JP2009060897A - 核酸増幅方法 - Google Patents

核酸増幅方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2009060897A
JP2009060897A JP2008208874A JP2008208874A JP2009060897A JP 2009060897 A JP2009060897 A JP 2009060897A JP 2008208874 A JP2008208874 A JP 2008208874A JP 2008208874 A JP2008208874 A JP 2008208874A JP 2009060897 A JP2009060897 A JP 2009060897A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
nucleic acid
bases
oligonucleotide primer
region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2008208874A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5393077B2 (ja
Inventor
Hayato Miyoshi
隼人 三好
Yoshihide Iwaki
義英 岩木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Corp filed Critical Fujifilm Corp
Priority to JP2008208874A priority Critical patent/JP5393077B2/ja
Publication of JP2009060897A publication Critical patent/JP2009060897A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5393077B2 publication Critical patent/JP5393077B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

【課題】オリゴヌクレオチドプライマーとDNAポリメラーゼとを用いて実施可能な核酸の増幅方法を提供すること。
【解決手段】少なくとも1種のデオキシヌクレオチド3リン酸、少なくとも1種の鎖置換能を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの3’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする、核酸の増幅方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸の増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、DNAポリメラーゼを用いて反応溶液をインキュベートすることによってポリメラーゼ反応を行うことを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
分子生物学の研究においては、核酸の増幅は、一般的には、DNAポリメラーゼを利用した酵素的方法で行われている。核酸の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が広く知られている。PCR法では、目的とする標的核酸配列を増幅させるために、鋳型である二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性する工程(変性工程)、一本鎖DNAにプライマーをアニーリングさせる工程(アニーリング工程)、及びプライマーを起点として相補鎖を伸長する工程(伸長工程)の3つの工程から構成される。通常のPCR法においては、サーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程はそれぞれ異なる温度で行われている。しかし、3種類の異なる温度で核酸増幅反応を行うことは、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスも増大していくという問題があった。
そこで、等温状態で実施することが可能な核酸増幅方法が開発されている。例えば、RCA(Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995))、 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA;Bio Industry,第18巻、2号(2001))、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜(1993))等が挙げられる。
SDA法(特開平5−130870号)は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、5’→3’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度DNAポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレア−ゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレア−ゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。しかしながら、ポリメラーゼと共にエクソヌクレアーゼを用いる必要があり、コストがかかると共に、プライマーの設計を工夫する必要があった。
LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6箇所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5’→3’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の2本鎖DNAを1本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。しかしながら、6箇所の特定部位を認識する少なくとも4種のプライマーを用いる必要があり、プライマー設計が非常に困難であった。
ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後,RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。しかしながら、この方法もキメラプライマーという特殊なプライマーを用いる必要がありプライマー設計が非常に困難である。
特表平11−509406号公報には、鎖置換能を有するDNAポリメラーゼ存在下、少なくとも1組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のDNAを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特表平11−509406号公報に記載の方法では比較的長い反応時間が必要であるなどの問題がある。つまり、PCR法のように簡単なプライマー設計で等温にて簡便に実施が可能な核酸増幅方法の開発が望まれていた。
Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995) Bio Industry,第18巻、2号(2001) Nature,350,91〜(1991) J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜(1993) 特開平5−130870号公報 特表平11−509406号公報
本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーとDNAポリメラーゼとを用いて実施可能な核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、短時間で標的核酸配列を高い効率で増幅することができ、かつ標的核酸配列を特異的に増幅することができる核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって、核酸断片を高い効率で特異的に増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。
(1) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
(2) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
(3) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
即ち、本発明によれば、少なくとも1種のデオキシヌクレオチド3リン酸、少なくとも1種の鎖置換能を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの3’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域又はその一部を増幅できるように、第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする、核酸の増幅方法が提供される。
好ましくは、本発明は以下の何れかを特徴とする。
(1) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
(2) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
(3) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
本発明において、ある領域Aに対してオリゴヌクレオチドプライマーを設計するとは、領域Aと実質的に同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを設計することを言う。
別の表現をすれば、ある領域Aに対してオリゴヌクレオチドプライマーを設計するとは、領域Aの相補鎖に対してアニールするように、即ち領域Aの相補鎖と実質的に相補的となるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを言う。
本発明において、配列Xの5’側100塩基以内の領域とは、配列Xの1塩基分5’側に存在する塩基の位置、及び、配列Xの100塩基分5’側に存在する塩基の位置、及び、両者に挟まれる領域を意味する。
