EA018221B1 - АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ - Google Patents

АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ Download PDF

Info

Publication number
EA018221B1
EA018221B1 EA200970747A EA200970747A EA018221B1 EA 018221 B1 EA018221 B1 EA 018221B1 EA 200970747 A EA200970747 A EA 200970747A EA 200970747 A EA200970747 A EA 200970747A EA 018221 B1 EA018221 B1 EA 018221B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
bone
fusion protein
activin
amino acid
use according
Prior art date
Application number
EA200970747A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970747A1 (ru
Inventor
Джон НОПФ
Джасбир СИХРА
Равиндра КУМАР
Original Assignee
Акселерон Фарма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акселерон Фарма Инк. filed Critical Акселерон Фарма Инк.
Publication of EA200970747A1 publication Critical patent/EA200970747A1/ru
Publication of EA018221B1 publication Critical patent/EA018221B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04W—WIRELESS COMMUNICATION NETWORKS
    • H04W8/00—Network data management
    • H04W8/02—Processing of mobility data, e.g. registration information at HLR [Home Location Register] or VLR [Visitor Location Register]; Transfer of mobility data, e.g. between HLR, VLR or external networks
    • H04W8/08—Mobility data transfer
    • H04W8/082—Mobility data transfer for traffic bypassing of mobility servers, e.g. location registers, home PLMNs or home agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1796—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04W—WIRELESS COMMUNICATION NETWORKS
    • H04W40/00—Communication routing or communication path finding
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04W—WIRELESS COMMUNICATION NETWORKS
    • H04W80/00—Wireless network protocols or protocol adaptations to wireless operation
    • H04W80/04—Network layer protocols, e.g. mobile IP [Internet Protocol]
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04W—WIRELESS COMMUNICATION NETWORKS
    • H04W84/00—Network topologies
    • H04W84/18—Self-organising networks, e.g. ad-hoc networks or sensor networks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
    • H04L2212/00—Encapsulation of packets

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Computer Networks & Wireless Communication (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к композициям и способам для стимуляции роста кости и увеличения плотности кости, а также для лечения множественной миеломы.

Description

Нарушения костной ткани, тяжесть которых колеблется от остеопороза до переломов, представляют собой набор патологических состояний, для которых существует лишь несколько эффективных фармацевтических средств. Вместо этого лечение сфокусировано на физические воздействия и изменение образа жизни, включая иммобилизацию, упражнения и изменение диеты. Лекарственные средства, которые стимулируют рост кости и повышают плотность кости, были бы полезны при лечении различных нарушений кости.
Рост и минерализация кости зависят от активности двух типов клеток, остеокластов и остеобластов, хотя хондроциты и клетки сосудистой сети также принимают участие в важных аспектах этих процессов. В ходе развития формирование кости происходит за счет двух механизмов, внутрихрящевого окостенения и окостенения в соединительно-тканной мембране, причем первое отвечает за формирование продольных костей, а последнее отвечает за формирование топологически плоских костей, таких как кости черепа. Для внутрихрящевого окостенения необходимы последовательное формирование и деградация хрящевых структур в пластинках роста, которые служат матрицами для образования остеобластов, остеокластов, сосудистой сети и последующей минерализации. Во время окостенения в соединительнотканной мембране кость формируется непосредственно из соединительных тканей. Для обоих процессов необходимы инфильтрация остеобластов и последующее накопление в матриксе.
Переломы и другие структурные нарушения кости заживают благодаря процессу, который по меньшей мере отчасти напоминает последовательность событий остеогенеза при развитии, включая формирование хрящевой ткани и последующую минерализацию. Процесс заживления перелома может происходить двумя путями. Непосредственное или первичное заживление кости происходит без образования костной мозоли. Непрямое или вторичное заживление кости происходит со стадией формирования предшественника костной мозоли. Первичное заживление переломов включает в себя восстановление механической целостности вокруг близко расположенного повреждения. В подходящих условиях резорбирующие костную ткань клетки, окружающие повреждение, оказывают туннельный резорбтивный ответ и образуют пути для проникновения кровеносных сосудов и последующего заживления. Вторичное заживление кости следует за процессом воспаления, образования мягкой костной мозоли, минерализации костной мозоли и перестройкой костной мозоли. На стадии воспаления происходит образование гематомы и кровоизлияния в результате нарушения периостальных и эндостальных кровеносных сосудов в участке повреждения. Воспалительные клетки проникают в эту область. На стадии образования мягкой костной мозоли клетки образуют новые сосуды, фибробласты, внутриклеточный материал и поддерживающие клетки, образуя грануляционную ткань в пространстве между фрагментами перелома. Клиническое срастание между краями повреждения образуется посредством фиброзной или хрящевой ткани (мягкая костная мозоль). Образуются остеобласты и опосредуют минерализацию мягкой костной мозоли, которая затем заменяется пластинчатой костью и подвергается нормальным процессам перестройки.
Кроме переломов и других физических повреждений структуры кости, потеря минерального содержания кости и костной массы может быть вызвана большим числом условий и может приводить к существенным медицинским проблемам. Изменения костной массы происходит относительно предсказуемым путем в течение жизни индивидуума. Приблизительно до 30 лет кости как мужчин, так и женщин растут до максимальной массы посредством линейного роста внутрихрящевых пластинок роста и радиального роста. Приблизительно после 30 лет (для губчатых костей, например плоских костей, таких как позвоночник и таз) и 40 лет (для трубчатой кости, например длинных костей, обнаруженных в конечностях) как у мужчин, так и у женщин происходит медленная потеря костной массы. У женщин происходит также конечная фаза существенной потери костной массы, вероятно, в результате постклимактерического дефицита эстрогена. Во время этой фазы женщина может потерять дополнительно 10% костной массы трубчатой кости и 25% губчатой части. Приведет ли прогрессирующая потеря костной массы к патологическому состоянию, такому как остеопороз, в значительной степени зависит от исходного состояния костной массы индивидуума и от наличия ухудшающих состояний.
Потерю костной массы иногда характеризуют как нарушение равновесия нормального процесса перестройки кости. Здоровая кость постоянно подвергается перестройке. Перестройка начинается с резорбции кости остеокластами. Затем резорбированная кость заменяется новой костной тканью, которая характеризуется образованием коллагена остеобластами и последующей кальцификацией. У здоровых индивидуумов скорость резорбции и формирования кости находятся в равновесии. Остеопороз представляет собой хроническое, прогрессирующее состояние с характерным сдвигом в сторону резорбции, что приводит к общему уменьшению костной массы и минерализации кости. Остеопорозу у человека предшествует клиническая остеопения (минеральная плотность кости, которая ниже среднего значения по сравнению с плотностью кости молодого организма более чем на одно стандартное отклонение, но менее
- 1 018221 чем на 2,5 стандартных отклонений). Во всем мире приблизительно 75 миллионов людей подвержены риску остеопороза.
Таким образом, способы контроля равновесия между активностью остеокластов и остеобластов могут быть используемы для заживления переломов и другого повреждения кости, а также для лечения нарушений, таких как остеопороз, связанных с потерей костной массы и минерализации кости.
Для лечения остеопороза использовали и эстроген, и кальцитонин, и остеокальцин с витамином К, и высокие дозы кальция в рационе. Другие способы лечения остеопороза включают бисфосфонаты, паратиреоидный гормон, кальцимиметики, статины, анаболические стероиды, соли лантана и стронция и фторид натрия. Однако указанные лекарственные средства часто вызывают нежелательные побочные эффекты.
Таким образом, объектом настоящего описания являются композиции и способы стимуляции роста и минерализации кости.
Краткое изложение сущности изобретения
Частично в описании показано, что молекулы, обладающие активностью антагониста активина или Ас1КПа (антагонисты активина и антагонисты Ас1КПа, обобщенно антагонисты активина-АсЖПа), можно использовать для повышения плотности кости, стимуляции роста кости и/или увеличения прочности кости. В частности, в описании показано, что растворимая форма АсЖИа действует как ингибитор передачи сигнала активина-АсЖИа и стимулирует повышение плотности кости, рост кости и прочность кости ίη νίνο. В то время как большинство фармацевтических средств, которые стимулируют рост кости или ингибируют потерю костной массы, действуют либо как антикатаболические средства (также обычно обозначаемые как катаболические средства) (например, бисфосфонаты), либо как анаболические средства (например, паратиреоидный гормон, РТН, в соответствующей дозе), растворимый белок Ас1К11а обладает двойной активностью, оказывая как антикатаболический, так и анаболический эффекты. Таким образом, в описании указано, что антагонисты пути передачи сигнала активина-Ас1К11а можно использовать для увеличения плотности кости и стимуляции роста кости. В то время как растворимый Ас1КПа может воздействовать на кость за счет механизма, отличного от антагонизма активина, в описании тем не менее показано, что желательные лекарственные средства могут быть выбраны на основе активности антагониста активина-Ас®11а. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления в описании представлены способы использования антагонистов активина-АсЖПа, включая, например, связывающие активин полипептиды Ас1К11а, антитела против активина, антитела против Ас1К11а, нацеленные на активин или Ас1КПа малые молекулы и аптамеры, и нуклеиновые кислоты, уменьшающие экспрессию активина и Ас1КПа, для лечения нарушений, связанных с низкой плотностью кости или низкой прочностью кости, таких как остеопороз, или для стимуляции роста кости у пациентов, например с переломом кости. Кроме того, в описании показано, что антагонисты активина-Ас®11а являются эффективными для профилактики и/или восстановления кости при повреждении, вызванном множественными миеломами и опухолями молочной железы, и, кроме того, что антагонисты активина-Ас®11а уменьшают воздействие опухоли при множественной миеломе. Растворимый полипептид Ас1К11а стимулирует рост кости, не вызывая последовательного значительного увеличения мышечной массы.
В конкретных аспектах изобретение относится к полипептидам, содержащим растворимый, связывающий активин полипептид АсЖИа, который связывается с активином. Полипептиды Ас1К11а можно вводить в состав фармацевтического препарата, содержащего связывающий активин полипептид Ас1К11а и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно связывающий активин полипептид Ас1К11а связывает активин с К менее 1 мкМ или менее 100, 10 или 1 нМ. Необязательно, связывающий активин полипептид Ас1КПа селективно связывает активин по сравнению с ΟΌΡ-11 и/или ΟΌΡ-8, и предпочтительно с Кс, по меньшей мере в 10 раз, 20 раз или 50 раз меньшей по отношению к активину, чем по отношению к ΟΌΡ-11 и/или ΟΌΡ-8. Без желания быть связанными с конкретным механизмом действия, предполагают, что такая степень селективности для ингибирования активина по сравнению с ингибированием ΟΌΡ-11/ΟΌΡ-8 является причиной селективного эффекта на кость без согласованного поддающегося измерению эффекта на мышцу. Во многих вариантах осуществления полипептид АсЖПа выбирают как вызывающий менее 15, менее 10 или менее 5% увеличения мышцы в дозах, при которых достигается желательный эффект на кость. Предпочтительно чистота композиции составляет по меньшей мере на 95% по сравнению с другим полипептидным компонентом, как оценено эксклюзионной хроматографией, и более предпочтительно композиция является по меньшей мере на 98%. Связывающий активин полипептид Ас1КПа для использования в таком препарате может представлять собой любой из описанных в настоящем изобретении, такой как полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, выбранной из 8Еф ΙΌ N0: 2, 3, 7 или 12, или обладающий аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или 99% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 3, 7, 12 или 13. Связывающий активин полипептид Ас1КПа может включать функциональный фрагмент природного полипептида Ас1К11а, такой как содержащий по меньшей мере 10, 20 или 30 аминокислот из последовательности, выбранной из 8Еф ΙΌ N0: 1-3 или последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2 с отсутствием от 10 до 15 С-концевых аминокислот (хвоста).
- 2 018221
Растворимый связывающий активин полипептид Ас1КЛа может включать одно или несколько изменений в аминокислотной последовательности (например, в связывающем лиганд домене) по сравнению с природным полипептидом Ас1Р11а. Примеры измененных полипептидов Ас1Р11а представлены в \νϋ 2006/012627, стр. 59-60, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Изменение аминокислотной последовательности может, например, изменять гликозилирование полипептида при продукции клетками млекопитающих, насекомых или в других эукариотических клетках или изменять протеолитическое расщепление полипептида по сравнению с природным полипептидом Ас1Ш1а.
Связывающий активин полипептид АсЖНа может представлять собой слитый белок, который имеет в качестве одного домена полипептид Ас1КНа (например, связывающую лиганд часть Ас1КНа) и один или несколько дополнительных доменов, которые придают желаемое свойство, такое как улучшенную фармакокинетику, упрощенную очистку, нацеливание на конкретные ткани и т.п. Например, домен слитого белка может улучшать стабильность ίη νίνο, время полужизни ίη νίνο, поглощения/введения, локализацию или распределение в ткани, формирование комплексов белка, мультимеризацию слитого белка и/или очистку или одновременно несколько из этих параметров. Димеризация или мультимеризация может приводить к увеличению аффинности связывания лиганда. Связывающий активин слитый белок АсЖПа может включать домен Рс иммуноглобулина (дикого типа или мутантный) или часть сывороточного альбумина или другого полипептида, которые придают желательные свойства, такие как улучшенную фармакокинетику, улучшенную растворимость или улучшенную стабильность. Как правило, слитый белок Ас1К11а-Рс продуцируется в виде гомодимерного комплекса. Необязательно, слитый белок Ас1К11а-Рс содержит относительно неструктурированный линкер, расположенный между доменом Рс и внеклеточным доменом Ас1КЛа. Этот неструктурированный линкер может соответствовать неструктурированной области приблизительно из 15 аминокислот на С-конце внеклеточного домена Ас1КЛа (хвосте) или может представлять собой искусственную последовательность из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот либо отрезок длиной между 5 и 15, 20, 30, 50 или более аминокислот, относительно свободных от вторичной структуры, или смесь из обоих. Линкер может быть богат остатками глицина и пролина и может, например, содержать единственную последовательность треонина/серина и глицинов или повторяющиеся последовательности треонина/серина и глицинов (например, синглеты или повторы ТС4 или 8С4). Слитый белок может включать субпоследовательность для очистки, такую как эпитоп-метка, метка РЬАС, полигистидиновая последовательность и слитый С8Т. Необязательно, растворимый полипептид АсЖЛа включает один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из гликозилированной аминокислоты, ПЭГилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной группой, и аминокислоты, конъюгированной с органическим дериватизирующим средством. Фармацевтический препарат может также включать одно или несколько дополнительных соединений, таких как соединение, которое используют для лечения нарушения кости.
Предпочтительно фармацевтический препарат является, по существу, апирогенным. Как правило, предпочтительно белок Ас1КЛа является экспрессированным в линии клеток млекопитающего, которая опосредует соответствующее природное гликозилирование белка Ас1КЛа, уменьшая вероятность неблагоприятного иммунного ответа у пациента. Линии клеток человека и СНО успешно использовали, что говорит о том, что другие экспрессирующие системы млекопитающих будут используемыми.
Как описано в настоящем изобретении, белки Ас1КНа, обозначенные как АсЖНа-Рс, обладают желательными свойствами, включая селективное связывание с активином по сравнению с СЭР-8 и/или СЭР-11, высокоаффинное связывание лиганда и время полужизни в сыворотке более 2 недель на моделях животных. В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам АсЕКЛа-Рс и фармацевтическим препаратам, содержащим такие полипептиды и фармацевтически приемлемый наполнитель.
В конкретных аспектах изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим растворимый связывающий активин полипептид АсЖНа. Выделенный полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность растворимого связывающего активин полипептида Ас1КНа, такого как описано выше. Например, выделенная нуклеиновая кислота может включать последовательность, кодирующую внеклеточный домен (например, связывающий лиганд домен) Ас1КЛа, и последовательность, которая будет кодировать часть или весь трансмембранный домен и/или цитоплазматический домен Ас1КНа, кроме стоп-кодона, расположенного внутри трансмембранного домена или цитоплазматического домена или расположенного между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом или цитоплазматическим доменом. Например, выделенный полинуклеотид может содержать полноразмерную полинуклеотидную последовательность Ас1КНа, такую как 8ЕС 1Э N0: 4 или 5, или частично усеченный вариант, где указанный выделенный полинуклеотид дополнительно содержит кодон терминации транскрипции по меньшей мере за 600 нуклеотидов до З'-конца или расположенного другим образом, так чтобы трансляция полинуклеотида приводила к внеклеточному домену, необязательно, слитому с усеченной частью полноразмерного Ас1КНа. Предпочтительная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой 8ЕС !Э N0: 14. Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем изобретении, могут быть функ
- 3 018221 ционально связанными с промотором экспрессии, и изобретение относится к клеткам, трансформированным такими рекомбинантными полинуклеотидами. Предпочтительно клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка СНО.
В конкретных аспектах описание относится к способам получения растворимого связывающего активин полипептида АсЖНа. Такой способ может включать в себя экспрессию любой нуклеиновой кислоты (например, 8ЕО ΙΌ N0: 4, 5 или 14), описанных в настоящем изобретении, в подходящей клетке, такой как клетка яичника китайского хомячка (СНО). Такой способ может включать в себя а) культивирование клетки в условиях, подходящих для экспрессии растворимого полипептида Лс4К11а, где указанную клетку трансформируют растворимой экспрессирующей конструкцией ЛсЖНа; и Ь) выделение экспрессированного таким образом растворимого полипептида ЛсЖНа. Растворимые полипептиды ЛсЖНа можно выделять в виде неочищенных, частично очищенных или высокоочищенных фракций. Очистку можно проводить серией стадий очистки, включая, например, одно, два, или три, или более из следующего в любом порядке: хроматография с белком А, анионообменная хроматография (например, на О-сефарозе). хроматография гидрофобного взаимодействия (например, на фенилсефарозе), эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография.
В конкретных аспектах антагонист активина-АсЖНа, описанный в настоящем изобретении, такой как растворимый, связывающий активин полипептид Ас4КПа, можно использовать в способе стимуляции роста кости или увеличения плотности кости у индивида. В конкретных вариантах осуществления описание относится к способам лечения нарушения, связанного с низкой плотностью кости, или стимуляции роста кости у пациентов. Способ может включать введение индивиду эффективного количества антагониста активина-АсЖНа. В конкретных аспектах описание относится к применению антагониста активина-Ас4КПа для получения лекарственного средства для лечения нарушения или состояния, как описано в настоящем изобретении.
В конкретных аспектах описание относится к способу идентификации средства, стимулирующего рост или увеличивающего минерализацию кости. Способ включает: а) идентификацию тестируемого средства, которое связывается с активином или со связывающим лиганд доменом полипептида АсЖНа; и Ь) оценку эффекта средства на рост или минерализацию кости.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана очистка Ас4К.Па-йРс, экспрессированного в клетках СНО. Белок очищают в виде одиночного, четко выраженного пика.
На фиг. 2 показано связывание Ас4К.Па-№с с активином и 0ΌΡ-11, как измерено анализом В1аСоте™.
На фиг. 3 показана схема анализа репортерного гена А-204, а также репортерный вектор: рОЬ3 (САОА12) (описанный в Ьепп1ег е! а1., 1998, ЕМВО, 17:3091-3100). Повтор САОА12 присутствует в генах, отвечающих на ΤΟΡ-β (ген РА1-1), так что этот вектор имеет основное применение для факторов, передающих сигнал через 8шаб 2 и 3.
На фиг. 4 показаны эффекты АсЖНа-ЬРс (ромбы) и АсЖНа-шРс (квадраты) на передачу сигнала ΟΌΡ-8 в анализе репортерного гена в А-204. Для обоих белков показали существенное ингибирование опосредованной ΟΌΡ-8 передачи сигналов в пикомолярных концентрациях.
На фиг. 5 показаны эффекты трех различных препаратов Ас4К.Па-№с на передачу сигнала СЬР-11 в анализе репортерного гена в А-204.
На фиг. 6 показаны примеры изображений ЭЕХЛ контрольных и обработанных АсЖНа-шРс мышей ВАЬВ/с, до (верхние панели) и после (нижние панели) 12-недельного периода обработки. Светлое окрашивание указывает на увеличенную плотность кости.
На фиг. 7 показано количественное определение эффектов АсЖНа-шРс на минеральную плотность кости у мышей ВАЬВ/с в течение 12-недельного периода. Обработки представляли собой контроль (ромбы), 2 мг/кг дозирование АсЖНа-шРс (квадраты), 6 мг/кг дозирование АсЖНа-шРс (треугольники) и 10 мг/кг дозирование Ас1К11а-шРс (круги).
На фиг. 8 показано количественное определение эффектов Ас4К.Па-шРс на минеральное содержание кости у мышей ВАЬВ/с в течение 12-недельного периода. Обработки представляли собой контроль (ромбы), 2 мг/кг дозирование АсЖНа-шРс (квадраты), 6 мг/кг дозирование АсЖНа-шРс (треугольники) и 10 мг/кг дозирование Ас1К11а-шРс (круги).
На фиг. 9 показано количественное определение эффектов АсЖНа-шРс на минеральную плотность кости для губчатой кости у мышей С57ВЬ6 после овариэктомии (ОУХ) или ложной операции (8НАМ) после 6-недельного периода. Обработки представляли собой контроль (РВ8) или 10 мг/кг дозирование Ас1К11а-шРс (Ас1КНа).
На фиг. 10 показано количественное определение эффектов Ас4К.Па-шРс на губчатую кость у мышей С57ВЬ6 после овариэктомии (ОУХ) в течение 12-недельного периода. Обработки представляли собой контроль (РВ8; светлые столбцы) или 10 мг/кг дозирование АсЖНа-шРс (Ас1КНа; темные столбцы).
На фиг. 11 показано количественное определение эффектов Ас4К.Па-шРс на губчатую кость у мышей С57ВЬ6 после ложной операции после периода обработки 6 или 12 недель. Обработки представляли
- 4 018221 собой контроль (РВБ; светлые столбцы) или 10 мг/кг дозирование АсЖНа-тРс (АсЖПа; темные столбцы).
На фиг. 12 показаны результаты анализа рОСТ плотности кости у мышей после овариэктомии в течение 12 недель обработки. Обработки представляли собой контроль (РВБ; светлые столбцы) или Ас1Ш1а-шЕс (темные столбцы), у - ось: мг/см3.
На фиг. 13 показаны результаты анализа рОСТ плотности кости у мышей после ложной операции в течение 12 недель обработки. Обработки представляли собой контроль (РВБ; светлые столбцы) или Ас1Ш1а-шЕс (темные столбцы), у - ось; мг/см3.
На фиг. 14А и 14В показан анализ ΌΕΧΑ всего организма после 12 недель обработки (А) и анализ ех νίνο бедренной кости (В). Светлые области показывают области высокой плотности кости.
На фиг. 15 показан анализ рОСТ ех νίνο середины диафиза бедренной кости после 12 недель обработки. Обработки представляли собой контроль - носитель (РВБ, темные столбцы) и АсЖНа-тРс (светлые столбцы). Четыре столбца слева показывают общую плотность кости, тогда как четыре столбца справа показывают плотность трубчатой кости. Первая пара столбцов в каждом наборе из четырех столбцов представляет данные для мышей после овариэктомии, тогда как вторая пара столбцов представляет данные для мышей после ложной операции.
На фиг. 16 показан анализ рОСТ ех νίνο и диафизарное содержание кости середины диафиза бедренной кости после 12 недель обработки. Обработки представляли собой контроль - носитель (РВБ, темные столбцы) или АсЖНа-тРс (светлые столбцы). Четыре столбца слева показывают общее содержание кости, тогда как четыре столбца справа показывают содержание трубчатой кости. Первая пара столбцов в каждом наборе из четырех столбцов представляет данные для мышей после овариэктомии, тогда как вторая пара столбцов представляет данные для мышей после ложной операции.
На фиг. 17 показан анализ рОСТ ех νίνο толщины середины диафиза бедренной кости и толщины кортикального слоя бедренной кости. Обработки представляли собой контроль (РВБ, темные столбцы) и АсЖНа-тРс (светлые столбцы). Четыре столбца слева показывают эндостальную окружность, тогда как четыре столбца справа показывают периостальную окружность. Первая пара столбцов в каждом наборе из четырех столбцов представляет данные для мышей после овариэктомии, тогда как вторая пара столбцов представляет данные для мышей после ложной операции.
На фиг. 18 показаны результаты механического тестирования бедренной кости после 12 недель обработки. Обработки представляли собой контроль (РВБ, темные столбцы) и АсЖНа-тРс (светлые столбцы). Два столбца слева представляют данные для мышей после овариэктомии, тогда как остальные два столбца представляют данные для мышей после ложной операции.
На фиг. 19 показаны эффекты АсЖНа-тРс на объем губчатой кости.
На фиг. 20 показаны эффекты Ас®11а-тРс на губчатую архитектуру в дистальной части бедренной кости.
На фиг. 21 показаны эффекты АсЖНа-тРс на трубчатую кость.
На фиг. 22 показаны эффекты АсЖИа-тРс на механическую прочность кости.
На фиг. 23 показаны эффекты различных доз АсЖИа-тРс на характеристики кости при трех различных дозах.
На фиг. 24 показана гистоморфометрия кости, показывающая, что АсЖИа-тРс обладает двойной анаболической и антирезорбтивной активностью.
