CN104928399A - 引物组、试剂盒及其在hpv全基因组检测中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一组引物,其包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少2对。该组引物能够分别与不同型别HPV特异性结合,而且,能用于扩增获得多种不同型别的HPV的完整基因组序列。本发明还公开该组引物的用途,一种试剂盒、试剂盒的用途和一种获取HPV全基因序列的方法。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测领域,具体的,本发明涉及一组引物、该组引物在HPV基因组的扩增和/或HPV的检测中的用途、一种试剂盒、该试剂盒在HPV基因组扩增、HPV分型和/或HPV检测中的用途,以及一种获得HPV全基因组序列的方法。
背景技术
***是世界上第三大常见女性肿瘤,并且86%病例发生在发展中国家[Arbyn M,Castellsague X,de Sanjose S,Bruni L,Saraiya M,Bray F,FerlayJ:Worldwide burden of cervicalcancer in 2008.Ann Oncol2011,22:2675–2686.]。据世界范围内统计,每年大约有46万左右新发病例,有超过20万的妇女死于***,世界每年发病的75-80%在发展中国家,中国由于人口众多,每年新发病例超过13万之多,占到世界发病的25%,且近年来处于增长趋势,在广大农村地区增高趋势更加明显,并呈现发病年龄提前的现象[开丽比努·依马木,马彩玲.***的诊断治疗进展[J].地方病通报,2006,21(6):62-65.]。
1977年ZurHause首先提出人***瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是***致病因素的假设;1992年,世界卫生组织(WHO)宣布人***瘤病毒是引起***变的首要因素;1995年,国际癌症研究署(IARC)专题讨论会将HPV感染确定为***的主要病因,明确***是一种感染性疾病。HPV感染是***发生的主要因素。
人***瘤病毒是乳多空病毒科(Papovaviridae)A亚群内的一组DNA病毒,无包膜,相对分子质量为5×106。基因组呈双链闭环状,含有7900对碱基。人***状瘤病毒是一个全球范围来,广泛传播的DNA病毒,主要感染人的粘膜及皮肤。研究表示99.7%的***组织中可以检测到HPV病毒。
HPV双链环状基因组DNA,主要包括四个部分,早期区域,晚期区域,上游调控区和在E5及L2之间极短的高突变率的非编码区。***状瘤病毒进化速度缓慢,以每年2±0.5×10-8个碱基突变频率进行。同时进化过程也呈现出组织及宿主特异性,导致HPV基因组多态性在进化过程中,只随机发生在各型别少数病毒亚型内[Bernard H U,Burk R D,Chen Z,et al.Classification of papillomaviruses(PVs)based on 189PV types and proposal oftaxonomic amendments(J).Virology,2010,401(1):70-79.]。
现有研究表明,HPV致病分子机制是病毒基因组DNA的复制和表达,其中早期基因区E1、E2、E4、E5、E6和E7转录是HPV在宿主细胞增殖的关键步骤[IARC Working Groupon the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.IARC Monographs on the evaluation ofcarcinogenic risks to humans[M].World Health Organization,2007.],目前对于HPV与***发生的研究仅局限在高危型HPV型别之间,很少探讨亚型致癌性的不同。