同様に、本発明において、配列Xの3’側100塩基以内の領域とは、配列Xの1塩基分3’側に存在する塩基の位置、及び、配列Xの100塩基分3’側に存在する塩基の位置、及び、両者に挟まれる領域を意味する。
好ましくは、配列X、及び配列Xに相補的な配列Xcは連続した5塩基以上の配列である。
好ましくは、配列X、及び配列Xに相補的な配列Xcは連続した7塩基以上の配列である。
好ましくは、反応溶液は、少なくとも0.05%以上の界面活性剤をさらに含む。
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする。
好ましくは、反応溶液は2価の陽イオンをさらに含む。
好ましくは、2価の陽イオンはマグネシウムイオンである。
好ましくは、反応溶液は、融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、融解温度調整剤は、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である。
好ましくは、反応溶液は各々1.0mM以上100mM以下のデオキシヌクレオチド3リン酸を含む。
好ましくは、反応溶液は、1μM以上100μM以下のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは前記鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端領域のみが前記鋳型核酸断片と実質的に相補的である。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、前記鋳型核酸断片と連続した一箇所でのみ実質的に相補的である。
好ましくは、少なくとも1種の鎖置換能を有するDNAポリメラーゼは、バチルス ステアロサーモフィラス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst.DNAポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Vent.DNAポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである。
好ましくは、核酸を増幅する工程は実質的に等温で行われる。
好ましくは、核酸を増幅する工程は室温以上100℃以下で行われる。
本発明によれば、増幅産物が次々に伸長されるため、標的核酸配列を非常に高い増幅効率で増幅することができる。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による核酸の増幅方法は、少なくとも1種のデオキシヌクレオチド3リン酸、少なくとも1種のDNAポリメラーゼ、少なくとも2種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの3’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域又はその一部を増幅できるように、第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。さらに具体的には、本発明による核酸の増幅方法は、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
(1) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する(図13を参照)。
(2) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する(図15を参照)。
(3) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する(図17を参照)。
好ましくは、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
(1) 連続した4塩基以上の配列Xが100塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
(2) 連続した4塩基以上の配列Xが100塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
(3) 連続した4塩基以上の配列Xが100塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
好ましくは、以下の条件のいずれかを満たすように第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする。
(1) 連続した4塩基以上の配列Xが60塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
(2) 連続した4塩基以上の配列Xが60塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
(3) 連続した4塩基以上の配列Xが60塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
本発明による核酸の増幅方法の上記(1)の概要を図13及び図14に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Xを3’末端に含む増幅核酸断片(これを核酸断片Aとする)が得られる。
同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Xと相補的な配列Xcを3’末端に含む増幅核酸断片(これを核酸断片Bとする)が得られる。
次に、上記で得られた増幅核酸断片Aと増幅核酸断片Bとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。
または、上記で得られた増幅核酸断片Aと鋳型となる核酸断片とが配列X(配列Xc)を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
または、上記で得られた増幅核酸断片Bと鋳型となる核酸断片とが配列X(配列Xc)を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
核酸断片A、核酸断片B、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、3’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。
本発明による核酸の増幅方法の上記(2)の概要を図15及び16に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Xを3’末端側に少なくとも2箇所含む増幅核酸断片(これを核酸断片Aとする)が得られる。
同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Xと相補的な配列Xcを3’末端に含む増幅核酸断片(これを核酸断片Bとする)が得られる。
次に、上記で得られた増幅核酸断片Aと増幅核酸断片Bとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。
または、上記で得られた増幅核酸断片Aと鋳型となる核酸断片とが配列X(配列Xc)を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによって、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
核酸断片A、核酸断片B、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、3’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。
本発明による核酸の増幅方法の上記(3)の概要を図17及び18に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーと第二のオリゴヌクレオチドプライマーとがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Xを3’末端側に少なくとも2箇所含む増幅核酸断片(これを核酸断片Aとする)が得られる。
同様に、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、配列Xと相補的な配列Xcを3’末端に少なくとも2箇所含む増幅核酸断片(これを核酸断片Bとする)が得られる。
次に、上記で得られた増幅核酸断片Aと増幅核酸断片Bとがハイブリッドを形成し、伸長が開始する。これにより、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。
または、上記で得られた増幅核酸断片Aと鋳型となる核酸断片とが配列X(配列Xc)を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによっても、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
または、上記で得られた増幅核酸断片Bと鋳型となる核酸断片とが配列X(配列Xc)を介してハイブリッドを形成し、伸長が開始することによっても、高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
核酸断片A、核酸断片B、及び、高分子の増幅核酸断片は、第一のオリゴヌクレオチドプライマーまたは第二のオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその両方がアニーリングすることができ、3’末端を起点としたポリメラーゼ反応が進行し、核酸断片の複製反応が継続的に起こる。結果として、鋳型となる核酸断片が検出可能なレベルまで増幅される。
以下、本発明で用いる成分について説明する。
(1)デオキシヌクレオチド3リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド3リン酸を用いる。具体的には、dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド3リン酸としては、dNTPのアナログ(例えば、7−デアザ−dGTP等)が含まれていてもよい。
また、デオキシヌクレオチド3リン酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP混合物)は、最終濃度で、それぞれ0.1mM〜100mM、好ましくは0.75mM〜3.0mM、さらに好ましくは1.0mMから2.0mM、特に好ましくは1.0mMから1.5mMの範囲である。
(2)DNAポリメラーゼ
