JP2007531746A - Il−10応答を誘導するための免疫活性化核酸 - Google Patents
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Abstract
本発明は、免疫活性化核酸を用いてIL−10発現を誘導するための方法及び産物に関する。特に、本発明は、高レベルのIFN−α発現を誘導すること無くIL−10発現を誘導するための方法及び産物に関する。IL−10誘導性免疫活性化核酸は、好ましくは、5’末端にTCジヌクレオチド、及び5’末端近くではない3’末端側にCGジヌクレオチドを含む。本発明は、Th1又はTh2免疫応答に関連した疾患を治療及び予防するために、又は、不適当な免疫応答を抑制するために(例えば、過剰な免疫応答を調節又は抑制するために)適した調節T細胞の環境を促進するために有用である。
Description
(関連出願)
本願は、2004年4月2日に出願された「IMMUNOSTIMULATORY NUCLEIC ACIDS FOR INDUCING IL−10 RESPONSES」を標題とする米国特許仮出願60/558,951号に対する優先権を主張し、その内容は全体を参照することにより本明細書中に組み入れるものとする。
本願は、2004年4月2日に出願された「IMMUNOSTIMULATORY NUCLEIC ACIDS FOR INDUCING IL−10 RESPONSES」を標題とする米国特許仮出願60/558,951号に対する優先権を主張し、その内容は全体を参照することにより本明細書中に組み入れるものとする。
(発明の分野)
本発明は全体として免疫活性化核酸に関し、特に、CpG含有免疫活性化核酸及びそれらの治療的用途に関する。
本発明は全体として免疫活性化核酸に関し、特に、CpG含有免疫活性化核酸及びそれらの治療的用途に関する。
(発明の背景)
CD4+ヘルパーT(Th)細胞により分泌されるサイトカインのプロフィールによって、機能的に偏向したT細胞の応答の存在が十分に実証されている。一般的に、Th1細胞はインターフェロン−ガンマ(IFN−γ)、インターロイキン(IL)−2、及び腫瘍壊死因子−ベータ(TNFβ)を分泌し、マクロファージの活性化、体液及び細胞が媒介する免疫応答及び食細胞依存的な防衛的応答の両反応を生じる点で重要である。Th2細胞はIL−4、IL−5、IL−10及びIL−13を分泌し、体液性免疫、好酸球の活性化、細胞媒介性免疫応答の調節、マクロファージ機能の制御及び特定のIgイソタイプの刺激を起こす点でより重要である(Morelら、1998、Romagnani、1999)。Th1細胞は通常、細胞内の病原体による感染に続いて発現し、一方Th2細胞は腸内線虫への応答において優位を占める。防衛的免疫におけるそれらの役割に加えて、Th1及びTh2細胞は異なるタイプの免疫病理学的疾患に関与する。例えば、Th1細胞は、臓器特異的自己免疫性疾患、クローン病、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)が引き起こす消化性潰瘍、急性の固形臓器同種移植の拒絶反応、及び原因不明の再発性流産において優位を占める傾向を有し、一方Th2細胞はオーメン症候群、全身性エリテマトーデス、移植寛容、慢性対宿主性移植片疾患、特発性肺線維症、及び全身性進行性硬化症において優位を占める傾向を有し、また、ほとんどの喘息を含むアレルギー反応の誘発に関与する(Romagnani 1999、Singhら、1999)。狼瘡等の多くの疾患においては、Th1及びTh2成分の両方が、疾患の進行において、同時期又は異なる時期のいずれかにおいて病気の発症に寄与するという証拠がある。
CD4+ヘルパーT(Th)細胞により分泌されるサイトカインのプロフィールによって、機能的に偏向したT細胞の応答の存在が十分に実証されている。一般的に、Th1細胞はインターフェロン−ガンマ(IFN−γ)、インターロイキン(IL)−2、及び腫瘍壊死因子−ベータ(TNFβ)を分泌し、マクロファージの活性化、体液及び細胞が媒介する免疫応答及び食細胞依存的な防衛的応答の両反応を生じる点で重要である。Th2細胞はIL−4、IL−5、IL−10及びIL−13を分泌し、体液性免疫、好酸球の活性化、細胞媒介性免疫応答の調節、マクロファージ機能の制御及び特定のIgイソタイプの刺激を起こす点でより重要である(Morelら、1998、Romagnani、1999)。Th1細胞は通常、細胞内の病原体による感染に続いて発現し、一方Th2細胞は腸内線虫への応答において優位を占める。防衛的免疫におけるそれらの役割に加えて、Th1及びTh2細胞は異なるタイプの免疫病理学的疾患に関与する。例えば、Th1細胞は、臓器特異的自己免疫性疾患、クローン病、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)が引き起こす消化性潰瘍、急性の固形臓器同種移植の拒絶反応、及び原因不明の再発性流産において優位を占める傾向を有し、一方Th2細胞はオーメン症候群、全身性エリテマトーデス、移植寛容、慢性対宿主性移植片疾患、特発性肺線維症、及び全身性進行性硬化症において優位を占める傾向を有し、また、ほとんどの喘息を含むアレルギー反応の誘発に関与する(Romagnani 1999、Singhら、1999)。狼瘡等の多くの疾患においては、Th1及びTh2成分の両方が、疾患の進行において、同時期又は異なる時期のいずれかにおいて病気の発症に寄与するという証拠がある。
T細胞がインターロイキン10(IL−10)存在下で活性化された時に、T細胞応答のさらなる一つのタイプが観察された。IL−10活性化は、調節T細胞として知られるT細胞サブセットの生成をもたらす。調節T細胞はTh1及びTh2のサイトカインプロフィールのいずれとも異なるサイトカインプロフィールを有する。調節T細胞はまた、Th1及びTh2応答の両方を含む抗原(Ag)特異的又は抗原非特異的なT細胞の活性化において阻害効果を有することが観察された。
近年、多数の研究が、先天性及び特異的な免疫応答の両方を刺激するための、ある種の側面配列(CpGモチーフ)のコンテキスト内部における非メチル化CpGジヌクレオチド類(すなわち、シトシンがメチル化されていない)の能力を立証している。このような配列は、免疫を活性化するバクテリアDNA中に共通に見出される。類似の免疫刺激は、合成オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)であってCpGモチーフを含有するもの(CpG ODN)によっても可能である。CpG DNAはB細胞の刺激を引き起こして増殖させ、イムノグロブリン(Ig)、IL−6及びIL−12を分泌させ、アポトーシスから保護することが実証されている(Kriegら、1995、Yiら、1996、Klinmanら、1996)。これらの効果はCpG DNAがアジュバント活性を有する能力に貢献する。さらに、CpG DNAはクラスII MHC及びB7共刺激分子の発現を促進し(Davisら、1998、Sparwasserら、1998)、このことが抗原提示の向上をもたらす。さらに、CpG DNAは、マウスの樹状細胞を直接的に活性化して、ヘルパーTの機能を提供し得る各種サイトカイン及びケモカイン(Uhlmann及びVollmer、2003)を分泌させもする。これらのインビトロの効果は非メチル化CpGモチーフに対し特異的であると信じられた。なぜならそれらは、メチル化されたバクテリアDNAによっても、通常は非メチル化CpGモチーフを含まないODNによっても引き起こされなかったからである。
非経口的及び経粘膜的に送達される各種抗原に対する動物の免疫では、CpG ODNの添加が、強力な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の刺激、高レベルのIgG2a抗体、及び優勢的にはTh1サイトカイン(例えば、IL−12及びIFN−γ、しかしIL−4又はIL−5ではない)など、より示されるように、Th1に優勢的な応答を引き起こすことが実証されている(Klinmanら、1996、Davisら、1998、Romanら、1997、Chuら、1997、Lipfordら,1997、Weinerら、1997、McCluskie及びDavis、1998,1999)。
対照的に、CpGを欠く核酸を用いて免疫実験すると、これらの核酸の粘膜への投与がTh2に優勢的な応答を引き起こし得ることが実証される。
(発明の概要)
本発明は、インターフェロンα(IFN−α)の発現及びタイプIインターフェロンが媒介する効果を顕著に引き起こすことなく、高レベルのインターロイキン10(IL−10)の発現を引き起こす核酸を含む、CpGのサブセットを提供する。
本発明は、インターフェロンα(IFN−α)の発現及びタイプIインターフェロンが媒介する効果を顕著に引き起こすことなく、高レベルのインターロイキン10(IL−10)の発現を引き起こす核酸を含む、CpGのサブセットを提供する。
一態様において、本発明は、その核酸の3’末端側に位置する1以上のCpGジヌクレオチドから離れた5’TCジヌクレオチドを含む免疫活性化核酸を含むCpGを提供する。好ましい実施形態において、その核酸はただ1つのCpGジヌクレオチドを含む。
一態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は、IFN−αの発現及びタイプIインターフェロンが媒介する効果を刺激することなくIL−10の発現を刺激するために有用である。
別の態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は、調節T細胞の応答を獲得するために有用である。特に、このCpG免疫活性化核酸は、調節T細胞の応答が望ましい疾患又は状態を処置するために有用である。
別の態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は、調節B細胞の応答を獲得するために有用である。特に、このCpG免疫活性化核酸は、調節B細胞の応答が望ましい疾患又は状態を処置するために有用である。
別の態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は、B細胞を刺激するために有用である。特に、このCpG免疫活性化核酸は、B細胞の刺激が望ましい疾患又は状態を処置するために有用である。
別の態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は、調節B細胞の応答を獲得するために有用である。特に、このCpG免疫活性化核酸は、調節B細胞の応答が望ましい疾患又は状態を処置するために有用である。
別の態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は、臓器移植又は組織移植における宿主対象の拒絶反応を軽減又は最小化するために有用である。
別の態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は、喘息、アレルギー、自己免疫疾患及びその他の炎症性障害を処置するために有用である。
別の態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は、自己免疫疾患を患う対象の抗原特異的なワクチン接種のために有用である。
別の態様において、本発明は、以下から選択されるオリゴヌクレオチドである:a) 5’ XYN1YZN2 3’、前記配列中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはTヌクレオチド又は修飾Tヌクレオチドであり、YはCヌクレオチド又は修飾Cヌクレオチドであり、ZはGヌクレオチド又は修飾Gヌクレオチドであり、N1及びN2はCGジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドであり、N1は5’Zヌクレオチドを含まず、且つ、YZジヌクレオチド及びN2ポリヌクレオチドからなる3’ポリヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数の最大で45%である複数のヌクレオチドを含む;及びb) 5’ XYN1YZN2 3’、前記配列中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはTヌクレオチド又は修飾Tヌクレオチドであり、YはCヌクレオチド又は修飾Cヌクレオチドであり、ZはGヌクレオチド又は修飾Gヌクレオチドであり、N1は5〜10個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであり、N1はCGジヌクレオチドを含まず、N1は5’Zヌクレオチドを含まず、且つ、N2は5〜30個のヌクレオチドのポリヌクレオチドである。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも50%の修飾ヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合は修飾されている。さらに他の実施形態において、0%〜10%、10%〜20%、20%〜30%、30%〜40%、40%〜50%、50%〜60%、60%〜70%、70%〜80%、80%〜90%、又は90%〜100%の間のヌクレオチド間結合が修飾されている。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは10〜100個のヌクレオチドからなる。ある実施形態において、修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは5’Cヌクレオチドと3’Gヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合を含む。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは5’Cヌクレオチドと3’Gヌクレオチドとの間にR−ホスホロチオエート結合を含む。
ある実施形態において、Yは、5−置換シトシン類、6−置換シトシン類、N4−置換シトシン類、縮合環系を有するシトシンアナログ類、ウラシル、ウラシル誘導体、ユニバーサル塩基、芳香族環系及び水素原子からなる群から選択される修飾シトシン塩基を含む修飾Cヌクレオチドである。他の実施形態において、Yは、5−メチル−シトシン、5−フルオロ−シトシン、5−クロロ−シトシン、5−ブロモ−シトシン、5−ヨード−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、5−ジフルオロメチル−シトシン、非置換又は置換5−アルキニル−シトシン、N4−エチル−シトシン、5−アザ−シトシン、2−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、N,N’−プロピレンシトシン又はフェノキサジン、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−ブロモビニル−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−ヒドロキシ−ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、3−ニトロピロール、P−塩基、フルオロベンゼン、及びジフルオロベンゼンからなる群から選択される修飾シトシン塩基を含む修飾Cヌクレオチドである。
ある実施形態において、Zは、7−デアザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン、7−デアザ−7−(C2−C6)アルキニルグアニン、7−デアザ−8−置換グアニン、ヒポキサンチン、N2−置換グアニン、N2−メチル−グアニン、5−アミノ−3−メチル−3H,6H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7−ジオン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、インドール、イノシン、アデニン、置換アデニン類、N6−メチル−アデニン、8−オキソ−アデニン、8−置換グアニン、8−ヒドロキシグアニン、8−ブロモグアニン、6−チオグアニン、ユニバーサル塩基、4−メチル−インドール、5−ニトロ−インドール、K−塩基、芳香族環系、ベンズイミダゾール、ジクロロ−ベンズイミダゾール、1−メチル−1H−[1,2,4]トリアゾール−3−カルボン酸アミド及び水素原子からなる群から選択される修飾グアニン塩基を含む修飾Gヌクレオチドである。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、1つまたは2つの接近可能な5’末端とともに3’−3’結合を含む。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、最適なCpGヘキサマー配列を含まないヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含まないヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、安定した2次構造を形成しない。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、抗原及びサイトカインからなる群から選択される部分と結合体化されている。ある実施形態において、前記抗原は、感染性疾患抗原からなる群から選択される。ある実施形態において、前記サイトカインはIL−4、IL−10、IL−12からなる群から選択され得る。