HPV检测广泛用于HPV相关恶性病变的自然史和病因学研究。传统方法主要是通过形态学和免疫学对其进行检测。前者包括巴氏涂片细胞学检测、***镜检查、宫颈活检组织病理学检查、电镜技术(直接观察病毒颗粒)、宫颈摄像检查以及宫颈荧光检查等。后者包括应用免疫组化法通过抗L1蛋白与外壳蛋白反应检测HPV、采用放射免疫沉淀法测定宫颈上皮细胞内瘤变(CIN)和***患者血清中的HPV16抗体水平、用血清免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的HPV E6、E7特异性抗体蛋白等[Sehr P,Zumbach K,Pawlita M.Ageneric capture ELISAfor recombinant proteins fused to glutathione S-transferase:validation forHPV serology[J].Journal of immunological methods,2001,253(1):153-162.]。传统方法的特异性和灵敏度不够理想,存在较高的假阴性率和假阳性率,且不便于对HPV进行分型,因而目前HPV的主要实验或诊断技术是应用分子生物学方法进行HPV-DNA检测。
目前所使用的HPV-DNA检测方法主要是使用聚合酶链式反应目前常用类型包括:通用引物PCR、型特异PCR(Type-Specific PCR)和实时荧光定量PCR。但这些方法都只基于不同亚型的某部分基因组区域(多数为100-500bp左右)进行分型检测。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一或者至少提出一种商业手段。
依据本发明的第一方面,本发明提供一组引物,该组引物能够特异性的结合不同型别的HPV,该组引物包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少2对,所称14对引物的序列分别如SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ IDNO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ ID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:25和26以及SEQ ID NO:27和28所示。在本发明的一些实施例中,该引物组包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少3对、至少4对、至少5对、至少5对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少11对、至少12对、至少13对引物或者全部14对引物。在本发明的一个实施例中,该组引物还包括序列如SEQ ID NO:29和30所示的一对引物。该组引物是发明人经过大量序列设计和大量试验筛选组合,确定下来的能够分别特异性的识别不同型别的HPV的引物,并且,该组引物能够在同一反应体系下互不干扰的特异性结合到各自的目标模板上,在同一反应体系中特异性扩增出多个型别的HPV全基因组序列。
依据本发明的第二方面,本发明提供一种前述任一实施例中的一组引物在HPV基因组的扩增和/或HPV的检测中的用途。利用前述本发明一方面或者任一实施例中的这组引物,能够对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和/或HPV66进行全基因扩增及全基因分型。既能快速对HPV病毒进行检测,同时也能对其基因组各种特性进行分析。
依据本发明的第三方面,本发明提供一种试剂盒,其包含前述任一实施例中的一组引物。该该试剂盒包含的引物是发明人经过大量序列设计和大量试验筛选组合,确定下来的能够分别特异性的识别不同型别的HPV的引物,并且,该引物能够在同一反应体系下互不干扰的特异性结合到各自的目标模板上,在同一反应体系中扩增出多个型别的HPV全基因组序列。
依据本发明的第四方面,本发明提供一种前述试剂盒在HPV基因组扩增、HPV分型和/或HPV检测中的用途。利用前述本发明这一方面的试剂盒,利用其所包含的引物,能够对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和/或HPV66进行全基因扩增及全基因分型。既能快速对HPV病毒进行检测,同时也能对其基因组各种特性进行分析。
基于一种能够对HPV病毒全基因组信息的检测方法将会更加有利于进行HPV病毒的鉴定及分型检测,有助于对型间变异体的检测,有助于对于***患者病情发展的预期,有助于更好的辅助指导临床策略。而且,HPV病毒基因组技术,也能够给HPV疫苗的研制、HPV感染的防治提供更多有效的意见,并且随着对HPV病毒基因组了解的深入,HPV全基因组技术可能有助于提供给患者个性化的医疗意见。本发明针对目前缺乏一种能对HPV病毒全基因组进行检测方法,提供一种检测HPV全基因组的方法。