На фиг. 25 показаны дополнительные гистоморфометрические данные.
На фиг. 26 показаны изображения бедренной кости мыши от наивных и несущих опухоль мышей и эффекты обработки АсЖНа-тРс на морфологию костей на модели множественной миеломы. Для мышей, несущих опухоли - множественные миеломы (5Т2), показали заметное выкрашивание и деградацию кости по сравнению с нормальными мышами (наивными). Обработка Ас®11а-тРс прекращает этот эффект.
На фиг. 27 показаны результаты клинического испытания на людях, описанного в примере 5, где площадь под кривой (АИС) и введенная доза Ас®Иа-№с обладали линейной корреляцией, независимо от того, вводили ли Ас®11а-№с внутривенно (IV) или подкожно (8С).
На фиг. 28 показано сравнение уровней Ас®На-№с в сыворотке у пациентов после введения IV или 8С.
На фиг. 29 показаны уровни костной щелочной фосфатазы кости (ВАР) в ответ на различные уровни дозы Ас®На-№с. ВАР является маркером анаболического роста кости.
На фиг. 30 показаны суммарные эффекты АсЖНа-тРс (ВАР-011) и бисфосфонатного средства (золедроната) у мышей.
- 5 018221
Подробное описание изобретения
1. Обзор.
Суперсемейство трансформирующего фактора роста-бета (ΤΟΡ-β) содержит множество факторов роста, разделяющих общие элементы последовательности и структурные повторы. Известно, что эти белки оказывают биологические эффекты на большое множество типов клеток как позвоночных, так и беспозвоночных. Члены суперсемейства выполняют важные функции в процессе эмбрионального развития для образования структур и спецификации тканей и могут влиять на множество процессов дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кардиогенез, гемопоэз, нейрогенез и дифференцировку эпителиальных клеток. Семейство разделено на две основные ветви: ветви ΒΜΡ/ΟΌΡ и ΤΟΡв/активина/ВМР10, члены которых оказывают разнообразные, часто комплементарные эффекты. Посредством манипуляции активностью члена семейства ΤΟΡ-β, часто возможны значительные физиологические изменения в организме. Например, породы крупного рогатого скота Пьемонтская и Бельгийская голубая несут мутацию с потерей функции в гене ΟΌΡ-8 (называемом также миостатином), которая вызывает заметное увеличение мышечной массы. СгоЬе! е! а1., ΝηΙ Сспс1. 1997, 17(1):71-4. Более того, у человека неактивные аллели ΟΌΡ-8 связаны с увеличенной мышечной массой и, по имеющимся сообщениям, исключительной силой. 8сйие1ке е! а1., Ν. Епд1. ί. Меб. 2004, 350:2682-8.
Активины представляют собой димерные полипептидные факторы роста, относящиеся к суперсемейству ΤΟΡ-β. Существует три главные формы активина (А, В, и АВ), которые представляют собой гомо/гетеродимеры из двух близкородственных β-субъединиц (βΑβΑ, βΒβΒ, и βΑβΒ). Геном человека кодирует также активин С и активин Е, которые, в первую очередь, экспрессируются в печени. В суперсемействе ΤΟΡ-β активины представляют собой уникальные и многофункциональные факторы, которые могут стимулировать продукцию гормонов в клетках яичника и плаценты, поддерживать жизнеспособность нейрональных клеток, влиять на прогрессирование клеточного цикла, положительно или отрицательно, в зависимости от типа клеток, и индуцировать мезодермальную дифференцировку, по крайней мере, у эмбрионов земноводных (ЭеРао1о е! а1., 1991, Ргос. 8ос. Ер. Βίοί. Меб. 198:500-512; Эукон е! а1., 1997, Сигг Βώΐ. 7:81-84; ХУообгиГГ. 1998, ΒΟΟ^η Рйагтасо1. 55:953-963). Более того, было обнаружено, что фактор эритроидной дифференцировки (ΕΌΡ), выделенный из стимулированных моноцитарных лейкозных клеток человека, идентичен активину Α (Мига!а е! а1., 1988, ΡΝΑ8, 85:2434). Было сделано предположение, что активин Α действует как природный положительный регулятор эритропоэза в костном мозге. В некоторых тканях передачу сигнала от активина ингибирует родственный ему гетеродимер, ингибин. Например, во время высвобождения фолликулостимулирующего гормона (Ρ8Η) из гипофиза активин стимулирует секрецию и синтез Ρ8Η, тогда как ингибин предотвращает секрецию и синтез Ρ8Η. К другим белкам, которые могут регулировать биоактивность активина и/или связывать активин, относятся фоллистатин (Ρ8), родственный фоллистатину белок (Ρ8ΒΡ) и а2-макроглобулин.
Сигналы ΤΟΡ-β опосредованы гетеромерными комплексами рецепторов серин/треонинкиназы типа I и типа II, которые фосфорилируют и активируют нижележащие белки 8таб при стимуляции лигандом (Маккадие, 2000, №11. Вес. Мо1. Се11 Βωΐ. 1:169-178). Эти рецепторы типа I и типа II представляют собой трансмембранные белки, состоящие из связывающего лиганд внеклеточного домена с богатой цистеином областью, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с рассчитанной специфичностью к серину/треонину. Рецепторы типа I необходимы для передачи сигнала; и рецепторы типа II необходимы для связывания лигандов и экспрессии рецепторов типа I. Рецепторы активина типа I и II образуют стабильный комплекс после связывания лиганда, что приводит к фосфорилированию рецепторов типа I рецепторами типа II.
Два родственных рецептора типа II, ЛщВПа и ЛсШИЕ были идентифицированы как рецепторы типа II для активинов (МаШехск апб Уа1е, 1991, Се11. 65:973-982; Αώ^^ е! а1., 1992, Се11. 68:97-108). Помимо активинов, ЛсШИа и ΑΛΚΠΒ могут биохимически взаимодействовать с несколькими другими белками семейства ΤΟΡ-β, включая ВМР7, №бак ΟΌΡ-8 и ΟΌΡ-11 (Уатакййа е! а1., 1995, I. Се11 ΒΟΙ. 130:217-226; Бее апб МсРйеггоп, 2001, Ргос. №111. Αсаб. 8ск 98:9306- 9311; Уео апб ^ййтап, 2001, Мо1. Се11. 7:949-957; Ой е! а1., 2002, Оепек Эеу. 16:2749-54). ΑΕΚ-4 представляет собой первичный рецептор типа I активинов, в частности активина А, и ΑΕΚ-7 может также служить рецептором активинов, в частности активина Β.
Как показано в настоящем описании, растворимый полипептид ΑсίΚIIа (кΑсίЯIIа), для которого продемонстрирована значительная предпочтительность связывания с активином Α в отличие от других членов семейства ΤΟΡ-β, таких как ΟΌΡ-8 или ΟΌΡ-11, является эффективным для стимуляции роста кости и увеличения плотности кости т у1уо. Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом, предполагают, что эффект ^сЖНа вызван, в первую очередь, эффектом антагониста активина, принимая во внимание крайне сильное связывание активина (пикомолярная константа диссоциации), показанное для конкретной конструкции κΑ^ΗΠι, используемой в этих исследованиях. Независимо от механизма, из представленных в настоящем описании данных очевидно, что антагонисты ΑсίВIIа-активина действительно повышают плотность кости у нормальных мышей, на моделях остеопороза у мышей и модели множественной миеломы у мышей. Следует отметить, что кость является динамической тканью, расту
- 6 018221 щей или уменьшающейся, с увеличивающейся или уменьшающейся плотностью в зависимости от равновесия факторов, образовывающих кость и стимулирующих минерализацию (в первую очередь, остеобластов), и факторов, разрушающих и деминерализующих кость (в первую очередь, остеокластов). Рост и минерализацию кости можно усилить, увеличивая количество образующих факторов, уменьшая количество разрушающих факторов или и тем, и другим. Термины стимулировать рост кости и увеличивать минерализацию кости относятся к наблюдаемым физическим изменениям в кости, и эти термины являются нейтральными по отношению к механизму, благодаря которому происходят изменения в кости.
Считается, что модели остеопороза у мышей и модели роста/плотности кости, которые использовали в описанных в настоящем изобретении исследованиях, имеют высокую прогностическую способность в отношении эффективности у человека, и, таким образом, это описание относится к способам использования полипептидов Ас1КЛа и других антагонистов активина-Ас1КЛа для стимуляции роста кости и увеличения плотности кости у человека. Антагонисты активина-АеЖЛа включают, например, связывающие активин растворимые полипептиды Ас1КЛа, антитела, которые связывают активин (в частности, субъединицы А или В активина, обозначаемые также как βΑ или βΒ) и нарушают связывание Ас1КЛа, антитела, которые связывают Ас1КЛа и нарушают связывание активина, не относящиеся к антителу белки, выбранные по связыванию активина или АсЖЛа (см., например, в νθ 2002/088171, νθ 2006/055689 и \νϋ 2002/032925 примеры таких белков и способы для конструирования и отбора таких реагентов со связыванием, не относящимся к аффинности антитела), и случайные пептиды, выбранные по связыванию активина или Ас1КЛа, часто прикрепленные к домену Рс. Два различных белка (или другие молекулы) с активностью связывания активина или Ас1КЛа, особенно связывающие активин вещества, которые блокируют участки связывания типа I (например, растворимый рецептор активина типа I) и типа II (например, растворимый рецептор активина типа II) соответственно, можно соединять вместе для создания бифункциональной связывающей молекулы. Аптамеры нуклеиновой кислоты, малые молекулы и другие средства, которые ингибируют ось передачи сигнала активина-Ас1КЛа. Различные белки обладают активностью антагониста активина-АсЖЛа, включая ингибин (т.е. альфа-субъединицу ингибина), хотя ингибин не является универсальным антагонистом активина во всех тканях, фоллистатин (например, фоллистатин-288 и фоллистатин-315), Е8КР, активин С, альфа(2)-макроглобулин и мутантный активин А М108А (с заменой метионина на аланин в положении 108). Как правило, альтернативные формы активина, в частности формы с изменениями в связывающем рецептор типа I домене, могут связывать рецепторы типа II и не могут образовывать активный трехкомпонентный комплекс, таким образом действуя как антагонисты. Кроме того, нуклеиновые кислоты, такие как антисмысловые молекулы, миРНК или рибозимы, ингибирующие экспрессию активина А, В, С или Е или, в частности, Ас1КЛа, можно использовать в качестве антагонистов активина-АсЖЛа. Предпочтительно следует использовать антагонист активинаАсЖЛа, обладающий селективностью для ингибирования опосредованной активином передачи сигнала по сравнению с другими членами семейства ТСР-β, в частности, по отношению к СЭЕ-8 и СЭЕ-11. Растворимые белки Ас1КЛЬ действительно связывают активин, однако белок дикого типа не обладает значительной селективностью для связывания активина по сравнению с СЭЕ-8/1Е и предварительные эксперименты позволяют предполагать, что этот белок не обеспечивает желательные эффекты на кость, тогда как вызывает также существенный рост мышц. Однако идентифицировали измененные формы Ас1КЛЬ с различными связывающими свойствами (см., например, νϋ 2006/012627, стр. 55-59, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки), и с этими белками можно достигать желательных эффектов на кость. Природному или измененному Ас1КЛЬ можно придавать дополнительную специфичность в отношении активина благодаря присоединению второго селективного для активина связывающего вещества.
Термины, используемые в описании, как правило, имеют обычное в данной области значение, в контексте этого изобретения и в конкретном контексте, где используют каждый термин. Конкретные термины описаны ниже или в другом месте описания, чтобы обеспечить дополнительное руководство специалисту в данной области в описании композиций и способов по изобретению и того, как их получать и использовать. Объем или значение любого использования термина очевидны из конкретного контекста, в котором используют термин.
Около и приблизительно, как правило, означают приемлемую степень ошибки для количественного измерения с учетом характера или точности измерений. Как правило, примерные степени ошибки составляют 20%, предпочтительно 10% и более предпочтительно 5% данного значения или диапазона значений.
Альтернативно, и особенно в биологических системах, термины около и приблизительно могут обозначать значения, находящиеся в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5-кратной и более предпочтительно в пределах 2-кратной данной величины. Числовые количества, приведенные в настоящем описании, являются приблизительными, если не указанно иначе, это означает, что термин около или приблизительно можно подразумевать, когда он не указан прямо.
- 7 018221
Способы по изобретению могут включать в себя стадии сравнения последовательностей друг с другом, включая сравнение последовательности дикого типа с одним или несколькими мутантами (вариантами последовательности). Такие сравнения, как правило, включают сравнение последовательностей полимеров, например, с использованием программ и/или алгоритмов выравнивания последовательности, которые хорошо известны в данной области (например, ВЬА8Т, РЛ8ТЛ и ΜΕΟΑΤΙΟΝ, чтобы указать немногие). Специалисту в данной области ясно понятно, что при таких выравниваниях, где мутация содержит вставку или делецию остатка, в выравнивание последовательности будут вносить пропуск (как правило, представленный штрихом, или А) в последовательности полимера, не содержащей вставленного или делетированного остатка.
Гомологичный, во всех его грамматических формах и вариантах написания, относится к родству между двумя белками, обладающими общим эволюционным происхождением, включая белки из суперсемейств одних и тех же организмов, а также гомологичные белки из различных видов организмов. Такие белки (и кодирующие их нуклеиновые кислоты) обладают гомологией последовательности, как отражено сходством их последовательности, по отношению к процентной идентичности или по присутствию специфических остатков или повторов и консервативных положений.
Термин сходство последовательности, во всех его грамматических формах, относится к степени идентичности или соответствия между последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислот, которые могут разделять или не разделять общее эволюционное происхождение.
Однако, как принято, и в настоящем описании термин гомологичный, при модификации наречиями, такими как высоко, может относиться к сходству последовательности и может относиться или не относиться к общему эволюционному происхождению.
2. Полипептиды Ас1РПа.
В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам Ас®На. Как используется в настоящем описании, термин АсЖНа относится к белкам семейства рецепторов активина типа 11а (АсЖПа) любых видов и к вариантам, полученным из таких белков Ас1РПа посредством мутагенеза или другой модификации. Ссылку на АсЖНа в настоящем описании следует понимать как ссылку на любую из идентифицированных в настоящее время форм. Члены семейства ΑοίΡΙΙη. как правило, представляют собой трансмембранные белки, состоящие из связывающего лиганд внеклеточного домена с богатой цистеином областью, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной активностью серина/треонинкиназы.
Термин полипептид Ас®На включает в себя полипептиды, содержащие любой природный полипептид из членов семейства АсЖПа, а также из любых их вариантов (включая формы мутантов, фрагментов, слитых белков и пептидомиметиков), которые сохраняют применимую активность. Например, полипептиды АсЖНа включают полипептиды, полученные из последовательности любого известного АсЖЛа, обладающего последовательностью, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичной последовательности полипептида АсЖПа и предпочтительно идентичной по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 99% или более. Например, полипептид АсЖПа по изобретению может связывать белок АсЖНа и/или активин и ингибировать его функцию. Предпочтительно полипептид Ас®На стимулирует рост кости и минерализацию кости. Примеры полипептидов АсЖПа включают в себя полипептид-предшественник АсЖЛа человека (8ΕΟ ΙΌ N0: 1) и растворимые полипептиды АсЖНа человека (например, 8ΕΟ ΙΌ N0: 2, 3, 7 и 12).
Последовательность белка-предшественника Ас®На человека является следующей:
МСАААКЬАЕАУГЫЗСЗЗСА!ЦОНЗЕТСЕСЬГЕЫАТГНЕКГКТЦСТСУЕР С¥СОКОКВКНСЕАТИКИ1ЗС51Е1УК0ССИ1ЯЖΙΝΟХЦЙТПСУЕККОЗР еухесссеоммстекгзугремеутсртзырутркррууы ιьъузьу рь МЕ1АС1У1САГИУУВННКМАУРРУЬУРТС0РС;РРРРЗРЦЪСЬКРЬ0ЬЬЕ νΚΑΒΟΒΡ6θνΗΚΑΟΙΙ,ΝΕΥνΑνΚΙΓΡΙΟΟΚ<23ΚΟΝΕΥΕνΥ8ΒΡ6ΜΚΗΕΝ 1Ь0Г16АЕККеТ5У0У0ЬИЬ1ТАЕНЕК63Ь5РЕЪКАА1УУЗИЫЕЬСН1АЕ ΤΜΑΚΟΙΑΥΙΛΕΡΙРСЬК0СЯКРА13ΗΚΡΙΚ5ΚΝУЬЬКНЫЬТАСIΑϋΓΟΕ АЬКГЕАСКЗАеОТНСОУеТВКУМАРЕУЬЕСА1ЫГОВОАГЬВ1РМУАМСЗЬ УЬИЕЬА8ВСТААОСРУОЕУМЬРЕЕЕЕ1СОНР5ЪЕОМ(2ЕУУУНКККВРУЬ КОУНОКНАСМАМЬСЕТ1ЕЕСЫОНОАЕАКЪЗА6СУ6ЕВ1ТОМОВЬТЫ11Т ΤΕ0ΐντννΤΜνΤΝνϋΓΡΡΚΕ35Σ (5Ε13ΙΟΝΟ: 1)
Сигнальный пептид подчеркнут одной линией; внеклеточный домен отмечен жирным шрифтом и потенциальные участки Ν-связанного гликозилирования подчеркнуты дважды.
Последовательность растворимого (внеклеточного) полипептида АсЖПа человека после процессинга является следующей:
1ЬСКЗЕТ12ЕСЬЕГМАКИЕК0ВТН2ТСУЕРСУС0К0КВВНСГАТНКЫ15С 31Е1УК0ССИЬО01ЫС¥ОКТОСУЕККОЗРЕУУГСССЕОКМСЫЕКЕ8УГР ЕМЕУТОРТЗМРУТРКРР (5Е<2 Π) ΝΟ: 2)
С-концевой хвост внеклеточного домена подчеркнут. Последовательность с делетированным хвостом (последовательность Δ15) является следующей:
- 8 018221
ΙΣεΚΞΕΤΟΕϋΙ,ΓΓΝΆΝΗΕΚΟΒΤΝΟΤΟνΕΡςΥδΟΚΟΚΒΕΗΟΓΑΤΗΚΝΙδΟ ЗТЕ^КФССИЬООТКСУОВТОСУЕККОЗРЕУУЕСССЕСКМСМЕКГЗУГР ЕМ (5Ер ГО N0:3)
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-предшественник АсШПа человека, является следующей (нуклеотиды 164-1705 из записи ΝΜ_001616 в СепЬапк):
АТБССАеСТСС'ГССАААСТТСССБТТТССССТСТТТСТТАТСТССТСТТСТТСАбСТеС ТАТАСТТССТАСАТСАСАААСТСАСйАйТСТСТТТТСТТТААТССТААТТСбСАААААС АСАСААССААТСАААСТССТЗТТСААСССТ6ТТАТС6ТБАСААА6АТАААС66СС6САТ ТсттттССТАССТССААСААТАТТТСТССТТССАТТСАААТАСТСАААСААбаТТСТТб
ССТССАТСАТАТСААСТССТАТСАСАБСАСТСАТТСТСТАСААААААААСАСАССССТЗ
АА5ТАТАТТТТТ6ТТеСТСТЗАССССААТАТСТСТААТ6ААААСТТТТСТТАТТТТССА ЗАСАТБЗААЗТСАСАСАССССАСТТСАААТССАСТТАСАССТААСССАСССТАТТАСАА САТССТЗСТСТАТТССТТбСТЗССАСТТАТСТТААТТССССССАТТСТСАТТТСТССАТ ТТТСбСТСТАСАСбСАТСАСААСАТСЗССТАСССТССТСТАСТТЗТТССААСТСААСАС ССАССАССАСССССАССТТСТССАТТАСТАСССТТСАААССАСТССАСТТАТТАСААЗТ САААССААССССААБАТТТбСТТСТСТСТСЗАААССССАСТТеСТТААССААТАТЗТбС СТЗТСААААТАТ'ГТССААТАСАССАСАААСАСТСАТСССААААтеААТАСЗААСТСТАС АСТТТСССТССААТСАЛЗСАТСАеААСАТАТТАСАСТТСАТТЗЗТбСАСАААААССАСС САССАЗТСТТСАТСТСЗАТСТТТбССТСАТСАСАССАТТТСАТСААААЗССТТСАСТАТ САбАСТТТСТТААббСТААТСТССТСТСТТССААТСААСТСТЗТСАТАТТССАСАААСС АТСССТАСАСЗАТТСССАТАТТТАСАТ6АССАТАТАССТССССТААААСАТ6СССАСАА АССТСССАТАТСТСАСАЗССАСАТСААААЗТАААААТСТЗСТСТТСАААААСААССТЗА САЗСТТССАТТбСТЗАСТТТССбТТССССТТААААТТТЙАСССТЗССААбТСТССАССС ЗАТАСССАТССАСАССТТССТАСССССА6СТАСАТ6ССТССАЗА0СТАТТАСАССЗТСС ТАТАААСТТССАААЗССАТЗСАТТТТТ6АССАТАСАТАТСТАТЗССАТССЗАТТАСТСС ТАТБбеААСТБбСТТСТСеСТСТАСТССТЗСАБАТССАССТСТАеАТЙААТАСАТСТТе ССАТТТСАССАЗСАААТТСЗССАССАТССАТСТСТТЗДАСАСАТЗСАЗСААОТТЗТТбТ ССАТААААААААСАССССТСТТТТААСАОАТТАТТСССАСАААСАТССТСЙААТСССАА ТбСТСТСТСАААССАТТЗААСААТСТТЗЗСАТСАССАСЗСАЗААСССАССТТАТСАССТ ССАТСТ6ТАСЗТСАААСААТТАСССАСАТ6САСАСАСТААСАААТАТТАТТАССАСАСА ббАСАТТЗТААСАСТССТСАСААТССТСАСАААТСТТСАСТТТССТСССДААСААТСТА отстатса (5Е<2 ГО ΝΟ: 4)
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей растворимый (внеклеточный) полипептид АсГКИа человека, является следующей:
АТАСТТССТАСАТСАСАААСТСАССАСТСТСТТТТСТТТААТССТААТТЗССАААААСА
САСААССААТСАААСТСЗТСТТ5ААСССТСТТАТССТЗДСАААСАТАААССЗС6ССАТТ СТТТТССТАССТССААСААТАТТТСТССТТССАТТСАААТАСТСАААСААСЗТТЗТТ6С СТСаАТСАТАТСААСТССТАТЗАСАЗСАСТСАТТСТСТДЗААААААААСАСАССССТСА АСТАТАТТТТТСТТССТЗТСАЗСССААТАТСТСТААТСААААСТТТТСТТАТТТТССАС АСАТССААСТСАСАСАССССАСТТСАААТССАСТТАСАССТААСССАССС (ЗЕО ГО
ΝΟ: 5)
В конкретном варианте осуществления изобретение относится к растворимым полипептидам АсЖПа. Как описано в настоящем изобретении, термин растворимые полипептиды Лс1К11а. как правило, относится к полипептидам, содержащим внеклеточный домен белка АсШПа. Термин растворимый полипептид АсГКПа, как используется в настоящем описании, включает любой природный внеклеточный домен белка Лс1КИа, а также любые его варианты (включая формы мутантов, фрагментов и пептидомиметиков).
Связывающий активин полипептид АсШПа представляет собой полипептид, который сохраняет способность связывать активин, в частности активин АА, АВ или ВВ. Предпочтительно связывающий активин полипептид АсШПа будет связывать активин АА с константой диссоциации 1 нМ или менее. Аминокислотные последовательности белка-предшественника АсШПа человека представлены ниже. Внеклеточный домен белка АсШПа связывает активин и, как правило, является растворимым, и, таким образом, его можно обозначать как растворимый связывающий активин полипептид АсГКПа. Примеры растворимых связывающих активин полипептидов АсГКПа включают растворимый полипептид, проиллюстрированный на 8Εβ ΙΌ N0: 2, 3, 7, 12 и 13. Пептид, проиллюстрированный на 8Εβ ΙΌ N0: 7, обозначен АсГКПа-КЕс и дополнительно описан в примерах. Другие примеры растворимых связывающих
- 9 018221 активин полипептидов ЛеЖИа, кроме внеклеточного домена белка АсЖПа, содержат сигнальную последовательность, например лидерную последовательность меллитина пчелы медоносной (8ЕО ΙΌ N0: 8), лидер тканевого активатора плазминогена (ТРА) (8Е0 ΙΌ N0: 9) или лидер природного Ас1Р11а (8Е0 ΙΌ N0: 10). В полипептиде АсЖПа-йЕс, проиллюстрированном в 8Е0 ΙΌ N0: 13, использован лидер ТРА.
Функционально активные фрагменты полипептидов Ас1Р11а могут быть получены скринингом полипептидов после рекомбинантной продукции с соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АсЖПа. Кроме того, фрагменты можно химически синтезировать с использованием известных в данной области способов, таких как общепринятый твердофазный химический способ синтеза полипептидов по Меррифилду с ί-Мос или ί-Вос. Фрагменты могут быть получены (рекомбинантно или химическим синтезом) и тестированы для идентификации тех пептидильных фрагментов, которые могут функционировать как антагонисты (ингибиторы) белка Ас1Р11а или передачи сигнала, опосредованной активином.
