JP6092906B2 - ヒトパピローマウイルスを検出するための遺伝子マーカー - Google Patents
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Description
本出願は、2008年10月31日に出願された米国仮出願第61/197,850号に対する優先権およびその利益を主張する。この出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
本発明は、医学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、最も一般的な高リスクHPV遺伝子型を低リスクの対応物に対して検出することによる鑑別診断のための特異的マーカーとしてのパピローマウイルスゲノムのE1遺伝子フラグメントの使用に関する。
有効なスクリーニングおよび処置ストラテジーの欠如が、先進国と比較して発展途上国において子宮頸癌率が有意に高いことの主要な原因である。
ヒトパピローマウイルス(HPV)は、皮膚および粘膜上皮の良性および悪性病変に関連する上皮親和性ウイルスである(当該ウイルスの遺伝子地図についての図1)。HPV感染とそれに続く子宮頸癌の発生との間には、十分に立証された因果関係が存在する。また、HPV感染と頭頸部、呼吸器組織、および***の癌とを関連づける観察結果も存在する(Braakhuisら、2004,J.Natl.Cancer Inst.96(13):998−1006;Dahlstrandら、2004,Anticancer Res.24(3b):1829−35;Dalingら、2004,Cancer 101(2):270−80;Haら、2004,Crit.Rev.Oral Biol.Med.15(4):188−96;Hafkampら、Acta Otolaryngol.124(4):520−6;Harwoodら、2004,Br.J.Dermatol.150(5):949−57;Reesら、2004,Clin.Otolaryngol.29(4):301−6;Widschwendterら、2004,J.Clin.Virol.31(4):292−7)。
したがって、本発明は、非常に短い(約30〜50bp)アンプリコンを標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを設計および使用するための方法を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、尿中のTr−DNAとともに、流れた細胞から放出されたHPV DNAの両方を効果的に検出する。
本明細書において使用する場合、核酸配列の相補体とは、一方の配列の5’末端がもう一方のものの3’末端と対合するように核酸配列と整列させた場合に、「逆平行な関係」の状態にあるオリゴヌクレオチドを表す。天然の核酸に一般に見られない特定の塩基を本発明の核酸中に含めることができ、例えば、イノシンおよび7−デアザグアニンを含めることができる。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖はミスマッチ塩基対または不適合塩基を含有し得る。核酸技術の分野における当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の出現率を含めた多くの変数を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を判断することができる。
尿の調製
尿試料を、少なくとも100mlの容量を入れることが可能な容器中に回収した。
10mlの尿(希釈前)の標準的なバッチサイズに、1.0mlのQ−Sepharoseスラリー(Q−Sepharoseストック:GE Healthcare製の25mlサイズ;250μL樹脂)を用いた。
.3M LiCl/10mM NaOAc(pH5)で2回洗浄した。NAを、750μ
Lの2M LiCl/10mM NaOAcで溶出した。
750μlバッファー中のQ−Sepharose NAから溶出したDNAに2.25mLの95% EtOHを補充し、シリカカラム(Qiagenまたは同等物)に適用した。カラムエクステンションを用いた場合には、1回のロードで全混合液が取り込まれ、そうでない場合には、数回のロードを行った。卓上微小遠心機(Eppendorf)中でカラムを1分間遠心分離した。あるいは、吸引マニホールドを用いた。