检测HPV全基因组,需要获得HPV全基因组序列,依据本发明的第五方面,本发明提供一种获得HPV全基因组序列的方法,该方法包括以下步骤:从待测样品中获得核酸;利用上述本发明一方面或者任一实施例中的一组引物扩增所述核酸,获得扩增产物;对扩增产物进行序列测定,获得测序数据,测序数据包括多个读段;基于测序数据,获得HPV全基因组序列。所说的测序数据可以通过对核酸序列进行测序文库制备、上机测序获得,在本发明的一个实施例中,获取所述测序数据,包括:制备所述核酸的测序文库,对所述测序文库进行测序。测序文库的制备方法根据所选择的测序方法的要求进行,测序方法依据测序平台的不同可选择但不限于Illumina公司的Hisq2000/2500测序平台、LifeTechnologies公司的Ion Torrent平台和单分子测序平台,测序方式可以选择单端测序,也可以选择双末端测序,获得的下机数据是测读出来的片段,称为读段(reads)。在本发明的一个实施例中,在获得扩增产物之后,包括:电泳检测所述扩增产物,依据所得的电泳检测结果进行HPV分型,具体的,可以先利用通用引物例如利用SEQ ID NO:29和30,对获得的核酸进行第一扩增,电泳检测第一扩增是否有产物,即看电泳图谱上是否有扩增产物条带,若有条带说明该样品核酸中有含有HPV病毒的核酸,接着利用SEQ ID NO:1-28中的14对引物中的任意多对引物组合对所获得的核酸进行第二扩增,根据第二扩增的扩增产物的电泳检测结果,就能确定该样品核酸所含有的HPV类型。在本发明的一个实施例中,所说的基于测序数据获得HPV全基因组序列,包括:将测序数据中的读段与HPV参考序列进行比对,获得比对结果,依据所述比对结果,组装出HPV全基因组序列。所称的参考序列指预先确定的序列,可以是预先获得的待测核酸所属生物类别的任意参考模板,例如,若待测核酸为人类核酸,参考序列可选择NCBI数据库提供的HG19,若目标检测核酸是病毒核酸,参考序列可选择公开数据库中已有的该病毒的序列,进一步地,也可以预先配置包含更多参考序列的资源库,例如依据待测核酸的来源、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。所称比对可以利用已知比对软件进行,例如SOAP、BWA和/或TeraMap等。在本发明的一些实施例中,所称HPV参考序列包括HPV16参考序列、HPV18参考序列、HPV31参考序列、HPV33参考序列、HPV35参考序列、HPV39参考序列、HPV45参考序列、HPV51参考序列、HPV52参考序列、HPV56参考序列、HPV58参考序列、HPV59参考序列、HPV66参考序列和HPV68参考序列中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或者全部十四种。组装可以利用比对上HPV参考序列的读段在参考序列上的位置及读段之间的重叠信息来进行。
在本发明的一个实施例中,基于比对结果,能够识别检测出HPV核酸序列上的突变位点,将这些突变位点的突变频率等信息加入到组装出的HPV全基因组序列,使得组装出的HPV全基因组序列带有突变位点信息。这样,丰富了HPV基因组信息,利于以后更完善准确的HPV病毒的鉴定及分型检测,也利于对型间病毒变异体的更准确检测,有助于辅助预期判断***患者病情发展和辅助指导临床采取的治疗策略。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是本发明一个实施例中的检测扩增产物的电泳结果图。
图2是本发明一个实施例中的检测扩增产物的电泳结果图。
图3是本发明一个实施例中的比对情况示意图。
具体实施方式
依据本发明的一个实施例,提供一组引物,该组引物包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少2对,所称14对引物的序列分别如SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:25和26以及SEQ ID NO:27和28所示。该组引物是发明人经过大量序列设计和大量试验筛选组合,确定下来的能够分别特异性的识别不同型别HPV的引物,并且,该组引物能够在同一反应体系下互不干扰的特异性结合到各自的目标模板上,在同一反应体系中扩增出多个型别的HPV全基因组序列。而且,只需要利用所列的一对引物就能获得一种型别的HPV的完整基因组序列。