Функционально активные варианты полипептидов Ас®Па могут быть получены скринингом библиотек модифицированных полипептидов после рекомбинантной продукции с соответствующих подвергнутых мутагенезу нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид Ас1Р11а. Варианты могут быть получены и тестированы для идентификации тех, которые могут функционировать как антагонисты (ингибиторы) белка Ас1Р11а или передачи сигнала, опосредованной активином. В конкретных вариантах осуществления функциональный вариант полипептидов АсЖПа содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 75% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из 5>Е0 ΙΌ N0: 2 или 3. В конкретных случаях функциональный вариант обладает аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 3.
Функциональные варианты могут быть получены модификацией структуры полипептида Ас®Па для таких целей, как увеличение терапевтической эффективности или стабильности (например, срока хранения ех νίνο и устойчивости к протеолитической деградации ίη νίνο). Такие модифицированные полипептиды АсЖПа при отборе по сохранению связывания активина считают функциональными эквивалентами природных полипептидов АсЖПа. Модифицированные полипептиды Ас1РИа могут также быть получены, например, посредством замены, делеции или добавления аминокислоты. Например, можно предположить, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или подобной замены аминокислоты на структурно родственную аминокислоту (например, консервативные мутации) не оказывают основного эффекта на биологическую активность полученной молекулы. Консервативные замены представляют собой такие замены, которые имеют место внутри семейства аминокислот, являющихся родственными по их боковым цепям. Приводит ли изменение в аминокислотной последовательности полипептида АсЖПа к функциональному гомологу, можно легко определить оценкой способности варианта полипептида АсЖПа вызывать ответ клеток сходным образом с полипептидом Ас1РИа дикого типа.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к конкретным мутациям полипептидов АсЖПа, изменяющим гликозилирование полипептида. Такие мутации могут быть выбраны так, чтобы вводить или исключать один или несколько участков гликозилирования, таких как участки 0-связанного или ^связанного гликозилирования. Участки распознавания аспарагин-связанного гликозилирования, как правило, содержат трипептидную последовательность, аспарагин-Х-треонин (или аспарагины-Х-серин) (где X представляет собой любую аминокислоту), которую специфически распознают соответствующие клеточные ферменты гликозилирования. Изменение можно осуществлять также добавлением или заменой одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательности полипептида АсЖПа дикого типа (в случае участков 0-связанного гликозилирования). Множество замен или делеций аминокислот в одном или обоих из первого или третьего положений аминокислот участка распознавания для гликозилирования (и/или делеция аминокислоты во втором положении) приводит к отсутствию гликозилирования в модифицированной трипептидной последовательности. Другими способами увеличения числа углеводных групп на полипептиде АсЖПа являются химическое или ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду АсЖПа. В зависимости от используемого способа присоединения, сахар(а) можно присоединять к (а) аргинину и гистидину; (Ь) свободным карбоксильным группам; (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина; (б) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина; (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана; или (ί) амидной группе глутамина. Такие способы описаны в \У0 87/05330, опубликованном 11 сентября 1987 г., и в статье Арйп апб ХУгМоп (1981), СНС СпЕ Веу. Вюсйет., р. 259-306, содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Удаление одного или нескольких углеводных групп, присутствующих на полипептиде Ас®Па, можно осуществлять химически и/или ферментативно. Химическое дегликозилирование может включать, например, воздействие на полипептид АсЖПа соединением трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентным соединением. Эта обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением связывающего сахара (№ацетилглюкозамина или №ацетилгалактозамина), в то же
- 10 018221 время оставляя аминокислотную последовательность интактной. Химическое дегликозилирование дополнительно описано в статье Накшиббш с1 а1. (1987), Агск. Вюскет. Вюркуз. 259:52 и Ебде с1 а1. (1981), Апа1. Вюскет. 118:131. Ферментативное отщепление групп углевода на полипептидах АсШПа можно осуществлять использованием множества эндо- и экзогликозидаз, как описано в статье Т1ю1акига е1 а1. (1987), МеШ Еп7уто1. 138:350.
Последовательность полипептида Ас®Иа можно регулировать, по необходимости, в зависимости от типа используемой экспрессирующей системы, поскольку клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых и растений - все могут вводить различающиеся типы гликозилирования, на которые может влиять аминокислотная последовательность пептида. Как правило, белки Ас®Ла для использования у человека, экспрессируют в линии клеток млекопитающего, которая обеспечивает подходящее гликозилирование, такой как линии клеток НЕК293 или СНО, хотя предполагают, что другие экспрессирующие линии клеток млекопитающих, линии клеток дрожжей с модифицированными ферментами гликозилирования и клетки насекомых также можно использовать.
Кроме того, описание относится к способу получения мутантов, в частности наборов комбинаторных мутантов полипептида Ас®Ла, а также усеченных мутантов; пулы комбинаторных мутантов являются особенно эффективными для идентификации функциональных вариантов последовательности. Целью скрининга таких комбинаторных библиотек может быть получение, например, вариантов полипептида Ас®Ла, которые могут действовать либо как агонисты, либо как антагонист или, альтернативно, которые обладают всеми вместе новыми активностями. Множество анализов скрининга представлены ниже, и такие анализы можно использовать для оценки вариантов. Например, можно проводить скрининг вариантов полипептида Ас®Ла по способности связывать лиганд Ас®Ла для предотвращения связывания лиганда АсШЛа с полипептидом Ас®Ла или чтобы помешать передаче сигнала, вызванной лигандом АсШПа.
Активность полипептида АсЖЛа или его вариантов также можно тестировать в анализе на основе клеток или в анализе ίη νίνο. Например, можно оценить эффект варианта полипептида Ас®Ла на экспрессию генов, вовлеченных в образование кости или разрушение кости. Можно, по необходимости, проводить в присутствии одного или нескольких белков - лигандов рекомбинантного АсШЛа (например, активина), и клетки можно трансфицировать для получения полипептида Ас®Ла и/или его вариантов и, необязательно, лиганда Ас®Ла. Подобным образом, полипептид АсЖЛа можно вводить мыши или другому животному и можно оценивать одно или несколько свойств кости, таких как плотность или объем. Можно оценивать также скорость заживления для переломов кости. Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (ВЕХА) представляет собой хорошо разработанный, неинвазивный, количественный способ оценки плотности кости у животного. У человека системы центральной ВЕХА можно использовать для оценки плотности костей в позвоночнике и тазе. Они являются наилучшим прогностическим параметром общей плотности костей. Системы периферической ВЕХА можно использовать для оценки плотности костей в периферических костях, включая, например, кости кисти, запястья, голеностопа и ступни. Традиционные системы рентгеновского изображения, включая сканирования САТ, можно использовать для оценки роста костей и заживления переломов. Можно оценивать также механическую прочность кости.
Могут быть получены варианты комбинаторного происхождения, обладающие селективной или в целом увеличенной активностью по сравнению с природным полипептидом Ас®Ла. Подобным образом, мутагенез может приводить к вариантам, обладающим временем полужизни внутри клетки, существенно отличающимся от соответствующего полипептида Ас®Ла дикого типа. Например, измененному белку можно придавать либо большую стабильность, либо меньшую стабильность к протеолитической деградации или другим клеточным процессам, приводящим к разрушению или инактивации другим образом природного полипептида АсЖЛа. Такие варианты и кодирующие их гены можно использовать для изменения уровней полипептида Ас®Ла модуляцией времени полужизни полипептидов АсЖЛа. Например, короткое время полужизни может приводить к более временным биологическим эффектам и может позволять более жесткий контроль уровней рекомбинантного полипептида Ас®Ла у пациента. В слитом с Ес белке мутации можно вводить или в линкер (при его наличии), и/или в Ес часть для изменения времени полужизни белка.
Комбинаторная библиотека может быть получена посредством вырожденной библиотеки генов, кодирующих библиотеку полипептидов, каждый из которых включает по меньшей мере часть потенциальных последовательностей полипептида АсЖЛа. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов можно ферментативно лигировать в последовательности генов, так что вырожденный набор нуклеотидных последовательностей потенциальных полипептидов Ас®Ла можно экспрессировать в виде отдельных полипептидов или, альтернативно, в виде набора более крупных слитых белков (например, для фагового дисплея).
Существует много способов, которыми библиотека потенциальных гомологов может быть получена из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Можно проводить химический синтез вырожденной последовательности гена на автоматическом синтезаторе ДНК и затем синтетические гены лигировать в подходящий вектор для экспрессии. Синтез вырожденных олигонуклеотидов хорошо известен в
- 11 018221 данной области (см., например, №1гапд. Б.А. (1983), Те!гайебгоп. 39:3; Йакига е! а1. (1981), КесотЫпап! ΌΝΆ, Ргос. 3гб С1еуе1апб Бутрок. Масгото1еси1е8, еб. Л.С. ХУаНом, Лтйегбат: Е1кеу1ег, р. 273-289; Иакига е! а1. (1984), Лили. Кеу. ВюсНет. 53:323; Иакига е! а1. (1984), Бс1епсе. 198:1056; 1ке е! а1. (1983), М.1с1е1с Ас1б Кез. 11:477). Такие способы применяли для направленной эволюции других белков (см., например, Бсо!! е! а1. (1990), Баепсе. 249:386-390; КоЬейк е! а1. (1992), ΡΝΑ8 ИБА. 89:2429-2433; Оеуйп е! а1. (1990), Бшепсе. 249:404-406; Сшг1а е! а1. (1990), ΡΝΑ8 ИБА. 87:6378-6382; а также патенты США № 5223409, 5198346 и 5096815).
Альтернативно, другие формы мутагенеза можно использовать для получения комбинаторной библиотеки. Например, варианты полипептида Ас!К11а могут быть получены и выделены из библиотеки посредством скрининга с использованием, например, мутагенеза со сканированием аланином и т.п. (Ки! е! а1. (1994), Вюсйет1к!гу. 33:1565-1572; \\апд е! а1. (1994), 1. Вю1. Сйет. 269:3095-3099; Ва1ш! е! а1. (1993), Сепе. 137:109-118; СгобЬегд е! а1. (1993), Еиг. 1. ВюсНет. 218:597-601; №1дак1шпа е! а1. (1993), 1. Вю1. С’Нет. 268:2888-2892; Бо\гтап е! а1. (1991), ВюсНетМгу. 30:10832-10838 и Сипптдйат е! а1. (1989), Бс1епсе. 244:1081-1085), мутагенеза со сканированием линкером (Сик!ш е! а1. (1993), Упо1оду. 193:653660; Вго\уп е! а1. (1992), Мо1. Се11 Вю1. 12:2644-2652; МсКшдй! е! а1. (1982), Бс1епсе. 232:316); насыщающего мутагенеза (Меуегк е! а1. (1986), Бс1епсе. 232:613); ПЦР-мутагенеза (Беипд е! а1. (1989), Ме!1об Се11 Мо1. Вю1. 1:11-19); случайного мутагенеза, включая химический мутагенез и т.п. (МШег е! а1. (1992), А Б1юг1 Соигке ш Вас!епа1 СепеИск, СБНЬ Ргекк, Со1б Брппд НагЬог, ΝΥ и Сгеепег е! а1. (1994), Б!га!ед1ек ш Мо1. Вю1. 7:32-34). Мутагенез со сканированием линкером, в частности, при комбинаторных параметрах представляет собой привлекательный способ для идентификации усеченных (биоактивных) форм полипептидов Ас!К11а.
Широкий диапазон способов известен в данной области для скрининга продуктов генов из комбинаторных библиотек, полученных посредством точечных мутаций и усечений, и в связи с этим для скрининга библиотек кДНК по продуктам генов, обладающим конкретными свойствами. Такие способы можно будет в основном адаптировать для быстрого скрининга библиотек генов, полученных комбинаторным мутагенезом полипептидов Ас1КНа. Наиболее широко используемые способы скрининга больших библиотек генов, как правило, включают клонирование библиотеки генов в реплицирующихся экспрессирующих векторах, трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых детекция желательной активности облегчает относительно простое выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого детектировали. Предпочтительные анализы включают анализы связывания активина и анализы опосредованной активином передачи сигнала клеток.
В конкретных вариантах осуществления полипептиды Ас!К11а по изобретению могут дополнительно содержать посттрансляционные модификации в дополнение к любым, которые естественным образом присутствуют в полипептидах Ас!К11а. Такие модификации включают в качестве неограничивающих примеров ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, присоединение липидов и ацилирование. В результате модифицированные полипептиды Ас1КНа могут содержать не относящиеся к аминокислотам элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, поли- или моносахариды и фосфаты. Эффекты таких не относящихся к аминокислотам элементов на функциональность полипептида Ас!К11а можно тестировать, как описано в настоящем изобретении для других вариантов полипептида АсЖНа. Когда полипептид Ас!К11а продуцируют в клетках посредством расщепления растущей формы полипептида АсЖНа, посттрансляционный процессинг также может быть важным для правильного сворачивания и/или функционирования белка. Различные клетки (такие как СНО, НеЬа, МОСК, 293, ^138, МН-3Т3 или НЕК293) обладают специфическими клеточными аппаратами и характерными механизмами для таких посттрансляционных видов активности, и их можно выбирать, чтобы убедиться в правильной модификации и процессинге полипептидов Ас1КНа.
В конкретных аспектах функциональные варианты или модифицированные формы полипептидов Ас!КНа включают слитые белки, обладающие по меньшей мере частью полипептидов Ас1КНа и одним или несколькими слитыми доменами. Хорошо известные примеры таких слитых доменов включают в качестве неограничивающих примеров полигистидин, С1и-С1и, глутатион-Б-трансферазу (СБТ), тиоредоксин, белок А, белок С, константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Ес), связывающий мальтозу белок (МБР) или человеческий сывороточный альбумин. Слитый домен может быть выбран так, чтобы придавать желательное свойство. Например, некоторые слитые домены являются особенно эффективными для выделения слитых белков аффинной хроматографией. Для цели аффинной очистки используют соответствующие матрицы для аффинной хроматографии, такие как конъюгированные с глутатионом, амилазой и никелем или кобальтом смолы. Многие из таких матриц доступны в форме набора, такого как система очистки СБТ РНагтааа и система 01Аехргекк™ (Р1адеп), используемые с партнерами для слияния (Н1Б6). В качестве другого примера слитый домен может быть выбран так, чтобы облегчать детекцию полипептидов Ас1КНа. Примеры таких доменов для детекции включают различные флуоресцентные белки (например, СЕР), а также эпитопы-метки, которые обычно представляют собой короткие пептидные последовательности, для которых доступно специфическое антитело. Хорошо известные эпитопы-метки, для которых легко доступны специфические моноклональные антитела, вклю
- 12 018221 чают в себя метки РЬАС, гемагглютинин (НА) вируса гриппа и с-тус. В некоторых случаях слитые домены имеют участок расщепления протеазой, такой как фактор Ка или тромбин, который позволяет соответствующей протеазе частично расщеплять слитые белки и, таким образом, высвобождать из них рекомбинантные белки. Затем высвобожденные белки можно отделять от слитого домена последующим хроматографическим разделением. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления полипептид Ас®На сливают с доменом, который стабилизирует полипептид Ас£КНа ίη νίνο (стабилизирующий домен). Под стабилизацией обозначают все, что увеличивает время полужизни в сыворотке, независимо от того, происходит ли это из-за уменьшения разрушения, уменьшения клиренса почками или другого фармакокинетического эффекта. Известно, что слияние с частью Рс иммуноглобулина сообщает желательные фармакокинетические свойства широкому диапазону белков. Подобным образом, слияние с сывороточным альбумином может придавать желательные свойства. Другие типы слитых доменов, которые могут быть выбраны, включают мультимеризующие (например, димеризующие, тетрамеризующие) домены и функциональные домены (придающие биологическую функцию, такую как стимуляция роста костей или роста мышц, как желательно).
В качестве конкретного примера настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему растворимый внеклеточный домен АсЖПа, слитый с доменом Рс (например, 8ЕЦ ГО N0: 6).
ТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗУГЪГРРКРКОТЪМТЗКТРЕУТСУУУр(Α)νδΗΕϋΡΕνΚΓΝΗΥνΟΟ νΕνΗΝΑΚΤΚΡΒΕΕ0ΥΝ5ΤΥΗνν5νΐ,Τνΐ,Η0Ι)ΗΙ.Ν6ΚΕΥΚΟΚ (А) У5ЫКАЬРУР1ЕКТ13КАК
СОРКЕРОУУТЬРРЗПЕЕМТКНОУЗЬТСЬУКСГУРЭОМУЕИЕЗМбОРЕЫМУКТТРРУЬРЗРС
РГЕЬУЗКЪТУОКЗВИООСНУГЗСЗУМНЕАЬНМ(А)НУТОКЗЬЗЬЗРБК*
Необязательно, домен Рс обладает одной или несколькими мутациями в таких остатках, как Акр-265, лизин 322 и Акп-434. В конкретных случаях мутантный домен Рс, обладающий одной или несколькими из этих мутаций (например, мутацией Акр-265), обладает уменьшенной способностью связывания с рецептором Рсу относительно домена Рс дикого типа. В других случаях мутантный домен Рс, обладающий одной или несколькими из этих мутаций (например, мутацией Акп-434), обладает увеличенной способностью связывания родственного МНС класса I Рс-рецептора (^ΡΝ) по сравнению с доменом Рс дикого типа.
Понятно, что различные элементы слитых белков могут быть расположены любым образом, согласующимся с желательной функциональностью. Например, полипептид АсЖНа можно располагать на С-конце от гетерологичного домена или, альтернативно, гетерологичный домен можно помещать на С-конце от полипептида АсЖНа. Домен полипептида Ас®Па и гетерологичный домен не обязательно являются соседними в слитом белке, и дополнительные домены или аминокислотные последовательности можно включать с С- или Ν-конца от любого домена или между доменами.
В конкретных вариантах осуществления полипептиды Ас®Па по настоящему изобретению содержат одну или несколько модификаций, способных стабилизировать полипептиды Ас1Р11а. Например, такие модификации увеличивают время полужизни полипептидов АсЖНа ίη νίίτο, увеличивают время полужизни в кровотоке полипептидов Ас1Р11а или уменьшают протеолитическую деградацию полипептидов Ас®На. Такие стабилизирующие модификации включают в качестве неограничивающих примеров слитые белки (включая, например, слитые белки, содержащие полипептид Ас®Па и стабилизирующий домен), модификации участка гликозилирования (включая, например, добавление участка гликозилирования к полипептиду Ас®Па) и модификации углеводной группы (включая, например, удаление углеводных групп из полипептида АсЖНа). В случае слитых белков полипептид Ас®Па сливают со стабилизирующим доменом, таким как молекула 1дС (например, домен Рс). Как используется в настоящем описании, под термином стабилизирующий домен понимают не только слитый домен (например, Рс), как в случае слитых белков, но также понимают небелковые модификации, такие как углеводородная группа, или небелковый полимер, такой как полиэтиленгликоль.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение делает доступными выделенные и/или очищенные формы полипептидов Ас®Па, которые являются отделенными от других белков, или иным образом, по существу, свободными от них. Полипептиды Ас1Р11а. как правило, получают экспрессией с рекомбинантных нуклеиновых кислот.
3. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды Ас®На.
В конкретных аспектах изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим любой полипептид Ас®Па (например, растворимых полипептидов Ас®Па), включая фрагменты, функциональные варианты и слитые белки, описанные в настоящем изобретении. Например, 8ЕЦ ГО N0: 4 кодирует природный полипептид-предшественник Ас®Па человека, в то время как 8ЕЦ ГО N0: 5 кодирует внеклеточный домен Ас®На после процессинга. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут являться одноцепочечными или двухцепочечными. Такие нуклеиновые кислоты могут представлять собой молекулы ДНК или РНК. Эти нуклеиновые кислоты можно использовать, например, в способах получения полипептидов Ас®Па или в качестве непосредственных лекарственных средств (например, в способе генотерапии).
- 13 018221
В конкретных аспектах под рассматриваемыми нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептиды АеГКПа, дополнительно понимают как включающие нуклеиновые кислоты, являющиеся вариантами 8ЕО ΙΌ N0: 4 или 5. Варианты нуклеотидных последовательностей включают последовательности, отличающиеся одной или несколькими заменами, добавлениями или делециями нуклеотидов, такие как аллельные варианты.
В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к выделенным или рекомбинантным последовательностям нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичны 8ЕС ΙΌ N0: 4 или 5. Специалисту в данной области понятно, что последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарные 8ЕС ΙΌ N0: 4 или 5 и вариантам 8ЕС ΙΌ N0: 4 или 5, также входят в объем этого изобретения. В следующих вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть выделенными, рекомбинантными и/или слитыми с гетерологичной нуклеотидной последовательностью или могут присутствовать в библиотеке ДНК.
В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по изобретению включают в себя также нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью 8ЕС ΙΌ N0: 4 или 5, последовательностью, комплементарной 8ЕС ΙΌ N0: 4 или 5, или их фрагментами. Как обсуждают выше, специалисту в данной области ясно понятно, что подходящие условия жесткости, способствующие гибридизации ДНК, можно изменять. Например, можно проводить гибридизацию в 6,0х хлориде натрия/цитрате натрия (88С) приблизительно при 45°С, с последующей отмывкой 2х88С при 50°С. Например, концентрация соли на стадии отмывки может быть выбрана от низкой жесткости приблизительно 2х88С при 50°С до высокой жесткости приблизительно 0,2х88С при 50°С. Кроме того, температуру на стадии отмывки можно увеличивать от условий низкой жесткости при комнатной температуре, приблизительно 22°С, до условий высокой жесткости приблизительно при 65°С. Как температуру, так и соль можно изменять либо температуру или концентрацию соли можно поддерживать постоянными, в то время как другую переменную изменяют. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к нуклеиновым кислотам, гибридизующимся в условиях низкой жесткости при 6х88С при комнатной температуре с последующей промывкой при 2х88С при комнатной температуре.
Выделенные нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот с последовательностями 8ЕС ΙΌ N0: 4 или 5 в результате вырожденности генетического кода, также входят в объем изобретения. Например, ряд аминокислот определяется более чем одним триплетом. Кодоны, которые задают ту же аминокислоту, или синонимы (например, САИ и САС являются синонимами для гистидина), могут приводить к молчащим мутациям, которые не влияют на аминокислотную последовательность белка. Однако предполагают, что полиморфизмы последовательности ДНК, которые действительно приводят к изменениям аминокислотных последовательностей рассматриваемых белков, будут существовать в клетках млекопитающих. Специалисту в данной области будет известно, что эти варианты одного или нескольких нуклеотидов (вплоть до приблизительно 3-5% нуклеотидов) нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный белок, могут существовать у индивидуумов данного вида из-за естественной аллельной изменчивости. Все и любые такие варианты нуклеотидов и полученные полиморфизмы аминокислот входят в объем этого изобретения.
В конкретных вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты по изобретению могут являться функционально связанными с одной или несколькими регуляторными нуклеотидными последовательностями в экспрессирующей конструкции. Регуляторные нуклеотидные последовательности, как правило, являются подходящими для клетки-хозяина, используемой для экспрессии. Многочисленные типы подходящих экспрессирующих векторов и подходящих регуляторных последовательностей известны в данной области для множества клеток-хозяев. Как правило, указанные одна или несколько регуляторных нуклеотидных последовательностей могут включать в качестве неограничивающих примеров промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, участки связывания рибосомы, последовательности старта и терминации транскрипции, последовательности старта и терминации трансляции и последовательности энхансера или активатора. Конститутивные или индуцибельные промоторы, как известно в данной области, относятся к изобретению. Промоторы могут представлять собой либо природные промоторы, либо гибридные промоторы, сочетающие элементы более одного промотора. Экспрессирующая конструкция может присутствовать в клетке на эписоме, такой как плазмида, или экспрессирующую конструкцию можно вставлять в хромосому. В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующий вектор содержит ген селективного маркера, чтобы обеспечить отбор трансформированных клеток-хозяев. Гены селективных маркеров хорошо известны в данной области и могут меняться с используемой клеткой-хозяином.
В конкретных аспектах изобретения рассматриваемая нуклеиновая кислота представлена в экспрессирующем векторе, содержащем нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид АеГКПа и функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью. Регуляторные последовательности известны в данной области, и их выбирают, чтобы управлять экспрессией полипептида АеГКПа. Соответственно, термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхан
- 14 018221 серы и другие элементы контроля экспрессии. Примерные регуляторные последовательности описаны в Соеббек Сспс Ехртеззюи Тсе1то1оду: Мебюбз ίη Епхуто1оду. Асабетк Ргезз, 8аи Όίοβο. СА (1990). Например, любую из широкого множества последовательностей для контроля экспрессии, которые контролируют экспрессию последовательности ДНК, когда функционально связаны с ней, можно использовать в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид АскКНа. Такие используемые последовательности для контроля экспрессии включают, например, ранний и поздний промоторы 8У40, промотор 1е(, немедленный ранний промотор аденовируса или цитомегаловируса, промоторы К8У, систему 1ас, систему ίτρ, систему ТАС или ТКС, промотор Т7, экспрессией с которого управляет Т7 РНК-полимераза, главные области промотора и оператора фага лямбда, контрольные области для белка оболочки Гб, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например Р1о5, промоторы факторов α-скрещивания дрожжей, промотор многогранника бакуловирусной системы и другие последовательности, известные для контроля экспрессии генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные их комбинации. Следует понимать, что конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, и/или типа белка, желательного для экспрессии. Более того, следует учитывать также число копий вектора, способность контролировать это число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых вектором, таких как маркерные антибиотики.