単一の型の高リスクHPVに特異的であり、また開示されたE1遺伝子のフラグメント中に位置するように設計したプライマーを検査した。これらのプライマーを表3に一覧にする。当該PCRにおいて、それぞれの正方向プライマーは500nMの濃度で対応する逆方向プライマーと対合した。PCRごとに、MgCl2の最終濃度は2mMであり、JumpStart Taq DNAポリメラーゼの最終濃度は1.25U/反応であった。高リスクHPV型に対応する個々のオリゴヌクレオチドを、1反応につき1000コピーでテンプレートとして用いた(表2を参照されたい)。PCR産物の予想されるサイズは47塩基対(bp)であった。
1サイクル
94℃−2分間(酵素活性化)
5サイクル
94℃−30秒間
65℃−2分間
5サイクル
94℃−30秒間
60℃−1分間
35サイクル
94℃−30秒間
55℃−1分間
1サイクル
72℃−5分間
4℃−永久 。
この実験の目的は、13種の高リスクHPV株のすべてまたは大部分を特異的に検出するために、低リスクの対応物とは反応しない、HPVのE1遺伝子の対象のフラグメント中に位置する単一のプライマーの対を使用することであった。配列番号41:5’−CAGGCAGAATTAGAGRCAGC−3’を正方向プライマーとして用い、配列番号42:5’−tccaccacaWACTTTCGTTTTA−3’を逆方向プライマーとして用いた。逆方向プライマー中の小文字のヌクレオチドは、プライマーの融解温度(Tm)を調節するためにランダムに選択されたテイルである。
1サイクル
94℃−2分間(酵素活性化)
40サイクル
94℃−30秒間
50℃−30秒間
72℃−30秒間
1サイクル
72℃−5分間
4℃−永久 。
HPVのE1遺伝子の対象のフラグメント中に位置する単一のプライマーの対を、高リスクHPV遺伝子型のDNAを特異的に検出するために用いた。具体的には、配列番号41:5’−CAGGCAGAATTAGAGRCAGC−3’を正方向プライマーとして用い、配列番号42:5’−tccaccacaWACTTTCGTTTTA−3’を逆方向プライマーとして用いた。逆方向プライマー中の小文字のヌクレオチドは、プライマーのTmを調節するために用いられたランダムに選択されたテイルである。当該PCRにおいて、正方向プライマーは800nMの濃度で逆方向プライマーと対合した。この反応では、MgCl2の最終濃度は3mMであり、JumpStart Taq DNAポリメラーゼの最終濃度は1.25U/反応であった。
1サイクル
94℃−2分間(酵素活性化)
40サイクル
94℃−30秒間
50℃−30秒間
72℃−30秒間
1サイクル
72℃−5分間
4℃−永久 。
高リスク遺伝子型を示すオリゴヌクレオチドテンプレート(表2を参照されたい)を、すべての高リスク特異的プライマーの対の混合物を有するPCRによって増幅した。それぞれの反応には、計25のPCRプライマーが含まれていた(表4を参照されたい)。当該PCRにおいて、それぞれ200nMの濃度で用いられた正方向プライマーは、それぞれ300nMの濃度で用いられた逆方向プライマーとそれぞれ組み合わさった。この反応では、MgCl2の最終濃度は2mMであり、AmpliTaq DNAポリメラーゼの最終濃度は1.25U/反応であった。高リスクおよび低リスクのHPV型に対応する個々のオリゴヌクレオチドを、1反応につき1000コピーでテンプレートとして用いた(表3を参照されたい)。
1サイクル
94℃−10分間(酵素活性化)
40サイクル
94℃−30秒間
60℃−30秒間
72℃−30秒間
1サイクル
72℃−2分間
4℃−永久 。
子宮頸癌を有する患者由来の尿サンプルを、すべての高リスク特異的プライマーの対の混合物を用いることによって検査した。したがって、当該PCRはそれぞれの反応に計25のPCRプライマーを含有していた(表4を参照されたい)。当該PCRにおいて、それぞれ200nMの濃度で用いられた正方向プライマーは、それぞれ300nMの濃度で用いられた逆方向プライマーと組み合わさった。この反応では、MgCl2の最終濃度は2mMであり、AmpliTaq DNAポリメラーゼの最終濃度は1.25U/反応であった。尿サンプル由来のDNAを、実施例1に記載されたプロトコールに従って抽出した。診療所への訪問時に回収された尿サンプルを用いた(実施例5を参照されたい)。10mlの尿由来のDNAを、100μlの溶出バッファー中に抽出し、そのうちの5μlをPCRに用いた。
1サイクル
94℃−10分間(酵素活性化)
40サイクル
94℃−30秒間
60℃−30秒間
72℃−30秒間
1サイクル
72℃−2分間
4℃−永久。
