JP2011224002A5 - - Google Patents
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- T7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド（T7変異体）であって、該T7変異体が、(i) DNA依存性RNAポリメラーゼ活性、(ii) 配列番号2で示される883個のアミノ酸のT7 RNAポリメラーゼポリペプチド（野生型参照）と比較して増強された熱安定性、および(iii) 該野生型参照と比較して異なるアミノ酸組成により特徴付けられ、
該変異体が、異なる位置の少なくとも1個のアミノ酸であって4個までのアミノ酸が置換されている野生型参照のポリペプチドを含み、
該野生型参照のN末端から番号付けされたVal426が、Leuに置換され(Val426Leu)、
3個までのアミノ酸の置換については、置換はAla702ValおよびVal795Ileから選択され、4個の置換されたアミノ酸については、さらなる置換はVal650Leuであり、かつ
50℃で、10mMリン酸カリウム、200mM KCl、0.1mM EDTA、30mMメルカプトエタノール、50%グリセロール、0.1% Tween 20、pH7.9からなる緩衝液中で、該T7変異体の半減期が20分〜320分である、
上記T7変異体。 - T7変異体のアミノ酸配列が、配列番号40、配列番号42、配列番号44および配列番号48からなる群から選択される、請求項１に記載のT7変異体。
- T7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド（T7変異体）の製造方法であって、該T7変異体が、(i) DNA依存性RNAポリメラーゼ活性、(ii) 配列番号2で示される883個のアミノ酸のT7 RNAポリメラーゼポリペプチド（野生型参照）と比較して増強された熱安定性、および(iii) 該野生型参照と比較して異なるアミノ酸組成により特徴付けられ、該方法が、
(a) 該野生型参照のN末端から番号付けされたVal426をLeuと置換してT7変異体を形成する工程、
ただし、該野生型参照の少なくとも1個のアミノ酸であって異なる位置の4個までのアミノ酸は置換され、かつ
3個までのアミノ酸の置換については、置換はAla702ValおよびVal795Ileから選択され、4個の置換されるアミノ酸については、さらなる置換はVal650Leuである、
(b) 工程(a)のT7変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を発現系で発現させて、発現されたT7変異体を該発現系から単離する工程、
を含み、それによりT7変異体を製造し、
50℃で、10mMリン酸カリウム、200mM KCl、0.1mM EDTA、30mMメルカプトエタノール、50%グリセロール、0.1% Tween 20、pH7.9からなる緩衝液中で、該T7変異体の半減期が20分〜320分である、
上記方法。 - 配列番号39、配列番号41、配列番号43および配列番号47からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子。
- 請求項４に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、該核酸分子が、転写および/または翻訳を制御可能な1つ以上のヌクレオチド配列に機能的に連結されている、発現ベクター。
- 請求項５に記載の発現ベクターで形質転換されている、ポリペプチドの組換え発現が可能な宿主生物。
- (a) T7プロモーターを含む鋳型DNA分子を提供する工程、ただし、該T7プロモーターは、転写される標的ヌクレオチド配列に機能的に連結されている、
(b) 工程(a)の鋳型DNAを、請求項１および２のいずれかに記載のT7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド（T7変異体）または請求項３に記載の方法により取得可能なT7変異体に、接触させる工程、続いて、
(c) リボヌクレオシド三リン酸の存在下で該鋳型DNAおよび該T7変異体をインキュベートする工程、
を含み、それによりRNA分子を合成する、RNA分子の合成方法。 - 転写される標的ヌクレオチド配列に機能的に結合されたT7プロモーターを有する鋳型DNA分子と、リボヌクレオシド三リン酸と、請求項１および２のいずれかに記載のT7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド（T7変異体）または請求項３に記載の方法により取得可能なT7変異体と、を含む組成物。
- 個別の容器内に、請求項１および２のいずれかに記載のT7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド（T7変異体）または請求項３に記載の方法により取得可能なT7変異体と、1種以上のリボヌクレオシド三リン酸を含む緩衝液と、を含むキット。
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