JP2008516634A - セミソフトcクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、免疫応答を刺激するのに有用である特定のCクラスセミソフトCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドに関する。特に、そのオリゴヌクレオチドは、アレルギー(例えば、アレルギー性鼻炎および喘息)、癌ならびに感染症(B型肝炎およびC型肝炎)を処置するのに有用である。また、本発明は、以下のオリゴヌクレオチドを提供する:
5’ TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3’(配列番号27)
を含むヌクレオチドであって、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示し、そしてここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示す、オリゴヌクレオチド。
5’ TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3’(配列番号27)
を含むヌクレオチドであって、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示し、そしてここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示す、オリゴヌクレオチド。
Description
(発明の分野)
本発明は、一般的に、減少した腎臓の炎症効果を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド、その組成物、およびこの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用する方法に関連する。特に、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、アレルギーおよび喘息、癌ならびに感染症の処置において特に有効であるCクラスセミソフトオリゴヌクレオチドである。
本発明は、一般的に、減少した腎臓の炎症効果を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド、その組成物、およびこの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用する方法に関連する。特に、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、アレルギーおよび喘息、癌ならびに感染症の処置において特に有効であるCクラスセミソフトオリゴヌクレオチドである。
(発明の背景)
細菌DNAは、B細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫刺激効果を有するが、脊椎動物DNAは、B細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化しない(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;および非特許文献4における概説)。細菌DNAのこれらの免疫刺激効果は、特定の塩基構成(base context)における非メチル化CpGジヌクレオチド(CpGモチーフ)の存在の結果であることが、新たに理解される。非メチル化CpGジヌクレオチドは、細菌DNAにおいて一般的であるが、脊椎動物DNAにおいてはメチル化されており、そして一般的に知られていない(非特許文献5;非特許文献6)。細菌DNAの免疫刺激効果は、これらのCpGモチーフを含む合成のオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)によって模倣され得る。このようなCpG ODNは、ヒトおよびマウスの白血球に対する高い刺激効果を有し、この刺激効果は、B細胞の増殖;サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌;ナチュラルキラー(NK)細胞の細胞溶解活性およびIFN−γの分泌;ならびに樹状細胞(DC)の活性化および共起刺激分子の発現し、そしてサイトカイン(特に、Th1様T細胞の応答の発生を促すのに重要であるTh1様サイトカイン)を分泌する他の抗原提示細胞の活性化を誘導する。ネイティブなホスホジエステル骨格のCpG ODNのこれらの免疫刺激効果は、そのCpGモチーフが、メチル化されるか、GpCに変換されるか、または別の方法で除去されるか、もしくは変化する場合、上記効果を劇的に減少させる点で、高度にCpG特異的である(非特許文献5;非特許文献7)。
細菌DNAは、B細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫刺激効果を有するが、脊椎動物DNAは、B細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化しない(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;および非特許文献4における概説)。細菌DNAのこれらの免疫刺激効果は、特定の塩基構成(base context)における非メチル化CpGジヌクレオチド(CpGモチーフ)の存在の結果であることが、新たに理解される。非メチル化CpGジヌクレオチドは、細菌DNAにおいて一般的であるが、脊椎動物DNAにおいてはメチル化されており、そして一般的に知られていない(非特許文献5;非特許文献6)。細菌DNAの免疫刺激効果は、これらのCpGモチーフを含む合成のオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)によって模倣され得る。このようなCpG ODNは、ヒトおよびマウスの白血球に対する高い刺激効果を有し、この刺激効果は、B細胞の増殖;サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌;ナチュラルキラー(NK)細胞の細胞溶解活性およびIFN−γの分泌;ならびに樹状細胞(DC)の活性化および共起刺激分子の発現し、そしてサイトカイン(特に、Th1様T細胞の応答の発生を促すのに重要であるTh1様サイトカイン)を分泌する他の抗原提示細胞の活性化を誘導する。ネイティブなホスホジエステル骨格のCpG ODNのこれらの免疫刺激効果は、そのCpGモチーフが、メチル化されるか、GpCに変換されるか、または別の方法で除去されるか、もしくは変化する場合、上記効果を劇的に減少させる点で、高度にCpG特異的である(非特許文献5;非特許文献7)。
初期の研究において、免疫刺激性のCpGモチーフは、式プリン−プリン−CpG−ピリミジン−ピリミジンに従うと考えられた(非特許文献5;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10)。しかし、ここで、マウスリンパ球は、この「式」に従わないホスホジエステルCpGモチーフと遜色なく反応し(非特許文献11)、そして同じことが、ヒトのB細胞および樹状細胞についても当てはまる(非特許文献7;非特許文献12)ことが、明らかである。
最近、CpGオリゴヌクレオチドの数種の異なるクラスが、記載されている。1つのクラスは、強力にB細胞を活性化するが、IFN−αおよびNK細胞の活性化の誘導については、比較的弱く;このクラスは、Bクラスと称される。BクラスCpGオリゴヌクレオチドは、代表的に、完全に安定化され、そして特定の好ましい塩基構成内に非メチル化CpGジヌクレオチドを含む。例えば、特許文献1;特許文献2;特許文献3;特許文献4;特許文献5;および特許文献6を参照のこと。CpGオリゴヌクレオチドの別のクラスは、B細胞およびNK細胞を活性化し、およびIFN−αを誘導し;このクラスは、Cクラスと称されている。CクラスCpGオリゴヌクレオチドは、最初に特徴付けられたように、代表的には完全に安定化され、Bクラス型の配列、およびGCリッチなパリンドロームまたはGCリッチなほぼ完全なパリンドロームを含む。このクラスは、同時係属中の特許文献7(2002年8月19日出願)、および特許文献8の下で公開された関連するPCT特許出願第PCT/US02/26468号に記載されている。
米国特許第6,194,388号明細書
米国特許第6,207,646号明細書
米国特許第6,214,806号明細書
米国特許第6,218,371号明細書
米国特許第6,239,116号明細書
米国特許第6,339,068号明細書
米国特許出願第US10/224,523号明細書
国際公開第WO 03/015711号パンフレット
Tokunaga,T.ら、Jpn.J.Cancer Res.、1988年、第79巻、p.682−686
Tokunaga,T.ら、JNCI、1984年、第72巻、p.955−962
Messina,J.P.ら、J.Immunol.、1991年、第147巻、p.1759−1764
Krieg、「Applied Oligonucleotide Technology」、1998年、C.A.SteinおよびA.M.Krieg(編)、John Wiley and Sons,Inc.、New York、NY、p.431−448
Kriegら、Nature、1995年、第374巻、p.546−549
Krieg、Biochim.Biophys.Acta、1999年、第93321巻、p.1−10
Hartmannら、Proc.Natl.Acad.Sci USA、1999年、第96巻、p.9305−10
Pisetsky、J.Immunol.、1996年、第156巻、p.421−423
Hackerら、EMBO J.、1998年、第17巻、p.6230−6240
Lipfordら、Trends in Microbiol.、1998年、第6巻、p.496−500
Yiら、J.Immunol.、1998年、第160巻、p.5898−5906
Liang、J.Clin.Invest.、1996年、第98巻、p.1119−1129
(発明の要旨)
特定のヌクレオチドの間に1つ以上の安定化されていない結合を選択的に含む特定のCクラスCpGオリゴヌクレオチドの免疫刺激性の特性は、顕著な活性を有し、そしてアレルギーおよび喘息の処置において特に有用であることが、見出されている。その安定化されていない結合は、好ましくは天然の結合(すなわち、ホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合)である。安定化されていない結合は、代表的に、ヌクレアーゼ消化に比較的影響されやすいが、必ずしもそうではない。本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、5’側のCと隣接する3’側のGとの間に位置する少なくとも1つの安定化されていない結合を含み、その5’側のCおよびその3’側のGの両方は、内部ヌクレオチドである。
特定のヌクレオチドの間に1つ以上の安定化されていない結合を選択的に含む特定のCクラスCpGオリゴヌクレオチドの免疫刺激性の特性は、顕著な活性を有し、そしてアレルギーおよび喘息の処置において特に有用であることが、見出されている。その安定化されていない結合は、好ましくは天然の結合(すなわち、ホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合)である。安定化されていない結合は、代表的に、ヌクレアーゼ消化に比較的影響されやすいが、必ずしもそうではない。本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、5’側のCと隣接する3’側のGとの間に位置する少なくとも1つの安定化されていない結合を含み、その5’側のCおよびその3’側のGの両方は、内部ヌクレオチドである。
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Th1様免疫応答を誘導するのに有用である。従って、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ワクチン接種のためのアジュバントとして有用であり、そしてそれらの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、癌、感染症、アレルギー、および喘息を含む疾患を処置するのに有用である。それらの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、任意の目的のために免疫刺激性オリゴヌクレオチドの長期または頻回の投与を必要とする任意の状態において特に有用であると考えられるが、喘息およびアレルギー性疾患(例えば、アレルギー性鼻炎)の処置において特に有用である。
本発明は、部分的に免疫刺激性CpG含有オリゴヌクレオチドに関する。1つの局面において、本発明は、以下の式:
5’ TC_GX1C_GX2N1X3C_GN2CG 3’(配列番号26)
を有するオリゴヌクレオチドである。上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を有する。「_」は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す。N1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、N2は、0ヌクレオチド長〜9ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを指す。X1、X2、およびX3は、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、X1、X2、およびX3は、Tである。
5’ TC_GX1C_GX2N1X3C_GN2CG 3’(配列番号26)
を有するオリゴヌクレオチドである。上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を有する。「_」は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す。N1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、N2は、0ヌクレオチド長〜9ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを指す。X1、X2、およびX3は、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、X1、X2、およびX3は、Tである。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5’ TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3’(配列番号27)を含み得る。1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*T*N1 *T*C_G*G*C*G*CN1G*C*C*G 3’(配列番号27)を含み得る。いくつかの実施形態において、N1は、3ヌクレオチド長または2ヌクレオチド長である。他の実施形態において、N1は、0ヌクレオチド長である。
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C__G*C*G*C*C*G 3’(配列番号2)を含み、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す。必要に応じて、特に示される場合、5’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し得、そして3’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示し得る。
他の実施形態において、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(配列番号3)を含み得、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す。必要に応じて、特に示される場合、5’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し得、そして3’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示し得る。
別の局面において、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、以下の式:TC_GX1C_GX2C_GX3TC_GGCGC−GN33’(配列番号28)
を有する。
を有する。
N3は、1ヌクレオチド長〜5ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを指す。1つの実施形態においてN3は、5ヌクレオチドである。X1、X2、およびX3は、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、X1およびX3は、Tである。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5’ TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG 3’(配列番号4)を含み得、ここで上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す。1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(配列番号4)を含み得る。必要に応じて、特に示される場合、5’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し得、そして3’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示し得る。
本発明の別の局面に従って、以下の式:
5’ TTC_GX2C_GN1X1_GX3C_GTT 3’(配列番号24)
を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、提供される。上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す。N1は、1ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを指す。X1は、ピリミジンである。X2およびX3は、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、X2およびX3は、Tである。
5’ TTC_GX2C_GN1X1_GX3C_GTT 3’(配列番号24)
を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、提供される。上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す。N1は、1ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを指す。X1は、ピリミジンである。X2およびX3は、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、X2およびX3は、Tである。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5’ TTC_GTC_GTTTX1_GTC_GTT 3’(配列番号25)を含み得る。別の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5’ T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*X1_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号25)を含み得る。いくつかの実施形態において、X1は、TまたはCである。
上記オリゴヌクレオチドは、5’ T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号5)含み得、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す。必要に応じて、特に示される場合、5’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し得、そして3’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示し得る。
上記オリゴヌクレオチドは、5’ T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号6)を含み得、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す。必要に応じて、特に示される場合、5’は、上記オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し得、そして3’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示し得る。本発明のいくつかの局面において、そのオリゴヌクレオチドは、以下の式:
本発明の他の局面において、上記オリゴヌクレオチドは、以下の式:
本発明の他の局面において、上記オリゴヌクレオチドは、以下の式:
本発明の他の局面において、以下:
T*C_G*T*C_G*T*C
を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチドが提供される。必要に応じて、上記オリゴヌクレオチドは、以下:
T*C_G*T*C_G*T*C
を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチドが提供される。必要に応じて、上記オリゴヌクレオチドは、以下:
他の局面において、以下:
T*C_G*T*T*C_G*G
を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチドが提供される。必要に応じて、上記オリゴヌクレオチドは、以下:
T*C_G*T*T*C_G*G
を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチドが提供される。必要に応じて、上記オリゴヌクレオチドは、以下:
本発明のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物が、提供される。
いくつかの実施形態において、上記組成物は、噴霧器または吸入器中に処方される。上記吸入器は、定量噴霧吸入器であり得る。代替的に、上記吸入器は、粉末吸入器である。
他の実施形態において、上記薬学的組成物は、化学療法剤を含有し得る。なお他の実施形態において、上記組成物は、抗ウイルス剤を含有し得る。
上記薬学的組成物は、皮下投与、経口投与または鼻腔内投与のために処方される薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物中にある。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、エアロゾルとして処方される。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、アジュバントまたはサイトカインをさらに含む。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、抗原をさらに含み、ここでそのオリゴヌクレオチドは、ワクチンアジュバントである。
1つの実施形態において、上記抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、および腫瘍抗原からなる群より選択される。1つの実施形態において、上記抗原は、核酸核酸ベクターによってコードされる。1つの実施形態において、上記抗原は、ペプチド抗原である。1つの実施形態において、上記抗原は、上記オリゴヌクレオチドまたは免疫刺激性核酸分子に共有結合される。別の実施形態において、上記抗原は、上記オリゴヌクレオチドまたは免疫刺激性核酸分子に共有結合されない。
1つの実施形態において上記ホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合は、ホスホジエステルである。1つの実施形態において、上記ホスホジエステル様結合は、ボラノホスホネート(boranophosphonate)またはジアステレオマー的に純粋なRpホスホロチオエートであり得る。
1つの実施形態において、上記安定化された骨格は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される複数のヌクレオチド間結合を含む。1つの実施形態において、上記安定化された骨格は、複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、4ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長である。
他の局面において、本発明は、喘息を有するか、または有する危険にある被験体に対して、喘息を処置するのに有効な量で本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによって喘息を処置するための方法である。
なお他の局面において、本発明は、アレルギーを有するか、または有する危険にある被験体に対して、アレルギーを処置するのに有効な量で本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによってアレルギーを処置するための方法である。1つの実施形態において、上記被験体は、アレルギー性鼻炎を有する。1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、粘膜表面に投与される。他の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、アエロゾル処方物において投与される。必要に応じて、上記オリゴヌクレオチドは、鼻腔内に投与される。
サイトカイン産生を誘導するための方法が、本発明の別の局面に従って提供される。その方法は、被験体に対して、IL−6、IL−8、IL−12、IL−18、TNF、IFN−α、ケモカイン、およびIFN−γからなる群より選択されるサイトカインを誘導するのに有効な量で、本明細書中に記載される免疫刺激性CpGオリゴヌクレオチド投与することによって行なわれる。
別の局面において、本発明は、抗原または治療用化合物(例えば、抗微生物剤)と組み合わせた、本明細書中に記載されるCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの組成物である。上記抗微生物剤は、例えば、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗細菌剤または抗真菌剤であり得る。
本明細書中に記載されるCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを備える徐放性デバイスの組成物が、本発明の別の局面に従って提供される。
上記組成物は、必要に応じて、薬学的キャリアを含有し得、そして/または送達デバイス中に処方され得る。いくつかの実施形態において、上記送達デバイスは、カチオン性脂質、細胞浸透性タンパク質、および徐放性デバイスからなる群より選択される。1つの実施形態において、上記徐放性デバイスは、生分解性ポリマー、またはマイクロ粒子である。
本発明の別の局面によって、免疫応答を刺激する方法が、提供される。その方法は、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、被験体における免疫応答を誘導するのに有効な量で、その被験体に投与する工程を包含する。好ましくは、上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、経口的にか、局所的にか、徐放性デバイスによってか、経粘膜的にか、全身的にか、非経口的にか、または筋肉内に投与される。上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、粘膜表面に投与される場合、それは、粘膜の免疫応答または全身性の免疫応答を誘導するのに有効な量で送達され得る。好ましい実施形態において、上記粘膜表面は、口腔の表面、鼻腔の表面、直腸の表面、膣の表面、または眼の表面からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、その方法は、上記被験体を抗原に曝す工程を包含し、その免疫応答は、抗原特異的な免疫応答である。いくつかの実施形態において、上記抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原およびペプチド抗原からなる群より選択される。
CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、広範囲の免疫応答を誘発し得る。例えば、これらのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Th2をTh1免疫応答に変えるために使用され得る。CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、リンパ球(例えば、B細胞およびT細胞)、樹状細胞、およびNK細胞のような免疫細胞を活性化するために使用され得る。上記活性化は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボ、すなわち、上記被験体から免疫細胞を単離し、その免疫細胞と、その免疫細胞を活性化するのに有効な量のCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを接触させ、そしてその活性化された免疫細胞をその被験体に再投与することによって行われ得る。いくつかの実施形態において、上記樹状細胞は、癌抗原を提示する。上記樹状細胞は、エキソビボにて上記癌抗原に曝され得る。
CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドによって産生される上記免疫応答はまた、サイトカイン産生(例えば、IL−6、IL−8、IL−12、IL−18、TNF、IFN−α、ケモカイン、およびIFN−γの産生)の誘導を生じ得る。
さらに別の実施形態において、上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、癌を処置するのに有用である。本発明の他の局面に従って、上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、癌を発症する危険を有する被験体において癌を予防する(例えば、癌を発症する危険を減少させる)のに有用である。上記癌は、胆道癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌(例えば、小細胞癌および非小細胞癌)、黒色腫、神経芽細胞種、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、甲状腺癌、および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫からなる群より選択され得る。いくつかの重要な実施形態において、上記癌は、骨の癌、脳の癌および中枢神経系の癌、結合組織の癌、食道癌、眼の癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、口腔癌、皮膚癌、および精巣癌からなる群より選択される。
