JP2008509397A - 分離システム、分離システムの構成要素及びそれらを製造及び使用する方法 - Google Patents

分離システム、分離システムの構成要素及びそれらを製造及び使用する方法 Download PDF

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Abstract

透過性ポリマー性モノリシック材料は、カラムケーシングにおいて製造される。ある態様においては、透過性ポリマー性モノリシック材料は、混合物及びカラムのサイズに依存して、低温、例えば４０℃で出発し、及び高温、例えば６０℃で続く外部源からの熱の適用により重合される。重合出発温度は、発熱ランナウェイ(run-away)状態を引き起こさず及びカラムの横断面にわたる実質的に一定の温度を防止するであろう反応の高温をさけるのに十分低いものである。十分なモノマー枯渇が生じ及び立体障害が上昇した後に高温が使用され、重合反応は、十分にゆっくりしていて、細孔サイズの均質性において有意な低減を引き起こすのに十分高い反応発生の熱を避ける。

Description

発明の詳細な説明
関連するケース
本件出願は、分離システム、分離システムの構成要素及びそれらを製造及び使用する方法についての、Shaofeng Xie及びRobert W. Allingtonの、２００２年６月２６日に出願された米国特許出願10/180,350の部分係属である、分離システム、分離システムの構成要素及びそれらを製造及び使用する方法についての、Robert W. Allington、Shaofeng Xie、Tao Jiang及びMingcheng Xuの、２００３年６月２５日に出願された米国特許出願10/607,080の部分係属である。
発明の背景
本発明は、分離システム及びそれらの構成要素及びより具体的には、分離システム及びモノリシック透過性ポリマー性材料(monolithic permeable polymeric material)を含む構成要素に関する。
モノリシックマクロ多孔性材料、例えば、有機モノリシックマクロ多孔性ポリマー性材料及びモノリシックシリカパッキングは、分離システム、例えば、クロマトグラフィー又は抽出システムのための構成要素として知られる。そのような材料のあるクラスは、少なくともポロゲン(porogen)を含む重合混合物中における１以上のモノマーを重合することにより製造されるモノリシックマクロ多孔性ポリマープラグ又は固形支持体として形成される。いくつかの重合混合物について、他の材料、例えば、架橋剤、触媒及び小さな溶解性ポリマーを含ませることが知られており、それは、重合の後に溶解されて、多孔性、分離−有効開口部サイズ分布及び他の特徴を制御することができる。更に、プラグは、形成されて、官能基が付加された後に修飾され得る。
プラグ又は固形支持体は、通常、ハウジング、例えば、クロマトグラフィーカラム又は圧力容器中に含まれる。プラグが存在するハウジングの部分が、反応器として機能する。ある従来技術のモノリシックカラム製造方法においては、重合混合物が、カラムケーシングに添加されてもよく、及び重合が、その中において開始されて、カラム壁内にマクロ多孔性ポリマー性プラグ又は固形支持体が形成される。
ガス、液体及び超臨界流体クロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー及びろ過、固相抽出、触媒反応体、固相合成及び他のものを含む、これらのプラグ又は固形支持体の幅広い用途がある。プラグ又は固形支持体のためのカラム又は他の容器の効果、分離に必要とされる時間、及びプラグ又は固形支持体のためのカラム又は他の容器の再現性は、重要な商業的要因である。分離システム、例えば、それらの中に多孔性ポリマーを有するクロマトグラフィーカラムの効果は、マクロ多孔性ポリマー材料を含むカラム又は他の構成要素の選択性及びゾーン拡散の双方に関連する。これらの要因のいくつかは、分離工程の間のプラグ又は固形支持体における移動相の速度及び分子拡散により影響を受ける。
移動相の速度及び分子拡散が、カラム効率に影響を与える方法は、カラム効率の従来の指示、理論段に等しい高さ(Height Equivalent to Theoretical Plate)（ＨＥＴＰ）におけるこれらの要因の効果を示すことにより部分的に説明することができる。ヴァンデームター式は、以下のようにＨ（ＨＥＴＰ）の用語におけるゾーン拡散、流速及び拡散の間の関係を示す：
Ｈ＝Ａ＋Ｂ／ｕ＋Ｃｕ（高効率に相当する低Ｈを有する）
Ｕ＝移動相の流速
Ａ＝ラジアル渦巻拡散係数
Ｂ＝縦分子拡散係数
Ｃ＝物質移動係数
分子拡散は、分子の拡散に依存するが、床のパッキングには依存しない。渦巻拡散は、粒子のパッキングの均質性に依存する。
物質移動からのゾーン拡散は、非多孔性粒子及び１．５μｍ（１．５ミクロン）より小さなサイズの多孔性粒子を用いることにより最小化することができる。しかしながら、非多孔性粒子でのパッキングは、極度に低い表面積を有し、それは、精製方法に有害であり（分析方法とは対照的に）、なぜなら、精製方法が高いサンプル負荷(loading)を要求するからである。非常に小さなパックされた粒子の使用は、現在の器具を用いる分離方法のほとんどにおいて困難である高圧又は低速度のいずれかを要求し、それは、所定の分離についての時間を上昇し得る（時々、分あたりのＨで表される）。
構成要素としてマクロ多孔性ポリマー性モノリシックプラグ又は固形支持体を含む従来の分離システムは、所望のものよりも大きく、均質でなく及び微小孔を含むポリマーにおける粒子から形成されるプラグ又は固形支持体を使用する。粒子の大きなサイズ及びそれらの均一性の欠如により、分離−有効開口部サイズ分布における均一性が欠如する。従来技術の多孔性ポリマーにおける多量の微小孔及び分離有効開口部のサイズの非均一性は、ヴァンデームター式により示されるようにゾーン拡散に大きく貢献する。多数の微小孔は、サンプルを捕獲し及びそれを一時の間保持することによりゾーン拡散に貢献する。これは、従来、固定相及び移動相の間及び細孔の内及び外の非平衡物質移動として述べられるかもしれない。
多孔性ポリマーから形成される従来のプラグ又は固形支持体は、分離−有効開口部サイズの低均質性、少ない望ましい表面特徴及び壁効果により生じるそれらの外壁におけるボイド及び従って、分離システムにおいて望まれるより高いゾーン拡散及び低い効率を有する。
従来技術は、また、いくつかの従来技術の多孔性ポリマーにおける、重合の間に生じるシュリンケージ及び重合の後に生じるシュリンケージに関連する問題に対して、適切な液体混合物を提供するのに失敗している。重合の間のシュリンケージの問題が生じるが、これは、モノマーが、ランダムに、重合液体混合物中に分散すること及びポリマーが、規律正しく構築されたモノマーからなることによる。従って、重合のほとんどにおけるポリマーの容量は、混合モノマーの容量より小さい。シュリンケージは、上記製造方法の全てにおける重合の間に生じる。重合後のシュリンケージについて１つの問題が生じるが、これは、高度に親水性の水性移動相又は他の高度に極性の移動相に対する高度に親水性のポリマー支持体の不適合性により、例えば、５〜８％未満の有機溶剤含量を有する液体混合物である。
分離システム及びそれらの構成要素において重合の間に使用される多孔性ポリマー性材料のシュリンケージは、多孔性ポリマーの表面上に不規則なボイド及びポリマー内に分離−有効開口部サイズの不規則性を生じ、それらは、カラム効率及び製造方法の再現性に有害である。カラム効率が壁効果により低減される１つの理由は、壁効率により、サンプルが、壁チャンネルを通して流れ及び分離媒体をバイパス(bypass)することが可能になることである。製造方法の再現性が壁効果により低減される１つの理由は、壁効果の程度(degree)及び壁効果の位置がカラムからカラムへ予測できないことである。
上記従来技術の特許における大きなチャンネルを有するカラムは、表面積及びキャパシティが低い。カラムの低キャパシティは、高いサンプル負荷を要求する精製方法について有害である。シュリンケージの問題を解決するための試みにおける多大な努力、時間及び費用にもかかわらず、従来技術では、低減されたキャパシティに対する液体混合物を示すことに失敗している。