一実施形態において、オリゴヌクレオチドは以下の構造:5’T*C*T*T*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T 3’(配列番号4)(このとき、*は、ホスホロチオエート結合を意味する)を有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは以下の構造:5’T*T*G*C*G*T*G*C*G*T*T*T*T*G*A*C*G*T*T*T*T*T*T*T 3’(配列番号62)(このとき、*は、ホスホロチオエート結合を意味する)を有する。別の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは以下の構造:5’T*C*T*T*T*T*T*T*T*T*C*G*T*T*T*T*T 3’(配列番号2)(このとき、*は、ホスホロチオエート結合を意味する)を有する。
ある実施形態において、N1はポリ−Tポリヌクレオチドである。他の実施形態において、N2はポリ−Tポリヌクレオチドである。N1及びN2の両方がポリ−Tポリヌクレオチドであることもできる。ポリ−Tポリヌクレオチドは1以上の修飾Tヌクレオチドを含んでもよい。好ましい実施形態において、ポリ−Tポリヌクレオチドは、5〜20個の間のTヌクレオチド、5〜10個の間のTヌクレオチド、20個を超えるTヌクレオチド、又は少なくとも55%のTヌクレオチドを含む。
別の態様において、本発明は、化学治療薬、放射性治療薬、モノクローナル抗体、及び抗癌剤からなる群から選択される治療薬と組み合わせた本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物である。ある実施形態において、その医薬組成物はポリカチオン性の担体と組み合わせたオリゴヌクレオチドである。
別の態様において、本発明は、対象中のIFN−αの発現に対してIL−10の発現を特異的に増加させる方法であって、調節Tの応答を誘導することが有益であるだろう対象に本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物を投与する工程を含む、方法である。好ましい実施形態において、投与工程は、吸入、経口、局所、皮下、及び経静脈投与からなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、対象において抗原特異的な調節T細胞又は調節B細胞の応答を誘導する方法であって、抗原に曝露された対象に本発明の免疫活性化核酸又は組成物を投与する工程を含む、方法である。ある実施形態において、抗原は免疫活性化核酸又は組成物と共に対象に投与される。他の実施形態において、抗原は免疫活性化核酸又は組成物の後に対象に投与される。他の実施形態において、抗原は食物中に存在し、該食物を摂取することにより対象が該抗原に曝露される。さらに他の実施形態において、抗原は対象によって吸入される。
別の態様において、本発明は、アレルギー又は喘息を処置する方法であって、対象をアレルゲンに曝露する工程と、本発明の免疫活性化核酸又は組成物を対象に投与する工程であって、この免疫活性化核酸又は組成物を、対象における前記アレルゲンに対するアレルギー性応答を抑制又は緩和するために十分な量で投与する工程を含む、方法である。ある実施形態において、この方法はまた、対象にIL−10を投与する工程を含む。ある実施形態において、対象は、アレルギー性喘息に罹患している、又は、発症するリスク状態にある。
別の態様において、本発明は、対象の自己免疫疾患を処置する方法であって、対象を自己抗原に曝露する工程と、本発明の免疫活性化核酸又は組成物を対象に投与する工程であって、この免疫活性化核酸又は組成物を、対象の自己免疫疾患を抑制又は処置するために十分な量で投与する工程を含む、方法である。ある実施形態において、この方法はまた、対象にIL−10を投与する工程を含む。ある実施形態において、自己免疫疾患は、関節炎、多発性硬化症、1型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群等の自己免疫性ニューロパシー、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、乾癬、尋常性天疱瘡、ヴェグナー肉芽腫症等の血管炎、白斑、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、1型又は免疫媒介性の糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、副腎における自己免疫疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎等の脊椎関節症、又はシェーグレン症候群である。ある実施形態において、自己免疫疾患は感染により引き起こされ、例えばライム病である。
別の態様において、本発明は対象の移植片に対する抗原特異的応答を減少させる方法であって、対象を移植片抗原に曝露する工程と、本発明の免疫活性化核酸又は組成物を対象に投与する工程であって、この免疫活性化核酸又は組成物を、対象の前記移植片に対する抗原特異的応答を抑制又は減少するために十分な量で投与する工程を含む、方法である。ある実施形態において、この方法はまた、対象にIL−10を投与する工程を含む。ある実施形態において、移植片は自己組織移植片である。他の実施形態において、移植片は非自己組織移植片である。他の実施形態において、移植片は組み換え細胞移植片である。他の実施形態において、移植片は合成(人工)移植片である。
ある実施形態において、本発明は、以下の配列(5’から3’方向に示される)の1以上を有する1以上の核酸、もしくはその使用を含まない:
本発明は、その適用において、以下の記述中で説明され又は図面中で示される、構成の詳細及び構成要素の配置へと限定されるものではない。本発明は、その他の実施形態が可能であり、多様なやり方で実践、実行され得る。また、本明細書中に記載の表現や専門用語は記述を目的としたものであって、限定的なものとみなされるべきではない。「含有する(including)」「含む(comprising)」又は「有する(having)」「含む(containing)」「包含する(involving)」及び本明細書中のそれらのバリエーションは、その後に列挙された事項及びそれらの等価物ならびに付加的な事項を包含することを意味する。
(詳細な説明)
本発明はIFN−αの発現を大きく増加させることなくIL−10の発現を増加させるCpGジヌクレオチド含有免疫活性化核酸を提供する。本発明の核酸は自己免疫性障害を含む疾患及び障害を処置するために有用である。
本発明はIFN−αの発現を大きく増加させることなくIL−10の発現を増加させるCpGジヌクレオチド含有免疫活性化核酸を提供する。本発明の核酸は自己免疫性障害を含む疾患及び障害を処置するために有用である。
一態様において、本発明は、その5’末端にTCジヌクレオチドを含み、そのTCジヌクレオチドから少なくとも2ヌクレオチド離れたところにCpGジヌクレオチドを含む核酸、好ましくは、オリゴヌクレオチドを提供する。
一実施形態において、CpGジヌクレオチドは、TCジヌクレオチドから、少なくとも2ヌクレオチド、より好ましくは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、26、27、28、29、若しくは30又はそれ以上のヌクレオチドの距離を置いている。別の実施形態において、CpGジヌクレオチドは、3’側で、その核酸分子の長さの80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、又は2.5%に含まれる。
ある実施形態において、この核酸は、2以上のTCジヌクレオチド、2以上のCpGジヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを有する。最も5’側のCpGジヌクレオチドは、好ましくは、最も3’側のTCジヌクレオチド(5’末端と最も5’側のCpGジヌクレオチドとの間に存在する)から、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、26、27、28、29、若しくは30又はそれ以上のヌクレオチド離れている。TCジヌクレオチドは、好ましくは、5’側の、その核酸分子の長さの10%、20%、30%、40%、又は50%に含まれる。CpGジヌクレオチドは、3’側の、その核酸分子の長さの50%、40%、30%、20%、又は10%に含まれる。しかし、TC及びCpGジヌクレオチドは、分子の5’末端にTCジヌクレオチドがあり、最も5’側のCpGがそのTCジヌクレオチドから2、3、4、5、6、7,8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、26、27、28、29、若しくは30又はそれ以上のヌクレオチド離れている場合に散在され得、また5’のTCとCpGジヌクレオチドとの間の最適距離は核酸分子の長さに依存し得る。好ましい実施形態において、3’ジヌクレオチドは好ましくはCpGジヌクレオチドではない。
ある実施形態において、5’ジヌクレオチドは、AC、GC、CC、TA、TG、又はTTである。しかし、5’TCを有する核酸は、より効果的にIL−10産生を刺激する。ある実施形態において、核酸はCpGジヌクレオチド中に修飾Cを有する。しかし、他の実施形態においては、合成の簡易化又は潜在的なインビボ毒性を減少させるために、CpGジヌクレオチド中に非修飾Cを含む核酸が用いられ得る。
本発明の核酸は、好ましくは、1以上の長さのポリT(例えば、3T、4T、5T、6T、7T、8T、9T、10T、又はそれ以上の長さのポリT)を有する。好ましい核酸は、25%〜99%、好ましくは、30%〜90%、好ましくは、35%より多い、40%より多い、45%より多い、50%より多い、55%より多い、60%より多い、65%より多い、70%より多い、75%より多い、80%より多い、85%より多い、90%より多い、又は95%より多いTヌクレオチドを含む。
好ましい核酸は5〜100ヌクレオチド長であり、また好ましくは約10、15、20、25、30、35又は40ヌクレオチド長より長い。しかし、より長い核酸もまた本発明に包含される。好ましい核酸は約10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90又は90〜100ヌクレオチド長である。
好ましい核酸は5’TCGトリヌクレオチドを有しない。核酸は2本鎖分子として提供され得る。核酸は、好ましくは1本鎖分子であり、より好ましくはDNA分子である。しかし、1以上のヌクレオチド及び/又はヌクレオチド間結合は本明細書中に記載のように修飾され得る。
一実施形態において、本発明の核酸は以下の一般式を有する:
5’ XYN1YZN2 3’
上記配列中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはT又は修飾Tヌクレオチドであり、YはC又は修飾Cヌクレオチドであり、ZはG又は修飾Gヌクレオチドであり、N1及びN2はCGジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドであり、N1は5’Zヌクレオチドを含まず、且つ、YZジヌクレオチド及びN2ポリヌクレオチドからなる3’ポリヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数の最大で45%である複数のヌクレオチドを含む。
5’ XYN1YZN2 3’
上記配列中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはT又は修飾Tヌクレオチドであり、YはC又は修飾Cヌクレオチドであり、ZはG又は修飾Gヌクレオチドであり、N1及びN2はCGジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドであり、N1は5’Zヌクレオチドを含まず、且つ、YZジヌクレオチド及びN2ポリヌクレオチドからなる3’ポリヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数の最大で45%である複数のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、本発明の核酸は以下の一般式を有する:
5’ XYN1YZN2 3’
上記配列中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはTヌクレオチド又は修飾Tヌクレオチドであり、YはCヌクレオチド又は修飾Cヌクレオチドであり、ZはGヌクレオチド又は修飾Gヌクレオチドであり、N1は5〜10個のヌクレオチドのポリヌクレオチドであり、N1はCGジヌクレオチドを含まず、N1は5’Zヌクレオチドを含まず、且つ、N2は5〜30個のヌクレオチドのポリヌクレオチドである。
5’ XYN1YZN2 3’
上記配列中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはTヌクレオチド又は修飾Tヌクレオチドであり、YはCヌクレオチド又は修飾Cヌクレオチドであり、ZはGヌクレオチド又は修飾Gヌクレオチドであり、N1は5〜10個のヌクレオチドのポリヌクレオチドであり、N1はCGジヌクレオチドを含まず、N1は5’Zヌクレオチドを含まず、且つ、N2は5〜30個のヌクレオチドのポリヌクレオチドである。
本発明の核酸はIFN−α産生と比較してIL−10産生を刺激する。IFN−α誘導と比較したIL−10誘導の割合は、好ましくは1.5〜10であり、それ以上であることも可能である。ある実施形態において、この誘導の割合は、約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、又は10.0より高い。
本発明の免疫活性化CpG核酸は、これまでに研究されている免疫活性化CpG核酸とは識別し得る特性を有するCpG核酸のサブセットを形成する。3つのクラス:A−、B−及びC−クラスのCpG ODNがこれまでに報告されている。これらの報告されているCpG ODNクラスの最も特筆すべき特性は、pDCからIFN−αの分泌を刺激するその能力であり、したがって、単球からのIP−10産生など、タイプIインターフェロンによって媒介されるその他の効果である(Blackwell(2003),J.Immunol.170:4061)。それにもかかわらず、今日までに報告されている2つのTLR9発現細胞:pDC及びB細胞の刺激の間には違いが存在するように思われる(Uhlmann(2003),Current Drugs 6:204)。B細胞はIL−6又はIL−10などのサイトカインを分泌するために免疫調節性ODNによって刺激される(Krieg(2002),Annu.Rev.Immunol.20:709)。対照的に、PDCはタイプIインターフェロンを産生するために刺激される。今日までに報告されているCpG ODNクラスは、PDCの活性化及びサイトカイン産生、並びにB細胞の活性化の両方を刺激する(Uhlmann(2003),Current Drugs 6:204)。しかし、本発明は、IFN−α分泌又は関連の効果(例えば、単球からのIP−10産生)をわずかに刺激するか或いは全く刺激せず、TLR9に依存するB細胞からの強いサイトカイン分泌を刺激するODN配列を提供する。本発明のCpG免疫活性化核酸(T−クラスODNと名づける)は、ヒト細胞においてCpGにより媒介される強い刺激効果を主として担う5’−CGを欠く。好ましい実施形態において、それらは、B細胞からの強力且つ効率的なサイトカイン産生を依然として保持することが示されている5’TCを含む。さらに、かかる好ましいODNは、より3’側の位置にではあるが、依然としてCpGジヌクレオチドを保持する。3’末端へのCpGのこの移動は、pDCのIFN−α産生の大きな減少を引き起こすが、B細胞のIL−10分泌の大きな減少は引き起こさない。本発明のCpG免疫活性化核酸は効率的なIL−10産生を誘導するが、効率的なIFN−α産生は誘導しない。
IL−10はTh2誘導性サイトカインであると見なされることも多いが、IL−10は特定の条件において、例えば、IL−10産生がその他のTh2サイトカイン(例えば、IL−4、IL−5、及びIL−13)に対して不均衡なときには、「抑制性」サイトカインであり得る。IL−10が炎症性応答及び自己免疫疾患の低減に関与することが研究によって示された(Mocellin(2003),TRENDS 24:36)。この効果は、調節リンパ球、T細胞及びB細胞が関与する(Shevach(2002),Nature Reviews Immunol.2:389;Sakaguchi(2003),Nature Immunol.4:10;Fillatreau(2002),Nature Immunol.10:944;Mauri(2003),J.Exp.Med.197:489;Mizoguchi(2002),Immunity 16:219)。IL−10は、インビトロにおいて、IL−10を産生する調節T細胞の生成に関与することが示された(Shevach(2002),Nature Reviews Immunol.2:389)。これらのT細胞は、宿主の(例えば、細菌感染に対する)免疫応答に影響を及ぼすと思われる。これらのT細胞は、自己免疫疾患の発症から保護されるために役立っていることも示された(Shevach(2002),Nature Reviews Immunol.2:389)。調節B細胞においても同一の効果が観察された(Fillatreau(2002),Nature Immunol.10:944;Mauri(2003),J.Exp.Med.197:489;Mizoguchi(2002),Immunity 16:219)。本発明の一実施形態において、T−クラスCpG ODNは、高レベルのIL−10を産生するB細胞の強力な刺激を媒介するために使用され、自己免疫疾患の治療として有用である。
一態様において、本発明のCpG刺激核酸は、IFN−αレベルに対してIL−10レベルの増大を誘導するために有用である。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドによって誘導されるIL−10/IFN−α発現の割合は、参照オリゴヌクレオチド、例えば:5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(配列番号54)、5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’(配列番号142)、又は5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(配列番号143)によって誘導されるIL−10/IFN−α発現の割合よりも少なくとも50%高い。
