１、ＣＡＴ／ＧＰＸ３、及びＧＰＸ３／ＳＯＤ１に共通のＴＦ認識部位を配列解析（Genomatix Software GmbH, Munich, Germany, http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/）（Quandt K, Freeh K, Karas H, Wingender E, and Werner T, NAR, 23, 4878-4884. 1995）を介して同定して、１１のＴＦの部位を得る。
標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲＴＭ試薬（「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）」（Shimkets, R. A. 監修）（ヒュマナプレス社、ニュージャージー州トトワ、2004）13-41中 Willey JC, et al）を、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＢＰＥ、ＣＥＢＰＧ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５、Ｅ２Ｆ６、ＥＶＩ１、及びＰＡＸ５が含まれる、これらＴＦの１０に最適化する。多数のＮＢＥＣ試料の間で低くて不変のレベルで発現された４つのＴＦについては、さらに評価しない。残る６つ、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＢＰＧ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ６、及びＥＶＩについて、１０のＡＯと６のＤＮＡＲ遺伝子の拡張群との相関性を評価する。これら遺伝子の受入れ番号を、解析する各遺伝子の競合鋳型配列、増幅用のフォワード及びリバースプライマー対の配列、プライマーがハイブリダイズする遺伝子上の位置、及びＰＣＲ増幅産物のサイズとともに以下の表１に提供する。
上記に詳述したように、診断用気管支鏡検査の間の気管支ブラシ生検によってＮＢＥＣ試料を得る。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲＴＭを使用して、実質的に多重複合（multiplexed）した転写物の存在量（ＶＭＴＡ）のデータ（Workman J and Mark H, Spectroscopy, 19, 1-3, 2004）を作成する。独立した実験室でのこの方法の緻密なバリデーションが含まれる、この方法の詳細が最近公表された。「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）」（Shimkets, R. A. 監修）（ヒュマナプレス社、ニュージャージー州トトワ、2004）13-41中 Willey JC, et al。簡潔に言えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素とオリゴｄＴプライマーを先に記載のように使用して、ＮＢＥＣより抽出した全ｍＲＮＡ試料を逆転写させる。Benhamou S. et al., Carcinogenesis, 8: 1343-1350 (2002)。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲＴＭでは、内部標準の標準化混合物（ＳＭＩＳＴＭ）内の各遺伝子の内部標準を各測定に含める。測定する遺伝子のそれぞれのＳｔａＲＴ−ＰＣＲＴＭ試薬（プライマーと内部標準の標準化混合物（ＳＭＩＳＴＭ）が含まれる）を先に記載の方法に従って調製する（上記に考察したように、競合鋳型とプライマー配列の情報を表１に提供する）。
２４のＮＢＣＩと２５のＢＣＩが含まれる４９の個体からのＮＢＥＣ試料において、上記２２遺伝子のＶＭＴＡ値を測定する。ＮＢＥＣ試料を提供する患者の人口学データを表２に提供して、入手したＶＭＴＡデータを表３に提供する。内部標準は、試料中の阻害剤が含まれる、ＰＣＲの間の変動のいくつかの既知の源を制御する。例えば、試料１４７においてＥ２Ｆ１測定値を得ることが可能でなかった主たる理由は、阻害剤の存在であった（表３を参照のこと）。
ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子と推定調節ＴＦの正規化ＶＭＴＡ値に対してピアソン解析を行う。データを表４に提供する。ＮＢＣＩ試料において、ＣＥＢＰＧ ＴＦは、１６のＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子のうち８つ、具体的には、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、ＧＰＸ１、ＥＲＣＣ１、ＣＡＴ、及びＥＲＣＣ２と有意に（ｐ＜０．０１）相関する。対照的に、ＢＣＩ試料において、ＣＥＢＰＧは、本実施例において検査したＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子のいずれとも相関しない。各ＶＭＴＡ値の年齢との関係の解析はピアソン相関で、性別とはｔ検定により、そして喫煙歴とはＡＮＯＶＡに続くダンカン検定によって評価する。すべての統計学的検定は両側検定であり、ＳＡＳバージョン８．０（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ノースカロライナ州キャリー）を使用して実施する。
図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）のそれぞれの５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１との相関性を例示する。各パネルは、５つの遺伝子のそれぞれに関する１つのＴＦの相関係数（ｒ値）を提示する。相関性は、対数変換に続くピアソン相関によって判定する。この変換は、個体間での各遺伝子の発現が広い範囲であるために必要になり得る。図３では、それぞれの有意な相関性のｐ値をバーの上に提供する。有意水準は、多重比較、具体的には、６つのＴＦのそれぞれのＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子のそれぞれへの比較についてのボンフェローニ補正に従って（ｐ＜０．０１）として定義する。相関係数の対の間の有意差の比較をフィッシャーのＺ変換によって行う。Workman J and Mark H, Spectroscopy, 19: 1-3 (2004)。
３（ｂ）に提示するＣＥＢＰＧでは、ＮＢＣＩとＢＣＩの間のｒ値の差がそれぞれの相関遺伝子について有意であるか又はほとんど有意であり、各比較についてのｐ値をバーの対応対の下に提供する。図３ｂが例示するように、ＣＥＢＰＧとＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、及びＳＯＤ１のそれぞれの間の相関性は、ＮＢＣＩに比較してＢＣＩにおいて有意に低く、その差は、ＧＰＸ１でほとんど有意であった。
ＮＢＣＩでは、ピアソン相関解析からのｒ２値に基づけば、ＸＲＣＣ１（６９％）、ＥＲＣＣ５（６２％）、ＧＳＴＰ１（５５％）、ＳＯＤ１（４４％）、及びＧＰＸ１（５２％）の発現における変動のほとんどがＣＥＢＰＧで説明される。残る変動のいくらかを説明するのはＥ２Ｆ１である。例えば、ＮＢＣＩでは、Ｅ２Ｆ１がＧＳＴＰ１と相関する（図３ｃ）が、その相関性は、ＢＣＩではより低い。しかしながら、ＮＢＣＩとＢＣＩの間の相関性の差は、有意でない。さらに、全部で４９のＮＢＣＩ及びＢＣＩからの試料を単一の群として評価したとき、Ｅ２Ｆ１は、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、及びＳＯＤ１と有意に相関する（表４を参照のこと）。本実施例において検査した他のＴＦのいずれも、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１と相関しない（図３ａ、ｄ、ｅ、ｆ）。
図３（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩについて散布図として提示する、図３ｂからのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。ＮＢＣＩ又はＢＣＩにおけるＣＥＢＰＧとＸＲＣＣ１の間の関係の散布図は、他の４つの遺伝子（ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、及びＧＰＸ１）を代表する。ＮＢＣＩ、ＢＣＩ、又は組合せ群において、ＣＥＢＰＧ、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、及びＧＰＸ１は、年齢、性別、又は喫煙歴と有意には相関しない。
（ｂ）ＣＥＢＰＧをＢＣの転写因子バイオマーカーとして同定する追加データ
１６の選択したＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の発現レベルは、１２のＮＢＣＩの二変量解析では相関するが、１５のＢＣＩでは相関しないことがわかる。ＮＢＣＩ群とＢＣＩ群を年齢、性別、喫煙歴、及び疾患状態で厳密に適合させて、本実施例のスタディ２を含む。どの試験でも、多数のＡＯ、ＤＮＡＲ、ＸＭＥ、細胞周期、分化、アポトーシス、及び転写因子の遺伝子についての転写物存在量の数値を二変量解析し、癌及び非癌の個体（例、非ＢＣ対ＢＣ個体）の群で結果を比較して、候補遺伝子を同定することができる。
相関する遺伝子をＴＦ認識部位解析へ処する。具体的には、Ｇｅｎｏｍａｔｉｘソフトウェア・パッケージからのＥｌ Ｄｏｒａｄｏ（Ｂｕｉｌｄ ３５）プログラムを使用して、１６のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子のそれぞれの調節領域においてＴＦ認識部位を捜索する。はじめに、このソフトウェアを使用して、ゲノム内のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子を定位して各遺伝子のプロモーター領域の１１０１塩基対（転写開始部位の上流にある１０００塩基対とその中への１００塩基対）を確定する（Genomatix Software GmbH, Munich, Germany, http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/）。次いで、Ｅｌ Ｄｏｒａｄｏプログラムより入手した１１０１塩基対の配列を、Ｍａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒ バージョン４．２プログラム（Genomatix Software GmbH, Munich, Germany, http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/）を使用する推定ＴＦ認識部位同定のための標的配列として使用する。使用する変数は、標準（０．７５）コア類似性であり、最適化したマトリックス類似性である。相関するＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子のそれぞれにおいて同定したＴＦ認識部位は、ＣＥＢＰファミリー、Ｅ２Ｆファミリー、ＥＶＩ１、及びＰＡＸ５に含まれる。
これらファミリーのそれぞれにおけるＴＦのそれぞれのためにＳｔａＲＴ−ＰＣＲＴＭ試薬を調製する。これら標的遺伝子間で共有される認識部位を有するＴＦのそれぞれについてのＶＭＴＡデータを、１２のＮＢＣＩと１５のＢＣＩのＮＢＥＣ試料より採取する。評価した１１のＴＦの中で、ＣＥＢＰＧ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ６、及びＥＶＩ１を含む８つがＮＢＥＣにおいて発現されている。
ＮＢＣＩにおける標的遺伝子との相関性とこの相関性のＢＣＩにおける喪失のパターンを共有するＴＦを同定する。評価した８つの中でこの特性を有したＴＦは、ＣＥＢＰＧである。８つのＴＦのそれぞれと１６のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子のそれぞれについて、追加の１２のＮＢＣＩと１３のＢＣＩにおいてアッセイして、ＣＥＢＰＧがＮＢＣＩにおける１０のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の調節と、ＢＣＩにおける相関性の喪失の原因であるかどうかを検査することができる。この１２のＮＢＣＩと１３のＢＣＩがスタディ３を含む。
スタディ２及び３において、２４のＮＢＣＩは５５歳の平均年齢を有し、一方２５のＢＣＩは６８歳の平均年齢を有した。ＢＣＩは男性１８名、女性７名であり、ＮＢＣＩでは男性１２名、女性１２名であった。ＣＡＲＡＴ研究（例えば、Bach et al, J Natl Cancer Inst. 95: 470 (2003) を参照のこと）の一部として収集した人口学情報より、喫煙歴、年齢、及び性別に基づいてＢＣリスクを予測するアルゴリズムを開発した。このアルゴリズムに基づけば、ＮＢＣＩの間での平均計算ＢＣリスクは、２．２％（１〜１５％の範囲）であり、ＢＣＩの間での平均計算リスクは６．８％（１〜１５％の範囲）である。このように、スタディ２及び３での２５名のＢＣＩの間でのＢＣ発症率は１００％であるが、同じ年齢、性別、及び喫煙歴を有する一般集団における個体間でのＢＣ発症率は、６．８％にすぎない。表面上は、喫煙によりもたらされる酸化体とＤＮＡ傷害ストレスに抗する遺伝的に決定された低い防御に基づいて、２５名のＢＣＩが選択される可能性がある。
結果として、ＣＥＢＰＧは、ａ）ＮＢＣＩにおいて相関した１０の遺伝子のそれぞれと相関する、ｂ）ＢＣＩではその１０の遺伝子と相関しない、そしてｃ）ＮＢＣＩでもＢＣＩでも相関しなかった６つの遺伝子と相関しない、と予測することができる。さらに、ｄ）１０のＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子と相関しないと評価された他の６つのＴＦのそれぞれは、再びこのパターンを明示すると予測することができる。
結果
上記予測のそれぞれをスタディ３からのＶＭＴＡデータの盲検解析において確認して、スタディ２及び３からのＶＭＴＡデータを組み合わせるとき、さらに確認する。スタディ２及び３から組み合わせたデータを表５〜８に提示する。上記予測を裏付けるデータは、以下の通りである：
ａ）ＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子のそれぞれとＣＥＢＰＧの二変量解析では、ＮＢＣＩにおける平均相関係数と標準偏差が０．６９＋／−０．１０であり、平均Ｐ値は０．００３である（表５）。ＮＢＣＩでのＣＥＢＰＧとＸＲＣＣ１の間の二変量解析の例を図４ａに提示する。
ｂ）ＢＣＩにおける１０のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子とＣＥＢＰＧの解析では、表５にまた示すように、相関係数が０．２３＋／−０．１３であり、平均Ｐ値は０．３６である。ＢＣＩにおけるＸＲＣＣ１とＣＥＢＰＧの二変量プロットを図４ｂに示す。
ｃ）スタディ２で相関しない６つの遺伝子のそれぞれとＣＥＢＰＧの二変量解析では、スタディ３でもＣＥＢＰＧとの相関性がなく、組み合わせたデータを表６に提示する。
ｄ）二変量解析では、７つの他のＴＦ（ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＥＶＩ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ６、及びＭＹＣが含まれる）のいずれも、ＣＥＢＰＧで観測されたパターン（即ち、ＮＢＣＩでは１０のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子との有意な相関性、そしてＢＣＩでは相関性なし）を明示しない。これらの知見は、表７に提示する、１０のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子のそれぞれとＣＥＢＰＢについてのＶＭＴＡデータの二変量解析からの結果により表される。図５は、ＮＢＣＩ又はＢＣＩのいずれでも、ＸＲＣＣ１とＣＥＢＰＢの相関性が不足していることの例を例示する。
ｅ）年齢、性別、及び最近又は累積の喫煙歴に対する遺伝子のそれぞれの発現レベルの二変量解析は、相関性を明らかにしない。従って、本試験に含まれるＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の調節に喫煙が影響を及ぼすことの証拠は、ほとんど又はまったくない。このことは、制御することが困難であり得る潜在的に強力で、混乱を招く変数を除去することができるので、重要である。