Рекомбинантная нуклеиновая кислота по изобретению может быть получена лигированием клонированного гена или его части в вектор, подходящий для экспрессии либо в прокариотических клетках, либо в эукариотических клетках (дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих), либо и в тех, и в других. Экспрессирующие носители для получения рекомбинантного полипептида АскКНа включают плазмиды и другие векторы. Например, подходящие векторы включают плазмиды типов: полученные из рВК322 плазмиды, полученные из рЕМВЬ плазмиды, полученные из рЕХ плазмиды, полученные из рВТас плазмиды и полученные из рИС плазмиды для экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е.со11.
Некоторые экспрессирующие векторы для млекопитающих содержат как прокариотические последовательности для облегчения размножения вектора в бактериях, так и одну или несколько эукариотических транскрипционных единиц, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Векторы, полученные из рсПХА1/атр, рсПХА1/иео, рКс/СМУ, р8У2др1, р8У2иео, р8У2-бШт, рТк2, рКБУиео, рМ8С, р8УТ7, рко-иео и рНуд, являются примерами экспрессирующих векторов для млекопитающих, подходящих для трансфекции эукариотических клеток. Некоторые из этих векторов модифицируют последовательностями из бактериальных плазмид, таких как рВК322, для облегчения репликации и отбора по устойчивости к лекарственным средствам как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. Альтернативно, производные вирусов, таких как вирус бычьей папилломы (ВРУ-1) или вирус ЭпштейнаБарр (рНЕВо, полученный из рКЕР и р205), можно использовать для временной экспрессии белков в эукариотических клетках. Примеры других вирусных (включая ретровирусные) систем экспрессии можно обнаружить ниже в описании систем доставки для генотерапии. Различные способы, применяемые в получении плазмид и в трансформации организмов-хозяев, хорошо известны в данной области. Другие подходящие экспрессирующие системы как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, а также общие рекомбинантные способы, см. в Мо1еси1аг Оошпд А БаЬога1огу Маииа1, 3гб Еб., еб. Ьу 8атЬтоок, Етйзсй аиб Машабз (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮту Ртезз, 2001). В некоторых случаях желательно экспрессировать рекомбинантные полипептиды посредством использования бакуловирусной экспрессирующей системы. Примеры таких бакуловирусных экспрессирующих систем включают в себя полученные из рУЪ векторы (такие как рУЪ1392, рУЪ1393 и рУЪ941), полученные из рАсЬУ векторы (такие как рАси\У1) и полученные из рВ1иеВас векторы (такие как содержащий (3-да1 рВ1иеВас III).
В предпочтительном варианте осуществления конструируют вектор для получения рассматриваемых полипептидов АскКНа в клетках СНО, такой как вектор Рсшу-8спр1 (81га1адеие, Ьа 1о11а, Са11Г), векторы рсЭХА4 (Шубю^еи, Саг1зЬаб, Са11Г.) и векторы рС1-иео (Рготеда, Маб1зои, \У1зе). Как будет очевидно, рассматриваемые генные конструкции можно использовать для индукции экспрессии рассматриваемых полипептидов Ас1К11а в клетках, размножаемых в культуре, например, для получения белков, включая слитые белки или варианты белков, для очистки.
Изобретение также относится к клетке-хозяину, трансфицированной рекомбинантным геном, включая кодирующую последовательность (например, 8ЕО Ш N0: 4 или 5) для одного или нескольких из рассматриваемых полипептидов АскКНа. Клетка-хозяин может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку. Например, полипептид АсЖНа по изобретению можно экспрессировать в бактериальных клетках, таких как Е.сой, клетках насекомых (например, с использованием бакуловирусной экспрессирующей системы), дрожжах или клетках млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области.
Соответственно, настоящее изобретение, кроме того, относится к способам получения рассматриваемых полипептидов АскКНа. Например, клетку-хозяина, трансфицированную экспрессирующим вектором, кодирующим полипептид АскКНа, можно культивировать в соответствующих условиях, делаю
- 15 018221 щих возможной экспрессию полипептида АскКНа. Полипептид АскКЛа можно секретировать и выделять из смеси клеток и среды, содержащей полипептид АскКЛа. Альтернативно, полипептид АсЖНа может оставаться в цитоплазматической или в мембранной фракции, а клетки собирают, лизируют и выделяют белок. Культура клеток включает клетки-хозяева, среду и другие побочные продукты. Подходящие среды для культивирования клеток хорошо известны в данной области. Рассматриваемые полипептиды АсЖЛа можно выделять из среды для культивирования клеток, клеток-хозяев или и того, и другого с использованием способов, известных в данной области для очистки белков, включая ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафильтрацию, электрофорез, иммуноаффинную очистку с помощью антител, специфических для конкретных эпитопов полипептидов Ас1Я11а. и аффинную очистку с помощью средства, связывающего домен, слитый с полипептидом АсЖПа (например, колонку с белком А можно использовать для очистки слитого белка АскКНа-Рс). В предпочтительном варианте осуществления полипептид АскКЛа представляет собой слитый белок, содержащий домен, облегчающий очистку. В предпочтительном варианте осуществления очистки достигают сериями стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующего, в любом порядке: хроматография с белком А, хроматография на 0-сефарозе, хроматография на фенилсефарозе, эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистку можно завершать фильтрацией вирусов и заменой буфера. Как показано в настоящем описании, белок Ас®Ла-№с очищали до чистоты >98%, как определяли эксклюзионной хроматографией, и >95%, как определяли посредством 8Ό8 РАСЕ. Этот уровень чистоты являлся достаточным для достижения желательных эффектов на кость у мышей и приемлемого профиля безопасности у мышей, крыс и не относящихся к человеку приматов.
В другом варианте осуществления слитый ген, кодирующий лидерную последовательность для очистки, такую как поли-(Н1к)/последовательность участка расщепления энтерокиназой на Ν-конце желательной части рекомбинантного полипептида АсЖПа, может позволять очистку экспрессированного слитого белка аффинной хроматографией с использованием смолы с металлом Νί2+. Лидерную последовательность для очистки можно затем удалять обработкой энтерокиназой для получения очищенного полипептида АскВИа (см., например, ΗοΟιιιΙί е! а1. (1987), 1. СНготаЮдгарку. 411:177 и 1апкпес111 е! а1., РХ'АБ И8А. 88:8972).
Способы получения слитых генов хорошо известны. По существу, соединение различных фрагментов ДНК, кодирующих различные полипептидные последовательности, проводят согласно общепринятым способам, применяя тупые или выступающие концы для лигирования, расщепление ферментом рестрикции для получения подходящих концов, достраивание липких концов по необходимости, обработку щелочной фосфатазой для избегания нежелательного соединения и ферментативное лигирование. В другом варианте осуществления слитый ген можно синтезировать общепринятыми способами, включая использование автоматических синтезаторов ДНК. Альтернативно, можно проводить ПЦР-амплификацию фрагментов генов с использованием якорных праймеров, образующих комплементарные выступающие концы между двумя последовательными фрагментами гена, которые затем можно гибридизовать для получения последовательности химерного гена (см., например, Сиггеи! Рю^ток ίη ΜοΚαιΙηΓ Вю^^у, ебк. АикиЬе1 е! а1., 6ο1ιπ \Убеу & δοηκ, 1992).
4. Альтернативные антагонисты активина и АсЖНа.
Данные, представленные в настоящем описании, показывают, что антагонисты передачи сигнала активином-АскКЛа можно использовать для стимуляции роста кости и минерализации кости. Хотя растворимые полипептиды АскКНа, в частности АскКНа-Рс, являются предпочтительными антагонистами, и хотя такие антагонисты могут влиять на кость посредством механизма, отличного от антагонизма активина (например, ингибирование активина может быть показателем тенденции средства ингибировать активность спектра молекул, включая, возможно, другие члены суперсемейства ТСР-β, и такое совместное ингибирование может приводить к желательному эффекту на кость), предполагают, что другие типы антагонистов активина-АскКНа будут используемыми, включая антитела против активина (например, А, В, С или Е), антитела против АскКНа, нуклеиновые кислоты: антисмысловые, РНКи или рибозимы, ингибирующие продукцию АскКЛа, и другие ингибиторы активина или АскКНа, в частности те, которые нарушают связывание активина-АскКНа.
Антитело, которое специфически реагирует с полипептидом АскКЛа (например, растворимым полипептидом АскКЛа) и которое либо конкурирует с лигандом за связывание с полипептидом АскКЛа, либо другим способом ингибирует опосредованную АскКЛа передачу сигнала, можно использовать в качестве антагониста активности полипептида АскКНа. Подобным образом, антитело, которое специфически реагирует с полипептидом активина А и которое нарушает связывание АскКНа, можно использовать в качестве антагониста.
С использованием иммуногенов, полученных из полипептида АскКНа или полипептида активина, антисыворотки или моноклональные антитела против белка/против пептида можно получить общепринятыми способами (см., например, Αηί^Ьοб^ек: А ^аЬο^аΐο^у Мапиа1 еб. Ьу ΗηιΊο\ν апб Ьапе (С.о1б Брппд ΗπΛογ Ргекк: 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомяк или кролик, можно иммунизировать иммуногенной формой полипептида АскКЛа, антигенным фрагментом, способным вызывать ответ антитела, или слитым белком. Способы придания иммуногенности белку или пептиду включают в себя конъюга
- 16 018221 цию с носителями или другие способы, хорошо известные в данной области. Иммуногенную часть полипептида АсЕКЛа или активина можно вводить в присутствии адъюванта. Прогрессирование иммунизации можно мониторировать детекцией титров антитела в плазме или сыворотке. Общепринятый ЕЬ18А или другие иммуноанализы можно использовать с иммуногеном в качестве антигена для оценки уровней антител.
После иммунизации животного антигенным препаратом полипептида АсЕКЛа может быть получена антисыворотка и, если желательно, поликлональные антитела можно выделить из сыворотки. Для получения моноклональных антител продуцирующие антитело клетки (лимфоциты) можно собирать из иммунизированного животного и сливать общепринятыми способами слияния с иммортализованными клетками, такими как клетки миеломы, чтобы получить клетки гибридомы. Такие способы хорошо известны в данной области и включают в себя, например, способ гибридомы (исходно разработанный КоЫет апб Μίΐκίοίη (1975), №11игс. 256:495-497), способ гибридомы В-клеток человека (КохЬаг еЕ а1. (1983), 1ттипо1оду Тобау, 4:72) и способ ЕВУ-гибридомы для получения моноклональных антител человека (Со1е еЕ а1. (1985), Мопос1опа1 АпЕ1Ьоб1е8 апб Сапсег ТНегару, А1ап К. Ь188, 1пс. р. 77-96). Можно проводить иммунохимический скрининг клеток гибридомы для получения антител, специфически реагирующих с полипептидом АсЕКЛа, и выделять моноклональные антитела из культуры, содержащей такие клетки гибридомы.
Под термином антитело, как используется в настоящем описании, понимают его фрагменты, которые также специфически реагируют с рассматриваемым полипептидом. Антитела можно фрагментировать с использованием общепринятых способов и проводить скрининг фрагментов по эффективности таким же образом, как описано выше для полноразмерных антител. Например, Р(аЬ)2-фрагменты могут быть получены обработкой антитела пепсином. Полученный Р(аЬ)2-фрагмент можно обработать для восстановления дисульфидных мостиков для получения РаЬ-фрагментов. Кроме того, антитело по настоящему изобретению включает биспецифические, одноцепочечные, химерные, гуманизированные и полностью человеческие молекулы, обладающие аффинностью для полипептида АсЕКЛа или активина, придаваемой по меньшей мере одной областью СЭК антитела. Кроме того, антитело может содержать присоединенную к нему метку и обладать способностью к детекции (например, метка может представлять собой радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента).
В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой рекомбинантное антитело, причем термин охватывает любое антитело, частично полученное способами молекулярной биологии, включая СЭК-привитые или химерные антитела, человеческие или другие антитела, собранные из отобранных из библиотеки доменов антитела, одноцепочечные антитела и однодоменные антитела (например, белки Ун человека или белки Унн верблюжьих). В конкретных вариантах осуществления антитело по изобретению представляет собой моноклональное антитело, и в конкретных вариантах осуществления изобретение делает доступными способы получения новых антител. Например, способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с полипептидом АсЕКЛа или полипептидом активина, может включать в себя введение мыши количества иммуногенной композиции, содержащей антигенный полипептид, эффективного для стимуляции поддающегося детекции иммунного ответа, получение продуцирующих антитело клеток (например, клеток из селезенки) из мыши и слияние продуцирующих антитело клеток с клетками миеломы для получения продуцирующих антитело гибридом, а также тестирование продуцирующих антитело гибридом для идентификации гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, специфически связывающееся с антигеном. После получения гибридому можно размножать в культуре клеток, необязательно, в условиях культивирования, где происходящие из гибридомы клетки продуцируют моноклональное антитело, специфически связывающееся с антигеном. Моноклональное антитело можно очищать из культуры клеток.
Определение специфически реагирующий с, как используют по отношению к антителу, обозначает, как это в основном понимают в данной области, что антитело является достаточно селективным между интересующим антигеном (например, полипептидом АсЕКЛа) и другими антигенами, не представляющими интерес, чтобы антитело являлось используемым, как минимум, для детекции присутствия интересующего антигена в конкретном типе биологического образца. В конкретных способах, использующих антитело, таких как терапевтические применения, может быть желательна более высокая степень специфичности связывания. Моноклональные антитела, как правило, проявляют более сильную тенденцию (по сравнению с поликлональными антителами) к эффективной дискриминации между желательными антигенами и перекрестно реагирующими полипептидами. Одной из характеристик, влияющих на специфичность взаимодействия антитело:антиген, является аффинность антитела для антигена. Хотя желаемой специфичности можно достигать в диапазоне различных аффинностей, предпочтительные в основном антитела будут обладать аффинностью (константой диссоциации) приблизительно 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или менее. Принимая во внимание чрезвычайно тесное связывание между активином и АсЕКЛа, предполагают, что нейтрализующее антитело против активина или АсЕКЛа будет, как правило, обладать константой диссоциации 10-10 или менее.
- 17 018221
Кроме того, способы, используемые для скрининга антител, чтобы идентифицировать желательное антитело, могут влиять на свойства полученного антитела. Например, если антитело предназначено для использования для связывания антигена в растворе, может быть желательно протестировать связывание в растворе. Множество различных способов доступно для тестирования взаимодействия между антителами и антигенами для идентификации особенно желательных антител. Такие способы включают ЕЫ8А, анализы связывания поверхностным плазмонным резонансом (например, анализ связывания В1асоге™, В1асоге АВ, Ирр8а1а, 8^ебеи), сэндвич-анализы (например, система парамагнитных бусин из ΙΟΕΝ 1п1егпайопа1, 1пс., баИйегаЬитд, Магу1аиб), вестерн-блоттинг, анализы иммунопреципитации и иммуногистохимию.
Примеры категорий соединений нуклеиновой кислоты, которые являются антагонистами активина или Ас®Ла, включают антисмысловые нуклеиновые кислоты, конструкции для РНКи и каталитические конструкции нуклеиновой кислоты. Соединение нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Двухцепочечное соединение может также включать области выступания или некомплементарности, где одна или другая из нитей является одноцепочечной. Одноцепочечное соединение может включать области самокомплементарности, что означает, что соединение формирует структуру так называемой шпильки или стебля-петли, с областью двухспиральной структуры. Соединение нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидную последовательность, комплементарную области, состоящей из не более 1000, не более 500, не более 250, не более 100 или не более 50, 35, 30, 25, 22, 20 или 18 нуклеотидов из последовательности нуклеиновой кислоты полноразмерного Ас®Ла или последовательности нуклеиновой кислоты активина β..\ или активина βΒ. Область комплементарности будет предпочтительно составлять по меньшей мере 8 нуклеотидов, и, необязательно, по меньшей мере 10 или по меньшей мере 15 нуклеотидов, и, необязательно, между 15 и 25 нуклеотидами. Область комплементарности может попадать внутрь интрона, кодирующей последовательности или некодирующей последовательности намеченного транскрипта, например части кодирующей последовательности. Как правило, соединение нуклеиновой кислоты будет обладать длиной от приблизительно 8 до приблизительно 500 нуклеотидов или пар оснований, и, необязательно, длина будет составлять от приблизительно 14 до приблизительно 50 нуклеотидов. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК (в частности, для применения в качестве антисмысловой), РНК или гибрид РНК:ДНК. Любая одна цепь может включать смесь ДНК и РНК, а также модифицированные формы, которые нельзя легко классифицировать как ДНК или РНК. Подобным образом, двухцепочечное соединение может представлять собой ДНК:ДНК, ДНК:РНК или РНК:РНК, и любая одна цепь также может включать смесь ДНК и РНК, а также модифицированные формы, которые нельзя легко классифицировать как ДНК или РНК. Соединение нуклеиновой кислоты может включать любую из множества модификаций, включая одну из модификаций части остова (сахаро-фосфатной части природной нуклеиновой кислоты, включая межнуклеотидные связи) или основания (пуриновой или пиримидиновой части природной нуклеиновой кислоты). Соединение антисмысловой нуклеиновой кислоты будет предпочтительно обладать длиной от приблизительно 15 до приблизительно 30 нуклеотидов и часто будет содержать одну или несколько модификаций для улучшения таких характеристик, как стабильность в сыворотке, в клетке или на месте, куда соединение, вероятно, будут доставлять, таком как желудок в случае перорально доставляемых соединений и легкое для вдыхаемых соединений. В случае конструкции для РНКи цепь, комплементарная намеченному транскрипту, будет, как правило, представлять собой РНК или ее модификации. Другая цепь может представлять собой РНК, ДНК или любой другой вариант. Дуплексная часть двухцепочечной или одноцепочечной шпилечной конструкции РНКи предпочтительно будет иметь длину 18-40 нуклеотидов и, необязательно, приблизительно 21-23 нуклеотидов, пока она служит субстратом для Ьюег. Каталитические или ферментативные нуклеиновые кислоты могут представлять собой рибозимы или ДНК-ферменты и могут также содержать модифицированные формы. Соединения нуклеиновых кислот могут ингибировать экспрессию мишени приблизительно на 50, 75, 90% или более при контакте с клетками в физиологических условиях и при концентрации, когда антисмысловой или смысловой контроль оказывает малый эффект или не оказывает эффекта. Предпочтительными концентрациями для тестирования эффекта соединений нуклеиновой кислоты являются 1, 5 и 10 мкМ. Соединения нуклеиновой кислоты можно также тестировать по эффектам, например на рост и минерализацию кости.
5. Анализы скрининга.
В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептидов Ас®Ла (например, растворимых полипептидов Ас®На) и полипептидов активина для идентификации соединений (средств), которые являются агонистами или антагонистами пути передачи сигнала активинаАс®Ла. Соединения, идентифицированные посредством этого скрининга, можно тестировать для оценки их способности модулировать рост или минерализацию кости ш νίΐϊΌ. Необязательно, эти соединения можно дополнительно тестировать на моделях животных для оценки их способности модулировать рост тканей ш у1уо.
- 18 018221
Существуют многочисленные способы скрининга лекарственных средств для модуляции роста тканей посредством нацеливания на полипептиды активина и Ас®Ла. В конкретных вариантах осуществления высокопроизводительный скрининг соединений можно проводить для идентификации средств, которые мешают опосредованным активином или Ас®Ла эффектам на кость. В конкретных вариантах осуществления анализ проводят для скрининга и идентификации соединений, которые специфически ингибируют или уменьшают связывание полипептида Ас®На с активином. Альтернативно, анализ можно использовать для идентификации соединений, усиливающих связывание полипептида Ас®Ла с активином. В следующем варианте осуществления соединения можно идентифицировать по их способности взаимодействовать с полипептидом активина или Ас®На.
Множество форматов анализа будут подходящими и, в свете настоящего описания, те, которые не описаны в настоящем изобретении явно, тем не менее будут понятны специалисту в данной области. Как описано в настоящем изобретении, тестируемые соединения (средства) по изобретению могут быть получены любым комбинаторным химическим способом. Альтернативно, рассматриваемые соединения могут представлять собой встречающиеся в природе биомолекулы, синтезированные ίη νίνο или ίη νίΐτο. Соединения (средства), подлежащие тестированию по их способности действовать как модуляторы роста тканей, могут быть получены, например, посредством бактерий, дрожжей, растений или других организмов (например, природные продукты), получать химически (например, малые молекулы, включая пептидомиметики) или получать рекомбинантным образом. Тестируемые соединения, предусматриваемые по настоящему изобретению, включают в себя непептидильные органические молекулы, пептиды, полипептиды, пептидомиметики, сахара, гормоны и молекулы нуклеиновой кислоты. В конкретном варианте осуществления тестируемое средство представляет собой малую органическую молекулу, обладающую молекулярной массой менее приблизительно 2000 Да.
Тестируемые соединения по изобретению могут быть получены как одиночные, отдельные объекты или могут быть получены в библиотеках большей сложности, таких как полученные комбинаторной химией. Эти библиотеки могут содержать, например, спирты, алкилгалиды, амины, амиды, сложные эфиры, альдегиды, простые эфиры и другие классы органических соединений. Представление тестируемых соединений тестовой системе может происходить либо в выделенной форме, либо в виде смесей соединений, особенно на начальных стадиях скрининга. Необязательно, соединения могут являться, необязательно, дериватизированными с помощью других соединений и обладать дериватизирующими группами, облегчающими выделение соединений. Дериватизирующие группы включают в себя в качестве неограничивающих примеров биотин, флуоресцеин, дигоксигенин, зеленый флуоресцентный белок, изотопы, полигистидин, магнитные бусины, глутатион-8-трансферазу (С8Т), фотоактивируемые перекрестно сшивающие средства или любые их сочетания.
Во многих программах скрининга лекарственных средств, в которых тестируют библиотеки соединений и природных экстрактов, являются желательными высокопроизводительные анализы, чтобы максимизировать число соединений, исследованных в данный период времени. Анализы, которые проводят в бесклеточных системах, таких, какие можно получить с помощью очищенных или полуочищенных белков, часто являются предпочтительными в качестве первичных скринингов, поскольку их можно получать, чтобы позволять быстрое развитие и относительно простую детекцию изменения в молекулярной мишени, опосредованного тестируемым соединением. Более того, эффекты клеточной токсичности или биодоступности тестируемого соединения, как правило, можно игнорировать в системе ίη νίΐτο, вместо этого анализ в первую очередь сфокусирован на эффекте лекарственного средства на молекулярную мишень, что может проявляться в изменении аффинности связывания между полипептидом Ас®На и активином.
Просто для иллюстрации, в примерном анализе скрининга по настоящему изобретению интересующее соединение приводят в контакт с выделенным и очищенным полипептидом Ас®На, который обычно способен связывать активин. Затем к смеси соединения и полипептида Ас®Ла добавляют композицию, содержащую лиганд Ас®Ла. Детекция и количественное определение комплексов АсЖЛа/активин обеспечивает средства для определения эффективности соединения для ингибирования (или стимуляции) формирования комплекса между полипептидом АсЖНа и активином. Эффективность соединения можно оценивать получением кривых зависимости эффекта от дозы по данным, полученным с использованием различных концентраций тестируемого соединения. Более того, можно проводить также контрольный анализ для предоставления фона для сравнения. Например, в контрольном анализе выделенный и очищенный активин добавляют к композиции, содержащей полипептид Ас®Ла, и формирование комплекса Ас®Ла/активин количественно оценивают в отсутствие тестируемого соединения. Как правило, порядок, в котором можно смешивать реагенты, можно изменять, и их можно смешивать одновременно. Более того, вместо очищенных белков клеточные экстракты и лизаты можно использовать для предоставления подходящей бесклеточной системы анализа.
Формирование комплекса между полипептидом Ас®Ла и активином можно детектировать множеством способов. Например, модуляцию формирования комплексов можно количественно оценивать с использованием, например, меченных поддающейся детекции меткой белков, таких как радиоактивно
ОС 1/1 о меченые (например, Р, 8, С или Н), флуоресцентно меченые (например, ЕПС) или ферментативно
- 19 018221 меченые полипептид Ас4КЛа или активин, посредством иммуноанализа или посредством хроматографической детекции.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к использованию флуоресцентных поляризационных анализов и анализов резонансного переноса энергии флуоресценции (РВЕТ) для измерения, либо напрямую, либо опосредованно, степени взаимодействия между полипептидом Ас®Ла и связывающим его белком. Кроме того, другие способы детекции, такие как основанные на оптических волноводах (публикация РСТ \У0 96/26432 и патент США № 5677196), поверхностном плазмонном резонансе (8РВ), сенсорах поверхностного заряда и сенсорах поверхностных сил, являются совместимыми со многими вариантами осуществления изобретения.