この割合はさらに高くてもよく、例えば、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、又はそれ以上であってもよい。オリゴヌクレオチドによって誘導されるIL−10/IFN−αの割合は、誘導されたIL−10増加量又はパーセントを、誘導されたIFN−α増加量又はパーセントで除算することによって計算できる。分子の誘導された発現増加量又はパーセントは、当該オリゴヌクレオチドによる処置前及び後における分子の発現レベルを比較することにより計算できる。発現レベルはRNA又はタンパク質の
発現レベルであってもよい。
発現レベルであってもよい。
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドはIL−10発現の増加を誘導し、この増加は参照オリゴヌクレオチド(例えば、上記した参照オリゴヌクレオチドのうちのひとつ)についての増加と同様である。しかし、誘導されるIFN−α発現増加は、参照オリゴヌクレオチドによって得られる増加よりも有意に低くあり得る(例えば、1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、又は1/50、等)。このため、本発明のオリゴヌクレオチドを使用すると、より高いIL−10/IFN−α誘導比率が得られる。一実施形態において、IFN−αの唯一のバックグラウンドレベルは、本発明の免疫活性化核酸によって得られる。
しかし、他の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドによって得られるIL−10誘導の絶対的なレベルは、参照オリゴヌクレオチドによって得られるレベルよりも高い(例えば、50%より高い、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、又は50倍等高い)。
したがって、本発明の一態様において、T−クラスCpG刺激核酸はIL−10産生を刺激するために使用される。ある実施形態において、CpG刺激核酸はマクロファージからのIL−10産生を間接的に刺激する。他の実施形態において、CpG刺激核酸はB細胞からのIL−10産生を刺激する。さらにさらなる実施形態において、CpG刺激核酸は1以上の細胞型からのIL−10産生を刺激する。IFN−α産生が無いIL−10産生は、自己免疫疾患又は症状などの疾患及び障害を処置するために有用である。ある実施形態において、IL−10産生はT調節細胞を活性化するために有用である。他の実施形態において、IL−10産生はB調節細胞を活性化するために有用である。さらにさらなる実施形態において、IL−10産生はTh1サイトカインを抑制するために有用である。IL−10産生は1以上のTh2が媒介するアレルギー性疾患又は障害を有する又はその発症リスクを有する対象を処置するために、特に有用であり得る。IL−10は自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を抑えるためにも使用することができる。自己免疫疾患としては、限定するものではないが、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症(MG)、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡(例えば、尋常性天疱瘡)、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫が関連する不妊症、糸球体腎炎(例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎)、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、及び自己免疫性糖尿病が挙げられる。
別の態様において、本発明のCpG刺激核酸は調節T細胞応答を刺激するために有用である。調節T細胞は、炎症性腸疾患などの疾患を制御することができ、自己免疫応答等、その他の免疫応答の抑制に関与する。
調節T細胞の活性化は、特にアレルギー及び自己免疫疾患との関連において、抗体特異的応答を調節するために使用され得る。ある実施形態において、CpG免疫活性化核酸は、抗体が媒介する自己免疫疾患を処置及び抑制するために使用される。いくつかの自己免疫疾患においては、対象自身の抗体が宿主組織と反応するか、或いは、対象において、免疫エフェクターT細胞が、内在する自身のペプチドに対して自己反応して組織の破壊を引き起こす。すなわち、自己抗原と呼ばれる対象自身の抗原に対して免疫応答が引き起こされる。自己免疫疾患としては、限定するものではないが、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症(MG)、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡(例えば、尋常性天疱瘡)、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫が関連する不妊症、糸球体腎炎(例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎)、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、及び自己免疫性糖尿病が挙げられる。これらの自己免疫疾患のいくつかは、Th2応答が関与する臓器特異的自己免疫性疾患とも関連し得る。
ある実施形態において、抗原特異的な調節T細胞応答は、特定の抗原、好ましくは自己抗原と、本発明の免疫活性化CpG核酸を(直前に、同時に、又は直後に)一緒に投与することにより刺激することができる。ある場合においては、CpG免疫活性化核酸は低用量の自己抗原とともに送達される。
本明細書中で使用する時「自己抗原」とは、正常な宿主組織の抗原を意味する。正常な宿主組織は癌細胞を含まない。したがって、自己免疫疾患との関連において、自己抗原に対して付与される免疫応答は、望ましくない免疫応答であり、正常組織の破壊及び損傷の一因となる一方、癌抗原に対して付与される免疫応答は望ましい免疫応答であり、腫瘍又は癌の破壊に寄与する。
さらに別の態様において、本発明のCpG免疫活性化核酸は調節B細胞の応答を刺激するために使用される。調節B細胞の刺激は自己免疫性疾患などの疾患を抑えるために使用することができる。ある実施形態において、抗原特異的な調節B細胞応答は、本発明の免疫活性化CpG核酸よりも前に、一緒に、又は後に、特異的抗原を投与することにより刺激することができる。ある実施形態において、喘息及びアレルギーなどのTh2が媒介する疾患は、1以上のアレルゲンと一緒に1以上の本発明のCpG免疫活性化核酸を投与することにより処置することができる。別の実施形態において、SLEは、1以上の抗原(例えば、精製されたヌクレオソーム又はリボ核タンパク質成分)と一緒に1以上の本発明のCpG刺激核酸を投与することにより処置することができる。さらなる実施形態において、関節リウマチは、1以上の抗原(例えば、免疫グロブリン)と一緒に1以上の本発明のCpG刺激核酸を投与することにより処置することができる。
さらなる態様において、本発明のCpG刺激核酸はT調節応答を刺激するために使用される。これらの核酸は、強いT調節応答がより重要であり得る多くの疾患(例えば、クローン病、同種移植に対する拒絶反応又は自然流産)(McCluskie(2001)、Vaccine 19:413)において(例えば、ワクチンのためのアジュバントとして又は単独治療として)投与することができる。ある実施形態において、本発明のCpG刺激核酸は粘膜を通して投与される。経粘膜投与方法及び製剤の例が米国特許公開20010044416中に開示されており、その全開示内容は参照により本明細書中に組み入れるものとする。
T調節応答の刺激は、臓器特異的自己免疫性障害(例えば、クローン病、消化性潰瘍、急性の固形臓器同種移植による拒絶反応、及び原因不明の反復性流産)などの特定の自己免疫疾患及び障害を処置するために有用であり得る。T調節応答の刺激は、抗原特異的免疫応答を生成させるために有効な量の本発明の核酸と一緒に抗原を対象に投与することにより、抗原特異的応答を誘導するためにも有用であり得る。
本発明によれば、用語「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、例えば、塩基及び/又は糖に置換又は修飾を有する核酸又はオリゴヌクレオチドも包含する。例えば、それらは、2’位置にヒドロキシル基以外の低分子量有機基と、5’位置にリン酸基又はヒドロキシ基以外の低分子量有機基と共有結合している骨格糖を有する核酸を含む。すなわち、修飾核酸は2’−O−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、修飾核酸はリボースの代わりにアラビノース又は2’−フルオロアラビノースなどの糖を含んでもよい。したがって、この核酸は骨格組成が混成であってもよく、それにより、任意の可能な互いに結合したポリマー単位の組み合わせ、例えば、(核酸塩基とともにアミノ酸骨格を有する)ペプチド−核酸などを含んでもよい。
核酸はC−5プロピンピリミジン及び7−デアザ−7−置換プリン修飾塩基などの置換プリン類及びピリミジン類も含む。Wagner RWら(1996) Nat Biotechnol 14:840−4。プリン類及びピリミジン類としては、限定するものではないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシシトシン、5−フルオロシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、2,6−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、及び他の天然及び非天然の核塩基、置換及び非置換芳香族成分が挙げられる。その他のこのような修飾は当業者に周知である。
本発明の免疫活性化オリゴヌクレオチドは、天然のRNA及びDNAと比較して、様々な化学的修飾及び置換を含むことができ、それらには、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、β−D−リボース単位及び/又は天然のヌクレオチド塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル)を含む。化学的修飾の例は当業者に知られており、又、例えば、Uhlmann Eら(1990) Chem Rev 90:543;“Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal編,Humana Press,Totowa,USA 1993;Crooke STら(1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107−129;及び、Hunziker Jら(1995) Mod Synth Methods 7:331−417中に記載されている。本発明のオリゴヌクレオチドは1以上の修飾を有しても良く、この場合、各修飾は、天然のDNA又はRNAから構成される同一の配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオチド間架橋及び/又は特定のβ−D−リボース単位及び/又は特定の天然のヌクレオチド塩基位置に存在する。
例えば、本発明は、1以上の修飾を含んでいてもよく、且つ、各修飾が以下から独立して選択されるオリゴヌクレオチドに関する:
a) ヌクレオチドの3’端及び/又は5’端に位置するホスホジエステルヌクレオチド間架橋の修飾ヌクレオチド間架橋による置換、
b) ヌクレオチドの3’端及び/又は5’端に位置するホスホジエステル架橋の脱リン架橋による置換、
c) 糖リン酸骨格の糖リン酸単位の別の単位による置換、
d) β−D−リボース単位の修飾糖単位による置換、及び
e) 天然のヌクレオチド塩基の修飾ヌクレオチド塩基による置換。
a) ヌクレオチドの3’端及び/又は5’端に位置するホスホジエステルヌクレオチド間架橋の修飾ヌクレオチド間架橋による置換、
b) ヌクレオチドの3’端及び/又は5’端に位置するホスホジエステル架橋の脱リン架橋による置換、
c) 糖リン酸骨格の糖リン酸単位の別の単位による置換、
d) β−D−リボース単位の修飾糖単位による置換、及び
e) 天然のヌクレオチド塩基の修飾ヌクレオチド塩基による置換。
オリゴヌクレオチドの化学的修飾のより詳細な例は以下の通りである。
ヌクレオチドの3’端及び/又は5’端に位置するホスホジエステルヌクレオチド間架橋は修飾ヌクレオチド間架橋によって置換することができる。この場合、修飾ヌクレオチド間架橋は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、NR1R2−ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスホネート、ホスフェート−(C1−C21)−O−アルキルエステル、ホスフェート−[(C6−C12)アリール−(C1−C21)−O−アルキル]エステル、(C1−C8)アルキルホスホネート及び/又は(C6−C12)アリールホスホネート架橋、(C7−C12)−α−ヒドロキシメチル−アリール(例えば、国際特許公開WO95/01363に開示されているもの)から選択され、これらの場合に、必要に応じて(C6−C12)アリール、(C6−C20)アリール及び(C6−C14)アリールは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノによって置換されていてもよく、又、R1及びR2は、互いに独立して、水素、(C1−C18)−アルキル、(C6−C20)−アリール、(C6−C14)−アリール−(C1−C8)−アルキル、好ましくは、水素、(C1−C8)−アルキル、好ましくは、(C1−C4)−アルキル及び/又はメトキシエチルであるか、あるいはR1及びR2は、窒素原子を有するそれらと一緒になって、O、S及びNの群からのさらなるヘテロ原子を付加的に含み得る5〜6員の複素環を形成する。
脱リン架橋(脱リン架橋については、例えば、“Methods in Molecular Biology”,第20巻、Uhlmann E及びPeyman A “Protocols for Oligonucleotides and Analogs”,S.Agrawal編,Humana Press,Totowa 1993,第16章,pp.355ページ以下に記載されている)によるホスホジエステル架橋の置換はヌクレオチドの3’端及び/又は5’端に位置し、この場合、脱リン架橋は、例えば、脱リン架橋ホルムアセタール、3’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチル−ヒドラゾ、ジメチレンスルホン及び/又はシリル基から選択される。
糖リン酸骨格(すなわち、糖リン酸骨格は糖リン酸単位から構成される)の糖リン酸単位(すなわち、β−D−リボースとホスホジエステルヌクレオチド間架橋が一緒になって糖リン酸単位を形成する)は別の単位によって置換することができ、この場合、別の単位は、例えば、「モルホリノ誘導体」オリゴマー(例えば、Stirchak EPら(1989) Nucleic Acids Res 17:6129−41に記載されているようなもの)を構築するのに適している、すなわち、例えば、モルホリノ誘導体単位による置換であり、或いは、ポリアミド核酸(「PNA」;例えば、Nielsen PEら(1994)Bioconjug Chem 5:3−7に記載されているようなもの)を構築するのに適している、すなわち、例えば、PNA骨格単位(例えば、2−アミノエチルグリシン)による置換である。
β−リボース単位又はβ−D−2’−デオキシリボース単位は、修飾糖単位によって置換することができ、この場合、修飾糖単位は、例えば、β−D−リボース、α−D−2’−デオキシリボース、L−2’−デオキシリボース、2’−F−2’−デオキシリボース、2’−F−アラビノース、2’−O−(C1−C6)アルキル−リボースから選択され、好ましくは、2’−O−(C1−C6)アルキル−リボースは、2’−O−メチルリボース、2’−O−(C2−C6)アルケニル−リボース、2’−[O−(C1−C6)アルキル−O−(C1−C6)アルキル]−リボース、2’−NH2−2’−デオキシリボース、β−D−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、2,4−ジデオキシ−β−D−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、及び炭素環式(例えば、Froehler J(1992) Am Chem Soc 114:8320に記載)及び/又は開鎖式糖アナログ(例えば、Vandendriesscheら(1993)Tetrahedron 49:7223に記載)及び/又は二環式糖アナログ(例えば、Tarkov Mら(1993)Helv Chim Acta 76:481に記載)である。
ある好ましい実施形態において、特に、ホスホジエステル又はホスホジエステル様のヌクレオチド間結合により結合した1つ又は両方のヌクレオチドに対する糖は、2’−O−メチルリボースである。
核酸はまた、C−5プロピンピリミジン及び7−デアザ−7−置換プリン修飾塩基等の置換プリン類及びピリミジン類を含む。Wagner RWら(1996)Nat Biotechnol 14:840−4。プリン類及びピリミジン類は、限定されるものではないが、アデニン、シトシン、グアニン、及びチミン、並びにその他の天然及び非天然のヌクレオ塩基、置換及び非置換の芳香族部分を含む。