必要に応じて、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、抗癌療法との組み合わせで投与される場合、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、癌治療(例えば、抗癌療法)に対する癌細胞の反応性を増加させるために使用され得る。上記抗癌療法は、例えば、化学療法、ワクチン(例えば、インビトロにてプライミングした樹状細胞のワクチンまたは癌抗原のワクチン)または抗体ベースの療法であり得る。この後者の療法はまた、例えば、癌細胞の細胞表面抗原に対して特異的な抗体を投与する工程を包含し、その免疫応答は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を生じる。1つの実施形態において、上記抗体は、以下からなる群より選択され得る:リブタキシン(Ributaxin)、ハーセプチン、クアドラメット(Quadramet)、パノレックス(Panorex)、IDEC−Y2B8、BEC2、C225、オンコリム(Oncolym)、SMART M195、ATRAGEN、オバレックス(Ovarex)、ベキサール(Bexxar)、LDP−03、ior t6、MDX−210、MDX−11、MDX−22、OV103、3622W94、抗VEGF、ゼナパックス(Zenapax)、MDX−220、MDX−447、MELIMMUNE−2、MELIMMUNE−1、CEACIDE、プレターゲット(Pretarget)、NovoMAb−G2、TNT、Gliomab−H、GNI−250、EMD−72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm−C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗FLK−2、MDX−260、ANA Ab、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 AbおよびImmuRAIT−CEA。
従って、本発明のいくつかの局面によって、癌を有するか、または癌を有する危険にある被験体は、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与され、そして抗癌療法を施される。いくつかの実施形態において、上記抗癌療法は、化学療法剤、免疫療法剤および癌ワクチンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、癌治療薬(cancer medicament)は、タキソール、またはカルボプラチンとパクリタキセルとの組み合わせである。
癌の予防または処置を指向する方法のさらに別の実施形態において、上記被験体は、インターフェロン−αをさらに投与され得る。
他の局面における本発明は、被験体において疾患を予防するための方法に関連する。その方法は、免疫系の反応性を促進して、被験体において疾患を予防するために、その被験体に対してCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを定期的に投与する工程を包含する。本発明の予防方法を使用して予防されることが求められる疾患または状態の例としては、微生物感染(例えば、性感染症)、および食物アレルギー由来のアナフィラキシーショックが挙げられる。
他の局面において、本発明は、上記被験体に対して、生得的な免疫応答を活性化するのに有効な量でCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与することによって、生得的な免疫応答を誘導するための方法である。
本発明の別の局面によって、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を処置するか、または予防するための方法が、提供される。その方法は、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を有するか、またはそれらを有する危険がある被験体に対して、ウイルス感染もしくはレトロウイルス感染を処置するか、または予防するのに有効な量の、本発明の組成物のいずれかを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎もしくはC型肝炎)、HIV、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスによって引き起こされる。
細菌感染を処置するか、または予防するための方法が、本発明の別の局面によって提供される。その方法は、細菌感染を有するか、または細菌感染を有する危険がある被験体に対して、細菌感染を処置するか、または予防するのに有効な量の、本発明の組成物のいずれかを投与する工程を包含する。1つの実施形態において、その細菌感染は、細胞内の細菌に起因する。
別の局面において、本発明は、寄生虫感染を有するか、または寄生虫感染を有する危険がある被験体に対して、寄生虫感染を処置するか、または予防するのに有効な量の、本発明の組成物のいずれかを投与することによって、寄生虫感染を処置するか、または予防するための方法である。1つの実施形態において、その寄生虫感染は、細胞内の寄生虫に起因する。別の実施形態において、その寄生虫感染は、非駆虫性の寄生虫に起因する。
いくつかの実施形態において、上記被験体は、ヒトであり、そして他の実施形態において、その被験体は、犬、猫、馬、牛、豚、七面鳥、山羊、魚、猿、鶏、ラット、マウス、または羊からなる群より選択される非ヒト脊椎動物である。
別の局面において、本発明は、被験体に対して、TH1免疫応答をもたらすのに有効な量で本発明の組成物のいずれかを投与することによって、TH1型免疫応答を誘導するための方法に関連する。
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患を有する危険がある被験体に対して、自己免疫疾患を処置するか、または予防するのに有効な量の、本発明の組成物のいずれかを投与することによって、自己免疫疾患を処置するための方法に関する。
他の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、上記被験体に対して、サイトカインの発現を誘導するのに有効な量で送達される。必要に応じて、そのサイトカインは、IL−6、TNFα、IFNα、IFNγおよびIP−10からなる群より選択される。他の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、上記被験体に対して、免疫応答をTh2に偏った応答(biased response)からTh1に偏った応答へ変化させるのに有効な量で送達される。
いくつかの局面における本発明は、気道リモデリングを処置するための方法であり、その方法は、被験体に対して、その被験体において気道リモデリングを処置するのに有効な量で、CGジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する。1つの実施形態において、その被験体は、喘息、慢性閉塞性肺疾患を有するか、または喫煙者である。他の実施形態において、その被験体は、喘息の症状を有さない。
免疫応答を刺激するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用もまた、本発明の局面として提供される。
免疫応答を刺激するためおよび本発明の方法のいずれかを実施するための医薬の製造における本発明のオリゴヌクレオチドの使用もまた、提供される。
本発明のそれぞれの限界は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。これにより、本発明のそれぞれの限界は、いずれか1つの要素、または要素の組み合わせを含み、その限界は、本発明のそれぞれの局面に含まれ得ることが認められる。
(詳細な説明)
Cクラスセミソフト(semi−soft)免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットが、本発明に従って提供される。本明細書中に記載される本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、同様のまたは増強された効力、腎臓、肝臓および脾臓に対する全身性曝露の低下を含む改善された特性を有し、そして注射部位での反応原性が低下し得る。出願人はある機構に拘束されることはないが、これらの改善された特性は、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドのホスホジエステル「ヌクレオチド間結合」またはホスホジエステル様「ヌクレオチド間結合」内の戦略上の位置に関連すると考えられる。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド間結合」という用語は、核酸分子における2つの隣接するヌクレオチドを接続する共有結合的な骨格の結合をいう。共有結合的な骨格の結合は、代表的には、改変されたリン酸結合または未改変のリン酸結合であるが、他の改変も可能である。従って、nヌクレオチド長の直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でn−1のヌクレオチド間結合を有する。これらの共有結合的な骨格の結合は、本発明の教示による免疫刺激性オリゴヌクレオチドにおいて改変されてもされなくてもよい。
Cクラスセミソフト(semi−soft)免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットが、本発明に従って提供される。本明細書中に記載される本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、同様のまたは増強された効力、腎臓、肝臓および脾臓に対する全身性曝露の低下を含む改善された特性を有し、そして注射部位での反応原性が低下し得る。出願人はある機構に拘束されることはないが、これらの改善された特性は、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドのホスホジエステル「ヌクレオチド間結合」またはホスホジエステル様「ヌクレオチド間結合」内の戦略上の位置に関連すると考えられる。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド間結合」という用語は、核酸分子における2つの隣接するヌクレオチドを接続する共有結合的な骨格の結合をいう。共有結合的な骨格の結合は、代表的には、改変されたリン酸結合または未改変のリン酸結合であるが、他の改変も可能である。従って、nヌクレオチド長の直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でn−1のヌクレオチド間結合を有する。これらの共有結合的な骨格の結合は、本発明の教示による免疫刺激性オリゴヌクレオチドにおいて改変されてもされなくてもよい。
特に、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、「内部ジヌクレオチド」を含む。内部ジヌクレオチドは、一般に、ヌクレオチド間結合によって接続される隣接するヌクレオチドの任意の対を意味するが、ここでヌクレオチドの対におけるどのヌクレオチドも末端ヌクレオチドではなく、すなわち、ヌクレオチドの対におけるどのヌクレオチドもオリゴヌクレオチドの5’末端または3’末端を規定するヌクレオチドではないものとする。従って、nヌクレオチド長である直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でn−1のジヌクレオチド、およびn−3だけの内部ジヌクレオチドを有する。内部ジヌクレオチドにおける各々のヌクレオチド間結合は内部ヌクレオチド間結合である。従って、nヌクレオチド長である直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でn−1のヌクレオチド間結合およびn−3だけの内部ヌクレオチド間結合を有する。従って、戦略的に位置されるホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合とは、核酸配列におけるヌクレオチドの任意の対の間に位置するホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合をいう。いくつかの実施形態では、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、5’末端または3’末端に最も近いヌクレオチドのいずれか対の間にも位置しない。
本発明は、少なくともいくつかの局面において、本明細書中に記載される特定のCクラスセミソフトオリゴヌクレオチドが重要な免疫刺激性活性を有し、そして好ましくはアレルギーおよび喘息の処置において有用であるという驚くべき知見に基づく。これらの分子は、少なくとも同じ免疫刺激性活性を有するか、または多くの場合、同じヌクレオチド配列を有する対応する完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドより、高い免疫刺激性活性を有する。
セミソフトオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの内部ピリミジン−プリン(YZ、好ましくはCG)ジヌクレオチド内にのみ生じるホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を有する、部分的に安定化された骨格を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。セミソフトオリゴヌクレオチドは、一般に、対応する完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドに対して増加した免疫刺激性の効力を有する。セミソフトオリゴヌクレオチドのより高い効力に起因して、セミソフトオリゴヌクレオチドは、所望の生物学的効果を達成するために、従来の完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドより低い有効濃度で使用され得、そして従来の完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドより低い有効量を有する。
完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、最大の用量反応を示し得るのに対して、本発明のセミソフトオリゴヌクレオチドは、対応する完全に安定化した免疫刺激性オリゴヌクレオチドについての至適濃度を超えて、より高い濃度に及ぶ、単調に増加する用量反応曲線(TLR9刺激によってアッセイされる場合)を有するようである。従って、本発明のセミソフトオリゴヌクレオチドは、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドより高い免疫刺激を誘導し得ると考えられる。
20ヌクレオチド長未満の完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、より長い(例えば、24ヌクレオチド長)完全に安定化されたオリゴヌクレオチドと比較して低い免疫刺激性活性を有し得るのに対して、16ヌクレオチド長の短さのセミソフトオリゴヌクレオチドは、20ヌクレオチド長を超える完全に安定化されたオリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性と少なくとも等しい免疫刺激性活性を有することが見出された。
いくつかの場合において、6マーのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激性活性を欠くようである場合、ホスホロチオエート結合のホスホジエステルのただ1つの内部CGヌクレオチド間結合による置換が、免疫刺激性活性を有し、対応する6マーを生じることを見出した。
従って、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサイズ(すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに従ったヌクレオチド残基の数)はまた、そのオリゴヌクレオチドの刺激活性に寄与し得る。細胞中への取り込みの促進に関して、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、最小で6ヌクレオチド残基の長さを有し得る。6ヌクレオチドより大きい任意のサイズのオリゴヌクレオチド(数kb長でさえ)は、十分な免疫刺激性モチーフが存在する場合、本発明に従って、免疫応答を誘導し得る。なぜなら、より大きい核酸は、細胞内で分解されるからである。4ヌクレオチド程度の短さのセミソフトオリゴヌクレオチドはまた、それらが細胞の内部に送達され得る場合に、免疫刺激性であり得ると本発明者らによって考えられる。本発明に従う特定の好ましい実施形態において、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、4ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長である。代表的な実施形態において、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、6ヌクレオチド長と40ヌクレオチド長との間であるか、または10ヌクレオチド長と40ヌクレオチド長との間である。本発明に従う特定の好ましい実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、6ヌクレオチド長と19ヌクレオチド長との間であるか、または6ヌクレオチド長と24ヌクレオチド長との間である。
セミソフトオリゴヌクレオチドの上記の特性は、一般に、内部CGジヌクレオチドに伴うホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合の増加性の「用量」によって増加することが考えられる。従って、例えば、5つの内部CGジヌクレオチドを有する所与のオリゴヌクレオチド配列に関して、5つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、4つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドより免疫刺激性であり、次に、4つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、3つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドより、免疫刺激性であり、次に、3つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、2つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドより、免疫刺激性であり、次に、2つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、1つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドより、免疫刺激性である。重要なことには、1つでさえ、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を含むことは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部CGヌクレオチド間結合を含まないより、有益であると考えられる。ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合の数に加えて、核酸の長さに沿った位置もまた、効力に影響し得る。
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、血清における急速な分解から一般に保護される。本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた一般に、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドを分解し得る特定のまたは過剰なヌクレアーゼ活性を有する特定の組織を除いて、ほとんどの組織において急速な分解から保護される。このことは、その特定の組織において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの減少が生じる。そうでなければこの免疫刺激性オリゴヌクレオチドの蓄積は、分解抵抗性オリゴヌクレオチドを利用する長期治療からの所望されない効果をもたらし得る。本発明のオリゴヌクレオチドは一般に、好ましい内部位置におけるホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間結合に加えて、分解に対して抵抗性である5’末端および3’末端を含む。このような分解抵抗性末端は、対応する未改変の末端を上回るエキソヌクレアーゼ消化に対する抵抗性の増大を生じる任意の適切な改変を含んでもよい。例えば、この5’末端および3’末端はこの骨格の少なくとも1つのリン酸塩の改変を含むことによって安定化され得る。好ましい実施形態において、各々の末端での骨格の少なくとも1つのリン酸塩修飾は独立して、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、ホスホロジチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合またはメチルホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。別の実施形態では、この分解抵抗性末端は、3’末端でペプチド結合またはアミド結合によって接続された1つ以上のヌクレオチド単位を含む。さらに他の安定化末端としては、以下にさらに記載されるものが挙げられるがこれらに限定されず、この安定化末端は、本発明によって包含されることが意図される。
上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、内部CGジヌクレオチド内であり、かつ必要に応じて、内部CGジヌクレオチドに隣接した、ホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合を含む。このようなCGジヌクレオチドは、頻繁に免疫刺激性モチーフの一部である。しかし、オリゴヌクレオチドがあらゆる免疫刺激性モチーフ内にホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合を含む必要はない。さらなるホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合はまた、これらの他の点では「安定化されたオリゴヌクレオチド」のより急速な腎臓消化のために維持されてもよい。
ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、天然に見出される核酸の結合特性の型である。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、酸素原子の2つの架橋によって隣接され、そしてまた2つのさらなる酸素原子(一方は荷電しており、そして他方は荷電していない)によって結合されたリン原子を含む。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、上記オリゴヌクレオチドの組織半減期を減少させることが重要である場合に、特に好ましい。
ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、化学的に、そして/またはジアステレオマーとしてホスホジエステルに類似する、リン含有架橋基である。ホスホジエステルに対する類似性の尺度は、ヌクレアーゼ消化に対する感受性、およびRNAse Hを活性化する能力を含む。従って、例えば、ホスホジエステルのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対して感受性であるが、ホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対して感受性ではない一方で、ホスホジエステルのオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドの両方は、RNAse Hを活性化する。好ましい実施形態において、ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、ボラノホスフェート(または同等に、ボラノホスホネート)結合である。米国特許第5,177,198号;同第5,859,231号;同第6,160,109号;同第6,207,819号;Sergueevら、(1998)J Am Chem Soc 129:9417−27。別の好ましい実施形態において、ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、ジアステレオマーとして純粋なRpホスホロチオエートである。ジアステレオマーとして純粋なRpホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ消化に対して、より感受性であり、そして混合型Spホスホロチオエート、またはジアステレオマーとして純粋なSpホスホロチオエートより、RNAse Hを良好に活性化すると考えられる。本発明の目的のために、用語「ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合」が具体的にはホスホロジチオエートヌクレオチド間結合およびメチルホスホネートヌクレオチド間結合を除外することに、留意すべきである。
本発明の免疫刺激性核酸分子は、キメラ骨格を有する。本発明の目的に関しては、キメラ骨格とは、部分的に安定化された骨格をいい、少なくとも1つのヌクレオチド間結合がホスホジエステルまたはホスホジエステル様であり、そして少なくとも1つの他のヌクレオチド間結合が安定化されたヌクレオチド間結合であり、この少なくとも1つのホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合および少なくとも1つの安定化された結合が異なる。ボラノホスホネート結合は、この骨格のキメラ的な性質の目的に関して、ホスホジエステル結合に比べて安定化されていることが報告されているので、ボラノホスホネート結合はその状況に応じて、ホスホジエステル様結合であるか、または安定化されている結合であるかのいずれかとして分類され得る。例えば、本発明によるキメラ骨格は、1つの実施形態において、少なくとも1つのホスホジエステル(ホスホジエステルまたはホスホジエステル様)結合および少なくとも1つのボラノホスホネート(安定化)結合を含む。別の実施形態において、本発明によるキメラ骨格は、ボラノホスホネート(ホスホジエステルまたはホスホジエステル様)結合およびホスホロチオエート(安定化)結合を含み得る。「安定化されたヌクレオチド間結合」とは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合に比べて、インビボの分解(例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを介した)に比較的抵抗性であるヌクレオチド間結合を意味するものとする。好ましい安定化されたヌクレオチド間結合としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートおよびメチルホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限定されない。他の安定化されたヌクレオチド間結合としては、ペプチド、アルキル、デホスホおよび上記のその他が挙げられるが、これらに限定されない。
ホスホロチオエートのような改変された骨格は、ホスホラミデート化学反応またはH−ホスホネート化学反応のいずれかを利用する、自動化された技術を使用して合成され得る。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第4,469,863号に記載されるように作製され得、そしてアルキルホスホトリエステル(荷電した酸素部分が、米国特許第5,023,243号および欧州特許第092,574号に記載されるようにアルキル化される)は、市販の試薬を使用する自動固相合成によって調製され得る。他のDNA骨格改変および他のDNA骨格置換をなすための方法が、記載されてきた。Uhlmann,E.ら,Chem.Rev.90:544,1990;Goodchild,J.,Bioconjugate Chem.1:165,1990。キメラオリゴヌクレオチドを調製するための方法もまた、公知である。例えば、Uhlmannらに対して発行された特許が、このような技術を記載している。
混合型の骨格改変ODNは、市販されているDNA合成機および標準的なホスホラミダイト化学反応を使用して合成され得る。(F.E.Eckstein、「Oligonucleotides and Analogues−A Practical Approach」、IRL Press、Oxford、UK、1991、ならびにM.D.MatteucciおよびM.H.Caruthers、Tetrahedron Lett.21、719(1980))。カップリングした後、PS結合が、Beaucage試薬(R.P.Iyer、W.Egan、J.B.ReganおよびS.L.Beaucage、J.Am.Chem.Soc.112、1253(1990))(アセトニトリル中に0.075M)またはフェニルアセチルジスルフィド(PADS)を使用した硫化(sulfurization)を行い、次いで無水酢酸、2,6−ルチジンを含むテトラヒドロフラン(1:1:8;v:v:v)、およびN−メチルイミダゾール(テトラヒドロフラン中に16%)によりキャップ形成することによって導入される。このキャップ形成する工程は、ホスホロチオエート結合が配置されるべき位置における望ましくないホスホジエステル(PO)結合の形成を最小化するために硫化反応の後に行われる。例えば、CpGジヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合の導入の場合、中間体のリン(III)は、水/ピリジン中のヨウ素の溶液を用いた処理によって酸化される。固体支持体からの切断および濃アンモニアを用いた処理による最終的な脱保護(50℃にて15時間)の後、上記ODNは、NaCl勾配(例えば、緩衝液A:アセトニトリル/水=1:4/v:v(pH6.8)中の10mM NaH2PO4;緩衝液B:アセトニトリル/水=1:4/v:v中の10mM NaH2PO4、1.5M NaCl;1ml/分にて30分間で5〜60%のB)を使用したGen−Pak Faxカラム上でのHPLCによってか、またはキャピラリーゲル電気泳動によって分析される。ODNは、HPLCによってか、またはSource High Performanceカラム(Amersham Pharmacia)上でのFPLCによって精製され得る。HPLCの均質な分画は、合わせられ、そしてC18カラムを介してか、または限外濾過によって脱塩される。そのODNを、MALDI−TOF質量分析によって分析し、予測された質量を確認した。
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、他の改変を含み得る。これらは、非イオン性DNAアナログ(例えば、アルキル−ホスフェートおよびアリール−ホスフェート(ここで、荷電したホスホネートの酸素がアルキル基またはアリール基によって置換される)、ホスホジエステル、および荷電した酸素部分がアルキル化されるアルキルホスホトリエステル)を含む。いずれかの末端または両方の末端にてジオール(例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール)を含む核酸はまた、ヌクレアーゼ分解に対して十分に抵抗性であることを示した。
本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答を排除することが見出された特定の配列を含む核酸である。免疫応答を排除するこれらの特定の配列は、「免疫刺激性モチーフ」と称され、そして免疫刺激性モチーフを含むオリゴヌクレオチドは、「免疫刺激性核酸分子」および同等に「免疫刺激性核酸」または「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」と称される。従って、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの免疫刺激性モチーフを含む。好ましい実施形態では、この免疫刺激性モチーフは、「内部免疫刺激性モチーフ」である。用語「内部免疫刺激性モチーフ」とは、この免疫刺激性モチーフ配列の5’末端および3’末端の両方に連結された少なくとも1つのヌクレオチドによって、このモチーフ配列よりも長い、さらに長い核酸配列内のモチーフ配列の位置をいう。