Более того, настоящее изобретение относится к использованию анализа взаимодействия с ловушкой, известного также как двугибридный анализ, для идентификации средств, которые нарушают или стимулируют взаимодействие между полипептидом АсЖПа и связывающим его белком. См., например, патент США № 5283317; Ζβτνοδ е! а1. (1993), Се11, 72:223-232; Майша е! а1. (1993), 1. Бю1. СНет. 268:12046-12054; ВаЛе1 е! а1. (1993), Вю!есЬшдиек, 14:920-924 и 1\\аЬис1п е! а1. (1993), 0псодепе, 8:16931696). В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию обратных двугибридных систем для идентификации соединений (например, малых молекул или пептидов), которые приводят к диссоциации взаимодействий между полипептидом Ас1ВЛа и связывающим его белком. См., например, У1йа1 апй Ьедтат (1999), №.1с1е1с Ас1йк Век, 27:919-29; У1йа1 апй Ьедгаш (1999), Ттепйк Вю!есЬпо1. 17:374-81 и патенты США № 5525490; 5955280 и 5965368.
В конкретных вариантах осуществления рассматриваемые соединения идентифицируют по их способности взаимодействовать с полипептидом АсЖПа или активина по изобретению. Взаимодействие между соединением и полипептидом Ас4КПа или активина может быть ковалентным или нековалентным. Например, такое взаимодействие можно идентифицировать на уровне белка с использованием биохимических способов ш νίίτο, включая фотоперекрестное сшивание, связывание радиоактивно меченого лиганда и аффинную хроматографию (1акоЬу \У.В. е! а1., 1974, Ме!йойк ш Епхуто1оду. 46:1). В конкретных случаях можно проводить скрининг соединений в анализе на основе механизма, таком как анализ для детекции соединений, которые связываются с полипептидом активина или Ас4КПа. Это может включать в себя событие связывания в твердой фазе или в жидкой фазе. Альтернативно, ген, кодирующий полипептид активина или Ас!В11а, можно трансфицировать с репортерной системой (например, β-галактозидазой, люциферазой или зеленым флуоресцентным белком) в клетку и проводить скрининг против библиотеки, предпочтительно посредством высокопроизводительного скрининга, или с отдельными членами библиотеки. Можно использовать анализы связывания на основе другого механизма, например анализы связывания, детектирующие изменения в свободной энергии. Анализы связывания можно проводить с мишенью, фиксированной на лунке, бусине или чипе, или захваченной иммобилизованным антителом, или разделенной капиллярным электрофорезом. Связанные соединения можно детектировать, обычно с использованием колориметрии или флуоресценции или поверхностного плазмонного резонанса.
В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к способам и средствам для модуляции (стимуляции или ингибирования) формирования кости и увеличения костной массы. Таким образом, любое идентифицированное соединение можно тестировать в целых клетках или тканях, ш νίΙΐΌ или ш νί\Ό, для подтверждения их способности модулировать рост или минерализацию кости. Различные способы, известные в данной области, можно использовать для этой цели.
Например, эффект полипептидов АсЖПа, или активина, или тестируемых соединений на рост кости или хряща можно определять измерением индукции Мкх2 или дифференцировки клетокостеопредшественников в остеобласты в анализах на основе клеток (см., например, Па1шкк1 е! а1., №11. Сепе!. 2001, 27(1):84-8; Ншо е! а1., Ргоп! ВюксГ 2004, 9:1520-9). Другой пример анализов на основе клеток включает в себя анализ остеогенной активности рассматриваемых полипептидов Ас4КПа или активина и тестируемых соединений в мезенхимальных клетках-предшественниках и остеобластах. Для иллюстрации, можно сконструировать рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие полипептид активина или Ас4КЛа, для инфекции плюрипотентных мезенхимальных клеток-предшественников С3Н10Т1/2, клеток-преостеобластов С2С12 и клеток-остеобластов ТЕ-85. Затем остеогенную активность определяют измерением индукции щелочной фосфатазы, остеокальцина и минерализации матрикса (см., например, СНепд е! а1., 1 Ьопе .Тот! 8итд Ат. 2003, 85-А(8):1544-52).
Настоящее изобретение относится также к анализам ш νί\Ό для измерения роста кости или хряща. Например, в №ткипд-Ма!!Ьа1 е! а1., Вопе, 28:80-86 (2001) описана модель остеопороза на крысах, на которой изучают репарацию кости во время раннего периода после перелома. В КиЬо е! а1., 81егснй ВюсНетМгу & Мо1еси1аг Вю1о§у, 68:197-202 (1999) описана также модель остеопороза на крысах, на которой изучают репарацию кости во время позднего периода после перелома. В Апйетккоп е! а1., ί. Епйостто1. 170:529-537 описана модель остеопороза на мышах, в которой мышей подвергают овариэктомии, что вызывает у мышей потерю значительного минерального содержания кости и минеральной плотности кости, где губчатая кость теряет приблизительно 50% минеральной плотности кости. Плотность кости можно увеличивать у мышей после овариэктомии введением таких факторов, как паратирео
- 20 018221 идный гормон. В конкретных аспектах настоящего изобретения используют анализы заживления переломов, известные в данной области. Эти анализы включают в себя способы разлома, гистологический анализ и биомеханические анализы, описанные, например, в патенте США № 6521750, содержание которого приведено полностью для описания экспериментальных способов с индукцией переломов и процесса репарации, а также для измерения их степени.
6. Примерные терапевтические применения.
В конкретных вариантах осуществления антагонисты активина-ΑсΐΚIIа (например, полипептиды ΑΛΚΠι) по настоящему изобретению можно использовать для лечения или предотвращения заболевания или состояния, связанного с разрушением кости, например, из-за перелома, утраты или деминерализации. Как показано в настоящем описании, антагонисты активина-ΑсΐΚIIа, в частности конструкции ΑΛΗΠι-Εο, являются эффективными для лечения или предотвращения связанной с раком потери костной массы. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения или предотвращения повреждения кости индивидуума посредством введения индивидууму терапевтически эффективного количества антагониста активина-ΑсЖIIа, в частности полипептида ΑΛΚΠι. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам стимуляции роста или минерализации кости у индивидуума посредством введения индивидууму терапевтически эффективного количества антагониста активина-Αс!ШIа, в частности, полипептида ΑοΙΚΡη. Эти способы предпочтительно имеют целью терапевтические и профилактические обработки животных, более предпочтительно человека. В конкретных вариантах осуществления описание относится к использованию антагонистов активина-ΑсΐΚIIа (в частности, растворимых полипептидов ЛсШПа и нейтрализующих антител, нацеленных на активин или ΑοϊΗΠι) для лечения нарушений, связанных с низкой плотностью кости или уменьшенной прочностью кости.
Как используется в настоящем описании, терапевтическое средство, которое предотвращает нарушение или состояние, относится к соединению, которое, в статистической выборке, уменьшает частоту возникновения нарушения или состояния в обработанной выборке по сравнению с необработанной контрольной выборкой, или задерживает начало, или уменьшает тяжесть одного или нескольких симптомов нарушения или состояния по сравнению с необработанной контрольной выборкой. Термин обработка, как используется в настоящем описании, включает в себя профилактику указанного состояния или облегчение или прекращение состояния после его развития. В любом случае предотвращение или лечение можно различать по диагнозу, представленному врачом, и предполагаемому результату введения лекарственного средства.
Описание относится к способам индукции формирования кости и/или хряща, предотвращения потери костной массы, увеличения минерализации кости или предотвращения деминерализации кости. Например, рассматриваемые антагонисты активина-ΑсЖIIа имеют применение для лечения остеопороза и заживления переломов кости и дефектов хряща у человека и других животных. Полипептиды ΑοϊΗΠι или активина могут использоваться у пациентов с диагнозом субклиническая низкая плотность кости в качестве защитной меры против развития остеопороза.
В одном конкретном варианте осуществления способы и композиции по настоящему изобретению могут найти применение в медицине для заживления переломов кости и дефектов хряща у человека и других животных. Рассматриваемые способы и композиции могут также иметь профилактическое применение для уменьшения закрытых, а также открытых переломов, а также для улучшенной фиксации искусственных суставов. Формирование кости бе поуо, индуцированное остеогенным средством, приводит к репарации врожденных, индуцированных травмой или онкологической резекцией черепно-лицевых дефектов, а также используется в косметической пластической хирургии. В конкретных случаях рассматриваемые антагонисты активина-ΑсЖIIа могут обеспечивать окружение для привлечения формирующих кость клеток, стимулировать рост формирующих кость клеток или индуцировать дифференцировку предшественников формирующих кость клеток. Антагонисты активина-ΑсΐΚIIа по изобретению могут также использоваться для лечения остеопороза.
Способы и композиции по изобретению можно применять для состояний, характеризующихся или вызванных потерей костной массы, таких как остеопороз (включая вторичный остеопороз), гиперпаратиреоз, болезнь Кушинга, болезнь Педжета, тиреотоксикоз, хроническое диарейное состояние или малабсорбция, почечный канальцевый ацидоз или нервная анорексия.
Остеопороз может быть вызван различными факторами или связан с различными факторами. Женский пол, особенно после менопаузы, низкая масса тела и ведение сидячего образа жизни - все представляют собой факторы риска для остеопороза (потери минеральной плотности кости, приводящие к риску перелома). Лица, обладающие одной из следующих характеристик, могут являться кандидатами на лечение антагонистом ΑοϊΚΠι: женщина после менопаузы, не принимающая эстроген или другое гормонзаместительное лекарственное средство; лицо с собственным или переломом шейки бедра в наследственном анамнезе или курением в анамнезе; женщина после менопаузы, являющаяся высокой (выше 5 футов 7 дюймов (170 см)) или худой (менее 125 фунтов (57 кг)); мужчина с клиническими состояниями, связанными с потерей костной массы; лицо, использующее лекарственные средства, известные как вызывающие потерю костной массы, включая кортикостероиды, такие как Преднизон™, различные противо
- 21 018221 судорожные лекарственные средства, такие как Дилантин™ и конкретные барбитураты, или высокую дозу замещающих гормоны щитовидной железы лекарственных средств; лицо, страдающее диабетом 1 типа, заболеванием печени, заболеванием почек или имеющее семейный анамнез остеопороза; лицо с высокой перестройкой кости (например, с избыточным коллагеном в образцах мочи); лицо с таким состоянием щитовидной железы, как гипертиреоз; лицо, пережившее перелом после только умеренной травмы; лицо с переломом позвонка или другими признаками остеопороза по данным рентгеновского анализа.
Как указано выше, остеопороз может также возникать как состояние, связанное с другим нарушением, или в результате использования конкретных лекарственных средств. Остеопороз, возникающий изза лекарственных средств или другого медицинского состояния, известен как вторичный остеопороз. При состоянии, известном как болезнь Кушинга, избыточное количество кортизона, продуцируемое в организме, приводит к остеопорозу и переломам. Наиболее распространенными лекарственными средствами, связанными с вторичным остеопорозом, являются кортикостероиды, класс лекарственных средств, которые действуют подобно кортизону, гормону, естественно продуцируемому надпочечниками. Хотя адекватные уровни гормонов щитовидной железы (продуцируемых щитовидной железой) необходимы для развития скелета, избыток гормона щитовидной железы может уменьшать костную массу с течением времени. Антациды, содержащие алюминий, могут приводить к потере костной массы при введении в больших дозах людям с проблемами почек, в частности, подвергавшимся диализу. Другие лекарственные средства, которые могут вызывать вторичный остеопороз, включают в себя фенитоин (дилантин) и барбитураты, которые используют для предотвращения судорог; метотрексат (ревматрекс, иммунекс, фолекс РЕ8), лекарственное средство против некоторых форм артрита, рака и иммунных нарушений; циклоспорин (сандиммун, неорал), лекарственное средство, используемое для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и для супрессии иммунной системы у пациентов с трансплантатами органов; агонисты гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон (люпрон, золадеке), используемые для лечения рака предстательной железы и эндометриоза; гепарин (кальципарин, ликваемин), противосвертывающее лекарственное средство и холестирамин (квестран) и колестипол (колестид), используемые для лечения высокого уровня холестерина. Потеря костной массы в результате противораковой терапии широко известна и названа индуцированной противораковой терапией потерей костной массы (СТГВЬ). Метастазы в кости могут образовывать полости в кости, которые можно корректировать лечением антагонистами активина-АсЖПа.
В предпочтительном варианте осуществления антагонисты активина-Ас®Ла, в частности растворимый АсЖЛа, описанный в настоящем изобретении, можно использовать для больных раком. Пациенты, страдающие определенными опухолями (например, опухолями предстательной железы, молочной железы, множественной миеломой или любой опухолью, вызывающей гиперпаратиреоз), подвержены высокому риску потери костной массы из-за индуцированной опухолью потери костной массы, а также из-за метастазов кости и лекарственных средств. Таких пациентов можно лечить антагонистами активина-Ас®Ла даже в отсутствие признаков потери костной массы или метастазов в кости. Можно также проводить мониторинг пациентов по признакам потери костной массы или метастазов в кости и можно лечить антагонистами активина-АсЖПа в случае, если показатели позволяют предполагать увеличенный риск. Как правило, используют сканирование ЭЕХА для оценки изменений в плотности кости, в то время как показатели перестройки кости можно использовать для оценки вероятности метастазов в кости. Можно проводить мониторинг сывороточных маркеров. Специфическая костная щелочная фосфатаза (В8АР) представляет собой фермент, присутствующий в остеобластах. Уровни В8АР в крови повышены у пациентов с метастазами в кости и другими состояниями, приводящими к увеличению перестройки кости. Пептиды остеокальцин и проколлаген также связаны с формированием кости и метастазами в кости. Увеличение уровня В8АР детектировали у пациентов с метастазами в кости, вызванными раком предстательной железы, и в меньшей степени при метастазах кости из-за рака молочной железы. Уровни костного морфогенетического белка-7 (ВМР-7) являются высокими при раке предстательной железы, который метастазирует в кость, но не при метастазах в кости из-за рака мочевого пузыря, кожи, печени или легкого. Карбоксиконцевой телопептид типа Ι (ЮТР) представляет собой сшивку, обнаруженную в коллагене, которая формируется во время резорбции кости. Поскольку кость постоянно разрушается и переформируется, ЮТР будут обнаруживать повсюду в организме. Однако в участке метастазов в кости уровень будет значительно выше, чем в области нормальной кости. Высокие уровни ЮТР обнаружили в метастазах кости из-за рака предстательной железы, легкого и молочной железы. Другая сшивка коллагена, Юконцевой телопептид типа Ι (ЛТх), продуцируется вместе с ЮТР во время перестройки кости. Количество №Тх увеличено в метастазах кости, вызванных многими различными типами рака, включая рак легкого, предстательной железы и молочной железы. Уровни №Тх увеличиваются также при прогрессировании метастазирования в кости. Таким образом, этот маркер можно использовать как для детекции метастазов, так и для измерения степени заболевания. Другие маркеры резорбции включают в себя пиридинолин и дезоксипиридинолин. Любое увеличение уровня маркеров резорбции или маркеров метастазов в кости указывает на необходимость терапии антагонистом активина-АсЖПа для пациента.
- 22 018221
Антагонисты активина-Ас®Иа можно вводить совместно с другими фармацевтическими средствами. Совместное введение можно осуществлять введением одного совместного состава, одновременным введением или введением в разное время. Антагонисты активина-Ас®Ла могут являться особенно эффективными при введении с другими активными по отношению к кости средствами. Пациент может получать преимущество от совместного введения антагониста активина-Ас®Ла и введения пищевых добавок с кальцием, витамином Ό, доступных упражнений и/или в некоторых случаях другого лекарственного средства. Примеры других лекарственных средств включают бисфосфонаты (алендронат, ибандронат и ризедронат), кальцитонин, эстрогены, паратиреоидный гормон и ралоксифен. Бисфосфонаты (алендронат, ибандронат и ризедронат), кальцитонин, эстрогены и ралоксифен действуют на цикл перестройки кости, и их классифицируют как антирезорбтивные лекарственные средства. Перестройка кости состоит из двух отдельных стадий: резорбции кости и формирования кости. Антирезорбтивные лекарственные средства замедляют или останавливают часть резорбции кости из цикла перестройки кости, но не замедляют части формирования кости из цикла. В результате новое формирование продолжается с более высокой скоростью, чем резорбция кости, и плотность кости может увеличиваться с течением времени. Терипаратид, форма паратиреоидного гормона, увеличивает скорость формирования кости в цикле перестройки кости. Алендронат одобрен как для предотвращения (5 мг в сутки или 35 мг один раз в неделю), так и для лечения (10 мг в сутки или 70 мг один раз в неделю) остеопороза после менопаузы. Алендронат уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости и уменьшает риск переломов позвоночника, запястья и бедра. Алендронат одобрен также для лечения индуцированного глюкокортикоидом остеопороза у мужчин и женщин в результате долговременного использования этих лекарственных средств (т.е. преднизона и кортизона) и для лечения остеопороза у мужчин. Алендронат плюс витамин Ό одобрен для лечения остеопороза у женщин после менопаузы (70 мг один раз в неделю плюс витамин Ό) и для лечения для улучшения костной массы у мужчин с остеопорозом. Ибандронат одобрен для предотвращения и лечения остеопороза после менопаузы. При введении пилюли (150 мг) раз в месяц ибандронат следует вводить в одни и те же сутки каждый месяц. Ибандронат уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости и уменьшает риск переломов позвоночника. Ризедронат одобрен для предотвращения и лечения остеопороза после менопаузы. При введении ежесуточно (доза 5 мг) или еженедельно (доза 35 мг или доза 35 мг с кальцием) ризедронат замедляет потерю костной массы, увеличивает плотность кости и уменьшает риск переломов позвоночника и не относящихся к позвоночнику переломов. Ризедронат одобрен также для использования у мужчин и женщин для предотвращения и/или лечения индуцированного глюкокортикоидами остеопороза в результате долговременного использования этих лекарственных средств (т.е. преднизона или кортизона). Кальцитонин представляет собой природный гормон, вовлеченный в регуляцию кальция и метаболизм кости. У женщин через более 5 лет после менопаузы кальцитонин замедляет потерю костной массы, увеличивает плотность кости позвоночника и может облегчать боль, связанную с переломами кости. Кальцитонин уменьшает риск переломов позвоночника. Кальцитонин доступен в виде инъекции (50-100 МЕ ежесуточно) или назального спрея (200 МЕ ежесуточно). Эстрогенная терапия (ЕТ)/гормональная терапия (НТ) одобрена для предотвращения остеопороза. Показано, что ЕТ уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости как в позвоночнике, так и в бедре и уменьшает риск переломов бедра и позвоночника у женщин после менопаузы. ЕТ чаще всего вводят в форме пилюли или чрескожного пластыря, доставляющих низкую дозу приблизительно 0,3 мг ежесуточно или стандартную дозу приблизительно 0,625 мг ежесуточно, и она является эффективной даже при начале после возраста 70 лет. Когда эстроген вводят отдельно, он может увеличивать у женщин риск развития рака слизистой оболочки матки (рака эндометрия). Чтобы избежать этого риска, работники здравоохранения прописывают гормон прогестин в сочетании с эстрогеном (гормонозаместительная терапия или НТ) для женщин, имеющих интактную матку. ЕТ/НТ облегчает симптомы менопаузы, и показано, что она оказывает благоприятный эффект на здоровье кости. Побочные эффекты могут включать в себя вагинальное кровотечение, болезненность молочных желез, перепады настроения и заболевание желчного пузыря. Ралоксифен, 60 мг в сутки, одобрен для предотвращения и лечения остеопороза после менопаузы. Он принадлежит к классу лекарственных средств, называемых избирательными модуляторами рецепторов эстрогена (8ЕКМ), разработанных для обеспечения благоприятных эффектов эстрогенов без их потенциальных недостатков. Ралоксифен увеличивает костную массу и уменьшает риск переломов позвоночника. До сих пор не доступны данные, чтобы продемонстрировать, что ралоксифен может уменьшать риск переломов бедра и других не относящихся к позвоночнику переломов. Терипаратид, форма паратиреоидного гормона, одобрена для лечения остеопороза у женщин после менопаузы и у мужчин, подверженных высокому риску переломов. Это лекарственное средство стимулирует формирование новой кости и значительно увеличивает минеральную плотность кости. У женщин после менопаузы уменьшение переломов отмечено для позвоночника, бедра, стопы, ребер и запястья. У мужчин уменьшение переломов отмечено для позвоночника, однако существовало недостаточно данных для оценки уменьшения переломов в других участках. Терипаратид вводят самостоятельно в виде ежесуточной инъекции в течение вплоть до 24 месяцев.
- 23 018221
7. Фармацевтические композиции.
В конкретных вариантах осуществления антагонисты активина-АсШПа (например, полипептиды АсЖПа) по настоящему изобретению составляют с фармацевтически приемлемым носителем. Например, полипептид Лс1В11а можно вводить отдельно или в качестве компонента фармацевтического состава (терапевтической композиции). Рассматриваемые соединения можно составлять для введения любым удобным способом для применения в медицине или ветеринарии.
В конкретных вариантах осуществления терапевтический способ по изобретению включает введение композиции системно или местно в виде имплантата или устройства. При введении терапевтическая композиция для применения по этому изобретению представляет собой апирогенную физиологически приемлемую форму. Терапевтически применимые средства, отличные от антагонистов Ас1В11а. которые можно, необязательно, включать в композицию, как описано выше, можно вводить одновременно или последовательно с рассматриваемыми соединениями (например, полипептидами АсЖПа) в способах по изобретению.
Как правило, антагонисты Ас1КПа будут вводить парентерально и, в частности, внутривенно или подкожно. Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут содержать один или несколько полипептидов Ас®Па в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями или стерильными порошками, которые можно разводить в стерильных подходящих для инъекции растворах или дисперсиях непосредственно перед использованием, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты, растворенные вещества, придающие составу изотоничность с кровью намеченного реципиента, или суспендирующие средства или загустители. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях по изобретению, включают в себя воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекции органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, использованием покрывающих материалов, таких как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсий и использованием поверхностно-активных веществ.
Кроме того, композицию можно инкапсулировать или инъецировать в форме для доставки к намеченному участку ткани (например, кости). В конкретных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению могут включать матрикс, способный доставлять одно или несколько терапевтических соединений (например, полипептидов Ас®Па) к намеченному участку ткани (например, кости) и предоставлять структуру для развития ткани и оптимально, способный резорбироваться в организме. Например, матрикс может обеспечивать медленное высвобождение полипептидов Ас®Па. Такие матриксы можно формировать из материалов, в настоящее время применяемых для других применений медицинской имплантации.
Выбор материала матрикса основан на биосовместимости, биоразлагаемости, механических свойствах, косметическом внешнем виде и свойствах поверхности. Конкретное применение рассматриваемых композиций будет определять подходящий состав. Потенциальные матриксы для композиций могут представлять собой биоразлагаемые и химически определенные сульфат кальция, трикальцийфосфат, гидроксиапатит, полимолочную кислоту и полиангидриды. Другие потенциальные материалы являются биоразлагаемыми и хорошо определенными биологически, такие как костный или дермальный коллаген. Дополнительные матриксы состоят из чистых белков или компонентов внеклеточного матрикса. Другие потенциальные матриксы являются не биоразлагаемыми и химически определенными, такими как спеченный гидроксиапатит, биостекло, алюминаты или другие виды керамики. Матриксы могут состоять из сочетаний любых из вышеупомянутых типов материала, таких как полимолочная кислота и гидроксиапатит или коллаген и трикальцийфосфат. Биокерамику можно изменять по составу, такому как кальцийалюминат-фосфат, и перерабатывать для изменения размера пор, размера частиц, формы частиц и биоразлагаемости.
В конкретных вариантах осуществления способы по изобретению могут представлять собой введение пероральное, например в форме капсул, облаток, пилюль, таблеток, пастилок (с использованием вкусовой основы, обычно сахарозы и гуммиарабика или трагакантовой камеди), порошков, гранул, или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии масло-вводе или вода-в-масле, или в виде эликсира или сиропа, или в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик) и/или в виде жидкости для полоскания рта и т.п., где каждое содержит предопределенное количество средства в качестве активного ингредиента. Средство можно вводить также в виде болюса, электуария или пасты.
В твердых лекарственных формах для перорального введения (капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и т.п.) одно или несколько терапевтических соединений по настоящему изобретению можно смешивать с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или фосфат дикальция, и/или любым из следующего: (1) наполнители или разбавители, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связующие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон,
- 24 018221 сахароза и/или гуммиарабик; (3) смачивающие средства, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие вещества, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или маниоковый крахмал, альгиновая кислота, конкретные силикаты и карбонат натрия; (5) замедляющие растворение средства, такие как парафин; (6) ускорители всасывания, такие как соединения четвертичного аммония; (7) увлажняющие вещества, такие как, например, цетиловый спирт и глицеринмоностеарат; (8) абсорбирующие вещества, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и (10) окрашивающие средства.
В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции могут также содержать забуферивающие средства. Твердые композиции подобного типа можно также применять в качестве наполнителей в мягких и твердых заполненных желатиновых капсулах с использованием таких наполнителей, как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.