高リスクHPV遺伝子型を示すオリゴヌクレオチド(表3)を、高リスクHPの一部を用いたPCRによって増幅し、それぞれ200nMの濃度で用いられた正方向プライマーは、300nMの濃度で用いられた逆方向プライマーとそれぞれ組み合わさった。この反応では、計20のプライマーを用いた(表5)。この反応では、MgCl2の最終濃度は2mMであり、AmpliTaq DNAポリメラーゼの最終濃度は1.25U/反応であった。高リスクおよび低リスクのHPV型に対応する個々のオリゴヌクレオチドを、1反応につき1000コピーで用いた(表2)。
1サイクル
94℃−10分間(酵素活性化)
40サイクル
94℃−30秒間
62℃−30秒間
1サイクル
72℃−2分間
4℃−永久 。
Xenomicsの経腎臓性DNA(Tr−DNA)技術は、身体全体にわたる死にかけている細胞由来のDNAフラグメントに基づいている。このDNAは血流中に現れ、尿中に排出される。尿サンプルの分析を、男性胎児を有する女性由来のY染色体特異的DNA配列、結腸直腸癌患者における変異型K−ras、および肺結核を有する患者におけるMycobacterium tuberculosisの検出に適用した。
サンプル回収
Simbiosys Biowares社およびMetropolis社によって病期分類された癌患者由来のものを含む、インドにおける高リスクおよび低リスクの集団からサンプルを回収した。高リスクの被験者を、病院のSTD外来またはインド東部にある西ベンガルの売春街から募集した。具体的には、この集団由来の事前スクリーニングした270のサンプルをこの調査に用い、当該270のうちの51サンプル(18.9%)がQIAGEN hc2検査によって陰性であることが分かった。既知の疾病素因を有さない50人の低リスクの被験者を、ムンバイにあるヘルスキャンプから募集した。50の尿サンプルを、インドの一般集団からの妊娠女性から入手した。インド医学研究評議会を含めた独立倫理委員会によって審査されたプロトコールに従い、また当該被験者のインフォームド・コンセントを得て、細胞診試料および尿サンプルを入手した。市販の回収カップ中に尿を回収した。尿サンプルを少なくとも50mMのEDTAの状態にし、ドライアイス上で運搬し、さらなる使用まで−80℃で保存した。
子宮頸部細胞診およびhc2検査を、Simbiosys Biowares社およびMetropolis社によって行った。回収した子宮頸部サンプルの一部を用いて、直ちに細胞診検査のための塗抹標本を作製し、残りをQIAGEN hc2によるHPV検査のためのバッファー溶液に移した。HR HPVプローブカクテルを用いて、hc2検査をメーカーの使用説明書どおりに行い、分析した。1pg/mlの推奨される陽性閾値をカットオフとして用い、1.00以上の相対発光量/コントロール(RLU/CO)の比率を有するすべてのサンプルを陽性とみなした。
−80℃で保存した尿サンプルを解凍し、穏やかに反転させることによって混合した。以前に記載されているプロトコールどおりにDNAの単離を実施した(Shekhtman E.M.ら、Clin Chem 2009;55:723−729)。簡潔には、1:1の尿:水のサンプルをQ−Sepharose樹脂のスラリー(GE Healthcare,Piscataway,NJ)とインキュベーションした。樹脂を沈殿させ、上清を捨てた。沈殿させた樹脂を再懸濁し、スピンカラムに移した。再懸濁バッファーを除去し、樹脂を洗浄した。2M LiClによって、DNAを樹脂から溶出した。溶出液を70%エタノールの状態にし、QIAquickカラム(QIAGEN,Hilden,Germany)に適用した。カラムを、2M LiCl/70% EtOHで、続いて75mM KOAc(pH5.0)/80% EtOHで洗浄した。DNAをEBバッファー(QIAGEN,Hilden,Germany)で溶出し、−20℃で保存した。単離したDNAサンプルをPicogreenアッセイ(Life Technologies)によって定量化した。
XEN−HPV−FAM−FおよびXEN−HPV−Rのプライマー(表6)をPCRアッセイに用いた。AmpErase(登録商標)UNG(Life Technologies)で10分間処理した後、25μL中に600nMの各プライマー、3mM MgCl2、1.25ユニットのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Life Technologies)、200μMの各dATP、dCTP、dGTP;および400μM dUTPを用いて、40サイクルで増幅を実施した。各サイクルは、95℃で15秒間(s)および50℃で60sであった。反応産物をGENEWIZ(South Plainfield,NJ)によるキャピラリー電気泳動にかけた。