ＢＣの転写因子バイオマーカーとしてのＥ２Ｆ１に関する追加データ
評価した８つのＴＦの中で、１０のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子と有意に相関する唯一のＴＦは、ＣＥＢＰＧを除けば、Ｅ２Ｆ１である。１０の遺伝子のそれぞれとＥ２Ｆ１の二変量解析からの結果を表８に提示する。ＣＥＢＰＧについて表５に提示した結果と比較した違いは、ａ）ＮＢＣＩにおけるＥ２Ｆ１と１０の遺伝子それぞれの間の二変量解析の平均相関係数（０．４９＋／−０．１１）が、ＣＥＢＰＧについて観測されるものより低いこと、ｂ）ＢＣＩにおける１０の遺伝子とＥ２Ｆ１の解析についての平均相関係数が０．４６＋／−０．１１であること（これは、ＮＢＣＩに比較して有意に低くはない）である。これらの結果は、Ｅ２Ｆ１が１０のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の調節に貢献すること、そしてＮＢＣＩに比較してＢＣＩでは、Ｅ２Ｆ１が１０の遺伝子間の相関性の減少に役割を担わない可能性があることを示唆する。
実施例３
ＮＢＣＩをＢＣＩより識別するモデルの同定
ＮＢＣＩをＢＣＩより識別するモデルを、個体の訓練セットからのＶＭＴＡデータの多変量解析と遺伝子プログラミングソフトウェア解析より導く。年齢、性別、及び喫煙歴を適合させた追加の２５のＮＣＢＩと２５のＢＣＩの検査セットより入手されるＶＭＴＡデータを使用して、これらのモデルを評価する。訓練セットにおける追加遺伝子の解析と追加セットにおけるバリデーションを介して、好適なモデルを精緻化する。
可能である場合、各遺伝子の同一３検体の発現レベル測定を実施する。すべての検定は、ＮＢＣＩ群単独、ＢＣＩ群単独、及び組合せ群で実施することができる。スチュ−デントのｔ検定を実施して、各遺伝子についてのＮＢＥＣのＮＢＣＩ及びＢＣＩからの統計学的有意差を同定する。統計学的有意差は、ｐ＜０．０５に設定する。ＳＡＳバージョン６．１１（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ノースカロライナ州キャリー）を使用して、すべての統計解析を実施することができる。
遺伝子発現レベルにおける統計学的に有意な個体間変異を確かめるために、一因子ＡＮＯＶＡを実施する。ピアソン相関検定を使用して、遺伝子の対の間の有意な二変量相関性を同定する。それぞれのＢＣＩの各遺伝子のＴＧ／ＣＥＢＰＧ比を、ＮＢＣＩについて確定した信頼限界に関して、ピアソン相関検定により評価する。ＮＢＣＩからのＶＭＴＡデータの二変量解析からの回帰直線に基づいて、カットオフ値を確定する。このモデルについて、個体がＮＢＣＩ又はＢＣＩ群のいずれにあるかを判定するときの精度を盲検試験で評価する。
全体のコンセプトは、それぞれのＡＯ又はＤＮＡＲ遺伝子とＣＥＢＰＧの相関性の不足は、ＢＣのリスク状態にある個体からのＮＢＥＣの特徴である、ということである。ＮＢＣＩについて観測される回帰直線に関して高いか又は低い（ＴＧ／ＣＥＢＰＧ）比は、相関性の不足と、それ故にＢＣのリスクを示す。ＮＢＣＩにおけるＣＥＢＰＧとＴＧの間の高い相関性により、予測される被調節遺伝子の発現レベルが、特定のＮＢＣＩからのＮＢＥＣ中のＣＥＢＰＧレベルに付随することを有意な信頼度で判定することが可能である。次いで、選択したＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子のＴＧ／ＣＥＢＰＧ比を使用して、各個体においてリスクを供与する多型の対立遺伝子を予測することができる。
ＴＧ／ＣＥＢＰＧ比が、ＮＢＣＩのＴＧ／ＣＥＢＰＧの解析より決定される特定の水準の上方又は下方にあれば、リスクを高める多型が示される。定義上高いリスク状態にあるどの特定のＢＣＩ個体にあっても、特定の遺伝子のＴＧ／ＣＥＢＰＧは、ＮＢＣＩにおいて観測される回帰直線に関して高い、低い、又は不変であり得る（例、図４のＣＥＢＰＧ対ＸＲＣＣ１）。即ち、ＴＧの多くのＣＥＢＰＧによる調節は、特定のＢＣＩにおいて正常であり得る。しかしながら、ＢＣの高いリスク状態にある特定の個体では、十分な数のＴＧの改変された調節が予期される。これにより、ＢＣＩをＮＢＣＩより識別するためのモデルが提供される。
ＮＢＥＣにおいて測定する発現レベルに基づいてＢＣＩをＮＢＣＩより識別するモデルを確定したらすぐに、このモデルを他の組織（例えば、非侵襲技術により入手可能な組織、例えば、頬内及び／又は鼻腔上皮細胞が含まれる）において評価する。これらの他の組織では、ＮＢＥＣ中のＮＢＣＩ及びＢＣＩについて観測される二変量相関パターンも観測してよい。約５０の頬内上皮試料及び末梢血液細胞試料を、ＮＢＥＣを提供する同じ患者より採取する。このモデルでの使用のために発現レベルを定量する。このデータを、ＮＢＥＣについて得られるデータと、同じ患者からの末梢血液細胞のＳＮＰ解析と比較する。
実施例４
（ａ）相関性の喪失を同定することによるＢＣの検出
実施例２ａからの全２２遺伝子についてのＶＭＴＡデータの識別解析を実施して、各個体をＮＢＣＩ又はＢＣＩとして同定するモデルを確定することができる。４９名の個体のうち３６名（１９名のＮＢＣＩと１７名のＢＣＩ）を訓練セットとして使用すると、この最良のモデルには、ＣＥＢＰＧと１又は２の他の遺伝子の間の相互作用が含まれる。次いで、年齢、性別、及び喫煙歴が適合した６名のＮＢＣＩと７名のＢＣＩの盲検バリデーションセットにおいて、６つの最良モデルを評価する。この最良モデルは、１３名の個体のうち１０名をＮＢＣＩ又はＢＣＩと正確に同定して、７７％の精度、１００％の特異性、及び７０％の感度を与える。ＮＢＥＣからのＶＭＴＡデータの直線識別解析より確定されるモデルは、ＢＣのリスク状態の個体を同定する目的のために、化学予防及び早期検出の臨床治験の効果を高めるのに十分な精度を有する。例えば、リスク状態にある個体の中にはまだＢＣを発症したことのないものがいることからすれば、７０％の特異性であっても、驚くにあたらない。
（ａ）相関性の喪失を同定することによってＢＣを検出するための追加データ
実施例２ｂからのＣＥＢＰＧと１０の遺伝子についてのＶＭＴＡデータの多変量解析を実施して、ＮＢＣＩをＢＣＩより識別するモデルを確定する。はじめに、５０名の個体のうち３４名（１７名のＮＢＣＩと１７名のＢＣＩ）からのＶＭＴＡデータについて解析を実施して、これにより、１００％正確であるいくつかのモデルを得る。残る盲検の１６名の個体（８名のＮＢＣＩと８名のＢＣＩ）を使用して、上記のモデルを評価することができる。ＣＥＢＰＧを含むモデルのいくつかは、ＮＢＣＩをＢＣＩより識別するのに少なくとも７５％正確であった。
実施例５
多型の同定
本実施例は、相関するＴＦ、ＡＯ、及び／又はＤＮＡＲ遺伝子（これらについては、ある種の対立遺伝子がＢＣＩにおいて有意に高い割合で表れる）における多型の同定について記載する。
ＣＥＢＰ及びＥ２Ｆファミリー、ＰＡＸ５、及びＥＶＩ１の認識部位を、ＮＢＣＩのＮＢＥＣにおいて相関するＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の調節領域に共通するものとして同定する。これら共通のＴＦ認識部位は、ＭａｔｔｉｎｓｐｅｃｔｏｒＴＭソフトウェアでの調節領域配列解析を介して同定する。上記の認識部位へ結合し得る８つのＴＦの中で、ＣＥＢＰＧ ＴＦの発現レベルは、ＮＢＣＩのＮＢＥＣ中の１０種の選択ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の発現レベルとは相関するが、ＢＣＩのＮＢＥＣ中のそれとは相関しないことがわかる。Ｅ２Ｆ１発現レベルは、ＮＢＣＩとＢＣＩの両方のＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の発現レベルと相関し、そのような遺伝子には、ＧＰＸ１、ＣＡＴ、ＧＳＴＺ１、ｍＧＳＴｌ、ＳＯＤ１、ＧＳＴＰ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ５、及びＸＲＣＣ１が含まれる。
ＣＥＢＰＧ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＳ、及び１０の相関ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子について、配列変異体を解析することができる。優先的に評価する多型は、転写調節、タンパク質機能、転写後プロセシング及び／又は安定性、及び／又はタンパク質−タンパク質結合に影響を及ぼし得るものであり、上流調節領域にあるものと、コーディング領域の３’ＵＴＲ、翻訳領域、及び５’ＵＴＲにあるものが含まれる。はじめに、遺伝学的に決定されるリスクにおいて最大の差を有する可能性がある群（一方での高齢の重度喫煙者のＮＢＣＩと他方での若い軽度又は非喫煙者のＢＣＩが含まれる）について比較することができる。ＳＮＰ協会（Consortium）データベースを使用して、多型（例えば、ＳＮＰ）を相関遺伝子とＣＥＢＰＧ及びＥ２Ｆ１の３’非翻訳、翻訳、５’非翻訳、及び調節領域に同定する。
末梢血ＷＢＣより抽出したＤＮＡを市販サービスより配列決定することができる。Ｃ／ＥＢＰ遺伝子は、数千ｂｐの長さであるので、既知の機能のある領域を最優先で評価することができる。これらの最優先領域には、ＤＮＡ結合、ヘテロ二量体形成、及び活性化の原因になるものと３’ＵＴＲが含まれる。これら遺伝子中の既知のＳＮＰのほとんどは３’ＵＴＲにあり、これは転写物の安定性及び／又はプロセシング（例、ポリアデニル化）においてある役割を担う可能性がある。例えば、Conne, et al, Nature Medicine 6（6）: 637-41 (2000) を参照のこと。
ＣＥＢＰＡ、Ｂ、及びＧタンパク質について、ＮＣＢＩを介して利用可能なバイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、既知のＳＮＰを評価する。既知のＳＮＰのリストを以下の表９に提供する。この表より、ＣＥＢＰＧ及びＡ中のほとんどのＳＮＰが３’非翻訳領域（ＵＴＲ）において生じることが明らかである。３つのＣ／ＥＢＰのそれぞれでは、調節領域ものコーディング領域にも既知のＳＮＰがない。これらの領域では共通のＳＮＰが知られていないが、数多くの珍しい多型、例えばＳＮＰがこの集団に存在すること（Mohrenweiser et al Toxicologic Pathology 32: 1336-45 (2004)）、そして鋭敏な領域でのいくつかのヌクレオチドのいずれかの変化が改変機能をもたらし得ることには可能性がある。ＣＥＢＰＧ、Ａ、及びＢとそれらのイソロイシンヘテロ二量体パートナー（ＦＯＳが含まれる）について特に注目すべき領域は、トランス活性化、ヘテロ二量体形成、及び／又はＤＮＡ結合に参画するものである。ＣＥＢＰＧは、末端切断されていて、活性化ドメインを欠く（Cooper et al, Nucleic acids Res. 23: 4371-4377 (1995)）。しかしながら、それは、完全なＣＥＢＰタンパク質と同じアフィニティーでＤＮＡと結合する（Roman et al, Gene Dev. 4: 1404-1415 (1990)）。故に、ＣＥＢＰＧでは、ヘテロ二量体形成とＤＮＡ結合の原因になるｂＺｉｐ領域へ注目が向けられる。
標的遺伝子では、主たる関心は、調節領域、具体的には、ＣＥＢＰＧの認識部位を含有する領域にある。例えば、ＸＲＣＣ１の１１００ｂｐ調節領域（転写開始部位の１０００ｂｐ上流と１００ｂｐ下流）にある既知のＳＮＰを表１０に提示する。ＮＣＢＩ中の各多型での各対立遺伝子の頻度を決定して、ＢＣＩ中の各多型での各対立遺伝子の頻度と比較することができる。特定の個体に存在し得る、遺伝的に決定されるリスク増加の推定５〜１０％の発症を説明する、多くのシナリオのうち３つを以下に示す。
（ｉ）リスクに貢献する５つの共同調節される（co-regulated）遺伝子のそれぞれがＣＥＢＰＧの認識部位に多型を有する。このリスク対立遺伝子の出現率は、各認識部位で０．５である。０．５ｘ０．５ｘ０．５ｘ０．５ｘ０．５＝０．５ｘ．０６２５＝０．０３１２。これらのいずれもの多型の発生率が０．５未満であるか、又は低い発現の表現型がこの遺伝子のいずれにも同型接合性を要求するのであれば、この表現型の頻度は、これより低くなる。
（ｉｉ）５つの遺伝子すべてを制御する転写因子の認識部位に多型が存在する。この頻度が０．２５であり同型接合性が要求される（０．２５ｘ０．２５＝０．０６２５）か又は、この頻度が０．０５であり異型接合性が原因になる（０．０５ｘ０．９５＝０．０４７５）。
（ｉｉｉ）Mohrenwiener (2004) により報告されているように、ＡＯ及び／又はＤＮＡＲ機能に影響を及ぼす多くの低頻度多型が存在する。例えば、ｂＺｉｐ領域中の５０ｂｐの同一線上ストリングのいずれにおいても生じるリスク対立遺伝子がリスクを高める。稀な対立遺伝子の各ヌクレオチドの出現率は０．００１未満であり得るが、５０ｂｐの同一線上ストリングに起こるこれらの稀な対立遺伝子の１つの可能性は、５０ｘ０．００１、又は０．０５となろう。
異なるヌクレオチドにおける変異が各個体のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ機能の改変の原因になり得るので、ＢＣＩの間では、注目の機能領域全体で、遺伝子の残りに比較して、稀な対立遺伝子の全体出現率がより高くなる可能性があり、この差は、ＮＢＣＩの間では観測されないかもしれない。例えば、ＢＣＩの間では、ＣＥＢＰＧのｂＺｉｐ領域全体で、ＣＥＢＰＧの残りに比較して、稀な対立遺伝子のより高い出現があり得るのに対し、ＮＢＣＩの間では、差がない。データについて、一方向ＡＮＯＶＡでの有意（ｐ＜０．０５）差を評価することができる。
大きい数の多型部位を比較的小さい数の個体において評価する場合、多型部位でのパターンがＢＣ患者に関連しているように見える場合が偶然ある。このことは、それぞれの多型部位パターンがモデルとしてＢＣに関連しているとはじめに考慮することによって抑えることができる。これらのモデルのそれぞれは、例えば、上記に詳述したように、後続の盲検試験において検証することができる。
相関するＴＦ、ＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子における既知のＳＮＰの対立遺伝子頻度に基づいて、検出力分析を実施する。各遺伝子に適した試料サイズは、対立遺伝子頻度を１つの群で５％、他の群で９５％と仮定して計算する。少なくとも８０％の検出力を達成するには、各群５名の被検者を使用する。例えば、１０のＳＮＰ（例えば、各遺伝子について１つ）では、１００名の被検者を使用する。Ｆｉｓｈｅｒ Ｅｘａｃｔ ＰｒｏｃｅｄｕｒｅをｎＱｕｅｒｙ５．０で使用して、検出力の計算を行うことができる。ＣＥＢＰＧにより調節される、及び／又は保護へ貢献する追加のＡＯ及び／又はＤＮＡＲ遺伝子を評価しない場合、感度を抑えてよい（例えば、高い偽陰性が観測される場合がある）が、特異性は影響され得ない（例えば、偽陽性は低いままである）。
実施例６
ＢＣＩにおいてではなく、ＮＢＣＩにおいてＣＥＢＰＧとＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子が相関することの機序根拠を探究することによる多型の同定
ＢＣＩにおいてではなく、ＮＢＣＩにおいてＣＥＢＰＧとＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子が相関することの機序根拠を探究して、ＢＣを示唆する多型領域をさらに同定することができる。確立された技術を適用して、主要な細胞／組織における転写物の調節を評価することができる。転写調節を測定することは、３つの要因を伴う可能性がある：（ａ）ＴＦにより調節される標的遺伝子ＶＭＴＡ測定、（ｂ）標的遺伝子の調節領域に存在する、ＴＦのＤＮＡ認識部位配列の解析、及び（ｃ）それぞれの認識部位とＴＦ相互作用の解析。（ａ）の標的遺伝子の発現レベルは、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲＴＭにより作成されるＶＭＴＡデータを使用して測定することができる；（ｂ）のＳＮＰのハイスループット分析には、ＤＮＡ配列決定と他の方法が容易に利用可能である；及び、（ｃ）については、確立されたＥＭＳＡ、ＳＰＲ、及びウェスタンブロットの方法を使用することができる。気管支鏡ブラシ生検により入手可能なＮＢＥＣ試料のサイズが小さいために、いくつかの態様では、より高感度の方法、例えば、標準化ＩｍｍｕｎｏＰＣＲ（ＳｉＰＣＲ）が好ましい。例えば、米国特許出願番号１１／１０３，３９７を参照のこと。これらの方法は、特定のＤＮＡ配列へのＴＦのアフィニティーと、異なる推定ＴＦヘテロ二量体タンパク質の間のアフィニティーを気管支鏡生検により得られる小さなＮＢＥＣ試料に対して測定するために使用することができる。