Жидкие формы дозирования для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активному ингредиенту, жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, общепринятые в данной области, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие средства и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное масла, масло проростков, оливковое, касторовое, и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана и их смеси. Помимо инертных разбавителей, пероральные композиции могут также включать в себя адъюванты, такие как увлажняющие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, подсластители, вкусовые вещества, окрашивающие средства, ароматизаторы и консервирующие средства.
Суспензии, в дополнение к активным соединениям, могут содержать суспендирующие вещества, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакантовая камедь и их смеси.
Композиции по изобретению могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие вещества, эмульгаторы и диспергирующие средства. Предупреждение действия микроорганизмов можно обеспечивать включением различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Может также являться желательным включать изотонические средства, такие как сахара, хлорид натрия и т.п., в композиции. Кроме того, замедленное всасывание пригодной для инъекции фармацевтической формы можно вызывать включением средств, задерживающих всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Понятно, что режим дозирования будет определять лечащий врач с учетом различных факторов, модифицирующих действие рассматриваемых соединений по изобретению (например, полипептидов Ас(КЛа). Различные факторы включают в качестве неограничивающих примеров количество массы кости, которое желательно сформировать, степень потери плотности кости, участок повреждения кости, состояние поврежденной кости, возраст, пол и диету пациента, тяжесть любого заболевания, которое может вносить вклад в потерю костной массы, время введения и другие клинические факторы. Необязательно, доза может меняться с типом используемого для реконструирования матрикса и типами соединений в композиции. Добавление других известных факторов роста к конечной композиции также может влиять на дозу. Прогресс можно мониторировать периодической оценкой роста и/или репарации кости, например, рентгеновскими лучами (включая ОЕХА), гистоморфометрическими определениями и тетрациклиновым мечением.
Эксперименты на приматах и людях показали, что эффекты АсЖПа-Рс на кость поддаются детекции, когда соединение дозируют в интервалах и количествах, достаточных для достижения концентраций в сыворотке приблизительно 200 нг/мл, при возникновении половины от максимальных эффектов на анаболические биомаркеры кости при дозе 0,3 мг/кг или эквивалентной, в переводе на площадь под кривой. У человека уровней в сыворотке 200 нг/мл можно достигать при однократной дозе 0,1 мг/кг или более и уровней в сыворотке 1000 нг/мл можно достигать при однократной дозе 0,3 мг/кг или более. Наблюдаемое время полужизни молекулы в сыворотке составляет между приблизительно 25 и 35 сутками, по существу, дольше, чем для большинства слитых с Рс белков, и, таким образом, можно достигать продолжительного эффективного уровня в сыворотке, например дозированием приблизительно 0,05-0,5 мг/кг на основе дозирования один раз в неделю или два раза в неделю, или можно использовать более высокие дозы с более длительными интервалами между дозами. Например, дозы 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1, 2 или 3 мг/кг или промежуточные значения можно использовать на основе дозирования один раз в месяц или один раз в два месяца, и эффект на кость может быть достаточно стойким, чтобы дозирование являлось необходимым только один раз в каждые 3, 4, 5, 6, 9, 12 или более месяцев. Более длительные интервалы между дозами дополнительно поддержаны продолжительностью фармакодинамического эффекта, которая является более длительной, чем продолжительность присутствия лекарственного средства в сыворотке. ΡΌ эффекты наблюдали в течение по меньшей мере 120 суток у пациентов-людей.
- 25 018221
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к генотерапии для получения полипептидов АсЕКПа ш νί\Ό. Терапевтического эффекта такой терапии будут достигать введением полинуклеотидных последовательностей Ас1.К11а в клетки или ткани, обладающие нарушениями, как перечислено выше. Доставки полинуклеотидных последовательностей АсЕКЛа можно достигать с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, такого как химерный вирус, или коллоидной дисперсионной системы. Предпочтительным для терапевтической доставки полинуклеотидных последовательностей АсЕКЛа является использование нацеленных липосом.
Различные вирусные векторы, которые можно использовать для генотерапии, как объясняют в настоящем описании, включают в себя аденовирус, вирус герпеса, вирус осповакцины или предпочтительно РНК-вирус, такой как ретровирус.
Предпочтительно ретровирусный вектор представляет собой производное ретровируса мышей или птиц. Примеры ретровирусных векторов, в которые можно вставлять отдельный чужеродный ген, включают в себя в качестве неограничивающих примеров вирус лейкоза мышей Молони (МоМиЬУ), вирус саркомы мышей Харви (НаМи8У), вирус опухоли молочной железы мышей (МиМТУ) и вирус саркомы Рауса (К8У). Ряд дополнительных ретровирусных векторов могут включать несколько генов. Все эти векторы могут переносить или включать ген селективного маркера, так чтобы трансдуцированные клетки можно было идентифицировать и получать. Ретровирусные векторы можно сделать специфическими для мишени присоединением, например, сахара, гликолипида или белка. Предпочтительное нацеливание осуществляют с использованием антитела. Специалистам в данной области известно, что специфические полинуклеотидные последовательности можно вставлять в ретровирусный геном или присоединять к оболочке вируса, чтобы позволять специфическую для мишени доставку ретровирусного вектора, содержащего полинуклеотид АсЕКЛа. В предпочтительном варианте осуществления вектор нацелен на кость или хрящ.
Альтернативно, культуру клеток ткани можно непосредственно трансфицировать плазмидами, кодирующими структурные гены ретровирусов дад, ро1 и спу, посредством общепринятой трансфекцией с фосфатом кальция. Затем эти клетки трансфицируют векторной плазмидой, содержащей интересующие гены. Полученные клетки высвобождают ретровирусный вектор в культуральную среду.
Другой системой для нацеленной доставки полинуклеотидов АсЕКЛа является коллоидная дисперсионная система. Коллоидные дисперсионные системы включают макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, бусины и системы на основе липидов, включая эмульсии типа масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой по этому изобретению является липосома. Липосомы представляют собой везикулы с искусственной мембраной, которые используются в качестве носителей для доставки ίη У11го и ίη νί\Ό. РНК, ДНК и интактные вирионы можно инкапсулировать внутри водного внутреннего пространства и доставлять в клетки в биологически активной форме (см., например, Рга1еу, еЕ а1., Тгепбк ВюсЬет. 8с1, 6:11, 1981). Способы эффективного переноса генов с использованием липосомного носителя известны в данной области, см., например, Мапшпо, еЕ а1., В|о1есНп1цне5, 6:682, 1988. Состав липосомы обычно представляет собой сочетание фосфолипидов, обычно в сочетании со стероидами, особенно холестерином. Можно использовать также другие фосфолипиды или другие липиды. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов.
Примеры липидов, используемых при получении липосом, включают фосфатидильные соединения, такие как фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфинголипиды, цереброзиды и ганглиозиды. Примерные фосфолипиды включают фосфатидилхолин яйца, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин. Возможно и известно в данной области также нацеливание липосомы на основе, например специфичности для органа, специфичности для клетки и специфичности для органеллы.
- 26 018221
Примеры
Изобретение, в настоящее время описанное в общем, будет более легко понятно со ссылкой на следующие примеры, которые включены только для целей иллюстрации конкретных вариантов осуществления и вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения изобретения.
Пример 1. Слитые белки АсЖПа-Рс.
Авторы настоящего изобретения сконструировали растворимый слитый белок АсЖПа, обладающий внеклеточным доменом Ас£КПа человека, слитым с доменом Рс человека или мыши с минимальным линкером между ними. Конструкции обозначены как АсЖПа-№с и Ас®Па-тЕс соответственно.
Ас£КПа-№с показан внизу, как выделено из линий клеток СНО (8ЕЦ ГО N0: 7):
ΙΕΟΒ8ΕΤρΕ€ΕΡΡΝΑΝΧνΕΚϋΒΤΝρτανΕΡΟΥΟΟΚϋΚΚΒΗΟΡΑΤ\νΚΝΙ8αδΙΕ]νΚΟ<3
ΟλνΕΡΡΙΝΟ ΥΡΚΤΡΟνΕΚΚΡδΡΕνΥΡΟΟΟΕΟΝΜΟΝ ЕКР8 ΥΡΡΕΜ Е УТЦРТК N Р УТРК РРТСООТНТСРРСРАРЕЬБСаР8УРЕРРР1СРКРТЕМ18КТРЕУТСУУУРУ8НЕРРЕУКР ΝλνγνΡΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΜδΤΥΚννδνΕΤνΕΗΟΡΧνΕΝΟΚΕΥΚΟΚνδΝΚΑΕΡ УР1ЕКТ18КАКСОРКЕРОУУТ1РР5КЕЕМТККОУ5ЕТСЕУКС;РУР5Р1АУЕ\УЕ8НСОР ЕНМУКТТРРУЬР8РС£РРЕУ8КЬТУРКЗКАУООСНУР8С8УМНЕАЕНЫНУТОК8ЬЗЬ 8РСК
Белки АсЖЛа-йРс и Ас1К11а-тРс экспрессировали в линиях клеток СНО. Рассматривали три различные лидерные последовательности:
(ί) меллитина пчелы медоносной (НВМЬ):
МКБЬУКУАЬУБМУУУ18У1УА (8ЕО ГО N0: 8);
(ίί) тканевого активатора плазминогена (ТРА):
МПЛМКВ6ЬССУЪЬЬС6АУБУ8Р (8ЕО ГО N0: 9);
(ίίί) природный:
М6АААКЬАБАУБЬ18С88ОА (8ЕО ГО N0: 10).
Выбранная форма содержит лидер ТРА и обладает следующей непроцессированной аминокислотной последовательностью:
ΜΡΑΜΚΚΟΕΟθνΕΕΕΟΟΑνΓν8Ρ6ΑΑΙΕϋΚ8ΕΤΟΕΟΕΡΡΝΑΝ\νΕΚ.ΡΚΤΝ(?ΤθνΕΡΟΥ СРКРКККНСРАТ\УКЫ15681Е1УК<?ОС\УЕРР1МСУРКТРСУЕКК.Р8РЕУУРСССЕС ΝΜσΝΕΚΓδΥΕΡΕΜΕντρΡΤδΝΡντΡΚΡΡΤΟαΟΤΗΤΌΡΡΟΡΑΡΕΙΛΟΟΡδνΓΕΓΡΡΚΡΚ ΟΤΕΜΙ8ΒΤΡΕνΤθνννρν8ΗΕΡΡΕνΚΕΝ\νΥνΡθνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ<}ΥΝ8ΤΎΒνν8 νΕΤνΕΗρΡν/ΕΝΟΚΕΥΚΟΚν8ΝΚΑΕΡνΡ1ΕΚΤΙ8ΚΑΚαθΡΕΕΡςνΥΤΕΡΡ8ΕΕΕΜΤΚΝ ΟνδΕΤΟΕνΚΌΡΥΡδΡΙΑνΕλνΕδΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδΡΟδί'ΕΕΥδΚΧΤνΡΚΒΕΆΌ <?0Ν УЕ8С8 νΜΗΕΑί.ΗΝΗΥΤ<3Κ81_3Ε8ΡαΚ {5 ЕС? ΙΡ ΝΟ: 13)
Этот полипептид кодирует следующая последовательность нуклеиновой кислоты:
АТООАТОСААТОААОАОАССОСТСТОСТОТОТаСТОСТОСТОТОТООАОСАОТСТ ТСОТТТСОССС06ССССОСТАТАСТТС6ТАСАТСА6АААСТСАОСАСТСТСТТТТ ТТТААТОСТААТТСССАААААСАСАОААССААТСАААСТССТСТТ6ААСС6ТСТТ АТОСТСАСАААОАТАААССССОССАТТСТТТТОСТАССТСОААСААТАТТТСТСО ТТССАТТОААТАСТСАААСААСОТТОТТСОСТСОАТСАТАТСААСТОСТАТОАСА ССАСТ0АТТСТСТАСАААААААА0АСАССССТ6ААСТАТАТТТСТСТТ6СТ6ТСА СООСААТАТОТаТААТОААААОТТТТСТТАТТТТСССОАСАТСОААОТСАСАСАО СССАСТТСАААТССАСТТАСАССТААСССАСССАССОСТОСТССААСТСАСАСАТ ОСССАССОТОСССАОСАССТСААСТССТСОООСаАССаТСАОТСТТССТСТТССС СССААААСССААОбАСАСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАОСТСАСАТССОТО ОТС6ТССАСОТСАСССАССААОАСССТ6АС6ТСААОТТСААСТОСТАССТОСАС СССОТОСАООТОСАТААТОССААОАСАААОСССССОСАССАССАСТАСААСАС САСОТАССОТСТООТСАОССТССТСАССОТССТОСАССАССАСТаССТбААТСОС ААОСАСТАСААСТССААСОТСТССААСАААССССТСССАСТССССАТС6АОААА АССАТСТССАААСССАААООССАОСССССАОААССАСАООТОТАСАСССТСССС ССАТСССОООАаОАОАТОАССААСААССАООТСАОССТаАССТаССТаСТСААА СССТГСТАТСССАаССАСАТСОССОТООАОТСаОАОАССААТССОСАСССССАС ААСААСТАСААОАССАСОССТСССОТССТСОАСТССОАССССТССТТСТТССТСТ АТАОСААССТСАССОТССАСААСАССАССТСОСАССАООСОААССТСТТСТСАТ ОСТССОТСАТаСАТСАбССТСТОСАСААССАСТАСАСОСАОААОАСССГСТСССТ СТСТССОССТАААТСАОААТТС (8Е<? ΙΡ N0:14)
- 27 018221
Как Ас®На-йРс, так и АсЖНа-шРс замечательно поддавались рекомбинантной экспрессии. Как показано на фиг. 1, белок очищали в виде отдельного, хорошо определенного пика белка. Ν-концевым секвенированием выявили отдельную последовательность - ГЬСКБТЦЕ (8ЕЦ ΙΌ N0: 11). Очистки можно достигать серией стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующего, в любом порядке: хроматография с белком А, хроматография на Ц-сефарозе, хроматография на фенилсефарозе, эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистку можно завершать фильтрацией вирусов и заменой буфера. Белок АсЖЛа-йРс очищали до чистоты >98%, как определяли эксклюзионной хроматографией, и >95%, как определяли посредством 8Ь8 РАСЕ.
Ас®На-йРс и Ас®На-тРс показали высокую аффинность к лигандам, в частности активину А. СЬР-11 или активин А (Ас1А) иммобилизовали на чипе В1асоге СМ5 с использованием общепринятого способа присоединения по аминогруппам. Белки Ас®Ла-йРс и Ас®На-тРс вводили в систему и измеряли связывание. Ас®На-№с связывался с активином с константой диссоциации (Кс) 5х10-12, и белок связывался с СЬР-11 с Кс 9,96х 10-9, см. фиг. 2. Поведение АсЖПа-тРс являлось сходным.
Анализ репортерного гена А-204 использовали для оценки эффектов белков АсЖПа-йРс на передачу сигнала посредством СЬР-11 и активина А. Линия клеток: Рабдомиосаркома человека (полученная из мышцы). Репортерный вектор: рСЬ3(САСА)12 (описанный в Ьепп1ег е1 а1., 1998, ЕМВО. 17:3091-3100), см. фиг. 3. Повтор САСА12 присутствует в отвечающих на ТСР-β генах (ген РА1-1), так что этот вектор находит основное применение для факторов, передающих сигналы посредством 8шаб2 и 3.
Сутки 1: Распределяли клетки А-204 в 48-луночном планшете.
Сутки 2: Клетки А-204 трансфицировали 10 мкг рСЬ3(САСА)12 или рСЬ3(САСА)12 (10 мкг) + рКЬСМУ (1 мкг) и Ридепе.
Сутки 3: Добавляли факторы (разведенные в среде + 0,1% В8А). Ингибиторы необходимо предварительно инкубировать с факторами в течение 1 ч перед добавлением к клеткам. Через 6 ч клетки промывали РВ8 и лизировали.
За этим следовал анализ люциферазы. Как правило, в этом анализе в отсутствие каких-либо ингибиторов для активина А показывают приблизительно 10-кратную стимуляцию экспрессии репортерного гена и ЕЬ50 ~2 нг/мл. СЬР-11: 16-кратную стимуляцию, ЕЬ50: ~1,5 нг/мл. Для СЬР-8 показали эффект, сходный с СЬР-11.
Как показано на фиг. 4, АсЖНа-йРс и АсЖПа-тРс ингибируют опосредованную СЬР-8 передачу сигналов в пикомолярных концентрациях. Как показано на фиг. 5, три различных препарата Ас®Ла-йРс ингибировали передачу сигналов СЬР-11 с 1С50 приблизительно 200 пМ.
Ас®На-йРс был очень стабильным при фармакокинетических исследованиях. Крысам вводили дозы 1, 3 или 10 мг/кг белка АсЖНа-йРс и уровни белка в плазме измеряли через 24, 48, 72, 144 и 168 ч. В отдельном исследовании крысам вводили дозы 1, 10 или 30 мг/кг. У крыс Ас®На-йРс обладал временем полужизни в сыворотке 11-14 суток, и уровни лекарственного средства в кровотоке являлись довольно высокими через 2 недели (11, 110 или 304 мкг/мл для исходных введений 1, 10 или 30 мг/кг соответственно). У яванских макак время полужизни в сыворотке составляло, по существу, более 14 суток, и уровни лекарственного средства в кровотоке составляли 25, 304 или 1440 мкг/мл для исходных введений 1, 10 или 30 мг/кг соответственно. Предварительные результаты у человека позволяют предполагать, что время полужизни в сыворотке составляет между приблизительно 20 и 30 сутками.
Пример 2. Ас®На-тРс стимулирует рост кости ш у1уо.
Нормальным самкам мышей (ВАЬВ/с) вводили дозы Ас®Ла-шРс на уровне 1, 3 или 10 мг/кг/дозу, с введением доз дважды в неделю. Минеральную плотность кости и минеральное содержание кости определяли посредством ЬЕХА, см. фиг. 6.
У самок мышей ВАЬВ/с сканированиями ЬЕХА показали значительное увеличение (>20%) минеральной плотности и содержания кости в результате обработки Ас®Ла-тРс, см. фиг. 7 и 8.
Таким образом, антагонизм Ас®Ла вызывал увеличение плотности и содержания кости у нормальных самок мышей. В качестве следующего шага, тестировали эффект Ас®На-тРс на кость на модели остеопороза у мышей.
Апбетккоп е1 а1. (2001) определили, что мыши после овариэктомии страдают значительной потерей костной массы (приблизительно 50% потери губчатой кости через 6 недель после операции) и что потерю костной массы у этих мышей можно корректировать лекарственными средствами-кандидатами, такими как паратиреоидный гормон.
Авторы настоящего изобретения использовали самок мышей С57ВЬ6 после овариэктомии (ОУХ) или ложной операции в возрасте 4-5 недель. Через 8 недель после хирургической операции начинали обработку Ас®Ла-тРс (10 мг/кг, дважды в неделю) или контрольную обработку (РВ8). Плотность кости измеряли сканером СТ.
Как показано на фиг. 9, для мышей после овариэктомии без обработки показали значительную потерю плотности губчатой кости по сравнению с контролями после ложной операции через 6 недель. Обработка Ас®На-тРс восстанавливала плотность кости до такого уровня, как у мышей после ложной операции. Через 6 и 12 недель обработки Ас®На-тРс вызывал существенное увеличение губчатой кости
- 28 018221 у мышей ОУХ, см. фиг. 10. После 6 недель обработки плотность кости увеличивалась на 24% по сравнению с контролями после РВБ. Через 12 недель увеличение составляло 27%.
У мышей после ложной операции Ас®Ла-тЕс также вызывал существенное увеличение губчатой кости, см. фиг. 11. Через 6 и 12 недель обработка приводила к 35% увеличению по сравнению с контролями.
В дополнительном наборе экспериментов мышей после овариэктомии (ОУХ) или после ложной операции, как описано выше, обрабатывали Ас®Ла-тЕс (10 мг/кг, дважды в неделю) или контролем (РВБ) в течение 12 недель. Подобно результатам, описанным выше для Ас®Ла-тЕс, для мышей ОУХ после введения Ас®Ла-тЕс показали увеличение плотности губчатой кости на 15% настолько рано, как через 4 недели, и на 25% через 12 недель обработки (фиг. 12). Подобным образом, для мышей после ложной операции после введения Ас®Ла-тЕс показали увеличение плотности губчатой кости на 22% настолько рано, как через 4 недели, и на 32% через 12 недель обработки (фиг. 13).
Через 12 недель обработки Ас®Иа-тЕс анализ всего организма и анализ ЭЕХА бедренной кости ех У1уо показали, что обработка индуцирует увеличение плотности кости у мышей как после овариэктомии, так и после ложной операции (фиг. 14А и 14В соответственно). Эти результаты поддержаны также анализом рОСТ ех у1уо середины диафиза бедренной кости, который показал значительное увеличение как общей плотности кости, так и плотности трубчатой кости через 12 недель после обработки Ас®Ла-тЕс. Обработанные носителем мыши после овариэктомии показали плотности кости, сравнимые с плотностями у обработанных носителем мышей после ложной операции (фиг. 15). В дополнение к плотности кости, содержание костной ткани увеличивалось после обработки АсЖЛа-тЕс. Анализы рОСТ ех у1уо середины диафиза бедренной кости показали значительное увеличение как общего содержания кости, так и содержания трубчатой кости через 12 недель обработки Ас!КЛа-тЕс, тогда как для обработанных контролем-носителем мышей как после овариэктомии, так и после ложной операции показали сравнимое содержание кости (фиг. 16). Анализ рОСТ ех у1уо середины диафиза бедренной кости также показал, что обработанные Ас®Ла-тЕс мыши не обладали изменениями периостальной окружности; однако обработка Ас®Ла-тЕс приводила к уменьшению эндостальной окружности, указывая на увеличение толщины кортикального слоя из-за роста внутренней поверхности бедренной кости (фиг. 17).
Механическим тестированием бедренной кости определили, что Ас®Иа-тЕс являлся способным увеличивать внешние характеристики кости (максимальную нагрузку, прочность и работу для разлома), которые вносят вклад в значительное увеличение внутренних свойств (предела прочности) костей. Для мышей после овариэктомии, обработанных Ас®Ла-тЕс, показали увеличение прочности кости до уровней выше, чем у контролей после ложной операции после обработки носителем, что указывает на полное обращение остеопорозного фенотипа (фиг. 18).
Эти данные показывают, что антагонист активина-Ас®Ла может увеличивать плотность кости у нормальных самок мышей и, более того, корректировать дефекты плотности кости, содержания кости и в конечном счете - прочности кости на модели остеопороза у мышей.
В дополнительных экспериментах мышей подвергали овариэктомии или ложной операции на 4 неделе и начиная с 12 недель вводили либо плацебо, либо Ас!К11а-тЕс (2 раза/неделю, 10 мг/кг) (обозначены также как КАР-11 на фиг. 19-24) в течение дополнительного периода 12 недель. Оценивали ряд параметров кости. Как показано на фиг. 19, Ас®Ла-тЕс увеличивал соотношения объема губчатой кости позвоночника к общему объему (ВУ/ТУ) у мышей, после операции как ОУХ, так и БНАМ. Ас!К11а-тЕс также улучшал губчатую архитектуру (фиг. 20), увеличивал толщину кортикального слоя (фиг. 21) и улучшал прочность кости (фиг. 22). Как показано на фиг. 23, АсШПа-тЕс оказывал желательные эффекты в диапазоне доз от 1 до 10 мг/кг.
Гистоморфометрию кости проводили во временной точке 2 недели у мышей после ложной операции. Эти данные, представленные на фиг. 24, показывают, что Ас®Ла-тЕс оказывает двойной эффект, как ингибируя резорбцию кости, так и стимулируя рост кости. Таким образом, Ас®Ла-тЕс стимулирует рост кости (анаболический эффект) и ингибирует резорбцию кости (антикатаболический эффект). ВУ = объем кости; ТУ = общий объем ткани. ВУ/ТУ представляет собой меру процента объема кости, который является минерализованным. ЕБ = эродированная поверхность; ВБ = поверхность кости. ЕБ/ВБ является мерой эрозии кости, и уменьшение, вызванное КАР-011, показывает антирезорбтивный или антикатаболический эффект. Мк/Вк представляет собой соотношение минерализованной поверхности/поверхности кости, что является показателем роста кости или анаболического эффекта. Подобным образом, уровень аппозиции минералов (МАК) и скорость формирования кости на поверхность кости в сутки (ВЕК/ВБб) указывают на рост кости. Измерения остеобластов (ШЬ/ВРщ) и остеокластов (Нос/ВРт) проводили для исследования механизма действия.
Второй эксперимент по гистоморфометрии проводили на самках мышей С57ВБ/6 начиная с возраста 12 недель. Мышам дважды в неделю вводили внутрибрюшинно 10 мг/кг Ас®Ла-тЕс в течение 2, 4, 8 или 12 недель.