本発明においては、DNAポリメラーゼを用いる。DNAポリメラーゼとしては、好ましくは、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いることができる。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってDNA複製を行う際、DNA鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換(strand displacement)することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス ステアロサーモフィラス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst.DNAポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Vent.DNAポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。
(3)2価の陽イオン
本発明では、使用する酵素の金属要求性等に2価の陽イオンを用いる。2価の陽イオンとしては、マグネシウム塩やその他の金属塩を使用することができ、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどを使用できる。2価の陽イオンの濃度は最終濃度で、好ましくは1mM〜20mMであり、さらに好ましくは2mM〜10mMの範囲である。
(4)界面活性剤
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという有利な効果を達成することができる。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン(アニオン)性界面活性剤、しょ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、POEソルビタン脂肪酸エステル(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)、脂肪酸アルカノールアミド、POEアルキルエーテル(Brij35、Brij58、等)、POEアルキルフェニルエーテル(TritonX-100、TritonX-114、Nonidet P40、等)、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、POEアルキルアミン、POE脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン(ノニオン)性界面活性剤、そしてセチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン(カチオン)性界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは0.01%以上、より好ましくは0.05%以上、より好ましくは0.1%以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は10%以下、好ましくは5%以下、より好ましくは1%以下である。
界面活性剤の中でも、非イオン性界面活性剤を使用することが特に好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水性がより強い界面活性剤が好ましく、HLB価で示すと12以上が好ましい。より好ましくは14以上であり、上限は20まで好ましく用いることができる。さらに好ましくは17以下であり、より好ましくは14以上17以下である。構造的には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることが好ましい。さらに、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの中でも、脂肪酸エステルが一つだけのものが好ましい。例えば、以下の構造式で表すことができる。
(式中、x + y + z + w = 20 であり、R:炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。)
アルキル基の位置は特に限定されず、以下のような構造でも好ましく用いることができる。
このような界面活性剤として、物質名でポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレート等が挙げられる。(商品名:Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)の界面活性剤が挙げられる。また、使用量も特に限定されないが、好ましくは0.01%以上、より好ましくは0.05%以上、より好ましくは0.1%以上である。
(5)オリゴヌクレオチドプライマー
本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型DNAに実質的に相補的な塩基配列を有し、その3'末端よりDNA鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型DNAに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるDNAにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。
さらに、前記、オリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅反応で用いられるような複雑な設計を必要としない。通常のPCR反応で用いられる少なくとも一組以上のプライマーを用いて等温増幅反応を行うことを可能にしたことが、本発明の大きな特徴である。詳細には、これらのプライマーは、LAMP法等で用いられるような5’末端が3’末端より伸長した部分と相補的になるループ構造を形成するような構造を持っていない。つまり、プライマーの3'末端の連続した領域が鋳型核酸と相補的である。さらに、SDA法やICAN法で用いられるように、反応途上でプライマーが切断され、切断された3‘末端が新たな合成起点になるようなるような複雑な仕組みを持たない。
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
(1) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
(2) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
(3) 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
(1) 連続した4塩基以上の配列Xが100塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
(2) 連続した4塩基以上の配列Xが100塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
(3) 連続した4塩基以上の配列Xが100塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の条件のいずれかを満たすように設計する。
(1) 連続した4塩基以上の配列Xが60塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
(2) 連続した4塩基以上の配列Xが60塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計する。
(3) 連続した4塩基以上の配列Xが60塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計する。
好ましくは、配列X及びXcは連続した5塩基以上の配列である。
好ましくは、配列X及びXcは連続した7塩基以上の配列である。
連続した4塩基以上の配列Xは必ずしも完全に一致していなくてもよい。例えば、5塩基中の4塩基以上、6塩基中の5塩基以上、7塩基中の5塩基以上、8塩基中の6塩基以上、9塩基中の7塩基以上、10塩基中の7塩基以上が一致していれば、同様の機構で増幅することができる。
オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に限定されないが、一般的には、10〜100ヌクレオチド程度の長さであり、好ましくは15〜50ヌクレオチド程度の長さであり、さらに好ましくは15〜40ヌクレオチド程度の長さである。
オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のDNA合成機(例えば、アプライド バイオシステムズ社(Applied Biosystem Inc.)のDNAシンセサイザー394型など)を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。
オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、反応溶液中において0.1μM以上が好ましく、1μM以上がさらに好ましく、1.5μM以上が特に好ましい。
(6)鋳型となる核酸断片
本発明において鋳型となる核酸(DNAまたはRNA)は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、mRNA、全RNAのいずれでもよい。鋳型となる核酸を含む可能性のある試料から調製した核酸を使用してもよいし、鋳型となる核酸を含む可能性のある試料をそのまま直接使用してもよい。鋳型となる核酸を含む試料の種類は特に限定されず、例えば、体液(例えば、全血、血清、尿、脳脊髄液、***、唾液など)、組織(例えば、癌組織など)、細胞培養物のような生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、微生物が混入している可能性のある試料(例えば、食品など)、あるいは土壌、排水のような環境中の試料が挙げられる。上記したような試料から核酸を調製する場合、その調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた精製など当業者に公知の方法を用いることができる。核酸の試料からの精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などにより行うことができる。