修飾された塩基は、T、C、G、A及びU等のDNA及びRNA中に通常見られる天然の塩基とは化学的に異なるが、基本的な化学構造をこれらの天然塩基類と共有する任意の塩基である。修飾ヌクレオチド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−アミノウラシル,5−(C1−C6)−アルキルウラシル、5−(C2−C6)−アルケニルウラシル、5−(C2−C6)−アルキニルウラシル、5−(ヒドロキシメチル)ウラシル、5−クロロウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヒドロキシシトシン、5−(C1−C6)−アルキルシトシン、5−(C2−C6)−アルケニルシトシン、5−(C1−C6)−アルキニルシトシン、5−クロロシトシン、5−フルオロシトシン、5−ブロモシトシン、N2−ジメチルグアニン、2,4−ジアミノ−プリン、8−アザプリン、置換7−デアザプリン、好ましくは7−デアザ−7−置換及び/又は7−デアザ−8−置換プリン、5−ヒドロキシメチルシトシン、例えばN4−エチルシトシン等のN4−アルキルシトシン、5−ヒドロキシデオキシシチジン、5−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、例えばN4−エチルデオキシシチジン等のN4−アルキルデオキシシチジン、6−チオデオキシグアノシン、及び、ニトロピロールのデオキシリボヌクレオチド、C5−プロピニルピリミジン、及び2,6−ジアミノプリン等のジアミノプリン、イノシン、5−メチルシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、ヒポキサンチン又はその他の天然のヌクレオチド塩基における修飾物である。このリストは例示することを意味し、限定的に解釈されるものではない。
特定の化学式において、本明細書中に記載の修飾塩基のセットが定義される。例えば、文字のYは、シトシン又は修飾シトシンを含むヌクレオチドを称するため使用される。本明細書中に使用される修飾シトシンは、シトシンの天然又は非天然のピリミジン塩基アナログであり、そのオリゴヌクレオチドの免疫活性化能を損なうことなく、この塩基を置換することが可能である。
修飾シトシンは、限定されるものではないが、5−置換シトシン類(5−メチル−シトシン、5−フルオロ−シトシン、5−クロロ−シトシン、5−ブロモ−シトシン、5−ヨード−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、5−ジフルオロメチル−シトシン、非置換又は置換5−アルキニル−シトシン等)、6−置換シトシン類、N4−置換シトシン類(例えば、N4−エチル−シトシン)、5−アザ−シトシン、2−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有するシトシンアナログ類(N,N’−プロピレンシトシン又はフェノキサジン等)、及びウラシルとその誘導体(5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−ブロモビニル−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−ヒドロキシ−ウラシル、5−プロピニル−ウラシル等)を含む。好ましい シトシン類のいくつかには、5−メチル−シトシン、5フルオロ−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、及びN4−エチル−シトシンを含む。本発明別の実施形態では、シトシン塩基は、ユニバーサル塩基(3−ニトロピロール、P−塩基等)、芳香族環系(フルオロベンゼン又はジフルオロベンゼン等)又は水素原子(dSpacer)により置換される。
文字Zは、グアニン又は修飾グアニン塩基を称するため使用される。本明細書中に使用される修飾グアニンは、グアニンの天然又は非天然のプリン塩基アナログであり、そのオリゴヌクレオチドの免疫活性化能を損なうことなく、この塩基を置換することが可能である。修飾グアニンは、限定されるものではないが、7−デアザグアニン、(7−デアザ−7−(C2−C6)アルキニルグアニン等の)7−デアザ−7−置換グアニン、7−デアザ−8−置換グアニン、ヒポキサンチン、N2−置換グアニン類(例えばN2−メチル−グアニン)、5−アミノ−3−メチル−3H,6H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7−ジオン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、インドール、イノシン、アデニン、置換アデニン類(例えばN6−メチル−アデニン、8−オキソ−アデニン)、8−置換グアニン類(例えば8−ヒドロキシグアニン及び8−ブロモグアニン)、及び6−チオグアニンを含む。その他の本発明の実施形態において、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基(例えば、4−メチル−インドール、5−ニトロ−インドール、K−塩基)、芳香族環系(例えば、ベンズイミダゾール、ジクロロ−ベンズイミダゾール、1−メチル−1H−[1,2,4]トリアゾール−3−カルボン酸アミド)又は水素原子(dSpacer)で置換される。
オリゴヌクレオチドは、1以上の接近可能な5’末端を有し得る。2つのそのような5’末端を有する修飾オリゴヌクレオチドを創出することが可能である。このことは、例えば、3’−3’結合を介して2つのオリゴヌクレオチドを連結して1つまたは2つの接近可能な5’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成することにより達成してもよい。3’3’−結合はホスホジエステル、ホスホロチオエート又は任意のその他の修飾ヌクレオチド間架橋であり得る。このような結合を達成するための方法は技術的に知られている。例えば、このような結合は、Seliger、H.;ら、Oligonucleotide analogs with terminal 3’−3’− and 5’−5’−internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression、Nucleotides & Nucleotides(1991)、10(1−3)、469−77及びJiangら、Pseudo−cyclic oligonucleotides:in vitro and in vivo properties、Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999)、7(12)、2727−2735において記述されている。
さらに、3’−末端ヌクレオチド間の結合がホスホジエステル、ホスホロチオエート又はその他の修飾架橋ではない場合の3’3’−連結核酸は、トリ−又はテトラ−エチレングリコールリン酸部分等の付加的なスペーサーを用いて調製され得る(Durand,M.ら、Triple−helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12 and two(dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains、Biochemistry(1992)、31(38)9197−204、米国特許第5658738号、及び米国特許第5668265号)。あるいは、非ヌクレオチドリンカーは、標準的なホスホロアミダイト化学を用いてエタンジオール、プロパンジオール、又は脱塩基デオキシリボース(dSpacer)単位から得てもよい(Fontanel、Marie Laurenceら、Sterical recognition by T4 polynucloetide kinase of non−nucleosidic moieties 5’−attached to oligonucleotides;Nucleic Acids Research(1994)、22(11)、2022−7)。非ヌクレオチドリンカーは、連結される2つのODNにおける3’端の間に任意の望ましい距離がとれるように、1回又は複数回組み込まれ得るか、又は互いに組み合わされ得る。
CpGオリゴヌクレオチドはToll様受容体9(TLR9)との相互作用により免疫活性化効果を発揮するようであるということが最近報告された。Hemmi Hら(2000)Nature 408:740−5。したがって、TLR9のシグナル伝達活性は、NF−κB、NF−κB−関連シグナル伝達、及びNF−κBの上流の適切な事象及び中間体を測定することにより、CpGオリゴヌクレオチド又は他の免疫活性化核酸に対する応答として測定することができる。
本発明における用途のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野における多数の良く知られた手法のうちのいずれかを用いてデノボ合成することができる。例えば、b−シアノエチルホスホルアミダイト法(Beaucage,S.L.,及びCaruthers,M.H.,Tet.Let.22:1859,1981);ヌクレオチド H−ホスホネート法(Gareggら、Tet.Let.27:4051−4054,1986;Froehlerら、Nucl.Acid.Res.14:5399−5407,1986;Gareggら、Tet.Let.27:4055−4058,1986、Gaffneyら、Tet.Let.29:2619−2622,1988)。これらの化学反応は様々な市販の自動核酸合成装置によって行うことができる。これらのオリゴヌクレオチドは合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。単離されたオリゴヌクレオチドとは、一般的に、天然で通常会合される構成要素から分離されているオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、単離されたオリゴヌクレオチドは、細胞から、核から、ミトコンドリアから、又はクロマチンから分離されたものであり得る。
オリゴヌクレオチドは分解に対して部分的に抵抗性を有する(例えば、安定化されている)。「安定化されたオリゴヌクレオチド分子」とは、比較的、インビボ分解(例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによる)に対する耐性を有するオリゴヌクレオチドを意味し得る。核酸の安定化は骨格の修飾により達成し得る。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは最大の活性を提供し、細胞内のエキソ及びエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護する。その他の修飾オリゴヌクレオチドとしては、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルとホスホロチオエート核酸の組み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、p−エトキシ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
修飾骨格(例えば、ホスホロチオエート)は、ホスホロアミデート又はH−ホスホネート化学反応のいずれかを用いる自動化された技法を使用して合成することができる。アリール−及びアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第4,469,863号に記載されているようにして製造することができ、アルキルホスホトリエステル(荷電した酸素部分が米国特許第5,023,243号及び欧州特許第092,574号に記載されているようにアルキル化されている)は、市販の試薬を用いる自動化された固相合成により調製することができる。その他のDNA骨格修飾及び置換を作製する方法が記載されている(例えば、Uhlmann,E.及びPeyman,A.,Chem.Rev.90:544,1990;Goodchild,J.,Bioconjugate Chem.1:165,1990)。
その他の安定化されたオリゴヌクレオチドは以下を含む:アルキル−及びアリール−ホスフェート(荷電したホスホネートの酸素がアルキル又はアリール基に置換されたもの)、ホスホジエステル及びアルキルリン酸3エステル等であって、荷電した酸素部分がアルキル化されている、非イオン性のDNAアナログ。テトラエチレングリコール又はヘキサエチレングリコール等のジオールを含む核酸も、一方又は両方の末端において、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることを示している。
本明細書中に記載するように、本発明のオリゴヌクレオチドはC及びGの間にホスホジエステル又はホスホジエステル様の結合を有し得る。ホスホジエステル−様結合の1例は、Rp形態のホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチドのp−キラル性は、その活性が測定される時点に応じて、CpGオリゴヌクレオチドの免疫活性において明らかに逆の効果を有し得る。40分という早い時点で、ホスホロチオエートCpGオリゴヌクレオチドにおけるSp型ではないRp型立体異性体が、マウス脾臓細胞におけるJNKのリン酸化反応を誘導する。対照的に、44時間という遅い時刻でアッセイされた場合、Rp型ではなくSp型の立体異性体が、膵臓細胞増殖の刺激において活性を有する。Sp型及びRp型の立体異性体における反応速度及び生物活性のこの相違は、細胞取り込みにおける相違に由来するものではなく、むしろ多分、p−キラリティーにおける2つの逆の生物学的役割によるものと思われる。まず、免疫細胞を早い時期に刺激するSpと比較した、Rp立体異性体の促進された活性は、RpがCpG受容体、TLR9との相互作用又は下流のシグナル伝達経路の誘導において、より効果的であろうことを示唆する。一方、Spと比較したRp PS−オリゴヌクレオチドのより迅速な分解は、遅い時点で試験した場合にSp PS−オリゴヌクレオチドがより生物学的に活性であるようにみえるように、シグナル伝達の持続時間を、より短縮する。
CpGジヌクレオチドそれ自身におけるp−キラリティーにより、驚くべき強い効果が達成される。立体的にランダムなCpGオリゴヌクレオチドの比較において、ただひとつのCpGジヌクレオチドがRpに連結された同種のものがわずかに高い活性を有し、一方、Sp結合を含む同種のものは脾臓細胞増殖の誘導に関しほとんど不活性であった。
本発明により、対象とは、ヒト、又は脊椎動物(限定されるものではないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、霊長類(例えばサル等)及び魚類(水産養殖種:例えばサケ等)が挙げられる)を意味するであろう。従って本発明は、非ヒト対象における癌及び腫瘍、感染及びアレルギー/喘息の処置のために使用することもできる。癌はペット(すなわち、ネコやイヌ)の死亡の中心的な原因のひとつである。
本明細書中で使用されるとき、用語「処置する、処置された、又は処置」は、感染症や癌、アレルギー又は喘息のような疾患に関し使用される場合、その疾病の進行における対象の耐性(例えば、病原体による感染に対する)を増加させ、又は言い換えれば、対象がその疾病を進行させる(例えば、病原体に感染する)であろう可能性を低減させ、ならびに、対象が疾病の進行後にその疾病と闘う(例えば感染を低減させる又はなくす)又はより悪化することを防ぐための、処置を指す。
例として、CpGオリゴヌクレオチドが抗原と共に投与された場合、対象は抗原に被曝され得る。本明細書中で使用するとき、用語「被曝する」とは、対象を抗原と接触させる能動的ステップ、又は対象の抗原へのインビボでの受動的曝露のいずれかを指す。対象を抗原へと能動的に曝露するための方法は技術的によく知られている。一般的に、抗原は、静脈内、筋肉内、経口、経皮、経粘膜、鼻腔内、気管内、又は皮下投与等の任意の手段により、直接的に対象へと投与される。抗原は全身的又は局所的に投与され得る。抗原及びCpG免疫活性化核酸の投与方法を以下により詳細に記述する。抗原が体内の免疫細胞へと曝露するために利用できる場合、対象は受動的に抗原に被曝される。対象は、例えば外来の病原体が体内に侵入することにより、又は外来の抗原を表面に発現している腫瘍細胞の成長によって、受動的に抗原に被曝され得る。
対象が受動的に抗原に被曝される方法は、CpG免疫活性化核酸を投与するタイミングに特定的に依存する場合がある。例えば、癌もしくは感染症、又はアレルギーもしくは喘息的な応答が進行しているリスク状態にある対象では、その対象はCpG免疫活性化核酸を、そのリスクが最大の場合、すなわちアレルギー期の間又は発癌物質へと曝露した後、通常の基準に基づいて投与され得る。追加的なCpG免疫活性化核酸を、感染性の物質へ曝露されるリスク状態にある外国へ旅行する前の旅行者に対して投与してもよい。同様に、対象がそれらに被曝したときに抗原に対する全身的又は経粘膜的な免疫応答を引き起こすための生物兵器に曝露するリスクを有する兵士又は民間人に対して、CpG免疫活性化核酸を投与することができる。
本明細書中に使用する抗原は、免疫応答を誘発可能な分子である。抗原は、限定されるものではないが、細胞、細胞抽出物、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカライド、ポリサッカライド結合体、ポリサッカライドのペプチド及び非ペプチド擬似体及びその他の分子、小分子、脂質、糖脂質、糖質、ウィルス及びウィルス抽出物及び寄生虫等の多細胞生物、及びアレルゲンを含む。用語「抗原」は、宿主の免疫系により外来物であると認識される任意のタイプの分子を広範に含む。抗原は、限定されるものではないが、癌抗原、微生物抗原、及びアレルゲンを含む。