在本发明的一些实施例中,该引物组包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少3对、至少4对、至少5对、至少5对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少11对、至少12对、至少13对引物或者全部14对引物。该组引物是发明人经过大量序列设计和大量试验筛选组合,确定下来的能够分别特异性的识别不同型别HPV的引物,并且,该组引物能够在同一反应体系下互不干扰的特异性结合到各自的目标模板上,在同一反应体系中扩增出多个型别的HPV全基因组序列。而且,只需要利用所设计的一对引物就能获得一种型别的HPV的完整基因组序列。
在本发明的一个实施例中,该组引物还包括序列如SEQ ID NO:29和30所示的一对引物。该组引物是发明人经过大量序列设计和大量试验筛选组合,确定下来的能够分别特异性的识别不同型别HPV的引物,并且,该组引物能够在同一反应体系下互不干扰的特异性结合到各自的目标模板上,在同一反应体系中扩增出多个型别的HPV全基因组序列。而且,只需要利用所设计的一对引物就能获得一种型别的HPV的完整基因组序列。SEQ ID NO:1-30如表1所示。
表1
依据本发明的一个实施例,提供一种前述任一实施例中的一组引物在HPV基因组的扩增和/或HPV的检测中的用途。利用前述本发明任一实施例中的这组引物,能够对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和/或HPV66进行全基因扩增及全基因分型。既能快速对HPV病毒进行检测,同时也能对其基因组各种特性进行分析。
依据本发明的一个实施例,提供一种试剂盒,其包含前述任一实施例中的一组引物。该试剂盒包含的引物是发明人经过大量序列设计和大量试验筛选组合,确定下来的能够分别特异性的识别不同型别的HPV的引物,并且,该引物能够在同一反应体系下互不干扰的特异性结合到各自的目标模板上,在同一反应体系中扩增出多个型别的HPV全基因组序列。
依据本发明的一个实施例,提供一种前述任一实施例中的试剂盒在HPV基因组扩增、HPV分型和/或HPV检测中的用途。利用前述任一实施例中的试剂盒,利用其所包含的引物,能够对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和/或HPV66进行全基因扩增及全基因分型。既能快速对HPV病毒进行检测,同时也能对其基因组各种特性进行分析。
基于一种能够对HPV病毒全基因组信息的检测方法将会更加有利于进行HPV病毒的鉴定及分型检测,有助于对型间变异体的检测,有助于对于***患者病情发展的预期,有助于更好的辅助指导临床策略。而且,HPV病毒基因组技术,也能够给HPV疫苗的研制、HPV感染的防治提供更多有效的意见,并且随着对HPV病毒基因组了解的深入,HPV全基因组技术可能有助于提供给患者个性化的医疗意见。本发明针对目前缺乏一种能对HPV病毒全基因组进行检测方法,提供一种HPV全基因组的检测方法。
检测HPV全基因组,包括获得HPV全基因组序列,依据本发明的一个实施例,提供一种获得HPV全基因组序列的方法,该方法包括以下步骤:从待测样品中获得核酸;利用上述本发明任一实施例中的一组引物扩增所述核酸,获得扩增产物;对扩增产物进行序列测定,获得测序数据,测序数据包括多个读段;基于测序数据,获得HPV全基因组序列。所说的测序数据可以通过对核酸序列进行测序文库制备、上机测序获得,在本发明的一个实施例中,获取所述测序数据,包括:制备所述核酸的测序文库,对所述测序文库进行测序。测序文库的制备方法根据所选择的测序方法的要求进行,测序方法依据测序平台的不同可选择但不限于Illumina公司的Hisq2000/2500测序平台、Life Technologies公司的Ion Torrent平台和单分子测序平台,测序方式可以选择单端测序,也可以选择双末端测序,获得的下机数据是测读出来的片段,称为读段(reads)。
在本发明的一个实施例中,在获得扩增产物之后,包括:电泳检测所述扩增产物,依据所得的电泳检测结果进行HPV分型,具体的,可以先利用通用引物例如利用SEQ ID NO:29和30,对获得的核酸进行第一扩增,电泳检测第一扩增是否有产物,即看电泳图谱上是否有扩增产物条带,若有条带说明该样品核酸中有含有HPV病毒的核酸,接着利用SEQ IDNO:1-28中的14对引物中的任意多对引物组合对所获得的核酸进行第二扩增,根据第二扩增的扩增产物的电泳检测结果,就能确定该样品核酸所含有的HPV类型。
在本发明的一个实施例中,所说的基于测序数据获得HPV全基因组序列,包括:将测序数据中的读段与HPV参考序列进行比对,获得比对结果,依据所述比对结果,组装出HPV全基因组序列。所称的参考序列指预先确定的序列,可以是预先获得的待测核酸所属生物类别的任意参考模板,例如,若待测核酸为人类核酸,参考序列可选择NCBI数据库提供的HG19,若目标检测核酸是病毒核酸,参考序列可选择公开数据库中已有的该病毒的序列,进一步地,也可以预先配置包含更多参考序列的资源库,例如依据待测核酸的来源、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。