RNA由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該RNAを鋳型とした逆転写反応によって合成されたcDNAを鋳型として本発明の方法を実施することができる。逆転写反応に使用されるプライマーは、特定の鋳型RNAに相補的な塩基配列を有するプライマーでもよいし、オリゴdTプライマーやランダムな配列を有するプライマーでもよい。逆転写用プライマーの長さは好ましくは6から100ヌクレオチド程度であり、更に好ましくは9から50ヌクレオチド程度である。逆転写反応に使用される酵素としては、RNAを鋳型としたcDNA合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素(AMV RTase)、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素(MMLV RTase)、ラウス関連ウイルス2逆転写酵素(RAV−2 RTase)などを使用することができる。また、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型DNAポリメラーゼを使用することもできる。
本発明においては、ゲノムDNAや核酸増幅断片のような二本鎖DNA、およびRNAから逆転写反応で調製されたcDNAのような一本鎖DNAを、鋳型DNAとして使用できる。上記二本鎖DNAは、一本鎖DNAに変性してから本発明の方法に使用してもよいし、このような変性を行うことなく本発明の方法に使用することもできる。
(7)融解温度調整剤
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの2種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、DMSOやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に10%以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、0.2〜3.0M、好ましくは0.5〜1.5M程度添加することができる。
(8)緩衝成分
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩(リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等)などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は5mM〜100mMの範囲、特に好ましくは10mM〜50mMの範囲であり、またpHは、増幅反応に用いられる酵素の至適pHにもよるが、一般的には6.0〜9.0、特に好ましくはpH7.0〜9.0のものを使用できる。
(9)本発明による核酸の増幅方法
次に、本発明による核酸の増幅方法について説明する。本発明では、少なくとも1種のデオキシヌクレオチド3リン酸、少なくとも1種のDNAポリメラーゼ、2価の陽イオン、少なくとも2種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートする。これにより、前記プライマーの3’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することができる。本発明では、好ましくは、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行うことができる。反応溶液をインキュベートする際の温度は好ましくは室温以上であり、より好ましくは50℃以上であり、さらに好ましくは、55℃以上であり、例えば、60℃程度でインキュベートすることができる。好ましい温度範囲は、例えば、約50℃から約70℃であり、さらに好ましくは約55℃から約65℃である。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、DNA増幅の特異性が向上し、また鋳型DNAの二次構造が解消されることによりDNAポリメラーゼの伸長性も向上する。本発明による核酸の増幅方法は、実質的に等温において実施すことができる。本発明において等温とは、各工程の反応温度を大きく変化することなく、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。
本発明において、反応溶液を実質的に等温でインキュベートする時間は、標的核酸断片が増幅できる限り特に限定されない。インキュベートする時間は、例えば、5分以上12時間以内とすることができる。インキュベートする時間は、好ましくは、5分以上2時間以内であり、より好ましくは5分以上60分以内であり、さらに好ましくは5分以上30分以内であり、5分以上15分以内とすることもできる。
核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、温度を上昇させたり低下させたりする必要がないことが利点の一つになる。従来のPCR法では温度を上下させる必要があり、例えばサーマルサイクラーのような反応装置が必要であったが、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、一定温度を保持できる装置のみで実施が可能である。
(10)本発明による核酸の増幅方法の利用
本発明による核酸の増幅方法は、核酸の検出、標識、塩基配列の決定、塩基の変異の検出(一塩基多型の検出などを含む)などに使用することができる。本発明の核酸の増幅方法には温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、多量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。
本発明の核酸の増幅方法により得られる増幅物は、当業者に公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって特定サイズの反応産物を検出することができる。増幅産物を検出するための検出系は、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移、酵素標識(例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど)、蛍光標識(例えば、フルオレセイン、ローダミンなど)、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
<実施例1>核酸の増幅反応
(1)ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
HumanGenomicDNA(Clontech社製)3.0ngを98℃で3min.加熱を行い、1本鎖にしたのち、β−アクチン遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
<プライマー>
プライマーは、βアクチン遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Forward Primer):
5'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−3'(配列番号1)
プライマー(2)(Reverse Primer):
5'−CCTCGTCGCCCACATAG−3'(配列番号2)
上記プライマーのβアクチン遺伝子に対する位置関係の詳細を図1に示した。
ここで、配列Xは「5'-CCCAG-3'」であり、54塩基離れた位置に存在する。プライマー(1)は5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計されており、プライマー(2)は5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。
(2)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、60℃、60分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、NEB社のBst.DNA polymeraseを使用した。
<反応液の組成>
10×Bst Buffer(DF) 1.0μL
100mM MgSO4 0.6μL
10%(v/v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR Green I(2000倍) 0.2μL
50μM primer(1) 0.64μL
50μM primer(2) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
1)で得た核酸断片試料液(3.0ng) 0.4μL
精製水 4.96μL
10.0μL
(3)増幅産物の検出
前記(2)における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置(Mx3000p,Stratagene社製)を用いて蛍光検出を行った。結果を図2に示す。
Mx3000pの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が250に到達したときの時間(Ct値)を算出した。Ct値は37.6±1.1分であった。
<実施例2>増幅産物の電気泳動
3wt%のアガロースゲル、0.5xTBEバッファー(50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4)を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図3に示す。電気泳動パターンはN=6でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。
<実施例3>増幅産物のクローニング
電気泳動を実施後、200bp以下の領域のゲルを切り出し、QIAEXII(Qiagen製)を用いてゲル中のDNAを回収した。
回収したDNAをTOPO TA Cloning Kit(Invitrogen製)を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
QIAprep Miniprep(Qiagen製)を使用して培養した大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。
M13 Reverse Primer
5'−CAGGAAACAGCTATGAC−3'(配列番号3)
シークエンスの結果、次の3種類の増幅産物が存在することがわかった。
(1)
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGG-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCC-5'
38塩基対(配列番号4)
(2)
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC CAGGGCGTGA-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCCGG GTCCCGCACT-5'