Каждую группу умерщвляли через 5 суток после последней дозы и отбирали кости для анализа. Мышей метили кальцеином за 9 и 2 суток до эвтаназии. Как показано на фиг. 25, измерения показывают, что Ас®Ла-тЕс стимулирует рост и минерализацию кости и оказывает как анаболический, так и антика
- 29 018221 таболический эффекты. См., например, соотношение ВУ/ТУ, соотношение Е8/В8 и соотношение М5/В5. Анаболические эффекты, по-видимому, сохраняются на протяжении режима дозирования, тогда как антирезорбтивные эффекты, по-видимому, являются недолговечными у мышей.
Пример 3. АсЖЛа-тЕс облегчает или предотвращает повреждение кости на модели множественной миеломы у мышей.
Пациенты с множественной миеломой обладают нарушением с потерей костной массы, характеризующимся увеличенной активностью остеокластов и уменьшенным формированием кости остеобластами. Модель миеломы на мышах 5Т2ММ основана на использовании опухолевых клеток (клеток 5Т2ММ) из типа спонтанной опухоли, которая развивается у старых мышей и вызывает у мышей эффекты, сходные с эффектами, наблюдаемыми у пациентов-людей с множественной миеломой. См., например, Уапбегкегкеп с1 а1., Мс11юб5 Мо1. Меб. 2005; 113:191-205. Эффекты Ас£КПа-тЕс тестировали на этой модели.
Клетки 5Т2ММ, инъецированные мышам С57ВЬ/КаЬ^К1], стимулировали увеличение поверхности остеокластов, образование остеолитических очагов и вызывали уменьшение площади кости. Заболевание кости являлось связанным с уменьшением числа остеобластов, поверхности остеобластов и с уменьшением минерализации.
Мышей, несущих клетки 5Т2ММ, обрабатывали Ас£КПа-тЕс (КАР-011) (10 мг/кг, ί.ρ. дважды в неделю) или носителем со времени инъекции 5Т2ММ всего в течение 12 недель. Анализ микро-СТ проксимальной большой берцовой кости и поясничных позвонков показал уменьшение объема губчатого вещества кости на 39 и 21% (р<0,001 и р<0,01) и уменьшение числа трабекул на 37 и 15% (р<0,01 и р<0,05) у несущих 5Т2ММ мышей по сравнению с наивными мышами. КАР-011 полностью предотвращает индуцированные 5Т2ММ уменьшения объема губчатой ткани и числа трабекул как в большой берцовой кости (р<0,001 и р<0,05), так и в позвоночнике (р<0,01 и р<0,05) при сравнении с обработанными носителем мышами. Объем кости был на 19% выше для большой берцовой кости (р=168) и на 12% выше для позвоночника (р<0,05) у обработанных КАР-011 мышей по сравнению с наивными мышами. КАР-011 предупреждал развитие остеолитических очагов в кости (р<0,05). Этот эффект проиллюстрирован на фиг. 26. В то время как предварительной оценкой данных не удалось идентифицировать значительные эффекты парапротеина в сыворотке (биомаркера опухолевых клеток множественной миеломы) или нагрузки миеломы в этом исследовании, дальнейший анализ показал, что уровень парапротеина в сыворотке являлся, по существу, пониженным у всех обработанных животных, кроме одного, и, кроме того, что объем здорового костного мозга являлся, по существу, увеличенным, что указывает на уменьшение нагрузки опухолевых клеток миеломы.
Таким образом, Ас®Ла-тЕс можно использовать для уменьшения эффектов заболевания кости, возникающего из-за множественной миеломы, и для лечения собственно от опухолевых клеток.
Пример 4. Характеризация белка Ас£КПа-ЬЕс.
Слитый белок АсЖНа-ЬЕс экспрессировали в стабильно трансфицированных клетках СНО-ЭИКХ В11 с вектора рАГО4 (8У40 οτί/энхансер, промотор СМУ), с использованием лидерной последовательности тканевого плазминогена из 8ЕО Ш N0: 9. Белок, очищенный, как описано выше в примере 1, обладает последовательностью 8Е0 Ш N0: 7. Часть Ес представляет собой последовательность Ес [дС] человека, как показано на 8Е0 Ш N0: 7. Анализ сиаловой кислоты показал, что белок содержал, в среднем, между приблизительно 1,5 и 2,5 моль сиаловой кислоты на молекулу слитого белка АсЖЛа-ЬЕс.
Для этого очищенного белка показали существенно долгое время полужизни в сыворотке для всех тестируемых животных, включая время полужизни 25-32 суток для пациентов-людей (см. пример 5). Кроме того, экспрессированный в клетках СНО материал обладал более высокой аффинностью для лиганда активина В, чем опубликовано для слитого белка АсЖНа-ЬЕс, экспрессированного в клетках 293 человека (бе1 Ке еΐ а1., 1. Вю1. СЬет. 2004 Эес. 17; 279(51):53126-35). Кроме того, использование лидерной последовательности ΐРа обеспечивало более высокую продукцию, чем другие лидерные последовательности, и, в отличие от Ас®Ла-Ес, экспрессированного с природным лидером, обеспечивало высокочистую Ν-концевую последовательность. Применение природной лидерной последовательности приводило к двум главным видам Ас£КПа-Ес, где каждый обладал различной Ν-концевой последовательностью.
Пример 5. Клинические испытания на людях.
Белок, описанный в примере 4, вводили пациентам-людям в рандомизированном двойном слепом контролируемом плацебо исследовании, которое проводили для оценки, в первую очередь, безопасности белка для здоровых женщин после менопаузы. 48 индивидов случайным образом распределяли в когорты по 6 для введения либо однократной дозы АсЖНа-ЬЕс, либо плацебо (5 активное вещество: 1 плацебо). Уровни дозы лежали в диапазоне от 0,01 до 3,0 мг/кг внутривенно (IV) и от 0,03 до 0,1 мг/кг подкожно (8С). Всех индивидов наблюдали в течение 120 суток. Индивидов исключали из участия в исследовании, если они принимали лекарственные средства, влияющие на метаболизм кости, в пределах 6 месяцев от начала исследования. Проводили исследования безопасности, наблюдая каждую когорту для определения увеличения дозы. В дополнение к фармакокинетическим (РК) анализам, оценивали также биологическую активность АсЖЛа-ЬЕс измерением биохимических маркеров формирования и резорбции кости и уровней Е8Н.
- 30 018221
В этом исследовании не опубликовано тяжелых неблагоприятных событий. Неблагоприятные события (ΑΕ) в основном являлись умеренными и временными. Предварительный анализ ΑΕ включал в себя головную боль, повышенные лабораторные показатели, симптомы простуды, рвоты или тошноты, внутривенную инфильтрацию и гематому в участке инъекции.
Анализ РК ΑοΙΚ^ι-ΠΕο показал линейный профиль для дозы, и среднее время полужизни приблизительно 25-32 суток. Площадь под кривой (Αυί.') для ΑοΙΚ^ι-ΠΕο линейно зависела от дозы, и поглощение после 8С дозирования являлось, по существу, полным (см. фиг. 27 и 28). Эти данные показывают, что 8С является желательным способом для дозирования, поскольку он обеспечивает эквивалентную биодоступность и время полужизни в сыворотке для лекарственного средства, в то же время избегая всплеска концентраций лекарственного средства в сыворотке, связанного с первыми несколькими сутками IV дозирования (см. фиг. 28). ΑοΙΚΡι-ΗΡο вызывал быстрое, продолжительное зависимое от дозы увеличение уровней в сыворотке специфической костной щелочной фосфатазы (ΒΑΓ), которая является маркером анаболического роста кости, и зависимое от дозы уменьшение уровней С-концевого телопептида коллагена 1 типа и устойчивой к тартрату кислой фосфатазы 5Ь, которые являются маркерами резорбции кости. Для других маркеров, таких как РЮТ, показали неопределенные результаты. Для уровней ΒΑΓ показали почти насыщающие эффекты при наиболее высокой дозе лекарственного средства, показывая, что половины максимальных эффектов на эти анаболические биомаркеры кости можно достигать при дозе 0,3 мг/кг, с увеличением в диапазоне вплоть до 3 мг/кг. Рассчитанная как отношение фармакодинамического эффекта к ΑυС для лекарственного средства, ЕС50 составляет 51,465 (суткихнг/мл), см. фиг. 29. Изменения уровня этих биомаркеров кости сохранялись в течение приблизительно 120 суток при наиболее высоких тестируемых уровнях дозы. Присутствовало также зависимое от дозы уменьшение уровней Ρ8Η в сыворотке, согласующееся с ингибированием активина.
Однократная доза ΑΛΗΠι-ΗΕο, вводимая здоровым женщинам после менопаузы, являлась безопасной и хорошо переносимой в диапазоне тестируемых уровней дозы. Продолжительные РК и фармакодинамические эффекты позволяют предполагать, что прерывистое дозирование будет подходящим для будущих исследований. Например, дозирование на основании времени полужизни в сыворотке можно проводить на основании дозирования один раз в месяц, или по порядку один раз в каждые 2, 3, 4, 5 или 6 недель. Кроме того, поскольку фармакодинамический эффект продолжается далеко за пределами пребывания лекарственного средства в сыворотке, дозирование можно проводить на основании фармакодинамического эффекта, подразумевая, что дозирование каждые 3 месяца или каждые 2, 3, 4, 5, 6 или даже 12 месяцев может быть эффективным для получения желательного эффекта у пациентов. Это клиническое испытание показывает, что для человека ΑοϊΚ-Πι-ΗΕο является остеоанаболическим средством с биологическим доказательством как увеличения формирования кости, так и уменьшения резорбции кости.
Пример 6. Совместное введение ΑсΐΚIIа-тΕс и бисфосфоната.
Бисфосфонаты представляют собой класс лекарственных средств, которые широко используют для лечения нарушений, связанных с низкой минеральной плотностью кости, включая остеопороз и связанную с раком потерю костной массы. Бисфосфонаты обладают сильной антирезорбтивной активностью, ингибируя остеокласты. Возможно, поскольку остеокласты необходимы как для разрушения кости, так и для роста кости, бисфосфонаты, по-видимому уменьшают эффекты паратиреоидного гормона (РТН), одного из единственно известных средств для анаболического роста кости (Ыаск е! а1., Ν. Епд1. ί. Меб. 2003 8ер. 25; 349(13):1207-15; 8атабГат е! а1., Епбосппо1оду. 2007 ,1ип; 148(6):2778-87).
Для тестирования эффективности лечения ΑοϊΚΠι-Ρο у пациентов, которым ранее вводили или одновременно вводили бисфосфонат или другое антирезорбтивное лекарственное средство, мышей тестировали с помощью комбинированных ΑсΐΚIIа-тΕс и золедроната, бисфосфонатного соединения. Мышей ί.’57Βυ6Ν в возрасте 12 недель обрабатывали следующим образом:
Группа 1: ΡΒ8.
Группа 2: ΑсΐΚIIа-тΕс (ΚЛΡ-0I1) (10 мг/кг) дважды в неделю (с группами 3 и 4).
Группа 3: Золедроновая кислота (ΖΟΕ), однократная доза (20 мг/кг).
Группа 4: ΖΟΕ (1 доза), 3 суток после ΑсΐΚIIа-тΕс (ΚЛΡ-01I) (1 мг/кг) дважды в неделю.
Группа 5: ΖΟΕ (1 доза), 3 суток после ΑсΐΚIIа-тΕс (ΚЛΡ-01I) (10 мг/кг) дважды в неделю.
Общую ΒΜ^ определяли сканированием ^ΕXΑ (Р!Х1) перед дозированием и на 3 и 8 неделе обработки.
Как показано на фиг. 30, общая ΒΜ^ значительно увеличивалась во всех группах обработки, причем с комбинацией ΖΟΕ и ΑсΐΚIIа-тΕс получали самые большие эффекты. Эти результаты показывают, что белки ΑοϊΚΠι-Ρο можно использовать для увеличения плотности кости даже у пациентов, получающих терапию бисфосфонатом.
Пример 7. ΑοΙΚ^ι-Εο облегчает или предотвращает потерю костной массы, вызванную метастазированием рака молочной железы.
Предполагают, что 65-75% рака молочной железы метастазирует в кость, вызывая существенное повреждение структуры кости, увеличение риска переломов и вызывая боль и другие побочные эффекты. Авторы настоящего изобретения тестировали эффекты ΑсΐΚIIа-Ρс на модели на мышах рака молочной железы, метастазирующего в кость.
- 31 018221
Сублинию линии клеток рака молочной железы человека МЭА-МВ-231 (клон 2287) культивировали 1и уйго, и клетки собирали при плотности 5х106 клеток/мл. МОА-МВ-231 представляет собой линию клеток, которые являются высококомпетентными для засева в кость и вызывают повреждение кости, сходное с повреждением, вызванным метастазами в кости. 10 мл клеток инъецировали в большую берцовую кость бестимусной мыши иибе в возрасте 6 недель на сутки исследования 0. На сутки исследования 10 мышам вводили АсЕКНа-тРс (10 мг/кг/дважды в неделю/подкожно) (и=8) или носитель - РВ8 (и=7). Прогрессирование заболевания оценивали двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрией (Р1Х1Миз) с недельными интервалами. Мышей обрабатывали АсЕКПа-тРс в течение 4 недель, затем умерщвляли и большие берцовые кости (как после инъекции опухоли, так и без опухоли) собирали от каждого животного. Затем большие берцовые кости обрабатывали и подготавливали для микро-СТ и гистологического анализа.
Инъекция клеток МОА-МВ-231 в большую берцовую кость бестимусной мыши иибе стимулировала развитие остеолитических очагов в большой берцовой кости после инъекции по сравнению с контралатеральной ногой. Анализ микро-СТ проксимальной большой берцовой кости показал уменьшение на 62% объема губчатой ткани кости в несущих МОА-МВ-231 больших берцовых костях по сравнению с большой берцовой костью без опухоли у мышей после обработки носителем - РВ8. Обработка АсЕКПа-тРс приводила к увеличению на 70 или 147% в наивной или несущей опухоль большой берцовой кости соответственно по сравнению с носителем (р<0,01 для обеих). Несущие опухоль большие берцовые кости обработанных АсЕВПа-тРс мышей обладали плотностью губчатой ткани кости, сходной с наивными большими берцовыми костями обработанных УЕН мышей (р=0,39).
Таким образом, АсЕВПа-тРс является способным устранять повреждение кости, связанное с присутствием опухолевых клеток молочной железы в кости.
Пример 8. Альтернативные белки ЛсίКIIа-Рс.
Альтернативная конструкция может обладать делецией С-концевого хвоста (последних 15 аминокислот внеклеточного домена АсЕКПа). Последовательность для такой конструкции представлена ниже (часть Рс подчеркнута) (8ЕО ΙΌ N0: 12):
ΙΕΟΚδΕΤΟΕΟΕΗΡΝΑΝλνΕΚβΚΤΝρτσνΕΡΟΥαΟΚΟΚΚΚΗσΡΑΤΧνΚ.ΝΙδΟδΙΕίνΚΟα С\УГ.РР1ЫСУРКТРСУЕККР8РЕУУРСССЕПКМСКЕКР8УРРЕМТООСТНТСРРСРА РЕЕЕООР8УРЕГРРКРКРТЕМ18КТРЕУТСУУУРУ8НЕРРЕУКГК1УУУРСУЕУШАК ТКРКЕЕОУ№ТУКУУ8УЕТУЕНОР\УЕКСКЕУКСКУ8ЫКАЕРУР1ЕКТ18КАКаОРКЕ Ρ0νΥΤΕΡΡ8ΚΕΕΜΤΚΝ0ν8ΕΤαΕνΚ0ΡΥΡ8Π1ΑνΕ1Λ,Ε8Ν<30ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΡ8Ρϋ 5ΡΓΕΥ5ΚΕΤνΡΚ8ΚΐνθΟΟΝνΡ8Ο8νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤΟΚ$Ε8Ε8ΡΟΚ
Включение в качестве ссылки.
Полное содержание всех публикаций и патентов, упомянутых в настоящем описании, таким образом, приведено в качестве ссылки, как если бы было конкретно и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или патент приведены в качестве ссылки.
В то время как обсуждали конкретные варианты осуществления объекта, приведенное выше описание является иллюстративным, а не ограничивающим. Множество вариантов будут очевидными для специалистов в данной области после обзора этого описания и следующей ниже формулы изобретения. Полный объем изобретения следует определять исходя из пунктов формулы изобретения, вместе с полным объемом эквивалентов в них, и из описания, вместе с такими вариантами.

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение Ас®Ла-Ес слитого белка для получения лекарственного средства для лечения или профилактики множественной миеломы у больного.
  2. 2. Применение по п.1, где слитый белок Ас®Ла-Ес выбран из группы, состоящей из:
    a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90 или 95% идентичную 8Е0 ГО N0: 2;
    b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90 или 95% идентичную 8Е0 ГО N0: 3;
    c) полипептида, содержащего по меньшей мере 50 последовательных аминокислот из 8Е0 ГО N0: 2;
    б) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90 или 95% идентична 8Е0 ГО N0: 7; и
    е) полипептида с последовательностью 8Е0 ГО N0: 7.
  3. 3. Применение по п.2, где слитый белок АсЖПа-Ес обладает одной или несколькими из следующих характеристик:
    ί) связывает лиганд Ас®Ла с Кс по меньшей мере 10-7 М и ίί) ингибирует передачу сигнала Ас®Па в клетке.
  4. 4. Применение по пп.1-3, где указанный слитый белок АсЖЛа-Ес содержит один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из гликозилированной аминокислоты, пэгилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной группой, и аминокислоты, конъюгированной с органическим дериватизирующим агентом.
  5. 5. Применение по любому из пп.1-4, где слитый белок АсЖЛа-Ес представляет собой димер, сформированный из двух полипептидов, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 2, и где слитый белок Ас®Ла-Ес содержит три или более группы сиаловой кислоты.
  6. 6. Применение по любому из пп.1-5, где слитый белок Ас®Ла-Ес содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8Е0 ГО N0: 3.
  7. 7. Применение по любому из пп.1-5, где слитый белок Ас®Ла-Ес содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3.
  8. 8. Применение по любому из пп.1-5, где слитый белок Ас®Ла-Ес содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8Е0 ГО N0: 2.
  9. 9. Применение по любому из пп.1-5, где слитый белок Ас®Ла-Ес содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2.
  10. 10. Применение по любому из пп.1-5, где слитый белок Ас®Ла-Ес содержит от трех до пяти групп сиаловой кислоты.
  11. 11. Применение по любому из пп.1-10, где слитый белок Ас®Ла-Ес повышает массу скелетной мускулатуры больного по меньшей на 10%.
  12. 12. Применение по любому из пп.1-11, где слитый белок Ас®Па-Рс вводят до достижения его концентрации в сыворотке больного по меньшей мере до 200 нг/мл.
  13. 13. Применение по п.12, где слитый белок Ас®Па-Рс вводят до достижения его концентрации в сыворотке больного по меньшей мере 1000 нг/мл.
  14. 14. Применение по любому из пп.1-13, где слитый белок Ас®Па-Рс содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8Е0 ГО N0: 7.
  15. 15. Применение по любому из пп.1-13, где слитый белок Ас®Па-Рс содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 7.
  16. 16. Применение по любому из пп.1-15, где слитый белок Ас®Ла-Ес обладает временем полужизни в сыворотке от 15 до 40 суток у нормальных здоровых людей.
  17. 17. Применение по любому из пп.1-15, где слитый белок АсЖПа-Ес вводят пациенту не чаще чем один раз в неделю, один раз в месяц или один раз в три месяца.
  18. 18. Применение по любому из пп.1-17, где пациент в течение года до введения слитого белка Ас®Па-Ес получал или получает терапию антирезорбтивным средством.
  19. 19. Применение по любому из пп.1-18, где слитый белок Ас®Па-Рс вводят одновременно с введением антирезорбтивного средства.
  20. 20. Применение по п.18 или 19, где антирезорбтивное средство выбрано из группы, состоящей из бисфосфонатного средства, антагониста лиганда КАИК и антагониста остеопротегрина.
  21. 21. Применение по любому из пп.1-20, где слитый белок Ас®Па-Рс вводят в состав для введения одновременно с радиационной терапией цитотоксическим или химиотерапевтическим средством.
  22. 22. Применение по любому из пп.1-21, где слитый белок Ас®Ла-Ес снижает тяжесть течения миеломной опухоли у пациента.
