JP5616584B2 - 核酸配列の複製方法 - Google Patents
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Description
好ましくは、本発明による核酸配列の複製方法は、以下の工程を含む。
(a)連続する20塩基以上200塩基以下の配列A(Ac)、上記鋳型核酸配列上の上記配列A(Ac)とは異なる1塩基以上100塩基以下の配列B(Bc)が交互に連結した構造を有する2本鎖鋳型核酸であって、配列A(Ac)が少なくとも2箇所以上存在することを特徴とする2本鎖鋳型核酸を与える工程、
(b)工程(a)で与えた鋳型核酸の全部または一部を解離させる工程、
(c) 工程(b)で得た全部または部分的に解離した2本鎖鋳型核酸に対して、新たな核酸鎖を配列A(Ac)を介して塩基対結合させる工程、及び
(d)工程(c)で塩基対結合した核酸鎖の一方または両者の3'末端を合成起点として、鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行う工程。
(a)連続する20塩基以上200塩基以下の配列A(Ac)、上記鋳型核酸配列上の上記配列A(Ac)とは異なる1塩基以上100塩基以下の配列B(Bc)が交互に連結した構造を有する2本鎖鋳型核酸であって、配列A(Ac)が少なくとも2箇所以上存在することを特徴とする2本鎖鋳型核酸を与える工程、
(b)工程(a)で与えた鋳型核酸の全部または一部を解離させる工程、
(c)工程(b)で得た全部または部分的に解離した2本鎖鋳型核酸同士が配列A(Ac)を介して塩基対結合する工程、及び
(d)工程(c)で塩基対結合した核酸鎖の一方または両者の3'末端を合成起点として、鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行う工程。
好ましくは、工程(d)で得られた鎖置換相補鎖合成反応産物は、工程(a)での2本鎖鋳型核酸として利用される。
好ましくは、全ての工程は50℃以上100℃以下の等温で行なわれる。
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、反応溶液は、2価の陽イオンをさらに含む。
好ましくは、反応溶液は、融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、全ての工程は60分以内で行なわれる。
本発明による核酸の増幅方法は、以下の工程を含むことを特徴とすることで、複雑なプライマー設計や特殊な酵素を必要とせずに、等温で標的核酸配列を高い効率で短時間に増幅する方法である。
(a)連続する20塩基以上200塩基以下の配列A(Ac)、上記鋳型核酸配列上の上記配列A(Ac)とは異なる1塩基以上100塩基以下の配列B(Bc)が交互に連結した構造を有する2本鎖鋳型核酸であって、配列A(Ac)が少なくとも2箇所以上存在することを特徴とする2本鎖鋳型核酸を与える工程、
(b)工程(a)で与えた鋳型核酸の全部または一部を解離させる工程、
(c) 工程(b)で得た全部または部分的に解離した2本鎖鋳型核酸に対して、新たな核酸鎖を配列A(Ac)を介して塩基対結合させる工程、及び
(d)工程(c)で塩基対結合した核酸鎖の一方または両者の3'末端を合成起点として、鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行う工程。
本発明によれば、鋳型核酸の全部または一部を解離させる工程には、特別な試薬、高温での処理を必要としない。
好ましくは、鋳型核酸の全部または一部を解離させる工程は、50℃以上100℃以下で行なわれる。
本発明によれば、工程c)における新たな核酸鎖は、全部または部分的に解離した異なる2本鎖鋳型核酸分子より提供されてもよい(図2)。
本発明によれば、工程c)における新たな核酸鎖は、全部または部分的に解離した元々の2本鎖鋳型核酸分子より提供されてもよい(図3)。
本発明によれば、2本鎖鋳型核酸の一部と相補的なオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。
(1)デオキシヌクレオチド3リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド3リン酸を用いる。具体的には、dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド3リン酸としては、dNTPのアナログ(例えば、7−デアザ−dGTP等)が含まれていてもよい。
本発明においては、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いる。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってDNA複製を行う際、DNA鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換(strand displacement)することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス ステアロサーモフィラス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst.DNAポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損Vent.DNAポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のDNAポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという有利な効果を達成することができる。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン(アニオン)性界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル、POEソルビタン脂肪酸エステル(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)、脂肪酸アルカノールアミド、POEアルキルエーテル(Brij35、Brij58、等)、POEアルキルフェニルエーテル(TritonX-100、TritonX-114、Nonidet P40、等)、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、POEアルキルアミン、POE脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン(ノニオン)性界面活性剤、そしてセチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン(カチオン)性界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは0.01%以上、より好ましくは0.05%以上、より好ましくは0.1%以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は10%以下、好ましくは5%以下、より好ましくは1%以下である。