5'-TGGTGGGCAT GGGTCAGAAG GATTCCTATG TGGGCGACGA GG-3'
3'-ACCACCCGTA CCCAGTCTTC GTAAGGATAC ACCCGCTGCT CC-5'
92塩基対(配列番号5)
(3)
5'-GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC CAGGGCGTGA-3'
3'-CCCGTACCCA GTCTTCCTAA GGATACACCC GCTGCTCCGG GTCCCGCACT-5'

5'-TGGTGGGCAT GGGTCAGAAG GATTCCTATG TGGGCGACGA GGACCAGGGC-3'
3'-ACCACCCGTA CCCAGTCTTC CTAAGGATAC ACCCGCTGCT CCTGGTCCCG-5'

5'-GTGATGGTGG GCATGGGTCA GAAGGATTCC TATGTGGGCG ACGAGG-3'
3'-CACTACCACC CGTACCCAGT CTTCCTAAGG ATACACCCGC TGCTCC-5'

146塩基対(配列番号6)
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図2の電気泳動結果とも一致した。
(1)の増幅産物は、2つのプライマーに挟まれる領域である。
(2)の増幅産物は、それぞれのプライマーによって増幅された産物が、配列X(CCCAG)及び配列Xc(CTGGG)を介して結合し、さらに増幅した産物である。
(3)の増幅産物は、(2)の増幅産物と2つのプライマーのどちらかによって増幅された産物が、配列X(CCCAG)及び配列Xc(CTGGG)を介して結合し、さらに増幅した産物である。
<実施例4>核酸の増幅反応
(1)ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
HumanGenomicDNA(Clontech社製)3.0ngを98℃で3min.加熱を行い、1本鎖にしたのち、β3AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
<プライマー>
プライマーは、β3AR遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Forward):
5'−ATCGTGGCCATCGCCT−3'(配列番号7)
プライマー(2)(Reverse):
5'−CCAGCGAAGTCACGAAC−3'(配列番号8)
上記プライマーのβ3AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図4に示した。
ここで、配列Xは「5'-GCTGGCC-3'」であり、90塩基離れた位置に存在する。プライマー(1)は5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計されており、プライマー(2)は5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。
(2)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、60℃、60分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、NEB社のBst.DNA polymeraseを使用した。
<反応液の組成>
10×Bst Buffer(DF) 1.0μL
100mM MgSO4 0.6μL
10%(v/v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR Green I(2000倍) 0.2μL
50μM primer(1) 0.64μL
50μM primer(2) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
1)で得た核酸断片試料液(3.0ng) 0.4μL
精製水 4.96μL
10.0μL
(3)増幅産物の検出
前記(2)における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置(Mx3000p,Stratagene社製)を用いて蛍光検出を行った。結果を図5に示す。
Mx3000pの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が250に到達したときの時間(Ct値)を算出した。Ct値は41.2±0.5分であった。
<実施例5>増幅産物の電気泳動
3wt%のアガロースゲル、0.5xTBEバッファー(50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4)を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図6に示す。電気泳動パターンはN=4でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。
<実施例6>増幅産物のクローニング
電気泳動を実施後、200bp以下の領域のゲルを切り出し、QIAEXII(Qiagen製)を用いてゲル中のDNAを回収した。
回収したDNAをTOPO TA Cloning Kit(Invitrogen製)を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
QIAprep Miniprep(Qiagen製)を使用して培養した大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。
M13 Reverse Primer
5'−CAGGAAACAGCTATGAC−3'(配列番号3)
シークエンスの結果、次の3種類の増幅産物が存在することがわかった。
(1)
5'-ATCGTGGCCA TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT-3'
3'-TAGCACCGGT AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA-5'
5'-CGTGACTTCGCTGG-3'
3'-GCACTGAAGCGACC-5'
64塩基対 (配列番号9)
(2)
5'-ATCGTGGCCA TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT-3'
3'-TAGCACCGGT AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA-5'
5'-CGTGACTTCG CTGGGCACCG TGGGAGGCAA CCTGCTGGTC ATCGTGGCCA-3'
3'-TCACTGAAGC GACCCGTGGC ACCCTCCGTT GGACGACCAG TAGCACCGGT-5'
5'-TCGCCTGGAC TCCGAGACAC CAGACCATGA CCAACGTGTT CGTGACTTCG-3'
3'-AGCGGACCTG AGGCTCTGTG GTCTGGTACT GGTTGCACAA GCACTGAAGC-5'
5'-CTG-3'
3'-GAC-5'
153塩基対(配列番号10)
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図6の電気泳動結果とも一致した。
(1)の増幅産物は、2つのプライマーに挟まれる領域である。
(2)の増幅産物は、それぞれのプライマーによって増幅された産物が、配列X(GCTGGCC)及び配列Xc(GGCCAGC)を介して結合し、さらに増幅した産物である。
<実施例7>
核酸の増幅反応
(1)ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
HumanGenomicDNA(Clontech社製)3.0ngを98℃で3min.加熱を行い、1本鎖にしたのち、7番染色体中の配列の増幅を以下の条件で行った。
<プライマー>