本発明の方法において、CpG免疫活性化核酸は直接的に対象へと投与されてもよく、又は核酸送達複合体と組み合わせて投与されてもよい。核酸送達複合体は、(例えば、イオン結合的に又は共有結合的に;又はその中にカプセル化されて)標的化の手段(例えば、標的細胞への、より高い親和性結合をもたらす分子)と組み合わされた核酸分子を意味する。核酸送達複合体の例は、ステロール(例えばコレステロール)、脂質(例えばカチオン性脂質、ウィロソーム(virosome)又はリポソーム)、又は標的細胞特異的な結合剤(例えば、標的細胞特異的な受容体により認識されるリガンド)と関連した核酸を含む。好ましい複合体は、標的細胞により内在化される前の顕著な脱カップリングを防ぐためには、インビボで十分に安定ではない場合がある。しかし、この複合体は、オリゴヌクレオチドが機能的な形態で放出されるように、細胞内の好適な条件下では開裂可能である。
抗原及びオリゴヌクレオチドを表面へと輸送するための送達ビヒクル又は送達デバイスが記述されている。CpG免疫活性化核酸及び/又は抗原及び/又はその他の治療剤は、単独で投与されてもよく(例えば、生理食塩水又は緩衝液中で)、又は技術的に知られた任意の送達ビヒクルを用いて投与されてもよい。例えば、以下の送達ビヒクルが記述されている:蝸牛状物(cochleate);エマルソーム(Emulsome);ISCOMs;リポソーム;生きたバクテリアのベクター(例えばサルモネラ、大腸菌、バチルス・カルマッテ−グエリン(Bacillus calmatte−guerin)、シゲラ、ラクトバチルス);生きたウィルスのベクター(例えば、ワクシニア、アデノウィルス、ヘルペス・シンプレックス);ミクロスフィア;核酸ワクチン;ポリマー(例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン);ポリマー環;プロテオソーム;フッ化ナトリウム;トランスジェニック植物;ウィロソーム;ウィルス様粒子。その他の送達ビヒクルは技術的に知られ、いくつかの付加的な例が本明細書中で提供されている。
用語「効果的な量のCpG免疫活性化核酸」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要な、又は十分な量をいう。例えば、粘膜免疫を誘導するために抗原と共に投与されるある効果的な量のCpG免疫活性化核酸とは、抗原に曝露したときの、その抗原に対する応答におけるIgAの生成を引き起こすために必要な量である一方、全身的な免疫を誘導するために必要とされる量は、抗原に曝露したときにその抗原に対する応答におけるIgGの生成を引き起こすために必要な量である。本明細書中で提供される教示と組み合わせて各種の活性化合物の中から選択し、有効性、相対的な生物学的利用能、対象の体重、不利な副作用の深刻性及び好ましい投与様式等の要素を重み付けすることによって、実質的な毒性をもたらさないが、特定の対象を処置するために全体として効果的である予防的又は治療的処置の計画が可能である。任意な特定の適用のために効果的な量は、処置される疾病又は状態に関するこのような因子、投与される特定のCpG免疫活性化核酸、その対象の大きさ、又はその疾患又は状態の重篤性に応じて変わり得るものである。当業者は、効果的な量の、特定のCpG免疫活性化核酸及び/又は抗原及び/又はその他の治療剤を、過度の実験を必要とすることなく実験的に判断することができる。
粘膜又は局所的な送達のための本明細書中に記載の化合物の対象投与量は、通常、その適用が日毎か、週毎か、又は月毎及びそれらの間における任意のその他の期間に行われるかに応じて、投与当たり約0.1μg〜10mgの範囲である。より通常的には、投与当たり約10μg〜5mgの範囲であり、最も通常的には、数日又は数週間間隔をおいた2〜4回の約100g〜1mgの投与である。より通常的には、免疫刺激剤の投与量は、投与あたり1μg〜10mgの範囲であり、最も通常的には、数日又は数週間間隔をおいた10μg〜1mgの範囲の投与である。化合物が別の治療剤とではなく抗原とともに送達される、抗原特異的な免疫応答を誘導するための非経口的な送達のための本明細書中に記載の化合物の対象投与量は、ワクチンアジュバント又は免疫刺激的な適用のために効果的な粘膜的な投与量よりも通常5〜10,000倍多く、より通常的には10〜1,000倍高く、また最も通常的には20〜100倍高い。固有の免疫応答を誘導するため、又は、ADCCを増加させ、あるいは抗原特異的な免疫応答を誘導する目的で非経口的に送達するための本明細書中に記載の化合物の投与量は、CpG免疫活性化核酸がその他の治療薬と組み合わせて、又は特殊化された送達ビヒクル中で投与される場合、通常、投与あたりその適用が日毎か、週毎か、又は月毎及びそれらの間における任意のその他の期間に行われるかに応じて、約0.1g〜10mgの範囲である。これらの目的に対する、より通常的な非経口的投与量は、投与あたり約10g〜5mgの範囲であり、最も通常的には、数日又は数週間間隔をおいた2〜4回の約100μg〜1mgの投与である。ある実施形態において、しかし、これらの目的のための非経口的な投与量は、上述の通常の投与量よりも5〜10,000倍多い範囲で使用される場合がある。
本明細書中に記載の任意の化合物に関する、治療に効果的な量は、まず動物モデルから決定され得る。治療に効果的な投与量は、ヒトにおいて試験されているCpGオリゴヌクレオチドに関するヒトのデータ(ヒト臨床試験が開始されている)からも決定することができ、また、例えばワクチン接種の目的のためのLT及びその他の抗原等、その他のアジュバント等の類似する医薬的薬理的活性を示すことが知られている化合物についても決定することができる。より多い投与量が、非経口的な投与のためには必要とされ得る。投与量は、投与された化合物の相対的な生物学的利用能及び有効性に基づいて調節され得る。上述の方法に基づいて最大の効果を達成するため投与量を調節する方法、及びその他の方法は、当業者により可能な範囲で技術的によく知られている。
本発明の製剤は薬学上許容し得る溶液中で投与され、それは通常、薬学上許容し得る濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合し得る担体、アジュバント、及び任意にその他の治療成分を含み得る。
治療に使用するために、効果的な量のCpG免疫活性化核酸を、例えば、粘膜、全身等の所望の表面へとそのオリゴヌクレオチドを送達する任意の様式によって、対象へと投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は、当業者に知られた任意の手段により達成し得る。好ましい投与経路は、限定されるものではないが、経口、非経口的、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼内、膣内、及び直腸内を含む。
経口投与のために、化合物(すなわち、CpG免疫活性化核酸、抗原及びその他の治療薬)は、活性な(単数又は複数の)化合物を、技術的に良く知られた薬学上許容し得る担体と組み合わせることによって、容易に製剤化することができる。このような担体は、本発明の化合物を、処置される対象による経口摂取のために錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化することを可能にする。経口用途のための医薬調製物は、固体の賦形剤として得ることができ、状況に応じ、所望される場合、錠剤又は糖衣錠の中心部を得るために、得られる混合物を挽き、そして好適な助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、シュークロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類等の増量剤、例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び/又はポリビニルピロリドン(PVP)等のセルロース調製物である。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸、又はアルギン酸ナトリウム等のその塩等の崩壊剤を添加してもよい。状況に応じて、経口製剤は、食塩水又は緩衝液中、すなわち内部の酸性状態を中和するためのEDTA中に製剤化してもよく、又はなんら担体を伴わずに投与してもよい。
また、上述の単数又は複数の成分の経口投与量形態も具体的に意図される。単数又は複数の成分は、その誘導体の経口送達が有効であるように化学的に修飾され得る。通常、意図される化学的修飾は、成分分子それ自身に対する少なくとも1つの部分の連結であり、その部分が(a)蛋白質分解の阻害;及び(b)胃又は腸から血流への取り込みを可能にする。また、単数又は複数の全体的な安定性を高め、体内での循環を増加させることが所望される。このような部分の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロピレンを含む。Abuchowski及びDavis、1981、”Soluble Polymer−Enzyme Adducts”:Enzymes as Drugs、Hocenberg及びRobertsら編、Wiley−Interscience、New York、NY、pp.367−383;Newmarkら、1982、J.Appl.Biochem.4:185−189。使用可能なその他のポリマーは、ポリ−1,3−ジオキソラン及びポリ−1,3,6−チオキソカンである得る。上記に示されたポリエチレングリコール部分が、医薬的な用途にとって好ましい。
組成物(又は誘導体)に関する放出場所は胃、小腸(十二指腸、空腸、又は回腸)、又は大腸であり得る。当業者であれば、胃では溶解しないが、十二指腸又は腸内の他の場所では物質を放出するであろう製剤が入手可能である。好ましくは、その放出は、オリゴヌクレオチド(又は誘導体)の保護、又は腸等において等の、胃の環境を過ぎてからの生物学的活性成分の放出のいずれかによって、胃の環境における有害な影響を回避するであろう。
十分な胃での耐性を保障するために、少なくともpH 5.0に対し不浸透性のコーティングが不可欠である。腸溶コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース(CAT)、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、フタル酸ポリビニル酢酸(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、フタル酸酢酸セルロース(CAP)、Eudragit L、Eudragit S、及びShellacである。これらのコーティングは混合被膜として使用してもよい。
コーティング又はコーティングの混合物は、胃に対する保護を意図しない錠剤にも使用される場合がある。このことは、糖コーティング又は錠剤をより飲み込みやすくさせるためのコーティングを含み得る。カプセルは、乾燥した治療薬すなわち粉末の送達に対しては硬質シェル(ゼラチン等)から構成され得、液状形態に対しては柔らかいゼラチンシェルが使用され得る。このカプセル(cachet)のシェルの素材は、厚い澱粉又はその他可食性の紙である場合もある。
丸薬、トローチ剤、成型された錠剤又は錠剤の粉末については湿式の成型技術が使用され得る。
治療剤は、顆粒形態の微細な複数粒子、又は大きさ約1mmの粒子のペレットとして製剤中に含まれる。カプセル投与のための物質における製剤は、粉末、軽度に圧縮したプラグ(plug)でもあり得、又は錠剤であってもよい。治療剤は圧縮によって調製し得る。色素及び香料を含んでも良い。例えば、オリゴヌクレオチド(又は誘導体)は(リポソーム又はミクロスフィアカプセル化などにより)製剤化され、さらに、色素や香料を含む冷却された飲料等として、可食性の産物内に含有されてもよい。
治療剤の容量を、不活性な素材により希釈又は増加させることができる。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、a−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、シュークロース、修飾デキストラン及び澱粉を含み得る。ある種の無機塩を3リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含む増量剤として使用してもよい。いくつかの市販の希釈剤としては、Fast−Flo、Emdex、STA−Rx 1500、Emcompress及びAvicellである。
錠剤分解物質は、治療剤を固体の投与量形態へと製剤化する際に含まれ得る。錠剤分解物質としての素材は、限定されるものではないが、澱粉をベースとする市販の錠剤分解物質であるExplotab等の澱粉を含む。グリコール酸澱粉ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、カルボキシメチルセルロース酸、海綿及びベントナイトは全て使用可能である。錠剤分解物質の別の形態は、不溶性のカチオン交換樹脂である。粉末化されたガムは錠剤分解物質及び結合剤として使用することができ、これらは寒天、カラヤゴム又はトラガカント等の粉末化されたガムを含み得る。アルギン酸及びそのナトリウム塩も錠剤分解物質として有用である。
結合剤は治療剤をまとめて硬い錠剤にするために使用され得、アカシア、トラガカント、澱粉及びゼラチン等の天然産物由来の素材を含む。その他には、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)及びカルボキシメチルセルロース(CMC)を含む。ポリビニルピロリドン(PVP)及びヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は、治療剤を顆粒化するためにアルコール溶液中でいずれも使用することができる。
潤滑剤は、製剤プロセス中の固着を防ぐために治療剤の製剤の際に含まれてもよい。滑剤は、治療剤と型との間の層として使用され得、これらは限定されるものではないが、マグネシウム塩及びカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、液状パラフィン、植物性油脂及びワックスを含む。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000及び6000等の可溶性の滑剤も使用され得る。
製剤化における薬物の流体特性を向上させ、圧縮の際の再配置を助けるために、流動促進剤を添加してもよい。流動促進剤は、澱粉、タルク、発熱シリカ及び水和アルミニウムケイ酸を含む。
治療剤の水系環境への溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として添加してもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホスクシネート及びジオクチルナトリウムスルホネート等のアニオン性界面活性剤を含む。カチオン性界面活性剤は使用でき、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムを含み得る。界面活性剤として製剤中に含まれ得る可能性が見込まれる非イオン性界面活性剤のリストとしては、lauromacrogol 400、ステアリン酸ポリオキシル 40、ポリオキシエチレン水和化ヒマシ油 10、50及び60、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルビン酸 40、60、65及び80、シュークロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、オリゴヌクレオチド又は誘導体の製剤において、単独で、又は異なる割合での混合物のいずれかとして存在し得る。
経口的に使用される医薬調製物は、ゼラチン製の押し込み型のカプセルならびに軟らかいゼラチン製の密閉カプセル、及びグリセロール又はソルビトール等の可塑剤を含む。押し込み型のカプセルは、ラクトース等の増量剤、澱粉等の結合剤、及び/又はタルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の滑剤、任意で安定剤等と混合された活性成分を含む。軟らかいカプセルにおいては、活性化合物は脂肪油、液状パラフィン、又は液状のポリエチレングリコール等の好適な液体中に溶解又は懸濁され得る。さらに、安定剤を加えてもよい。経口投与のために製剤化されるミクロスフィアも使用される場合がある。このようなミクロスフィアは技術的によく規定されている。経口投与のための全ての製剤は、そのような投与に好適な投与量である必要がある。
口腔投与のために、組成物は従来の方法により製剤化された錠剤又はトローチ剤の形態をとり得る。
吸入による投与のために、本発明の用途のための化合物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の好適なガス等の好適な推進剤(高圧ガス)を用いて加圧バッグ又はネブライザー(噴霧器)からエアロゾルスプレーを生じる形で簡便に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投与量単位は、一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定してもよい。吸入又は吸入器で使用するための、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物の粉末混合物及びラクトース又は澱粉等の好適な粉末基材を含んで製剤化され得る。