この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、「CpGジヌクレオチド」である免疫刺激性モチーフを含む。CpGジヌクレオチドは、メチル化されてもメチル化されなくてもよい。少なくとも1つのメチル化されていないCpGジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、メチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチド配列(すなわち、リン酸結合によって連結される、メチル化されていない5’シチジン、およびそれに続く3’グアノシン)を含み、そして免疫系を活性化する核酸分子である;このような免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、CpGオリゴヌクレオチドである。CpGオリゴヌクレオチドは、米国特許第6,194,388号;同第6,207,646号;同第6,214,806号;同第6,218,371号;同第6,239,116号;および同第6,339,068号を含む、多数の発行された特許、公開された特許出願および他の刊行物において記載されている。少なくとも1つのメチル化CpGジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、メチル化されたシトシン−グアニンジヌクレオチド配列(すなわち、リン酸結合によって連結される、メチル化されていない5’シチジン、およびそれに続く3’グアノシン)を含み、そして免疫系を活性化するオリゴヌクレオチドである。
異なるクラスのCpGオリゴヌクレオチドが存在することが、最近記載されている。1つのクラスはB細胞活性化について強力であるが、IFN−αおよびNK細胞の活性化を誘導するには比較的弱い;このクラスは、Bクラスと称されている。このBクラスCpGオリゴヌクレオチドは、代表的に、完全に安定化され、そして特定の好ましい塩基構成内に、メチル化されていないCpGジヌクレオチドを含む。例えば、米国特許第6,194,388号;同第6,207,646号;同第6,214,806号;同第6,218,371号;同第6,239,116号および同第6,339,068号を参照のこと。別のクラスは、IFN−αおよびNK細胞の活性化を誘導するのに強力であるが、B細胞を刺激するには比較的弱い;このクラスは、Aクラスと称されている。このAクラスCpGオリゴヌクレオチドは、代表的に、5’末端および3’末端に安定化されたポリG配列、そして少なくとも6つのヌクレオチドからなる中心の回文構造のホスホジエステルCpGジヌクレオチドを含む配列を有する。例えば、公開された特許出願PCT/US00/26527(WO01/22990)を参照のこと。
CpGオリゴヌクレオチドのさらに別のクラスはB細胞およびNK細胞を活性化し、そしてIFN−αを誘導する;このクラスは、Cクラスと称されている。このCクラスCpGオリゴヌクレオチドは、最初に特徴付けられたように、代表的には完全に安定化され、Bクラス型の配列、およびGCリッチなパリンドロームまたはGCリッチなほぼ完全なパリンドロームを含む。このクラスは、US2003/0148976として公開された同時係属中の米国特許出願10/224,523(2002年8月19日出願)、およびWO2005/042018として公開された関連するPCT出願を伴うUS10/978,283(2004年10月29日出願)(これらの内容の全体は、参考として本明細書中に援用される)に記載されている。
Cクラスオリゴヌクレオチドはまた、C型CpG ODNと称される。特定の実施形態において、このC CpG ODNは、モチーフの組み合わせを含み、1つのモチーフは、CGリッチなパリンドロームまたは中和(neutralizing)モチーフであり、そして別のモチーフは、刺激性モチーフ(例えば、CpGモチーフまたは配列TCGTCG)である。
上記C CpG ODNは、以下の式を有し得る:5’X1DCGHX23’。X1およびX2は、独立して、0ヌクレオチド長〜10ヌクレオチド長の任意の配列である。Dは、C以外のヌクレオチドであり。Cは、シトシンであり。Gは、グアニンである。Hは、G以外のヌクレオチドである。その核酸配列はまた、この核酸配列はまた、X1のすぐ5’側またはX2のすぐ3’側に位置する、PおよびNからなる群より選択される核酸配列をさらに含む。Nは、B細胞中和配列である。Nは、CGGトリヌクレオチドで始まり、かつ少なくとも10ヌクレオチド長である。Pは、GCリッチなパリンドロームを含む少なくとも10ヌクレオチド長の配列である。
いくつかの実施形態において、上記免疫刺激核酸は、5’NX1DCGHX23’、5’X1DCGHX2N3’、5’PX1DCGHX23’、5’X1DCGHX2P3’、5’X1DCGHX2PX33’、5’X1DCGHPX33’、5’DCGHX2PX33’、5’TCGHX2PX33’、または5’DCGHPX33’である。X3は、0ヌクレオチド長〜10ヌクレオチド長の任意の配列である。他の実施形態において、その免疫刺激核酸は、5’DCGHP3’である。
必要に応じて、Dおよび/またはHは、チミン(T)である。
他の実施形態において、HはTであり、そしてX2は、CG、CGT、CGTT、CGTTT、またはCGTTTTである。
他の実施形態によると、HはTであり、そしてX2は、CGまたはCGTTTTである。
他の実施形態によると、Cは、メチル化されていない。
いくつかの実施形態において、Nは、少なくとも4つのCGジヌクレオチド、および2つ以下のCCGトリヌクレオチドを含む。
必要に応じて、Pは、少なくとも1つのイノシンを含む。
上記核酸はまた、5’末端または3’末端にポリT配列を含み得る。
あるいは、C CpG ODNは、以下の式を有し得る:5’N1PyGN2P3’。N1は、1ヌクレオチド長〜6ヌクレオチド長の任意の配列である。いくつかの実施形態において、N1は、少なくとも50%がピリミジンであり、好ましくは、少なくとも50%がTである。他の実施形態において、N1は、少なくとも1つのCGモチーフ、少なくとも1つのTCGモチーフ、少なくとも1つのCIモチーフ、少なくとも1つのTCIモチーフ、少なくとも1つのIGモチーフ、または少なくとも1つのTIGモチーフを含む。他の実施形態において、N1は、TCGGまたはTCGHである。Hは、G以外のヌクレオチドである。
Pyは、ピリミジンである。いくつかの実施形態において、Pyは、非メチル化Cである。
N2は、0ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長の任意の配列である。いくつかの実施形態において、N2は、少なくとも50%がピリミジンであるか、または少なくとも50%がTである。他の実施形態において、N2は、いかなるポリGモチーフもポリAモチーフも含まない。
Pは、少なくとも10ヌクレオチド長の配列を含む、GCリッチなパリンドロームである。いくつかの実施形態において、Pは、完全にパリンドロームである。他の実施形態において、Pは、1個と3個との間の個数連続する介在ヌクレオチドを有するパリンドロームである。必要に応じて、その介在ヌクレオチドは、TGであり得る。他の実施形態において、Pは、少なくとも3つのCヌクレオチド、少なくとも4つのCヌクレオチド、もしくは少なくとも5つのCヌクレオチド、および少なくとも3つのGヌクレオチド、少なくとも4つのGヌクレオチド、もしくは少なくとも5つのGヌクレオチドを含む。他の実施形態によると、Pは、少なくとも1つのイノシンを含む。
1つの実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、少なくとも3分の2がGおよびCである塩基含量を有する。別の実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、少なくとも81%がGおよびCである塩基含量を有する。いくつかの実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、少なくとも12ヌクレオチド長である。このGCリッチなパリンドロームは、CおよびGのみから構成され得る。いくつかの実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、CでもGでもない少なくとも1つのヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、少なくとも1つのCGGトリマー、少なくとも1つのCCGトリマー、または少なくとも1つのCGCGテトラマーを含む。いくつかの実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、少なくとも4つのCGジヌクレオチドを含む。特定の好ましい実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、中心にあるCGジヌクレオチドを有する。
特定の実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、CGGCGCGCGCCG(配列番号58)、CGGCGGCCGCCG(配列番号59)、CGACGATCGTCG(配列番号60)またはCGACGTACGTCG(配列番号61)である。
特定の実施形態において、このGCリッチなパリンドロームは、CGCGCGCGCGCG(配列番号62)、GCGCGCGCGCGC(配列番号63)、CCCCCCGGGGGG(配列番号64)、GGGGGGCCCCCC(配列番号65)、CCCCCGGGGG(配列番号66)、またはGGGGGCCCCC(配列番号67)である。
いくつかの実施形態において、N1PyGN2は、TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT、およびTCGTCGTからなる群より選択される、配列である。
長さが13ヌクレオチド〜100ヌクレオチドの免疫刺激核酸が、本発明の他の局面に従って提供される。この核酸は、以下の式を有する:5’N1PyG/IN2P3’。G/Iは、GまたはIのいずれかである単一のヌクレオチドを指す。Gはグアニンであり、Iはイノシンである。
N1は、1ヌクレオチド長〜6ヌクレオチド長の任意の配列である。Pyは、ピリミジンである。N2は、0ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長の任意の配列である。
Pは、パリンドロームを含む少なくとも10ヌクレオチド長の配列である。いくつかの実施形態において、Pは、GCリッチなパリンドロームである。他の実施形態において、Pは、ICリッチなパリンドロームである。
いくつかの実施形態において、N1PyIN2は、TCITCITTTT(配列番号62)である。本明細書中で改変Cクラスオリゴヌクレオチドと称されるクラスのオリゴヌクレオチドは、特徴的に、溶液中でモノマーである。これらの核酸分子は、インビトロで分子内の二重鎖構造を形成し得、それらをヌクレアーゼ消化に対して安定にすると考えられる。これらの同じ核酸分子は、分子間の二重鎖構造を形成し得、そしておそらく、これらの核酸分子がその生物学的活性を発揮すると考えられるエンドソーム内の区画の環境中で、さらに高い次数の構造を形成し得るとも考えられる。
改変Cクラスオリゴヌクレオチドは、3つの一般式を有する。式I:
1つの実施形態において、N1、N2、....Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn#の各々は、C、G、またはそれらの改変物(modification)から選択され、ここでCは、Gと塩基対を形成する。
1つの実施形態において、N1、N2、....Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn#の各々は、T、A、またはそれらの改変物から選択され、そしてTは、Aと塩基対を形成する。
これらの実施形態および他の実施形態において、C、G、A、およびTの各々は、対応する塩基(シトシン、グアニン、アデニン、およびチミン)を有するデオキシヌクレオチドを指し得る。1つの実施形態において、N1、N2、....Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn#の各々は、C、T、A、G、またはそれらの改変物から選択され、そしてCは、Gと塩基対を形成し、Tは、Gと塩基対を形成し、Aは、Tと塩基対を形成し、そしてAは、Gと塩基対を形成する。
1つの実施形態において、N1、N2、....Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn#の各々は、ワトソン−クリック型の塩基対を形成する、未改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドから選択される。
1つの実施形態において、N1、N2、....Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn#の各々は、非ワトソン−クリック型の塩基対を形成する、未改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドから選択される。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも1つのホスホジエステル結合を有する部分的に安定化された骨格を含む。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも1つの安定化されたヌクレオチド間結合を有する骨格を含む。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、全てのホスホロチオエート結合である。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、Y1R1またはY2R2の少なくとも1つを連結するホスホジエステル結合を有する部分的に安定化された骨格を含む。
1つの実施形態において、Y1は、Cである。
1つの実施形態において、R1は、Gである。
1つの実施形態において、Y1は、Cであり、そしてR1は、Gである。
1つの実施形態において、X1またはX2は、Tである。
1つの実施形態において、X1は、Tであり、X2は、Tであり、Y1は、Cであり、R1は、Gであり、そしてkは、1である。
1つの実施形態において、X1は、Tであり、X2は、Tであり、Y1は、Cであり、R1は、Gであり、kは、1であり、pは、1であり、NおよびN’およびZ3は、それぞれ、0個のヌクレオチドを含み、そしてZ2は、TTTTまたはd(UUUU)である。
1つの実施形態において、S2は、非ヌクレオチド性リンカーである。
1つの実施形態において、S2は、少なくとも1つの無塩基のdSpacer残基を含む。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの分枝した非ヌクレオシド結合を含む。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも1つのダブラー(doubler)単位、少なくとも1つのトレブラー(trebler)単位、または少なくとも1つのダブラー単位と少なくとも1つのトレブラー単位とを含む。
1つの実施形態において、S1は、ダブラー単位またはトレブラー単位である。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの2’5’−ヌクレオシド間結合、5’5’−ヌクレオシド間結合、3’3’−ヌクレオシド間結合、2’2’−ヌクレオシド間結合、または2’3’−ヌクレオシド間結合を含む。
1つの局面において、本発明は、式IIの免疫刺激性核酸分子を提供する。
1つの実施形態において、Z1(Nn)(Nn−1)は、TYRであり、Yは、シトシンまたは改変シトシンであり、そしてRは、グアニンまたは改変グアニンである。
1つの実施形態において、1つの実施形態において、N1、N2、....Nn−1、Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn−1#、Nn#の各々は、C、G、またはそれらの改変物から選択され、ここでCは、Gと塩基対を形成する。
1つの実施形態において、N1、N2、....Nn−1、Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn−1#、Nn#の各々は、T、A、またはそれらの改変物から選択され、そしてTは、Aと塩基対を形成する。
これらの実施形態および他の実施形態において、C、G、A、およびTの各々は、対応する塩基(シトシン、グアニン、アデニン、およびチミン)を有するデオキシヌクレオチドを指し得る。
1つの実施形態において、N1、N2、....Nn−1、Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn−1#、Nn#の各々は、C、T、A、G、またはそれらの改変物から選択され、そしてCは、Gと塩基対を形成し、Tは、Gと塩基対を形成し、Aは、Tと塩基対を形成し、そしてAは、Gと塩基対を形成する。
1つの実施形態において、N1、N2、....Nn−1、Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn−1#、Nn#の各々は、ワトソン−クリック型の塩基対を形成する、未改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドから選択される。
1つの実施形態において、N1、N2、....Nn−1、Nnの各々およびN1#、N2#、...Nn−1#、Nn#の各々は、非ワトソン−クリック型の塩基対を形成する、未改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドから選択される。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも1つのホスホジエステル結合を有する部分的に安定化された骨格を含む。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも1つの安定化されたヌクレオチド間結合を有する骨格を含む。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、全てのホスホロチオエート結合である。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、Y1R1またはY2R2の少なくとも1つを連結するホスホジエステル結合を有する部分的に安定化された骨格を含む。
1つの実施形態において、Y1は、Cである。
1つの実施形態において、R1は、Gである。
1つの実施形態において、Y1は、Cであり、そしてR1は、Gである。
1つの実施形態において、X1またはX2は、Tである。
1つの実施形態において、X1は、Tであり、X2は、Tであり、Y1は、Cであり、R1は、Gであり、そしてkは、1である。
1つの実施形態において、X1は、Tであり、X2は、Tであり、Y1は、Cであり、R1は、Gであり、kは、1であり、pは、1であり、NおよびN’およびZ3は、それぞれ、0個のヌクレオチドを含み、そしてZ2は、TTTTまたはd(UUUU)である。
1つの実施形態において、S2は、非ヌクレオチド性リンカーである。
1つの実施形態において、S2は、少なくとも1つの無塩基のdSpacer残基を含む。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの分枝した非ヌクレオシド結合を含む。
1つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも1つのダブラー単位、少なくとも1つのトレブラー単位、または少なくとも1つのダブラー単位と少なくとも1つのトレブラー単位とを含む。
1つの実施形態において、S1は、ダブラー単位またはトレブラー単位である。
1つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの2’5’−ヌクレオシド間結合、5’5’−ヌクレオシド間結合、3’3’−ヌクレオシド間結合、2’2’−ヌクレオシド間結合、または2’3’−ヌクレオシド間結合を含む。
1つの局面において、本発明は、式IIIの免疫刺激性核酸分子を提供する。
特定の実施形態において、Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)qは、非パリンドローム配列である。
特定の実施形態において、Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)qはTCGTCGTTTT(配列番号29)、TCGTCGTTDD(配列番号30)、TCGA、TCGAC、TCGACGTC、またはTCGACGTCGであり、ここでDは、dSpacerである。
特定の実施形態において、Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)qは、パリンドローム配列である。
特定の実施形態において、Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)qは、TCGACGTCGA(配列番号31)またはTCGTCGACGA(配列番号32)である。
特定の実施形態において、Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)qは、TCGCGACGTT(配列番号33)またはTCGCGTCGTT(配列番号34)である。
1つの実施形態において、(Nn)....(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)Z3は、以下の配列:
1つの実施形態において、(Nn)....(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)は、配列GGCGCGCTGCCG(配列番号50)を含む。
1つの実施形態において、上記核酸の5’末端は、(TCG)nNおよびRDCGY1Y2Nから選択される免疫刺激性モチーフによって始まる。Tは、チミンであり、Cは、非メチル化シトシンであり、Gは、グアニンであり、Rは、プリンであり、Dは、Cではなく、Y1およびY2の各々は、独立して、ピリミジンであり、nは、1および4を含めて1と4との間の整数であり、そしてNは、0塩基長〜12塩基長の任意の配列である。
上記核酸の3’末端は、ヘアピン構造またはステム−ループ構造を形成し得る逆方向反復で終結する。用語「終結する」とは、3’末端か、または3’末端近傍における構造をいう。従って、ほぼパリンドロームの末端は、その分子の実際の3’末端に位置付けられ得るか、あるいは、その3’末端は、逆方向反復構造の一部ではない1個以上のさらなるヌクレオチドを含み得る。好ましくは、上記分子の3’末端は、逆方向反復構造の一部を形成しない3個以下のヌクレオチドを含む。
1つの実施形態において、本明細書中で使用される場合、「ヘアピン構造またはステム−ループ構造を形成し得る逆方向反復」とは、2〜10個の連続した塩基対の長さであるGCリッチなステムまたはヘアピンを形成し、そして少なくとも1個の調和しない塩基またはミスマッチの塩基を含むヌクレオチドの配列をいう。個々の実施形態において、そのGCリッチなステムは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の連続した塩基対の長さである。いくつかの実施形態において、そのGCリッチなステムは、少なくとも2個、3個、または4個のG−C塩基対を含む。
1つの実施形態において、本明細書中で使用される場合、「ヘアピン構造またはステム−ループ構造を形成し得る逆方向反復」とは、2〜10個の連続した塩基対の長さであるATリッチなステムまたはヘアピンを形成し、そして少なくとも1個の調和しない塩基またはミスマッチの塩基を含むヌクレオチドの配列をいう。個々の実施形態において、そのATリッチなステムは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の連続した塩基対の長さである。いくつかの実施形態において、そのATリッチなステムは、少なくとも2個、3個、または4個のA−T塩基対を含む。
いくつかの場合において、上記少なくとも1個の1個の調和しない塩基またはミスマッチの塩基は、ステムまたはヘアピンの末端を架橋する。これは、その分子中の順応性の点そのステムに提供して、塩基対を形成し、そしてヘアピンを形成することによって、二次構造の形成を可能にし得る。あるいは、その調和しない塩基またはミスマッチの塩基は、そのステム内にあり得る。好ましくは、ミスマッチの塩基が、そのステム内にある場合、そのステムは、少なくとも3塩基対の長さである。その調和しない塩基またはミスマッチの塩基は、任意のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、その調和しない塩基またはミスマッチの塩基は、Tである。二本鎖の末端における調和しないヌクレオチドはまた、二重鎖形成またはヘアピン形成を顕著に安定化し得る、突出ヌクレオチドまたはダングリング末端(dangling end)として公知である。Freier SMら、(1983)Effects of 3’ dangling end stacking on the stability of GGCC and CCGG double helixes.Biochemistry 22:6198−206。
上記核酸はまた、少なくとも1つのホスホジエステル5’−CpG−3’結合を含む部分的に安定化された骨格を含む。
いくつかの場合において、上記分子の二本鎖部分はまた、天然に存在しない(非標準の)塩基対(例えば、キサントシンと対形成したジアミノピリジン)を含み得る。Lutz MJら、(1998) Recognition of a non−standard base pair by thermostable DNA polymerases.Bioorg Med Chem Lett 8:1149−52。
上記の式は、免疫を刺激する優れた特性を示した上記クラスのCpGオリゴヌクレオチドのサブセットを定義する。上記の式において、5’とは、オリゴヌクレオチドの自由な5’末端をいい、そして3’とは、オリゴヌクレオチドの自由な3’末端をいう。
上記オリゴヌクレオチドは、1つ以上の接触可能(accessible)な5’末端または3’末端を有し得る。いくつかの実施形態において、3’末端は、別の3’末端に連結され得る。5’モチーフおよび3’モチーフの重要性が、見出され、そして本明細書中に記載されているので、2つのこのような5’末端または3’末端を有する改変オリゴヌクレオチドを作製することも、可能である。これは、例えば、3’−3’結合を介して2つのオリゴヌクレオチドを接続して、1つまたは2つの接触可能な5’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成することによって達成され得る。このような構造は、5’−RDCGY1Y2N−NY2Y1GCDR−5’(ここでDは、Cではないものを表す;配列番号51)または5’−(TCG)nN−N(GCT)n−5’(配列番号52)のような式を有し得る。上記3’3’−結合または5’5’−結合は、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、ホスホロチオエートヌクレオチド間架橋、または任意の他の改変ヌクレオチド間架橋であり得る。このような結合を達成するための方法は、当該分野において公知である。例えば、このような結合は、Seliger,Hら、(1991)、「Oligonucleotide analogs with terminal 3’−3’−and 5’−5’−internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression」、Nucleotides & Nucleotides、10:469−77およびJiangら、(1999)、「Pseudo−cyclic oligonucleotides:in vitro and in vivo proterties」、Bioorg Med Chem、7、2727−35に記載されている。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造のうちの1つを有する:TCGTCGTTTTA(配列番号53)、CGGCGCCGTGCCG(配列番号54)、CGGCGTCGTGCCG(配列番号55)、TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(配列番号56)、TCGTCGTTTTACGGCGTCGTGCCG(配列番号57)。
1つの局面における本発明は、キメラ骨格を有するCクラスCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの特定のサブクラスが、免疫刺激効果を媒介する工程において非常に効果的であるという発見に関係する。これらのCpGオリゴヌクレオチドは、癌、感染症、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、および他の障害を処置し、そして癌の化学療法後の日和見感染に対する保護を支援するために免疫系を刺激する工程に対して、治療的および予防的に有用である。CpG刺激によって生じる強力であるがバランスのとれた、細胞性免疫応答および体液性免疫応答は、侵入する病原体および癌性細胞に対する身体自体の天然の防御システムを反映する。
1つの局面において、本発明は、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットは免疫刺激性の特性が改善されて、腎炎症の影響が低下されているという知見に関係する。いくつかの場合において、完全にホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドを投与されている被験体において腎炎症が観察されている。本明細書において記載されるキメラ核酸は、十分にホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドよりも腎炎症を生じることが少ないと考えられる。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは免疫応答を刺激するのに非常に有効である。従って、この分子のホスホジエステル領域は、その有効性を低下させなかった。
好ましいCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、以下の7つの一般式のうちの1つにおさまる:
5’ TTC_GX2C_GN1X1_GX3C_GTT 3’(配列番号24);ここでN1は、1ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示し、X1は、ピリミジンであり、X2およびX3は、任意のヌクレオチドである;
5’ TTC_GTC_GTTTX1_GTC_GTT 3’(配列番号25);ここでX1は、ピリミジンである;
5’ T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*X1_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号25);ここでX1は、ピリミジンである;
5’ TC_GX1C_GX2N1X3C_GN2CG 3’(配列番号26);ここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、N2は、0ヌクレオチド長〜9ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示し、そしてX1、X2、およびX3は、任意のヌクレオチドである;
5’ TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3’(配列番号27);ここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長である;
5’ T*C_G*T*C_G*T*N1 *T*C_G*G*C*G*CN1G*C*C*G 3’(配列番号27);ここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長である;
5’ TC_GX1C_GX2C_GX3TC_GGCGC_GN3 3’(配列番号28);ここでN3は、1ヌクレオチド長〜5ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示し、そしてX1、X2、およびX3は、任意のヌクレオチドである。