相関性の喪失は、ＣＥＢＰＧによるＴＧの直接的又は間接的な調節によるのかもしれない。例えば、ＣＥＢＰＧの発現レベルは、ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子の発現レベルと相関する場合があっても、ＣＥＢＰＧは、それらを調節しないかもしれない。例えば、ａ）それが他の遺伝子のトランスフェクションに必要であるが十分ではない補助因子である場合、又はｂ）それが共同調節されるＡＯ遺伝子と同じＴＦにより共同調節されるが、それらに対して影響を及ぼさない場合。ＣＥＢＰＧがＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子を調節していることを確かめるために、低いレベルのＣＥＢＰＧと好適な標的遺伝子を発現する細胞へＣＥＢＰＧ発現ベクターを導入する。この目的には、ある個体からの培養ＮＢＥＣが適している場合がある。例えば、Willey et al., Am J Respir Cell MoI Biol. 19(1): 6-17 (1998) を参照のこと。また、ＥＲＣＣ５の調節領域を含有するレポーター構築体を、多様な内因性レベルのＣＥＢＰＧを発現する気管支癌細胞系へトランスフェクトすることができる。異なる機能上の影響を有するＳＮＰへの測定可能な生物学的相関のリストを表１１に提示する。
図６は、１つのＮＢＣＩ（ＮＢＣＩ１）と５つのＢＣＩ（ＢＣＩ１−５）におけるＴＧ／ＣＥＢＰＧ発現レベルの二変量解析の概略図を例示する。この概略図において、ＡＯ又はＤＮＡＲの発現レベルは、ＮＢＣＩ個体では、ＣＥＢＰＧ発現レベルと高度に相関する。従って、個体ＮＣＢＩ１が含まれるＮＢＣＩの二変量座標は、太い回帰直線に沿って存在する。細い水平線は、重度喫煙者において生じる酸化体及びＤＮＡ傷害ストレスに抗して保護するのに十分なＴＧ発現レベルを表す。ＮＢＣＩでは、ＡＯ又はＤＮＡＲ標的遺伝子発現レベルとＣＥＢＰＧ発現レベルの（例えば、ＣＥＢＰＧによる調節による）相関性が酸化体及びＤＮＡ傷害ストレスからのＮＢＥＣ保護に関連している（ＮＢＣＩ１の座標は、細い水平線の上方にある）。
ＢＣＩ１−５により表されるＢＣＩでは、矢印により示すように、ＴＧ発現レベルが低下している。さらに、ＴＧ及びＣＥＢＰＧの発現レベルの間の相関性は低いか又は欠失していて、二変量座標のほとんどは、回帰直線に沿っていないものとして表される。この概略図は、ａ）ＣＥＢＰＧが主要なＡＯ及びＤＮＡＲ ＴＧの転写を調節して、酸化体及びＤＮＡ傷害ストレスからの保護の低下に伴って相関性が減少する、そしてｂ）ＢＣＩは保護の低下に基づいて選択されるので、それらは、彼らのＮＢＥＣにおいて、ＣＥＢＰＧ及びＴＧの発現レベルの間の低下した相関性を発露する可能性があるという仮説を表す。
個々のＢＣＩ ＣＥＢＰＧ発現レベルがＮＢＣＩのそれより低いか又は高いかということは、相関性の喪失のあり得る機序と、疾患リスクを示唆する多型について解析すべき領域を示す可能性がある。個々のＢＣＩ ＴＧ／ＣＥＢＰＧ比が回帰直線の上方、その線上、又は下方にあるかということも、相関性の喪失のあり得る機序と、疾患リスクを示唆する多型について解析すべき領域を示す可能性がある。表１２は、個々のＢＣＩ ＴＢ／ＣＥＢＰＧデータがＮＢＣＩ回帰直線の上方、その線上、又は下方にあることを例示する。相関性の減少のあり得る機序には、ＣＥＢＰＧ転写の低下、及び／又はＣＥＢＰＧとＴＧ調節領域の間の機能性相互作用の低下が含まれる：
ＣＥＢＰＧ転写の低下
ＢＣＩ１とＢＣＩ２では、ＣＥＢＰＧ転写がより低く、喫煙者により体験されるＡＯ／ＤＮＡ傷害に抗する保護に十分なレベル未満のＴＧ発現レベルを生じる。ＢＣＩ１とＢＣＩ２の間のＴＧ発現レベルにおける変動は、異なる個体における異なる度合いのストレスにより誘発されるＴＧを調節する他のＴＦによるのかもしれない。ＣＥＢＰＧ発現レベルが低下したＢＣＩにおいて、ＣＥＢＰＧの調節領域について、例えば、下記により詳しく考察するように、例えば、ＴＦの認識部位へのアフィニティーに影響を及ぼす可能性がある、ＮＢＣＩとは異なる多型を解析する。
ＣＥＢＰＧとＴＧ調節領域の間の機能性相互作用の低下
ＢＣＩ３、ＢＣＩ４、及びＢＣＩ５では、ＣＥＢＰＧ発現レベルがＮＢＣＩ１のそれと（実質的に）同じであるか、又はより高くても、ＴＧ発現レベルは、重度喫煙者におけるＡＯ及びＤＮＡ傷害ストレスに抗するのに十分な保護を提供するのに必要なそれより低い。例えば、ＣＥＢＰＧ発現レベルは、ＢＣＩ３及びＢＣＩ４において、より高いＣＥＢＰＧ機能のある個体と同じである。ＢＣＩ５では、例えば不十分な保護が存在することのフィードバックシグナルのために、ＣＥＢＰＧ発現レベルがより高い。ＢＣＩ３では、ＴＧを調節する非ＣＥＢＰＧ ＴＦのレベルがＢＣＩ４におけるより高い。それぞれの状況において、達成されるＴＧ発現レベルは、十分な保護を提供するには不十分である。（実質的に）同じか又は高いＣＥＢＰＧ発現レベルを有するＢＣＩにおいて、例えば、下記により詳しく考察するように、ＮＢＣＩに比較してより低い機能のＣＥＢＰＧに関連する多型を探索する。
ＴＧ／ＣＥＢＰＧ比がＢＣＩ１、ＢＣＩ２又はＢＣＩ３−４に類似したＢＣＩについて、表１２に提供するように、１０のＡＯ又はＤＮＡＲ ＴＧのそれぞれを同定する。本明細書に記載の機序によれば、ＢＣＩ１又はＢＣＩ２と同じか又はそれに類似した比を有するＢＣＩは、ＮＢＣＩ１に対して低下したＣＥＢＰＧの転写を引き起こす多型を有するが、ＢＣＩ３−５と同じか又はそれに類似した比を有するものは、低下したＣＥＢＰＧの機能を引き起こす多型を有する。下記に記載のように、特徴的なＴＧ／ＣＥＢＰＧ比を有するＢＣＩを評価することによって、これらの仮説を検証する：
ＴＧ／ＣＥＢＰＧがＮＣＢＩ回帰直線の上方にあるＢＣＩ
ＢＣＩ０６１１０２（表１２）は、ＴＧ／ＣＥＢＰＧ比がＮＢＣＩ回帰直線の上方にある点で、ＢＣＩ１（図６）に類似している。表１２に述べるように、ＴＧ／ＣＥＢＰＧ比の増加は、ＣＥＢＰＧ転写物の合成速度の減少、及び／又はその安定性の減少によるのかもしれない。ＣＥＢＰＧの転写の減少は、ＣＥＢＰＧの調節領域に関与するか又はＣＥＢＰＧを調節するＴＦの機能に影響を及ぼす多型により生じる可能性がある。安定性の減少は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における多型に関連するのかもしれない。
ＴＧ／ＣＥＢＰＧ値が増加したＢＣＩ（例、ＢＣＩ０６１１０２）では、ＣＥＢＰＧの調節領域について、ＮＢＣＩとは異なる（例えば、ＴＦの認識部位へのアフィニティーに影響を及ぼす可能性がある）多型を解析する。違いが観測される場合、その配列を合成して、ＴＦ（市販の供給源より購入する）とのアフィニティーをＳＰＲ解析により評価する。
増加したＴＧ／ＣＥＢＰＧ値を有するＢＣＩ（例、ＢＣＩ０６１１０２）では、ＣＥＢＰＧの３’ＵＴＲについて、安定性の低下を説明する、ＮＢＣＩとは異なる多型を解析することができる。安定性の低下は、当該技術分野で知られている核の連続（run-on）アッセイによって測定することができる。
また、ＣＥＢＰＧを調節するＴＦの機能は、例えば、ＣＥＢＰＧの調節領域を含有するルシフェラーゼレポーター構築体をＮＢＣＩ対ＢＣＩのＰＭＮへ一過的にトランスフェクトすることによって、試験することができる。
ＴＧ／ＣＥＢＰＧがＮＢＣＩ回帰直線の下方にあるＢＣＩ
ＢＣＩ０１０９０２（表１２）は、ＴＧ／ＣＥＢＰＧ比がＮＢＣＩ回帰直線の下方にある点で、ＢＣＩ３−５に類似している（図６）。ＢＣＩ０１０９０２では、評価した１０のＡＯ又はＤＮＡＲ ＴＧのうち８つで、ＴＧ／ＣＥＢＰＧがＮＢＣＩ回帰直線に関して有意に低下している。例えば、ＮＢＣＩ回帰直線より予測されるＥＲＣＣ５／ＣＥＢＰＧ比は６１であるが、この値は、ＢＣＩ０１０９０２では５である。
ＴＧ／ＣＥＢＰＧがＮＢＣＩ回帰直線の下方にあるいくらかのＢＣＩでは、これは、ＣＥＢＰＧ中の、又はＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢのようなＣＥＢＰＧ又はＦＯＳとヘテロ二量体を形成する遺伝子中の多型（例、ＳＮＰ）によるのかもしれない。このシナリオでは、ＣＥＢＰＧのＣＥＢＰ認識部位への結合効率は、それがＮＢＣＩにあるより低い。このことを検証するために、ＢＣＩ０１０９０２のようなＴＧ／ＣＥＢＰＧ値を有するＢＣＩの末梢血液細胞よりＣＥＢＰＧ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、及びＦＯＳを単離する。このことは、はじめに、ビオチンへ結合した配列特異的なオリゴを使用してＴＦを精製すること、アビジン金属ビーズと混合してから磁気セパレータを使用することによって行う（Kroeger et al, Analytical Biochemistry 250: 127-129 (1997)）。次いで、確立された方法に従って、ＳＰＲを使用して、ＴＧ中のＣＥＢＰ認識部位へのＣＥＢＰＧのアフィニティーと、ＣＥＢＰＡ又はＣＥＢＰＢの存在下での認識部位へのＣＥＢＰＧのアフィニティーを評価する（例えば、Rutigliano et al, Int J Oncol 12(2): 337-43 (1998); Linnell et al., J Biol Chem 275: 12231-12236 (2004) を参照のこと）。これらの結果を、ＴＢ／ＣＥＢＰＧ比がＮＢＣＩ回帰直線上にあるＮＢＣＩ試料より得られるものと比較する。
低下したＣＥＢＰＧ結合効率を示す、ＴＧ／ＣＥＢＰＧが低下したＢＣＩでは、ＣＥＢＰＧ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ及び／又はＦＯＳについて、ＮＢＣＩとは異なる多型（例えば、ＴＧのＣＥＢＰＧによる転写の低下に関連する多型）を解析することができる。
ＴＧ／ＣＥＢＰＧがＮＢＣＩ回帰直線の下方にあるいくらかのＢＣＩでは、これは、影響を受けるＴＧのそれぞれのＣＥＢＰＧ認識部位における多型（例、ＳＮＰ）によるのかもしれない。このことを検証するために、そのようなＢＣＩ由来のＴＧの認識部位について、ＮＢＣＩとは異なる多型を解析する。ＮＢＣＩ又はＢＣＩのＮＢＥＣより抽出されるＣＥＢＰＡ、Ｂ、又はＧのアフィニティーを、多型が有るか又は無い認識部位とのアフィニティーと比較することもできる。精製したＣＥＢＰＡ、Ｂ、及びＧが市販されていて（例えば、Ａｂｃａｍ、Ａｂｎｏｖａ、又はＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、これを入手して、例えば、上記に記載のように、ＳＰＲ測定法を確立して較正することができる。上記に言及した標準化イムノＰＣＲにより、標的遺伝子の発現レベルに関連して、気管支鏡検査法より利用可能な小さな一次ＮＢＥＣ試料内の注目の認識部位に関連して、結合又は遊離のＣＥＢＰＧの濃度を定量することができる。例えば、標準化イムノＰＣＲ試薬をＣＥＢＰＡ、Ｂ、Ｇ、及びＦＯＳ用に開発して、例えば、ＴＦのそれぞれの標準化された数的測定をより低い検出閾値（例えば、いくつかの態様では、Ｅｌｉｓａ又はＥＭＳＡの約１０００万分子以上とは対照的に、約５０未満の分子）で可能にすることができる。このことにより、ＮＢＥＣの酸化体及びＤＮＡ傷害剤からの保護を調節する遺伝子間のこれらの重要な相互作用の理解を高めることができる。
実施例７
ＥＲＣＣ５における多型。非ＢＣ個体（ＮＢＣＩ）とＢＣ個体（ＢＣＩ）におけるＥＲＣＣ５調節領域の配列決定は、ＢＣ個体におけるＥＲＣＣ５とＣＥＢＰＧの相関性の不足のあり得る特定原因をもたらす、５’上流調節領域中のＹＹ１転写因子認識部位における２つの多型部位を明らかにした。具体的には、ＥＲＣＣ５においてすでに知られた多型部位（転写開始部位に対して−２２２）で、より頻繁な対立遺伝子（Ｇ）がＢＣ個体において有意により多く出現して、予測されるより低いＥＲＣＣ５に関連していた。これまでに知られていない部位（−２２８）では、ＥＲＣＣ５が予測されるより低い非ＢＣ個体だけに稀な対立遺伝子（Ｇ）が生じた。（−２２２は、ｃｏｎｔｉｇ．ＮＴ＿００９９５２．１４上の１０２２９６１９９位である；ｒｓ７５１４０２のｒｅｆ ＳＮＰ ＩＤ；−２２８は、同じｃｏｎｔｉｇ．上の１０２２９６１９３位にある）。
１１名のＢＣと１２名の非ＢＣにおけるＥＲＣＣ５調節領域の配列解析は、２つの多型部位を明らかにして、それらはいずれもＹＹ１レプレッサー認識部位にあった。１１０名の非ＢＣと１１０名のＢＣ個体におけるＥＲＣＣ５を配列決定して、ＥＲＣＣ５−２２２Ｇ対立遺伝子がＢＣ個体において有意に高い割合で表れることを確認することによって、さらなる確証を提供することができる。データに基づいた検出力分析は、この数の個体の配列情報を収集することで、０．０５のｐ値での有意差と８０％の検出力の実証が可能になることを示す。ＢＣ個体におけるＥＲＣＣ５−２２２Ｇ対立遺伝子の有意に高い出現率の実証は、この対立遺伝子のある個体をリスク増加に基づいてＢＣについて選択したことを示す。
ＥＲＣＣ５：２２９；１２名の非ＢＣでは７５％（１８／２４対立遺伝子）、そして１１名のＢＣでは９１％（２０／２２）のＭＦ対立遺伝子（Ｇ）頻度のある、ＹＹ１認識部位に共通の多型。逆に、ＬＦヌクレオチド対立遺伝子（Ａ）の頻度は、非ＢＣ個体で２５％（６／２２）であり、ＢＣ個体では９％（２／２２）である。さらに、ＬＦ対立遺伝子が出現した１名のＢＣ個体は、非ＢＣのＣＥＢＰＧ／ＥＲＣＣ５回帰直線に関してＥＲＣＣ５の正常な位置を有した。従って、非ＢＣの回帰直線に関してＥＲＣＣ５が低い５名のＢＣ個体の間では、Ａ対立遺伝子の頻度が０％（０／１０）であった。これら対立遺伝子の頻度では、ＬＦ対立遺伝子の異型接合性又は同型接合性の頻度は、集団の全個体の間での予測頻度（３６％）に比較して、ＢＣでは１７％で、非ＢＣでは４４％（２．６倍の差）である。これまでの試験は、試験した全２１名の個体の間でＭＦ対立遺伝子の頻度が８３％であったことを示し、これは８０％に近い。
ＥＲＣＣ５：２２２；ＹＹ１認識部位における稀な多型。ＬＦ対立遺伝子は、評価した４６の対立遺伝子うち１つに観測された（０．０２の頻度）。ある種のＹＹ１認識部位の多型は、非ＢＣ個体間のＣＥＢＰＧに対するＥＲＣＣ５の二変量比較により作成される回帰直線に対して低いＥＲＣＣ５発現に関連していた。ＥＲＣＣ５：２２８ＭＦ対立遺伝子（ＧＧ）同型接合性の個体では、全個体の３１％（５／１６）（ＢＥＰ２Ｄが含まれる）とＥＲＣＣ５が回帰直線の下方にあるＢＣ個体の１００％（４／４）［５６％又は５／９］がＧＧ同型接合性を有した。回帰直線の下方にある１名の非ＧＧ個体は、ＥＲＣＣ５：２２２ＬＦ対立遺伝子を有した。非ＧＧ ＥＲＣＣ５：２２８個体のうち１４％（１／７）がＥＲＣＣ５を回帰直線の下方に有した。ＥＲＣＣ５：２２２ＬＦ対立遺伝子のある単独の個体を除けば、非ＧＧＥＲＣＣ５：２２８アレロタイプ（allelotype）の０／６［０／４］がＥＲＣＣ５を回帰直線の下方に有した。観測された単独のＥＲＣＣ５：２２２ＬＦ対立遺伝子は、ＥＲＣＣ５が回帰直線の下方にある１名の非ＢＣで生じた。
ＥＲＣＣ５調節領域欠失解析。Ｈ２３では、ＭＹＢを介した欠失により、２倍より高いＥＲＣＣ５−ＬＵＣの増加をもたらす。ＣＥＢＰ１、Ｅ２Ｆ１、及びＣＥＢＰ２を介したさらなる欠失は、ＥＲＣＣ５−ＬＵＣの減少をもたらさない。しかしながら、ＥＬＫ１とＥＶＩ１の欠失は、ベースラインレベルを超えた４倍以上の低下を実際にもたらす。ＣＭＶ−ＣＥＢＰＧ発現ベクターのＨ２３への外因性ＣＥＢＰＧトランスフェクションは、ＥＲＣＣ５−ＬＵＣを内因性レベルより２．５〜３．５倍へ誘導する。
上記のデータは、非ＢＣ個体からのＢＥＣにおけるＥＲＣＣ５発現を調節するのに、ＣＥＢＰＧ、ＥＬＫ１、及びＹＹ１がそれぞれ役割を担うことを示す。ＣＥＢＰＧについての証拠は、２０名の非ＢＣ個体の間にＣＥＢＰＧ発現とＥＲＣＣ５発現の間に相関性があること、そしてＣＭＶ−ＣＥＢＰＧのＨ２３へのトランスフェクションにより、ＥＲＣＣ５ ＬＵＣからのルシフェラーゼの発現が２．５〜３．５倍増加することである。ＥＬＫ１についての証拠は、それが欠失するときに、内因性転写因子により調節されるＥＲＣＣ−ＬＵＣからの転写が顕著に減少することである。ＹＹ１についての証拠は、ＢＣ個体の間ではＥＲＣＣ５：２２８ＭＦ（Ｇ）対立遺伝子の増加頻度があること；ＥＲＣＣ５の発現が、非ＢＣ個体におけるＥＲＣＣ５とＣＥＢＰＧの二変量解析より作成される回帰直線の下方にある個体の間では、ＥＲＣＣ５：２２８ＭＦ（Ｇ）対立遺伝子又はＥＲＣＣ５：２２２ＬＦ対立遺伝子（Ａ）対立遺伝子の頻度が増加していることである。