JumpStart(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ(Sigma−Aldrich)および様々な濃度のMgCl2(MY09/MY11およびGP5+/GP6+に対しては2mM、XEN−HPV−F/−Rに対しては3mM)とともに、種々のプライマーセット(表6)を用いて、PCR増幅を行った。反応混合物をそれぞれのプライマーの対に対して様々なサイクル工程:95℃30秒間,55℃45秒間,72℃20秒間で37サイクルの増幅(MY09/MY11);95℃15秒間,40℃30秒間,72℃10秒間で50サイクルの増幅(GP5+/GP6+);95℃15秒間,50℃60秒間で45サイクルの増幅(XEN−HPV−F/−R)にかけた。PCR産物を、10%ポリアクリルアミドゲル(Bio−Rad)上での電気泳動によって分析した。ゲル切片を切り出し、QIAEX IIゲル抽出キット使用説明書(QIAGEN)に従って精製し、PCR増幅に用いたプライマーの一つを用いて配列決定した。DNAシークエンシングをGENEWIZ社(South Plainfield,New Jersey)によって行った。生のPCR産物の配列を、特定のヒトパピローマウイルス株と適合させるために、NCBIのBlastnアルゴリズムによって分析した。
標準的な分割表の方法(Excel 2003,Microsoft社)を用いてデータを分析した。本発明者らの方法の有用性を特徴付けするために、本発明者らは、hc2検査ならびに/あるいはシークエンシングならびに診断の感度、特異性、ならびに陽性および陰性適中率(PPVおよびNPV)とのその一致率を算出した(Altman,D.G.およびBland,J.M.BMJ 1994;309:102)。上記パラメーターのそれぞれに対して、Java(登録商標)Statによって95%の信頼区間を算出した。比較される分析方法間の周辺同等性を、McNemar検定によって評価した(X2)。<0.05のP値を統計的に有意であるとみなした。検査間の一致度を、Cohenのκ統計量を用いて評価した(K)。0.4〜0.6間のK値を中程度の一致度を有するとみなし、0.61〜0.8の値をかなりの一致度を有するとみなした(Landis,JR;Koch,GG.Biometrics.1977;33:159−174.doi:10.2307/2529310)。
計320の尿サンプルを、対応する子宮頸部試料のhc2アッセイおよび細胞診検査の結果と比較するために、XenomicsのCEアッセイによって分析した。hc2に関する比較の結果を表7に示す。一致率は248/320(77.5%)であった。320の尿サンプルのうち、72は適合させた子宮頸部試料のhc2アッセイと不一致の結果を出し、DNAシークエンシングによってさらに検証された。
まず、約450bpの産物を生成するプライマーMY09/MY11を用いることによって、代替的な増幅およびシークエンシングを試みた。高リスクのHPV産物が得られないまたは配列決定されない場合、次いで、約150bpのフラグメントを作り出すGP5+/GP6+プライマーを用いることによってシークエンシングを試みた。これらプライマーの対の両方は、CEアッセイによるHPV検出に用いられたものから独立した部位であるHPV L1領域を検証する。MY09/MY11および/またはGP5+/GP6+プライマーが低リスクHPVの配列のみを作り出す、あるいは特定の産物を作り出さない場合には、XEN−HPV−F/−Rプライマーを用いて、サンプル中にわずかでも存
在していれば高リスクHPV DNA配列の証拠を提供し得る、E1遺伝子の88bpの
痕跡を増幅した。
のうち、18サンプル(47.4%)において、高リスクHPV型がL1領域のDNAシ
ークエンシング(MY09/MY11および/またはGP5+/GP6+プライマー)に
よって証明された。さらには、XEN−HPV−F/−Rプライマーを用いることによっ
て、さらなる13サンプルが高リスクHPVを有することが示され、計31/38(81
.6%)が高リスクHPVを含有することになった(表8)。
CEアッセイは、ASCUSおよび正常として記された多くを含めた高リスクHPV陽性の女性をhc2アッセイよりも多く検出した(表10)。Simbiosysによって提供されたサンプルの中には、正常な細胞診の結果を有するがhc2の結果を入手できないコントロールとして分類されたものがあった。他のものは、子宮頸部細胞診によって正常として記され、またhc2によって非反応性であった。これらのグループ由来のサンプルは、STD外来および売春宿を含めた高リスク集団から入手したものであった。本発明者らは、正常または悪性でないという臨床診断を受けた、Metropolisによって低リスクとして指定された50サンプルを検査した。50のうちの3つ(6.0%)はhc2によって反応性であり、6つ(12.0%)はCEによって反応性であった。この後者の6サンプルのうち、4つはシークエンシングによって高リスクHPV(型:16、18、および31)を含有しており、2つはHPV DNAの証拠を含有していなかった。