5’ TTC_GX2C_GN1X1_GX3C_GTT 3’(配列番号24);ここでN1は、1ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示し、X1は、ピリミジンであり、X2およびX3は、任意のヌクレオチドである;
5’ TTC_GTC_GTTTX1_GTC_GTT 3’(配列番号25);ここでX1は、ピリミジンである;
5’ T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*X1_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号25);ここでX1は、ピリミジンである;
5’ TC_GX1C_GX2N1X3C_GN2CG 3’(配列番号26);ここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、N2は、0ヌクレオチド長〜9ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示し、そしてX1、X2、およびX3は、任意のヌクレオチドである;
5’ TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3’(配列番号27);ここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長である;
5’ T*C_G*T*C_G*T*N1 *T*C_G*G*C*G*CN1G*C*C*G 3’(配列番号27);ここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長である;
5’ TC_GX1C_GX2C_GX3TC_GGCGC_GN3 3’(配列番号28);ここでN3は、1ヌクレオチド長〜5ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示し、そしてX1、X2、およびX3は、任意のヌクレオチドである。
必要に応じて、上記の式において明記される場合、5’とは、そのオリゴヌクレオチドの自由な5’末端をいい、そして3’とは、そのオリゴヌクレオチドの自由な3’末端をいう。
上記の式において使用される記号*は、安定化されたヌクレオチド間結合の存在を指す。これらの構造において、記号_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合の存在を指す。*で印を付けられていないヌクレオチド間結合は、そのオリゴヌクレオチドが、少なくとも2つ〜3つのホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を含む限り、安定化されても、安定化されなくてもよい。いくつかの実施形態において、それらのオリゴヌクレオチドは、3つ〜6つのホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を含むことが好ましい。いくつかの場合において、上記CGモチーフの間の結合は、ホスホジエステル結合であり、そして他の場合において、それらの結合は、ホスホロチオエート結合または他の安定化された結合である。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造のうちの1つを有する:
核酸はまた、置換プリンおよび置換ピリミジン(例えば、C−5プロピンピリミジンおよび7−デアザ−7置換プリン改変塩基)を包含する。Wagner RWら、(1996)、Nat Biotechnol 14:840−4。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシシトシン、5−フルオロシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、2,6−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに天然に存在する他の核酸塩基(nucleobase)および天然に存在しない他の核酸塩基、置換芳香族部分および非置換芳香族部分が挙げられるが、これらに限定されない。他のこのような改変は、当業者に周知である。
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、天然のRNAおよびDNA(これらは、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、β−D−リボース単位および/または天然のヌクレオチド塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル)を含む)と比較して種々の化学的改変および化学的置換を包含し得る。化学的改変の例は、当業者に公知であり、そして例えば、Uhlmann Eら、(1990)、Chem Rev 90:543;「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」、Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques、S.Agrawal編、Humana Press、Totowa、USA 1993;Crooke STら、(1996)、Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107−129;およびHunziker Jら、(1995)、Mod Synth Methods 7:331−417に記載される。本発明によるオリゴヌクレオチドは、1つ以上の改変を含み得、各改変は、天然のDNAまたはRNAから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオチド間架橋および/または特定のβ−D−リボース単位および/または特定の天然ヌクレオチド塩基位置に配置される。
例えば、本発明は、1つ以上の改変を含み得るオリゴヌクレオチドに関連し、そして各改変は、独立して、以下から選択される:
a)改変ヌクレオチド間架橋による、ヌクレオチドの3’末端および/または5’末端に配置されるホスホジエステルのヌクレオチド間架橋の置換;
b)デホスホ架橋によるヌクレオチドの3’末端および/または5’末端に配置されるホスホジエステル架橋の置換;
c)別の単位による糖リン酸骨格由来の糖リン酸単位の置換;
d)改変糖単位によるβ−D−リボースの置換;および
e)改変ヌクレオチド塩基による天然のヌクレオチド塩基の置換。
a)改変ヌクレオチド間架橋による、ヌクレオチドの3’末端および/または5’末端に配置されるホスホジエステルのヌクレオチド間架橋の置換;
b)デホスホ架橋によるヌクレオチドの3’末端および/または5’末端に配置されるホスホジエステル架橋の置換;
c)別の単位による糖リン酸骨格由来の糖リン酸単位の置換;
d)改変糖単位によるβ−D−リボースの置換;および
e)改変ヌクレオチド塩基による天然のヌクレオチド塩基の置換。
オリゴヌクレオチドの化学的改変についてのより詳細な例は、以下の通りである。
ヌクレオチドの3’末端および/または5’末端に配置されるホスホジエステルのヌクレオチド間架橋は、改変ヌクレオチド間架橋によって置換され得、この改変ヌクレオチド間架橋は、例えば、ホスホロチオエート架橋、ホスホロジチオエート架橋、NR1R2−ホスホラミデート架橋、ボラノホスフェート架橋、α−ヒドロキシベンジルホスフェート架橋、ホスフェート−(C1〜C21)−O−アルキルエステル架橋、ホスフェート−[(C6〜C12)アリール−(C1〜C21)−O−アルキル]エステル架橋、(C1〜C8)アルキルホスホネート架橋および/または(C6〜C12)アリールホスホネート架橋、(C7〜C12)−α−ヒドロキシメチル−アリール(例えば、WO95/01363に開示される)から選択され、(C6〜C12)アリール、(C6〜C20)アリールおよび(C6〜C14)アリールは、必要に応じて、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノによって置換され、そしてR1およびR2は、互いに独立して、水素、(C1〜C18)−アルキル、(C6〜C20)−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキルであり、好ましくは、水素、(C1〜C8)−アルキルであり、好ましくは、(C1〜C4)−アルキルおよび/もしくはメトキシエチルであるか、またはR1およびR2は、それらを担持する窒素原子と一緒になって、O、SおよびNという基からのさらなるヘテロ原子をさらに含み得る5〜6員の複素環を形成する。
ヌクレオチドの3’末端および/または5’末端に配置されるホスホジエステル架橋は、脱リン架橋(脱リン架橋は、例えば、Uhlmann EおよびPeyman A、「Methods in Molecular Biology」、第20巻、「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」、S Agrawal編、Humana Press、Totowa 1993、第16章、pp.355 ffに記載される)によって置換され、脱リン架橋は、例えば、デホスホ架橋ホルムアセタール基、3’−チオホルムアセタール基、メチルヒドロキシルアミン基、オキシム基、メチレンジメチル−ヒドラゾ基、ジメチレンスルホン基および/またはシリル基から選択される。
糖リン酸単位(すなわち、一緒になって糖リン酸単位を形成するβ−D−リボースおよびホスホジエステルのヌクレオチド間架橋)は、糖リン酸骨格(すなわち、糖リン酸骨格は、糖リン酸単位から構成される)に由来し、この糖リン酸単位は、別の単位によって置換され得、他の単位は、例えば、「モルホリノ誘導体」オリゴマー(Stirchak EPら(1989)Nucleic Acids Res 17:6129−41に記載されるような)を構築(すなわち、例えば、モルホリノ誘導体単位による置換)するのに適しているか、またはポリアミド核酸(「PNA」;例えば、Nielsen PEら(1994)Bioconjug Chem 5:3−7に記載される)を構築(すなわち、例えば、PNA骨格単位(例えば、2−アミノエチルグリシン)による置換)するのに適している。
β−リボース単位またはβ−D−2’−デオキシリボース単位は、改変糖単位によって置換され得、この改変糖単位は、例えば、β−D−リボース、α−D−2’−デオキシリボース、L−2’−デオキシリボース、2’−F−2’−デオキシリボース、2’−F−アラビノース、2’−O−(C1〜C6)アルキル−リボースから選択され、好ましくは、2’−O−(C1〜C6)アルキル−リボースは、2’−O−メチルリボース、2’−O−(C2〜C6)アルケニル−リボース、2’−[O−(C1〜C6)アルキル−O−(C1〜C6)アルキル]−リボース、2’−NH2−2’−デオキシリボース、β−D−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、2,4−ジデオキシ−β−D−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、ならびに炭素環式糖アナログ(例えば、Froehler J(1992)Am Chem Soc 114:8320に記載される)および/または開鎖糖アナログ(例えば、Vandendriesscheら(1993)Tetrahedron 49:7223に記載される)および/またはビシクロ糖アナログ(例えば、Tarkov Mら(1993)Helv Chim Acta 76:481に記載される)である。
いくつかの好ましい実施形態において、上記糖は、特に、ホスホジエステルもしくはホスホジエステル様のヌクレオチド間結合によって結合される一方または両方のヌクレオチドに関して、2’−O−メチルリボースである。
改変塩基は、代表的にDNA中およびRNA中に見出されるT、C、G、A、およびUのような天然の塩基と、化学的に区別される任意の塩基であるが、改変塩基は、これらの天然の塩基とは基本的化学構造を共にする。例えば、その改変ヌクレオシド塩基は、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−アミノウラシル、5−(C1〜C6)−アルキルウラシル、5−(C2〜C6)−アルケニルウラシル、5−(C2〜C6)−アルキニルウラシル、5−(ヒドロキシメチル)ウラシル、5−クロロウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヒドロキシシトシン、5−(C1〜C6)−アルキルシトシン、5−(C2〜C6)−アルケニルシトシン、5−(C2〜C6)−アルキニルシトシン、5−クロロシトシン、5−フルオロシトシン、5−ブロモシトシン、N2−ジメチルグアニン、2,4−ジアミノ−プリン、8−アザプリン、置換された7−デアザプリン(好ましくは、7−デアザ−7−置換プリンおよび/または7−デアザ−8−置換プリン)、5−ヒドロキシメチルシトシン、N4−アルキルシトシン(例えば、N4−エチルシトシン)、5−ヒドロキシデオキシシチジン、5−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、N4−アルキルデオキシシチジン(例えば、N4−エチルデオキシシチジン)、6−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオチド、C5−プロピニルピリミジン、およびジアミノプリン(例えば、2,6−ジアミノプリン)、イノシン、5−メチルシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、ヒポキサンチンまたは天然のヌクレオシド塩基の他の改変物より選択され得る。この一覧は、例示を意図するのであって、限定であると解釈されるべきではない。
上記オリゴヌクレオチドは、1つ以上の接触可能な5’末端を有し得る。2つのこのような5’末端を有する改変オリゴヌクレオチドを作製することが、可能である。これは、例えば、3’−3’結合を介して2つのオリゴヌクレオチドを接続して、1つまたは2つの接触可能な5’末端を生成することによって達成され得る。上記3’3’−結合は、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、ホスホロチオエートヌクレオチド間架橋、または任意の他の改変ヌクレオチド間架橋であり得る。このような結合を達成するための方法は、当該分野において公知である。例えば、このような結合は、Seliger,Hら、「Oligonucleotide analogs with terminal 3’−3’−and 5’−5’−internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression」、Nucleotides & Nucleotides(1991)、10(1−3)、469−77およびJiangら、「Pseudo−cyclic oligonucleotides:in vitro and in vivo proterties」、Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999)、7(12)、2727−2735に記載されている。
さらに、3’末端のヌクレオチドの間の結合がホスホジエステルでも、ホスホロチオエートでも他の改変された架橋でもない3’3’−結合したオリゴヌクレオチドは、さらなるスペーサー(例えば、トリ−エチレングリコールホスフェート部分またはテトラ−エチレングリコールホスフェート部分)を使用して調製され得る(Durand,Mら、「Triple−helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12 and two(dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains」、Biochemistry(1992)、31(38)、9197−204、米国特許第5,658,738号および同第5,668,265号)。あるいは、非ヌクレオチド性リンカーは、標準的なホスホラミダイト化学反応を使用した、エタンジオール、プロパンジオール、または無塩基デオキシリボース(dSpacer)単位(Fontanel,Marie Laurenceら、Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non−nucleosidic moieties 5’−attached to oligonucleotides;Nucleic Acids Research(1994)、22(11)、2022−7)に由来し得る。非ヌクレオチド性リンカーは、1回または複数回取り込まれ得るか、または互いに組み合わされ得、結合される2つのODNの3’末端の間に任意の望ましい距離を与える。
最近、CpGオリゴヌクレオチドは、Toll様レセプター9(TLR9)と相互作用することによってそれらの免疫刺激性効果を発揮するようであることが報告された。Hemmi Hら、(2000) Nature 408:740−5。従って、TLR9シグナル伝達活性は、NF−κBシグナル、NF−κB関連性シグナル、ならびにNF−κBの上流または下流の適切な事象および中間体を測定することによって、CpGオリゴヌクレオチドまたは他の免疫刺激性オリゴヌクレオチドに対する応答において測定され得る。
本発明における使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の多数の手順のいずれかを使用して新規に合成され得る。例えば、b−シアノエチルホスホロアミダイト法(Beaucage,S.L.およびCaruthers,M.H.,Tet.Let.22:1859,1981);ヌクレオシドH−リン酸法(Gareggら、Tet.Let.27:4051−4054,1986;Froehlerら、Nucl.Acid.Res.14:5399−5407,1986;Gareggら、Tet.Let.27:4055−4058,1986,Gaffneyら、Tet.Let.29:2619−2622,1988)。これらの化学反応は、市販されている種々の自動核酸合成機によって行われ得る。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと称される。単離されたオリゴヌクレオチドとは、一般に、自然界において通常付随している成分から分離されているオリゴヌクレオチドをいう。例として、単離されたオリゴヌクレオチドは、細胞から分離されたものであっても、核から分離されたものであっても、ミトコンドリアから分離されたものであっても、またはクロマチンから分離されたものであってもよい。
上記オリゴヌクレオチドは、分解に対して部分的に抵抗性であり得る(例えば、安定化される)。「安定化されたオリゴヌクレオチド分子」は、インビボ分解(例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによって)に対して比較的抵抗性であるオリゴヌクレオチドを意味するものとする。核酸の安定化は、骨格の改変によって達成され得る。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、最大の活性を提供し得、そしてそのオリゴヌクレオチドを、細胞内の、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解から保護し得る。他の改変オリゴヌクレオチドとしては、ホスホジエステル改変オリゴヌクレオチド、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、p−エトキシ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
ホスホロチオエートのような改変された骨格は、ホスホラミデート化学反応またはH−ホスホネート化学反応のいずれかを利用する、自動化された技術を使用して合成され得る。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第4,469,863号に記載されるように作製され得、そしてアルキルホスホトリエステル(荷電した酸素部分が、米国特許第5,023,243号および欧州特許第092,574号に記載されるようにアルキル化される)は、市販の試薬を使用する自動固相合成によって調製され得る。他のDNA骨格改変および他のDNA骨格置換をなすための方法が、記載されてきた。Uhlmann,E.およびPeyman,A.,Chem.Rev.90:544,1990;Goodchild,J.,Bioconjugate Chem.1:165,1990。
他の安定化されたオリゴヌクレオチドは、以下を含む:非イオン性DNAアナログ(例えば、アルキル−ホスフェートおよびアリール−ホスフェート(ここで、荷電したホスホネートの酸素がアルキル基またはアリール基によって置換される)、ホスホジエステル、および荷電した酸素部分がアルキル化されるアルキルホスホトリエステル)。いずれかの末端または両方の末端にてジオール(例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール)を含む核酸はまた、ヌクレアーゼ分解に対して十分に抵抗性であることを示した。
CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドのサブセットが、PBMCのようなヒト細胞に対して劇的な免疫刺激作用を有していることが、本発明によって発見された。このことは、これらのCpG免疫刺激オリゴヌクレオチドが、ヒトのワクチン接種、ガンの免疫療法、喘息の免疫療法、免疫機能の全般的な強化、照射後または化学療法後の造血系の回復の促進、自己免疫疾患および他の免疫調節用途にとって、有効な治療剤であることを示唆している。CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットが、インビボで喘息およびアレルギー性鼻炎の処置に有用であることもまた、示された。
アレルギーを有する被験体は、アレルゲンに対する応答におけるアレルギー反応を有するかまたはその反応を発症する危険のある被験体である。アレルギーとは、物質(アレルゲン)に対する後天性の過敏症をいう。アレルギー性状態としては、湿疹、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性コリーザ、枯草熱、結膜炎、気管支喘息、じんま疹(urticaria)(じんま疹(hives))および食物アレルギー、および他のアトピー性の状態が挙げられるが、これらに限定されない。
アレルギーは、一般的に、無害なアレルゲンに対するIgE抗体の生成によって引き起こされる。CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの全身投与または粘膜投与によって誘導されるサイトカインは、主に、Th1と呼ばれるクラスのものであり(例えば、IL−12、IP−10、IFN−α、およびIFN−γ)、これらは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答との両方を誘導する。IL−4およびIL−5サイトカインの生産に関係している免疫応答の他の主要な型は、Th2免疫応答と呼ばれる。一般に、アレルギー性疾患は、Th2型の免疫応答によって媒介されるようである。CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドがTh2優勢(これはIgE抗体の生産およびアレルギーに関係している)からバランスのとれたTh2/Th1応答(これはアレルギー反応に対して防御的である)へと被験体の免疫応答を変化させる能力に基づいて、アレルゲンなしか、またはアレルゲンと組み合わせて単独の治療としてCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫応答を誘導するための有効量が、喘息およびアレルギーを処置するために被験体に投与され得る。
このように、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、喘息およびアレルギー性鼻炎のようなアレルギー性状態の処置において、有意な治療上の有用性を有する。Th2サイトカイン(特に、IL−4およびIL−5)は、喘息の被験体の気道において増大する。これらのサイトカインは、IgEアイソタイプの切り替え、好酸球の走化性および活性化、ならびに肥満細胞の増殖を含む、喘息の免疫応答の重要な局面を促進する。Th1サイトカイン(特に、IFN−γおよびIL−12)は、Th2クローンの形成、およびTh2サイトカインの生産を抑制し得る。喘息とは、炎症、気道の狭窄、および吸入される因子に対する気道の反応性の増大によって特徴付けられる、呼吸系の障害をいう。喘息は、多くの場合は、アトピー性症状またはアレルギー性症状に関係しているが、必ずしもそうとは限らない。
喘息は、ウイルス感染によって増悪され得る。喘息とウイルス感染との組み合わせは、被験体においてその症状を顕著に悪化させる。本明細書中で使用されるオリゴヌクレオチドは、喘息のウイルス誘導性の増悪の処置に、重要な利益を提供する。このような療法の数種の例は、以下に示される。
アレルギー性鼻炎は、アレルゲン(例えば、花粉または埃)によって引き起こされる、鼻粘膜の炎症を生じる障害である。この用語は、薬物性鼻炎、乾燥性鼻炎、およびアトピー性鼻炎を含む。アレルギー性鼻炎の2つの一般的な型(季節性および通年性)が存在する。季節性のアレルギー性鼻炎は、一般的には枯草熱と称され、そして通常、カビ(mould)または花粉によって引き起こされる。通年性のアレルギー性鼻炎は、通常、1つ以上の型のアレルゲンに対する生得的な感受性によって引き起こされる。この状態は、一般的に、一年中続くか、または患者がそのアレルゲンに曝される限り続く。両方の型のアレルギー性鼻炎は、炎症を生じる1型(IgE媒介性)過敏症に関与する。この炎症は、特定のアレルゲンに対する応答における肥満細胞および血中の好塩基球の過剰な脱顆粒によって引き起こされると考えられる。これは、上昇したIgEレベル、ならびに炎症メディエーター(例えば、ヒスタミン)および走化性因子(例えば、サイトカイン、プロスタグランジンおよびロイコトリエン)の同時放出を生じ、これらは、限局性の炎症反応をもたらす。
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、さらなる抗アレルギー/喘息の医薬も療法も伴わずに単独療法として投与されても、このような療法または医薬と組み合わせて投与されてもよい。代表的な抗アレルギー/喘息の医薬および療法としては、血管収縮剤の鼻腔内使用、抗ヒスタミン剤の鼻腔内使用および全身的使用、糖質コルチコイドの鼻腔内使用、肥満細胞安定化剤(例えば、クロモリン化合物)の使用、ならびに充血除去剤の経口使用が挙げられる。
アレルゲンとは、感受性の被験体において、アレルギー反応または喘息の反応を誘導し得る物質(抗原)をいう。アレルゲンの一覧は、莫大な数であり、そしてアレルゲンとしては、花粉、昆虫の毒液、動物の鱗屑の塵(dander dust)、真菌の胞子、および薬物(例えば、ペニシリン)が挙げられ得る。天然の、動物性アレルゲンおよび植物性アレルゲンの例としては、以下の属:
上記オリゴヌクレオチドはまた、免疫応答をTh2型免疫応答からTh1型免疫応答へ移行させるために有用である。このことは、比較的にバランスのとれたTh1/Th2環境の産生を生じる。Th2型免疫応答からTh1型免疫応答への免疫応答の移行は、その核酸に対する反応において産生されたサイトカインのレベルを測定することによって(例えば、IL−12、IFN−γおよびGM−CSFを含む、単核細胞およびTh1サイトカインを産生する他の細胞を誘導することによって)評価され得る。Th2応答からTh1応答への免疫応答の、移行またはリバランス(rebalance)は、喘息の処置または予防に、特に有用である。例えば、喘息を処置するのに有効な量は、喘息に関連するTh2型の免疫応答を、Th1型の免疫応答またはバランスのとれたTh1/Th2環境に移行させるために有用な量であり得る。Th2サイトカイン、特にIL−4およびIL−5は、喘息の被験体の気道において上昇する。本発明のCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫系のリバランスを補助するTh1サイトカインの増加を引き起こし、それは優勢なTh2型免疫応答に関連する悪影響を防ぐか、または減少させる。
上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本発明のいくつかの局面において、アレルギーもしくは喘息に加えて、感染性の生物体による感染もしくは特定の癌抗原が確認された癌を発症する危険にある被験体の処置のためのワクチンとして有用である。そのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、感染、アレルギーもしくは癌に対する防御のための抗原またはアレルゲンを伴わずに投与され得る、そしてこの場合において、反復投与は、より長い期間の防御を可能にし得る。本明細書中で使用されるような危険にある被験体は、感染を引き起こす病原体、もしくは癌、もしくはアレルゲンに対する曝露の危険のいずれか、または癌を発症する危険を有する被験体である。例えば、危険にある被験体は、特定の型の感染因子が見出される地域への旅行を計画している被験体であり得るか、またはその危険にある被験体は、ライフスタイルまたは医療手順を通じて、感染性の生物体を含み得る体液に曝されるか、あるいは直接的にその生物に曝され得るか、または感染性の生物もしくはアレルゲンが確認されている地域に生きる任意の被験体でさえある。感染を発症する危険のある被験体はまた、医療機関が、特定の感染性の生物体の抗原を用いるワクチン接種を推奨する、一般的な集団を含む。その抗原が、アレルゲンであり、そしてその被験体が、その特定の抗原に対してアレルギー反応を発症し、そしてその被験体が、その抗原に曝露され得る(すなわち、花粉の季節の間)場合、その被験体は、上記抗原への曝露の危険にある。アレルギーから喘息を発症する危険にある被験体としては、アレルギーまたは喘息を有することが確認されてきた被験体が挙げられるが、その被験体は、上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドによる処置の間に、活動性の疾患を有さず、そして遺伝的要因または環境的要因に起因して、これらの疾患を発症する危険にあると考えられる被験体である。
癌を発症する危険にある被験体は、癌を発症する高い確率を有する被験体である。例えば、これらの被験体としては、その存在が癌を発症するというより高い可能性に対して相関関係を有することが実証されてきた遺伝的異常を有する被験体、および癌を引き起こす因子(例えば、タバコ、アスベスト、もしくは他の化学的毒素)に曝露される被験体、またはこれまでに癌について処置され、そして表面上は回復状態にある被験体が挙げられる。癌を発症する危険のある被験体が、被験体が発症する危険のある癌の型に特異的な抗原、およびCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いて処置される場合、その被験体は、癌が発症するときに、その癌細胞を殺傷することが可能であり得る。上記被験体中で腫瘍の形成が始まる場合、その被験体は、その腫瘍抗原に対する特異的な免疫応答を発生する。
予防的処置についての上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用に加えて、本発明はまた、感染、アレルギー、喘息、または癌を有する被験体の処置についてのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用を包含する。
感染を有する被験体は、感染性病原体に曝された被験体であり、そしてその被験体は、身体の中に、急性的または慢性的な、その病原体の検出可能なレベルを有する。上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、抗原を伴うか、または伴わずに使用され得、その抗原は、抗原特異的な全身性免疫応答、または抗原特異的な粘膜の免疫応答を起こし、その免疫応答は、その感染性病原体のレベルの減少させること、またはその感染性病原体を根絶することができる。本明細書中で使用される場合、感染症は、身体の中の外来性の微生物の存在に起因する疾患である。有効なワクチンによる方法、および病原体侵入の主要な部位である身体の粘膜表面を保護するための処置を開発することは、特に重要である。