また、本明細書中で、オリゴヌクレオチド(又はその誘導体)の肺への送達も意図される。吸入の間に、オリゴヌクレオチド(又は誘導体)は哺乳動物の肺へと送達され、肺上皮層を越えて血流へと至る。その他の吸入された分子に関する報告は、Adjeiら、1990、Pharmaceutical Research、7:565−569;Adjeiら、1990、International Journal of Pharmaceutics、63:135−144(酢酸ロイプロリド);Braquetら、1989、Journal of Cardiovascular Pharmacology、13(補遺 5):143−146(エンドセリン−1);Hubbardら、1989、Annals of Internal Medicine、Vol.III、pp.206−212(a1−アンチトリプシン);Smithら、1989、J.Clin.Invest.84:1145−1146(a−1−プロテイナーゼ);Osweinら、1990、“Aerosolization of Proteins”、Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II、Keystone、Colorado、March、(組換えヒト成長ホルモン);Debsら、1988、J.Immunol.140:3482−3488(インターフェロン−g及び腫瘍壊死因子α)及びPlatzら、米国特許第5,284,656号(顆粒球コロニー刺激因子)を含む。全身的効果のための薬物における肺送達のための方法及び組成物は、1995年9月19日にWongらに付与された米国特許第5,451,569号に記述されている。
治療用産物の肺送達のため設計された広範な機械的デバイスが、本発明の実践において使用されることを意図され、限定されるものではないが、ネブライザー、定量吸入器及び粉末吸入器や、当業者に知られたあらゆるものを含む。
本発明の実践に好適な市販のデバイスにおけるいくつかの具体的な例としては、Mallinckrodt社(セントルイス、ミズーリ)製のUltravent(商標)ネブライザー、Marquest Medical Products社(Englewood、コロラド)製のAcorn II ネブライザー、Glaxo社(Research Triangle Park、ノースカロライナ)製のVentolin(商標)定量投与量吸入器、及びFisons社(Bedford、マサチューセッツ)製のSpinhaler(商標)粉末吸入器が挙げられる。
全てのそのようなデバイスは、オリゴヌクレオチド(又は誘導体)の投薬に対し好適な製剤の使用を必要とする。通常、各製剤は利用されるデバイスのタイプに特異的であり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント及び/又は担体に加えて好適な推進物質の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセル又はミクロスフィア、封入複合体(inclusion complex)、又はその他のタイプにおける担体の使用も意図される。化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを、化学的修飾のタイプ又は利用されるデバイスのタイプに応じて異なる製剤に調製してもよい。
ジェット噴流又は超音波のいずれかの噴霧器を用いた使用に好適な製剤は、通常、溶液1mLあたり約0.1〜25mgの濃度で生物学的に活性なオリゴヌクレオチドが水に溶解したオリゴヌクレオチド(又は誘導体)を含む。製剤はまた、(例えば、オリゴヌクレオチド安定化及び浸透圧の調節のための)緩衝液及び単糖を含んでもよい。この噴霧器製剤はまた、エアロゾル形成時の溶液の噴霧化により引き起こされる、表面に誘起されたオリゴヌクレオチドの凝集を低減又は予防するための界面活性剤を含んでもよい。
定量噴霧器デバイスを用いた使用のための製剤は、一般に、界面活性剤の助けを伴う推進物質中に懸濁されたオリゴヌクレオチド(又は誘導体)を含む、微粉化された粉末を含む。この推進物質は、この用途に対し利用される、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び1,1,1,2−テトラフルオロエタン、又はそれらの組み合わせを含むクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン又はヒドロカーボン等の任意の従来物質であってよい。好適な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン及び大豆レシチンを含む。オレイン酸も界面活性剤として有用である。
粉末噴霧器デバイスから投薬するための製剤は、オリゴヌクレオチド(又は誘導体)を含む微粉化された乾燥粉末を含むであろうし、またラクトース、ソルビトール、シュークロース又はマンニトール等の充てん剤を、デバイスからの粉末の散布を手助けする量、例えば製剤重量の50〜90%で含んでもよい。オリゴヌクレオチド(又は誘導体)は、最も効果的な末梢気道への送達のためには、最も有利には平均的な粒子サイズが10mm(又はミクロン)に満たない粒子形態、最も好ましくは0.5〜5mmの粒子形態に調製される必要がある。
本発明の医薬組成物の経鼻送達もまた意図される。経鼻送達は、治療用産物を鼻に対して投与後、肺においてこの産物を堆積させる必要なしに、本発明の医薬組成物を直接血流へと通過可能にする。経鼻送達のための製剤は、デキストラン又はシクロデキストランを伴うものを含む。
経鼻投与のための有用なデバイスは、小型の硬質のボトルであり、これに対し定量投与スプレーが連結される。一実施形態において、定量投与量は、本発明の溶液の医薬組成物を所定の容量でチャンバーへと取り出すことにより供給され、このチャンバーは、チャンバー中の液体が圧縮されるときにスプレーを形成することによるエアロゾル化及びエアロゾル形成を行うために寸法付けられた開口(アパーチャ)を有する。チャンバーは本発明の医薬組成物を投与するために圧縮される。特定の実施形態において、このチャンバーはピストン装置である。そのようなデバイスは市販されている。
あるいは、圧縮されるときにスプレーを形成することによるエアロゾル化及びエアロゾル形成を行うために寸法付けられた開口を有する、プラスチック製のスクイーズボトルが使用される。この開口部は通常ボトルの頂部に見られ、この頂部は通常、エアロゾル製剤の効率的な投与のために鼻道に部分的に合うよう、先細となっている。好ましくは、鼻吸入器は、計量された投与量の薬物を投与するために定量のエアロゾル製剤を提供するであろう。
化合物は、それらを全身に送達することが望ましい場合、例えばボーラス注入又は連続的輸液等の注入による非経口的な投与のために製剤化され得る。注入のための製剤は、例えば、保存料を添加されて、アンプルでか又は複数回投与量の容器等における単位投与量の形で与えられてもよい。その組成は懸濁液、溶液又は油性又は水溶性ビヒクル中のエマルジョン等の形態をとる場合があり、また懸濁剤、安定化剤、及び/又は分散剤等の処方用の薬剤を含んでもよい。
非経口的な投与のための医薬製剤は、水可溶性の形態における活性な化合物の水溶液を含む。さらに、この活性な化合物の懸濁液は、好適な油性の注入懸濁液として調製される場合がある。好適な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油等の脂肪酸等、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドの合成脂肪酸エステル等、又はリポソーム等を含む。水性の注入用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストラン等の、懸濁液の粘性を高める物質を含んでもよい。状況に応じ、この懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解性を高める好適な安定剤又は薬物を含み得る。
あるいは、活性な化合物は、使用前に、滅菌された発熱物質非含有の水等の好適なビヒクルを伴う状態のために粉末形態で存在してもよい。
化合物は、例えば、カカオバター又はその他のグリセリド等の従来の坐剤用基剤を含む坐剤又は保留浣腸等の、直腸用又は膣用の組成に製剤化することもできる。
上述の製剤に加えて、この化合物を持続性製剤として製剤化してもよい。このような長時間作用性の製剤は、好適なポリマー性又は疎水性物質(例えば許容し得るオイル中のエマルジョン等)又はイオン交換樹脂と共に製剤化することができ、又は、例えば、やや溶けにくい塩等のやや溶けにくい誘導体として製剤化することができる。
医薬組成物はまた、好適な固体又はゲル相の担体又は賦形剤を含んでもよい。そのような担体又は賦形剤の例は、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン及びポリエチレングリコール等のポリマーを含む。
好適な液状の又は固体の医薬調製物形態は、例えば、吸入のための水溶液又は食塩水溶液であり、マイクロカプセル化され、渦巻き型にされ(encochleated)、微細な金粒子上に被覆され、リポソーム中に含有され、噴霧され、エアロゾルであり、皮膚へと埋め込むためのペレットであり、又は皮膚内へと至るための尖った物体の上で乾燥される。医薬組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、(マイクロ)カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップ又は持続的な活性化合物の放出を伴う調製物を含み、それらの調製物においては、錠剤分解物質、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑剤、香料、甘味料又は可溶化剤等の賦形剤及び添加剤及び/又は助剤が、通例上述のように使用される。医薬組成物は、各種の薬物送達系において使用するために好適である。薬物送達についての方法の手短なレビューに関しては、Langer、Science 249:1527−1533、1990を参照されたく、これを参照により本明細書中に取り込むものとする。
CpG免疫活性化核酸及び任意のその他の治療法の及び/又は抗原は、それ自体(ニート)で、又は薬学上許容し得る塩の形態で投与され得る。薬剤中で使用される場合、その塩は薬学上許容し得るものである必要があるが、薬学上許容し得る塩でないものが、薬学上許容し得るその塩を調製するために都合よく用いられる場合がある。そのような塩は、限定されるものではないが、以下の酸から調製されるものを含む:塩酸、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロニル酸、コハク酸、ナフタレン−2−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。また、このような塩はカルボン酸類のナトリウム、カリウム又はカルシウム塩等のアルカリ金属又はアルカリ土類塩として調製されてもよい。
好適な緩衝剤は、酢酸及び塩(1−2% w/v);クエン酸及び塩(1−3% w/v);ホウ酸及び塩(0.5−2.5% w/v);及びリン酸及び塩(0.8−2% w/v)を含む。好適な保存料は塩化ベンザルコニウム(0.003−0.03% w/v);クロロブタノール(0.3−0.9% w/v);パラベン(0.01−0.25% w/v)及びチメロサール(0.004−0.02% w/v)を含む。
本発明の医薬組成物は、効果的な量のCpG免疫活性化核酸及び、抗原及び/又は薬学上許容し得る担体中に任意に含まれるその他の治療薬を、任意に含む。用語「薬学上許容し得る担体」は、ヒト又はその他の脊椎動物への投与に好適な、1以上の適合する固体又は液体の状の増量剤、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。用語「担体」は、適用を促進するために活性成分を組み合わせる有機又は無機成分、天然又は合成を意味する。医薬組成物の成分は、本発明の化合物と混合でき、また互いにより、臨まれる医薬的効果を実質的に損なうことがないような相互作用を生じない方法において混合することができる。
ある実施形態において、本発明の免疫活性化オリゴヌクレオチドは1以上の親油基(L)に連結され得る。
親油基Lは、好ましくはコレステリル又は修飾コレステリル残基である。コレステロール部分は還元(例えばコレスタンにおけるように)され、又は置換(例えばハロゲンによる)されてもよい。1分子中での異なる親油基の組み合わせも可能である。その他の親油基は、限定されるものではないが、胆汁酸、コール酸又はタウロコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸オレイル、コレン酸オレオイル、糖脂質類、リン脂質類、スフィンゴ脂質類、ステロイド等のイソプレノイド類、ビタミンE等のビタミン類、飽和又は不飽和の脂肪酸類、トリグリセリド類等の脂肪酸エステル類、ピレン類、ポルフィリン類、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリル、シアニン色素(例えばCy3又はCy5)、ヘキスト33258色素、ソラレン、又はイブプロフェンを含む。
ある実施形態において、Lは、好ましくはオリゴヌクレオチドの3’末端、又はその近傍に存在する。Lはリンカー部分によりオリゴヌクレオチドへと連結され得る。状況に応じて、リンカー部分は非ヌクレオチドのリンカー部分である。非ヌクレオチドのリンカーは、例えば脱塩基残基(dSpacer)、トリエチレングリコール(スペーサー9)もしくはヘキサエチレングリコール(スペーサー18)等のオリゴエチレングリコール、又はブタンジオール等のアルカン−ジオールである。スペーサー単位は、好ましくはホスホジエステル又はホスホロチオエート結合により連結される。このリンカー単位は分子中に1度だけ出現するか、又はホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、又はアミド結合等を介して数回取り込まれ得る。
親油基Lは、オリゴヌクレオチドの様々な位置に結合させることができる。ある実施形態において、親油基Lはオリゴヌクレオチドの3’末端へと結合され、3’エキソヌクレアーゼに対するオリゴマーの安定性を高めるための役割も果たす。あるいは、内部ヌクレオチド又は分岐におけるヌクレオチドへと結合する。親油基Lはヌクレオチドの2’の位置に結合されてもよい。親油基Lはまた、ヌクレオチドの複素環塩基にも結合される。
本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、決して更なる限定として解釈されるべきではない。本出願書類全体にわたり引用される参考文献(参考文献、特許、公開された特許出願及び同時係属中の特許出願が挙げられる)の全文は、本明細書により、参照によって明確に取り込まれる。
(材料及び方法)
(オリゴデオキシヌクレオチド)
全てのODNはBiospring(フランクフルト、ドイツ)より購入し、Coley Pharmaceutical Group(ランゲンフェルド、ドイツ)により同一性及び純度について管理され、Limulusアッセイ(BioWhittaker、ベルビエ、ベルギー)によって測定されるエンドトキシンレベルは検出限界以下(<0.1EU/ml)であった。ODNは滅菌されたエンドトキシン非含有のTris−EDTA(Sigma、デイセンホーフェン、ドイツ)、中に懸濁し、微生物及びエンドトキシンの汚染の両方を防ぐために無菌状態で保管及び操作された。全ての希釈は発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies、エッゲンスタイン、ドイツ)を用いて行った。
(オリゴデオキシヌクレオチド)
全てのODNはBiospring(フランクフルト、ドイツ)より購入し、Coley Pharmaceutical Group(ランゲンフェルド、ドイツ)により同一性及び純度について管理され、Limulusアッセイ(BioWhittaker、ベルビエ、ベルギー)によって測定されるエンドトキシンレベルは検出限界以下(<0.1EU/ml)であった。ODNは滅菌されたエンドトキシン非含有のTris−EDTA(Sigma、デイセンホーフェン、ドイツ)、中に懸濁し、微生物及びエンドトキシンの汚染の両方を防ぐために無菌状態で保管及び操作された。全ての希釈は発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水(Life Technologies、エッゲンスタイン、ドイツ)を用いて行った。
以下の表は、以下の実験(*はホスホロチオエート、及び_はホスホジエステル又はホスホジエステル様のものである)に使用するオリゴヌクレオチド類(5’から3’方向に示す)の配列を示す。
(TLR9アッセイ)
ヒト又はマウスTLR9を発現している、安定にトランスフェクトされたHEK293細胞が以前に報告された。手短に言えば、HEK293細胞を、ヒト又はマウスTLR9を発現するベクター及び6×NFκB−ルシフェラーゼレポータープラスミドと共に電気泳動することによりトランスフェクトした。安定な形質転換体(3×104細胞/ウェル)をODNと共に16時間、37℃、加湿インキュベーター内でインキュベートした。各データのポイントは3連で行った。細胞を溶菌し、ルシフェラーゼ遺伝子活性をアッセイした(BriteLite kit(Perkin−Elmer、ザベンテム、ベルギー)を使用した)。刺激の指標はODNを添加しない培地におけるレポーター遺伝子の活性と比較して計算した。
ヒト又はマウスTLR9を発現している、安定にトランスフェクトされたHEK293細胞が以前に報告された。手短に言えば、HEK293細胞を、ヒト又はマウスTLR9を発現するベクター及び6×NFκB−ルシフェラーゼレポータープラスミドと共に電気泳動することによりトランスフェクトした。安定な形質転換体(3×104細胞/ウェル)をODNと共に16時間、37℃、加湿インキュベーター内でインキュベートした。各データのポイントは3連で行った。細胞を溶菌し、ルシフェラーゼ遺伝子活性をアッセイした(BriteLite kit(Perkin−Elmer、ザベンテム、ベルギー)を使用した)。刺激の指標はODNを添加しない培地におけるレポーター遺伝子の活性と比較して計算した。
(細胞の精製)
Blood Bank of the University of Dusseldorf(ドイツ)由来の健康なヒトのドナーから末梢血バフィーコート調製物を入手し、Ficoll−Hypaque(Sigma)上で遠心分離してPBMCを精製した。細胞を、5%(v/v)熱失活ヒトAB血清(BioWhittaker)又は10%(v/v)熱失活FCS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(全てSigmaより)を添加したRPMI 1640培地中、37℃、加湿インキュベーター内で培養した。