プライマーは、7番染色体中の配列を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(5)(Forward):
5'−CATTGCTCAGGGGTCTTC−3'(配列番号11)
プライマー(6)(Reverse):
5'−ATTTCGGCTCCCTTGG−3'(配列番号12)
上記プライマーの7番染色体中の配列に対する位置関係の詳細を図7に示した。
ここで、配列Xは「5'-GCCGGG-3'」であり、32塩基離れた位置に存在する。プライマー(5)は5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計されており、プライマー(6)は5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計されている。
(2)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、60℃、60分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、NEB社のBst.DNA polymeraseを使用した。
<反応液の組成>
10×Bst Buffer(DF) 1.0μL
100mM MgSO4 0.6μL
10%(v/v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR Green I(2000倍) 0.2μL
50μM primer(5) 0.64μL
50μM primer(6) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
1)で得た核酸断片試料液(3.0ng) 0.4μL
精製水 4.96μL
10.0μL
(3)増幅産物の検出
前記(2)における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置(Mx3000p,Stratagene社製)を用いて蛍光検出を行った。結果を図8に示す。
Mx3000pの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が250に到達したときの時間(Ct値)を算出した。Ct値は50.1±0.4分であった。
<実施例8>増幅産物の電気泳動
3wt%のアガロースゲル、0.5xTBEバッファー(50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4)を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図9に示す。電気泳動パターンはN=2でほぼ均一であり、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。
<実施例9>
核酸の増幅反応
(1)ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
HumanGenomicDNA(Clontech社製)3.0ngを98℃で3min.加熱を行い、1本鎖にしたのち、7番染色体中の配列の増幅を以下の条件で行った。
<プライマー>
プライマーは、7番染色体中の配列を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(5)(Forward):
5'−CATTGCTCAGGGGTCTTC−3'(配列番号11)
プライマー(7)(Reverse):
5'−GGGCTCATAAGGTGCGTG−3'(配列番号13)
上記プライマーの7番染色体中の配列に対する位置関係の詳細を図10に示した。
ここで、配列Xは「5'-GCCGGG-3'」であり、32塩基離れた位置に存在する。プライマー(5)は5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計されており、プライマー(7)は3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計されている。
(2)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、60℃、60分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、NEB社のBst.DNA polymeraseを使用した。
<反応液の組成>
10×Bst Buffer(DF) 1.0μL
100mM MgSO4 0.6μL
10%(v/v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR Green I(2000倍) 0.2μL
50μM primer(5) 0.64μL
50μM primer(7) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
1)で得た核酸断片試料液(3.0ng) 0.4μL
精製水 4.96μL
10.0μL
(3)増幅産物の検出
前記(2)における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置(Mx3000p,Stratagene社製)を用いて蛍光検出を行った。結果を図11に示す。
Mx3000pの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が250に到達したときの時間(Ct値)を算出した。Ct値は49.0±5.0分であった。
<実施例10>増幅産物の電気泳動
3wt%のアガロースゲル、0.5xTBEバッファー(50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4)を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図12に示す。電気泳動パターンより、N=2でほぼ同一の増幅産物が得られていることがわかった。これより、増幅産物は同一の反応機構により得られていることがわかった。
図1は、実施例で用いたプライマーのβアクチン遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。 図2は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。 図3は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。 図4は、実施例で用いたプライマーのβ3AR遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。 図5は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。 図6は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。 図7は、実施例で用いたプライマーの7番染色体に対する位置関係の詳細を示す。 図8は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。 図9は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。 図10は、実施例で用いたプライマーの7番染色体に対する位置関係の詳細を示す。 図11は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。 図12は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。 図13は、本発明の核酸の増幅方法の第一の態様の概要(前半)を示す。 図14は、本発明の核酸の増幅方法の第一の態様の概要(後半)を示す。 図15は、本発明の核酸の増幅方法の第二の態様の概要(前半)を示す。 図16は、本発明の核酸の増幅方法の第二の態様の概要(後半)を示す。 図17は、本発明の核酸の増幅方法の第三の態様の概要(前半)を示す。 図18は、本発明の核酸の増幅方法の第三の態様の概要(後半)を示す。