Claims (21)
- 配列5′-CAGGCAGAATTAGAGRCAGC (SEQ ID NO:41)を有するフォワードプライマー、ここで、RはAまたはGである、及び、
配列5′-TCCACCACAWACTTTCGTTTTA (SEQ ID NO:42)を有するリバースプライマー、ここで、WはTまたはAである、
とを含む
対をなすオリゴヌクレオチドプライマー。 - 前記オリゴヌクレオチドプライマーの一つが蛍光標識されている、請求項1に記載の対をなすオリゴヌクレオチドプライマー。
- 前記フォワードプライマーが、XEN-HPV-FAM-Fである請求項2に記載の対をなすオリゴヌクレオチドプライマー。
- 前記フォワードプライマーが蛍光標識されている、請求項2に記載の対をなすオリゴヌクレオチドプライマー
- 請求項1に記載の対をなすオリゴヌクレオチドプライマーを含むキット
- 請求項2に記載の対をなすオリゴヌクレオチドプライマーを含むキット
- 請求項3に記載の対をなすオリゴヌクレオチドプライマーを含むキット
- 請求項4に記載の対をなすオリゴヌクレオチドプライマーを含むキット
- 患者におけるヒトパピローマウイルス(HPV)の存在を示す方法であって、該患者から採取した核酸を含む尿サンプルにおいて、HPVのE1遺伝子の1つ以上の配列を検出する工程を含み、ここで、前記検出は、請求項1に記載の対をなすオリゴヌクレオチドプライマーへの1以上の前記E1遺伝子の配列のハイブリダイゼーションを含み、そして、HPVのE1遺伝子の1つ以上の配列を検出することが、該患者における少なくとも1つのヒトパピローマウイルスの存在を示す、方法。
- 前記検出が、(a)前記対をなすオリゴヌクレオチドプライマーで、増幅されたE1遺伝子配列を生成するため、前記患者から採取した尿サンプル由来の核酸を増幅する工程、及び(b)該増幅されたE1遺伝子配列を検出する工程を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ネステッドプライマーPCR、リアルタイムPCR、NAハイブリダイゼーション、サイクリックプローブ反応、一本鎖高次構造多型(SSCP)、鎖置換増幅(STA)、および制限断片長多型(RFLP)からなる群から選択される技術を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記増幅が、さらに、対をなすオリゴヌクレオチドプライマーの一つが蛍光標識されている、請求項10に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーが蛍光標識されている、請求項12に記載の方法。
- 前記核酸が、トランスレナル(transrenal)DNAを含む、請求項9に記載の方法。
- さらに、前記尿サンプルにおける核酸分解を減少させる工程を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸分解を減少させる工程が、上昇させたpHによって、増大させた塩濃度によって、熱不活性化によって、または、処理をすることによって、ヌクレアーゼ活性を阻害することを含む方法であって、該処理は、前記尿サンプルを、エチレンジアミン四酢酸、グアニジンHCI、グアニジンイソチオシアネート、N−ラウロイルサルコシン、またはドデシル硫酸ナトリウムで処理するものである、請求項15に記載の方法。
- さらに、前記増幅の前に、前記尿サンプル由来の前記核酸を実質的に単離する工程を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記単離が、沈降によるまたは固形吸着物質を用いることによるものである、請求項17に記載の方法。
- さらに、前記増幅されたE1遺伝子配列を定量化する工程を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記検出が、さらに、ハイブリダイゼイション後の前記対をなすオリゴヌクレオチドプライマーの拡張(extension)を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーが、XEN-HPV-FAM-Fである請求項13に記載の方法。
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