上記現象及び／又は他の欠乏のために、上記方法により製造されたカラムは、いくつかの不利な点を有し、例えば、（１）それらは、ビーズでパックされた商業的に入手可能なカラムよりそこそこ又は少ない解決をカラムに提供し；（２）これらの方法により得られた分離は、特には、大きな分子の分離に関して、シリカビーズ又はポリマービーズのいずれかでパックされた従来のカラムよりそこそこの又は同等の解決及び速度を有し；（３）種々の形状及びサイズを有する不規則な粒子のスタッキング(stacking)により生じる幅広い細孔分布により、カラム効率が低下し；（４）上記材料における粒子サイズ及び形状の不均一性により生じるサイズ有効開口部の不均一性は、ゾーン拡散に高度に貢献し；（５）上記材料における多量の微小孔は、また、ゾーン拡散に高度に貢献し；及び（６）カラム中に使用される材料のシュリンケージは、カラムの効率を低減する。これらの問題は、高い分離(resolution)クロマトグラフィーにおけるそれらの使用を制限する。
米国特許第5,453,185号明細書は、モノマーの部分を置き換えるために不溶性ポリマーを用いる重合混合物においてモノマーの量を低減することによりシュリンケージを低減する方法を提案している。これは、シュリンケージを低減するが、多量の官能性モノマーを要求するカラムのキャパシティ及び保持能力因子に有害である。これらの特許明細書には、分離(resolution)におけるシュリンケージの有害作用及び多孔性ポリマーの表面における得られる不規則性ボイド及びポリマー内の分離−有効開口部の不規則性について記載しておらず、それらは、カラム効率及び製造方法の再現性に対して有害である。
従来技術の欧州特許第1,188,736号明細書には、一端がシールされ及び他端が開口しているポリテトラフルオロエチレンチューブ内における、現場での、モノマー、架橋剤、プロゲン(progenic)溶剤及び開始剤の共重合による多孔性ポリ（エチレングリコールメタクリレート-co-エチレングリコールジメタクリレート）の製造方法が記載されている。得られるカラムは、ガス液体クロマトグラフィーのために使用されている。この従来技術のアプローチは、少なくとも部分的に実用のために望ましい特徴を有する材料が得られないという不利な点を有しており、これは、それが、開口末端を有するプラスチックチューブにおける重合を使用することによる。
米国特許第2,889,632号；第4,923,610号及び第4,952,349号明細書は、２つのプレート及びセパレーターを含むシールされたデバイス内に薄いマクロ多孔性膜を製造する方法を開示する。この方法においては、所望の膜支持体が多孔性ポリマーシートの薄い層からパンチアウトされ及び所望の官能基を有するように修飾される。多孔性シートの層は、“膜分離”のためのサポートデバイスに保持される。これらの特許明細書は、欧州特許第1,188,736号明細書に記載された方法を拡大して、多孔性膜を製造し及び膜分離における実用適用のための技術を改良している。得られる材料は、２ナノメーター未満のサイズの微小孔から大きな細孔までの細孔を含むマクロ多孔性膜である。ポリマーの粒子サイズは、０．５マイクロメートル未満である。膜分離の分離メカニズムは、従来の液体クロマトグラフィーのものとは異なる。
この多孔性材料は、いくつかの不利な点を有しており、例えば、（１）膜の希薄性のために、その保持因子が制限され；及び（２）これらの粒子により形成される細孔は、小さく、及び、個々の膜厚さより非常に長いベッド長さ(bed length)を有する液体クロマトグラフィーカラムについての高い流速で使用することができない。微小孔及び他のトラッピング細孔は、分離されるべき及びゾーン拡散に貢献する分子をトラップする。本件明細書において、用語“トラッピング細孔(trapping pore)”は、ゾーン拡散に貢献する細孔、例えば、分離される分子よりわずかに大きなものから、分離される細孔の直径の数倍のものまでのサイズの範囲の細孔を意味する。
米国特許第5,334,310号；第5,453,185号及び第5,728,457号明細書の各々は、シールされたカラム内において、現場で、マクロ多孔性ポリ（グリシジルメタクリレート-co-エチレングリコールジメタクリレート）ポリスチレンを製造する方法を開示する。この方法は、タンパクの分離のための液体クロマトグラフィーカラムのために、欧州特許第1,188,736号明細書及び米国特許第2,889,632号；第4,923,610号及び第4,952,349号明細書に記載の方法を拡大する。米国特許第5,334,310号；第5,453,185号及び第5,728,457号明細書は、ビーズを有する従来のパックされたカラムの間隙容量を除去することによりカラム効率を改良することの意図を明言する。これらの特許明細書により形成されるプラグは、プロゲン、モノマー及び重合温度のタイプ及び量により制御される分離−有効開口部サイズ分布を有する。マクロ多孔性ポリマーは、種々のサイズの相互連結凝集体からなり、それは、移動相の運送のための凝集体の間に大きな細孔のチャンネルを形成する。凝集体又はクラスターの間に、分離のための小さな細孔が存在する。小さな粒子は、堅くパックされた極めて小さな粒子（約１００〜３００ナノメートル）から形成される。
これらの文献に従って形成される材料は、これらの粒子の内又は間の微小孔が、物理的に、サンプル分子をトラップし及び分離を低下させるという不利な点を有する。これらの特許明細書は、ビーズを有するパックされた床におけるようにモノリシック媒体において間質腔がないことを主張するが、凝集体及び相互連結粒子の間の大きなチャンネルは、実際、ビーズを有する従来のパックされたカラムにおけるビーズ間の間質腔と同一の問題を生じる。凝集体及びクラスターの種々のサイズから形成される大きなチャンネルは、不均一であり、及び狭い粒子サイズ分布についてでさえ、ランダムな間質腔を提供する。ランダムな間質腔のために、カラム効率は乏しい。
米国特許第5,334,310号；第5,453,185号及び第5,728,457号明細書は、平方マイクロメートルから平方メートルの断面積を有するカラム内の分離媒体の製造を開示する。これらの特許明細書に開示される方法は、いくつかの不利な点を有する。いくつかの不利な点は、Chemistry of Materials, 1997, 9, 1898における１９９７年のこれらの特許における発明者により開示されている。
ある重要な不利な点は、上記の特許された方法から製造される大きな直径（２６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）のカラムが、あまりに不規則で、クロマトグラフィー分離において有効でない分離−有効開口部サイズ分布を有することである。分離−有効開口部のサイズの不規則な分布は、重合発熱の有害な影響、ポリマーの熱単離効果(heat isolating effect)、熱伝達の能力がないこと、開始剤の自己加速分解(autoaccelerated decomposition)及び２６ｍｍの直径を有するモールドにおける開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを用いることによる窒素の付随急速放出により生じる。温度上昇及び重合発熱及び熱伝達困難性により生じるカラムにわたる差により、促進された重合が、大きな直径のモールド、例えば、１５ｍｍより大きな直径を有するモールドにおいて及びカラムの中心及び不均一細孔構造を生じるカラムの外壁の間の温度勾配において生じることが見い出された。この文献においては、問題が、重合混合物のゆっくりとした添加により低減され得ることが示唆されている。これは、問題を部分的に解決する助けとなるが、問題を完全には解決しない。依然として、大きな直径のカラムについての温度勾配があり、それは、分離−有効開口部サイズ分布における均一性の欠如をもたらす。
この問題は、また、Analytical Chemistry, 2000, 72, 5693の文献における理論計算により実証された。この著者は、半径流式(radial flow)クロマトグラフィーのための大きな直径のカラムを構築するための薄いシリンダーをスタックすることによるモジュール的接近法を提案している。しかしながら、連続プラグを形成するためのディスク間のシーリングは、困難で及び時間のかかることである。