癌を有する被験体は、検出可能な癌性細胞を有する被験体である。その癌は、悪性の癌または非悪性の癌であり得る。癌または腫瘍としては、胆道癌、脳の癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌(例えば、小細胞癌および非小細胞癌)、黒色腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態において、その癌は、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚のT細胞白血病、多発骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌または大腸癌である。
被験体は、ヒト、または脊椎動物を意味するものとし、脊椎動物としては、犬、猫、馬、牛、豚、羊、山羊、七面鳥、鶏、霊長類(例えば、猿)、および魚(水産養殖の生物種)(例えば、鮭)が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、癌および腫瘍、感染、ならびに非ヒト被験体におけるアレルギー/喘息を処置するために使用され得る。癌は、コンパニオンアニマル(companion animal)(例えば、猫および犬)の死の原因を導くものの1つである。
本明細書中で使用される場合、用語「処置(treat)」,用語「処置された(treated)」、用語「処置する(treating)」とは、障害(例えば、感染症、癌、アレルギー、または喘息)に関して使用される場合、予防的な処置(その処置は、疾患の発症に対する(例えば、病原体による感染に対する)被験体の抵抗性を増加し、または言い換えれば、その被験体が疾患を発症する(例えば、病原体に感染する)可能性を減少する)、および疾患と闘う(例えば、感染を軽減しまたは排除する)ためか、または疾患の悪化を防ぐための、被験体が疾患を発症した後の処置をいう。
上記CpGオリゴヌクレオチドが、抗原と一緒に投与される場合において、その被験体は、その抗原に曝され得る。本明細書中で使用される場合、用語「に曝される(exposed to)」とは、上記被験体と抗原とを接触する能動的な工程、またはインビボでの、その抗原に対するその被験体の受動的な曝露のいずれかをいう。抗原に対する被験体の能動的な曝露のための方法は、当該分野で周知である。一般的に、抗原は、任意の手段(例えば、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、経皮投与、粘膜投与、鼻腔内投与、気管内投与、皮下投与)によって、その被験体に直接的に投与される。その抗原は、全身的または局所的に投与され得る。その抗原およびそのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与するための方法は、以下に、より詳細に記載される。抗原が被験体の身体において、免疫細胞に対する曝露に利用可能になる場合、被験体は、抗原に受動的に曝される。被験体は、例えば、その身体の中への、外来性の病原体の侵入によってか、またはその表面上で外来性の抗原を発現する腫瘍細胞の発生によって、抗原に受動的に曝露され得る。
被験体が、抗原に対して受動的に曝露される方法は、特に、上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与の時期に依存する。例えば、癌、または感染症、またはアレルギー性反応もしくは喘息の反応を発症する危険のある被験体において、その危険が、最も高い(すなわち、アレルギーの季節の間、または癌を引き起こす因子に対する曝露の後)場合、その被験体は、通常の基準でそのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与され得る。さらに、そのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、旅行者が、感染性因子への曝露の危険がある外国の土地へ旅行する前に、その旅行者に投与され得る。同様に、そのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、生物戦争への曝露の危険がある、軍人または一般人に投与され得、被験体が、それに曝された場合、抗原に対する、全身性免疫応答または粘膜の免疫疫応が誘導される。
本明細書中で使用される抗原は、免疫応答を誘発し得る分子である。抗原としては、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類の結合体、多糖類および他の分子の、ペプチド性模倣物(mimic)および非ペプチド性模倣物、低分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物、ならびに多細胞生物(例えば、寄生虫およびアレルゲン)が挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗原」は、外来性である場合、宿主免疫系によって認識される任意の分子の型を広く含む。抗原としては、癌抗原、微生物抗原、およびアレルゲンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される癌抗原は、腫瘍細胞表面または癌細胞表面と関係がある化合物(例えば、ペプチドまたはタンパク質)であり、そしてその化合物は、MHC分子の状況において抗原提示細胞の表面上に発現されるときに、免疫応答を誘発し得る。癌抗原は、癌細胞の粗製抽出物を調製すること(例えば、Cohenら、1994,Cancer Research,54:1055に記載される)によってか、その抗原を部分的に精製することによってか、組換え技術によってか、または公知の抗原のデノボ合成によってかのいずれかで、癌細胞から調製され得る。癌抗原としては、組換え的(recombinantly)に発現された抗原、それらの免疫原性部分、または腫瘍細胞の全体もしくは癌細胞の全体が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原は、単離され得るか、または組換え的に調製され得るか、または当該分野で公知の任意の他の手段によって調製され得る。
本明細書中で使用される微生物抗原は、微生物の抗原であり、そしてその微生物としてはウイルス、細菌、寄生虫および真菌が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原としては、インタクトな微生物、ならびに天然の単離物および天然のフラグメントまたはそれらの誘導体、ならびに合成化合物も挙げられ、その合成化合物は、天然の微生物の抗原と同一であるか、または類似であり、その微生物に対して特異的な免疫応答を誘導する。化合物が、天然の微生物抗原に対する免疫応答(体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答)を誘導する場合、その化合物は、天然の微生物の抗原に類似する。このような抗原は、当該分野で慣用的に使用され、その抗原は、当業者にとって周知である。
本明細書中で使用される用語「実質的に精製され(substantially purified)」は、それが天然で結合している他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質が実質的にないポリペプチドをいう。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技術を使用して、ポリペプチド抗原を精製し得る。実質的に純粋なポリペプチドは、多くの場合、非還元のポリアクリルアミドゲル上に、単一の主要なバンドを生じる。部分的にグリコシル化されたポリペプチドの場合、またはいくつかの開始コドンを有するポリペプチドの場合、非還元のポリアクリルアミドゲル上に、いくつかのバンドが存在し得るが、それらのバンドは、そのポリペプチドに対する特有のパターンを形成する。そのウイルスポリペプチド抗原または細菌ポリペプチド抗原の純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列の分析によって決定され得る。核酸ベクターによってコードされない他の型の抗原(例えば、多糖類、低分子、模倣物など)は、本発明内に含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、抗微生物剤と一緒に、被験体に投与され得る。本明細書中で使用される場合、抗微生物剤とは、天然に存在する化合物または合成化合物をいい、それらは、感染性の微生物を、殺傷し得るか、または抑制し得る。本発明に従った有用な抗微生物剤の型は、被験体が、感染されるか、または感染される危険にある微生物の型に依存する。抗微生物剤としては、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗寄生虫剤が挙げられるが、これらに限定されない。「抗感染剤」、「抗細菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「抗寄生虫剤」および「駆虫薬」のような語句は、当業者にとって十分に確立された意味を有し、そしてその表現は、標準的な医学の教科書に定義される。簡単にいうと、抗細菌剤は、細菌を殺傷または抑制し、そして抗生物質ならびに類似の機能を有する他の合成化合物または天然化合物を含む。抗生物質は、微生物のような細胞によって二次代謝物として産生される低分子量の分子である。一般的に、抗生物質は、微生物に特異的でありかつ宿主細胞に存在しない1つ以上の細菌の機能または構造を妨害する。抗ウイルス剤は、天然供給源から単離され得るか、または合成され得、そしてウイルスを殺傷または抑制するために有用である。抗真菌剤は、表在性の真菌感染、ならびに日和見性および原発性の、全身性真菌感染を処置するために使用される。抗寄生虫剤は、寄生虫を殺傷または抑制する。
ヒト投与のための有用な駆虫薬とも称される抗寄生虫剤の例としては、アルベンダゾール、アムホテリシンB、ベンズニダゾール、ビチオノール、クロロキンHCl、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、エフロルニチン、フラゾリダオン(furazolidaone)、糖質コルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、アイバメクチン、メベンダゾール、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトリホネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス、オキサムニキン、パロモマイシン、ペンタミジンイセチオネート、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、ピランテルパモエート、ピリメタミンスルホンアミド(pyrimethanmine−sulfonamide)、ピリメタミンスルファドキシン、キナクリンHCl、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコン酸ナトリウム(グルコン酸アンチモンナトリウム)、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール(trimethroprim−sulfamethoxazole)、およびトリパルサミド(これらのいくつかは、単独で使用されるか、もしくは他のものと組み合わせて使用される)が挙げられるが、これらに限定されない。
抗細菌剤は、細菌を殺傷するか、または細菌の増殖または機能を抑制する。抗細菌剤の大きな分類は抗生物質である。広い範囲の細菌を殺傷または抑制するために有効である抗生物質は、広域スペクトル抗生物質と称される。他の型の抗生物質は、グラム陽性またはグラム陰性の分類の細菌に対して優先的に有効である。これらの型の抗生物質は、狭域スペクトル抗生物質と称される。単一の生物または疾患に対して有効であり、そしてその他のタイプの細菌に対しては有効でないその他の抗生物質は、限定スペクトル抗生物質と称される。抗細菌剤は、ときとして、それらの主な作用の様式に基づいて分類される。一般的に、抗細菌剤は、細胞壁合成インヒビター、細胞膜インヒビター、タンパク質合成インヒビター、核酸合成インヒビターまたは機能的インヒビター、および競合的インヒビターである。
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染、または細胞内のウイルスの複製を防ぐ化合物である。抗ウイルス性薬物は、抗細菌剤よりはかなり少ない。なぜならば、ウイルス複製のプロセスは、宿主細胞内のDNA複製に密接に関係しており、非特異的な抗ウイルス剤は、多くの場合、宿主に毒性であるからである。抗ウイルス剤によって遮断され得るか、または阻害され得るウイルス感染のプロセス内のいくつかの段階が存在する。これらの段階としては、ウイルスの宿主細胞への付着(免疫グロブリンまたは結合性ペプチド)、ウイルスの脱殻(例えば、アマンタジン)、ウイルスmRNAの合成または翻訳(例えば、インターフェロン)、ウイルスRNAまたはウイルスDNAの複製(例えば、ヌクレオチドアナログ)、新しいウイルスタンパク質の成熟(例えば、プロテアーゼインヒビター)、およびウイルスの出芽およびウイルスの放出が挙げられる。
ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドに類似している合成化合物であるが、不完全または異常な、デオキシリボース基またはリボース基を有している。一旦、ヌクレオチドアナログが細胞内に存在すると、それらは、リン酸化され、ウイルスDNA中またはウイルスRNA中への取り込みに関して正常ヌクレオチドと競合する、トリホスフェート形態を生成する。一旦、ヌクレオチドアナログのトリホスフェート形態が、伸長する核酸鎖中に取り込まれると、それは、ウイルスポリメラーゼと不可逆的な結合を引き起こし、それによって、鎖終結(chain termination)を引き起こす。ヌクレオチドアナログとしては、アシクロビル(単純ヘルペスウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスの処置に用いられる)、ガンシクロビル(サイトメガロウイルスの処置に有用である)、イドクスウリジン、リバビリン(RSウイルスの処置に有用である)、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジドブジン(アジドチミジン)、イミキモッドおよびレスイミキモッド(resimiquimod)が挙げられるが、これらに限定されない。
上記インターフェロンは、ウイルス感染細胞ならびに免疫細胞によって分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染細胞に隣接する細胞上の特異的レセプターに結合することによって機能し、細胞において細胞をウイルス感染から保護する変化を引き起こす。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンはまた、感染細胞の表面上のクラスI MHC分子およびクラスII MHC分子の発現を誘導し、宿主免疫細胞認識のための増加した抗原提示を生じる。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンは、組換え形態として入手可能であり、そして慢性の、B型肝炎感染およびC型肝炎感染の処置のために使用されてきた。抗ウイルス療法のために有効である投薬量において、インターフェロンは、発熱、倦怠感および体重減少のような重篤な副作用を有している。
本発明で有用な抗ウイルス剤としては、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオチドアナログ、およびプロテアーゼインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。抗ウイルス剤の特定の例としては、アセマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデフォビル、アロブジン(Alovudine)、アルビルセプトスドトックス(Alvircept Sudotox)、塩酸アマンタジン、アラノチン(Aranotin)、アリルドン、アテビルジンメシレート(Atevirdine Mesylate)、アブリジン、シドフォビル、シパムフィリン(Cipamfylline)、塩酸シタラビン、デラビルジンメシレート、デスシクロビル(Desciclovir)、ジダノシン、ジソキサリル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル(Famciclovir)、塩酸ファモチン(Famotine Hydrochloride)、フィアシタビン、フィアルリジン、フォサリレート、フォスカーネットナトリウム、フォスフォネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、ケトキサール(Kethoxal)、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、サキナビルメシレート、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン(Statolon)、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、リン酸ビダラビン、ビダラビンリン酸ナトリウム、ビロキシム(Viroxime)、ザルシタビン、ジドブジン、およびジンビロキシムが挙げられるが、これらに限定されない。
抗真菌剤は、感染性真菌の、処置および予防に有用である。抗真菌剤は、ときとして、それらの作用機構によって分類される。いくつかの抗真菌剤は、グルコース合成を阻害することによって、細胞壁インヒビターとして機能する。これらとしては、バシウンギン(basiungin)/ECBが挙げられるが、これに限定されない。他の抗真菌剤は、膜の統合性を不安定化させることによって機能する。これらとしては、クロトリマゾール、セルタコンゾール(sertaconzole)、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、およびボリコナコール(voriconacole)のようなイミダゾール系、ならびにFK 463、アンホテリシンB,BAY 38−9502、MK 991、プラディマイシン、UK 292,ブテナフィン、およびテルビナフィンが挙げられるが、これらに限定されない。他の抗真菌剤は、キチンを分解すること(例えば、キチナーゼ)によってか、または免疫抑制(501クリーム)によって機能する。
CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、アジュバントのような他の治療的因子と組み合わされて、免疫応答を向上させ得る。そのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび他の治療的因子は、同時にか、または連続して投与され得る。他の治療的因子が、同時に投与される場合、それらは、同一の処方物で投与されても、別の処方物において同時に投与されてもよい。上記他の治療的因子および上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与が、一時的に分離される場合、上記他の治療的因子は、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドと連続して投与される。これらの化合物の投与の間の時間の隔たりは、数分であってもよいし、またはそれより長くてもよい。他の治療的因子としては、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の組成物はまた、非核酸性アジュバントと共に投与され得る。非核酸性アジュバントは、本明細書中に記載されるCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを除く、任意の分子または任意の化合物であり、そのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答を刺激し得る。非核酸性アジュバントとしては、例えば、デポ(depo)効果を引き起こすアジュバント、免疫刺激アジュバント、およびデポ効果を引き起こしかつ免疫系を刺激するアジュバントが挙げられる。
上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、粘膜アジュバントとして有用である。これまでに、全身性免疫および粘膜免疫の両方が、CpGオリゴヌクレオチドの粘膜送達によって誘導されることが見出されてきた。従って、そのオリゴヌクレオチドは、他の粘膜アジュバントとの組み合わせで投与され得る。
免疫応答はまた、サイトカイン(BuelerおよびMulligan,1996;Chowら、1997;Geisslerら、1997;Iwasakiら、1997;Kimら、1997)、もしくはB−7のような共起刺激性分子(Iwasakiら;1997;Tsujiら、1997)とCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドとの同時投与または共直線性(co−linear)発現によって、誘導または増強され得る。用語サイトカインは、ナノモル濃度からピコモル濃度で体液性調節因子として作用し、そして正常な条件下または病理学的条件下のいずれかにおいて、個々の細胞および組織の機能的活性を調節する可溶性タンパク質および可溶性ペプチドの種々の群についての一般的な名称として使用される。これらのタンパク質はまた、直接的に細胞間の相互作用を媒介し、そして細胞外環境で行われるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15、IL−18、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、インターフェロン−γ(γ−IFN)、IFN−α、腫瘍壊死因子(TNF)、TGF−β、FLT−3リガンド、およびCD40リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
上記オリゴヌクレオチドはまた、樹状細胞の生存、分化、活性化および成熟を改善するするのに有用である。上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、細胞の生存、細胞の分化、細胞の活性化および樹状細胞の成熟を促進する固有の能力を有する。
CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、ナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を増強する。ADCCは、細胞標的(例えば、癌細胞)に対して特異的な抗体との組み合わせで、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用して行われ得る。そのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、その抗体との組み合わせで被験体に投与される場合、その被験体の免疫系が誘導されて、その腫瘍細胞を殺傷する。そのADCCの手順に有用な抗体は、身体の中の細胞と相互作用する抗体を含む。細胞標的に対して特異的である多くのこのような抗体は、当該分野において記載されており、そしてその多くは市販されている。
上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、抗癌療法と組み合わせて投与され得る。抗癌療法としては、癌治療薬、照射および外科的手順が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「癌治療薬」とは、癌を処置する目的で被験体に投与される薬剤をいう。本明細書中で使用される場合、「癌を処置する」とは、癌の発症を防ぐこと、癌の症状を軽減させること、および/もしくは確立した癌の成長を阻害することを含む。他の局面において、その癌治療薬は、癌を発症する危険を有する被験体に、その癌を発症する危険を減少させる目的で投与される。癌の処置のための種々の型の医薬が、本明細書中に記載される。本明細書の目的のため、癌治療薬は、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法、および生物学的反応改変因子として分類される。
1つの実施形態において、上記癌治療薬は、以下からなる群より選択される化学療法剤である:メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、クロロエチルニトロソ尿素を含む非糖成分、5−フルオロウラシル、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン(fragyline)、Meglamine GLA、バルルビシン(valrubicin)、カルムスチン(carmustaine)およびポリフェルポサン(poliferposan)、MMI270、BAY 12−9566、RASファメシル(famesyl)トランスフェラーゼインヒビター、ファメシルトランスフェラーゼインヒビター、MMP、MTA/LY231514、LY264618/ロメテキソール(Lometexol)、グラモレック(Glamolec)、CI−994、TNP−470、ハイカムチン/トポテカン、PKC412、バルスポダール/PSC833、ノバントロン/ミトキサントロン、メタレット(Metaret)/スラミン、バスチマスタット(Batimastat)、E7070、BCH−4556、CS−682、9−AC、AG3340、AG3433、インセル(Incel)/VX−710、VX−853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/マーミスタット(Marmistat)、BB2516/マーミスタット、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、レモナール(Lemonal)DP 2202、FK 317、ピシバニール/OK−432、AD 32/バルルビシン、メタストロン(Metastron)/ストロンチウム誘導体、テモダール/テモゾロマイド、エバセット(Evacet)/リポソーム化ドキソルビシン、ユーロタキサン(Yewtaxan)/パクリタキセル、タキソール/パクリタキセル、キセロード(Xeload)/カペシタビン、フルツロン/ドキシフルリジン、シクロパックス(Cyclopax)/経口パクリタキセル、経口タキソイド、SPU−077/シスプラチン、HMR 1275/フラボピリドール、CP−358(774)/EGFR、CP−609(754)/RAS癌遺伝子インヒビター、BMS−182751/経口白金錯体製剤、UFT(テガフール/ウラシル)、エルガミゾール/レバミゾール、エニルウラシル/776C85/5FUエンハンサー、カンプト/レバミゾール、カンプトサール/イリノテカン、ツモデックス(Tumodex)/ラリトレキセド(Ralitrexed)、リウスタチン/クラドリビン、パクセックス(Paxex)/パクリタキセル、ドキシル/リポソーム化ドキソルビシン、シーリクス(Caelyx)/リポソーム化ドキソルビシン、フルダラ/フルダラビン、ファーマルビシン(Pharmarubicin)/エピルビシン、DepoCyt、ZD1839、LU 79553/ビス−ナフタルイミド(Bis−Naphtalimide)、LU 103793/Dolastain、シーティクス(Caetyx)/リポソーム化ドキソルビシン、ジェムザール/ゲムシタビン、ZD 0473/アノルメッド(Anormed)、YM 116、ヨウ素種(lodine seed)、CDK4インヒビターおよびCDK2インヒビター、PARPインヒビター、D4809/デキシフォスアミド(Dexifosamide)、イフェス(Ifes)/Mesnex/イフォスファミド(Ifosamide)、ビューモン/テニポシド、パラプラチン/カルボプラチン、プランチノール(Plantinol)/シスプラチン、ベプシド(Vepeside)/エトポシド、ZD 9331、タキソテール/ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサンアナログ、ニトロソ尿素、メルフェラン(melphelan)およびシクロフォスファミドのようなアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロムブシル(Chlorombucil)、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド(VP16−213)、フロクスウリジン、フルオロウラシル(5−FU)、フルタミド、ヒドロキシ尿素(ヒドロキシカルバミド)、イホスファミド、インターフェロンα−2a、インターフェロンα−2b、酢酸ロイプロリド(LHRH−放出因子アナログ)、ロムスチン(CCNU)、塩酸メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン(o.p’−DDD)、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン(m−AMSA)、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン(HMM)、インターロイキン2、ミトグアゾン(メチル−GAG;メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン;MGBG)、ペントスタチン(2’デオキシコホルマイシン)、セムスチン(メチル−CCNU)、テニポシド(VM−26)、および硫酸ビンデシン。重要な実施形態において、上記癌治療薬は、タキソールである。別の実施形態において、上記癌治療薬は、カルボプラチンとパクリタキセルとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記癌治療薬は、以下からなる群より選択される免疫療法剤である:リブタキシン、ハーセプチン、クアドラメット、パノレックス、IDEC−Y2B8、BEC2、C225、オンコリム、SMART M195、ATRAGEN、オバレックス、ベキサール、LDP−03、ior t6、MDX−210、MDX−11、MDX−22、OV103、3622W94、抗VEGF、ゼナパックス、MDX−220、MDX−447、MELIMMUNE−2、MELIMMUNE−1、CEACIDE、プレターゲット、NovoMAb−G2、TNT、Gliomab−H、GNI−250、EMD−72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm−C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗FLK−2、MDX−260、ANA Ab、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 Ab、およびImmuRAIT−CEA。
さらに、本発明の方法は、上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドとともに1種より多くの癌治療薬の使用を含むことが意図される。例として、適切な場合、そのCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、化学療法剤および免疫療法剤の両方とともに投与され得る。あるいは、その癌治療薬は、癌を有するか、もしくは癌を発症する危険にある被験体を処置する目的で1個体の被験体に全て投与される、免疫療法剤と癌ワクチンとを含んでも、化学療法剤と癌ワクチンとを含んでも、化学療法剤と免疫療法剤と癌ワクチンとを含んでもよい。
免疫療法剤(例えば、モノクローナル抗体)に組み合わせられた上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用は、ADCCの顕著な増強、ナチュラルキラー(NK)細胞の活性化、およびIFNαレベルの増加を含む多くの機構(上記で考察される)を通じて、長期生存を延長し得る。モノクローナル抗体と組み合わせて使用される場合、そのオリゴヌクレオチドは、生物学的結果を達成するのに必要とされる抗体の用量を減少させるように作用する。
本明細書中で使用される場合、用語「癌抗原」および用語「腫瘍抗原」は、癌細胞によって差次的に発現された、それによって癌細胞を標的化するために利用され得る抗原を称するために、交換可能に使用される。癌抗原は、腫瘍特異的免疫応答を潜在的に、明白に刺激し得る抗原である。これらの抗原のいくつかは、正常な細胞によって、コードされるが、必ずしも発現されない。これらの抗原は、正常細胞において、普通は無症候性(すなわち、発現されない)である抗原、分化の特定の段階においてのみ発現される抗原および一時的に発現される抗原(例えば、胚性の抗原および胎性の抗原)として特徴付けられ得る。他の癌抗原は、癌遺伝子(例えば、活性化されたras癌遺伝子)、サプレッサー遺伝子(例えば、変異p53)のような変異細胞内遺伝子によってコードされ、内部欠失または染色体転座から生じる融合タンパク質である。さらに他の癌抗原は、ウイルス遺伝子(例えば、RNA腫瘍ウイルスおよびDNA腫瘍ウイルスに保持される遺伝子)によってコードされ得る。
CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、自己免疫疾患を処置し、そして予防するために有用である。自己免疫疾患とは、被験体自身の抗体が宿主組織と反応し、免疫エフェクターT細胞が内因性自己ペプチドに対して自己反応性であって組織の破壊を生じるという疾患のクラスである。従って、免疫応答は自己抗原と称される被験体自体の抗原に対して惹起される。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性脳脊髄炎、筋無力症(MG)、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡(例えば、尋常性天疱瘡)、グレーヴス病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を有する強皮症、混合結合組織疾患、多発性筋症、悪性貧血、突発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎(例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎)、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病、および自己免疫性糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において用いる場合、「自己抗原(self−antigen)」とは、正常な宿主組織の抗原をいう。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。従って、自己抗原に対して惹起された免疫応答は、自己免疫疾患の状況では、所望されない免疫応答であって、正常な組織の破壊および障害に寄与するが、癌抗原に対して惹起される免疫応答は所望される免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊に寄与する。従って、自己免疫障害を処置する目的の本発明のいくつかの局面において、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、自己抗原(特に、この自己免疫障害の標的である自己抗原)とともに投与されることは推奨されない。
他の場合において、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、低用量の自己抗原とともに送達され得る。多数の動物研究によって、低用量の抗原の粘膜投与が免疫低応答または「寛容(tolerance)」の状態を生じ得ることが実証されている。活性な機構は、Th1から離れて、主にTh2およびTh3(すなわち、TGF−β優勢)応答に向かうサイトカイン媒介性免疫偏移であると考えられる。低用量の抗原送達を用いる活性抑制はまた、無関係の免疫応答を抑制し得(バイスタンダー(bystander)抑制)、これは自己免疫疾患、例えば、関節リウマチおよびSLEの治療においてかなり興味深い。バイスタンダー抑制は、炎症誘発性サイトカインおよびTh1サイトカインが抗原特異的様式または抗原非特異的様式のいずれかで放出される局所環境におけるTh1カウンター調節性、サプレッサーサイトカインの分泌に関与する。本明細書中で使用される場合、「寛容」とは、この現象をいうために使用される。実際、経口寛容は:実験性自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、実験性自己免疫性筋無力症、コラーゲン誘導性関節炎(CIA)およびインスリン依存性糖尿病を含む動物における多数の自己免疫疾患の処置に有用であった。これらのモデルにおいて、自己免疫疾患の予防および抑制は、Th1応答からTh2/Th3応答への抗原特異的な体液性応答および細胞性応答における偏移に関連している。
本発明はまた、抗原に非特異的な生得的免疫の活性化、および感染性の攻撃に対する広いスペクトルの抵抗性を誘導するための方法を包含し、それは、上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用する。本明細書中で使用される場合、用語「抗原に非特異的な生得的免疫の活性化」とは、B細胞以外の免疫細胞の活性化をいい、そして例えば、それは、NK細胞、T細胞もしくは抗原非依存的な様式で応答し得る他の免疫細胞、またはこれらの細胞のいくつかの組み合わせの活性化を包含し得る。感染性の攻撃に対する広いスペクトルの抵抗性は、その免疫細胞が活性形態であり、そしてプライムされて、任意の侵入する化合物および任意の侵入する微生物に応答するので誘導される。その細胞は、特定の抗原に対して特異的にプライムされなくてもよい。このことは、生物兵器を用いた戦争、および上述のような他の状況(例えば、旅行者)において、特に有用である。
CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、被験体に直接投与されてもよいし、または核酸送達複合体と組み合わせて投与されてもよい。核酸送達複合体は、標的手段(例えば標的細胞に対してさらに高い親和性を生じる分子と会合する(例えば、イオン結合もしくは共有結合したか;または内部にカプセル化されて)核酸分子を意味するものとする。核酸送達複合体の例としては、ステロール(例えば、コレステロ−ル)、脂質(例えば、カチオン性脂質、ビロソームまたはリポソーム)、または標的細胞特異的結合因子(例えば、標的細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド)と会合する核酸が挙げられる。好ましい複合体は、インビボで十分に安定であって、標的細胞による内在化の前に重大な脱共役を妨げ得る。しかし、この複合体は、細胞内の適切な条件下で切断可能であり得、それによって上記オリゴヌクレオチドは、機能的形態で放出される。
表面に対して抗原およびオリゴヌクレオチドを送達するための送達ビヒクルまたは送達デバイスが、記載されている。CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび/または抗原および/または他の治療剤は、単独(例えば、生理食塩水または緩衝液中で)か、または当該分野で公知の任意の送達ビヒクルを用いて投与され得る。
用語、「CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効な量」とは、望ましい生物学的効果を実現するのに、必要な量または十分な量をいう。例えば、粘液の免疫を誘導するために抗原と一緒に投与されるCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効量は、抗原に曝露した際に、抗原に応答してIgAの発生を引き起こすのに必要な量であるのに対して、全身性免疫を誘導するために必要とされる量は、抗原に曝露した際に、抗原に応答してIgGの発生を引き起こすのに必要な量である。本明細書中に提供される教示と組み合わせて、種々の活性化合物を選択し、そして因子(例えば、効力、相対的バイオアベイラビリティー、患者体重、有害な副作用の重篤度および投与の好ましい様式)を比較検討することによって、有効な予防処置レジメンまたは治療処置レジメン(実質的な毒性を引き起こさず、なお特定の被験体を処置するのに完全に有効である)が計画され得る。任意の特定の適用についての有効量は、処置される疾患または状態、投与される特定のCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチド、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度のような因子に依存して変動し得る。当業者は、過度な実験を必要とすることなく、特定のCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび/または抗原および/または他の治療剤の有効量を、経験的に決定し得る。
粘膜送達もしくは局所送達のための本明細書中に記載される化合物の被験体用量は、代表的には、約0.1μg/投与〜10mg/投与の範囲であり、これは、その適用が、毎日、毎週、または毎月、およびその間の他の任意の時間に投与され得ることに依存する。より代表的には、粘膜用量または局所用量は、約10μg/投与〜5mg/投与の範囲であり、最も代表的には、約100μg/投与〜1mg/投与であり、2回の投与〜4回の投与が、数日間または数週間の間隔を空けられる。より代表的には、免疫刺激用量は、約1μg/投与〜10mg/投与の範囲であり、最も代表的には、約10μg/投与〜1mg/投与の範囲であり、毎日または毎週投与される。抗原特異的免疫応答を誘導するために非経口送達のための本明細書中に記載される化合物の被験体用量(この化合物は、抗原と一緒に送達されるが、別の治療剤と一緒に送達されない)は、代表的には、ワクチンアジュバントまたは免疫刺激適用のための有効粘膜用量の5倍〜10,000倍高く、より代表的には10倍〜1,000倍高く、最も代表的には20倍〜100倍高い。このCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドが他の治療剤と組み合わせてか、または特殊な送達ビヒクルにおいて投与される場合に、生得的な免疫応答を誘導する目的で、またはADCCを増加する目的で、または抗原特異的な免疫応答を誘導する目的での、非経口送達のための本明細書中に記載される化合物の用量は、代表的には、約0.1μg/投与〜10mg/投与の範囲であり、これは、その適用が、毎日、毎週、または毎月、およびその間の他の任意の時間に投与され得ることに依存する。より代表的には、これらの目的のための非経口用量は、約10μg/投与〜5mg/投与の範囲であり、最も代表的には、約100μg/投与〜1mg/投与であり、2回の投与〜4回の投与が、数日間または数週間の間隔を空けられる。しかし、いくつかの実施形態において、これらの目的のための非経口用量は、上記の代表的な用量よりも5倍〜10,000倍高い範囲で使用され得る。
本明細書中に記載される任意の化合物について、その治療上有効な量は、最初に動物モデルから決定され得る。治療上有効な用量はまた、ヒトにおいて試験された(ヒトの臨床試験が開始された)CpGオリゴヌクレオチドについてのヒトのデータ、および同様の薬理学的活性を示すことが公知である化合物(例えば、他の粘膜アジュバント(例えば、LTおよびワクチン接種用の他の抗原))についてのヒトのデータから、決定され得る。より高用量が、非経口投与のために必要とされ得る。適用される用量は、投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティーおよび効力に基づいて、調整され得る。その用量を、上記の方法および当該分野で周知の他の方法に基づいて最大効力を達成するように調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液において投与され、この溶液は、慣用的には、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存剤、適合性キャリア、アジュバント、および必要に応じて他の治療成分を含み得る。
療法における使用のために、有効な量の上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、所望される表面(例えば、粘膜表面、全身表面)にその核酸を送達する任意の様式によって、被験体に投与され得る。本発明の薬学的組成物を投与することは、当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。好ましい投与経路としては、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、および直腸が挙げられるが、これらに限定されない。
経口投与については、化合物(すなわち、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチド、抗原および他の治療因子)は、活性化合物と当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアとを合わせることによって容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の化合物が、処置されるべき被験体による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして処方されることを可能にする。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤として得ることが可能であり、所望の場合、錠剤または糖衣錠コアを得るために、必要に応じて、適切な補助剤を添加した後に、得られた混合物を粉砕して、顆粒のこの混合物を処理する。適切な賦形剤は、特に、フィラー(filler)(例えば、糖)であり、これとしては、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール;セルロース調製物(例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント(gum tragacanth)、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウムのような)、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)などが挙げられる。所望される場合、崩壊剤(disintegrating agent)(例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはその塩(例えば、アルギン酸ナトリウム))が、添加され得る。必要に応じて、経口処方物はまた、内部の酸状態を中和するために、生理食塩水または緩衝液(すなわち、EDTA)において処方されてもよく、全くキャリアを伴わずに投与されてもよい。
上記の成分の経口投薬形態がまた、特に企図される。この成分は、誘導体の経口送達が有効であるように化学的に改変され得る。一般に、企図される化学的改変は、成分の分子自体への少なくとも1つの部分の結合であり、ここでこの部分は、(a)タンパク質分解の阻害;および(b)胃または腸からの血流への取り込みを可能にする。成分の全体的な安定性の増大、および身体内での循環時間の延長がまた、所望される。このような部分の例としては、以下が挙げられる:ポリエチレングリコール、エチレングリコールのコポリマー、およびプロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリン。Abuchowskiおよび Davis、1981、「Soluble Polymer−Enzyme Adducts」Enzymes as Drugs,Hocenberg and Roberts編、Wiley−Interscience,New York,NY,pp.367〜383;Newmarkら、1982,J.Appl.Biochem.4:185〜189。使用され得る他のポリマーは、ポリ−1,3−ジオキソラン、およびポリ−1,3,6−チオキソカン(tioxocane)である。薬学的用途のために好ましいのは、上記で示されるように、ポリエチレングリコール部分である。
成分について、放出の位置は、胃であっても、小腸(十二指腸、空腸または回腸)であっても、または大腸であってもよい。当業者は、胃で溶けないが、十二指腸または腸のいずれかにおいて物質を放出する、利用可能な処方物を有する。好ましくは、この放出は、オリゴヌクレオチドの保護によってか、または腸内のような胃の環境を通過してからの生物学的に活性な物質の放出によって、胃の環境の有害な影響を回避する。
完全な胃の耐性を確保するために、少なくともpH5.0までの不浸透性のコーティングが、必須である。腸溶性のコーティングとして用いられるさらに一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース(CAT)、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリビニルアセテートフタレート(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、酢酸フタル酸セルロース(CAP)、Eudragit L、Eudragit S、およびShellacである。これらのコーティングは、混合されたフィルムとして使用され得る。
コーティングまたはコーティングの混合物はまた、胃に対する保護に関しては意図してない錠剤上に使用され得る。これとしては、糖コーティング、または錠剤がより容易に嚥下されるようにするコーティングが挙げられ得る。カプセルは、乾燥した治療剤、すなわち粉末の送達のための硬性のシェル(例えば、ゼラチン)から構成され得る;液体形態のためには、軟ゼラチンのシェルが、使用され得る。カプレット(cachets)のシェルの材料は、粘性のデンプンであっても、または他の食用の紙であってもよい。丸剤、トローチ、成形錠剤または錠剤粉薬については、モイストマッシング(moist massing)技術を用いてもよい。
治療剤は、顆粒または約1mmサイズの粒子のペレットの形態で、微細なマルチパーティキュレート(multi−particulate)として処方物に含まれ得る。カプセル投与のための物質の処方物はまた、粉末として、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤としてでさえあり得る。治療剤は、圧縮によって調製されてもよい。
着色剤および香料は、全て含まれ得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、処方され得(例えば、リポソームまたはマイクロスフェアカプセル化によって)、次いでさらに、着色剤および香料を含む清涼飲料のような食品に含まれてもよい。
不活性物質を用いて治療剤の容積を希釈しても、増大させてもよい。これらの希釈剤としては、炭水化物(特に、マンニトール、a−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改変デキストランおよびデンプン)が挙げられ得る。特定の無機塩はまた、フィラーとして用いられ得るが、これにとしては、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムが挙げられる。いくつかの市販の希釈剤は、Fast−Flo、Emdex、STA−Rx 1500、EmcompressおよびAvicellである。
崩壊剤(disintegrant)は、固体投薬形態への治療剤の処方物に含まれ得る。崩壊剤として用いられる物質としては、デンプンに基づく市販の錠剤崩壊物質(Explotab)を含む、デンプンが挙げられるが、これに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Amberlite、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラマイロペクチン(ultramylopectin)、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、海綿およびベントナイトは全て用いることができる。崩壊剤の別の形態は、不溶性のカチオン交換樹脂である。粉末化ガムは、崩壊剤として、そして結合剤として用いられ得、そしてこれらとしては、寒天、カラヤまたはトラガカントのような粉末化ゴムが挙げられ得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩はまた、崩壊剤として有用である。
結合剤は、治療剤を一緒に保持して硬性の錠剤を形成するために用いられ得、そしてこれには、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンのような天然産物由来の物質が挙げられる。他には、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)、およびカルボキシメチルセルロース(CMC)が挙げられる。ポリビニルピロリドン(PVP)およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は両方とも、治療剤を粒化するためにアルコール溶液に使用され得る。
抗摩擦剤は、処方プロセスの間の固着を防止するために治療剤の処方物に含まれ得る。滑沢剤は、治療剤とダイ壁との間の層として用いられ得、そしてこれらとしては、ステアリン酸マグネシウムおよびカルシウムの塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、液体パラフィン、植物油およびワックスが挙げられるが、これらに限定されない。可溶性の滑沢剤、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000およびCarbowax 6000もまた、使用され得る。
処方の間の薬物の流動特性を改善し、そして圧縮の間の再配列を補助し得る流動促進剤が、添加され得る。流動促進剤としては、デンプン、タルク、発熱性シリカおよび水和シリコアルミン酸が挙げられ得る。
水性の環境への治療剤の溶解を補助するために、サーファクタントが、湿潤剤として添加され得る。サーファクタントとしては、アニオン性界面活性剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウム)が挙げられ得る。カチオン性界面活性剤が、使用され得、これとしては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウムが挙げられ得る。サーファクタントとして処方物に含まれ得る有力な非イオン性界面活性剤の一覧は、ラウロマクロゴール400、ポリオキシル40ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油10、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油50およびポリオキシエチレン水素化ヒマシ油60、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート65およびポリソルベート80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらのサーファクタントは、オリゴヌクレオチドまたは誘導体のいずれか単独の処方物中に存在し得るか、または異なる比の混合物として存在し得る。
経口的に用いられ得る薬学的調製物としては、ゼラチンから作製される押込み嵌めカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤(例えば、グリセロールまたはソルビトール)から作製される密閉された軟カプセルが挙げられる。押込み嵌めカプセルは、フィラー(例えば、ラクトース)、結合剤(例えば、デンプン)、および/または滑沢剤(例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム)、および必要に応じて安定化剤と混合されて活性成分を含み得る。軟カプセルにおいて、この活性化合物は、適切な液体、例えば、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールに溶解されてもよく、懸濁されてもよい。さらに、安定化剤が、添加され得る。経口投与のために処方されたマイクロスフェアもまた、用いられ得る。このようなマイクロスフェアは、当該分野で十分に規定されている。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投薬量でなければならない。
口腔内(buccal)投与のために、この組成物は従来の様式で処方される錠剤またはトローチの形態をとり得る。
吸入による投与のために、本発明に従う使用のための化合物は、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーを提示する形態で、適切な噴霧剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体)を使用して、従来のように送達され得る。加圧エアロゾルの場合、その投薬単位は、計量した量を送達するための弁を提供することによって、決定され得る。吸入器または注入器において使用するために、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、その化合物と適切な粉末基剤(例えば、ラクトースまたはデンプン)との粉末混合物を含んで、処方され得る。
オリゴヌクレオチド(またはその誘導体)の肺送達がまた、本明細書において企図される。オリゴヌクレオチドは、吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮を横切って血流に入る。吸入された分子の他の報告としては、Adjeiら、1990、Pharmaceutical Research,7:565〜569;Adjeiら、1990、International Journal of Pharmaceutics,63:135〜144(酢酸ロイプロリド);Braquetら、1989、Journal of Cardiovascular Pharmacology,13(補遺.5):143〜146(エンドセリン−1);Hubbardら、1989、Annals of Internal Medicine,第III巻、206〜212頁(a1−アンチトリプシン);Smithら、1989、J.Clin.Invest.84: 1145〜1146(a−1−プロテイナーゼ);Osweinら,1990、「Aerosolization of Proteins」、Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II,Keystone,Colorado,March,(組換えヒト成長ホルモン);Debsら,1988,J.Immunol.140: 3482〜3488(インターフェロン−gおよび腫瘍壊死因子α)およびPlatzら、米国特許第5,284,656号(顆粒球コロニー刺激因子)が挙げられる。全身性の効果のための薬物の肺送達のための方法および組成物は、Wongらの1995年9月19日発行の米国特許第5,451,569号に記載されている。
本発明の実施における使用について企図されるのは、治療製品の肺送達のために設計された広範な機構的デバイスであり、これらのデバイスとしては、全て当業者に周知である、噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の実施に適切な市販のデバイスのいくつかの特定の例は、Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Missouriによって製造された、Ultravent噴霧器;Marquest Medical Products Englewood,Coloradoによって製造されたAcorn II噴霧器;Glaxo Inc.,Research Triangle Park,North Carolinaによって製造されたVentolin定量吸入器;ならびにFisons Corp.,Bedford,Massachusettsによって製造されたSpinhaler粉末吸入器である。
このようなデバイスの全ては、オリゴヌクレオチド(または誘導体)の分散のために適切な処方物の使用を必要とする。代表的には、各々の処方物は、使用されるデバイスのタイプに特異的であり、そして治療において有用な希釈剤、アジュバントおよび/またはキャリアに加えて、適切な噴霧剤物質の使用に関与し得る。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、包接複合体(inclusion complex)または他の型のキャリアの使用が考慮される。化学的に改変されたオリゴヌクレオチドはまた、化学的改変の型または利用されるデバイスの型に依存して異なる処方物において調製されてもよい。
ジェットまたは超音波のいずれかの噴霧器を用いた使用に適切な処方物は、代表的には、溶液1mLあたり約0.1〜25mgの生物学的に活性なオリゴヌクレオチドの濃度で、水に溶解されたオリゴヌクレオチドを含む。この処方物はまた、緩衝液および単糖を含み得る(例えば、オリゴヌクレオチド安定化、および浸透圧の調節のため)。噴霧器処方物はまた、エアロゾルの形成において溶液の微粒化によって生じるオリゴヌクレオチドの表面誘導性の凝集を軽減または防止するためにサーファクタントを含み得る。
定量吸入器デバイスによる使用のための処方物は、一般に、サーファクタントの補助により噴霧剤に懸濁された上記オリゴヌクレオチドを含む微細に粉砕された粉末を含む。その噴霧剤は、この目的のために使用される任意の従来の物質(例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素)であり得、これとしては、トリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2−テトラフルオロエタン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。適切なサーファクタントとしては、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、サーファクタントとして有用であり得る。
粉末吸入器デバイスから分散するための処方物は、オリゴヌクレオチドを含む、微細に粉砕された乾燥粉末を含み、そしてまた充填剤(bulking agent)(例えば、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトール)を、デバイスからのこの粉末の分散を容易にする量(例えば,処方物の50〜90重量%の量)で含み得る。オリゴヌクレオチドは、肺の遠位への最も有効な送達のために、10mm(またはミクロン)未満、最も好ましくは0.5〜5mmの平均粒子サイズを有する粒子形態で最も有利に調製されるべきである。
本発明の薬学的組成物の経鼻送達もまた、企図される。経鼻送達によって、鼻へこの治療製品を投与した後、肺にこの製品が沈着する必要なしに、本発明の薬学的組成物の血流への直接の通過が可能になる。経鼻送達のための処方物としては、デキストランまたはシクロデキストランを含む処方物が挙げられる。
経鼻投与のために、有用なデバイスは、一定用量スプレイヤーが取り付けられる、小さい硬性のボトルである。1つの実施形態において、この定用量は、規定の容積のチャンバへ本発明の溶液の薬学的組成物を吸引することによって送達され、このチャンバは、このチャンバ中の液体が加圧される場合、スプレーを形成することによってエアロゾル化するための寸法決めされたアパーチャおよびエアロゾル処方物を有する。このチャンバは、本発明の薬学的組成物を投与するように加圧される。特定の実施形態において、このチャンバはピストン構成である。このようなデバイスは市販されている。
あるいは、圧搾される場合に、噴霧を形成することによってエアロゾル処方物をエアロゾル化するように寸法決めされたアパーチャまたは開口部を有するプラスチックのスクイーズボトルが用いられる。この開口は、一般に、ボトルの頂部に見出され、この頂部は一般に、エアロゾル処方物の効率的な投与のために、鼻の経路において部分的に適合するように傾斜付けされる。好ましくは、経鼻吸入器は、この薬物の測定した用量の投与のために、エアロゾル処方物の一定量を提供する。
この化合物は、全身的に送達することが望ましい場合に、注入(例えば、ボーラス注入または連続注入)による非経口投与のために処方され得る。注入のための処方物は、単位投与形態で(例えば、アンプルまたは複数用量容器中に)、添加された保存剤とともに提示され得る。その組成物は、油性ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の懸濁物、溶液、またはエマルジョンのような形態をとり得、そして処方剤(例えば、懸濁剤、安定化剤、および/もしくは分散剤)を含み得る。