ＥＲＣＣ５：ＹＹ１ ２２８ＧＧ又はＥＲＣＣ５：ＹＹ１ ２２２アレロタイプの遺伝は、ＢＥＣをＤＮＡ傷害より最適下限に保護するＥＲＣＣ５転写調節に関連している。これらのアレロタイプの１つを有する数名の個体（６／１６，３８％）［６／１７又は３５％］では、ＥＲＣＣ５が非ＢＣ ＥＲＣＣ５対ＣＥＢＰＧ回帰直線の下方にある。これらアレロタイプの１つも有さない個体（０／７）［０／６］では、ＥＲＣＣ５が回帰直線の下方にない。ＥＲＣＣ５：２２２ＬＦ対立遺伝子が、ＥＲＣＣ５：２２８で異型接合性の個体において生じるという知見は、両方のリスク決定対立遺伝子を有することが個体にとってハイリスクになり、それらが不利に選択されることを示す（この偶然が１：３未満であったのは、非選択個体の間では、ＥＲＣＣ５：２２８ＬＦ対立遺伝子について異型接合又は同型接合であるのが３０％にすぎないからである）。そのような個体は、過度に抑制されたＥＲＣＣ５を有して、生殖以前に死亡する可能性がある。ＬＦ対立遺伝子の異型接合性又は同型接合性の非癌での４６％［４５％］から癌での１７％への減少は、いくつかの遺伝子の調節制御では、肺癌への抵抗性を高める多型部位での対立遺伝子（例、ＥＲＣＣ５：２２８ＬＦ対立遺伝子）が少数の個体において生じ得る一方で、抵抗性を高める別の多型部位での対立遺伝子（例、ＥＲＣＣ５：２２８ＭＦ対立遺伝子）が多数の個体において生じ得るという仮説と一致している。ＥＲＣＣ５：２２８ＭＦ同型接合（ＧＧ）個体の３１％が非ＢＣＥＲＣＣ５／ＣＥＢＰＧ回帰直線の下方にある一方で、０／６［１／７］のＥＲＣＣ５：２２８異型接合又はＬＦ同型接合個体が回帰直線の下方にあるというデータは、ＭＦ同型接合アレロタイプが回帰直線下方のＥＲＣＣ５に関連する可能性がより高いこと、そしてこのことが、ＢＣ個体におけるＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の発現の相関性の不足に貢献する１つの要因となるという仮説を支持する。
ＥＲＣＣ５：２２８ＧＧアレロタイプは、それによりＹＹ１がＣＥＢＰＧ及び／又はＥＬＫ１のより強いレプレッサーになるので、ＥＲＣＣ５を回帰直線の下方にする。ＥＲＣＣ５におけるこのアレロタイプは、何らかの他の効果により、生殖期の間は生存に有利であり得るが、気管支上皮細胞における最適下限のＥＲＣＣ５転写調節により肺癌のリスクを高める。従って、ＥＲＣＣ５：２２９異型接合性又はＬＦ同型接合性及びＥＲＣＣ５：２２２ＭＦ同型接合性を有する幸運な少数者は、リスク低下状態にある。
ＢＣ個体２５５におけるＥＲＣＣ５とＢＣ個体９９における正常なＥＲＣＣ５は、ＹＹ１の発現又は機能における改変を示す。ＥＲＣＣ５が回帰直線の下方にないとしても、ＣＥＢＰＧが低くて、ＥＲＣＣ５発現が他の転写因子又はＹＹ１により支配されるので、下方にもあり得る。ＥＲＣＣ５：２２８ ＧＧアレロタイプ又はＥＲＣＣ５：２２２ ＡＴアレロタイプを有する個体でＥＲＣＣ５が低いことは、これらの配列が最適下限の調節を許容することを示す。おそらくは、ＥＲＣＣ５：２２８ ＧＧアレロタイプは、ＥＲＣＣ５をより効果的にダウンレギュレートするやり方でＹＹ１転写因子へ結合して、これが最適未満のＣＥＢＰＧ機能と結びついて（例えば、ＣＥＢＰＧ、又はＣＥＢＰＧ、ＣＥＢＰＺ、又はＪｕｎとのヘテロ二量体中の多型によるか他の理由による）、回帰直線に関して下方のＥＲＣＣ５をもたらすのであろう。
ＥＲＣＣ５：２２２ ＡＴアレロタイプは、ＥＲＣＣ５をより効果的にダウンレギュレートするやり方でＹＹ１転写因子へ結合して、これが最適未満のＣＥＢＰＧ機能と結びついて（例えば、ＣＥＢＰＧ、又はＣＥＢＰＧ、ＣＥＢＰＺ、又はＪｕｎとのヘテロ二量体中の多型によるか他の理由による）、回帰直線に対して下方のＥＲＣＣ５をもたらす。ＮＣ個体では、ＥＲＣＣ５：２２２異型接合性のある個体以外のすべてが、それらがＥＲＣＣ５：２２８ ＭＦの同型接合又は異型接合であるにかかわらず、ＥＲＣＣ５を回帰直線に沿って有する。ＥＲＣＣ５：２２９ＭＦ同型接合の個体ではＣＥＢＰＧ調節が最適下限であり得るが、このことは、最適なＹＹ１転写の調節及び機能、及び／又は他の代償的な応答による適正な代償により克服される。欠失解析データは、ＣＥＢＰＧの非存在下で、ＥＬＫ１がＥＲＣＣ５発現の支配的なアップレギュレータとなることを示唆する。
配列解析からのアレロタイプデータは、ＹＹ１がダウンレギュレータであり、そのダウンレギュレーションが、ＭＹＢ、ＣＥＢＰＧ、ＥＬＫ１又はある組合せを介して機能し得ることを示す。例えば、ＹＹ１は、最も近い部位、具体的にはＣＥＢＰＧ及び／又はＥＬＫ１と相互作用することができる。高いレベルのＣＥＢＰＧを発現する細胞では、ＥＲＣＣ５発現がＹＹ１及びＣＥＢＰＧにより何らかの相互作用を介して修飾され得て、これがＥＬＫ１との相互作用に関与する可能性がある。従って、ＹＹ１における多型は、ＣＥＢＰＧによる調節修飾をもたらす。ＥＲＣＣ：２２９同型接合Ｇの存在は、それ自体で、個体がリスク状態にあることを示すか、又は１以上の他のマーカーと組み合って、リスクを示す可能性がある。しかしながら、異型接合性又はＡＡ同型接合性は、リスクからの保護を示す。さらに、ＤＮＡ修復及び／又は抗酸化遺伝子における閾値数のリスクアレロタイプによって、検出可能なリスクの増加が決定される。この閾値には、ＸＲＣＣ１、ＳＯＤ１、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ１及び／又はＣＡＴ１の調節及び／又はコーディング領域中の特定の多型とＡＧ又はＡＡアレロタイプを組み合わせることによって到達し得る。
ＢＣ個体において改変した転写物存在量のプロフィールを発見して定量するには、好適な転写物存在量の測定法を開発することが必要であり、このことが標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲを開発することの動機となった。転写物存在量を測定することにおけるＳｔａＲＴ−ＰＣＲの優れた性能は、Nature Biotechnology（Caneles et al, 印刷中）での公表が受容れられた論文において明らかである。ＦＤＡにより調整されたこのＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＭＡＱＣ）プロジェクトでは、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲをＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ及びＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（分岐鎖増幅）（Caneles et al, 印刷中）だけでなく、６つのマイクロアレイプラットフォーム（Shi et al, 印刷中）とも直接比較した。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲとＴａｑｍａｎは、同等のより低い検出閾値（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅの６，０００分子に比較して１０分子）と、試験した遺伝子間での同様の直線的な動態範囲を有した（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅの４ｌｏｇ１０と比較して、ＴａｑｍａｎとＳｔａＲＴ−ＰＣＲでは６ｌｏｇ１０）。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、これらの方法の中で最も高い分析物へのシグナル応答を有した。Ｔａｑｍａｎ、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ、及びそれぞれのマイクロアレイに対するＳｔａＲＴ−ＰＣＲの試料Ａ〜Ｂ倍数変化値の二変量解析において、ＲＴ−ＰＣＲは、最高の分析物へのシグナル応答を有した。この分析物へのシグナル応答が１００％であって、１００％を超えないことは、ＳＭＩＳの品質管理調製の間に各遺伝子について報告されている。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、他のすべての方法に比較して、測定した遺伝子の最大分画を検出した。ロードした同等数の遺伝子に基づいて比較するとき、平均変動係数（ＣＶ）は、Ｔａｑｍａｎ（２．５％）又はＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（２％）に比較してＳｔａＲＴ−ＰＣＲ（３．５％）でやや高く、これは、ネイティブな鋳型と対応する内部標準を各試験においてともに測定することより生じるトレードオフである。
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲの主たる長所は、同じ標準化発現データベースにおいて多年にわたり入手した多数の患者間で比較し得る転写物存在量データがそれにより作成されることである。これらの比較を可能にするＳｔａＲＴ−ＰＣＲの主たる特徴は、各測定において、遺伝子特異的な内部標準を内部標準の標準化混合物（ＳＭＩＳ）内に含めることである。これにより、ここで関連する２つの重要な特性のあるデータが得られる。第一に、各測定は、アッセイ中のｃＤＮＡの分子数の計数を構成する。Caneles et al の論文において、他の参画者（Ｔａｑｍａｎ、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ、及びＦＤＡ）は、この分子計数により、彼らのデータをＳｔａＲＴ−ＰＣＲへスケール合わせする利点を認めている。提案される試験の文脈では、この特徴により、非ＢＣ個体に比較したＢＣ個体での改変パターンのデータの二変量解析が促進される。第二に、各測定に内部標準が存在することで、本来の品質管理が提供される。内部標準が測定可能でなければ、どの数値も記録されないので、偽陰性は存在せず、ローディングにおける変動は、内因性の参照遺伝子の測定を介して制御される。既知数の内部標準分子に関する係数により、偶発現象や他の人為事実に関連した誤差の回避が可能になるので、偽陽性も存在しない。対照的に、ＭＡＱＣ試験では、ＴａｑｍａｎとＱｕａｎｔｉｇｅｎｅのいずれも、低発現遺伝子への偽陽性値を報告していて、証拠は、高発現遺伝子の偽陽性をそれぞれ有したことを示唆している。この品質管理の不足はＴａｑｍａｎデータの研究所相互の比較が妨げるものであると、明確に報告されている（Adams, 2005）。
上記の明瞭に報告されたＳｔａＲＴ−ＰＣＲの利点のために、多数の転写物存在量の値に基づいてバイオマーカーを開発したならば、将来個体より入手される試料を標準化発現データベースの数値と比較して、各個体が高いリスク状態にあるかないかを判定することができる。ここで提示するデータでは、ほぼ５０名の個体からの６年以上にわたるＮＢＥＣ試料において入手した、６０００を超える数値を比較することが可能であった。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ試薬が利用可能である遺伝子のリストは、worldwide web geneexpressinc.com. でアクセス可能である。
実質的に多重複合した転写物存在量データの統計学的解析により共同調節遺伝子を同定すること
共同調節される遺伝子をスクリーニングするための強力なやり方は、試料中の多数の遺伝子の転写物存在量（ＴＡ）を測定して、各遺伝子の同じ試料内の相対ＴＡ値を比較して、相関する遺伝子を二変量解析により同定することである。このことは、有意な相関性のある遺伝子対の同定を可能にする。重要な知見は、ＣＥＢＰＧ転写因子が、非ＢＣ個体のＮＢＥＣにおいては重要なＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子（即ち、ＧＰＸ、ＳＯＤ１、ＧＳＴＰ１、ＥＲＣＣ５、及びＸＲＣＣ１）と相関したが、ＢＣ個体のＮＢＥＣにおいては相関しなかったことである（Mullins et al, 2005）。
ＢＣ個体において調節されないＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子を非ＢＣ個体において調節することの原因になる転写因子を同定する試験：転写因子認識部位解析
Ｇｅｎｏｍａｔｉｘソフトウェア・パッケージからのＥｌ Ｄｏｒａｄｏ（Ｂｕｉｌｄ３５）プログラムを使用して、非ＢＣ個体において相関するＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子のそれぞれの調節領域において転写因子認識部位を探索した。はじめに、このソフトウェアを使用して、ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子をゲノム内に定位して、各遺伝子の１１０１塩基対のプロモーター領域（転写開始部位の上流１０００塩基対とその中への１００塩基対）を確定した（Genomatix Software GmbH, Munich, Germany, http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/）。次いで、Ｍａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒ バージョン４．２プログラム（Genomatix Software GmbH, Munich, Germany, http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/）を使用して、Ｅｌ Ｄｏｒａｄｏプログラムより入手した１１０１塩基対配列を推定転写因子認識部位の同定の標的配列として使用した。使用する変数は、標準（０．７５）コア類似性と最適化マトリックス類似性であった。相関するＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子のそれぞれで同定された転写因子認識部位は、ＣＥＢＰファミリー、Ｅ２Ｆファミリー、ＥＶＩ１、及びＰＡＸ５を表した。
ＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子を調節することの原因になると推定される転写因子の転写物存在量解析
ＣＥＢＰ及びＥ２Ｆファミリー、ＥＶＩ１、及びＰＡＸ５の転写因子のそれぞれについて、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ試薬を調製して、ＡＯ及びＤＮＡＲデータを収集した２４名の非ＢＣと２５名のＢＣの試料において転写物存在量のデータを収集した。評価した１１の転写因子の中で、ＣＥＢＰＧ、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＢＰＥ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ６、及びＥＶＩ１を含む８つがＮＢＥＣにおいて発現されていた。これら８つの転写因子について、非ＢＣ個体におけるＡＯ及びＣＮＡＲ遺伝子との相関性とＢＣ個体におけるこの相関性の喪失を評価した。評価した８つの中でこの特性を有した唯一の転写因子は、ＣＥＢＰＧであった（Mullins et al, 2005）。
ＣＥＢＰＧ／ＥＲＣＣ５二変量プロットに関するアウトライアーを同定する二変量解析
上記と Mullins et al (2005)に 記載のように、ＣＥＢＰＧと試験用に提案された５つの標的遺伝子（ＥＲＣＣ５、ＸＲＣＣ１、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、及びＧＰＸ１）のそれぞれの転写物存在量レベルは、非ＢＣ集団においてＣＥＢＰＧと高度に相関した（Mullins et al, 2005）。１例は、２４名の非ＢＣ個体間でのＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の間の相関性（ｒ＝０．７２，ｐ＜０．０００１）である（図７，菱形の記号）。ＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の間の関係を規定する回帰直線の直線式を決定して、傾きを解いた。回帰直線の傾き値＋／−２標準偏差（ＳＤ）の外側にあるどの数値も、有意なアウトライアーとみなした。例えば、ＥＲＣＣ５では、傾き（［ＥＲＣＣ５−６．３５８］／ＣＥＢＰＧ）＋／−２ＳＤは、０．６９＋／−０．１４であった。次いで、各ＢＣ試料におけるＣＥＢＰＧ対ＥＲＣＣ５の傾き値（図７の四角い記号）を計算して、それが有意なアウトライアーであるかどうかを判定した。ＣＥＢＰＧ対ＥＲＣＣ５では、ＢＣ試料の間に９つのアウトライアー（図７の円囲み）があり、非ＢＣ試料の間には１つだけのアウトライアーがあった。ＢＣアウトライアーのうち４つは、非ＢＣ回帰直線の下方にあった。