米国特許第5,334,310号；第5,453,185号及び第5,728,457号明細書は、逆相カラム及び弱アニオン交換体の材料を開示する。製造される弱アニオン交換体は、低分解(low resolution)、低キャパシティ、低剛性、ゆっくりした分離及び非常に乏しい再現性を有する。逆相媒体は、微小キャパシティ、非理想的分解、及び非常に乏しい再現性を有する。それらは、この非常に極性の移動相における非常に疎水性の媒体のシュリンケージから生じる壁チャンネリング効果のために、高水分含量、例えば、水中における８％未満のアセトニトリルを有する移動相において使用することができない。この媒体は、また、分離の間に圧縮され及びカラムのヘッドにおいて過剰なボイド容量を生じる。上記特許明細書は、いかにして、弱カチオン交換体、強カチオン交換体、強アニオン交換体、正常相媒体及び疎水性相互作用媒体を製造するかについての指図がほとんどない。膜、ビーズ又はゲルをベースとするこれらの媒体は既知である。しかしながら、既知の方法は、オフラインで行われ、及び、モノリシックカラムの現場での製造に使用することができない。米国特許第2,889,632号；第4,923,610号及び第4,952,349号明細書に従って製造されるモノリシック膜は、低キャパシティ及び分解を有する。
Petersらの“Preparation of Large-Diameter Molded' Porous Polymer Monoliths and the Control of Pore Structure Homogeneity”, Chemistry of Materials v. 9, July 1997から、温度勾配を避ける努力においてモノリシックプラグをゆっくりと重合することが知られている。ある実施態様においては、温度は、５５〜６０℃の一定の低温で保持される。別の実施態様においては、重合速度は維持され、次第にモノマーを添加することにより低減される低及び発熱及び従って、反応速度が制限される。
これらの方法は、不均一な分離−有効開口部サイズ分布、ポリマープラグの低剛性及び多くの液体クロマトグラフィー分離のために非実際的に大きな分離−有効開口部を提供するという不利な点を有する。低温度は、低架橋を生じ、及びいくつかのポリマーについては、十分には堅くないプラグを生じる。
この文献は、また、著者が、重合の間のカラムの内部温度についての情報を得る方法を記載する。その方法は、カラムにおける温度測定デバイスの埋め込みを包含する。
発明の概要
従って、本発明の目的は、分離−有効開口部を有するポリマーとの相乗関係を有する新規分離システムを提供することである。
本発明の更なる目的は、新規クロマトグラフィーカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、クロマトグラフィーカラムを製造するための新規装置を提供することである。
本発明の更なる目的は、クロマトグラフィーカラムを形成するための新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、新規透過性モノリシック媒体を提供することである。
本発明の更なる目的は、改良された分解(resolution)を有する透過性モノリシックカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、改良されたキャパシティを有する透過性モノリシックカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、改良された流量を有するカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、水性溶剤と使用された場合に膨張する傾向が低減されたカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、改良された再現性を有するカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、キャパシティ又は分解又は流量を改良する目的のために選択される分離−有効開口部の制御されたサイズを有する透過性モノリシックカラムの形成のための新規技術を提供することである。
本発明の更なる目的は、予備分離のための大きな直径のカラムを製造する新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、新規な大きな直径のカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、放射線方法を用いて透過性ポリマー支持体を含むポリマー性材料の製造方法提供することである。
本発明の更なる目的は、新規弱アニオン交換カラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、新規逆相カラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、高性能強アニオン交換カラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、高性能弱カチオン交換カラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、高性能強カチオン交換カラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、高性能正常相カラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、洗浄の間又は分離の間の媒体の膨張又は重合の間のシュリンケージにより引き起こされる分離媒体の質の低下を避ける方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、特徴が非常に似ているカラムの配列を一緒に操作するクロマトグラフィーシステムを提供することである。
本発明の更なる目的は、液体、ガス及び超臨界流体クロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、触媒反応体、ろ過又は他の所定の透過性ポリマー支持体又は少なくとも部分的にサンプルから水平に隣接又は位置する固形透過性ポリマーホールダーを含むクロマトグラフィーにおける適用のためのモノリシック透過性固形支持体を製造するための新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、新規高分解媒体(resolution medium)及びそれを得るための新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、より均一なサイズ及び形状の相互連結凝集粒子から生じる均一な分離−有効開口部サイズ分布を有する新規透過性固形支持体を提供することである。
本発明の更なる目的は、微小孔がより少ない又は全くない新規透過性固形支持体を提供することである。
本発明の更なる目的は、ポリマー性支持体の壁上にボイドのない新規透過性固形支持体を提供することである。
本発明の更なる目的は、モノリシッククロマトグラフィー媒体のキャパシティを改良するための新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、改良された分解を有する透過性モノリシックカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、キャパシティ又は分解又は流量を改良する目的のために選択される制御されたサイズ分離−有効開口部を有する透過性モノリシックカラムの形成のための新規技術を提供することである。
本発明の更なる目的は、予備分離のための大きな直径のカラムを製造する方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、高性能触媒反応器を提供することである。
本発明の更なる目的は、高性能固相抽出床を提供することである。
本発明の更なる目的は、完全に渦巻き型の外形(throghly convoluted surface configuration)で制御された時間(controlled minute)を有する共有結合した粒子を有するが、少数の微小孔を有するか微小孔を全く有さない新規透過性モノリシック媒体を提供することである。
本発明の更なる目的は、重合反応の間の熱効果による極わずかな不均一性を有するモノリシッククロマトグラフィー床を提供することである。
本発明の更なる目的は、カラムへの熱の伝導に依存するクロマトグラフィーカラムにおける重合を制御するための新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、重合の速度を制御すること、及び床に作用する制御された放射線により熱勾配を得ることである。
本発明の更なる目的は、比較的安全な放射線源、例えば、媒体エネルギーＸ線（例えば、２００ｋＥＶ未満）、ＵＶ又は可視線を提供するもので重合速度を制御することである。
本発明の更なる目的は、少数の微小孔を有するか微小孔を全く有さない、透過性の、高キャパシティのカラムを提供することである。