本発明で使用するオリゴヌクレオチドは、鋳型DNAに実質的に相補的な塩基配列を有し、その3'末端よりDNA鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドは、鋳型DNAに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるDNAにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの2種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、DMSOやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に10%以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、0.2〜3.0M、好ましくは0.5〜1.5M程度添加することができる。
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩(リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等)などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は5mM〜100mMの範囲、特に好ましくは10mM〜50mMの範囲であり、またpHは、増幅反応に用いられる酵素の至適pHにもよるが、一般的には6.0〜9.0、特に好ましくはpH7.0〜9.0のものを使用できる。
本発明における反応溶液には、蛍光色素を含めることができる。蛍光色素としては、特に限定はないが、例えばSYBR GreenIなどを使用することができる。
本発明では、好ましくは、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行うことができる。反応溶液をインキュベートする際の温度は好ましくは50℃以上であり、より好ましくは55℃以上であり、例えば、60℃程度でインキュベートすることができる。好ましい温度範囲は、例えば、約50℃から約70℃であり、さらに好ましくは約55℃から約65℃である。
本発明による核酸の増幅方法は、核酸の検出、標識、塩基配列の決定、塩基の変異の検出(一塩基多型の検出などを含む)などに使用することができる。本発明の核酸の増幅方法には温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、多量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
(1)標的核酸配列を含む核酸試料液の調製
Human Genomic DNA(Clonetech社製)3.0ngを98℃で3分間加熱を行い、1本鎖にしたのち、β2AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
下記に示すプライマーを用いて、標的核酸配列を含む試料から連続する20塩基以上200塩基以下の配列A(Ac)、上記鋳型核酸配列上の上記配列A(Ac)とは異なる3塩基以上100塩基以下の配列B(Bc)が交互に連結した構造を有する2本鎖鋳型核酸であって、配列A(Ac)が少なくとも2箇所以上存在することを特徴とする2本鎖鋳型核酸を得た。
各プライマーの配列を以下に示す。
5'−CCACGACGCTTGCTGGCACCCAATA−3'(配列番号1)
プライマー(2):
5'−TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA−3'(配列番号2)
プライマー(3):
5'−CCGGCGCATGGCTT−3'(配列番号3)
ここで、プライマー(1)、(2)の5'末端8塩基は、プライマー(3)と実質的に相補的な配列の5'末端側に存在する配列と実質的に相補的である。
以下に示す反応液の組成で、60℃、60分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、NEB社のBst.DNA polymeraseを使用した。
<反応液の組成>
10×Bst Buffer(DF) 1.0μL
100mM MgSO4 0.6μL
10%(v/v) Tween20 0.1μL
100% DMSO 0.5μL
25mM dNTP each 0.56μL
SYBR GreenI(2000倍希釈) 0.2μL
50μM primer(1)又は(2) 0.64μL
50μM primer(3) 0.64μL
Bst. Polymerase 0.4μL
1)で得た核酸断片試料 3.0ng
精製水 4.96μL
10.0μL
3wt%のアガロースゲル、0.5×TBEバッファー(50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4)を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図5及び図6に示す。
複製反応産物をNucleoSpin(登録商標) Extract II(MACHEREY-NAGEL製)精製し、TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen製)を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。なお、シークエンスはABI PRISM 310 Genetic Analyzer(ABI社製)により行なった。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。
