JP2009131238A - 組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】被験者の細胞から抽出されたDNAを含有する第一試料を得、該DNAを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理して得られた第二試料を得、第一試料中に含まれるHPVのDNAの量に関する第一情報と、第二試料中に含まれるHPVのDNAの量に関する第二情報とを取得し、第一情報と第二情報とに基づいて、前記細胞中の組み込み型HPVの有無を判定する組み込み型HPVの有無の判定方法。
【選択図】 なし
Description
パヌ・ペイツァロ(Panu Peitsaro)ほか2名、「組み込み型16型ヒトパピローマウイルスは、新規定量的リアルタイムPCR技術により示されるように子宮頸癌前駆体に高頻度で見出される(Integrated Human Papillomavirus Type 16 Is Frequently Found inCervical Cancer Precursors as Demonstrated by a Novel Quantitative Real-TimePCR Technique)」、ジャーナル オブ クリニカル マイクロバイオロジー(Journal ofClinical Microbiology)、2002年3月、第40巻、p.886-891 フーゴ・アリアス−プリド(Hugo Arias-Pulido)ほか4名、「インサイチュ頸癌及び侵襲性頸癌における16型ヒトパピローマウイルス組み込み(Human Papillomavirus Type 16 Integration in Cervical Carcinoma InSitu and in Invasive Cervical Cancer)」、2006年5月、第44巻、p.1755-1762 レンスケ・ディー.エム.ステーンベルヘン(Renske D. M.Steenbergen)ほか6名、「組み込み型16型ヒトパピローマウイルス並びに口腔癌及びその派生細胞株における11q22及び18q21での異型接合性の喪失(Integrated Human Papillomavirus Type 16 and Loss of Heterozygosityat 11q22 and 18q21 in an Oral Carcinoma and Its Derivative Cell Line)」、キャンサー リサーチ(Cancer Research)、1995年11月15日、第55巻、p.5465-5471
(1) (A)被験者の細胞から抽出されたDNAを含有する第一試料を得るステップ、
(B)前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理して第二試料を得るステップ、
(C)前記ステップ(A)の第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量に関する第一情報と、前記ステップ(B)の第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量に関する第二情報とを取得するステップ、及び
(D)前記ステップ(C)で得られた第一情報と第二情報とに基づいて、前記細胞中の組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無を判定するステップ
を含む、組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無の判定方法、
(2) 前記ステップ(D)において、第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量が、第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量よりも少ないとき、細胞中に組み込み型ヒトパピローマウイルスが存在すると判定する、前記(1に記載の判定方法、
(3) 第一情報が、第一試料に含まれるDNAを鋳型として用い、かつヒトパピローマウイルスのDNAを増幅するためのプライマーセットを用いてDNAを増幅することにより得られた情報であり、前記第二情報が、第二試料に含まれるDNAを鋳型として用い、かつ該プライマーセットを用いてDNAを増幅することにより得られた情報である、前記(1又は2に記載の判定方法、
(4) 前記ヒトパピローマウイルスのDNA配列を増幅するためのプライマーセットが、組み込み型ヒトパピローマウイルスのDNA配列において、開裂の頻度が低い領域である、低開裂領域のDNA配列を増幅可能なプライマーセットである、前記(3)に記載の判定方法、
(5) 前記DNAの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法又はリガーゼ連鎖反応法により行なわれる、前記(3)又は(4)に記載の判定方法、
(6) 前記被験者の細胞が、子宮頸部の細胞又は口腔咽頭部の細胞である、前記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の判定方法、
(7) 前記ヒトパピローマウイルスが、ハイリスク型ヒトパピローマウイルスである、前記(1)〜(6)のいずれか1項に記載の判定方法、
(8) 前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、ATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、又はラムダエキソヌクレアーゼである、前記(1)〜(7)のいずれか1項に記載の判定方法、
(9) (E)第一試料及び/又は第二試料中におけるハウスキーピング遺伝子のDNAの有無の情報を取得するステップ、及び
(F)前記ステップ(E)で取得された情報に基づいて、前記ステップ(D)の判定の精度管理を行なうステップ
をさらに含む、前記(1)〜(8)のいずれか1項に記載の判定方法、
(10) 前記ステップ(B)において、前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、ヒトパピローマウイルスのDNAを切断しないエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とで処理して第二試料を得る、前記(1)〜(9)のいずれかに記載の判定方法、
(11) 前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理した後、得られた産物を、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でさらに処理する、前記(10)に記載の判定方法、並びに
(12) 前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とで同時に処理する、前記(10)に記載の判定方法、
に関する。
被験者の細胞から抽出されたDNAを含有する第一試料を得るステップ、
前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理して第二試料を得るステップ、
前記第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量に関する第一情報と、前記第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量に関する第二情報とを取得するステップ、及び