Blood Bank of the University of Dusseldorf(ドイツ)由来の健康なヒトのドナーから末梢血バフィーコート調製物を入手し、Ficoll−Hypaque(Sigma)上で遠心分離してPBMCを精製した。細胞を、5%(v/v)熱失活ヒトAB血清(BioWhittaker)又は10%(v/v)熱失活FCS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(全てSigmaより)を添加したRPMI 1640培地中、37℃、加湿インキュベーター内で培養した。
(サイトカイン検出)
PBMCを3×106細胞/mlの濃度で再懸濁し、48ウェルの平底プレート(1ml/ウェル)又は96ウェルの丸底プレート(250μl/ウェル)へと加えた。PBMCを各種濃度のODNと共にインキュベートし、指示されたタイムポイント経過後に培養上清(SN)を回収した。直ちに使用しない場合には、SNは必要とされるまで−20℃で凍結された。
PBMCを3×106細胞/mlの濃度で再懸濁し、48ウェルの平底プレート(1ml/ウェル)又は96ウェルの丸底プレート(250μl/ウェル)へと加えた。PBMCを各種濃度のODNと共にインキュベートし、指示されたタイムポイント経過後に培養上清(SN)を回収した。直ちに使用しない場合には、SNは必要とされるまで−20℃で凍結された。
SN中のサイトカインの量は、市販のELISAキット(IL−6、IP−10、IFN−γ又はIL−10;Diaclone、ブザンソン、フランス)、又は市販の抗体(PBL、ニューブルンズウィック、NJ、米国、複数のIFN−α種の検出用)を用いて開発した自作のIFN−α用ELISAを使用してアッセイした。
(ヒトB細胞の単離)
ヒトB細胞は、丸ごとのPBMCから、CD19B細胞単離キットを用いて製造者(Miltenyi、ベルギッシュ−グラッドバッハ、ドイツ)により記載されたやり方で単離された。純度を調べるために、細胞をCD20及びCD14に対するmAbを用いて染色し、フローサイトメトリーにより細胞を同定した。全ての実験においてB細胞は純度95%を上回るものであった。精製されたB細胞(2×105〜5×105細胞/ml)を24時間の間ODN濃度を高めながらインキュベートし、上述のようにIL−6又はIL−10を測定した。
ヒトB細胞は、丸ごとのPBMCから、CD19B細胞単離キットを用いて製造者(Miltenyi、ベルギッシュ−グラッドバッハ、ドイツ)により記載されたやり方で単離された。純度を調べるために、細胞をCD20及びCD14に対するmAbを用いて染色し、フローサイトメトリーにより細胞を同定した。全ての実験においてB細胞は純度95%を上回るものであった。精製されたB細胞(2×105〜5×105細胞/ml)を24時間の間ODN濃度を高めながらインキュベートし、上述のようにIL−6又はIL−10を測定した。
(実施例1)
ホスホロチオエートODNにおける免疫活性化CpGジヌクレオチドを5’末端から3’末端へと移動することにより、IL−10の刺激は維持したままでのIFN−αの産生の段階的な減少が観察された。ヒトPBMCを、示されるように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IFN−α(A)及びIL−10(B)をELISAにより測定した。図1は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
ホスホロチオエートODNにおける免疫活性化CpGジヌクレオチドを5’末端から3’末端へと移動することにより、IL−10の刺激は維持したままでのIFN−αの産生の段階的な減少が観察された。ヒトPBMCを、示されるように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IFN−α(A)及びIL−10(B)をELISAにより測定した。図1は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
データからは、3’末端へ向かって移動したCpGジヌクレオチドを含むODNによってIFN−αの産生が減少しているのにもかかわらず、IL−10分泌のレベルが相対的に一定に保たれていることがわかる。従って、5’CpGの位置はIFN−αの産生を引き起こす。このCpGジヌクレオチドを3’末端へと移動させることは免疫刺激の喪失をもたらさず、効率的にIFN−α分泌しないようにするのみである。
(実施例2)
ヒトPBMCを、示されるように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10をELISAにより測定した。図2は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
ヒトPBMCを、示されるように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10をELISAにより測定した。図2は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
データからは、3’末端へ向かって移動したCpGジヌクレオチドを含むODNに関して、効率的なIL−10分泌のためにはシトシンが5−メチル化されていないことが必要であることがわかる。さらに、ODNの長さが増すと、IL−10刺激の促進がもたらされるようにみえる(配列番号51)。
(実施例3)
ODNのT含量はその免疫刺激活性を決定する。T含量を減らし、指示濃度のODNと共にヒトPBMCを48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10をELISAにより測定した。図3は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
ODNのT含量はその免疫刺激活性を決定する。T含量を減らし、指示濃度のODNと共にヒトPBMCを48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10をELISAにより測定した。図3は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
データからは、ホスホロチオエートODNにおけるチミジンヌクレオチドの含量がIL−10の産生を誘導するためのその能力を決定することがわかる。5’−TCGを有するODN及びアデノシンヌクレオチド数の増加がIL−10を効率的に産生する能力を喪失される。従って、効率的なIL−10産生のためには特定のチミジン含量が必要とされる。
(実施例4)
5’−TCGは効率的なIFN−α産生のために必要とされ、一方、5’−TCは強力なIL−10分泌のために十分である。ヒトPBMCを、示されるように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IFN−α(A)及びIL−10(B)をELISAにより測定した。図1は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
5’−TCGは効率的なIFN−α産生のために必要とされ、一方、5’−TCは強力なIL−10分泌のために十分である。ヒトPBMCを、示されるように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IFN−α(A)及びIL−10(B)をELISAにより測定した。図1は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
データからは、効率的なIFN−α分泌のためにホスホロチオエートODNにおける5’−TCGが必要とされることがわかる。全てのその他の5’トリヌクレオチド(5’−ACG、CCG又はGCG)は、I型インターフェロンの分泌に効果を及ぼさないようにみえる。さらに、5’−CGを5’−TG又は5’−CT(5’−TCGから5’−TTG又は5’−TCTへ)交換することも、IFN−α産生における激しい減少をもたらす(Aにおいて示される)。IFN−α産生と対照的に、IL−10の分泌は、5’−TCを有し5’−CGを欠くODN(配列番号1により示される)により効率的に誘導される(Bにおいて示される)。このODNは、IL−10分泌の誘導に関し5’−TTGを含むODN(配列番号59で示される)よりも強力であるようにみえる。従って、5’−TCGを含まないが、5’TCを含むODNは、ヒトPBMCからのIL−10産生を効率的に誘導する。
(実施例5)
5’−TCにおけるチミジンは化学的に修飾され得る。5’−TCジヌクレオチドにおいて効果的なヌクレオチド塩基は、シトシン又はその修飾物以外にない。ヒトPBMCを、指示されたように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10をELISAにより測定した。図5は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
5’−TCにおけるチミジンは化学的に修飾され得る。5’−TCジヌクレオチドにおいて効果的なヌクレオチド塩基は、シトシン又はその修飾物以外にない。ヒトPBMCを、指示されたように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10をELISAにより測定した。図5は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
データからは、チミジンを豊富に含むODN(ポリ−T 配列番号43)中にシトシン(配列番号1におけるような)又は修飾シトシン(配列番号30における5−メチル−シトシン、及び配列番号33における5−ヒドロキシ−デオキシシチジンのような)を導入することがIL−10量の増加をもたらすことがわかる。この結果は、グアノシン又はアデノシン(配列番号29又は配列番号28におけるような)等のその他の塩基を用いては再現できない。5’−TC、5’−UC(U:ウラシル)、5’−5TC(5T:5−メトキシチミジン)を含むODNは全て同様の活性を有するようにみえる。従って、効率的なIL−10産生のためにはシトシン又はシトシンアナログが必要とされる。
(実施例6)
5’−TCならびに3’方向へ移動されたCpGを含むODNの両者は、5’−TC又はCpGを欠くそれぞれのODN配列と比較して、より強いIL−10産生を誘導する。ヒトPBMCを、指示されたように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10をELISAにより測定した。図6は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
5’−TCならびに3’方向へ移動されたCpGを含むODNの両者は、5’−TC又はCpGを欠くそれぞれのODN配列と比較して、より強いIL−10産生を誘導する。ヒトPBMCを、指示されたように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10をELISAにより測定した。図6は各実験条件に対する3名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
(実施例7)
5’−TCならびに3’方向へ移動されたCpG ジヌクレオチドを含むODNは、IL−6又はIL−10の強力な分泌を誘導するが、IFN−α又はIP−10等のTh1サイトカイン又はケモカインの効率的な刺激には効果を示さない。ヒトPBMCを、示されるように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10(A)IFN−α(B)、IP−10(C)又はIL−6(D)をELISAにより測定した。図7は2名(B)又は3名(A、C及びD)のドナーの平均値±標準誤差を示す。
5’−TCならびに3’方向へ移動されたCpG ジヌクレオチドを含むODNは、IL−6又はIL−10の強力な分泌を誘導するが、IFN−α又はIP−10等のTh1サイトカイン又はケモカインの効率的な刺激には効果を示さない。ヒトPBMCを、示されるように濃度を上げた各ODNとともに48時間インキュベートした。SNを回収し、IL−10(A)IFN−α(B)、IP−10(C)又はIL−6(D)をELISAにより測定した。図7は2名(B)又は3名(A、C及びD)のドナーの平均値±標準誤差を示す。
データからは、中央部のCpGジヌクレオチドと組み合わせた5’−TCが、IL−6又はIL−10等の各種のサイトカインの強力で効率的な刺激を伴うODNをもたらすことがわかる。対照的に、これらのODNは、B−クラスODN 配列番号54、及びC−クラスODN 配列番号60と比較して弱いIFN−α及びIP−10分泌をもたらす。これらのODNはT−クラスODNと称される。
(実施例8)
T−クラスODNは、高度精製ヒトB細胞からのIL−6及びIL−10の産生を効率的に誘導する。B細胞をヒトPBMCから単離し、示されるODNと共に24時間培養した。SNを回収し、IL−6(A)又はIL−10(B)をELISAにより測定した。図8は各実験条件に対する2名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
T−クラスODNは、高度精製ヒトB細胞からのIL−6及びIL−10の産生を効率的に誘導する。B細胞をヒトPBMCから単離し、示されるODNと共に24時間培養した。SNを回収し、IL−6(A)又はIL−10(B)をELISAにより測定した。図8は各実験条件に対する2名のドナーの平均値±標準誤差を示す。
データからは、TクラスODNを用いてヒトPBMCの培養物において産生されるIL−10又はIL−6の供給源がB細胞であることがわかる。従って、このことは直接的な効果であるようにみえる。実際、IL−10を分泌しているB細胞がIL−10産生者として重要な役割を果たし、従って、Th2に偏向した免疫応答、あるいは調節T細胞又は調節B細胞の誘導を行うことが先に実証されていた。
(実施例9)
ヒトTLR9及びNFκB−ルシフェラーゼレポーターを発現している細胞がT−クラスODNにより刺激される。ヒトTLR9を発現している形質転換体を示されるODN濃度で16時間インキュベートする。細胞を溶菌し、ルシフェラーゼ活性を介してNFκB刺激を測定した。結果を図9に示す。刺激の指標は、ODNを添加しない培地におけるルシフェラーゼ活性に対して計算した(ルシフェラーゼ活性における誘導の倍数)。
ヒトTLR9及びNFκB−ルシフェラーゼレポーターを発現している細胞がT−クラスODNにより刺激される。ヒトTLR9を発現している形質転換体を示されるODN濃度で16時間インキュベートする。細胞を溶菌し、ルシフェラーゼ活性を介してNFκB刺激を測定した。結果を図9に示す。刺激の指標は、ODNを添加しない培地におけるルシフェラーゼ活性に対して計算した(ルシフェラーゼ活性における誘導の倍数)。
データからは、非発現細胞におけるTLR9発現の再構成が、TクラスODNと共にインキュベーションした場合にNFκBの刺激を媒介する能力をもたらすことがわかる。従ってこのデータからは、TクラスODNはTLR9を介して免疫系を刺激することが強く示唆される。
(実施例10)
TLR9を介したNFκBの活性化を、マウス又はヒトTLR9によりトランスフェクトされた細胞中で測定した。図10はパネルA中にヒト細胞、パネルB中にマウス細胞の結果を示す。驚くべきことに、このクラスのODN(Tクラス)を伴うヒトTLR9形質転換体に比較して、マウスTLR9形質転換体において、CpGジヌクレオチドの位置における強い依存性が観察された。これらの実験において、マウスTLR9は、14(シトシン)及び15(グアノシン)位、又はさらに3’末端側の位置においてCpGを含むODNへの顕著なNFkBシグナル伝達応答を示さなかった(B)。対照的に、ヒトTLR9形質転換体は、14及び15位にCpGを含むODNに対し強く応答した(A)。さらにこれらの実験において、TクラスODNは、マウスTLR9形質転換体においてよりもヒトにおいて、より強力な刺激をもたらした。
TLR9を介したNFκBの活性化を、マウス又はヒトTLR9によりトランスフェクトされた細胞中で測定した。図10はパネルA中にヒト細胞、パネルB中にマウス細胞の結果を示す。驚くべきことに、このクラスのODN(Tクラス)を伴うヒトTLR9形質転換体に比較して、マウスTLR9形質転換体において、CpGジヌクレオチドの位置における強い依存性が観察された。これらの実験において、マウスTLR9は、14(シトシン)及び15(グアノシン)位、又はさらに3’末端側の位置においてCpGを含むODNへの顕著なNFkBシグナル伝達応答を示さなかった(B)。対照的に、ヒトTLR9形質転換体は、14及び15位にCpGを含むODNに対し強く応答した(A)。さらにこれらの実験において、TクラスODNは、マウスTLR9形質転換体においてよりもヒトにおいて、より強力な刺激をもたらした。
本発明の少なくとも1つの実施形態におけるいくつかの態様を記述してきたが、多様な変更、改変及び改良が当業者に容易に浮かぶことが理解されるべきである。このような変更、改変及び改良は、本開示の一部であることが意図され、そして本発明の精神及び範囲に含まれることが意図される。従って、前述の記述及び図面は例示のためのみのものである。
特許、特許出願、科学文献及びその他の参考文献における全ての開示は、参照によりその全文を本明細書中に取り込むものとする。
添付の図面は原寸に比例して描いているものではない。図面中、各図に描かれているそれぞれが同一又はほぼ同一の構成要素は同様の数字によって表されている。明確化のために、すべての図面において、すべての構成要素に表示が付されていないことがあり得る。
図1は、オリゴヌクレオチドの5’末端から3’末端へのCpGジヌクレオチドの移動が、IFN−α産生の減少及び一定したIL−10刺激をもたらすことを示し:図1Aは、異なるオリゴヌクレオチドに応答したIFN−α産生を示し;図1Bは、異なるオリゴヌクレオチドに応答したIL−10産生を示す。
図1は、オリゴヌクレオチドの5’末端から3’末端へのCpGジヌクレオチドの移動が、IFN−α産生の減少及び一定したIL−10刺激をもたらすことを示し:図1Aは、異なるオリゴヌクレオチドに応答したIFN−α産生を示し;図1Bは、異なるオリゴヌクレオチドに応答したIL−10産生を示す。
図2は、強力にIFN−α産生を減少させるオリゴヌクレオチドが、CpGジヌクレオチド中に非修飾Cを含むとき、最適なIL−10刺激をもたらすことを示す。
図3は、より高いT含有量を有するオリゴヌクレオチドが、より高いIL−10刺激をもたらすことを示す。
図4は、5’−TCGが効率的なIFN−α産生のために必要であるのに対して、強力なIL−10分泌のためには5’−TCで十分であることを示す。
図4は、5’−TCGが効率的なIFN−α産生のために必要であるのに対して、強力なIL−10分泌のためには5’−TCで十分であることを示す。
図5は、5’−TCのチミジンが化学的に修飾されているとき、IL−10刺激が維持されることを示す。
図6は、5’−TC又は3’に移動したCpGジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、5’−TC又はCpGを欠くオリゴヌクレオチドよりも強力にIL−10産生を誘導することを示す。
図7は、5’−TC及び3’に移動したCpGジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、IL−6又はIL−10の強力な分泌を誘導するが、結果的にサイトカイン又はケモカイン(例えば、IFN−α又はIP−10)の刺激には効果がないことを示す。
図7は、5’−TC及び3’に移動したCpGジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、IL−6又はIL−10の強力な分泌を誘導するが、結果的にサイトカイン又はケモカイン(例えば、IFN−α又はIP−10)の刺激には効果がないことを示す。
図7は、5’−TC及び3’に移動したCpGジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、IL−6又はIL−10の強力な分泌を誘導するが、結果的にサイトカイン又はケモカイン(例えば、IFN−α又はIP−10)の刺激には効果がないことを示す。
図7は、5’−TC及び3’に移動したCpGジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、IL−6又はIL−10の強力な分泌を誘導するが、結果的にサイトカイン又はケモカイン(例えば、IFN−α又はIP−10)の刺激には効果がないことを示す。
図8は、5’−TC及び3’に移動したCpGジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、高度に精製したヒトB細胞からIL−6及びIL−10の産生を効率的に誘導することを示す。
図9は、ヒトTLR9及びNFκB−ルシフェラーゼレポーターを発現する細胞が、5’−TC及び3’に移動したCpGジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドによって刺激されることを示す。
図10は、異なる3’位置にCpGジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに対するTLR9−媒介性NFκB応答を示し:図10Aはヒト細胞の応答を示し;図10Bはマウス細胞の応答を示す。
Claims (53)
- a) 5’ XYN1YZN2 3’
上記配列中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはTヌクレオチド又は修飾Tヌクレオチドであり、YはCヌクレオチド又は修飾Cヌクレオチドであり、ZはGヌクレオチド又は修飾Gヌクレオチドであり、N1及びN2はCGジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドであり、N1は5’Zヌクレオチドを含まず、且つ、YZジヌクレオチド及びN2ポリヌクレオチドからなる3’ポリヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数の最大で45%である複数のヌクレオチドを含む;及び
b) 5’ XYN1YZN2 3’
上記配列中、5’はオリゴヌクレオチドの5’末端を示し、3’はオリゴヌクレオチドの3’末端を示し、XはTヌクレオチド又は修飾Tヌクレオチドであり、YはCヌクレオチド又は修飾Cヌクレオチドであり、ZはGヌクレオチド又は修飾Gヌクレオチドであり、N1は5〜10個のヌクレオチドのポリヌクレオチドであり、N1はCGジヌクレオチドを含まず、N1は5’Zヌクレオチドを含まず、且つ、N2は5〜30個のヌクレオチドのポリヌクレオチドである;
から選択されるオリゴヌクレオチド。 - 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも1個の修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも50%の修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合が修飾されている、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが10〜100個のヌクレオチドからなる、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記修飾ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 5’Cヌクレオチドと3’Gヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合を含む、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 5’Cヌクレオチドと3’Gヌクレオチドとの間にR−ホスホロチオエート結合を含む、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
- Yが、5−置換シトシン類、6−置換シトシン類、N4−置換シトシン類、縮合環系を有するシトシンアナログ類、ウラシル、ウラシル誘導体、ユニバーサル塩基、芳香族環系及び水素原子からなる群から選択される修飾シトシン塩基を含む修飾Cヌクレオチドである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- Yが、5−メチル−シトシン、5−フルオロ−シトシン、5−クロロ−シトシン、5−ブロモ−シトシン、5−ヨード−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、5−ジフルオロメチル−シトシン、非置換又は置換5−アルキニル−シトシン、N4−エチル−シトシン、5−アザ−シトシン、2−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、N,N’−プロピレンシトシン又はフェノキサジン、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−ブロモビニル−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−ヒドロキシ−ウラシル、5−プロピニル−ウラシル、3−ニトロピロール、P−塩基、フルオロベンゼン、及びジフルオロベンゼンからなる群から選択される修飾シトシン塩基を含む修飾Cヌクレオチドである、請求項9に記載のオリゴヌクレオチド。
- Zが、7−デアザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン、7−デアザ−7−(C2−C6)アルキニルグアニン、7−デアザ−8−置換グアニン、ヒポキサンチン、N2−置換グアニン、N2−メチル−グアニン、5−アミノ−3−メチル−3H,6H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7−ジオン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、インドール、イノシン、アデニン、置換アデニン類、N6−メチル−アデニン、8−オキソ−アデニン、8−置換グアニン、8−ヒドロキシグアニン、8−ブロモグアニン、6−チオグアニン、ユニバーサル塩基、4−メチル−インドール、5−ニトロ−インドール、K−塩基、芳香族環系、ベンズイミダゾール、ジクロロ−ベンズイミダゾール、1−メチル−1H−[1,2,4]トリアゾール−3−カルボン酸アミド及び水素原子からなる群から選択される修飾グアニン塩基を含む修飾Gヌクレオチドである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、1つまたは2つの接近可能な5’末端とともに3’−3’結合を含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 最適なCpGヘキサマー配列を含まないヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- パリンドローム配列を含まないヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが安定した2次構造を形成しない、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、抗原及びサイトカインからなる群から選択される部分と結合体化されている、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記抗原が感染性疾患抗原からなる群から選択される、請求項16に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記サイトカインがIL−10である、請求項16に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが以下の構造:5’ T*C*T*T*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T 3’(配列番号4)を有し、*は、ホスホロチオエート結合を意味する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが以下の構造:5’ T*T*G*C*G*T*G*C*G*T*T*T*T*G*A*C*G*T*T*T*T*T*T*T 3’(配列番号62)を有し、*は、ホスホロチオエート結合を意味する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが以下の構造:5’ T*C*T*T*T*T*T*T*T*T*C*G*T*T*T*T*T 3’(配列番号2)を有し、*は、ホスホロチオエート結合を意味する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- N1がポリ−Tポリヌクレオチドである、請求項1のa)又は請求項1のb)に記載のオリゴヌクレオチド。
- N2がポリ−Tポリヌクレオチドである、請求項1のa)又は請求項1のb)に記載のオリゴヌクレオチド。
- N1及びN2の両方がポリ−Tポリヌクレオチドである、請求項1のa)又は請求項1のb)に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ポリ−Tポリヌクレオチドが1以上の修飾Tヌクレオチドを含む、請求項22〜24のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ポリ−Tポリヌクレオチドが5〜20個の間のTヌクレオチドを含む、請求項22〜24のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ポリ−Tポリヌクレオチドが5〜10個の間のTヌクレオチドを含む、請求項22〜24のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ポリ−Tポリヌクレオチドが20個を超えるTヌクレオチドを含む、請求項22〜24のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも55%のTヌクレオチドからなる、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 化学治療薬、放射性治療薬、モノクローナル抗体、及び抗癌剤からなる群から選択される治療薬と組み合わせた請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
- 対象におけるIFN−αの発現に対してIL−10の発現を特異的に増加させる方法であって、該方法が、IFN−αの発現に対してIL−10の発現の増加を必要とする対象に、請求項1〜32のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
- 誘導されたIL−10のIFN−αに対する比率が、IL−10のIFN−αに対する参照比率よりも高い、請求項31に記載の方法。
- 前記投与工程が、吸入、経口、局所、皮下、及び経静脈投与からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
- 抗原特異的な調節T細胞の応答を対象内で誘導する方法であって、該方法が、
抗原に曝露された対象に請求項1〜31のいずれか1項に記載の免疫活性化核酸又は組成物を投与する工程を含む、方法。 - 抗原特異的な調節B細胞の応答を対象内で誘導する方法であって、該方法が、
抗原に曝露された対象に請求項1〜31のいずれか1項に記載の免疫活性化核酸又は組成物を投与する工程を含む、方法。 - 前記抗原が前記免疫活性化核酸又は組成物と共に前記対象に投与される、請求項34又は35に記載の方法。
- 前記抗原が前記免疫活性化核酸又は組成物の後に前記対象に投与される、請求項34又は35に記載の方法。
- 前記抗原が食物中に存在し、該食物を摂取することにより前記対象が該抗原に曝露される、請求項34又は35に記載の方法。
- 前記抗原が前記対象によって吸入される、請求項34又は35に記載の方法。
- アレルギー又は喘息を処置する方法であって、該方法が、
対象をアレルゲンに曝露する工程;及び、
請求項1〜31のいずれか1項に記載の免疫活性化核酸又は組成物を前記対象に投与する工程であって、前記免疫活性化核酸又は組成物を、前記対象における前記アレルゲンに対するアレルギー性応答を抑制又は緩和するために十分な量で投与する工程;を含む、方法。 - 前記対象にIL−10を投与する工程をさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 対象の自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法が、
対象を自己抗原に曝露する工程;及び、
請求項1〜31のいずれか1項に記載の免疫活性化核酸又は組成物を前記対象に投与する工程であって、前記免疫活性化核酸又は組成物を、前記対象の自己免疫疾患を抑制又は処置するために十分な量で投与する工程;を含む、方法。 - 前記対象にIL−10を投与する工程をさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 対象の移植片に対する抗原特異的応答を減少させる方法であって、該方法が、
対象を移植片抗原に曝露する工程;及び、
請求項1〜31のいずれか1項に記載の免疫活性化核酸又は組成物を該対象に投与する工程であって、前記免疫活性化核酸又は組成物を、前記対象の前記移植片に対する抗原特異的応答を抑制又は減少するために十分な量で投与する工程;を含む、方法。 - 前記対象にIL−10を投与する工程をさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 前記対象が、アレルギー性喘息に罹患している、又は、発症するリスク状態にある、請求項40に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、クローン病、1型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群などの自己免疫性ニューロパシー、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、乾癬、尋常性天疱瘡、ヴェグナー肉芽腫症などの血管炎、白斑、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、1型又は免疫媒介型糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、副腎の自己免疫疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎などの脊椎関節症、及び、シェーグレン症候群から選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が感染症によって引き起こされる、請求項42に記載の方法。
- 前記感染症がライム病である、請求項48に記載の方法。
- 前記移植片が自己組織移植片である、請求項44に記載の方法。
- 前記移植片が非自己組織移植片である、請求項44に記載の方法。
- 前記移植片が組み換え細胞移植片である、請求項44に記載の方法。
- 前記移植片が合成移植片である、請求項44に記載の方法。
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