Claims (19)

  1. 少なくとも1種のデオキシヌクレオチド3リン酸、少なくとも1種の鎖置換能を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの3’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域又はその一部を増幅できるように、第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする、核酸の増幅方法。
  2. 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計し、かつ、第一のオリゴヌクレオチドプライマーと相補的な配列の5’側に第二のオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを特徴とする、請求項1記載の核酸の増幅方法。
  3. 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’末端の塩基と3’側の配列Xの3’末端の塩基に挟まれる領域の相補鎖に対して設計することを特徴とする、請求項1記載の核酸の増幅方法。
  4. 連続した4塩基以上の配列Xが200塩基以内に2箇所以上存在する領域に対し、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを5’側の配列Xの5’側100塩基以内の領域に対して設計し、かつ、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを3’側の配列Xの3’側100塩基以内の領域の相補鎖に対して設計することを特徴とする、請求項1記載の核酸の増幅方法。
  5. 配列X、及び配列Xに相補的な配列Xcが連続した5塩基以上の配列である、請求項1から4の何れかに記載の方法。
  6. 配列X、及び配列Xに相補的な配列Xcが連続した7塩基以上の配列である、請求項1から5の何れかに記載の方法。
  7. 反応溶液が少なくとも0.05%以上の界面活性剤を含む、請求項1から6の何れかに記載の方法。
  8. 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項7に記載の方法。
  9. 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする請求項8に記載の方法。
  10. 反応溶液が、少なくとも2価の陽イオンを含む、請求項1から9の何れかに記載の方法。
  11. 反応溶液が、融解温度調整剤をさらに含む、請求項1から10の何れかに記載の核酸の増幅方法。
  12. 融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項11に記載の核酸の増幅方法。
  13. 反応溶液が、各々1.0mM以上100mM以下のデオキシヌクレオチド3リン酸を含む、請求項1から12の何れかに記載の方法。
  14. 反応溶液が、各々1μM以上100μM以下のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項1から13の何れかに記載の方法。
  15. オリゴヌクレオチドプライマーが前記鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である、請求項1から14の何れかに記載の方法。
  16. 前記オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端領域のみが前記鋳型核酸断片と実質的に相補的である、請求項1から14の何れかに記載の方法。
  17. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記鋳型核酸断片と連続した一箇所でのみ実質的に相補的である、請求項1から16の何れかに記載の方法。
  18. 少なくとも1種の鎖置換能を有するDNAポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst.DNAポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Vent.DNAポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項1から17の何れかに記載の方法。
  19. 核酸を増幅する工程が、室温以上100℃以下の実質的に等温で行われる、請求項1から18の何れかに記載の核酸の増幅方法。
JP2008208874A 2007-08-15 2008-08-14 核酸増幅方法 Active JP5393077B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008208874A JP5393077B2 (ja) 2007-08-15 2008-08-14 核酸増幅方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007211633 2007-08-15
JP2007211633 2007-08-15
JP2008208874A JP5393077B2 (ja) 2007-08-15 2008-08-14 核酸増幅方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2009060897A true JP2009060897A (ja) 2009-03-26
JP5393077B2 JP5393077B2 (ja) 2014-01-22