要約。このように、データのすべてを直接比較し得る方法を使用する、多年にわたるＮＢＥＣでの遺伝子発現の詳細な解析は、重要なＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子が主にＣＥＢＰＧ転写因子により制御されること、そしてこの調節がＢＣ個体では最適下限であるという結論をもたらした。ＣＥＢＰＧによるＥＲＣＣ５の調節を詳細な検討のために選択して、以下と実験設計セクションに記載のように、ＢＣリスクのバイオマーカーを同定することへのこのアプローチの価値を判定した。
患者試料とＨ２３及びＢＥＰ２Ｄ細胞系におけるＥＲＣＣ５配列決定
既知の多型部位を含有する、ＥＲＣＣ５ ５’調節領域の２３５ｂｐ部分（−４５０〜−２３５）を、１１名の非ＢＣと１０名のＢＣ患者、並びにＨ２３細胞系（ＢＣ個体より導かれる）及びＢＥＰ２Ｄ細胞系（非ＢＣ個体からの不死化）のゲノムＤＮＡからの単離に続いて配列決定した（表１３）。解析する領域は、ルシフェラーゼレポーターベクターへクローン化されて、ＥＲＣＣ５転写調節実験の解析に使用する領域と重なっていた。全２３の試料は、Mullins et al. (2005) によりかつて試験された抗酸化、ＤＮＡ修復及び転写因子の遺伝子の転写物存在量をＮＢＥＣにおいてすでに測定した被検者からのものであった。本試験のために選択した個体には、ＥＲＣＣ５レベルが非ＢＣ個体の回帰直線の下方の２標準偏差より大きい、４名のＢＣ個体と１名の非ＢＣ個体が含まれた（図７）。この結果を表１３に提示する。２つの多型が同定された（図８及び表１３）。すでに既知の多型（Ｇ−２２２Ａ）がより高頻度の（ＭＦ）対立遺伝子（Ｇ）を有して、全２３試料の間での出現率（８３％）は、かつての報告（８０％）とほとんど同じであった。しかしながら、より高頻度のＭＦ対立遺伝子の出現率は、１１名のＢＣ個体（２０／２２対立遺伝子、９１％）と比較して、１２名の非ＢＣ個体（１８／２４対立遺伝子、７５％）でより低かった（表１３）。１名の非ＢＣ個体には、ＥＲＣＣ５の転写開始部位に関してこれまで知られていなかった多型、Ｔ−２２８Ｇ（図８及び表１３）が存在した。この出現率は、評価した４６のうち１つの対立遺伝子（０．０２の頻度）であった。これはまた、非ＢＣ個体におけるＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の転写物存在量の間の関係を規定する回帰直線の直線式より外れる２標準偏差（ＳＤ）よりＥＲＣＣ５のレベルが大きかった、唯一の非ＢＣ個体であった（図７、表１３）。
ＣＥＢＰＧに対して低いＥＲＣＣ５を引き起こす多型
いずれの多型部位も、ＥＲＣＣ５の５’調節領域中のＹＹ１認識部位内にあった。各部位でのある種のアレロタイプは、ＣＥＢＰＧ発現に対して低いＥＲＣＣ５発現に関連していた（非ＢＣ個体間のＥＲＣＣ５のＣＥＢＰＧに対する二変量比較により作成される回帰直線の下方の２標準偏差より大きいと定義される）。同型接合ＧＧが−２２２にあるＢＣ個体の中では、５６％（５／９）がＥＲＣＣ５を回帰直線の下方に有した。対照的に、同型接合ＧＧが−２２２にある非ＢＣ個体では、ＥＲＣＣ５を回帰直線の下方に有するものがなかった（０／７）。このことは、ＢＣ個体には、−２２２ＧＧアレロタイプとともに作用してＥＲＣＣ５の低下を引き起こす別の要因が存在することを示唆する。
さらに、ＥＲＣＣ５が回帰直線の下方にある１名の非ＢＣ個体がいた。この個体は、−２２２で非ＧＧであったが、本試験の２３名の中では、稀な対立遺伝子を−２２８に有する唯一の個体であった。配列決定した２３名の個体中の低いＥＲＣＣ５／ＣＥＢＰＧと特定の対立遺伝子の関連性に加えて、ＥＲＣＣ５／ＣＥＢＰＧ関係の傾きは、試験した６つの気管支癌細胞系の間では、ＮＢＥＣにおいて観測したものと比較して、顕著に平坦であった。ＮＢＥＣの傾きが１００に近いのに対し、気管支癌細胞系の傾きは、約１であった。Ｈ２３にあるように、ＧＧアレロタイプの存在が各細胞系において観測されることは、あり得ることである。
ＥＲＣＣ５プロモーター配列の−２２８及び−２２２での多型。
表１３。１１名の非ＢＣ患者、１０名のＢＣ患者、そしてＨ２３及びＢＥＰ２Ｄ細胞系において、ＥＲＣＣ５プロモーターの多型を同定した。上記の試料において、ゲノムＤＮＡについて多型を解析した。多型の位置は、ＥＲＣＣ５の転写開始部位に関する。非ＢＣ個体における相関性の直線的な回帰直線とのＣＥＢＰＧ／ＥＲＣＣ５転写物存在量の二変量相関の散布図について、図７を参照のこと。
ＣＥＢＰＧは、ＮＢＥＣにおいて主要なＡＯ及びＤＮＡＲ遺伝子を調節する。
１組の実験において、ＥＲＣＣ５上流の調節領域を含有するルシフェラーゼレポーター構築体とともにＣＭＶ−ＣＥＢＰＧ発現ベクターを共トランスフェクトさせた。これらの実験を行なって、ＣＥＢＰＧがＥＲＣＣ５調節領域由来のルシフェラーゼをアップレギュレートするかどうかを判定した。第二組の実験において、連続的に欠失させたＥＲＣＣ５調節領域を含有するルシフェラーゼレポーター構築体を努力してトランスフェクトさせて、ＥＲＣＣ５調節領域内のＣＥＢＰＧ認識部位がＣＥＢＰＧによるアップレギュレーションの原因になることを確認した。これらの実験を行なうためには、はじめにａ）ＣＥＢＰＧの外因的なアップレギュレーションに続いてＥＲＣＣ５のアップレギュレーションが容易に観測されるような、ＣＥＢＰＧの内因性の発現が低い細胞集団を同定すること、ｂ）ＣＭＶ−ＣＥＢＰＧ発現ベクターを調製すること、及びｃ）ＥＲＣＣ５−ルシフェラーゼレポーター構築体を調製することが必要であった。このトランスフェクション実験に最も適した細胞系を同定するために、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｈ２３、Ｈ２０９、Ｈ４６０、Ｈ１４３７、Ｈ１３５５、及びＢＥＰ２Ｄが含まれる６つの気管支癌細胞系においてＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５を測定した。非ＢＣ個体のＮＢＥＣにおけるように（Mullins et al, 2005）、この２つの遺伝子間の相関性は強く（Ｒ２＞０．９９）、ＣＥＢＰＧによるＥＲＣＣ５の調節と一致する。しかしながら、回帰直線の傾きは、この細胞系の間ではずっと平坦であって、ＣＥＢＰＧと相乗的に作用してＥＲＣＣ５をアップレギュレートさせる１以上の因子の非存在と一致していた。具体的には、傾きは、この細胞系の間で１．０に近くて、ＮＢＥＣの間では１００に近かった。
Ｈ２３細胞系を選択したのは、それがＣＥＢＰＧ（２９９分子／１０６のＡＣＴＢ分子）とＥＲＣＣ５（１，５４０分子／１０６のＡＣＴＢ分子）について最低の内因性転写物存在量の数値を有したからである。
プラスミド創出
ＥＲＣＣ５−Ｌｕｃレポーター構築体
肺癌のない個体（Mullins et al, 2005 からの被検者＃２６０）のゲノムＤＮＡより、ＥＲＣＣ５調節領域（図８）をＰＣＲ増幅させて、ルシフェラーゼ発現ベクターのプロモーターのすぐ上流に挿入した。転写因子認識部位の１１０１ｂｐ ＥＲＣＣ５上流調節領域の解析についはすでに報告されている（Mullins et al., 2005）。アニーリング温度と二重鎖形成及び非特異結合の不足に基づいて最適のプライマー配列を同定するＯｌｉｇｏ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ソフトウェアバージョン６．０（コロラド州カスケード）を使用して、この挿入部位と２つのＣＥＢＰ認識部位を含有する調節領域の５８９ｂｐセグメントを増幅するためのプライマーを設計した。ＰＣＲ増幅には、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を使用した。次いで、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間にこのアンプリコンを連結した。
ＣＭＶ−ＣＥＢＰＧ及びＣＭＶ−ＣＥＢＰＢ発現ベクター
全長のＣＥＢＰＧ発現ベクターをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（アラバマ州ハンツヴィル）より購入した。制限酵素ＡｖａＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ニューハンプシャー州ハンプトン）を使用してＣＥＢＰＧ挿入物を切り出して、陰性対照プラスミドのｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６を得た。全長のＣＥＢＰＢクローンをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（アラバマ州ハンツヴィル）より購入し、ｐＯＴＢ７ベクターよりＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ酵素（それぞれ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッドと、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ニューハンプシャー州ハンプトン）で切り出して、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６へ連結した。
ＣＥＢＰＧ又はＣＥＢＰＢコーディング領域をＣＭＶプロモーターのすぐ下流で連結して、発現ベクターを形成した。すべての挿入物連結は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールスバッド）からの１０Ｘ ＤＮＡリガーゼ緩衝液とＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して実施した。プラスミド及び／又は挿入物を２％ ＮｕＳｉｅｖｅ（登録商標）ＧＴＧ（登録商標）アガロース（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、ニュージャージー州イーストラザフォード）上で電気泳動した。Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）への形質転換によりプラスミドを増幅させて、ＬＢ寒天、アンピシリン（１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）入りのＭｉｌｌｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ニューハンプシャー州ハンプトン）上で増殖させた細胞より単離した。ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ、Ｍｉｄｉ又はＭａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を使用して、プラスミド精製を実施した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を使用して、プラスミド及び挿入物のゲル抽出及び精製を実施した。抽出に続いて、元の配列と適正な配向性の確認のために、ＣＭＶ−ＣＥＢＰＧ及びＣＭＶ−ＣＥＢＰＢ発現ベクターを配列決定した。配列の証明に続いて、各プラスミドの多量をＭａｘｉｐｒｅｐより調製した。
トランスフェクションに最適な細胞系の同定
気管支癌細胞系のＨ４６０及びＨ２３と不死化ヒト気管支上皮細胞系のＢＥＰ２Ｄが含まれる３つの細胞系へＣＭＶ−ＣＥＢＰＧ発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて、Ｈ２３では最高の外因性ＣＥＢＰＧ転写が観測され、この外因性ＣＥＢＰＧ転写物に関連して増加するタンパク質発現をウェスタンブロットにより確認した（図９）。このように、Ｈ２３細胞系を後続の共トランスフェクション試験に使用した。共トランスフェクション試験では、ＣＥＢＰＧ又はＣＥＢＰＢのいずれか単独、又はＣＥＢＰＧ及びＣＥＢＰＢの組合せとともにＥＲＣＣ５−ＬＵＣプラスミドをＨ２３へ共トランスフェクトした。
Ｈ２３細胞におけるＥＲＣＣ５プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築体と７μｇのＣＥＢＰＧ又はＣＥＢＰＢの共トランスフェクション
第一組のトランスフェクション実験では、７μｇのＣＥＢＰＧ又はＣＥＢＰＢのいずれかの発現ベクターを３μｇのＥＲＣＣ５プロモーター−ルシフェラーゼ構築体とともに共トランスフェクトした。主たる関心は、ＣＥＢＰＧがＥＲＣＣ５を調節するかどうかを実験的に確かめることであったが、ＣＥＢＰＺを除くすべてのＣＥＢＰファミリーメンバーが同じコンセンサス結合部位へ結合し得るので、ＣＥＢＰＢを用いたトランスフェクションを実施して、非特異的な効果を検証した。７マイクログラムのｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６プラスミドを両方の発現ベクターの陰性対照として役立てた。７μｇでトランスフェクトされたＣＥＢＰＧ発現ベクターは、共トランスフェクション時のルシフェラーゼ活性の増加により見られるように、外因性ＥＲＣＣ５プロモーターを空のベクター対照よりほぼ２〜３倍高く再現可能的に活性化することが示された（図１０）。このことは、外因性ＣＥＢＰＧによる外因性ＥＲＣＣ５プロモーターの活性化と一致している。後続の実験では、より効率的なトランスフェクションにより、５〜７倍の増加が観測された。しかしながら、ＣＥＢＰＢは、空のベクター対照より少ないＥＲＣＣ５プロモーターの活性化（対照の６２％）を再現可能的に引き起こして、ＣＥＢＰＧとＣＥＢＰＢによるプロモーターの活性化の間の差は、有意であった（ｐ＝０．００８）。
転写物存在量とタンパク質発現の結果
最初のトランスフェクションからのｃＤＮＡでＳｔａＲＴ−ＰＣＲＴＭを実施して、ＣＥＢＰＧ転写物が発現ベクターによって産生されることを確かめた。ＤＮアーゼ処理による混在プラスミドＤＮＡの除去の後で、ＣＥＢＰＧ発現ベクターのトランスフェクションでは、空のベクター対照に対して１３０倍のＣＥＢＰＧ転写物増加を観測した。ウェスタンブロットも実施して、ＣＥＢＰＧ転写物存在量とＣＥＢＰＧタンパク質の増加の間の関連性を確認した（図９）。トランスフェクトされた細胞では、増加量のＣＥＢＰＧタンパク質だけでなく、内因性ＣＥＢＰＧタンパク質も観測された（レーン２）（図９）。
ＣＥＢＰＧ認識部位の役割を確認するためのＥＲＣＣ５調節領域欠失解析
Ｈ２３細胞にとって内因性の因子が外因性のＥＲＣＣ５プロモーターを活性化し得るかどうかを判定するために、３μｇの５８９ｂｐ ＥＲＣＣ５プロモーター−ルシフェラーゼ構築体だけをＨ２３細胞へトランスフェクトする実験を実施した。このセグメントの５’末端は、開始部位の５４０ｂｐ上流であり、この数を基準点として使用する。３μｇのｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクターのトランスフェクションを空のベクター対照として使用した。空のルシフェラーゼベクターと比較して、Ｐ−５４０ ＥＲＣＣ５プロモーターからは、１６，０００倍以上のより高いルシフェラーゼ活性化があった。このことは、Ｈ２３細胞にとって内因性の因子による、外因性ＥＲＣＣ５ Ｐ−５４０の活性化と一致している。
適正に設計されたＰＣＲプライマーを使用して、調節領域の５’末端（コーディング鎖に関して）からの連続的により長い欠失を作製した。欠失配列のそれぞれをｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクターへ連結して、配列と配向性を証明し、大きなスケールで調製して、抽出した。
図１０に示すルシフェラーゼ活性の結果は、Ｐ−３９０の値に関して提示する。Ｐ−３９０において、ＭＹＢ１部位の欠失は、Ｐ−５４０で観測されるものに比較して、Ｈ２３における内因性転写因子からのルシフェラーゼ発現の１０倍以上の増加をもたらし、Ｈ４６０におけるほぼ４倍の増加をもたらした。Ｐ−３６１におけるＣＥＢＰ１（開始部位に対してほとんど３’のＣＥＢＰ部位）やＰ−３２９におけるより遠位のＥ２Ｆ１部位の追加欠失では、変化を観測しなかった。しかしながら、Ｐ−２７０におけるより近位のＣＥＢＰ部位（ＣＥＢＰ２）、ＥＬＫ１、及びＥＶＩ１の組合せが含まれる欠失では、顕著な低下を観測した。
ＣＥＢＰ２部位の役割をより明確に定義するために、Higuchi (1988) 及び CeIi (1993) の方法の組合せを使用して、Ｐ−３６１よりそれを選択的に欠失させた。Ｈ４６０へトランスフェクトしたとき、Ｐ−３６１Δは、Ｐ−３６１で観測されるルシフェラーゼ活性の５０％を生じた。残る活性は、おそらくＥＬＫ１又はＹＹ１によるものであった。これは、Ｐ−３６１のＰ−３０７へのさらなる短縮は、ＥＬＫ１とＹＹ１の認識部位しか残さないが、Ｈ２３のＰ−３６１に比較してルシフェラーゼ活性は不変であり、ＹＹ１部位だけのプロモーター、Ｐ−２７０では、Ｈ２３（図１０）又はＨ４６０のいずれにおいてもルシフェラーゼ活性がほとんどないことに関連したからである。
ＥＲＣＣ５発現をダウンレギュレートすることにおけるＹＹ１の役割は、−２２２Ｇ対立遺伝子と−２２８Ｇ対立遺伝子の両方を含有するＰ−３６１のＨ４６０へのトランスフェクションによって裏付けられた。このベクターは、−２２２Ａと−２２８Ｔを含有するＰ−３６１に比較した、Ｈ４６０におけるＥＲＣＣ−Ｌｕｃ発現の５０％以上の低下に関連していた。
要約。上記のデータは、ＣＥＢＰＧ、ＭＹＢ１、ＹＹ１、及び／又はＥＬＫ１が非ＢＣ個体のＮＢＥＣにおけるＥＲＣＣ５調節に参画することを示している。さらに、配列決定データは、ＢＣ個体でのＣＥＢＰＧに対するＥＲＣＣ５の低下が、少なくとも一部の個体では、ＹＹ１認識部位での特定の対立遺伝子の遺伝により説明されるとする結論を支持する。これらの個体では、ＹＹ１がＣＥＢＰＧ、ＭＹＢｌ、及び／又はＥＬＫ１と相互作用することによって機能することが可能である。ＥＬＫ１との相互作用は、近傍性とＥＲＣＣ５−Ｌｕｃトランスフェクションの結果によるものである。
設計と方法
１１０名の非ＢＣと１１０名のＢＣ個体におけるＥＲＣＣ５配列により、ＥＲＣＣ５−２２２Ｇ対立遺伝子がＢＣ個体において有意に高い割合で表れることが確認される。
データに基づいた検出力分析は、この数の個体の配列情報を収集することで、０．０５のｐ値での有意差と８０％の検出力の実証が可能になることを示す。ＢＣ個体におけるＥＲＣＣ５−２２２Ｇ対立遺伝子の有意に高い出現率の実証は、このような個体が高いリスク状態にあることを示唆する。Ｐ＜０．０５で８０％の検出力の統計学的判定基準は、全部で１１０名の非ＢＣと１１０名のＢＣ個体の評価を示唆する。これは、ＥＲＣＣ５−２２２Ｇ対立遺伝子の頻度が１２名の非ＢＣ個体の間で７５％であり、１１名のＢＣ個体の間で９１％であった、本明細書に開示するデータに基づく。
非気管支癌（非ＢＣ）及び気管支癌（ＢＣ）の個体からの試料の採取
in vivo 存在するレベルを近似して表す数値を得る、ＮＢＥＣ生検試料における転写物存在量の定量的な ex vivo 測定を可能にする方法を使用して、測定を行う（Willey et al, 2000；Warner et al, 2003；Willey et al, 2004a；Willey et al, 2004b）。１つの実施例では、気管支鏡ブラシ生検を介してＮＢＥＣを得る。気管支鏡生検は、一般に、百万個より少ない細胞を生じる。ＰＣＲベースの遺伝子発現測定の方法は、これらの小試料における数百の測定を可能にするのに十分なシグナル増幅を伴う唯一の方法である（Canales et al, 印刷中）。
末梢血液試料の採取及び処理
各患者より、１０ｍｌの末梢血液をＤＮＡ単離用のヘパリン管へ採取して、２．５ｍｌの血液をＲＮＡ単離用の４つのＰＡＸ管（Ｑｉａｇｅｎ社）のそれぞれへ採取する。この２０ｍｌの末梢血液は、ほぼ１〜２ｘ１０８個のＷＢＣを含有する。ヘパリン管からの細胞の１０パーセント（ほぼ１０００万個の細胞）を配列決定試験用のＤＮＡ抽出に使用する。ヘパリン管からの細胞の９０パーセント（ほぼ９０００万個の細胞）を使用して、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｉｍ ３の下で計画した実験用の核抽出物を産生する。ＰＡＸ管中のすべての細胞をＳｔａＲＴ−ＰＣＲ転写物存在量の測定用のＲＮＡ抽出に使用する。
ＤＮＡ配列決定の方法
領域配列には、開始部位に対して−２１５〜−４５０ｂｐの２３５ｂｐが含まれる（図８を参照のこと）。この領域は、上記に記載のように、ＥＲＣＣ５転写調節に関与している可能性がある認識部位のすべてを含有する。所望される領域に基づいて、当業者に馴染みの方法を使用して、必要な配列決定プライマーを設計して、合成することができる。
２２０名の個体の正常気管支上皮細胞及び末梢血液細胞（ＰＢＣ）におけるＣＥＢＰＧ及びＥＲＣＣ５の発現を測定すること
ＥＲＣＣ５−２２２、−２２８、及び／又は他の多型部位での対立遺伝子がＣＥＢＰＧに対してより低いＥＲＣＣ５発現に関連しているという実証は、それらがＥＲＣＣ５のダウンレギュレーションの原因になることを示唆する。ＰＢＣでの発現パターンが正常気管支上皮細胞と同じであれば、このことは、肺癌リスクのバイオマーカーの開発への代替組織としてのそれらの使用を裏付けることになる。
ＮＢＥＣ試料の採取
三次気管支付近の正常に見える粘膜よりほぼ１０ブラシの生検を入手する。患者が肺炎、外傷、又はＢＣのような局部の病理状態を有するならば、ブラシは、反対の肺より取る。患者は、一様に、この処理のこの部分にはきわめてよく耐えて、合併症も不快感も伴わない。ＮＢＥＣ試料を配列決定と発現レベルの測定への使用のために処理する。それぞれの気管支鏡ブラシ生検の後で、このブラシをほぼ３ｍｌの氷冷生理食塩水中で旋回させて、細胞を追い出して回収することができる。各ブラシでほぼ５００，０００〜百万個の細胞を入手する。従って、１０回のブラシで、約５００〜１，０００万個の細胞を得る。３ｍｌの氷冷生理食塩水中のこれらの細胞をＲＮＡ及びタンパク質の抽出のために分割する。ほぼ５百万個の細胞を核タンパクの抽出に使用する（Dignam et al, 1983）。これにより、ＥＭＳＡ及びウェスタン・ハイブリダイゼーション分析用にほぼ１００μｇの核抽出物を得る。ほぼ百万個の細胞をＳｔａＲＴ−ＰＣＲ転写物存在量の測定用のＲＮＡ抽出に使用する。これにより、過去の経験に基づけば提案の試験に十分である３〜５μｇのＲＮＡを得る（Willey et al, 1997；Crawford et al, 2000）。
末梢血液試料の処理
上記に記載のように、各患者より２．５ｍｌの血液をＲＮＡ単離用の４つのＰＡＸ管（Ｑｉａｇｅｎ社）のそれぞれへ採取する。この細胞数（ほぼ１０８）から１０μｇより多いＲＮＡが入手されるはずであり、これは、提案される試験に十分である。
転写物存在量の測定
転写物存在量の測定にＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する。提案される試験へのＳｔａＲＴ−ＰＣＲの特別な利点は、本明細書の上記に記載され、投稿中の Nature Biotechnology の論文（Caneles et al, 印刷中）により裏付けられている。Caneles は、医薬品及び診断薬の開発における規制上の評価への公表されたＦＤＡ及びＣＬＩＡ推奨要件を満たすデータがＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより作成されることを明確に示している。同じくらい重要にも、定量的な転写物存在量の測定を評価した他の方法は、ＦＤＡ／ＣＬＩＡ判定基準を満たさなかった。
各ＮＢＥＣ及び血液ＲＮＡ試料に由来するｃＤＮＡ中のＣＥＢＰＧ及びＥＲＣＣ５の同一３検体測定を実施する。既報（Willey et al, 2004；Mullins et al, 2005；Caneles et al, 印刷中）のようなＳｔａＲＴ−ＰＣＲの標準法を使用する。簡潔に言えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素とオリゴｄＴプライマーを使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写する。１μｌの内部標準の標準化混合物（ＳＭＩＳ）（ＡＣＴＢ内部標準の６００，０００個の分子を含有する）に対して測定するときに１μｌが６００，０００個のＡＣＴＢ ｃＤＮＡ分子を含有するように、それぞれのｃＤＮＡ試料を希釈により較正する。それぞれの較正済みｃＤＮＡ試料の２μｌ、２μｌのＳＭＩＳをポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマー、及び緩衝液と合わせて最終２０μｌのＰＣＲ反応容量としたものをそれぞれのＳｔａＲＴ−ＰＣＲ測定に使用する。空気熱循環器（air thermocycler）におけるＰＣＲ増幅に続いて、生成物をサイズで分離して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００又はＣａｌｉｐｅｒ ＡＭＳ９０微小流動電気泳動デバイスで定量する。ネイティブな鋳型のピーク下面積と内部標準鋳型の既知量（分子数で）を定量して、両者間の比をソフトウェアにより自動的に計算して、試料中の初期のネイティブな鋳型の数値を分子数で得る。この数値を各測定中のＡＣＴＢ分子数と比較して、最終値を標的遺伝子の分子／１０６のＡＣＴＢ分子の形式で得る。このデータをすでに収集したデータと合わせて、予備データセクションに提示する。
ＥＲＣＣ５対ＣＥＢＰＧ転写物存在量の数値の二変量解析
上記に記載のように、ＢＣ個体では、ＥＲＣＣ５−２２２ ＧＧアレロタイプが、非ＢＣ個体間のＮＢＥＣ中のＣＥＢＰＧに関するＥＲＣＣ５の二変量解析より形成される回帰直線に対して、ＮＢＥＣにおける低いＥＲＣＣ５転写物存在量に関連していた。非ＢＣ個体の回帰直線は、２４の試料からのデータに基づいた（Mullins et al, 2005）。試料数を１１０へ高めることによって、回帰直線からの差の信頼度は、実質的に増加するものである。上記で得られた結果に基づけば、ＢＣ個体の８０％より多くがＥＲＣＣ５−２２２アレロタイプを有して、これらの個体のほぼ５０％が、非ＢＣ回帰直線の下方の２標準偏差より大きいＥＲＣＣ５の数値を有する。従って、１１０名のＢＣ個体のうちほぼ９０名は、ＥＲＣＣ５−２２２アレロタイプを有して、このうち４５名は、非ＢＣ回帰直線の２標準偏差下方にＥＲＣＣ５を有する。
ＮＢＥＣにおける解析に加えて、末梢血液試料より抽出したＲＮＡにおいてＥＲＣＣ５及びＣＥＢＰＧの転写物存在量を測定する。そのような試料中のＲＮＡは、主に好中球に由来して、リンパ球、マクロファージ、好酸球、及び好塩基球の割合は、この順でさらに小さい。末梢血液からの転写物存在量の測定は、それらだけでも、あるいはいくつかの他のＢＣリスク関連遺伝子の測定と組み合わせても、ＥＲＣＣ５及びＣＥＢＰＧの転写物存在量のＢＣリスクのバイオマーカーとしての解析を簡素化する。この応用へのＳｔａＲＴ−ＰＣＲの適格性は、例証されて（Peters et al, 投稿中）、ここではＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して、きわめて「正常」と特徴付けられた１５名の個体において１９の炎症関連遺伝子の転写物存在量を測定した。Peters et al が使用した重要な手法（血液試料をＰＡＸ管へ採取した後でＳｔａＲＴ−ＰＣＲ解析を続ける）を使用すると、この方法は、きわめて低い分析上の変動と、低頻度の生物学的変動に関連する。これらの結果は、個体群間の転写物存在量における小さな生物学上の差が各群２０名未満の被検者で同定され得ることを示す。
ＥＲＣＣ５対ＣＥＢＰＧ結果のＥＲＣＣ５−２２２アレロタイプへの比較
上記からのＥＲＣＣ５−２２２アレロタイプ分析と二変量の転写物存在量の二変量解析の結果を比較して、ＢＣ個体の間では、ＥＲＣＣ５−２２２ＧＧアレロタイプの、ＣＥＢＰＧに対して低下したＥＲＣＣ５との有意な関連があり、非ＢＣ個体の間ではそのような関連性が不足しているかどうかを決定する。上記に提示したデータでは、ＧＧアレロタイプのある５／９（５６％）のＢＣ個体が回帰直線より２標準偏差下方にＥＲＣＣ５を有したが、７名の非ＢＣ個体ではこの特性を有したものはいなかった。直線の下方にＧ／Ａのある１名の非ＢＣ個体がいたが、この個体は、稀な多型をＥＲＣＣ−２２８に有していた。妥当な検出力分析では、ＧＧアレロタイプのある非ＢＣの１／７（１４％）が低いＥＲＣＣ５を有する。従って、ＢＣ中の５６％と非ＢＣ中の１４％、各群で９５の試料が０．０５のαと８０％の検出力で有意差の検出を提供する。
ＣＥＢＰＧによるＥＲＣＣ５調節と調節に影響を及ぼす多型部位
非ＢＣ個体におけるＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の相関性とＢＣ個体におけるこの相関性の非存在の機序根拠についてアッセイすることができる。結果は、ａ）非ＢＣ個体では、ＥＲＣＣ５転写が主にＣＥＢＰＧにより調節される、そしてｂ）ＢＣ個体では、ＥＲＣＣ５の調節領域におけるＥＲＣＣ５−２２２、ＥＲＣＣ５−２２８、及び／又は他の多型部位での特定の対立遺伝子の遺伝が最適下限のＥＲＣＣ５転写調節に貢献することを示すだろう。これらの試験を実施するには、非ＢＣ個体及びＢＣ個体由来の一次正常気管支上皮細胞（ＮＢＥＣ）、並びに培養した正常、不死化、又は悪性の気管支上皮細胞を使用する。
データは、非ＢＣ個体のＮＢＥＣにおいて、ＥＲＣＣ５のＴＡレベルが転写因子ＣＥＢＰＧと有意に相関したことを示す。ＢＣ個体のＮＢＥＣでは、そのような相関性を観測しなかった。この相関性が存在するのは、非ＢＣ個体のＮＢＥＣでは、ＣＥＢＰＧがＥＲＣＣ５転写を調節して、ＢＣ個体では、ＥＲＣＣ５とＣＥＢＰＧ転写物存在量の相関性の不足として観測される、最適下限の調節があるからである。さらに、ＥＲＣＣ５と評価した他の転写因子（ＣＥＢＰＢ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ６、及びＥＶＩが含まれる）の間には相関性が存在せず、ＣＥＢＰＧが非ＢＣ個体のＮＢＥＣにおけるＥＲＣＣ５調節の支配的な決定因子であることを示した。特に、ＣＥＢＰＡ、Ｄ、及びＥは、ＮＢＥＣにおいて、ごく低く、おそらくは有意でないレベルで発現されていた。
ＢＣ個体由来のＮＢＥＣ試料におけるＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の間のより低い相関性の根底にある機序は、図６に概略的に表される、３つの一般的な群へ分類することができる。推定機序１：ＣＥＢＰＧ転写の低下が低いＣＥＢＰＧタンパク質に関連して、ＥＲＣＣ５転写の低下を引き起こす。その結果、ＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の間の二変量関係は、ＢＣＩ２により例示されるように、非ＢＣ個体（ＮＢＣＩ）の回帰直線に沿って減少するか、又はＢＣＩ１により例示されるように、回帰直線の上方であり得る。ＢＣＩ１は、調節に関与すると推定される他の転写因子の効果（ＥＬＫ１における増加、又はＭＹＢ１若しくはＹＹ１における減少が含まれる）により回帰直線の上方にあり得る。推定機序２は、ＣＥＢＰＧのコーディング領域又はＥＲＣＣ５の調節領域における突然変異により引き起こされるような、ＣＥＢＰＧとＥＲＣＣ５の調節領域の間の機能的な相互作用の低下に関連する。この場合、ＢＣ個体（例、ＢＣＩ３〜５）の二変量関係は、非ＢＣ回帰直線の下方に落ちる。推定機序３：これは、ＥＲＣＣ５を調節する、ＣＥＢＰＧ以外の転写因子（例、ＥＬＫ１、ＹＹ１、ＭＹＢ１）の機能を改変させて、ＥＲＣＣ５の数値を回帰直線の下方にする多型に関連する。配列決定データは、ＥＲＣＣ５調節領域内のＹＹ１認識部位での多型が改変されたＹＹ１機能に関連して、ＣＥＢＰＧに対するＥＲＣＣ５の減少をもたらすこと、そしてこれが、ＥＲＣＣ５−２２２ ＧＧアレロタイプのあるＢＣ個体の５０％より多くにおいてＥＲＣＣ５を回帰直線の下方にすることの主な原因となる機序であることを示している。
ＥＲＣＣ５転写の調節を検討するためのＥＲＣＣ５−Ｌｕｃ実験
ＣＥＢＰＧ解析
ＣＭＶ−ＣＥＢＰＧ発現ベクターを、特異的な欠失及び／又は部位突然変異を含有するＥＲＣＣ５−ＬＵＣベクターとともにＨ２３細胞（低いＣＥＢＰＧ発現体）へトランスフェクトする。この目的に適した細胞系はすでに同定した（例、Ｈ２３及びＨ４６０）。培養した細胞を可変量のＣＥＢＰＧ発現プラスミド（ｐＣＭＶ／ＣＥＢＰＧ）と、ＥＲＣＣ５プロモーターを上流に含有する一定量のＥＲＣＣ５−Ｌｕｃレポーター構築体とともに一過的に共トランスフェクトする。さらに、細胞にＲＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）プラスミドをトランスフェクトして、トランスフェクション効率を正規化する。各トランスフェクションにおいて、Ｌｕｃ活性をβ−ｇａｌ活性により割って、正規化したＬｕｃ活性を得る。ＣＥＢＰＧ ｃＤＮＡ挿入物のないプラスミド（ｐＣＭＶベクター）と標的遺伝子プロモーター構築体の調節領域のないＰＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクターを陰性対照として使用する。トランスフェクションから４８時間後、これらのトランスフェクタントについて、ルシフェラーゼアッセイ系により標的遺伝子プロモーターＬｕｃレポーター活性を分析する。
ＥＬＫ１解析
１）ＥＬＫ１部位を保存したＣＥＢＰ２部位欠失（Ｐ−３６１Δ）は、低いＣＥＢＰＧ発現系のＨ２３において、最適のＥＲＣＣ５−Ｌｕｃ活性を減少させない（図１０）。２）ＥＬＫ１及びＥＶＩ認識部位を含有するセグメントの欠失は、Ｈ２３とＨ４６０の両方においてＥＲＣＣ５−Ｌｕｃ活性の最大低下を引き起こす。３）ＥＶＩ１は、気管支上皮細胞においてごく低いレベルで発現されて、この部位は、おそらく、この文脈において関連していない。追加実験：１）特異的なＥＬＫ１欠失のあるＰ−３６１ＥＲＣＣ５−ＬＵＣを調製する。２）内因性ＥＬＫ１発現が高いか又は低い細胞系を同定する。３）ＣＭＶ−ＥＬＫ１発現ベクターを調製する。４）Ｐ−３６１ＥＲＣＣ５−Ｌｕｃ及びΔＥＬＫ１Ｐ−３６１ＥＲＣＣ５−Ｌｕｃ由来のルシフェラーゼ活性を、ａ）Ｈ２３及びＨ４６０において、ｂ）高い内因性のＥＬＫ１発現がある細胞系において、ｃ）外因性のＥＬＫ１アップレギュレーション後の内因性ＥＬＫ１発現が低い細胞系（ＣＭＶ−ＥＬＫ１）において評価する。
ＹＹ１解析
ＹＹ１認識部位ではなく、ＣＥＢＰ２及びＥＬＫ１を介したＥＲＣＣ５調節領域の欠失は、Ｈ２３（低いＣＥＢＰＧ）又はＨ４６０（高いＣＥＢＰＧ）におけるＥＲＣＣ５−Ｌｕｃ活性の完全な喪失を引き起こす。ＹＹ１部位中のＥＲＣＣ５−２２２対立遺伝子は、ＣＥＢＰＧに対するＥＲＣＣ５の低い転写物存在量と相関する。
ルシフェラーゼ活性を、ＥＬＫ１ｄｅｌＰ−３６１ＥＲＣＣ５−Ｌｕｃ由来のＨ２３及びＨ４６０において：ｉ．インタクトなＣＥＢＰ２と異なるＹＹ１対立遺伝子（ＥＲＣＣ５−２２２Ｇ若しくはＡ、及び／又はＥＲＣＣ５−２２８Ｇ若しくはＴ）；ｉｉ．異なるＹＹ１多型対立遺伝子が欠失したＣＥＢＰ２とＥＬＫ１の両方で評価して；ｉｉｉ．同じ実験をＨ２３又はＨ４６０においてＹＹ１のｓｉＲＮＡとともに実施する。さらに、ＥＭＳＡを利用して、組換えＣＥＢＰＧ又はＥＬＫ１のプロモーター配列に対する結合を評価することができる。ＥＭＳＡ技術は、当業者によく知られている。
ＮＢＥＣ中のＥＲＣＣ５へのＣＥＢＰＧ結合
上記に示したように、ＥＲＣＣ５及びＣＥＢＰＧのＴＡレベルは、非ＢＣ個体においては高い相関性を示すが、ＢＣ個体においては示さない。さらに、ＥＲＣＣ５調節領域のＣＥＢＰ２部位へ導入した部位特異的突然変異は、Ｈ２３へのトランスフェクションに続くルシフェラーゼ活性の低下に関連した。これらの結果は、ＥＲＣＣ５を調節するのにＣＥＢＰＧが重要な役割を担うことを示す。さらに、非ＢＣ個体に対するＢＣ個体のＮＢＥＣがより低いＣＥＢＰＧ−ＤＮＡ結合アフィニティーによるのかどうかを判定するために、ゲルシフトアッセイ（ＥＭＰＳＡ）実験と免疫組織化学アッセイを実施することができる。
ＥＭＳＡ実験は、非ＢＣ個体及びＢＣ個体より入手する気管支ブラシ生検試料を用いて実施する。気管支ブラシ試料の獲得は、上記に記載の通りである。ＲＮＡ抽出用に１〜２百万個の細胞を取り出した後で、ほぼ５百万個の細胞（ほぼ１００μｇのタンパク質を生じる）を核抽出物の調製に使用する（Dignam et al, 1983）。ＥＭＳＡ実験は、ＣＥＢＰ２認識部位が含まれる３２Ｐ−標識ＣＥＢＰＧオリゴヌクレオチドと核抽出物を使用して、（Periyasamy et al, 2000）のような当該技術分野で知られた方法を使用して実施する。ＣＥＢＰＧの特異抗体を分析に含めて、ＣＥＢＰＧ ＤＮＡ結合活性の特異性を確認する。精製したＣＥＢＰＧタンパク質を陽性対照として役立てる。
ＥＲＣＣ５及びＣＥＢＰＧに特異的な抗体を使用する免疫蛍光試験を実施して、ＢＣ個体に対する非ＢＣ個体の気管支ブラシ生検における、ＥＲＣＣ５及びＣＥＢＰＧのタンパク質レベルでの相関性を判定する。ＣＥＢＰＧ及びＥＲＣＣ５の発現レベルを定量するための特異抗体は容易に入手可能であり、市販ベンダー（例、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）より入手する。簡潔に言えば、非ＢＣ個体及びＢＣ個体からの気管支ブラシ生検試料より取り出した正常気管支上皮細胞をカバーグラス上で増殖させる。この細胞を浸透化させてメタノール／アセトンで固定する。このメタノール／アセトン固定は、広範囲の抗体での信頼し得る再現可能な染色をもたらすことが示されている。固定の後で、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで適切に希釈した一次抗体とともに室温で１時間インキュベートする。引き続き、この細胞をＰＢＳで洗浄し、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳに希釈したＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ５６８へ共役した二次抗体との３０〜６０分のインキュベーションを続ける。このインキュベーション工程の後で、細胞をＰＢＳで濯いで、０．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩと２％の抗褪色試薬を含有するＴＲＩＳ−ＨＣＬ緩衝化Ｍｏｗｉｏｌに載せる。染色の強度を蛍光顕微鏡下で定量する。低いＥＲＣＣ５のＢＣにおいて強度が低下すれば、肺細胞中のＥＲＣＣ５調節におけるＣＥＢＰＧの重要性と一致するだろう。
転写の速度及び安定性の測定
すでに開示した方法（Periyasamy et al, 1996 及び Willey et al, 1998）に従って、核の連続解析とＳｔａＲＴ−ＰＣＲを同じ試料に対して行って、ＥＲＣＣ５調節領域におけるある種の対立遺伝子の存在下でのＣＥＢＰＧによる標的遺伝子プロモーター活性の減少及び／又はＥＲＣＣ５ ＤＮＡ結合の減少が標的遺伝子転写の速度や定常状態の標的遺伝子転写物存在量レベルに影響を及ぼすかどうかを判定する。標的遺伝子の転写物存在量レベルの減少が安定性の減少によるのかどうかを判定するには、先に記載のように（Periyasamy et al, 1996）、様々な時間の時期でのアクチノマイシンＤでの処理後にＴＡレベルを分析する。
本発明の好ましい態様を本明細書において示して記載してきたが、当業者には、そのような態様は例示のためにのみ提供されることが明らかであろう。当業者には、本発明より逸脱することなく、数多くのバリエーション、変更、及び代用が思いつくであろう。本明細書に記載する本発明の態様の様々な代替物が本発明を実施するときに利用し得ることを理解されたい。以下の特許請求項は、本発明の範囲を規定して、これらの特許請求項の範囲内にある方法及び組成物とその同等物がそれに含まれると企図される。
本明細書において言及するすべての刊行物、特許、及び特許出願は、そのそれぞれの刊行物、特許、及び特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれるものとして示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
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図１は、バイオマーカーを同定するための全体の方法を例示する。 図２は、生物学的状態を診断するための全体の方法を例示する。 図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）それぞれの、５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のそれぞれとの相関性を例示し；そして（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩの散布図として提示する図３ｂのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。 図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）それぞれの、５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のそれぞれとの相関性を例示し；そして（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩの散布図として提示する図３ｂのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。 図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）それぞれの、５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のそれぞれとの相関性を例示し；そして（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩの散布図として提示する図３ｂのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。 図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）それぞれの、５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のそれぞれとの相関性を例示し；そして（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩの散布図として提示する図３ｂのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。 図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）それぞれの、５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のそれぞれとの相関性を例示し；そして（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩの散布図として提示する図３ｂのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。 図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）それぞれの、５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のそれぞれとの相関性を例示し；そして（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩの散布図として提示する図３ｂのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。 図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）それぞれの、５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のそれぞれとの相関性を例示し；そして（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩの散布図として提示する図３ｂのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。 図３（ａ〜ｆ）は、６つのＴＦ（（ａ）ＣＥＢＰＢ、（ｂ）ＣＥＢＰＧ、（ｃ）Ｅ２Ｆ１、（ｄ）Ｅ２Ｆ３、（ｅ）Ｅ２Ｆ６、（ｆ）ＥＶＩ１）それぞれの、５つの遺伝子：ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１のそれぞれとの相関性を例示し；そして（ｇ〜ｈ）は、（ｇ）ＮＢＣＩ及び（ｈ）ＢＣＩの散布図として提示する図３ｂのＣＥＢＰＧ／ＸＲＣＣ１データを例示する。 図４ａは、ＮＢＣＩにおけるＸＲＣＣとＣＥＢＰＧの間の二変量解析を例示する。 図４ｂは、ＢＣＩにおけるＸＲＣＣとＣＥＢＰＧの間の二変量解析を例示する。 図５は、ＮＢＣＩ又はＢＣＩのいずれでも、ＸＲＣＣ１とＣＥＢＰＧの相関性が乏しいことを例示する。 図６は、１つのＮＢＣＩ（ＮＢＣＩ１）と５つのＢＣＩ（ＢＣＩ１−５）におけるＴＧ／ＣＥＢＰＧ発現レベルの概略的な二変量解析を例示する。 図７は、非ＢＣ（ひし形）又はＢＣ（四角形）の個体のＮＢＥＣにおけるＥＲＣＣ５とＣＥＢＰＧの二変量相関性の散布図表現を例示する。回帰直線は、非ＢＣ個体からのデータの直線相関性を表す。アウトライアーを円で囲む。 図８は、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃルシフェラーゼベクター（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）へクローン化したＥＲＣＣ５プロモーター領域を例示する。はじめに転写因子結合部位を解析したＥＲＣＣ５プロモーター領域の５８９塩基対部分を、ｐＧＬ２−ＢａｓｉｃベクターのＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位の間でクローン化した。 図９は、トランスフェクトしたＨ２３細胞のウェスタンブロット分析を例示する。ＣＥＢＰＧ及び／又はＣＥＢＰＢ又は空のベクターでトランスフェクトしたＨ２３細胞について、ＣＥＢＰＧの存在を解析した。各条件からの１０μｇの溶解液をロードした。全タンパク濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリーズ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して、比色法により定量した。精製したＣＥＢＰＧタンパク質を陽性対照として使用した（Ａｂｎｏｖａ．） 図１０は、トランケート型（truncated）ＥＲＣＣ５−Ｌｕｃを２つのＮＳＣＬＣ系へトランスフェクトすることによる内因性ＥＲＣＣ調節の解析を例示する。

Claims (88)

  1. 生物学的状態を示す転写因子バイオマーカーを同定する方法であって：
    複数の対照試料において、転写因子の発現レベル及び前記生物学的状態に関連している第一遺伝子の発現レベルをアッセイすること；
    複数の症例試料において、前記転写因子及び前記第一遺伝子の発現レベルをアッセイすること；及び
    前記対照試料において前記転写因子の発現レベルが前記第一遺伝子の発現レベルに相関するが前記症例試料においては相関しないかどうかを演繹して、それにより前記生物学的状態の転写因子バイオマーカーを同定することを含んでなる、前記方法。
  2. 前記第一遺伝子が前記対照試料において前記転写因子により調節される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生物学的状態に関連した１以上の追加の遺伝子の発現レベルをアッセイすることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第一遺伝子と前記１以上の追加遺伝子が前記対照試料において前記転写因子により調節される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記発現レベルの少なくとも１つを、ｍＲＮＡ転写物の存在量（abundance）をアッセイすることによってアッセイする、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることが：
    前記転写因子に対応する核酸を前記転写因子の競合鋳型との関連で測定すること；
    前記第一遺伝子に対応する核酸を前記第一遺伝子の競合鋳型との関連で共同測定すること；及び
    前記転写因子の数値を前記第一遺伝子の数値と比較する関係を入手することを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記競合鋳型を標準化混合物において提供する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることが：
    前記転写因子に対応する核酸を前記転写因子の競合鋳型とともに増幅させること；
    前記第一遺伝子に対応する核酸を前記第一遺伝子の競合鋳型とともに共同増幅させること；及び
    前記共同増幅より入手される増幅産物を比較することによって関係を入手することを含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記発現レベルの少なくとも１つを、タンパク質の存在量をアッセイすることによってアッセイする、請求項１に記載の方法。
  10. 約１０の症例試料と約１０の対照試料を使用する、請求項１に記載の方法。
  11. 約３０の症例試料と約３０の対照試料を使用する、請求項１に記載の方法。
  12. 約５０の症例試料と約５０の対照試料を使用する、請求項１に記載の方法。
  13. 約１００の症例試料と約１００の対照試料を使用する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記生物学的状態が気管支癌又はそのリスクであり、前記転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項１に記載の方法。
  15. 前記第一遺伝子が、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ５、ＣＡＴ、ＧＳＴＺ１、ｍＧＳＴ１、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記生物学的状態が気管支癌又はそのリスクであり、前記転写因子がＥ２Ｆ１である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記第一遺伝子が、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、又はＳＯＤ１である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記生物学的状態がＣＯＰＤ又はそのリスクであり、前記転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項１に記載の方法。
  19. 前記第一遺伝子が、ＸＲＣＣ１、ＣＡＴ、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２、ＧＳＴＺ１、ｍＧＳＴ１、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記生物学的状態がＣＯＰＤ又はそのリスクであり、前記転写因子がＥ２Ｆ１である、請求項１に記載の方法。
  21. 前記第一遺伝子が、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、又はＳＯＤ１である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記転写因子バイオマーカーを同定することに基づいて診断決定をすることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  23. 前記転写因子バイオマーカーを同定することに基づいて治療薬を投与することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  24. 生物学的状態を示すバイオマーカーを同定する方法であって：
    複数の対照試料において、遺伝子の発現レベル及び前記生物学的状態に関連している第一転写因子の発現レベルをアッセイすること；
    複数の症例試料において、前記遺伝子及び前記第一転写因子の発現レベルをアッセイすること；及び
    前記対照試料において前記遺伝子の発現レベルが前記第一転写因子の発現レベルに相関するが前記症例試料においては相関しないかどうかを演繹して、それにより前記生物学的状態のバイオマーカーを同定することを含んでなる、前記方法。
  25. 前記遺伝子が前記対照試料において前記第一転写因子により調節される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記生物学的状態に関連した１以上の追加の転写因子の発現レベルをアッセイすることをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記遺伝子が前記対照試料において前記第一転写因子と前記１以上の追加の転写因子により調節される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記発現レベルの少なくとも１つを、ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることによってアッセイする、請求項２４に記載の方法。
  29. 前記ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることが：
    前記遺伝子に対応する核酸を前記遺伝子の競合鋳型と混合すること；
    前記第一転写因子に対応する核酸を前記第一転写因子の競合鋳型との関連で測定すること；及び
    前記転写因子を前記競合鋳型と比較する関係を入手することを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記競合鋳型を標準化混合物において提供する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることが：
    前記遺伝子に対応する核酸を前記遺伝子の競合鋳型とともに共同増幅させること；
    前記第一転写因子に対応する核酸を前記第一転写因子の競合鋳型とともに共同増幅させること；及び
    前記共同増幅より入手される増幅産物を比較する関係を入手することを含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記発現レベルの少なくとも１つを、タンパク質の存在量をアッセイすることによってアッセイする、請求項２４に記載の方法。
  33. 約１０の症例試料と約１０の対照試料を使用する、請求項２４に記載の方法。
  34. 約３０の症例試料と約３０の対照試料を使用する、請求項２４に記載の方法。
  35. 約５０の症例試料と約５０の対照試料を使用する、請求項２４に記載の方法。
  36. 約１００の症例試料と約１００の対照試料を使用する、請求項２４に記載の方法。
  37. 前記生物学的状態が気管支癌又はそのリスクであり、前記第一転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項２４に記載の方法。
  38. 前記遺伝子が、ＸＲＣＣ１、ＣＡＴ、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＺ１、ｍＧＳＴ１、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１である、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記生物学的状態が気管支癌又はそのリスクであり、前記第一転写因子がＥ２Ｆ１である、請求項２４に記載の方法。
  40. 前記遺伝子が、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、又はＳＯＤ１である、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記生物学的状態がＣＯＰＤ又はそのリスクであり、前記第一転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項２４に記載の方法。
  42. 前記遺伝子が、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２、ＣＡＴ、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＺ１、ｍＧＳＴ１、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１である、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記生物学的状態がＣＯＰＤ又はそのリスクであり、前記第一転写因子がＥ２Ｆ１である、請求項２４に記載の方法。
  44. 前記遺伝子が、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、又はＳＯＤ１である、請求項１９に記載の方法。
  45. 前記バイオマーカーを同定することに基づいて診断決定をすることをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
  46. 前記バイオマーカーを同定することに基づいて治療薬を投与することをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
  47. 生物学的状態を示す多型を同定する方法であって：
    転写因子の発現レベルが遺伝子の発現レベルと相関する複数の対照試料を入手すること；
    前記転写因子の発現レベルが前記遺伝子の発現レベルと相関しない複数の症例試料を入手すること；及び
    前記対照試料の１以上と比較した前記症例試料の１以上において、前記転写因子及び／又は前記遺伝子中のヌクレオチド変異を同定して、それにより前記生物学的状態を示す多型を同定することを含んでなる、前記方法。
  48. 前記遺伝子が前記生物学的状態に関連していることが知られている、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記転写因子が前記生物学的状態に関連していることが知られている、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記転写因子が前記対照試料において前記遺伝子を調節する、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記発現レベルの少なくとも１つを、ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることによってアッセイする、請求項４７に記載の方法。
  52. 前記ｍＲＮＡ転写物の存在量をアッセイすることが：
    前記転写因子に対応する核酸を前記転写因子の競合鋳型とともに共同増幅させること；
    前記遺伝子に対応する核酸を前記遺伝子の競合鋳型とともに共同増幅させること；及び
    前記共同増幅より入手される増幅産物を比較する関係を入手することを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記競合鋳型を標準化混合物において提供する、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記発現レベルの少なくとも１つを、タンパク質の存在量をアッセイすることによってアッセイする、請求項４７に記載の方法。
  55. 約１０の症例試料と約１０の対照試料を使用する、請求項４７に記載の方法。
  56. 約３０の症例試料と約３０の対照試料を使用する、請求項４７に記載の方法。
  57. 約５０の症例試料と約５０の対照試料を使用する、請求項４７に記載の方法。
  58. 約１００の症例試料と約１００の対照試料を使用する、請求項４７に記載の方法。
  59. 前記生物学的状態が気管支癌又はそのリスクであり、前記転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項４７に記載の方法。
  60. 前記遺伝子が、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＳＯＤ１、ＧＳＴＺ１、ｍＧＳＴ１、ＣＡＴ、又はＧＰＸ１である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記多型がＥＲＣＣ５のＹＹ１転写因子認識部位にある、請求項４７に記載の方法。
  62. 前記多型がＥＲＣＣ５遺伝子内の塩基−２２２及び／又は塩基−２２８にある、請求項４７に記載の方法。
  63. 前記多型がＸＲＣＣ１のＳｐ１転写因子認識部位にある、請求項４７に記載の方法。
  64. 前記多型がＸＲＣＣ１遺伝子内の塩基−７７にある、請求項４７に記載の方法。
  65. 前記多型がＸＲＣＣ１のＹＹ１転写因子認識部位にある、請求項４７に記載の方法。
  66. 前記生物学的状態が気管支癌又はそのリスクであり、前記転写因子がＥ２Ｆ１である、請求項４７に記載の方法。
  67. 前記遺伝子が、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、又はＳＯＤ１である、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記生物学的状態がＣＯＰＤ又はそのリスクであり、前記転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項４７に記載の方法。
  69. 前記遺伝子が、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＺ１、ｍＧＳＴ１、ＳＯＤ１、又はＧＰＸ１である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記生物学的状態がＣＯＰＤ又はそのリスクであり、前記転写因子がＥ２Ｆ１である、請求項４７に記載の方法。
  71. 前記遺伝子が、ＥＲＣＣ５、ＧＳＴＰ１、又はＳＯＤ１である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記対照試料における前記遺伝子の発現レベルを前記転写因子の発現レベルと比較する第一の関係を入手すること；
    前記症例試料の１つにおける前記遺伝子の発現レベルを前記転写因子の発現レベルと比較する第二の関係を入手すること；
    前記第一及び第二の関係を比較すること；及び
    前記ヌクレオチド変異を同定するために、前記比較に基づいて前記転写因子及び／又は前記遺伝子の領域を解析することをさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
  73. 前記第一の関係が、前記転写因子の発現レベルを前記遺伝子の発現レベルに対してプロットすることより入手される回帰直線である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記第二の関係が、前記転写因子の前記発現レベルの、前記遺伝子の前記発現レベルに対する座標点である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記比較が、前記座標点が前記回帰直線上に、その上方、又はその下方にあるかどうかを決定することを含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記座標点が前記回帰直線の上方にあり、前記領域が前記転写因子の５’調節領域である、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記生物学的状態がＢＣ又はそのリスクであり、前記転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記座標点が前記回帰直線の上方にあり、前記領域が前記転写因子の３’非翻訳領域である、請求項７５に記載の方法。
  79. 前記生物学的状態がＢＣ又はそのリスクであり、前記転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記座標点が前記回帰直線の下方にあり、前記領域が前記転写因子のコーディング領域である、請求項７５に記載の方法。
  81. 前記生物学的状態がＢＣ又はそのリスクであり、前記転写因子がＣＥＢＰＧである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記生物学的状態がＢＣ又はそのリスクであり、前記コーディング領域がＣＥＢＰＧのｂＺｉｐである、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記生物学的状態がＢＣ又はそのリスクであり、前記転写因子がＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、又はＦＯＳである、請求項８０に記載の方法。
  84. 前記座標点が前記回帰直線の下方にあり、前記領域が前記遺伝子の転写因子認識部位である、請求項７５に記載の方法。
  85. 前記生物学的状態がＢＣ又はそのリスクであり、前記領域が前記遺伝子のＣＥＢＰＧ認識部位である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記遺伝子が、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ５、ＳＯＤ１、ＧＳＴＺ１、ｍＧＳＴ１、ＣＡＴ、ＧＳＴＰ１、又はＧＰＸ１である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記多型を同定することに基づいて診断決定をすることをさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
  88. 前記多型を同定することに基づいて治療薬を投与することをさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
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