非経口投与のための薬学的処方物としては、水溶性形態のその活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、その活性化合物の懸濁物が、適切な油性注入懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪油(例えば、ゴマ油)または合成脂肪酸エステル(例えば、オレイン酸エチル、もしくはトリグリセリド)、またはリポソームが挙げられる。水性注入懸濁物は、その懸濁物の粘性を増加する物質(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン)を含み得る。必要に応じて、その懸濁物はまた、非常に濃縮された溶液の調製を可能にするために、適切な安定化剤またはその化合物の溶解度を増加する薬剤を含み得る。
あるいは、その活性化合物は、適切なビヒクル(例えば、発熱物質を含まない滅菌した水)を用いて使用前に構成するための、粉末形態であり得る。
この化合物はまた、例えば、従来の坐剤基剤(例えば、カカオ脂または他のグリセリド)を含む)坐剤または貯留浣腸のような、直腸組成物または膣組成物の状態で処方され得る。
上記の処方物に加えて、この化合物はまた、デポー(depot)調製物として処方され得る。そのような長期作用処方物は、適切なポリマー物質もしくは疎水性物質を用いて(例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして)か、またはイオン交換樹脂を用いてか、または溶解性が乏しい誘導体(例えば、溶解性が乏しい塩)として、処方され得る。
この薬学的組成物はまた、適切な固相もしくはゲル相の、キャリアもしくは賦形剤を含み得る。そのようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)が挙げられるが、これらに限定されない。
適切な液体もしくは固体の薬学的調製物形態は、例えば、吸入用の水溶液もしくは生理食塩水溶液であるか、マイクロカプセル化されているか、渦巻き状(encochleated)になっているか、顕微的な金粒子上にコーティングされているか、リポソーム中に含まれるか、噴霧されるか、エアロゾルであるか、皮膚移植用のペレットであるか、または皮膚中に掻き入れるべき鋭利な物体上に乾燥されている。上記薬学的組成物はまた、顆粒、散剤、錠剤、コーティングされた錠剤、(マイクロ)カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁物、クリーム、活性化合物を長期放出する液滴もしくは調製物を包含し、その調製賦形剤および添加剤および/または補助剤(例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、香料、甘味料または溶解剤)は、上記のように慣習的に使用される。上記薬学的組成物は、種々の薬物送達系において使用するために適切である。薬物送達のための方法の簡略な概説については、Langer,Science 249:1527〜1533、1990(これは、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。
上記CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および必要に応じて他の治療剤、および/または抗原は、それ自体が(そのまま)投与され得るか、または薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。薬物中で使用される場合、その塩は、薬学的に受容可能であるべきであるが、薬学的に受容可能ではない塩が、その薬学的に受容可能な塩を調製するために簡便に使用され得る。そのような塩としては、以下の酸から調製された塩が挙げられるが、それらに限定されない:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−2−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩(例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩)として調製され得る。
適切な緩衝化剤としては、酢酸および塩(1〜2% w/v);クエン酸および塩(1〜3% w/v);ホウ酸および塩(0.5〜2.5% w/v);およびリン酸および塩(0.8〜2% w/v)が挙げられる。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム(0.003〜0.03% w/v);クロロブタノール(0.3〜0.9% w/v);パラベン類(0.01〜0.25% w/v)、およびチメロサール(0.004〜0.02% w/v)が挙げられる。
本発明の薬学的組成物は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中に含まれる、有効な量のCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および必要に応じて、抗原および/または他の薬剤を含有する。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適切な、1つ以上の適合性である固体もしくは液体の、フィラー、希釈剤、またははカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」とは、活性成分がその適用を容易にするために合わせられる、天然もしくは合成の、有機成分または無機成分を示す。その薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用が存在しない様式で、本発明の化合物と互いに混合可能である。
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。以下の実施例は、いかようにも、さらなる限定として解釈されるべきではない。本明細書全体を通して引用された参考文献(文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願)のすべての内容全体が、本明細書中に参考として明示的に援用される。
(オリゴデオキシヌクレオチド(ODN))
以下のODNを、本実施例において使用する。
以下のODNを、本実施例において使用する。
(オリゴデオキシヌクレオチド(ODN))
ODNを、Biospring (Frankfurt、Germany)またはSigma−Ark(Darmstadt、Germany)から購入し、Coley Pharmaceutical GmbH(Langenfeld,Germany)によって同一性および純度について管理した。ODNを、リン酸緩衝化生理食塩水(Sigma,Germany)で希釈し、−20℃で保存した。全ての希釈を、発熱物質を含まない試薬を用いて行った。配列番号15〜23のODNは、Trilink Biotechnologiesによって合成された。
(細胞の精製)
健常な男性および女性のヒトドナーに由来する末梢血軟膜の調製物を、Blood Bank of the University of Duesseldorf(Germany)から入手し、これらからPBMCを、Ficoll−Hypaque(Sigma)での遠心分離によって精製した。精製したPBMCを、新鮮なまま使用した(ほとんどのアッセイについて)か、または凍結培地中に懸濁して−70℃で保存したかのいずれかであった。必要な場合には、これらの細胞のアリコートを解凍し、洗浄し、5%(v/v)の熱非働化ヒトAB血清(BioWhittaker,Belgium)または10%(v/v)の熱非働化FCS、2.0mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリンと、100μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogen (Karlsruhe、Germany))を補充したRPMI 1640培養培地中に再懸濁した。
健常な男性および女性のヒトドナーに由来する末梢血軟膜の調製物を、Blood Bank of the University of Duesseldorf(Germany)から入手し、これらからPBMCを、Ficoll−Hypaque(Sigma)での遠心分離によって精製した。精製したPBMCを、新鮮なまま使用した(ほとんどのアッセイについて)か、または凍結培地中に懸濁して−70℃で保存したかのいずれかであった。必要な場合には、これらの細胞のアリコートを解凍し、洗浄し、5%(v/v)の熱非働化ヒトAB血清(BioWhittaker,Belgium)または10%(v/v)の熱非働化FCS、2.0mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリンと、100μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogen (Karlsruhe、Germany))を補充したRPMI 1640培養培地中に再懸濁した。
(サイトカインの検出)
解凍したPBMCまたは新鮮なPBMCを、48ウェル平底プレート、または96ウェル丸底プレート上に播種し、示されるような濃度のODNと一緒に、加湿インキュベーター中で37℃にてインキュベートした。培養上清を回収し、すぐに使用しない場合は、上清を必要になるまで−20℃で凍結させた。上清中のサイトカインの量を、市販のELISAキット(Diaclone、USA)か、または市販の抗体(Becton Dickinson/PharmingenまたはPBL)を用いて開発した自社製のELISAを使用して評価した。
解凍したPBMCまたは新鮮なPBMCを、48ウェル平底プレート、または96ウェル丸底プレート上に播種し、示されるような濃度のODNと一緒に、加湿インキュベーター中で37℃にてインキュベートした。培養上清を回収し、すぐに使用しない場合は、上清を必要になるまで−20℃で凍結させた。上清中のサイトカインの量を、市販のELISAキット(Diaclone、USA)か、または市販の抗体(Becton Dickinson/PharmingenまたはPBL)を用いて開発した自社製のELISAを使用して評価した。
実施例13の研究を、以下の通りに行った:
脾臓を6匹のマウス(雄、BALB/c)から取り出した。各脾臓由来の脾細胞を、細胞ふるい(70μmポアサイズ)によって穏やかに押すことによって分離し、次いでその脾細胞をプールした。脾細胞を、培養プレートのウェルに添加した。900μlの容量の培地中の1×107個の細胞を、各ウェルに添加した。培地は、10%のウシ胎仔血清を含むRPMI 1640であった。培地中のCpG ODN溶液の100μlのアリコートを、それらのウェル中の0.01〜10μg/mlの最終濃度を与えるように、各ウェルに添加した。36時間インキュベート(37℃、5% CO2インキュベーター)した後、培養上清を、回収し、そしてLuminex多重化アッセイ(IFNγ、IP−10、IL−10、IL−6、TNFα)またはELISA(IFNα)のいずれかを使用してサイトカインの濃度についてアッセイした。
脾臓を6匹のマウス(雄、BALB/c)から取り出した。各脾臓由来の脾細胞を、細胞ふるい(70μmポアサイズ)によって穏やかに押すことによって分離し、次いでその脾細胞をプールした。脾細胞を、培養プレートのウェルに添加した。900μlの容量の培地中の1×107個の細胞を、各ウェルに添加した。培地は、10%のウシ胎仔血清を含むRPMI 1640であった。培地中のCpG ODN溶液の100μlのアリコートを、それらのウェル中の0.01〜10μg/mlの最終濃度を与えるように、各ウェルに添加した。36時間インキュベート(37℃、5% CO2インキュベーター)した後、培養上清を、回収し、そしてLuminex多重化アッセイ(IFNγ、IP−10、IL−10、IL−6、TNFα)またはELISA(IFNα)のいずれかを使用してサイトカインの濃度についてアッセイした。
(モルモットの鼻の抵抗における抗原誘導性の増加の誘導)
モルモット(雄、Hartley)を、研究の0日目において抗原(オボアルブミン、5mgで、腹腔内および皮下の両方)で感作した。ブーストの感作(5mg、腹腔内)を、研究の4日目において与えた。モルモットに、2週間連続して各週に2回、鼻腔内に投与される抗原に対する曝露によって抗原をチャレンジ(challenge)した。最初のチャレンジは、研究の14日目であった。配列番号7(ロット番号AQE−03J−001−M、150μl/kgの生理食塩水中に0.03〜1mg/kg)を、各週に1度(その週の第1の抗原チャレンジの2日前)、鼻腔内に投与した。研究の24日目における最後のチャレンジを除いては、抗原チャレンジは、オボアルブミン(150μl/kgの生理食塩水中に1.5mg/kg)を用いた。動物を、チャレンジの30分前にメピラミン(10mg/kg、腹腔内)を用いて前処置して、ヒスタミン誘導性のアナフィラキシーから保護した。研究の24日目において、モルモットを、Buxco呼吸力学システムおよびソフトウェアを使用して鼻の抵抗の測定を可能にするために麻酔した。次いで最後の抗原チャレンジを、上咽頭に送達されるオボアルブミン(250μlの生理食塩水中に2.5mg)によって行った。動物を、チャレンジの30分前にメピラミン(3mg/kg、腹腔内)によって前処置した。鼻の抵抗を、チャレンジ後に40分間測定した。
モルモット(雄、Hartley)を、研究の0日目において抗原(オボアルブミン、5mgで、腹腔内および皮下の両方)で感作した。ブーストの感作(5mg、腹腔内)を、研究の4日目において与えた。モルモットに、2週間連続して各週に2回、鼻腔内に投与される抗原に対する曝露によって抗原をチャレンジ(challenge)した。最初のチャレンジは、研究の14日目であった。配列番号7(ロット番号AQE−03J−001−M、150μl/kgの生理食塩水中に0.03〜1mg/kg)を、各週に1度(その週の第1の抗原チャレンジの2日前)、鼻腔内に投与した。研究の24日目における最後のチャレンジを除いては、抗原チャレンジは、オボアルブミン(150μl/kgの生理食塩水中に1.5mg/kg)を用いた。動物を、チャレンジの30分前にメピラミン(10mg/kg、腹腔内)を用いて前処置して、ヒスタミン誘導性のアナフィラキシーから保護した。研究の24日目において、モルモットを、Buxco呼吸力学システムおよびソフトウェアを使用して鼻の抵抗の測定を可能にするために麻酔した。次いで最後の抗原チャレンジを、上咽頭に送達されるオボアルブミン(250μlの生理食塩水中に2.5mg)によって行った。動物を、チャレンジの30分前にメピラミン(3mg/kg、腹腔内)によって前処置した。鼻の抵抗を、チャレンジ後に40分間測定した。
(マウスの鼻の抵抗における抗原誘導性の増加の誘導)
マウス(雄、BALB/c)を、水酸化アルミニウムアジュバント(Pierce Alum i.p.)を伴う抗原(オボアルブミン、100μg、i.p.)を用いて、研究の0日目および7日目に感作した。マウスに、鼻腔内に投与される抗原(10μlの生理食塩水中に1mg)に対する曝露によって、毎日、抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の14日目であった。配列番号7を、鼻腔内に2回投与した。第1の用量を、第1の抗原チャレンジの2日前に与えた。第2の用量を、7日後に与えた。あるいは、ブデソニド(抗炎症性の、合成副腎皮質ステロイド)を、鼻腔内に毎日投与した。第1の用量を、第1の抗原チャレンジの2日前に与えた。それぞれの日において、ブデソニドの用量を、鼻腔内の抗原チャレンジの4時間前に、鼻腔内に投与した。エンドポイントを、研究の26日目(すなわち、配列番号7の第2の用量の7日後)に測定した。鼻の組織を、炎症の組織病理学的な評価のために採取した。別個のマウスは、最後の抗原チャレンジを受容した。くしゃみの頻度および鼻を擦る頻度を、チャレンジ後に10分間計測した。
マウス(雄、BALB/c)を、水酸化アルミニウムアジュバント(Pierce Alum i.p.)を伴う抗原(オボアルブミン、100μg、i.p.)を用いて、研究の0日目および7日目に感作した。マウスに、鼻腔内に投与される抗原(10μlの生理食塩水中に1mg)に対する曝露によって、毎日、抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の14日目であった。配列番号7を、鼻腔内に2回投与した。第1の用量を、第1の抗原チャレンジの2日前に与えた。第2の用量を、7日後に与えた。あるいは、ブデソニド(抗炎症性の、合成副腎皮質ステロイド)を、鼻腔内に毎日投与した。第1の用量を、第1の抗原チャレンジの2日前に与えた。それぞれの日において、ブデソニドの用量を、鼻腔内の抗原チャレンジの4時間前に、鼻腔内に投与した。エンドポイントを、研究の26日目(すなわち、配列番号7の第2の用量の7日後)に測定した。鼻の組織を、炎症の組織病理学的な評価のために採取した。別個のマウスは、最後の抗原チャレンジを受容した。くしゃみの頻度および鼻を擦る頻度を、チャレンジ後に10分間計測した。
(統計分析)
Mann−Whitney検定を、比較される集団が標準ではないデータセットの比較のために使用した。Dunnitt多重比較検定を、単一のコントロールに対するデータセットの比較のために使用した。
Mann−Whitney検定を、比較される集団が標準ではないデータセットの比較のために使用した。Dunnitt多重比較検定を、単一のコントロールに対するデータセットの比較のために使用した。
(インビボのマウスにおけるサイトカインの誘導)
マウス(雄、BALB/c)に、CpG ODN(0.1mg/kgおよび1mg/kg)またはコントロールビヒクル(生理食塩水、25μl)を鼻腔内滴注によって投薬した。気管支肺胞洗浄液および血清(心穿刺によって得た血液から分離した)を、投薬の8時間後および15時間後に回収した。気管支肺胞洗浄液中の細胞数を、Advia自動細胞カウンターによって計測した。気管支肺胞洗浄液および血清中のサイトカインならびにケモカインの濃度を、ELISA(IFNα、IL−12p40)またはLuminexサイトカイン多重化システム(IFNγ、IP−10、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−13、IL−15、IL−17、GM−CSF、RANTES、TNFα)のいずれかを使用してアッセイした。検出可能な最大濃度は、各分析物について異なるが、0.3〜12pg/mlの範囲である。
マウス(雄、BALB/c)に、CpG ODN(0.1mg/kgおよび1mg/kg)またはコントロールビヒクル(生理食塩水、25μl)を鼻腔内滴注によって投薬した。気管支肺胞洗浄液および血清(心穿刺によって得た血液から分離した)を、投薬の8時間後および15時間後に回収した。気管支肺胞洗浄液中の細胞数を、Advia自動細胞カウンターによって計測した。気管支肺胞洗浄液および血清中のサイトカインならびにケモカインの濃度を、ELISA(IFNα、IL−12p40)またはLuminexサイトカイン多重化システム(IFNγ、IP−10、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−13、IL−15、IL−17、GM−CSF、RANTES、TNFα)のいずれかを使用してアッセイした。検出可能な最大濃度は、各分析物について異なるが、0.3〜12pg/mlの範囲である。
(マウスの気道における炎症のインフルエンザウイルスによる誘導)
インフルエンザウイルス(インフルエンザA型、サブタイプH1N1、マウス適応株PR8)は、David Woodhouse、Trudeau Institute、Saranac Lake、NYからの寄贈品であった。インフルエンザの用量を滴定し、そして感染の時間経過を決定する予備研究として、BALB/cマウス(雌)を、研究の0日目における鼻腔内滴注によってインフルエンザウイルスに感染させた。マウスは、40μlの生理食塩水中のウイルスの50、200または500の鶏卵感染量(egg−infective dose)(EID)50を受容した。気道感染を、感染の1日後、3日後、6日後、9日後および14日後に評価した。
インフルエンザウイルス(インフルエンザA型、サブタイプH1N1、マウス適応株PR8)は、David Woodhouse、Trudeau Institute、Saranac Lake、NYからの寄贈品であった。インフルエンザの用量を滴定し、そして感染の時間経過を決定する予備研究として、BALB/cマウス(雌)を、研究の0日目における鼻腔内滴注によってインフルエンザウイルスに感染させた。マウスは、40μlの生理食塩水中のウイルスの50、200または500の鶏卵感染量(egg−infective dose)(EID)50を受容した。気道感染を、感染の1日後、3日後、6日後、9日後および14日後に評価した。
(CpG ODNの鼻腔内投与および気道感染の測定)
マウスは、25μlの生理食塩水中の鼻腔内滴注によって、CpG ODN(0.03mg/kg、0.3mg/kg、または3mg/kg)を受容した。それぞれのマウスに、2回(インフルエンザウイルス(200のEID50、鼻腔内)による感染の6日後および2日後)投薬した。このウイルス用量は、予備研究から選択された。気道感染および肺におけるウイルスの負荷を、ウイルス感染の6日後に評価した。この時点は、予備研究から選択された。気道中の細胞を、気管支肺胞洗浄によって回収した。総白血球の計測を、Advia自動細胞カウンター(Adiva、Bayer Diagnostics、Zurich、Switzerland)によって行なった。分化細胞の計測を、Wright−Giemza染色によって染色した細胞遠心分離調製物の光学顕微鏡法によって行なった。肺を取り出し、そして300μlの滅菌したPBSを用いてホモジナイズした。上清を回収し、そしてウイルスの負荷を、製造業者の説明書を用いて、酵素免疫アッセイキット(Takara Biomedical、Shiga、Japan)を使用してアッセイした。このアッセイは、固相としてインフルエンザAウイルスの核タンパク質に対するモノクローナル抗体、およびポリクローナルの抗インフルエンザウイルス検出抗体を利用する。
マウスは、25μlの生理食塩水中の鼻腔内滴注によって、CpG ODN(0.03mg/kg、0.3mg/kg、または3mg/kg)を受容した。それぞれのマウスに、2回(インフルエンザウイルス(200のEID50、鼻腔内)による感染の6日後および2日後)投薬した。このウイルス用量は、予備研究から選択された。気道感染および肺におけるウイルスの負荷を、ウイルス感染の6日後に評価した。この時点は、予備研究から選択された。気道中の細胞を、気管支肺胞洗浄によって回収した。総白血球の計測を、Advia自動細胞カウンター(Adiva、Bayer Diagnostics、Zurich、Switzerland)によって行なった。分化細胞の計測を、Wright−Giemza染色によって染色した細胞遠心分離調製物の光学顕微鏡法によって行なった。肺を取り出し、そして300μlの滅菌したPBSを用いてホモジナイズした。上清を回収し、そしてウイルスの負荷を、製造業者の説明書を用いて、酵素免疫アッセイキット(Takara Biomedical、Shiga、Japan)を使用してアッセイした。このアッセイは、固相としてインフルエンザAウイルスの核タンパク質に対するモノクローナル抗体、およびポリクローナルの抗インフルエンザウイルス検出抗体を利用する。
(実施例1:CpG ODNを用いて処理したヒトPBMCによるIFN−α分泌に対する効果)
方法:3つのドナー(配列番号4、配列番号5、配列番号6)または7つのドナー(配列番号1、配列番号2、配列番号3)のいずれかに由来するヒト末梢血単核細胞を、CpG ODNと一緒に、示した濃度にて48時間インキュベートした。ヒトPBMCによるインターフェロン−α分泌を測定した。
方法:3つのドナー(配列番号4、配列番号5、配列番号6)または7つのドナー(配列番号1、配列番号2、配列番号3)のいずれかに由来するヒト末梢血単核細胞を、CpG ODNと一緒に、示した濃度にて48時間インキュベートした。ヒトPBMCによるインターフェロン−α分泌を測定した。
結果:図1は、CpG ODNとのインキュベーションの際の、増加したIFN−αの産生を示す。データは、平均+/−SEMを示す。異なるドナー由来のPBMCを使用し、そして各ドナーから生じる結果は可変性であるので、pg/mlの絶対レベルが、直接比較できないことに留意すべきである。
(実施例2:インビボのTLR9トランスフェクト細胞の刺激)
方法:ヒトTLR9によってトランスフェクトしたHEK 293細胞を、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6と一緒に、16時間インキュベートした。そのシグナルを、ルシフェラーゼの読み値によって測定した。
方法:ヒトTLR9によってトランスフェクトしたHEK 293細胞を、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6と一緒に、16時間インキュベートした。そのシグナルを、ルシフェラーゼの読み値によって測定した。
結果:結果を、表1に示す。EC50を、Sigma Plot(SigmaPlot 2002 for Windows(登録商標) バージョン8.0)を使用して算出した。最大刺激指数(max SI)を、あらゆるODNに対して試験した全ての濃度のうちの最も高い値と、培地のコントロールとの間の商として算出した。
方法:モルモットの鼻の抵抗における抗原誘導性の増加に対するCpGオリゴデオキシヌクレオチド配列番号7の効果を調査するために、モルモットを、抗原によって感作し、次いで鼻に抗原をチャレンジした。鼻の抵抗を、チャレンジの40分後に測定した。
(実施例4:アレルギー性鼻炎のマウスモデルにおけるCpGオリゴヌクレオチド配列番号7の効果)
方法:BALB/cマウスを使用して、アレルギー性鼻炎の症状に対する配列番号7の効果を研究した。感作および抗原チャレンジの後、鼻の組織を、炎症の組織病理学的な評価のために採取した。別個のマウスは、最後の抗原チャレンジを受容した。くしゃみの頻度および鼻を擦る頻度を、チャレンジ後に10分間計測した。
方法:BALB/cマウスを使用して、アレルギー性鼻炎の症状に対する配列番号7の効果を研究した。感作および抗原チャレンジの後、鼻の組織を、炎症の組織病理学的な評価のために採取した。別個のマウスは、最後の抗原チャレンジを受容した。くしゃみの頻度および鼻を擦る頻度を、チャレンジ後に10分間計測した。
(実施例5:マウスの肺におけるインフルエンザウイルス誘導性の気道炎症:クラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチドの効果)
導入:CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)は、抗喘息効果を提供するであろう免疫を改変するサイトカインを誘導する。クラスC CpG ODNは、これまでのクラスB ODNより高いIFNαの力価を誘導する。クラスC CpG ODNは、喘息のウイルス誘導性の増悪を抑制するさらなる利点を提供し得る。この研究は、マウスの肺におけるウイルス(インフルエンザ)の負荷およびウイルス誘導性の気道炎症を抑制する、3種のクラスC CpG ODNの能力を調査した。
導入:CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)は、抗喘息効果を提供するであろう免疫を改変するサイトカインを誘導する。クラスC CpG ODNは、これまでのクラスB ODNより高いIFNαの力価を誘導する。クラスC CpG ODNは、喘息のウイルス誘導性の増悪を抑制するさらなる利点を提供し得る。この研究は、マウスの肺におけるウイルス(インフルエンザ)の負荷およびウイルス誘導性の気道炎症を抑制する、3種のクラスC CpG ODNの能力を調査した。
方法:インフルエンザウイルスを使用して、BALB/cマウスにおいて気道炎症を誘導した。CpG ODNを、鼻腔内に投与し、そしてその保護効果を、測定した。
結果:図4は、インフルエンザ用量を滴定し、そして感染の時間経過を決定する予備研究において、インフルエンザウイルスが、気道における白血球の蓄積を引き起こしたことを示す。ピークの炎症は、6〜9日後に達成された。500のEID50のウイルスに感染したマウスは、6日後に著しい体重減少を示し、そして屠殺された。
図5は、ウイルスの負荷およびウイルス誘導性の気道炎症に対するCpG ODNの保護効果を示す。インフルエンザウイルス(200のEID50)による感染前のCpG ODNを用いた前処置は、感染の6日後にアッセイされた通り、肺におけるウイルスの負荷を減少させた。図6は、インフルエンザウイルスによる感染が、6日後に気道において白血球の蓄積を引き起こしたことを示す。これらは、主に好中球および単核細胞(単球、マクロファージおよびリンパ球)であった。好酸球球は、ほとんど存在しなかった。細胞の蓄積は、上記CpG ODNのいずれかを用いて前処置したマウスにおいて有意に抑制された。
(実施例6:マウスにおける抗原誘導性の気道炎症に対するクラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチドの効果)
3種のクラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の活性を、比較した。上記クラスB CpG ODN配列番号7を、比較のためにこの研究に含めた。
3種のクラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の活性を、比較した。上記クラスB CpG ODN配列番号7を、比較のためにこの研究に含めた。
方法:マウス(雄、BALB/c)を、水酸化アルミニウムアジュバント(Pierce Alum、腹腔内)を伴う抗原(ゴキブリ、10μg、腹腔内)を用いて、研究の0日目および7日目に感作した。マウスに、2週間連続して各週に2回、鼻腔内に投与される抗原(40μlの生理食塩水中に10μg)に対する曝露によって抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の21日目であった。CpG ODN(1μg/kg、10μg/kgおよび100μg/kg)を、各週に1度(その週の第1の抗原チャレンジの2日前)、鼻腔内に投与した。
気道炎症を、最後の抗原チャレンジの48時間後に評価した。気道中の細胞を、気管支肺胞洗浄によって回収した。分化細胞の計測を、Advia自動細胞カウンターによって行なった。T細胞の数(全CD3+細胞、およびCD3+CD4+細胞)を、フローサイトメトリーによって計測した。
(実施例7:マウスにおけるインビボのクラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチドによるサイトカインの誘導)
3種のクラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の活性を、比較した。上記B CpG ODN配列番号7を、比較のためにこの研究に含めた。
3種のクラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の活性を、比較した。上記B CpG ODN配列番号7を、比較のためにこの研究に含めた。
方法:気管支肺胞洗浄液および血清中のサイトカインならびにケモカインの濃度を、材料および方法において記載した通りにアッセイした。
図10〜図15は、気管支肺胞洗浄液中のサイトカインの濃度を示す。上記CpG ODNの各々の鼻腔内滴注は、気管支肺胞洗浄液中のIFNα、IFNγ、IP−10、IL−12p40、IL−6およびTNFαの測定可能な力価を誘導した。測定した他の分析物の力価は、検出可能な濃度またはバックグラウンドを上回る濃度に到達しなかった(代表的に、20pg/ml未満、データ示さず)。これらのクラスC ODNは、それぞれ、IFNα、IFNγ、IP−10、IL−12p40、IL−6およびTNFαの誘導因子として、上記クラスB ODN配列番号7より強力であった。それらのクラスC ODNの増加した効力は、特に、0.1mg/kgの用量レベルにおいて明白であった。それらのクラスC ODNのみが0.1mg/kgにおける投薬後にIFNαおよびIFNγの任意の測定可能な力価を誘導し得るという観察は、特に重要である(図10)。