Family

ID=39870370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008208874A Active JP5393077B2 (ja) 2007-08-15 2008-08-14 核酸増幅方法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP2025763B1 (ja)
JP (1) JP5393077B2 (ja)
CN (1) CN101368197B (ja)
AT (1) ATE497022T1 (ja)
DE (1) DE602008004702D1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009136284A (ja) * 2007-11-14 2009-06-25 Fujifilm Corp 核酸増幅方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5616584B2 (ja) * 2009-01-09 2014-10-29 富士フイルム株式会社 核酸配列の複製方法
CN106754878B (zh) * 2016-12-20 2020-02-25 南京艾迪康医学检验所有限公司 乳腺癌易感基因变异文库构建方法
CN106757378B (zh) * 2016-12-20 2019-11-05 深圳市艾伟迪生物科技有限公司 结直肠癌易感基因变异文库构建方法
CN106757379B (zh) * 2016-12-20 2018-08-28 上海赛安生物医药科技股份有限公司 肺癌多基因变异文库构建方法
CN106498082B (zh) * 2016-12-20 2019-12-20 菁良基因科技(深圳)有限公司 卵巢癌易感基因变异文库构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11509406A (ja) * 1995-06-13 1999-08-24 ヒムラー,ゴットフリート 核酸の無転写増幅方法
JP2004257901A (ja) * 2003-02-26 2004-09-16 Eiken Chem Co Ltd 散乱光を利用した核酸検出方法
JP2007189983A (ja) * 2006-01-20 2007-08-02 Toshiba Corp 核酸検出法のためのプライマーの設計方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8997991A (en) 1991-01-31 1992-08-06 Becton Dickinson & Company Exonuclease mediated strand displacement amplification
US5565339A (en) * 1992-10-08 1996-10-15 Hoffmann-La Roche Inc. Compositions and methods for inhibiting dimerization of primers during storage of polymerase chain reaction reagents
US6100078A (en) * 1994-04-01 2000-08-08 Gen-Probe Incorporated Purified DNA polymerase from bacillus stearothermophilus ATCC 12980
JP2004154008A (ja) * 2002-11-01 2004-06-03 Eiken Chem Co Ltd 核酸の検出方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11509406A (ja) * 1995-06-13 1999-08-24 ヒムラー,ゴットフリート 核酸の無転写増幅方法
JP2004257901A (ja) * 2003-02-26 2004-09-16 Eiken Chem Co Ltd 散乱光を利用した核酸検出方法
JP2007189983A (ja) * 2006-01-20 2007-08-02 Toshiba Corp 核酸検出法のためのプライマーの設計方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009136284A (ja) * 2007-11-14 2009-06-25 Fujifilm Corp 核酸増幅方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE602008004702D1 (de) 2011-03-10
JP5393077B2 (ja) 2014-01-22
CN101368197B (zh) 2013-12-11
EP2025763A1 (en) 2009-02-18
CN101368197A (zh) 2009-02-18
ATE497022T1 (de) 2011-02-15
EP2025763B1 (en) 2011-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8435741B2 (en) Isothermal nucleic acid amplification method using surfactant
JP5401080B2 (ja) 核酸増幅方法
JP5616584B2 (ja) 核酸配列の複製方法
JPWO2003016569A1 (ja) 核酸の増幅方法
US20090155856A1 (en) Nucleic acid amplification method
US20080044921A1 (en) Primers used in novel gene amplification method
JP5393077B2 (ja) 核酸増幅方法
JP4249186B2 (ja) 核酸の増幅方法
JP2017508474A (ja) 低塩条件下での等温増幅
JPWO2002062993A1 (ja) 増幅核酸及びその固定化物
US20050059000A1 (en) Method of stabilizing reagent for amplifying or detecting nucleic acid and storage method
US20160348189A1 (en) Molecular detection of rna
JP2009131252A (ja) Rnaの検出方法
JP5546109B2 (ja) 核酸の塩基配列の識別方法
JP2002233379A (ja) 核酸の増幅方法
JP2003052380A (ja) 核酸の増幅方法
EP2206790B1 (en) Method for reducing dispersion in nucleic acid amplification reaction
JP2008178338A (ja) 断片化核酸が混入する核酸試料中の標的核酸を増幅する核酸増幅方法、及びそのキット

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20110209

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130625

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130823

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20131001

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20131015

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5393077

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250