在本发明的一些实施例中,所称HPV参考序列包括HPV16参考序列、HPV18参考序列、HPV31参考序列、HPV33参考序列、HPV35参考序列、HPV39参考序列、HPV45参考序列、HPV51参考序列、HPV52参考序列、HPV56参考序列、HPV58参考序列、HPV59参考序列、HPV66参考序列和HPV68参考序列中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或者全部十四种。组装可以利用比对上HPV参考序列的读段在参考序列上的位置及读段之间的重叠信息来进行。
所称比对可以利用已知比对软件进行,例如SOAP、BWA和/或TeraMap等。在本发明的一个实施例中,提供一种HPV全基因检测方法,其包括:基于比对结果,识别出HPV核酸序列上的突变位点。突变位点的识别检测软件可利用但不限于SOAPsnp、SOAPcnv、Varscan和GATK。在本发明的一个实施例中,基于比对结果,将这些突变位点的突变频率等信息加入到组装出的HPV全基因组序列,使得组装出的HPV全基因组序列带有突变位点信息。这样,丰富了HPV基因组信息,利于以后更完善准确的HPV病毒的鉴定及分型检测,也利于对型间病毒变异体的更准确检测,有助于辅助预期判断***患者病情发展和辅助指导临床采取的治疗策略。
为了使本发明技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例对本发明的一组引物及其在扩增HPV全基因、获得HPV全基因组序列、检测HPV全基因组中的用途进行详细的描述。应当理解,下面示例用于解释本发明,不是对本发明的限制。需要说明的是在本文中所使用的术语“第一”、“第二”等仅为方便描述,不能理解为指示或暗示相对重要性,也不能理解为之间有先后顺序关系。在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
除另有交待,以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和测序引物)、软件及仪器,都是常规市售产品或者开源的,例如购买Illumina的测序文库构建试剂盒。
一般包括:
A)使用商业试剂盒QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen,German)从生物样品中提取HPV病毒核酸。
B)使用表1中的特异性引物从步骤A)所得核酸中扩增HPV全基因组片段。
C)将步骤B)所得产物进行纯化后,进行混合,并片段化为200bp左右片段。
D)使用文库构建试剂盒,例如包括利用T4DNA polymerase,T4Phosphonucleotidekinase及Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase来补齐5′粘性末端及去除3′粘性末端;使用d-ATP及Klenow3′-5′Exo-enzyme对补齐产物进行末端加A;使用包含定制编码序列(8bp)通过高保真酶PCR扩增加到产物末端作为产物的特殊标签,每个特殊的标签作为一个高通量测序库,标签、标签引物可利用CN102409049A披露的;随后使用标准Miseq测序流程进行测序,每个循环能产生对应长度序列及8bp index序列。
E)将高通量检测原始结果经过过滤到无用序列以及质量较差序列,将合格序列数据与HPV参考序列进行对比,判断出HPV分型结果,并得出样本中所感染的HPV各型别基因组序列。
本方法利用高通量检测及长PCR(Long-PCR)技术,对生物样本中的HPV进行检测、测序和/或分型。能够用于各生物样本中高危性HPV感染所导致的各种疾病的发生发展以及对其进行预后指导或者辅助检测。同时本发明还能为各种科学研究积累更多的数据,为进一步确定HPV病毒致病机理提供技术手段。本发明通量高、检测时间短,成本低,其检测的特异性及灵敏度高,是HPV检测及研究的可靠的方法。
实施例一
使用商业试剂盒QIAamp DNAMini Kit(Qiagen,German)提取样本核酸。
1.将来自医院的宫颈脱落细胞样本(液基,宫颈取样刷取样)加入到2ml离心管中,保存液保存,14000rmp离心5min,弃上清液,加入400μL PBS buffer洗涤一次;
2.加入400μLAL buffer,加入20μL蛋白酶K,在恒温加热器上温育56℃直到完全溶解;
3.在离心管中加入400μL无水乙醇,涡旋5秒,短暂离心;
4.将离心管中液体小心转移至QIAamp Mini柱中,8000rpm离心1min,将QIAamp Mini柱放置于一个收集管中,并将原收集管抛弃;
5.加入500μLbuffer AW1Buffer,盖上管盖后,8000rpm离心1min,将QIAamp Mini柱放置于一个收集管中,并将原收集管抛弃;
6.加入500μL buffer AW2Buffer,盖上管盖后,14000rpm离心3min,将QIAamp Mini柱放置于一个收集管中,并将原收集管抛弃;
7.14000rpm离心3min,将QIAamp Mini柱放置于新的1.5ml离心管中,去掉收集管,加入50μL AE buffer,室温温育1min,8000rpm离心1min;
8.抛弃QIAamp Mini柱,将洗脱后离心管做好标记保存样本。
实施例二
利用L1通用引物序列扩增。
1)L1通用扩增实验反应体系:
使用0.125μL LA Taq(5U/μL)(TaKaRa,RR02MB)、2.5μL 10xPCR Buffer(Mg2+)(TaKaRa,RR02MB)、2μL dNTP Mixture(各2.5mM)(TaKaRa,RR02MB),1μL DNA(要求实施例一获得的DNA浓度为10ng/μL以上)、上下游引物(10μM)各lμL和自制双蒸水,混合配制25μL反应体系。
2)反应条件:
使用普通PCR仪(Applied Biosystems,96-Well Thermal Cycler)进行PCR反应,反应条件如下:94℃for 5minutes,(94℃for 30seconds,55℃for 30seconds,72℃for 30seconds,)30个循环,12℃保温
3)扩增结果:
使用1%琼脂糖凝胶(Agarose)在电压140V,电流75mA的情况下电泳30min后,进行溴化乙锭染色10分钟后,在Tanon1600全自动数码凝胶图像分析***上进行观察。电泳结果如图1所示,从左至右依次为marker、上述PCR反应扩增产物和阴性对照,上述PCR反应扩增产物泳道显示有HPV L1基因条带,表明样本感染有HPV。
实施例三
其他HPV基因组序列扩增。
1)扩增实验反应体系:
使用0.25μLLA Taq(5U/μL)(TaKaRa,RR02MB)、2.5μL 10x PCRBuffer(Mg2+Plus)(TaKaRa,RR02MB)、4μL dNTP Mixture(各2.5mM)(TaKaRa,RR02MB),1μLDNA(要求实施例一获得的DNA浓度为10ng/μL以上)、上下游引物(10μM)各lμL和自制双蒸水,混合配制25μL反应体系。
2)反应条件:
使用普通PCR仪(Applied Biosystems,96-Well Thermal Cycler)进行PCR反应,反应条件如下:94℃for 7minutes,(94℃for 30seconds,54℃for 30seconds,72℃for 6minutes,)30个循环,12℃保温。
3)扩增结果:
使用2%琼脂糖凝胶(Agarose)在电压140V,电流75mA的情况下电泳30min后,进行溴化乙锭染色10分钟后,在Tanon1600全自动数码凝胶图像分析***上进行观察。
根据图2所示的胶图结果进行HPV病毒分型,图中16表示HPV16,18表示HPV18,以此类推,从图中可以看出在HPV16型及HPV31型出现约8Kb左右的条带,因此认为本样本感染型别为HPV16/31。
实施例四
病毒基因组扩增产物纯化,用AMPure DNA Purification kit(SPRI beads)纯化扩增后的样品。
1.取出4℃保存的AMPure Beeds,室温放置30min平衡。
2.振荡均匀,按照样品体积1.5倍加入至1.5mL管中。
3.取出PCR产物,并放置在磁力架上,吸取上清;对应加入上清充分混匀,静置10min,瞬时离心3秒。
4.将1.5mL离心管转移放置在磁力架上,静置5-10min至澄清。
5.吸取上清后,加入500μL 70%乙醇,将磁珠吹起混匀后吸附,弃上清,重复一次。
6.置37℃干燥,至磁珠干裂。
7.往1.5mL离心管中加入20μL去离子水,充分混匀,静置5min,然后置于磁力架约5min至澄清。
实施例五
获得病毒基因组
1)病毒序列混合
将实施例四中的纯化产物进行Qubit(Life Technologies,Grand Island,NY)定量,并根据定量结果,按照以下公式计算拷贝数(copies),(6.02×1023)×(g/ml)/(DNAlength×660)=copies/ml,根据拷贝数对样本进行等量混合。
2)基因组DNA的片段化
使用超声法(Covaris,S2)将获得的基因组DNA片段化为大小约200bp的片段。
3)DNA片段的末端修复以及3'连接"A"碱基
根据制造商的说明书,使用T4DNA Polymerase(Enzymatics,P708L)、KlaneowFragment(Enzymatics,P706L)和T4Polynucleotide Kinase(Enzymatics,Y904L),对步骤1获得的片段化的DNA进行末端修复,从而形成平末端的DNA片段。然后使用Klaneow(3,-5,exo-)酶(Enzymatics,P701-LC-L),在具有平末端的DNA片段的3'末端连接"A"碱基。
4)标签接头(Index Adapter)的连接
使用T4DNA Ligase(Enzymatics,L603-HC-L),将步骤3)获得的3'末端连接有"A"碱基的DNA片段分别连接至不同的标签接头(Index Adapter)(序列参照CN102409045A来设计,由Invitrogen公司合成)。使用Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix(NEB,F-531L)扩增以及MinElute PCR Purification Kit(Qiagen,28006)纯化洗脱的样品,从而获得各个样品的测序文库。
5)测序
根据制造商的说明书,使用Illumina Miseq测序平台(Illumina,Miseq)对各个样品的测序文库进行测序,其中测序的读取长度为100bp,并且每个样本的平均测序深度至少为100x,从而获得每个样品的基因组测序数据。
实施例六
病毒基因测序数据分析,如下处理和分析各个样品的测序数据,以获得HPV病毒基因组序列。
1、如实施例五所述,获取各个样品的测序数据;
2、针对各个样品的测序数据,将实施例五的步骤3中的含有接头序列(adapter connector)的测序片段(reads)去除;对每个单泳道(lane)的下机数据进行测序片段去重复处理,该步骤是为了去掉测序引起的一些数据冗余。
具体执行步骤:
首先根据每个单泳道下机数据的报告得到其特异的接头序列,遍历下机数据的每条测序片段将含有接头序列的测序片段去除(通常有两种方法,一种是只去除接头序列保留截取接头序列后的测序片段,另一种是直接将含有接头序列的测序片段扔掉,由于含有接头序列的测序片段量较少不足以影响我们后续分析,因此我们为了序列的整齐利于后续分析而采取直接将含有接头序列的测序片段扔掉的方法)。
其次,每个单泳道的下机数据中由于实施例五中的扩增作用产生的完全一致的测序片段为重复序列,数据量越大,重复(duplication)比例越高,完全重复的测序片段是冗余的,根据测序片段的个异性去除数据冗余。
再次,下机数据中,部分序列质量较低,在数据量充足的情况下,可以将这些数据去除,例如去除数据质量分数低于10分,单测序序列含有不确定碱基N总数大于7%的读段,用以提高最终组装序列的准确性。
3、使用序列比对软件bwa(http://bio-bwa.sourceforge.net/软件:Burrows-WheelerAligner),将步骤2处理得到的测序数据与来自数据库NCBI的人***状瘤病毒标准序列,HPV16(GeneBank收录的K02718)、HPV18(X05015)、HPV31(J04353)、HPV33(M12732)、HPV35(X74477)、HPV39(M62849)、HPV45(X74479)、HPV51(M62877)、HPV52(X74481)、HPV56(X74483)、HPV58(D90400)、HPV59(X77858)、HPV66(U31794)、HPV68(DQ080079)进行比对,得到比对结果。
比对情况如下图3所示,图中两条序列中,下方的是人***状瘤病毒HPV16参考序列,上面是一条条的测序片段(读段)比对到上面去。
4、通过对每个样品的比对结果应用如下处理以统计得到各个样品的测序数据的质量,测序深度,以及区域覆盖度。
具体执行步驟:
首先读取比对结果,得到总测序片段数,进一步得到比对到人***状瘤病毒的测序片段数,非冗余地比对到人***状瘤病毒区域的测序片段数,区域位点数等。表2示例比对统计信息。
表2
5、依然以HPV16(GeneBank收录的K02718)、HPV18(X05015)、HPV31(J04353)、HPV33(M12732)、HPV35(X74477)、HPV39(M62849)、HPV45(X74479)、HPV51(M62877)、HPV52(X74481)、HPV56(X74483)、HPV58(D90400)、HPV59(X77858)、HPV66(U31794)、HPV68(DQ080079)为参考序列,使用比对软件Varscan(http://varscan.sourceforge.net/)和GATK(http://www.broadinstitute.org/gsa/wiki/index.php/The Genome Analysis Toolkit)来鉴定各样品的测序数据中具有单核苷酸多态性的位点,即与参考序列相比,发生了突变的位点。
如图3所示,以来自医院的***患者ZHPVS0021样本在209处的序列为例,碱基为G,参考序列HPV16(K02718)上同位点碱基C,那我们就认为通过比对,得到比对结果:209C>G,在该样本发生突变。
6、根据参考序列HPV16(GeneBank收录的K02718)、HPV18(X05015)、HPV31(J04353)、HPV33(M12732)、HPV35(X74477)、HPV39(M62849)、HPV45(X74479)、HPV51(M62877)、HPV52(X74481)、HPV56(X74483)、HPV58(D90400)、HPV59(X77858)、HPV66(U31794)和HPV68(DQ080079),将比对到参考序列的读段组装成HPV基因组全长序列,同时根据突变频率将突变信息加入HPV基因组全长序列。
Claims (10)
1.一组引物,其特征在于,包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少2对,所述14对引物的序列分别为SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ ID NO:19和20、SEQID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:25和26以及SEQ ID NO:27和28;
任选的,包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少4对引物;
任选的,包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少6对引物;
任选的,包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少8对引物;
任选的,包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少10对引物;
任选的,包含选自SEQ ID NO:1-28的14对引物中的至少12对引物;
任选的,包含SEQ ID NO:1-28的14对引物。
2.权利要求1的一组引物,其特征在于,还包括序列如SEQ ID NO:29和30所示的一对引物。
3.权利要求1或2的一组引物在HPV基因组的扩增和/或HPV的检测中的用途。
4.一种试剂盒,其特征在于,包含权利要求1或2的一组引物。
5.权利要求4的试剂盒在HPV基因组扩增、HPV分型和/或HPV检测中的用途。
6.一种获得HPV全基因组序列的方法,其特征在于,包括以下步骤:
从待测样品中获得核酸;
利用权利要求1或2的一组引物扩增所述核酸,获得扩增产物;
对所述扩增产物进行序列测定,获得测序数据,所述测序数据包括多个读段;
基于所述测序数据,获得HPV全基因组序列。
7.权利要求6的方法,其特征在于,在获得扩增产物之后,包括:
电泳检测所述扩增产物,依据所得的电泳检测结果进行HPV分型。
8.权利要求6的方法,其特征在于,所述基于测序数据获得HPV全基因组序列,包括:
将所述测序数据中的读段与HPV参考序列进行比对,获得比对结果,
依据所述比对结果,组装出所述HPV全基因组序列。
9.权利要求8的方法,其特征在于,所述HPV参考序列包括HPV16参考序列、HPV18参考序列、HPV31参考序列、HPV33参考序列、HPV35参考序列、HPV39参考序列、HPV45参考序列、HPV51参考序列、HPV52参考序列、HPV56参考序列、HPV58参考序列、HPV59参考序列、HPV66参考序列和HPV68参考序列。
10.权利要求8的方法,其特征在于,所述HPV全基因组序列带有突变位点信息。
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