5'−CAGGAAACAGCTATGAC−3'(配列番号4)
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC -5'
(42塩基対)(配列番号5)
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGG -3'
3'- CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCC -5'
(85塩基対)(配列番号6)
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGGACCAC GACGTTCTTG -3'
3'- CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCCTGGTG CTGCAAGAAC -5'
5'- CTGGCACCCA ATAGAAGCCA TGCGCCGG -3'
3'- GACCGTGGGT TATCTTCGGT ACGCGGCC -5'
(128塩基対)(配列番号7)
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC -5'
(42塩基対)(配列番号8)
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCT GGCACCCAAT
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCACCAAAGAACGAC CGTGGGTTA
5'- AGAAGCCATG CGCCGG -3'
3'- TCTTCGGTAC GCGGCC -5'
(116塩基対)(配列番号9)
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCT GGCACCCAAT -3'
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCAC CAAAGAACGA CCGTGGGTTA -5'
5'- AGAAGCCATG CGCCGGACCA CGACGTCACG CAGGAAAGGG ACGAGGTGTG -3'
3'- TCTTCGGTAC GCGGCCTGGT GCTGCAGTGC GTCCTTTCCC TGCTCCACAC -5'
5'- GGTGGTTTCT TGCTGGCACC CAATAGAAGC CATGCGCCGG -3'
3'- CCACCAAAGA ACGACCGTGG GTTATCTTCG GTACGCGGCC -5'
(190塩基対)(配列番号10)
Claims (8)
- 試料核酸、フォワードプライマーとリバースプライマー、デオキシヌクレオチド3リン酸、及び鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ、
を含む反応液を50℃以上100℃以下の等温でインキュベートすることにより、以下の(a)〜(d)の工程を行うことを含む、核酸配列の複製方法であって、
フォワードプライマーは、試料核酸配列における増幅すべき配列のセンス鎖の5’末端側の塩基配列を含み、リバースプライマーは、上記増幅すべき配列のアンチセンス鎖の5’末端側の塩基配列からなるプライマーであり、
フォワードプライマーとリバースプライマーで挟まれた領域が配列A(Ac)となり、
フォワードプライマーとリバースプライマーはDNAである、
上記の核酸配列の複製方法。
(a)連続する20塩基以上200塩基以下の配列A(Ac)、上記試料核酸配列上の上記配列A(Ac)とは異なる1塩基以上100塩基以下の配列B(Bc)が交互に連結した構造を有する2本鎖鋳型核酸であって、配列A(Ac)が少なくとも2箇所以上存在することを特徴とする2本鎖鋳型核酸を与える工程、
(b)工程(a)で与えた鋳型核酸の全部または一部を解離させる工程(ここで、鋳型核酸の解離した部分は、配列A(Ac)の全体を含む部分である)、
(c) 工程(b)で得た全部または部分的に解離した2本鎖鋳型核酸に対して、新たな核酸鎖を配列A(Ac)を介して塩基対結合させる工程(ここで、前記新たな核酸鎖とは、配列A(Ac)、配列B(Bc)が交互に連結した構造を有する2本鎖鋳型核酸が全部または部分的に解離したものである)、又は工程(b)で得た全部または部分的に解離した2本鎖鋳型核酸同士が配列A(Ac)を介して塩基対結合する工程、及び
(d)工程(c)で塩基対結合した核酸鎖の一方または両者の3'末端を合成起点として、鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行う工程。 - 工程(d)で得られた鎖置換相補鎖合成反応産物が、工程(a)での2本鎖鋳型核酸として利用される、請求項1に記載の方法。
- 鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の5'→3'エキソヌクレアーゼ欠損Bst. DNAポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の5'→3'エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼ、サーモコッカスリトラリス由来の5'→3'エキソヌクレアーゼ欠損Vent. DNAポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のDNAポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項1又は2に記載の方法。
- 反応溶液が少なくとも0.01%以上の界面活性剤を含む、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項4に記載の方法。
- 反応溶液が、2価の陽イオンをさらに含む、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 反応溶液が、融解温度調整剤をさらに含む、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
- 全ての工程が60分以内で行なわれる、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
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