本発明の更なる目的は、ナノメートルからミリメートルの小さな直径を有するカラムを製造する方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、１００ｍｍまでの中間直径及び１０００ｍｍ以上までの大きな直径カラムを有するクロマトグラフィー的に均一なカラムを製造する方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、重合方法を提供することであり、その中においては、多孔性ポリマーにおける分離−有効開口部の均一性における温度勾配の作用が最小化される。
本発明の更なる目的は、重合方法を提供することであり、その中においては、発熱反応のランアウェイ(run-away)温度が避けられる。
本発明の更なる目的は、重合方法を提供することであり、その中においては、ポリマー混合物内の最高温度が、自立ランアウェイ温度より低いが、その温度は、少なくとも、時々、ポリマー混合物の反応範囲内にある。
本発明の更なる目的は、エネルギー伝導を用いて、大きなモノリシックカラムを形成する新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、新規重合方法を提供することであり、その中においては、温度が、重合の間のモノリシックプラグの断面にわたる温度における有意差を避けるが、熱から十分なエネルギーを提供して、重合の後者の状態の間の適切な架橋及び発熱性ランアウェイ温度が達成されることなしに十分な時間において重合の高度な完結を可能にするレベルで維持される。
本発明の更なる目的は、モノリシックカラムを製造するために段階温度上昇及び勾配（急変というよりむしろ、連続的な、段階的変化）温度上昇を用いてクロマトグラフィーカラムを製造する新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、重合工程間の発熱及び放熱の速度を制御する新規方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、ポリマーの剛性を改良する方法を提供することである。
上記及び本発明の更なる目的に従って、重合混合物は、ポロゲン又は溶剤を有する場所において重合されて、分離有効開口部を有するポリマープラグが形成される。本件明細書においては、“分離−有効開口部”は、分離工程、例えば、クロマトグラフィーにおいて役割を果たす細孔又はチャンネル又は他の開口部を意味する。用語“細孔”は、一般に、実質的に円形である粒子における開口部を意味し、及び、いくつかのケースにおいては、粒子の凝集体へ又はそれを通す開口部又は粒子への開口部又は粒子を通過する（細孔を通す）細孔を通し得る。断面において実質的に円形であることにより、細孔が、完全な円ではなく、例えば、隣接球面間のオープンスペースである細孔を有する不完全な球形のセクターにより境界され得ることが意味される。いくつかの他の用語は、それらが本件明細書において使用されるように以下に定義される。分離因子は、リテンション及びキャパシティ又は分離工程において役割を果たす他の因子に作用する因子を含む。本件明細書における用語“マクロ多孔性”は、分離系におけるモノリシック材料に言及されるその通常の意味を提供する。その通常の意味は、粒子の小球間の細孔又は他のボイドを言及し、その細孔又は他のボイドは、他のものより実質的に長い断面寸法を有さない及び実質的に円形の断面を有する細孔に開口部が制限されるであろうその逐語的含蓄よりむしろ、開口部の長さにかかわらず５０ｎｍを越える直径を有する。
本件明細書における用語“透過性”は、分離技術におけるモノリシック材料について最も通常使用されるが、用語“マクロ多孔性”の逐語的意味との混同を避けるために細孔を有するものと非多孔性透過性材料とを区別するために用語“透過性の”についての形容詞の使用を可能にするために及び１つのみ又は他のものを有するものとチャンネル及び他の開口部及び細孔を有する材料とを区別するために用語“マクロ多孔性”よりむしろ使用される。本件明細書においては、用語“透過性非多孔性”は、開口部、例えば、チャンネルなどを有するが、上で定義したような細孔を含有しない媒体を意味する。ランアウェイ温度は、反応が熱の付加なしに続く温度であり、なぜなら、反応により生じる熱は、反応が自立するように付加熱から独立して反応温度より上の温度を維持するからである。用語“温度−時間適切化(moderated)”は、依然として、所望の特徴、例えば、適切な剛性、適切な分離−有効開口部サイズ、均一な分離有効開口部サイズ分布などを有するポリマーについて、高い程度の完全性へ重合を達成するのに十分に長い時間のために十分高い温度で、しかし、ランアウェイ温度より低い温度で重合されたモノリシック材料を意味する。これは、温度−時間適切化が、外部から付加される熱を制御することにより重合速度を制御することにより達成されるように重合速度と関連することが多い。
特定の概念の温度−時間適切化重合におけるある強制(constraint)は、重合の時間及び温度が、特定の適用のために必要とされる剛性の欠如又は剛性のために所望量の架橋を形成するのに適切なものであることである。この制限は、好ましい実施態様において満足され、それは、多くの重合作用因子をバランス化することにより、例えば、速度エネルギーは、結合での障害、例えば、実質的な重合が行われた後の他の分子による立体障害又はブロック及びポリマー及びモノマーのタイプの観点からの適切な架橋に必要とされる温度、入手可能なモノマーの量、活性化開始剤又は活性化剤の量及び重合混合物へ導入される。
重合作用因子をバランス化するある方法は、エネルギーが混合物へ導入される速度及び／又はエネルギーが、外部源から混合物へ導入される方法を制御することであり、例えば、水浴からの熱エネルギーは、混合物の表面での伝導により導入され又はＸ線は放射線により混合物へ導入される。好ましい実施態様においては、熱は、水浴での混合物の表面で導入される。発熱は、順に、水浴の温度を制御することにより制御される反応速度を制御することにより制御される。この実施態様における水浴の温度は、発熱放射速度を、混合物からの放熱の速度及び水浴からの混合物をエンター(enter)する熱を考慮して、自立反応温度未満であるが、正当な時間において適切な架橋で実質的に完全な反応を得るのに十分な高さに温度を維持するレベルに制御する。
ある実施態様においては、反応により放射される熱は、水浴の温度により制御される。それは、水浴の温度により制御することができるが、なぜなら、反応により放射される発熱は、一般に、反応速度に比例し及び速度の上昇に伴って上昇するからである。反応速度の上昇は、熱を水浴に加えて、水浴の温度を、徐々に（勾配温度制御）又は段階的にのいずれかで重合が進行するように上昇させることにより行うことができる。例えば、勾配温度制御においては、温度は、反応速度が、ランアウェイ重合を排除するために可能な限り低く及びカラムの特徴において他のものが均一性の欠如を引き起こす熱勾配を避けるのに十分低いように、重合、例えば、モノマーの消耗を遅らせる作用の観点から、重合の上昇速度を一定に保つ速度で上昇される。更に、これらの制御について、所望の特徴を、非常に大きなカラムについてさえ提供するために反応を制御することが可能である。
この技術について、好ましい実施態様において、温度により決定される混合物のエンタルピーは、開始剤を活性化させ及び自立反応速度を達成することなく計画的手段により温度−時間適切化ポリマーを提供することができる速度に重合を提供する所定レベルまで上昇される。この所定レベルのエンタルピーは、本件明細書において、制御−開始点と称する。制御開始点に達した後、反応速度は、温度が、１以上の段階で、所望なら、通常９５％以上である重合の終了までの高いエンタルピーまで上昇され得る重合のレベルまで実質的に一定に維持される。重合レベルが、温度が温度−時間適切化を達成するのに望ましいレベルまで上昇され得るような十分なものであるポイントは、安全点と称され、ここでは、温度における２以上の段階的上昇又は大きな上昇がある。
本発明のある実施態様においては、重合の間のシュリンケージが補正され及び本発明の別の実施態様においては、さもなければ後にシュリンケージを生じる重合の後の膨張が避けられる。シュリンケージは、ポリマー表面上に膨張ボイドを生じ、及び、細孔の均一性の欠如又はポリマー内部のほかの分離−有効開口部サイズ分布を生じ得る。ボイドは、重合の間に生じるとき、重合の前のモノマーの量と比較して減少された量の規則的に構築されたポリマーにより生じると考えられる。ボイドは、大抵、表面自由エネルギーの違いのためにカラム壁及びポリマー間に位置する。ボイドは、好ましくは、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）により生じる窒素ガスにより占められ、それは、重合のための通常の開始剤である。
第１態様においては、シュリンケージの補正は、重合の間に十分な圧力を付して、分離−有効開口部の分布における均一性を生じさせ及び壁作用ボイドを避けることにより達成される。この圧力は、また、ある程度プラグにおける開口部の性質及び型及び粒子サイズを制御することが知られている。シュリンケージを適合するために重合の間に大気圧でカラムを維持することは、容易に、ボイドの形成を予防する。一般に、１．７２ＭＰａ（２５０psi）の圧力が、便宜上使用されるが、より高い及びより低い圧力が首尾よく使用されている。ボイドは、プラグが、圧力下に置かれたときにシュリンキングをストップするときに除去される。第２の実施態様においては、他の方法で重合の後に生じるシュリンケージが避けられる。例えば、いくつかのプラグは、いくつかの液体混合物、例えば、有機溶剤に曝されたときに膨張する傾向にあり、及び、次いで、後に、例えば、ボイドを生じる水性移動相における分離ラン(separating run)の間にシュリンク(shrink)する。これらの実施態様においては、シュリンケージは、液体混合物に曝されたときにシュリンケージからカラムを保持することにより防止される。圧力の適用は、水性液体混合物への暴露の間のシュリンケージを防止する１つの方法である。シュリンキング及び／又は膨張を補正する、シュリンキングを低減する又はシュリンキングを避ける他の方法は、また、以下のより詳細に記載されるように使用される。外部的に施される圧力は、反応重合混合物の内部及び重合混合物及び内壁の間の均一でない力を克服して、均一な分離有効性因子、分離−有効開口部サイズ及び分布及びポリマーのカラムの内壁への均一な連続接触を維持すると考えられる。
驚くべきことに、ポリマープラグのいくつかのタイプは、それらが、重合間の圧力に付されて、シュリンキングを補正する場合には細孔を有さず又は親水性液体混合物へ、例えば、代わりに移動相中に暴露されるときにシュリンケージを補正するための逆相カラムのケースにおいては、それらが、それらの間（分離−有効開口部）の比較的大きなフローチャンネルと一緒に共有結合された、直径約２マイクロメートルの固形粒子を含む。驚くべきことは、これらの粒子が細孔を含まないにもかかわらず、プラグのクロマトグラフィーキャパシティが高いことである。これは生じることが考えられ、なぜなら、約５０〜２００ｎｍの深さの予期せぬ形成及び幅広いグルーブ又は波形及び他のオッド(odd)表面特徴のためである。典型的な粒子は、非常に小さな小惑星のテレスコープビューに似ている。
重合の間に付される圧力は、所望の結果に従って選択され及び例えば、直線的に上昇する圧力、一定の圧力又は段階的圧力勾配であるかもしれない。ある実施態様においては、分離−有効開口部サイズは、重合の間に細孔を生じるポロゲン及び重合の後にプラグを消耗(wash out of)させるにちがいないポロゲンのタイプ及び割合を選択することにより制御される。この割合は、所望の特徴を得るためのトライアルランにより選択される。全量のポロゲンが、また、選択される。
他の実施態様においては、いくつかの液体混合物、例えば、有機洗浄液体混合物に暴露された場合に膨張する傾向にある材料のプラグを製造することが意図され、及び次いで、後に、例えば、水性移動相における分離ラン(separating run)、カラム壁及びポリマー支持体の間のボイドを形成すること及び分離−有効開口部サイズ分布における変化の間にシュリンクする。例えば、分離−有効開口部を有するいくつかの逆相プラグは、重合された他のものがシュリンクし得ない場合にシュリンクするかもしれず、及び重合後、重合の間にシュリンクしなかったプラグのいくつか及びシュリンクしたいくつかは、水又はいくつかの他の極性液体混合物に暴露された場合にシュリンクし得る。そのような材料のプラグを改良することを意図する実施態様においては、このシュリンケージのための補正は、重合の間のピストンの圧縮及び／又は並べかえ又は再配置を強要する又はシュリンキングのための補正をする分離ランの間に生じるシュリンケージに等しいか又はそれより大きいシュリンキングを通常生じるであろう状態の間の重合後の圧縮であり得る。シュリンケージが圧力について補正される又はシュリンケージがボイドを生じるのを避けるのを予防するいずれかのケースにおいては、例えばピストンについての非流体圧が、流体での圧力よりむしろ好ましい。本件明細書における用語“圧力”は、用語“圧縮”が、そのようなゲルモノリスの細孔を開口するためのゲルモノリスへ塩液体混合物を適用することを示すために使用される場合、用語“圧縮”から区別され及び排除される。
この問題を解決する別の方法は、親水性を逆相媒体へ導入して、膨張を引き起こし及び分離ランの間の高度に親水性の環境においてポリマーのシュリンケージを防止することである。より具体的には、重合混合物は、好ましい実施態様においてカラムに又はいくつかの他の適切な金型へ適用され及び重合は、カラム又は金型内において開始される。カラム又は金型は、十分にシールされて：（１）重合がオーブンにおける場合に蒸発による計画されていない損失を避け；又は（２）重合が水浴における場合に汚染又は希釈を避ける。重合の間、圧力は、重合液体混合物に適用される。好ましくは、圧力は、大気圧より上のレベルで維持されて、重合が分離媒体の固形プラグを生じ又は重合が終了するまでシュリンケージによるボイドの形成の防止が行われる。重合液体混合物が重合の間に接触するカラム又は金型の内面は、非反応性であってもよく又は処理されて、プラグの表面への接着が上昇され得る。
いくつかの実施態様において重合混合物は：（１）選択されたモノマー；（２）いくつかのタイプのカラムについて、添加剤；（３）開始剤又は触媒；及び（４）分離−有効開口部を形成するためのポロゲンを含む。いくつかの実施態様においては、官能基が、重合の前又は後に添加されてもよい。ポロゲン、開始剤、添加される官能基、添加剤、及び反応条件及びモノマー及び／又はポリマーは、特定のタイプのカラム、例えば、逆相、弱カチオン、強カチオン、弱アニオン、強アニオンカラム、アフィニティー担体、正常相、固相抽出及び触媒床について選択される。重合混合物の成分の選択は、所望の質のカラムを提供するようになされる。
本発明に従ったクロマトグラフィーカラムは、好ましくは、透過性モノリシックポリマー性プラグを受け取るための内壁を有するケーシングを含み、その中においては、分離−有効開口部又は表面特徴は、重合混合物におけるポロゲンによるポリマーにおいて形成された制御されたサイズを有し、及び、重合の間の圧力によりサイズが制御される。このプラグは、クロマトグラフィーカラムにおけるサンプルのための支持体として機能する。透過性モノリシックポリマー性プラグは、プラグ内に実質的に切れ目(discontinuity)又は開口部を有さない及びプラグ壁において可視的切れ目を有さない滑らかな壁を有する。本件明細書において切れ目は、上昇した部分又は開口部又は陥没(depression)又は通常の滑らかさからの他の変化又は肉眼で可視的なサイズの十分なパターンを意味する。本件明細書においては、用語“サイズ−補正ポリマー”又は“サイズ−補正ポリマー性”は、分離−有効開口部を有するモノリシックポリマー性透過性材料を意味し、その中においては、分離−有効開口部における均一性の欠如及び切れ目は、本件明細書に言及される方法、例えば、圧力及び／又は温度−時間適切化を重合の間又は重合の後に極性液体混合物への暴露の間にいくつかのタイプのカラムのケースにおいて適用すること、又は、水性液体混合物を用いる分離操作における使用の間又は水性液体混合物での洗浄の間のいずれかで水性液体混合物の存在下で圧力を適用することによる水性液体混合物の存在下における更なるシュリンケージの防止がされているカラムを用いることにより防止される。あるタイプの切れ目又は均一性の欠如は、壁作用であり、及び、他のタイプは、ポリマー性プラグにおける異なる断面位置での分離−有効開口部におけるサイズの差である。
ある実施態様のカラムは、重合の間の重合混合物を含むように適用された温度制御反応チャンバー及び該温度制御反応チャンバーにおける該重合混合物へ圧力を適用する手段を用いて製造される。重合混合物は、少なくともポリマー形成材料及びポロゲンを含む。ある実施態様においては、圧力は、外部液体又は機械的圧力下における重合混合物と接触するスムースな表面を有する移動性因子により適用されるが、圧力は、ガス、例えば、窒素ガス又は液体を有する重合混合物に対して圧力下で直接適用することができる。
逆相媒体の実施態様は、従来技術から異なる疎水性、及び親水性で形成される。逆相媒体は、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びそれらの組み合わせを含む。これらの媒体は、水性移動相において異なる選択性及び湿潤性を有するように、フェニル、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１８及びヒドロキシル基及び疎水性及び親水性基の他の組み合わせを含む所望の官能基を含むモノマーの直接重合により製造される。重合条件及びポロゲンは、大きな分子、特には、タンパク、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び合成ホモポリマーの高分解分離(resolution separation)を与えるように研究され及び選択される。ある実施態様においては、逆相媒体は、ポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）をベースとする。本件明細書の別の実施態様においては、逆相媒体は、ポリ（ステアリルメタクリレート−ｃｏ−ジビニルベンゼン）をベースとする。別の実施態様においては、逆相媒体は、ポリ（ブチルメタクリレート−ｃｏ−エチレングリコールジメタクリレート）をベースとする。
例外的特徴を有する逆相プラグは、主に、異なる炭素鎖長を含むメタクリレート（ＭＡ）又はスチレン（ＳＴ）を含むモノマー及びエチレングリコールジメタクリレート及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ）を含む架橋剤のコポリマーから形成される。一般に、最良の結果は、架橋剤が、４０質量％を超えるときである。好ましくは、ジビニルベンゼン及びスチレンの比は、質量で７：１〜９：１及び好ましくは４：１質量％の範囲でのジビニルベンゼンの値であるが、代わりに、６４ＤＶＢ又は４０％スチレン及び７２質量％ＤＶＢ及び１ｇジビニルベンゼン、１ｇスチレンであってもよい。カラムは、また、１７：３〜１９：１の比の範囲、及び好ましくは９部のジビニルベンゼンを１部のスチレンに対するものであってもよい。親水性官能基を有するモノマーを添加して、分離の間の壁作用を防止するための水性移動相においてポリマー性媒体のシュリンケージを低減することができる。全モノマーにおけるＤＶＢの含量は、好ましくは、４０〜１００％である。ある好ましい実施態様においては、ＤＶＢの含量は、カラムの積載能力(loading capacity)を改善するために８０％である（それは、最も商業的に入手可能なものである）。プラグは、また、疎水性表面基を有するメタクリレート又は尿素ホルムアルデヒド又はシリカを含むビニル化合物である代わりに含んでいてもよい。
イオン交換プラグは、主に、メタクリレートポリマーから形成される。弱アニオン交換プラグは、主に、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）の及びエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）のポリマーから形成される。強アニオン交換プラグは、主に、グリシジルメタクリレート、２−（アクリロイルオキシエチル）トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＡＴＭＳ）、エチレングリコールジメタクリレートのポリマーである。重合混合物は、また、１，４−ブタンジオール、プロパノール及びＡＩＢＮを含んでいてもよい。弱カチオン交換プラグは、主に、グリシジルメタクリレート、アクリル酸（ＡＡ）及びエチレングリコールジメタクリレートから形成される。強カチオン交換プラグは、主に、グリシジルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）及びエチレングリコールジメタクリレートから形成される。全てのこれらのイオン交換体においては、官能基が、プラグが形成される前又は後に添加されてもよい。全モノマーにおけるＥＤＭＡの含量は、好ましくは、４０〜８０％である。
架橋剤、例えば、ＥＤＭＡの含量の上昇は、水性相における媒体の膨張を減少することによりカラムの剛性を上昇させる。重合混合物の各々は、加圧重合下で改質されて、高及び低流速の両方で高い流速及び高い分解が得られる。所望の相互作用的官能基を含むためのほかの官能モノマーの制御された改質(modification)及び相互作用のための所望の官能基を含むモノマーの共重合化のカップリングは、分離媒体の剛性を改良しつつカラムのキャパシティを上昇させる。この制御された改質は、また、親水性官能基を有する潜在的疎水性表面領域をカバーすることにより一般にカラムの親水性を改良する。改質条件は、媒体の高キャパシティ及び高親水性を提供するだけでなく、水性液体混合物におけるポリマーマトリックスの膨張を防止するように選択され、それは、ビーズ及びモノリスの双方を含むほかの高度に親水性のポリマーマトリックスにおいて生じる。
ポリマープラグは、円形シリンダー、コイル、ベント又はストレートキャピラリーチューブ、又はマイクロチップであってもよく又は任意の寸法又は形状を有する従来の液体クロマトグラフィーカラムを含む任意のサイズ又は形状のカラムにおいて形成され得る。その成分へ分離されるべきサンプル又は混合物はカラムへ入れられ及び液相は、カラムを移動して、サンプルをその成分へ分離する。成分は、フラクションコレクターにおいて検出及び／又は収集され及び／又は他のデバイス、例えば、ガスクロマトグラフ又は質量分析計へ挿入される。ある実施態様においては、複数のカラムが、パラレルに、ポンプ装置、溶剤系及び検出系を含むクロマトグラフシステムにおいて接続される。カラムは、それらを関連する分離のために一緒に作動させることを可能にするために高い再現性を有する透過性ポリマー性カラムである。ある実施態様においては、２５ｍｍより非常に大きな直径を有するクロマトグラフディスク又はプラグが製造される。
ある実施態様においては、反応は、独立手段、例えば、電磁放射、例えば、ＵＶ−ｖｉｓ、Ｘ線、又はγ線により、重合混合物における反応体、水浴の温度及び時間においてのみの信頼の代わりに又はそれに加えて制御される。独立手段を用いない実施態様におけるようにこの実施態様においては、熱を、また、伝導、例えば、水浴への又は水浴からの熱の伝導によりカラムに加えることができる。熱は、所望なら、反応の間にそれを変えるための又は所望の温度範囲における反応マス(reaction mass)の温度を維持するためのフィードバックの制御下における反応器において及び熱マス(thermal mass)の冷却材の有意に大きな部分と接触する冷却手段により除去又は熱源から加えることができる。
この実施態様のあるバージョンにおいては、可変強度又は可変波長Ｘ線を使用して、発熱が制御下にあるように反応体の重合速度を制御することができる。このバージョンのある変化においては、Ｘ線照射がカラムを貫通して、カラムを通して又は重合速度を上昇又は減少するように選択された位置においてエネルギーが付与される。これは、その二重結合を解離するのに十分にモノマーを照射して、モノマーを遊離基にし及び従って、それらの反応性を上昇させることによりなされる。別の方法は、反応マスのために使用されるべき温度範囲において照射により活性化される照射に感受性の開始剤を使用することである。開始剤は、モノマーのみのものより非常に低い活性化時間及び温度を有するように選択される。開始剤が、十分な強度の照射においてのみ遊離基を形成するので、照射は、他の因子から独立して重合反応を制御するように使用される。
重合を制御するための光開始剤の使用は、添加される成分、例えば、シンチレーター及び感光剤により強化され得る。例えば、Ｘ線は、溶剤内においてシンチレーターを活性化して、Ｘ線に応じて光を放出する。好ましくは、シンチレーション光は、蛍光感光剤を加えて、重合を引き起こす際に光開始剤の活性を上昇させることにより助長される。シンチレーター及び感光剤は、光開始剤の吸収バンド内において十分な波長での光の照射及びシンチレーターによりＸ線からエネルギーの十分な吸収を引き起こすように選択される。
放射線、例えば、Ｘ線を用いる重合は、ミクロメートルからメートルの断面を有するモノリシック材料を製造するために使用される。Ｘ線は、深さにおいて材料を貫通することができる。有機及び無機ポリマーの双方が、Ｘ線又はγ線を用いて製造され得る。高エネルギーのＸ線及びγ線は、深い深さにおいて材料をトラベルし得る。中程度のＸ線への低エネルギーは、使用により安全であるが、より長い重合時間を生じる浅い深さにおいて材料を貫通する。ある実施態様においては、より低いエネルギーのＸ線を使用して、Ｘ線シンチレーター及び光開始剤の組み合わせを用いる重合を開始する。１２時間未満から１週間を越える重合時間の非熱的（光開始）制御が、満足のいくクロマトグラフカラムを提供することを発見した。カラムの熱的重合は、通常、直径２０ｍｍを越えるカラムについて極度の温度勾配及びランアウェイ発熱反応になやむ。これは、不均一性をもたらし、それは、クロマトグラフ特性を落とす。Ｘ線又はγ線、又はＵＶでさえ入手可能なゆっくりとした、制御された重合速度は、重合の正当な速度を依然維持しつつ発熱の許容できる速度でのゆっくりとした重合を生じる。発熱により生じる熱勾配は、直径１メートルを越えるカラムの特性を落とさないのに十分小さく製造され得る。
発熱の過剰な速度及び得られる方法（重合）温度及び温度勾配は、安定化添加剤の選択により防止することができる。この安定化剤は、反応が、自由に、所望のポリマーが形成される速度までだが、あまりに高い温度を生じるより高い速度ではなく進行し得るような特性を有するべきである。例えば、ペルオキシド開始剤について、ジステリルヒオジプロピオネート（ＤＳＴＤＰ）は、ヒドロキシル基を急冷(quench)し、それは、副反応から生じ、それは、後に、主反応に比較してイベントあたりに更なる熱を生じるであろう。他のアプローチは、主反応のための安定化剤を使用することである。この安定化剤は、主な溶剤における制限された溶解性又は反応温度での活性及び反応温度より上の更なる溶解性のために選択される。類似の条件下で、好ましくは、ポロゲンにおいて溶解性であり及び溶解性又は活性の温度従属を有する安定化剤を使用することができる。
より高い容量の媒体を有するようにカラムのサイズをスケールアップすることが望ましく、準備クロマトグラフィー及び触媒反応器において高度に望ましい。本発明のある実施態様においては、大きな直径のカラムが、カラム内の２段階重合により製造される。最初に、標的カラムのものより小さな直径を有する複数の薄肉円筒カラムが、金型において圧力下で又は圧力なしで製造される。薄肉カラムは、薄肉カラムの形成に使用されるのと同一の重合液体混合物で充填された大きなカラムの内側に置かれる。薄肉カラムの一方の側の厚さは、８ｍｍを越えないべきであり、それは、発熱重合の間の放熱における困難性のため温度勾配の形成を防止するための既知の最大値である。温度勾配は、不均一分離−有効開口部サイズ分布を変動し、それは、クロマトグラフィーの使用に有害である。
分離系における使用のためのサイズ補正ポリマーを製造する際に、所定タイプの分離のための特徴が、所定のポリマーについて、適用に対して、重合の間に加えられる圧力の程度を変化させることにより及び／又は、例えば、逆相分離媒体を形成する際に使用されるいくつかのポリマーのケースにおいて、使用の際又は別の方法で極性溶剤、例えば水性溶剤又は洗浄流体へ接触させる際に圧力を付することにより調整され得る。ポリマー自体の性質をクラスの適用のために選択した後に、カラムを製造し及び試験する。試験をベースとして、特徴をいくつかのカラムにおいて圧力を加えることにより変えることができる。いくつかのカラムにおける圧力の適用は、粒子サイズの均一性を上昇させ及びほかの理由のために粒子サイズにおける変更から、ポリマーを通した分離有効開口部のサイズ分布及び均一性が上昇される。分離−有効開口部サイズ及び粒子サイズの均一性の上昇は、分解(resolution)を改良する。圧力における上昇は、一般に、キャパシティ及び分解及び圧力−時間勾配を改良する。いくつかのカラムにおいては、微小孔が、高度に低減され又は排除され、従って、重合の間及び／又は極性液体混合物でのポリマーの使用又は洗浄の間の圧力の付加によりゾーンスプレッディング(zone spreading)が低減されると考えられている。
一般に、小さい又は大きなサイズのカラムの特徴は、重合の間重合混合物のエンタルピーを制御することにより制御することができる。これは、好ましい実施態様において、エネルギーの導入及び／又は除去により達成される。いくつかの実施態様においては、エンタルピーは、温度制御により又は照射によるエネルギーの導入の必要性なしに重合の間の温度及び圧力により制御されるが、いくらかの環境下においては、エネルギーは、また、照射により加えることができる。この制御は、分離−有効開口部の均一性の欠如を低減し及び他の望ましい特徴をもたらし得る。この目的のために、エンタルピーは、重合の範囲内であるが、ランアウェイエンタルピー未満及び材料が時間−温度適切化されるのを防止する過剰な発熱が反応の熱により生じないエンタルピーで維持される。これを水浴で行うのが特に経済的である。いくつかの重合混合物について、例えば、このエンタルピーは、この範囲内に、熱の導入又は除去により又は放射線、例えば、ＵＶ線、ＩＲ線、Ｘ線、可視光線など又は重合混合物及び放射線へ行われる熱の組み合わせの制御された使用により維持される。エンタルピーは、また、圧力の適用により上昇される。発熱反応のケースにおいては、エンタルピーは、ランアウェイ温度未満で、その発生と釣り合った速度で熱を逃がすことを可能にすることにより維持される。
いくつかの重合混合物について、反応は、単に熱の導入を用いること、例えば、加熱された水浴により所望の反応温度に温度を上昇させることにより開始される。重合性混合物へ移動される熱の量は、熱の発生の速度を制御することの重合性混合物から熱が移動される媒体の温度を変えることにより熱が移動されつつ周期的に反応を変えることにより制御することができる。好ましい実施態様においては、プラグの外表面と接触する表面の温度は、カラムにおいて過剰な温度勾配を生じる速度で導入される熱を避けるのに十分低いが、ポリマーの適切な架橋のために十分な高さで維持される。これは、表面の外側の温度を、段階的に又は徐々に、例えば、上昇のゆっくりとした速度での線状的に上昇させることにより達成される。加えられる温度は、制御開始点及び第一安全点の間で制御されて、低い反応変化速度を生じる。これは、重合が、正当な時間で重合を完全なものとするような温度に上昇させ及び温度−時間適切化ポリマーを生成するのに十分なものであるまで発熱を維持する。
上の記載から、本発明の新規モノリシック固形支持体はいくつかの利点を有し、例えば：（１）それは、従来技術より優れた手段でクロマトグラムを提供し；（２）それは、単純に及び安価に製造することができ；（３）それは、従来の分離よりいくつかの分離についてより高い流量を提供し、従って、いくらかの分離時間を低減し；（４）それは、いくらかの従来技術の方法より低い圧力でいくつかの分離方法について高い分解分離(resolution separation)を提供し；（５）それは、カラムのコストを低減することにより使い捨てカラムで高い分解を提供し；（６）それは、多くの異なる形状のカラムが用意に製造されることを可能にし、例えば、環状クロマトグラフィーのための及び任意の寸法、特に小さな寸法において製造された、例えば、マイクロチップ及び毛細血管のための及びモノリシック透過性ポリマー性チップを使用する質量分析インジェクターのための環状カラムのためであり；（７）それは、小さな及び大きな分子の双方を急速に分離し；（８）それは、他のもののうち、抽出、クロマトグラフィー、電気泳動、超臨界分析システム及び触媒のための固形支持体、ＴＬＣ及び統合されたＣＥＣ分離又は化学反応を含む多くの方法のための優秀な分離媒体を提供することができ；（９）それは、より良い特徴をある既知の透過性モノリシック分離媒体に提供することができ；（１０）それは、均一分離−有効開口部サイズ分布についての大きな直径のカラムの製造のための新規アプローチを提供し；（１１）それは、高度に水性の移動相における壁作用なしに及びカラム効率が改良された分離媒体を提供し；（１２）それは、分離有効性因子を改良し；及び（１３）それは、逆相カラムにおける膨張及びシュリンキングの問題を低減する。
図面の簡単な記載
本発明の上に記載の及び他の特徴は、添付図を参照して考慮されたときに、以下の詳細な記載からよりよく理解されるであろうが、その中においては；
図１は、本発明の実施態様に従ったクロマトグラフカラムを製造するための方法のある実施態様の説明図であり；
図２は、重合の間のガラスカラムへ圧力を加えるためのフィクスチャーのアセンブリーであり；
図３は、重合の間のステンレス鋼カラムへ圧力を加えるための別のフィクスチャーのアセンブリーであり；