図15〜図18は、血清中のサイトカインの濃度を示す。上記CpG ODNの各々の鼻腔内滴注は、血清中のIFNγ、IL−6およびTNFαの測定可能な力価を誘導した。測定した他の分析物の力価は、検出可能な濃度に到達しなかった(代表的に、20pg/ml未満、データ示さず)。上記クラスB CpG配列番号7と比較した場合、上記3種のクラスC ODNの各々は、免疫を改変するサイトカインIFNα、IFNγ、IP−10、IL−12p40、IL−6およびTNFαの、より強力な誘導因子であった。
(実施例8:マウスにおける抗原誘導性のIgE産生に対するCpGオリゴデオキシヌクレオチド配列番号2および配列番号7の効果)
方法:マウス(雄、BALB/c)を、水酸化アルミニウムアジュバント(Pierce Alum,i.p.)を伴う抗原(オボアルブミン、10μg、i.p.)を用いて、研究の0日目および7日目に感作した。マウスは、研究の−2日目、0日目、5日目および7日目(すなわち、それぞれの感作の2日前および感作の当日)に、配列番号2または配列番号7を受容した。マウスを、研究の18日目に、心穿刺によって出血させた。血清を、遠心分離によって回収し、そしてオボアルブミン特異的なIgEおよびIgG2aに対するELISAによってアッセイした。
方法:マウス(雄、BALB/c)を、水酸化アルミニウムアジュバント(Pierce Alum,i.p.)を伴う抗原(オボアルブミン、10μg、i.p.)を用いて、研究の0日目および7日目に感作した。マウスは、研究の−2日目、0日目、5日目および7日目(すなわち、それぞれの感作の2日前および感作の当日)に、配列番号2または配列番号7を受容した。マウスを、研究の18日目に、心穿刺によって出血させた。血清を、遠心分離によって回収し、そしてオボアルブミン特異的なIgEおよびIgG2aに対するELISAによってアッセイした。
結論:実施例8のデータは、配列番号2および配列番号7が、抗原感作に対する応答におけるIgEのTh2関連性の産生を抑制し、そしてTh1関連性のIgG2a産生を増強することを示す。この研究の結果は、これらのCpGオリゴが、マウスにおいて抗原曝露に対するTh2型応答を抑制し得るさらなる証拠を提供する。
(実施例9:インフルエンザ感染および抗原チャレンジを合わせることによって誘導される増悪した気道感染に対する配列番号2の効果)
導入:上記クラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチド配列番号2は、マウスにおいて、インフルエンザウイルスの負荷およびウイルス誘導性の気道炎症を抑制し得る。本研究は、インフルエンザウイルス感染および抗原チャレンジを合わせることによって誘導される増悪した気道感染に対する配列番号2の保護効果を調べた。
導入:上記クラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチド配列番号2は、マウスにおいて、インフルエンザウイルスの負荷およびウイルス誘導性の気道炎症を抑制し得る。本研究は、インフルエンザウイルス感染および抗原チャレンジを合わせることによって誘導される増悪した気道感染に対する配列番号2の保護効果を調べた。
方法:抗原およびウイルスの投与:マウス(雄、BALB/c)を、水酸化アルミニウムアジュバント(Pierce Alum)を伴う抗原(ゴキブリ、10μg、腹腔内)を用いて、研究の0日目および7日目に感作した。マウスに、3週間連続して各週に2回、鼻腔内に投与される抗原(40μlの生理食塩水中に10μg)に対する曝露によって抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の21日目であった。マウスを、研究の34日目(すなわち、抗原チャレンジの最後の対の前)において鼻腔内滴注によって、インフルエンザウイルス(インフルエンザA型、サブタイプH1N1、マウス適応株PR8、40μlの生理食塩水中に200のEID50)に感染させた。あるいは、マウスの別個の群は、抗原チャレンジのみか、またはウイルス感染のみを受容した。
配列番号2(100μg/kg)を、各週に1回(その週の第1の抗原チャレンジの2日前)、鼻腔内に投与した。気道炎症を、最後の抗原チャレンジの48時間後に評価した。気道中の細胞を、気管支肺胞洗浄によって回収した。分化細胞の計測を、Wright−Giemza染色によって染色した細胞遠心分離調製物からの光学顕微鏡法によって行なった。
配列番号2(100μg/kg)を用いた処置は、ウイルス誘導性の好中球増加を抑制しなかった(図20)。このネガティブな知見は、予想された。なぜなら初期の研究において、300μg/kgの、より高い用量が、抗ウイルス効果を示すのに最も望ましかったからである。さらに、配列番号2(100μg/kg)は、抗原誘導性の好酸球増加を有意に抑制しなかった。このポジティブな知見は、初期の研究通りであった。
配列番号2(100μg/kg)は、ウイルス感染および抗原チャレンジの両方を行なわれたマウスにおいて誘導される増悪した気道炎症を有意に抑制した。好中球および単核細胞の増悪した蓄積は、両方とも抑制された。増悪した気道炎症に加えて、ウイルス感染および抗原チャレンジの両方を行なわれたマウスは、体重の顕著な減少を示した。これは、配列番号2を用いて処置したマウスにおいて、有意に抑制された。
結論:存在する喘息を有する小児および成人の両方において、気道(respiratory tract)のウイルスによる感染は、気道(airway)狭窄および喘鳴に関して非常に性急なものである。関連する炎症のプロセスは、複雑である。しかし、ウイルス誘導性の好中球および単核細胞の漸増ならびに活性化は、これらの喘息の増悪に寄与する気道狭窄の悪化に関係する(GernおよびBusse、Nature Immunology、2002によって概説される)。実施例9のデータは、配列番号2が、ウイルス感染および抗原チャレンジを合わせることによってマウスにおいて誘導される好中球および単核細胞の増悪した蓄積を、顕著に抑制するすることを示す。
(実施例10:モルモット研究)
(実施例10a:モルモットAHRプロトコルの概要)
雄モルモットを、研究の0日目および4日目に、水酸化アルミニウムアジュバントを伴う抗原(オボアルブミン、0.5ml、1% OVA i.p./s.c.)によって感作した。モルモットに、2週間連続して各週に2回、吸入型のオボアルブミンエアロゾルに曝露することによって抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の13日目であった。CpG ODNまたはビヒクル(生理食塩水、20μl)を、各週に1回(その週の第1の抗原チャレンジの2日前)、鼻腔内に投与した。気道の過敏症を、最後の抗原チャレンジの24時間後に、静脈内のメタコリンに対する気管支収縮(気道抵抗の増加)を測定することによって評価した。それぞれの動物に関して、メタコリンに対する用量反応曲線を入手し、そして気道の反応性を、曲線下面積として定量化した。図21は、手順の概略図を示す。
(実施例10a:モルモットAHRプロトコルの概要)
雄モルモットを、研究の0日目および4日目に、水酸化アルミニウムアジュバントを伴う抗原(オボアルブミン、0.5ml、1% OVA i.p./s.c.)によって感作した。モルモットに、2週間連続して各週に2回、吸入型のオボアルブミンエアロゾルに曝露することによって抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の13日目であった。CpG ODNまたはビヒクル(生理食塩水、20μl)を、各週に1回(その週の第1の抗原チャレンジの2日前)、鼻腔内に投与した。気道の過敏症を、最後の抗原チャレンジの24時間後に、静脈内のメタコリンに対する気管支収縮(気道抵抗の増加)を測定することによって評価した。それぞれの動物に関して、メタコリンに対する用量反応曲線を入手し、そして気道の反応性を、曲線下面積として定量化した。図21は、手順の概略図を示す。
(実施例10b:モルモットにおける気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号7の効果)
方法:モルモットを、実施例10に記載した通りに感作した。最初のチャレンジは、研究の13日目であった。モルモットに、キャリア(生理食塩水)、OVAのみ、10μl/kg、30μl/kg、100μl/kgまたは300μl/kg(i.t.)の濃度の配列番号7のいずれかを、鼻腔内に与えた。
方法:モルモットを、実施例10に記載した通りに感作した。最初のチャレンジは、研究の13日目であった。モルモットに、キャリア(生理食塩水)、OVAのみ、10μl/kg、30μl/kg、100μl/kgまたは300μl/kg(i.t.)の濃度の配列番号7のいずれかを、鼻腔内に与えた。
結果:図22は、配列番号7が、AUC−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。
(実施例10c:モルモットにおける気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号7の効果の統計分析)
方法:Dunnett多重比較検定を使用して、実施例10bにおける実験から得たデータを分析した。Dunnett多重比較検定は、単一のコントロール群に対する全てのサンプルの比較を可能にする。
方法:Dunnett多重比較検定を使用して、実施例10bにおける実験から得たデータを分析した。Dunnett多重比較検定は、単一のコントロール群に対する全てのサンプルの比較を可能にする。
結果:図23は、配列番号7が、AUC−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。
(実施例10d:モルモットにおける気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号2の効果)
方法:モルモットを、実施例10に記載した通りに感作した。最初のチャレンジは、研究の13日目であった。モルモットに、キャリア(生理食塩水)、OVAのみ、10μl/kg、30μl/kg、100μl/kgまたは300μl/kg(i.t.)の濃度の配列番号2のいずれかを、鼻腔内に与えた。
方法:モルモットを、実施例10に記載した通りに感作した。最初のチャレンジは、研究の13日目であった。モルモットに、キャリア(生理食塩水)、OVAのみ、10μl/kg、30μl/kg、100μl/kgまたは300μl/kg(i.t.)の濃度の配列番号2のいずれかを、鼻腔内に与えた。
結果:図24は、配列番号2が、AUC−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。
(実施例10e:モルモットにおける気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号2の効果の統計分析)
方法:Dunnett多重比較検定を使用して、実施例10dにおける実験から得たデータを分析した。Dunnett多重比較検定は、単一のコントロール群に対する全てのサンプルの比較を可能にする。
方法:Dunnett多重比較検定を使用して、実施例10dにおける実験から得たデータを分析した。Dunnett多重比較検定は、単一のコントロール群に対する全てのサンプルの比較を可能にする。
結果:図25は、配列番号2が、AUC−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。
(実施例11)
本明細書中に記載されるCpGオリゴヌクレオチドに対する曝露後のヒトPBMCによってもたらされる、IL−10、TNF−α、インターフェロン−γ、およびIL−6のレベル(pg/ml)を、添付の図27〜図31に示す。図27に示す試験オリゴヌクレオチドは、配列番号10、配列番号9、配列番号13、配列番号14、配列番号1、および配列番号2を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度を、X軸に沿って記載する(μM)。
本明細書中に記載されるCpGオリゴヌクレオチドに対する曝露後のヒトPBMCによってもたらされる、IL−10、TNF−α、インターフェロン−γ、およびIL−6のレベル(pg/ml)を、添付の図27〜図31に示す。図27に示す試験オリゴヌクレオチドは、配列番号10、配列番号9、配列番号13、配列番号14、配列番号1、および配列番号2を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度を、X軸に沿って記載する(μM)。
図27に示される通り、上記アッセイにおいて試験したオリゴヌクレオチドの各々は、IL−10の異なるレベルおよび異なるパターンを生じ得た。配列番号1および配列番号2の試験したODNは、IL−10の劇的に、より高い誘導をもたらした。
図28は、3つの代表的な用量における、TNF−α、インターフェロン−γ、およびIL−6に関するデータを示す。これらのサイトカインについての、より詳細なグラフを、さらなるオリゴヌクレオチドの投薬量と共に、図29〜図31に示す。
(実施例12:)
本明細書中に記載されるCpGオリゴヌクレオチドに対する曝露後のB細胞、形質細胞様樹状細胞および単球の活性化のレベルを、添付の図32〜図42に示す。調べたオリゴヌクレオチドは、配列番号によって図に示され、そして配列番号9、配列番号13、配列番号10、配列番号14、配列番号2、配列番号1、配列番号11、配列番号12、および配列番号3を含んだ。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度を、X軸に沿って記載する(μM)。
本明細書中に記載されるCpGオリゴヌクレオチドに対する曝露後のB細胞、形質細胞様樹状細胞および単球の活性化のレベルを、添付の図32〜図42に示す。調べたオリゴヌクレオチドは、配列番号によって図に示され、そして配列番号9、配列番号13、配列番号10、配列番号14、配列番号2、配列番号1、配列番号11、配列番号12、および配列番号3を含んだ。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度を、X軸に沿って記載する(μM)。
図32、図34、図35、図40、および図42に示される通り、上記アッセイにおいて試験したCpGオリゴヌクレオチドは、試験したマーカーによって示されるように、B細胞を活性化し得た。図32および図33において、上記アッセイにおいて試験したCpGオリゴヌクレオチドは、試験したマーカーによって示されるように、NK細胞を活性化し得た。図36、図37、図40、および図41において、上記アッセイにおいて試験したCpGオリゴヌクレオチドは、試験したマーカーによって示されるように、単球を活性化し得た。図36および図39において、上記アッセイにおいて試験したCpGオリゴヌクレオチドは、試験したマーカーによって示されるように、形質細胞様樹状細胞を活性化し得た。
上記アッセイにおいて試験した、セミソフト骨格を有する5種全てのODNは、配列番号9(十分にホスホロチオエートの骨格)と比較して、そのアッセイ(IFN−α、IP−10、IL−10)において増加した効力を示した。これらのセミソフトODNの効力はまた、以下において増加される:単球の活性化(CD80の発現、CD86の発現)、pDCの活性化(CD86の発現)、細胞内IP−10(単球およびB細胞)、IL−6の分泌、およびB細胞の活性化(CD80の発現、CD86の発現)。例えば、ほぼ等しいか、またはより低い濃度において、試験したODNのほとんどは、完全にホスホロチオエートの配列番号9より良好な、細胞表面マーカーの誘導をもたらした。
(実施例13)
本研究の目的は、配列番号2の選択したフラグメント(推定上の代謝産物)の生物学的活性を調査することであった。活性を、インビボで、マウス脾細胞からのTLR9関連性サイトカインの分泌を誘導する各フラグメントの能力を測定することによって決定した。
本研究の目的は、配列番号2の選択したフラグメント(推定上の代謝産物)の生物学的活性を調査することであった。活性を、インビボで、マウス脾細胞からのTLR9関連性サイトカインの分泌を誘導する各フラグメントの能力を測定することによって決定した。
配列番号2のフラグメントによるサイトカイン分泌の刺激を、添付の図43〜図45に示す。調べたオリゴヌクレオチドは、配列番号によって図に示され、そして配列番号15〜配列番号23を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度を、X軸に沿って記載する(μM)。
図43〜図45に示される通り、配列番号2および試験した全てのフラグメント(推定上の代謝産物、配列番号15〜配列番号23)は、インビボでマウス脾細胞から、TLR9関連性サイトカインIFNα、IFNγ、IP−10、IL−6、IL−10およびTNFαを誘導した(図43、図44および図45)。このデータは、それらのフラグメントの各々が、生物学的活性を保持したことを示す。
Claims (84)
- オリゴヌクレオチドであって、以下:
5’ TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3’(配列番号27)
を含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示し、そしてここでN1は、0ヌクレオチド長〜3ヌクレオチド長であり、Nは、任意のヌクレオチドを示す、オリゴヌクレオチド。 - N1は、3ヌクレオチド長である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C__G*C*G*C*C*G 3’(配列番号2)を含み、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(配列番号2)であり、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
- N1は、0ヌクレオチド長である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(配列番号3)を含み、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(配列番号3)であり、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項6に記載のオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドであって、以下:
5’ TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG 3’(配列番号4)
を含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチド。 - 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(配列番号4)であり、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドであって、以下:
5’ TTC_GTC_GTTTX1_GTC_GTT 3’(配列番号25)、
を含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示し、そしてここでX1は、ピリミジンである、オリゴヌクレオチド。 - X1は、Tである、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号5)を含み、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項11に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号5)であり、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項11に記載のオリゴヌクレオチド。
- X1は、Cである、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号6)を含み、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項14に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T 3’(配列番号6)であり、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項14に記載のオリゴヌクレオチド。
- TCGTCGTTCGGCGCGCCG(配列番号3)を含むオリゴヌクレオチド。
- TCGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG(配列番号2)を含むオリゴヌクレオチド。
- TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG(配列番号4)を含むオリゴヌクレオチド。
- TTCGTCGTTTTGTCGTT(配列番号5)を含むオリゴヌクレオチド。
- TTTCGTCGTTTCGTCGTT(配列番号6)を含むオリゴヌクレオチド。
- T*C_G*T*C_G*T*Cを含むオリゴヌクレオチドであって、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C−G*T*C−G*T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C−G*C*G*C*C 3’(配列番号21)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項22に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C−G*T*C−G*T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C 3’(配列番号22)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項22に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C−G*T*C−G*T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C−G*C*G*C 3’(配列番号23)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項22に記載のオリゴヌクレオチド。
- T*C_G*T*T*C_G*Gを含むオリゴヌクレオチドであって、ここで*は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして_は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ C−G*T*C−G*T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C−G*C*G*C*C*G 3’(配列番号15)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ G*T*C−G*T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C−G*C*G*C*C*G 3’(配列番号16)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C−G*T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C−G*C*G*C*C*G 3’(配列番号17)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ C−G*T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C−G*C*G*C*C*G 3’(配列番号18)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ G*T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C−G*C*G*C*C*G 3’(配列番号19)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、5’ T*C−G*T*T*C−G*G*C*G*C−G*C*G*C*C*G 3’(配列番号20)であり、ここで5’は、該オリゴヌクレオチドの自由な5’末端を示し、そして3’は、該オリゴヌクレオチドの自由な3’末端を示す、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
- 請求項33に記載の薬学的組成物であって、噴霧器をさらに含む、薬学的組成物。
- 請求項33に記載の薬学的組成物であって、吸入器をさらに含む、薬学的組成物。
- 前記吸入器は、定量噴霧吸入器である、請求項35に記載の薬学的組成物。
- 前記吸入器は、粉末吸入器である、請求項35に記載の薬学的組成物。
- 請求項33に記載の薬学的組成物であって、化学療法剤をさらに含有する、薬学的組成物。
- 請求項33に記載の薬学的組成物であって、抗ウイルス剤をさらに含有する、薬学的組成物。
- 前記薬学的に受容可能なキャリアは、皮下投与のために処方されている、請求項33に記載の薬学的組成物。
- 前記薬学的に受容可能なキャリアは、経口投与のために処方されている、請求項33に記載の薬学的組成物。
- 前記薬学的に受容可能なキャリアは、鼻腔内投与のために処方されている、請求項33に記載の薬学的組成物。
- 免疫応答を刺激するための、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 免疫応答を刺激するための医薬の製造における、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 喘息を処置するための医薬の製造における、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 前記喘息は、ウイルス感染によって増悪される、請求項45に記載の使用。
- アレルギーの処置のための医薬の製造における、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 癌の処置のための医薬の製造における、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 前記医薬は、化学療法剤と一緒に使用される、請求項48に記載の使用。
- 感染症の処置のための医薬の製造における、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- ウイルス性障害の処置のための医薬の製造における、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 前記ウイルス性障害は、肝炎である、請求項51に記載の使用。
- 前記肝炎は、B型肝炎である、請求項52に記載の使用。
- 前記肝炎は、C型肝炎である、請求項52に記載の使用。
- 自己免疫疾患の処置のための医薬の製造における、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 気道リモデリングの処置のための医薬の製造における、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 前記医薬は、抗原と一緒に使用しないための医薬である、請求項44に記載の使用。
- 前記医薬は、抗原と一緒に使用するための医薬である、請求項44に記載の使用。
- 喘息を処置するための方法であって、喘息を有するか、または喘息を有する危険にある被験体に対して、喘息を処置するのに有効な量で、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
- アレルギーを処置するための方法であって、アレルギーを有するか、またはアレルギーを有する危険にある被験体に対して、アレルギーを処置するのに有効な量で、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
- 前記被験体は、アレルギー性鼻炎を有する、請求項60に記載の方法。
- 免疫応答を調節するための方法であって、被験体に対して、免疫応答を調節するのに有効な量で、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
- ウイルス感染によって増悪される喘息を処置するための方法であって、ウイルス感染によって増悪される喘息を有するか、または該喘息を有する危険にある被験体に対して、該喘息を処置するのに有効な量で、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、被験体に送達されて、該被験体においてアレルギーを処置する、請求項62に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、被験体に送達されて、該被験体において自己免疫疾患を処置する、請求項62に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、被験体に送達されて、該被験体において気道リモデリングを処置する、請求項62に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、被験体に抗原と一緒に投与されない、請求項62に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、口の経路、鼻の経路、舌下の経路、静脈内の経路、皮下の経路、粘膜の経路、呼吸器の経路、直接注入、および経皮的な経路からなる群より選択される経路によって送達される、請求項62に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、前記被験体に対して、サイトカインの発現を誘導するのに有効な量で送達される、請求項62に記載の方法。
- 前記サイトカインは、IL−6、TNFα、IFNα、IL−10、IL−12、IFNγおよびIP−10からなる群より選択される、請求項69に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、前記被験体に対して、免疫応答をTh2に偏った応答からTh1に偏った応答へ変化させるのに有効な量で送達される、請求項62に記載の方法。
- 癌を処置するための方法であって、癌を有する被験体に対して、該癌を処置するのに有効な量で請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
- 請求項72に記載の方法であって、前記被験体に化学療法を施す工程をさらに包含する、方法。
- 請求項72に記載の方法であって、前記被験体に照射を施す工程をさらに包含する、方法。
- 感染症を処置するための方法であって、感染症を有するか、または感染症を有する危険にある被験体に対して、該感染症を処置するのに有効な量で請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
- 前記被験体は、ウイルス感染を有する、請求項75に記載の方法。
- 前記ウイルス感染は、B型肝炎である、請求項76に記載の方法。
- 前記ウイルス感染は、C型肝炎である、請求項76に記載の方法。
- 請求項76に記載の方法であって、前記被験体に抗ウイルス剤を投与する工程をさらに包含する、方法。
- 免疫応答を刺激するための、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
- 癌を処置するための、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
- 喘息を処置するための、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
- アレルギーを処置するための、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
- 感染症を処置するための、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
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