EA200970747A 2007-02-09 2008-02-01 АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ EA018221B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90058007P 2007-02-09 2007-02-09
US93276207P 2007-05-31 2007-05-31
US93736507P 2007-06-26 2007-06-26
US52807P 2007-10-25 2007-10-25
PCT/US2008/001354 WO2008100384A2 (en) 2007-02-09 2008-02-01 Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970747A1 EA200970747A1 (ru) 2010-02-26
EA018221B1 true EA018221B1 (ru) 2013-06-28

Family

ID=39690668

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200970747A EA018221B1 (ru) 2007-02-09 2008-02-01 АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ
EA201690994A EA201690994A1 (ru) 2007-02-09 2008-02-01 Антагонисты активина-actriia и применение для стимуляции роста кости у больных раком
EA201300116A EA025371B1 (ru) 2007-02-09 2008-02-01 АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201690994A EA201690994A1 (ru) 2007-02-09 2008-02-01 Антагонисты активина-actriia и применение для стимуляции роста кости у больных раком
EA201300116A EA025371B1 (ru) 2007-02-09 2008-02-01 АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ

Country Status (25)

Country Link
US (4) US8173601B2 (ru)
EP (3) EP2120999B1 (ru)
JP (6) JP5574711B2 (ru)
KR (7) KR101670417B1 (ru)
CN (3) CN104548056B (ru)
AR (1) AR065289A1 (ru)
AU (1) AU2008216896B2 (ru)
BR (1) BRPI0807506B1 (ru)
CA (3) CA2913992C (ru)
CY (1) CY1113963T1 (ru)
DK (1) DK2120999T3 (ru)
EA (3) EA018221B1 (ru)
ES (2) ES2756725T3 (ru)
HK (1) HK1137366A1 (ru)
HR (1) HRP20120947T1 (ru)
IL (3) IL200242B (ru)
ME (1) ME02333B (ru)
MX (2) MX2009008510A (ru)
PL (1) PL2120999T3 (ru)
PT (1) PT2120999E (ru)
RS (1) RS52535B (ru)
SI (1) SI2120999T1 (ru)
TR (1) TR200906329T1 (ru)
TW (7) TWI459963B (ru)
WO (1) WO2008100384A2 (ru)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2332977B1 (en) 2004-07-23 2015-11-25 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides
DK1973559T3 (da) 2005-11-23 2013-03-25 Acceleron Pharma Inc Activin-ActRIIa antagonister samt anvendelser til fremme af knoglevækst
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
CN104524548A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
CN103920139B (zh) * 2007-02-01 2018-02-02 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途
TWI782836B (zh) 2007-02-02 2022-11-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
TWI459963B (zh) 2007-02-09 2014-11-11 Acceleron Pharma Inc 包含ActRIIa-Fc融合蛋白的醫藥組合物；ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途；ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途
CN107412734A (zh) * 2007-09-18 2017-12-01 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
KR20190049912A (ko) 2008-06-26 2019-05-09 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
KR20190128002A (ko) 2008-06-26 2019-11-13 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ 길항물질을 투약하는 방법 및 치료된 환자의 모니터링
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
TWI626945B (zh) 2008-08-14 2018-06-21 艾瑟勒朗法瑪公司 使用ｇｄｆ阱以增加紅血球水平
AU2010204985A1 (en) 2009-01-13 2011-08-04 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
EP2440576A4 (en) * 2009-06-08 2013-11-20 Acceleron Pharma Inc PROCESS FOR INCREASING THE NUMBER OF THERMOUS ADIPOCYTES
KR20210034684A (ko) 2009-06-12 2021-03-30 악셀레론 파마 인코포레이티드 절두된 ＡｃｔＲＩＩＢ-ＦＣ 융합 단백질
KR20120062874A (ko) * 2009-09-09 2012-06-14 악셀레론 파마 인코포레이티드 ＡｃｔＲＩＩｂ 길항제들와 이의 투약 및 용도
US20110129469A1 (en) * 2009-11-03 2011-06-02 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
EP2501400B1 (en) 2009-11-17 2017-11-01 Acceleron Pharma, Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
DK3284818T3 (da) 2010-01-26 2022-06-20 Celularity Inc Behandling af knoglerelateret kræft ved hjælp af placenta stamceller
JP2014502260A (ja) 2010-11-08 2014-01-30 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド Ａｃｔｒｉｉａ結合剤およびその使用
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
KR102279522B1 (ko) 2012-11-02 2021-07-19 셀진 코포레이션 골 및 다른 장애를 치료하기 위한 액티빈-actrii 길항제 및 용도
CA2898467C (en) 2013-01-18 2024-06-11 Biomeme Incorporated Analytic device
HRP20181939T4 (hr) * 2013-03-20 2022-05-13 Genzyme Corporation Postupci za liječenje osteogenesis imperfecta
JP2015159766A (ja) * 2014-02-27 2015-09-07 国立大学法人京都大学 クッシング症候群の検査方法、検査用バイオマーカー及び治療剤
ES2845650T3 (es) 2014-04-18 2021-07-27 Acceleron Pharma Inc Procedimientos para aumentar los niveles de glóbulos rojos y tratar la drepanocitosis
EP3154566B1 (en) 2014-06-13 2022-08-03 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for the treatment or prevention of a cutaneous ulcer in a subject that has anemia
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
HUE062189T2 (hu) 2014-12-03 2023-09-28 Celgene Corp Aktivin-ACTRII-antagonisták és alkalmazások mielodiszpláziás szindróma kezelésére
EP3298034A4 (en) 2015-05-20 2019-02-13 Celgene Corporation IN VITRO CELL CULTURE PROCEDURE FOR BETA THALASSEMIA BY MEANS OF ACTIVIN TYPE II RECEPTOR LIGANDS
CA3005975A1 (en) * 2015-11-23 2017-06-01 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating eye disorders
EP3496739B1 (en) * 2016-07-15 2021-04-28 Acceleron Pharma Inc. Compositions comprising actriia polypeptides for use in treating pulmonary hypertension
CN110461349A (zh) * 2016-11-10 2019-11-15 科乐斯疗法公司 激活素受体iia型变体及其使用方法
GB201620119D0 (en) 2016-11-29 2017-01-11 Pharmafox Therapeutics Ag Compounds
CN110494155A (zh) * 2017-02-01 2019-11-22 阿塞勒隆制药公司 用于提高免疫活性的TGFβ和ActRII拮抗剂
KR20240014600A (ko) 2017-03-24 2024-02-01 노바르티스 아게 심장질환 예방 및 치료 방법
WO2019055875A2 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Biomeme, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR AUTOMATIC SAMPLE PROCESSING
JP7258021B2 (ja) * 2017-11-09 2023-04-14 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビンＩＩａ型受容体変異体を含む医薬組成物
CA3087008A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iib variants and methods of use thereof
CN112543644A (zh) * 2018-07-24 2021-03-23 古德T细胞有限公司 一种预防和治疗免疫相关疾病的组合物
JP7483745B2 (ja) 2019-03-21 2024-05-15 バイオミーム インコーポレイテッド 多機能性分析デバイス
CA3192080A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Marc DEJOHN Portable devices and methods for analyzing samples

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005094871A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-13 Acceleron Pharma Inc. Bmp-3 propeptides and related methods
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
WO2007062188A2 (en) * 2005-11-23 2007-05-31 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth

Family Cites Families (206)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0637520B2 (ja) * 1985-07-03 1994-05-18 味の素株式会社 ポリペプチド
US4956282A (en) * 1985-07-29 1990-09-11 Calgene, Inc. Mammalian peptide expression in plant cells
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4973577A (en) * 1986-04-04 1990-11-27 The Salk Institute For Biological Studies FSH-releasing peptides
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
AU8761391A (en) 1990-09-13 1992-04-15 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides
US5208219A (en) * 1991-02-14 1993-05-04 Celtrix Pharmaceuticals Inc. Method for inducing bone growth
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
EP0542971A1 (en) 1991-05-10 1993-05-26 The Salk Institute For Biological Studies CLONING AND RECOMBINANT PRODUCTION OF RECEPTOR(S) OF THE ACTIVIN/TGF-$g(b) SUPERFAMILY
US6162896A (en) * 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
US5885794A (en) * 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
US20050186593A1 (en) 1991-05-10 2005-08-25 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
KR100255415B1 (ko) 1991-06-25 2000-05-01 브루스 엠. 에이센 비엠피-9 조성물
US6692925B1 (en) * 1992-11-17 2004-02-17 Ludwig Institute For Cancer Research Proteins having serine/threonine kinase domains, corresponding nucleic acid molecules, and their use
EP1475440A3 (en) * 1993-01-12 2004-11-17 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-3
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
KR100231640B1 (ko) 1993-05-12 1999-12-01 토마스 제이 데스로저 Bmp-10 조성물
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5831050A (en) 1993-06-07 1998-11-03 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor
ATE355369T1 (de) 1993-10-14 2006-03-15 Harvard College Verfahren zur induzierung und zur erhaltung neuronalen zellen
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5658876A (en) 1994-04-28 1997-08-19 The General Hospital Corporation Activin antagonists as novel contraceptives
US5545616A (en) * 1994-09-22 1996-08-13 Genentech, Inc. Method for predicting and/or preventing preterm labor
US5760010A (en) 1995-01-01 1998-06-02 Klein; Ira Method of treating liver disorders with a macrolide antibiotic
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
NZ306767A (en) 1995-04-11 2000-03-27 Univ Johns Hopkins Method of identifying molecular interactions employing counterselection and at least two hybrid molecules or two hybrid systems
EP0771873A3 (en) * 1995-10-27 1998-03-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. Neuronal cell-specific receptor protein
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US6004780A (en) * 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US20050244867A1 (en) * 1996-03-26 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
EP0939816A1 (en) 1996-10-25 1999-09-08 G.D. SEARLE &amp; CO. Circularly permuted erythropoietin receptor agonists
US6605699B1 (en) * 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
US6034062A (en) 1997-03-13 2000-03-07 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses
US6231880B1 (en) * 1997-05-30 2001-05-15 Susan P. Perrine Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders
ATE417927T1 (de) 1997-07-30 2009-01-15 Univ Emory Neue knochenmineralisierungsproteine, dna, vektoren, expressionssysteme
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
WO1999006559A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6696260B1 (en) * 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
CA2302525A1 (en) 1997-08-29 1999-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
US6953662B2 (en) * 1997-08-29 2005-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
WO1999018212A1 (fr) 1997-10-03 1999-04-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain naturel
US6696411B1 (en) * 1998-04-22 2004-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Canine erythropoietin gene and recombinant protein
EP1113799A4 (en) 1998-09-17 2004-06-09 Lilly Co Eli PROTEIN-BASED PREPARATION
DE69934995T2 (de) * 1998-09-22 2007-11-22 Long Yu Für den menschlichen wachstums-differenzierungsfaktor kodierende sequenz und polypeptid, welches durch solche dna-sequenz kodiert wird und verfahren zur herstellung
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6238860B1 (en) 1998-11-05 2001-05-29 Dyax Corp. Binding moieties for human parvovirus B19
US6777205B1 (en) * 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
CN100567322C (zh) 1999-01-21 2009-12-09 梅塔莫菲克斯公司 抑制生长分化因子活性的多肽及表达该多肽的细胞
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
CN1163262C (zh) * 1999-04-01 2004-08-25 上海益众生物技术有限公司 成骨生长肽药物组合物及制备方法和应用
AU777783B2 (en) 1999-04-19 2004-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Proliferation inhibitor for androgen-independent tumor
US6468543B1 (en) * 1999-05-03 2002-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4
SK8292002A3 (en) 1999-11-12 2002-12-03 Maxygen Holdings Ltd A conjugate exhibiting interferon gamma activity, nucleotide sequence encoding for a polypeptide fraction of conjugate, an expression vector and a host cell containing nucleotide sequence, pharmaceutical composition comprising the same and use thereof
AU777166B2 (en) 1999-12-15 2004-10-07 Research Development Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof
US20030224501A1 (en) 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP4487376B2 (ja) * 2000-03-31 2010-06-23 味の素株式会社 腎疾患治療剤
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
US20030215913A1 (en) 2000-07-19 2003-11-20 Enrique Alvarez Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides, and uses thereof
US6632180B1 (en) 2000-09-07 2003-10-14 John H. Laragh Method for evaluating and treating hypertension
DE10045591A1 (de) 2000-09-15 2002-04-04 Klaus Pfizenmaier Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine)
CA2418835A1 (en) 2000-10-16 2002-04-25 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7087224B2 (en) * 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
EP1345959B1 (en) 2000-11-20 2011-05-25 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Membrane scaffold proteins
EP1370287A2 (en) 2000-12-01 2003-12-17 Wyeth Method and composition for modulating bone growth
US20030082233A1 (en) 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
TW200526779A (en) * 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US20040132675A1 (en) * 2002-02-08 2004-07-08 Calvin Kuo Method for treating cancer and increasing hematocrit levels
US7294472B2 (en) 2001-03-14 2007-11-13 Caden Biosciences Method for identifying modulators of G protein coupled receptor signaling
WO2002074340A1 (fr) 2001-03-16 2002-09-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de fabrication d'une preparation a liberation continue
AU2002256371B2 (en) 2001-04-26 2008-01-10 Amgen Mountain View Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
DK1436003T3 (da) 2001-05-24 2010-03-15 Zymogenetics Inc TACI-immunoglobulin-fusionsproteiner
IL159015A0 (en) * 2001-05-25 2004-05-12 Genset Sa Polypeptides, their preparation and use
JP2003012699A (ja) 2001-07-04 2003-01-15 Japan Science & Technology Corp 抗麻酔性貝毒抗体の製法、新規抗体、該抗体を用いるｅｌｉｓａ測定キット、該製法による系標識毒標品
AUPR638101A0 (en) 2001-07-13 2001-08-09 Bioa Pty Limited Composition and method for treatment of disease
AU2002318743B2 (en) 2001-07-17 2008-02-21 Teijin Limited Method of selecting substance characterized by assaying PPARD activating effect and drug
US6855344B2 (en) * 2001-07-17 2005-02-15 Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US7320789B2 (en) * 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
US20060234918A1 (en) 2001-12-19 2006-10-19 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for treating and preventing cancers that express the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of hormones and receptors
US20030144203A1 (en) 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
US6998118B2 (en) 2001-12-21 2006-02-14 The Salk Institute For Biological Studies Targeted retrograde gene delivery for neuronal protection
US20030224397A1 (en) 2002-02-11 2003-12-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
AU2003217612A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-09 Wyeth GASP1: a follistatin domain containing protein
US20030219846A1 (en) 2002-02-28 2003-11-27 Pfizer Inc. Assay for activity of the ActRIIB kinase
AU2003232485A1 (en) 2002-04-18 2003-10-27 Mtm Laboratories Ag Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer
KR20050083635A (ko) 2002-08-16 2005-08-26 와이어쓰 Ｂｍｐ-2 에스트로겐 반응 요소 및 이의 사용 방법
US7261893B2 (en) * 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
AU2002953327A0 (en) 2002-12-12 2003-01-09 Monash University Methods of diagnosing prognosing and treating activin associated diseases and conditions
ES2255467T3 (es) 2003-02-07 2009-05-01 Prometic Biosciences Inc. Acidos grasos de cadena de longitud media, gliceridos y analogos como estimuladores de eritropoyesis.
US20040197828A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Gaddy Dana P. Method for diagnosis and treatment of bone turnover
US20070184052A1 (en) * 2003-05-09 2007-08-09 Lin Herbert Y Soluble tgf-b type III receptor fusion proteins
RU2322261C2 (ru) 2003-06-02 2008-04-20 Уайт Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний
EP1636270B1 (en) 2003-06-16 2016-07-20 UCB Pharma S.A. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
WO2005009460A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Medexis, S.A. Pharmaceutical composition comprising activin a, alk-4 or derivatives thereof for the treatment of ophthalmic disorders or cancer
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
AU2005206277B2 (en) 2004-01-22 2011-06-23 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US20050197292A1 (en) * 2004-01-30 2005-09-08 Glennda Smithson Compositions and methods for treating T-cell mediated pathological conditions
EP1730186A2 (en) 2004-03-31 2006-12-13 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
WO2005113590A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Bmp10 propeptides and related methods
EP1755648A2 (en) * 2004-05-27 2007-02-28 Acceleron Pharma Inc. Cerberus/coco derivatives and uses thereof
CA2572330A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Acceleron Pharma Inc. Gdf3 propeptides and related methods
US8617815B2 (en) 2004-08-05 2013-12-31 The Regents Of The University Of California Molecules with effects on cellular development and function
EP1778275A2 (en) 2004-08-12 2007-05-02 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using gdf-8 inhibitors
EP1804824B1 (en) 2004-09-29 2017-01-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Fsh and fsh receptor modulator compositions and methods for inhibiting osteoclastic bone resorption and bone loss in osteoporosis
US7358361B2 (en) * 2004-10-08 2008-04-15 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Biophosphonate compounds and methods for bone resorption diseases, cancer, bone pain, immune disorders, and infectious diseases
CA2587424A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
WO2006088972A2 (en) 2005-02-16 2006-08-24 The General Hospital Corporation Use of modulatirs of compounds of tgf-beta superfamily to regulate hepcidin-mediated iron metabolism
US20060213667A1 (en) * 2005-03-28 2006-09-28 Mashburn Benny D Screen apparatus and method
WO2006115274A1 (ja) 2005-04-26 2006-11-02 Ajinomoto Co., Inc. 骨髄赤血球前駆細胞分化促進剤
CA2618482C (en) 2005-08-19 2014-10-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
JP2007099764A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 Ajinomoto Co Inc 血糖低下剤
EP1931697B1 (en) 2005-09-28 2010-09-15 ZymoGenetics, Inc. Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CA2632544C (en) 2005-12-06 2014-09-23 Amgen Inc. Use of myostatin antagonist for treating the effects of hypogonadism
EP1966183A4 (en) 2005-12-20 2010-12-29 Merck Frosst Canada Ltd HETEROAROMATIC COMPOUNDS AS INHIBITORS OF STEAROYL-COENZYME A-DELTA-9-DESATURASE
CA2634940A1 (en) 2005-12-21 2007-07-05 Schering Corporation Treatment of nonalcoholic fatty liver disease using cholesterol lowering agents and h3 receptor antagonist/inverse agonist
WO2007076127A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Biogen Idec Ma Inc Condensed imidazoles or pyrazoles and their use as transforming growth factor modulators
EP2016423B1 (en) * 2006-01-20 2011-07-13 Beckman Coulter, Inc. Methods of detection of iron deficiency
US7820721B2 (en) 2006-01-25 2010-10-26 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
WO2007101060A2 (en) 2006-02-28 2007-09-07 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
WO2007120767A2 (en) * 2006-04-14 2007-10-25 Amgen Inc. Agonist erythropoietin receptor antibodies
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
CA2652235A1 (en) * 2006-05-09 2007-11-22 Hemaquest Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating blood disorders
CN104095838A (zh) * 2006-07-21 2014-10-15 莱因实验室公司 醋酸钙的液体组合物
GB0615129D0 (en) 2006-07-29 2006-09-06 Univ Cardiff Anti-cancer activity of BMP-9 and BMP-10 and their use in cancer therapies
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
US7547781B2 (en) * 2006-09-11 2009-06-16 Curis, Inc. Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2008060139A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein
US20100003190A1 (en) 2006-12-08 2010-01-07 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for protecting renal tubular epithelial cells from radiocontrast nephropathy (RCN)
EP2103628A4 (en) 2006-12-14 2012-02-22 Forerunner Pharma Res Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY
CN104524548A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
US20100028332A1 (en) 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
CN103920139B (zh) 2007-02-01 2018-02-02 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途
TWI782836B (zh) * 2007-02-02 2022-11-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
TWI459963B (zh) 2007-02-09 2014-11-11 Acceleron Pharma Inc 包含ActRIIa-Fc融合蛋白的醫藥組合物；ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途；ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途
TW201718635A (zh) 2007-03-06 2017-06-01 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
EP2150560A1 (en) 2007-06-01 2010-02-10 Wyeth Methods and compositions for modulating bmp-10 activity
WO2009009059A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Biogen Idec Ma Inc. Spiro compounds as antagonists of tgf-beta
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
JP2010535708A (ja) 2007-08-03 2010-11-25 ビオマリン アイジーエー リミテッド デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬物併用
GB0715938D0 (en) 2007-08-15 2007-09-26 Vastox Plc Method of treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2009025651A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 University Of Maine System Board Of Trustees Biologically active peptide and method of using the same
US20100279409A1 (en) 2007-09-13 2010-11-04 Neil Robson Method for modifying celluar immune resonse by modulating activin activity
CN107412734A (zh) 2007-09-18 2017-12-01 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
PE20091163A1 (es) * 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
KR20100099193A (ko) 2007-11-21 2010-09-10 암젠 인크 Ｗｉｓｅ 결합 항체 및 에피토프
CA2718403A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 The General Hospital Corporation Inhibitors of the bmp signaling pathway
FR2930460B1 (fr) * 2008-04-25 2010-05-28 Valois Sas Distributeur de fragrance.
US20110104133A1 (en) 2008-05-06 2011-05-05 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
WO2009137075A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
KR20190128002A (ko) 2008-06-26 2019-11-13 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ 길항물질을 투약하는 방법 및 치료된 환자의 모니터링
KR20190049912A (ko) 2008-06-26 2019-05-09 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
TWI626945B (zh) * 2008-08-14 2018-06-21 艾瑟勒朗法瑪公司 使用ｇｄｆ阱以增加紅血球水平
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
WO2010059861A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
NZ627111A (en) 2008-11-26 2015-10-30 Amgen Inc Variants of activin iib receptor polypeptides and uses thereof
AU2010204985A1 (en) 2009-01-13 2011-08-04 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
US8110355B2 (en) 2009-02-20 2012-02-07 GenRemedy, LLC Methods for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis
DK2424895T3 (en) 2009-04-27 2017-12-18 Novartis Ag Compositions and Methods for Increasing Muscle Growth
EP2440576A4 (en) 2009-06-08 2013-11-20 Acceleron Pharma Inc PROCESS FOR INCREASING THE NUMBER OF THERMOUS ADIPOCYTES
KR20210034684A (ko) 2009-06-12 2021-03-30 악셀레론 파마 인코포레이티드 절두된 ＡｃｔＲＩＩＢ-ＦＣ 융합 단백질
EP3838919A1 (en) 2009-08-13 2021-06-23 Acceleron Pharma Inc. Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
KR20120062874A (ko) 2009-09-09 2012-06-14 악셀레론 파마 인코포레이티드 ＡｃｔＲＩＩｂ 길항제들와 이의 투약 및 용도
US20110129469A1 (en) 2009-11-03 2011-06-02 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
EP2501400B1 (en) 2009-11-17 2017-11-01 Acceleron Pharma, Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
WO2012027065A2 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
EP2726099B1 (en) 2011-07-01 2018-07-25 Novartis AG Method for treating metabolic disorders
EA034563B1 (ru) 2011-10-17 2020-02-20 Акселерон Фарма Инк. Способ лечения или предотвращения перегрузки железом у пациента с талассемией
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
WO2013063536A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
CN104023731A (zh) 2011-10-28 2014-09-03 帕仁塔生物科技有限公司 治疗粘液分泌亢进的方法
MX358358B (es) 2011-12-19 2018-08-15 Amgen Inc Polipeptidos de receptores de activina variantes y sus usos.
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9663569B2 (en) 2012-06-14 2017-05-30 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center Use of blocking agents of bone morphogenic protein (BMP) signalling for the treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
JP6298762B2 (ja) 2012-07-02 2018-03-20 協和発酵キリン株式会社 抗ｂｍｐ９抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤
CN112933223A (zh) 2012-10-24 2021-06-11 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法
CN113604550A (zh) 2012-10-24 2021-11-05 细胞基因公司 用于治疗贫血症的生物标志物
WO2014064292A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) A method for preventing or treating atrial fibrillation
KR102279522B1 (ko) 2012-11-02 2021-07-19 셀진 코포레이션 골 및 다른 장애를 치료하기 위한 액티빈-actrii 길항제 및 용도
MX2015005839A (es) 2012-11-08 2015-12-17 Clearside Biomedical Inc Metodos y dispositivos para el tratamiento de trastornos oculares en sujetos humanos.
WO2014093531A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Modulation of myofiber repair by anti-myostatin in strategies with stem cells
US20140220033A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an Anti-Activin-A Compound to a Subject
US20160184458A1 (en) 2013-03-14 2016-06-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
SG11201600212VA (en) 2013-08-14 2016-02-26 Novartis Ag Methods of treating sporadic inclusion body myositis
JP2017505428A (ja) 2013-12-16 2017-02-16 パランタ バイオサイエンス リミテッド 診断及び治療の方法
EP3094751A4 (en) 2014-01-14 2017-06-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
CN105992951A (zh) 2014-01-27 2016-10-05 诺华股份有限公司 预测肌萎缩的生物标志物、方法和用途
JP6601687B2 (ja) 2014-03-31 2019-11-06 大日本住友製薬株式会社 進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び治療剤
ES2845650T3 (es) 2014-04-18 2021-07-27 Acceleron Pharma Inc Procedimientos para aumentar los niveles de glóbulos rojos y tratar la drepanocitosis
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
MX2016016281A (es) 2014-06-13 2017-03-31 Santa Maria Biotherapeutics Inc Polipeptidos receptores formulados y metodos relacionados.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005094871A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-13 Acceleron Pharma Inc. Bmp-3 propeptides and related methods
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
US20060068468A1 (en) * 2004-07-23 2006-03-30 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
WO2007062188A2 (en) * 2005-11-23 2007-05-31 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
US20070249022A1 (en) * 2005-11-23 2007-10-25 John Knopf Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAKAI ET AL.: "Activin release from bone coupled to bone resorption in organ culture of neonatal mouse calvaria". BONE, vol. 26, no. 3, 2000, pages 235-240, XP009105409, the whole document *
SAKAI R. ET AL.: "Activin increases bone mass and mechanical strength of lumbar vertebrae in aged ovariectomized rats". BONE, PERGAMON PRESS., OXFORD, GB, vol. 27, no. 1, 1 July, 2000 (2000-07-01), pages 91-96, XP002294252, ISSN: 8756-3282, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202140531A (zh) 2021-11-01
MX2009008510A (es) 2010-01-15
AU2008216896A2 (en) 2011-07-14
TR200906329T1 (tr) 2010-01-21
IL200242A0 (en) 2010-04-29
HRP20120947T1 (hr) 2012-12-31
JP2015091870A (ja) 2015-05-14
TWI525102B (zh) 2016-03-11
CN104189889A (zh) 2014-12-10
EA025371B1 (ru) 2016-12-30
KR101672156B1 (ko) 2016-11-02
CN104548056B (zh) 2022-09-09
DK2120999T3 (da) 2012-12-03
TW201907953A (zh) 2019-03-01
JP2020176139A (ja) 2020-10-29
EP2484372A1 (en) 2012-08-08
TW201615660A (zh) 2016-05-01
CY1113963T1 (el) 2016-07-27
EA200970747A1 (ru) 2010-02-26
EP2120999B1 (en) 2012-08-29
CA3039330A1 (en) 2008-08-21
US20210261682A1 (en) 2021-08-26
TWI459963B (zh) 2014-11-11
CA2913992C (en) 2019-05-21
IL257848B (en) 2021-04-29
BRPI0807506B1 (pt) 2022-02-15
CA2677605C (en) 2016-01-19
KR20100014850A (ko) 2010-02-11
KR20180083967A (ko) 2018-07-23
CA2913992A1 (en) 2008-08-21
KR20190026047A (ko) 2019-03-12
ES2394123T3 (es) 2013-01-22
JP5574711B2 (ja) 2014-08-20
US20170190784A1 (en) 2017-07-06
US9572865B2 (en) 2017-02-21
IL281715A (en) 2021-05-31
JP6132861B2 (ja) 2017-05-24
IL200242B (en) 2018-03-29
AU2008216896A1 (en) 2008-08-21
TW201500371A (zh) 2015-01-01
BRPI0807506A2 (pt) 2013-07-30
WO2008100384A2 (en) 2008-08-21
WO2008100384A3 (en) 2008-12-11
PL2120999T3 (pl) 2013-01-31
KR20200054317A (ko) 2020-05-19
CN104548056A (zh) 2015-04-29
MX368173B (es) 2019-09-23
EA201690994A1 (ru) 2016-09-30
HK1137366A1 (en) 2010-07-30
CN101687016A (zh) 2010-03-31
TW201934141A (zh) 2019-09-01
KR20150115965A (ko) 2015-10-14
PT2120999E (pt) 2012-12-10
EA201300116A1 (ru) 2013-09-30
CA3039330C (en) 2021-11-09
IL257848A (en) 2018-04-30
EP2120999A2 (en) 2009-11-25
ES2756725T3 (es) 2020-04-27
US8173601B2 (en) 2012-05-08
US20090142333A1 (en) 2009-06-04
TWI606062B (zh) 2017-11-21
KR101670417B1 (ko) 2016-11-10
KR20160129095A (ko) 2016-11-08
AR065289A1 (es) 2009-05-27
AU2008216896B2 (en) 2013-06-20
ME02333B (me) 2013-04-30
EP2481415B1 (en) 2019-09-11
JP2013224317A (ja) 2013-10-31
JP2010518079A (ja) 2010-05-27
JP2017071624A (ja) 2017-04-13
TWI667038B (zh) 2019-08-01
TW200900076A (en) 2009-01-01
CA2677605A1 (en) 2008-08-21
CN101687016B (zh) 2014-12-31
TW201808334A (zh) 2018-03-16
US20130004489A1 (en) 2013-01-03
RS52535B (en) 2013-04-30
JP2018162312A (ja) 2018-10-18
SI2120999T1 (sl) 2012-12-31
KR20210082540A (ko) 2021-07-05
EP2481415A1 (en) 2012-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018221B1 (ru) АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ
JP6195885B2 (ja) アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび骨成長を促進するための使用
JP2021036916A (ja) Ｂｍｐ−ａｌｋ３アンタゴニストおよび骨成長促進のためのその使用
JP2009517051A5 (ru)
WO2009137075A1 (en) Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
AU2019222887A1 (en) Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth
EA042183B1 (ru) АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ
AU2013204959A1 (en) Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients