JP2009282112A - Confocal microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、共焦点顕微鏡に関し、特に構成を簡略化して高速サンプリングすることができる共焦点顕微鏡に関する。 The present invention relates to a confocal microscope, and more particularly to a confocal microscope capable of simplifying the configuration and performing high-speed sampling.
従来より、共焦点顕微鏡は、試料上の収束光点をスキャンして、試料からの蛍光や反射光などの戻り光を結像させて画像を得ることによって試料を観察するために用いられている。この共焦点顕微鏡は、例えば生物関連やバイオテクノロジー関連などの技術分野においては生きた細胞の形態観察や生理反応観察などに用いられ、例えば半導体関連などの技術分野においては集積回路の表面観察などに用いられている。また、共焦点顕微鏡は、特にZ軸上(深さ方向)の分解能が極めて高いため、これら以外の用途でも多用されてきている。 Conventionally, a confocal microscope is used to observe a sample by scanning a convergent light spot on the sample and forming an image by forming an image of return light such as fluorescence or reflected light from the sample. . This confocal microscope is used, for example, for observing the shape of a living cell and observing physiological responses in technical fields such as biological and biotechnological fields, and for example for observing the surface of integrated circuits in technical fields such as semiconductors. It is used. In addition, since the confocal microscope has particularly high resolution on the Z axis (in the depth direction), it has been widely used in other applications.
このような共焦点顕微鏡としては、代表的なものとして、例えばニポウディスク方式を採用したもの、ガルバノメータミラーを採用したもの、DMD(Digital Micromirror Device)方式を採用したものが知られている。ニポウディスク方式は、複数の小孔(ピンホール)の開いたディスクを機械的に回転させて、試料上に生成されるピンホールの像をスキャンするものであり、ガルバノメータミラーを採用した方式は、光源から照射されたレーザ光を点状に絞り、この点の像を扇形に回転振動するミラーで振って、試料上に生成される輝点によりレーザスキャンするものである。また、DMD方式は、微小ミラーの傾斜を制御してミラーに反射した光を試料上にスキャンするものである。 As such a confocal microscope, as a typical one, for example, a type employing a Nipkow disk system, a type employing a galvanometer mirror, and a type employing a DMD (Digital Micromirror Device) system are known. The Niipou disc method scans the image of the pinhole generated on the sample by mechanically rotating a disc with a plurality of small holes (pinholes). The method using a galvanometer mirror is a light source The laser beam emitted from the laser beam is narrowed in a dot shape, and the image of this point is shaken by a fan that rotates and vibrates in a fan shape, and laser scanning is performed with a bright spot generated on the sample. In the DMD method, the light reflected by the mirror is scanned on the sample by controlling the tilt of the micromirror.
そして、これらの複数の方式を採用して、試料の領域を選択的に照明して観察するようにした共焦点顕微鏡も知られている。この共焦点顕微鏡は、例えば光源からの照射光が集光レンズと回転式フィルタを介してDMDに入射し、DMDでオン制御された微小ミラー領域に照射した光のみが第2のニポウディスクのマイクロレンズに入射する。マイクロレンズを通過した光は第1のニポウディスクのピンホールに結像され、対物レンズによって試料の選択された領域に結像する。この試料の選択された領域から発せられる蛍光などの反射光は入射光路を逆向してダイクロイックミラーによって反射され結像レンズにより2次元光検出器に結像される構成となっている(例えば、特許文献1参照)。 A confocal microscope is also known that employs a plurality of these methods to selectively illuminate and observe a sample region. In this confocal microscope, for example, light emitted from a light source is incident on a DMD through a condensing lens and a rotary filter, and only the light irradiated on a micromirror region that is on-controlled by the DMD is a microlens of the second Nipou disk. Is incident on. The light that has passed through the microlens is imaged on the pinhole of the first Niipou disk and is imaged on a selected region of the sample by the objective lens. Reflected light such as fluorescent light emitted from a selected region of the sample is reflected by a dichroic mirror in the opposite direction of the incident optical path and imaged on a two-dimensional photodetector by an imaging lens (for example, patent) Reference 1).
上記特許文献1記載の共焦点顕微鏡は、光の利用効率を高めつつDMDを用いて試料の領域を選択的に照明して観察することができるので、ケージド試薬の広い応用や複数の微小領域で順次光解除刺激を行って細胞内応答を観察することができる構成とされている。しかしながら、ニポウディスク方式とDMD方式とを採用するため、装置構成が複雑化するとともにテレセントリック光学系で光学設計を単純化してコンパクトに共焦点顕微鏡を構築することができず、コストダウンを図りにくいという問題がある。
Since the confocal microscope described in
そこで、本発明は、このような問題を解決するものであって、試料の観察の応用範囲を維持してコンパクト化およびコストダウンを図ることができる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention solves such a problem, and an object of the present invention is to provide a confocal microscope capable of reducing the size and cost while maintaining the application range of sample observation.
本発明に係る共焦点顕微鏡は、試料面をレーザ光で走査してその焦点面の光により試料を観察する共焦点顕微鏡であって、前記レーザ光を照射する光源と、前記光源からのレーザ光を複数のビームスポットを構成する画素ごとにそれぞれ偏光方向を回転させて反射可能なLCOSからなる光空間変調器と、前記光空間変調器により反射され前記試料面に投影された複数のスポット光から前記焦点面の反射光を読み取る撮像素子と、前記光空間変調器および前記撮像素子を制御する制御手段とを備えたことを特徴とする。 A confocal microscope according to the present invention is a confocal microscope that scans a sample surface with a laser beam and observes the sample with the light on the focal plane, the light source for irradiating the laser beam, and the laser beam from the light source A spatial light modulator made of LCOS that can be reflected by rotating the polarization direction for each pixel constituting a plurality of beam spots, and a plurality of spot lights reflected by the light spatial modulator and projected onto the sample surface. An image pickup device that reads reflected light from the focal plane, and a control unit that controls the light spatial modulator and the image pickup device are provided.
上記構成によれば、複数のビームスポットを構成する光空間変調器がLCOSからなるため、従来のニポウディスクやDMDなどの複雑な装置構成を不要としつつも試料の観察の応用範囲を維持してコンパクト化およびコストダウンを図ることができる。 According to the above configuration, the spatial light modulator that configures a plurality of beam spots is made of LCOS, so that it is compact while maintaining the application range of sample observation while eliminating the need for complicated device configurations such as conventional Niipou discs and DMDs. And cost reduction.
また、本発明に係る共焦点顕微鏡において、前記光空間変調器により反射され前記試料面に投影された複数のスポット光からの反射光を画素ごとにそれぞれ偏光方向を回転させて反射するLCOSからなるピンホールアレイをさらに備え、前記制御手段は、前記ピンホールアレイをさらに制御する構成としてもよい。 Further, in the confocal microscope according to the present invention, it is composed of LCOS that reflects reflected light from a plurality of spot lights reflected by the spatial light modulator and projected onto the sample surface by rotating the polarization direction for each pixel. A pinhole array may be further provided, and the control unit may further control the pinhole array.
また、本発明に係る共焦点顕微鏡において、前記制御手段は、前記光空間変調器の前記複数のビームスポットの位置、配列、および数の少なくとも一つを変化させる構成とされていてもよい。 In the confocal microscope according to the present invention, the control means may be configured to change at least one of the position, arrangement, and number of the plurality of beam spots of the spatial light modulator.
また、本発明に係る共焦点顕微鏡において、前記制御手段は、前記ピンホールアレイの前記複数のピンホールの位置、配列、および数の少なくとも一つを変化させる構成とされていてもよい。 In the confocal microscope according to the present invention, the control means may be configured to change at least one of the position, arrangement, and number of the plurality of pinholes of the pinhole array.
以上のように本発明によれば、試料の観察の応用範囲を維持してコンパクト化およびコストダウンを図ることができる共焦点顕微鏡を提供することができる。 As described above, according to the present invention, it is possible to provide a confocal microscope capable of reducing the size and cost while maintaining the application range of sample observation.
次に、本発明に係る共焦点顕微鏡の実施形態について図面に基づいて説明する。 Next, an embodiment of a confocal microscope according to the present invention will be described with reference to the drawings.
図1は、本発明の一実施形態に係る共焦点顕微鏡の例を示す構成図である。また、図2および図3は、同共焦点顕微鏡の動作原理を説明するための説明図である。 FIG. 1 is a configuration diagram illustrating an example of a confocal microscope according to an embodiment of the present invention. 2 and 3 are explanatory diagrams for explaining the operation principle of the confocal microscope.
図1に示すように、共焦点顕微鏡1は、例えば光源11と、拡散板12と、コリメータレンズ13と、偏光板14と、偏光ビームスプリッタ15と、結像レンズ16と、λ/4波長板17と、対物レンズ18と、光空間変調器20と、CCDカメラ29とを備えて構成されている。
As shown in FIG. 1, the
光源11は、レーザダイオードなどにより構成され、試料19に照射される励起光であるレーザ光を出力する。拡散板12およびコリメータレンズ13は、光源11からのレーザ光を平行光にする。偏光板14は、拡散板12およびコリメータレンズ13を通過したレーザ光を一つの方向に振動する直線偏光に変える。
The
偏光ビームスプリッタ15は、偏光板14を通して入射した光をその偏光成分により分離し、光空間変調器20に対してP偏光成分を透過させるとともにS偏光成分を反射させる。光空間変調器20は、例えば反射型液晶素子(Liquid Crystal on Silicon:LCOS)からなり、複数の画素を配置した鏡面状のシリコンチップと表面のガラス層との間に液晶を挟み込んで構成されており、シリコンチップの裏側に各画素を駆動させるための駆動回路が埋め込まれた構造からなる。
The
この光空間変調器20は、コンピュータなどの図示しない制御手段に接続されており、オン制御中においては偏光ビームスプリッタ15により反射されたS偏光成分の光の偏光方向を各画素ごとに回転させて反射させることができる機能を備えている。この光空間変調器20における各偏光の回転角量(位相変調量)は、制御手段によって各画素ごとに個々に制御される。
The
したがって、光空間変調器20の表面20aにおいては、複数のビームスポット20bを生成することができ、点配列の面方向(水平・垂直方向)走査パターンの複数のスポット光を生成することができる。なお、複数のビームスポット20bの位置、配列、および数のうちの少なくとも一つは、制御手段の制御によって変化させることが可能である。このように、本例の共焦点顕微鏡1では、複数のビームスポット20bをLCOSからなる光空間変調器20によって生成することができるので、従来のニポウディスク方式やDMD方式の共焦点顕微鏡と比べて、ニポウディスクを回転させるための機械的要素やDMD固有の微小ミラー角度の配置制御的要素に基づく誤差がなく、走査精度を向上させることが可能となる。
Accordingly, a plurality of
この光空間変調器20によって生成された複数のスポット光を構成する反射光は、偏光ビームスプリッタ15を透過して結像レンズ16およびλ/4波長板17を介して偏光方位が90度回転され、対物レンズ18により試料19の測定面に結像される。
The reflected light constituting the plurality of spot lights generated by the
そして、試料19の測定面からの戻り光は、再び対物レンズ18、λ/4波長板17および結像レンズ16を通って偏光方位が90度回転された後、偏光ビームスプリッタ15によってCCDカメラ29に向けて直接反射され、このCCDカメラ29の撮像面に結像される。
Then, the return light from the measurement surface of the
このような構成の共焦点顕微鏡1によれば、光空間変調器20によって、オン制御中の画素からの光だけが伝達されて試料19の測定面に複数のスポット光を投影することができ、この測定面からの反射光を直接CCDカメラ29で撮像することができる。また、光空間変調器20によって、オン制御する画素を変化させて複数のビームスポット20bの位置を変化させることにより、測定面全体のすべての画素にスポット光を投影することができる。このため、従来のニポウディスクやDMDなどの構成部品を不要として共焦点顕微鏡1をコンパクトに構成することができ、コストダウンを図りつつ共焦点画像の取得を可能とすることができる。
According to the
すなわち、例えば従来のDMD方式を採用する共焦点顕微鏡では、DMDの各マイクロミラーがオンとオフとで例えば±10°傾くものでは、オフのマイクロミラーにより反射された光は光軸と40°の角度で反射するため、オフのマイクロミラーから反射する光がオンのマイクロミラーの光に干渉しないようにして、CCD素子、DMDおよび対物レンズの中心を、光軸上に配置してコンパクトに構成することは困難である。また、両側テレセントリック光学系の構成も容易ではない。 That is, for example, in a confocal microscope employing a conventional DMD method, if each DMD micromirror is tilted by ± 10 ° between on and off, the light reflected by the off micromirror is 40 ° to the optical axis. Since reflection is performed at an angle, the center of the CCD element, DMD, and objective lens is arranged on the optical axis in a compact manner so that the light reflected from the off micromirror does not interfere with the light of the on micromirror. It is difficult. In addition, the configuration of the double-sided telecentric optical system is not easy.
これに対し、本例の共焦点顕微鏡1では、オフの画素により反射される光はS偏光成分のままであり、再び偏光ビームスプリッタ15により反射されるためオン制御中の画素の光に干渉しない構造を実現し、テレセントリック光学系の構築が容易で、光学設計を単純化することができる。
On the other hand, in the
また、例えば正方形のDMDにおける画素サイズは一般に15μm程度であるのに対し、LCOSからなる光空間変調器20を採用した本例の共焦点顕微鏡1では、画素サイズをさらに小さくすることが可能となる。このため、共焦点顕微鏡1をニポウディスク方式やDMD方式の共焦点顕微鏡に比べて非常にコンパクトに構成し、コストダウンを図ることが可能となる。
Further, for example, the pixel size in a square DMD is generally about 15 μm, but in the
ここで、共焦点顕微鏡の動作原理は、図2に示すように、光源41からの光を集光レンズ42を介して集束し、ピンホール43およびビームスプリッタ44を透過させて対物レンズ45を通して試料49に照射し、その反射光を対物レンズ45を通してビームスプリッタ44により反射し、ピンホール46を介してCCDカメラ47に結像させることにより画像を取得するものである。
Here, as shown in FIG. 2, the operating principle of the confocal microscope is that the light from the
このような原理で測定する試料49の表面全体を面方向に走査を行うと、図2(b)および図3(a)に示すように、合焦しているときはビームスポット31aの形状が小さく、図3(b)に示すようにピンホール後の光強度が高いこととなる。一方、図2(a)や図2(c)および図3(a)に示すように、合焦していないときはビームスポット31bの形状が大きく、図3(b)に示すようにピンホール後の光強度が低いこととなる。すなわち、合焦していないときの反射光は、ほとんどがピンホールでカットされることになり、合焦位置のみの情報がCCDカメラ47で得られる。
When the entire surface of the
(光強度と輝度、最大輝度の使い方)
このことを利用して、試料49と対物レンズ45との距離を変化させ、一つの焦点面から他方まで走査するZ軸上の走査を行っている間に試料49の表面全体を面方向に走査して、各画素ごとに、最大輝度が得られたZ軸上の位置情報を保存して、各画素の焦点位置を分析することで試料49の高さ位置を導き出すことが可能となる。現在主流の共焦点顕微鏡では、画像の取得速度を上げるために、単一の点光源ではなく複数の点光源で試料49の表面全体を走査して、画像を高速、かつ高分解能で取得することができる。
(How to use light intensity and brightness, maximum brightness)
By utilizing this fact, the entire surface of the
図4は、本例の共焦点顕微鏡1の光空間変調器20による空間光パターンを説明するための説明図である。光空間変調器20の複数のビームスポット20bは、例えば点配列の面方向走査パターンの一例として構築されている。図4に示すように、光空間変調器20の画素を、隣接した光空間変調器20の画素によるビームスポットが、合焦していないときの大きな形状のビームスポットでもCCDカメラ47の画素に重なって入射しないようにして、同時に複数の画素をオン制御し、オン制御する画素を順次変化(例えば、図中a→pのように)させることですべての画素をオンにすることができる(試料49の表面全体を面方向に走査することができる)。
FIG. 4 is an explanatory diagram for explaining a spatial light pattern by the optical
図4に示した例では、例えば光空間変調器20において16回のオン制御を変化させることにより、すべての画素をオンにすることができる。また、この場合には、CCDカメラ47による16枚の画像を取得して、各画像のスポットサイズと輝度から合焦状態を求める処理を行って、試料49の高さの関係を導き出すことが可能となる。
In the example shown in FIG. 4, for example, by changing the on-
このように、本実施形態に係る共焦点顕微鏡1によれば、様々な試料を確実かつ正確に観察することができるので、従来のニポウディスク方式やDMD方式の共焦点顕微鏡と比べて観察の応用範囲を維持し(すなわち、観察に関して高い汎用性を備え)つつ、コンパクトな構成を採用することが可能となる。
As described above, according to the
図5は、同共焦点顕微鏡の光空間変調器を説明するための説明図である。図5(a)に示すように、共焦点顕微鏡1の光空間変調器20は、表面20aから見て複数の画素21を備えて構成され、各画素21ごとに入射光の位相を変更することができ、同図(b)に示すように、フレキシブルプリント基板22およびコネクタ23などを介して制御手段が搭載された基板などに接続されている。
FIG. 5 is an explanatory diagram for explaining an optical spatial modulator of the confocal microscope. As shown in FIG. 5A, the spatial
この光空間変調器20は、同図(c)に示すように、入射光および反射光の光路に配置された偏光ビームスプリッタ15などの偏光子とともに用いられ、光源11からの光を、オン制御中の画素21aにおいては偏光ビームスプリッタ15を透過するように反射し、オフ制御中の画素21bにおいては偏光ビームスプリッタ15により反射されるように反射することで、任意の空間光パターンを生成することができる。
The spatial
図6は、本発明の他の実施形態に係る共焦点顕微鏡の例を示す構成図である。なお、以降において、既に説明した部分と重複する箇所については同一の符号を付して説明を省略する。図6に示すように、この共焦点顕微鏡1Aは、上述した共焦点顕微鏡1とは、CCDカメラ29にて合焦していないときの光を排除するためのピンホールアレイ20Bを備え、試料19の共焦点画像をリアルタイムに取得するために適した構成となっている点が相違している。
FIG. 6 is a configuration diagram illustrating an example of a confocal microscope according to another embodiment of the present invention. In the following, portions that overlap with the portions already described are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted. As shown in FIG. 6, the
ピンホールアレイ20Bは、上述した光空間変調器20と同様にLCOSからなり、複数の画素を配置した鏡面状のシリコンチップと表面20Baのガラス層との間に液晶を挟み込んで構成されており、シリコンチップの裏側に各画素20Bbを駆動させるための駆動回路が埋め込まれ、図示しない制御手段に接続されていて、光空間変調器20と同期して、光空間変調器20のオン制御中の画素に対応した位置の画素がオンするように制御されている。
The
このピンホールアレイ20Bは、オン制御中においては偏光ビームスプリッタ27を透過した試料19からのP偏光成分の反射光の偏光方向を回転させてS偏光の光にして、偏光ビームスプリッタ27を反射させ結像レンズ28を介してCCDカメラ29に結像させる。オフの画素により反射される光はP偏光成分のままであり、再び偏光ビームスプリッタ15により透過されるためCCDカメラ29へは入射しない。したがって、ピンホールアレイ20Bの表面においては合焦しているときはビームスポットの形状が小さいため、ピンホールアレイ20BをなすLCOSの小さい画素サイズであってもビームスポットのすべてをCCDカメラ29に高い光強度で結像させることができる。一方、合焦していないときは、ビームスポットの形状が大きいためLCOSのオン制御中の画素、および隣接したオフの画素にも光が当たるが、オン制御中の画素によりビームスポットの中心部分のみがCCDカメラ29に結像されるため光強度が低いこととなる。すなわち、合焦していないときの反射光は、ほとんどがピンホールアレイ20Bでカットされることになり、合焦位置のみの情報がCCDカメラ29で得られる。
During the ON control, this
図7は、上述した図4における点配列の面方向走査パターンにより、平面状の試料を傾斜させて共焦点顕微鏡で測定したときのCCDカメラで撮像した画像を示したもので、図7(b)は図1に示した本発明の一実施形態に係る共焦点顕微鏡1で撮像した画像を表し、図7(c)は図6に示した本発明の他の実施形態に係る共焦点顕微鏡1Aで撮像した画像を表したものである。図7(c)に表す画像では、隣接した画素へのクロストークが生じないため、図4に示した例では、光空間変調器20において16回のオン制御を変化させることにより、すべての画素をオンにすることができ、図2に示したCCDカメラ47による16枚の画像を取得して、試料49の高さの関係を導き出すようにしたが、原理的には、CCDカメラ47の1枚の画像取得の時間内に16回のオン制御を変化させて、全画素をオン制御し1枚の画像として取得することも可能であり、この場合は第1回目の制御を行ったところを表している。また、例えば、光空間変調器20において4回のオン制御を変化させることにより、すべての画素をオンにするようにして、CCDカメラ47による4枚の画像取得により試料49の高さの関係を導き出すことができる。あるいは、図1に示した本発明の一実施形態の場合の画素を例に表した場合、CCDカメラ29の1枚の画像取得の時間内に、光空間変調器20において4回のオン制御を変化させて、すべての画素をオンにするようにすることで試料19の表面全体を走査して試料19の高さの関係を導き出すために1枚の画像取得で済ませられる。これにより、試料19の画像を正確にリアルタイムでCCDカメラ29に結像することができるようになる。
FIG. 7 shows an image picked up by a CCD camera when a planar sample is tilted and measured with a confocal microscope by the above-described point array surface direction scanning pattern in FIG. ) Represents an image captured by the
以上述べたように、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡1,1Aでは、ニポウディスクやDMDの代わりに、既存の半導体製造インフラを利用して生産可能なLCOSからなる光空間変調器20やピンホールアレイ20Bを用いることができるので、共焦点顕微鏡をコンパクトに構成してコストダウンを図ることができる。
As described above, in the
1,1A…共焦点顕微鏡、11…光源、12…拡散板、13…コリメータレンズ、14…偏光板、15,27…偏光ビームスプリッタ、16,28…結像レンズ、17…λ/4波長板、18…対物レンズ、19…試料、20…光空間変調器、20B…ピンホールアレイ。
DESCRIPTION OF
Claims (4)
前記レーザ光を照射する光源と、
前記光源からのレーザ光を複数のビームスポットを構成する画素ごとにそれぞれ偏光方向を回転させて反射可能なLCOSからなる光空間変調器と、
前記光空間変調器により反射され前記試料面に投影された複数のスポット光から前記焦点面の反射光を読み取る撮像素子と、
前記光空間変調器および前記撮像素子を制御する制御手段とを備えた
ことを特徴とする共焦点顕微鏡。 A confocal microscope that scans a sample surface with a laser beam and observes the sample with the light of the focal plane,
A light source for irradiating the laser beam;
A spatial light modulator composed of LCOS capable of reflecting the laser light from the light source by rotating the polarization direction for each pixel constituting a plurality of beam spots;
An image sensor that reads reflected light from the focal plane from a plurality of spot lights reflected by the spatial light modulator and projected onto the sample surface;
A confocal microscope, comprising: the spatial light modulator and a control unit that controls the imaging device.
前記制御手段は、前記ピンホールアレイをさらに制御することを特徴とする請求項1記載の共焦点顕微鏡。 A pinhole array made of LCOS that reflects the reflected light from the plurality of spot lights reflected by the light spatial modulator and projected onto the sample surface by rotating the polarization direction for each pixel;
The confocal microscope according to claim 1, wherein the control unit further controls the pinhole array.
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