前記第一情報と前記第二情報とに基づいて、前記細胞中の組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無を判定するステップ
を含む。
第一試料及び/又は第二試料中におけるハウスキーピング遺伝子のDNAの有無の情報を取得するステップ、及び
前記ステップで取得された情報に基づいて、上述の組み込み型HPVの有無を判定するステップの判定の精度管理を行なうステップ
をさらに含むことが好ましい。
HPV16が染色体に組み込まれている子宮頸部由来細胞株であるSiHa細胞(1×106個細胞)のゲノムDNAを、DNA抽出キット〔キアジェン(QIAGEN)社製、商品名:QIAamp DNAミニキット〕を用いて抽出した。抽出したSiHa細胞のゲノムDNAに、ヌクレアーゼを含まないPCRグレードの水を添加し、SiHa細胞のゲノムDNAの水溶液(0.1μg/μL)を得た。
SiHa細胞に代えて、HPV18が染色体に組み込まれている子宮頸部由来細胞株であるHeLa細胞(1×106個細胞)を用いたことを除き、実施例1と同様にして、HeLa細胞のゲノムDNAの水溶液を得た。
実施例1の第一試料及び第二試料について、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAを増幅するためのプライマーセット(配列番号:15、5'-ggcaccctatggacacgc-3'、配列番号:16、5'-ggaaagccagtccccagaac-3')を用いて、実施例1と同様にして、リアルタイムPCRを行なった。その結果を図5に示す。図5は、実施例3のリアルタイムPCRによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
実施例2の第一試料及び第二試料について、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAを増幅するためのプライマーセット(配列番号:15及び配列番号:16)を用いて、実施例2と同様にして、リアルタイムPCRを行なった。その結果を図6に示す。図6は、実施例4のリアルタイムPCRによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
ヒト胃癌細胞株であるKATOIII細胞(1×106個細胞)のゲノムDNAを、DNA抽出キット〔キアジェン(QIAGEN)社製、商品名:QIAamp DNAミニキット〕を用いて抽出した。
製造例1で得られたKATOIII細胞のゲノムDNAを5μg含む緩衝液〔組成:10mMTris−HCl(pH7.5)、10mM塩化マグネシウム、1mMジチオスレイトール、5μgのKATOIII細胞のゲノムDNA、残部ヌクレアーゼフリーの精製水〕30μLを調製した。調製したゲノムDNAを含む緩衝液を、37℃で一晩インキュベーションした。つぎに、得られた産物を60℃で15分間インキュベーションし、非処理試料を得た。
比較例1と同じ操作により得られた非処理試料(30μL)に、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液〔×5 buffer(組成:334mMグリシン−水酸化ナトリウム(pH9.4)、150mM塩化マグネシウム、42mM 2−メルカプトエタノール、2.5mM rATP)〕10μLと、5UのγATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:ATP−Dependent Deoxyribonuclease、コード番号:ADD−101)とを添加した。得られた混合物にヌクレアーゼフリーの精製水を添加して、50μLの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、37℃で、6時間インキュベーションした後、75℃で15分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア(GE healthcare)社製、商品名:MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実施例5の試料を得た。
製造例1で得られたKATOIII細胞のゲノムDNA5μgと、5UのSacI(タカラバイオ株式会社製)とを含む緩衝液〔組成:10mMTris−HCl(pH7.5)、10mM塩化マグネシウム、1mMジチオスレイトール、5μgのKATOIII細胞のゲノムDNA、5UのSacI、残部ヌクレアーゼフリーの精製水〕30μLを調製した。調製したゲノムDNAとSacIとを含む緩衝液を、37℃で一晩インキュベーションした。つぎに、得られた産物を60℃で15分間インキュベーションし、SacI処理試料を得た。
比較例2と同じ操作により得られたSacI処理試料(30μL)に、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液10μLと、5UのγATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:ATP−Dependent Deoxyribonuclease、コード番号:ADD−101)とを添加した。得られた混合物に、ヌクレアーゼフリーの精製水を添加して50μLの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、37℃で、6時間インキュベーションした後、75℃で15分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア(GE healthcare)社製、商品名:MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実施例6の試料を得た。
実施例5の試料1μLに対して、リアルタイムPCR用キット〔キアジェン社製、商品名:Brilliant(登録商標) SYBR(登録商標) Green QPCR Master Mix、カタログ番号:#600548〕に含まれている試薬(商品名:×2 Master Mix)12.5μLと、参照用色素(商品名:Reference dye)0.4μLと、プライマーGADPH/DNA−F(10μM、配列番号:17、5'-ggcaccctatggacacgc-3')水溶液1μLとプライマーGADPH/DNA−R(10μM、配列番号:18、5'-ggaaagccagtccccagaac-3')水溶液1μLと、水9.1μLとを添加して、25μLのリアルタイムPCR用反応液を調製した。プライマーGADPH/DNA−FとプライマーGADPH/DNA−Rプライマーとからなるプライマーセットは、ゲノムDNAのグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAの一部を増幅するためのプライマーセットである。
製造例1と同様の操作を行なうことにより得られたKATOIII細胞のゲノムDNAの水溶液(0.3μg/μL)3μLに、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液〔×5 buffer(組成:334mMグリシン−水酸化ナトリウム(pH9.4)、150mM塩化マグネシウム、42mM 2−メルカプトエタノール、2.5mM rATP)〕10μLと、10U/μLのγATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液(東洋紡績株式会社製、商品名:ATP−Dependent Deoxyribonuclease、コード番号:ADD−101)1μLと、ヌクレアーゼフリーの精製水36μLとを添加し、50μLの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、37℃で3時間インキュベーションした後、75℃で10分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア(GE healthcare)社製、商品名:MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例1の試料を得た。
製造例1と同様の操作を行なうことにより得られたKATOIII細胞のゲノムDNAの水溶液(0.3μg/μL)3μLに、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液10μLと、10U/μLのγATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液1μLと、ヌクレアーゼフリーの精製水35μLとを添加し、反応用混合物を得た。得られた反応混合物を37℃で、1時間インキュベーションした。得られた産物に、10U/μLのγATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液1μLをさらに添加し、2時間インキュベーションした後、75℃で10分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア(GE healthcare)社製、商品名:MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例2の試料を得た。
製造例1と同様の操作を行なうことにより得られたKATOIII細胞のゲノムDNAの水溶液(0.3μg/μL)3μLに、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液10μLと、10U/μLのγATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液2μLと、ヌクレアーゼフリーの精製水35μLとを添加し、50μLの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、37℃で、3時間インキュベーションした後、75℃で10分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア(GE healthcare)社製、商品名:MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例3の試料を得た。
製造例1と同様の操作を行なうことにより得られたKATOIII細胞のゲノムDNAの水溶液(0.3μg/μL)3μLに、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液10μLと、10U/μLのγATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液1μLと、10U/μLのSacI(タカラバイオ株式会社製)2μLと、ヌクレアーゼフリーの精製水34μLとを添加し、50μLの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、37℃で、3時間インキュベーションした後、75℃で10分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア(GE healthcare)社製、商品名:MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例4の試料を得た。
製造例1と同様の操作を行なうことにより得られたKATOIII細胞のゲノムDNAの水溶液(0.3μg/μL)3μLに、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液10μLと、10U/μLのγATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液1μLと、10U/μLのXhoI(タカラバイオ株式会社製)2μLと、ヌクレアーゼフリーの精製水34μLとを添加し、50μLの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、37℃で、3時間インキュベーションした後、75℃で10分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア(GE healthcare)社製、商品名:MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例5の試料を得た。
KATOIII細胞のゲノムDNAの水溶液(0.3μg/μL)3μLに、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液10μLと、ヌクレアーゼフリーの精製水37μLとを添加し、50μLの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、37℃で、3時間インキュベーションした後、75℃で10分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア(GE healthcare)社製、商品名:MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例6の試料を得た。
試験例1において、実施例5の試料、実施例6の試料、比較例1の試料又は比較例2の試料に代えて、実験例1〜実験例5の試料それぞれを用いたことを除き、試験例1と同様に操作を行ない、増幅産物である二本鎖DNA中に挿入された蛍光色素〔キアジェン社製、商品名:Brilliant(登録商標) SYBR(登録商標) Green〕に基づく蛍光強度を、リアルタイムPCRシステム(STRATAGENE社製、商品名:Mx3005P)の検出器(波長516nm)で測定した。
製造例1と同様の操作を行なうことにより得られたKATOIII細胞のゲノムDNAの水溶液(3μg相当量)を、表1に示される条件で、γATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:ATP−Dependent Deoxyribonuclease、コード番号:ADD−101)、エキソヌクレアーゼ(ノバジェン社製、商品名:RingMasterTM Nuclease)、エキソヌクレアーゼIII(ニューイングランドバイオラボ社製)、T7エキソヌクレアーゼ(ニューイングランドバイオラボ社製)又はラムダエキソヌクレアーゼ(ニューイングランドバイオラボ社製)で処理した。
配列番号:2は、プライマーの配列である。
配列番号:3は、プライマーの配列である。
配列番号:4は、プライマーの配列である。
配列番号:5は、プライマーの配列である。
配列番号:6は、プライマーの配列である。
配列番号:7は、プライマーの配列である。
配列番号:8は、プライマーの配列である。
配列番号:9は、プライマーの配列である。
配列番号:10は、プライマーの配列である。
配列番号:11は、プライマーの配列である。
配列番号:12は、プライマーの配列である。
配列番号:13は、プライマーの配列である。
配列番号:14は、プライマーの配列である。
配列番号:15は、プライマーの配列である。
配列番号:16は、プライマーの配列である。
配列番号:17は、プライマーの配列である。
配列番号:18は、プライマーの配列である。
Claims (12)
- (A)被験者の細胞から抽出されたDNAを含有する第一試料を得るステップ、
(B)前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理して第二試料を得るステップ、
(C)前記ステップ(A)の第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量に関する第一情報と、前記ステップ(B)の第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量に関する第二情報とを取得するステップ、及び
(D)前記ステップ(C)で得られた第一情報と第二情報とに基づいて、前記細胞中の組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無を判定するステップ
を含む、組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無の判定方法。 - 前記ステップ(D)において、第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量が、第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのDNAの量よりも少ないとき、細胞中に組み込み型ヒトパピローマウイルスが存在すると判定する、請求項1に記載の判定方法。
- 第一情報が、第一試料に含まれるDNAを鋳型として用い、かつヒトパピローマウイルスのDNAを増幅するためのプライマーセットを用いてDNAを増幅することにより得られた情報であり、前記第二情報が、第二試料に含まれるDNAを鋳型として用い、かつ該プライマーセットを用いてDNAを増幅することにより得られた情報である、請求項1又は2に記載の判定方法。
- 前記ヒトパピローマウイルスのDNA配列を増幅するためのプライマーセットが、組み込み型ヒトパピローマウイルスのDNA配列において、開裂の頻度が低い領域である、低開裂領域のDNA配列を増幅可能なプライマーセットである、請求項3に記載の判定方法。
- 前記DNAの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法又はリガーゼ連鎖反応法により行なわれる、請求項3又は4に記載の判定方法。
- 前記被験者の細胞が、子宮頸部の細胞又は口腔咽頭部の細胞である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の判定方法。
- 前記ヒトパピローマウイルスが、ハイリスク型ヒトパピローマウイルスである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の判定方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、ATP依存型デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、又はラムダエキソヌクレアーゼである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の判定方法。
- (E)第一試料及び/又は第二試料中におけるハウスキーピング遺伝子のDNAの有無の情報を取得するステップ、及び
(F)前記ステップ(E)で取得された情報に基づいて、前記ステップ(D)の判定の精度管理を行なうステップ
をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の判定方法。 - 前記ステップ(B)において、前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、ヒトパピローマウイルスのDNAを切断しないエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とで処理して第二試料を得る、請求項1〜9のいずれかに記載の判定方法。
- 前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理した後、得られた産物を、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でさらに処理する、請求項10に記載の判定方法。
- 前記被験者の細胞から抽出されたDNAを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とで同時に処理する、請求項10に記載の判定方法。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5968522A (en) * | 1988-05-13 | 1999-10-19 | Institut Pasteur | Immunogenic compositions and antibodies directed against human papillomavirus type 49 (HPV 49), type 50 (HPV 50), type 54 (HPV 54), and type 55 (HPV 55). |
US6083692A (en) * | 1996-06-03 | 2000-07-04 | American Home Products Corporation | Method of detecting the presence and measuring the quantity of biological polymers |
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---|---|---|---|---|
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US6083692A (en) * | 1996-06-03 | 2000-07-04 | American Home Products Corporation | Method of detecting the presence and measuring the quantity of biological polymers |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6013013172; J. Clin. Microbiol., 2002, Vol.40, No.3, p.886-891 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013516993A (ja) * | 2010-01-19 | 2013-05-16 | ハー マジェスティ ザ クイーン イン ライト オブ カナダ アズ リプリゼンテド バイ ザ ミニスター オブ ヘルス | 46種類の粘膜型ヒトパピローマウイルスを検出しタイプを特定するためのプローブセット |
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