図４は、重合の間のガラスカラムへ圧力を加えるための更に別のフィクスチャーのアセンブリーであり；
図５は、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）油圧下でのシリンダーカラム内で重合された強カチオン交換体の走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）図である。
図６は、カラムについてのタンパクサンプルからのピークを示すクロマトグラムであり、その中においては、ねじれ(distortion)が重合の間の圧力により避けられており；
図７は、３つの絡むを示す写真であり、左側の１つは、重合の間の圧力を用いて製造され、及び、右側の２つは、圧力なしに重合され；
図８は、カラムの配列を有し及び配列において互いに類似する再現可能な特性を有するクロマトグラフ系の構成図である。
図９は、媒体エネルギー（１１０ｋＥＶ）Ｘ線照射重合で達成されるクロマトグラフィー分離を示すクロマトグラフである。
図１０は、クロマトグラフカラムのためのＵＶ又は可視光重合装置の上面図であり；
図１１は、図１０の装置の側断面図である。
図１２は、クロマトグラフカラムのためのＸ線重合装置の略正面図であり；
図１３は、図１２の装置の部分の上面図であり；
図１４は、ライン１４から１４で行われた図１２の装置の部分の断面立面図であり；
図１５は、図１３のライン１５から１５で行われた断面立面図であり；
図１６は、モノリシックカラムを形成するための混合物を重合するための装置の計画図であり；
図１７は、図１６の実施態様において有用な温度勾配をモニターするためのその中における温度測定デバイスを有するカラムの切り欠き(broken-away)、単純化部分断面図であり；
図１８は、正当な量の時間において得ることが可能な重合の程度について低温可変温度重合と低温一定温度重合を比較するグラフであり；
図１９は、方法においてカラムのセンターから外表面までの温度を示すグラフであり、その中においては、外表面の温度は、カラムのセンターと同一の温度で維持され；
図２０は、ＥＤＭＡ及びＧＭＡでのＡＭＰＳの共重合のための方法及び方法の改良を説明する式１、式２及び式３を有する図であり；及び
図２１は、温度−時間適切化カラムにおける分離のクロマトグラムである。
詳細な記載
広範に、重合性混合物は、ポロゲン又は溶剤を有する容器に置かれて及び重合されて、分離系、例えばクロマトグラフカラムにおいて使用するための分離−有効開口部を有するプラグが形成される。有利には、重合は、容器内においてなされ、その中においては、プラグが、クロマトグラフカラム又は抽出チャンバーなどに使用されるべきである。本発明のある実施態様においては、混合物は、サイズ補正ポリマー性プラグを形成するために重合の間シュリンケージの効果について補正しつつ重合される。他の実施態様においては、シュリンケージは、サイズ補正ポリマー性プラグの別の実施態様を形成するために水の存在下で膨張する傾向にある材料に圧力を加えることで避けられる。更に別の実施態様においては、分離−有効開口部サイズ及び分布は、圧力により及び／又は重合混合物の成分の選択により及び／又は外的影響、例えば、電磁放射を用いる方法により及び／又は温度−時間適切化により制御される。シュリンキングは補正され又は避けられ、なぜなら、それは、容器の壁に隣接する増大ポイドを生じ及び細孔又はカラム内の他の分離−有効開口部サイズ分布に悪影響を有するからである。
好ましい実施態様においては、補正は、重合の間に圧力を加えて、少なくとも、それが重合の間にシュリンクする際に分離−有効開口部を有する材料の完全性(integrity)を保持することにより達成される。シュリンケージを適合するために大気圧でカラムを維持することは、各ケースにおいてボイドの形成を予防することができず及び乏しい再現性を提供し得る。ポリマー、モノマー、開始剤及びポロゲンは、カラムの特徴を改良するように選択され、及び、重合の間又は他の方法で圧力下で重合の実施態様について使用され得る。別の実施態様においては、圧力は、プラグに対して、それが形成された後に及び他の反応、例えば、いくつかの逆相プラグのケースにおいて重合後の水性液体混合物での洗浄により生じる膨張の後又はその間に施される。重合液体混合物が重合の間に接触するカラム又は金型の表面は、非反応性であってもよく又は接着性が上昇するように処理することができる。
ある実施態様においては、重合混合物は、少なくとも１つのビニル化合物及びポロゲンを含む。開始剤は、重合混合物に含まれ又は開始方法は、ビニルモノマー及びポロゲンに施されて、クロマトグラフカラム又は他のデバイスのためのモノリシックプラグを分離用ポリマー性プラグを用いて形成する。一般に、重合混合物は、ビニルモノマーに加えて、ビニルポリマー、又はモノマー及びポリマーの混合物、開始剤及びポロゲンを含む。しかしながら、重合混合物において開始剤を導入することのない重合への別のアプローチは、当該技術分野において知られており、及び、例えばポリマーを形成するために放射線を使用することができる。更に、本発明のいくつかの態様は、ビニル基以外の重合反応におけるモノマー及びポリマー、例えば、尿素ホルムアルデヒド又はシリカプラグを形成するための尿素ホルムアルデヒドに適用することができる。
これらの方法により形成されるクロマトグラフカラムは、重合混合物の成分の割合及び成分の選択により部分的に及び獣棒の間の圧力により部分的にサイズを制御され及び重合の間に形成される予め選択されたサイズ分布の分離−有効開口部を有する透過性モノリシックポリマー性プラグを受けるための内壁を有する支持体を含む。例えば、分離−有効開口部サイズは、他の成分の量に比例する重合混合物におけるポロゲンの量及びタイプにより制御される。圧力は、カラムの壁の強度内の値に対してわずかに高い大気圧の範囲で選択することができる。透過性モノリシックポリマー性プラグは、滑らかな壁を有し及びプラグ内に実質的に微小孔を有さない。プラグは、表面官能基を有していてもよい。例えば、疎水性表面基、例えば、フェノール基を添加して、逆相プラグにおける水性ベースの溶剤での膨張を低減することができるが、キャパシティは、また、このケースにおいて低減されるかもしれない。同様に、親水性表面基を添加して、逆相プラグにおけるキャパシティを上昇させることができる。
壁において微小孔又はチャンネリング開口部を有さない透過性モノリシックポリマー性プラグのある実施態様は、主に、ビニルポリマーから形成されるが、多くの他のポリマーを本発明を行う際に使用することができる。弱イオン交換透過性モノリシックポリマー性プラグは、主に、メタクリレート、例えば、グリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートとの、２．５〜３．５の値対１．８〜２．２の値、及び好ましくは３対２の質量比でのポリマーから形成される。例外的特徴を有する逆相透過性モノリシックポリマー性プラグは、主に、ジビニルベンゼンの及びスチレンのポリマーからなる。好ましくは、ジビニルベンゼン及びスチレンの比は、およそ、３．５〜４．５の値対０．８〜１．２の値の範囲内、好ましくは、４対１（質量で）であるが、代わりに、６４ＤＶＢ（ジビニルベンゼン）又は４０％スチレン及び７２質量％ＤＶＢ又はジビニルベンゼン対スチレンの比において２対３〜３対２の範囲内又は好ましくは１対１であってもよい。カラムは、また、８対１〜１０対１の範囲内及び好ましくは９対１のジビニルベンゼン対スチレンの比にあってもよい。１００％のＤＶＢがまた好ましい。
図１において、重合混合物を製造するための工程１２、混合物を重合するための工程１４、クロマトグラフィーランのためのカラムを製造する工程１６及びクロマトグラフィーランを行う工程１８を含むクロマトグラフカラムを製造するための方法のある実施態様１０の構成図が示されている。混合物を重合する工程１４において使用される重合混合物は、重合可能なモノマー及び又はポリマー、開始剤又は開始方法、例えば、照射、及びポロゲンを含み、それらの多くは、当該技術分野において知られている。クロマトグラフ混合物を製造する工程１２、重合する工程１４、クロマトグラフィーランを準備する工程１６及びクロマトグラフィーランを行う工程１８の全ては、異なる形態をとり得る。これらの変化のいくつかは、あとに記載する。
工程１４は、それを圧縮してボイドを低減しつつ重合化合物を反応させるサブ工程２０、ポリマーを洗浄するサブ工程２２、及びいくつかの実施態様においては、ある官能基を加えるためにポリマーを反応させる工程２４を含む。重合しつつ重合混合物を圧縮することなしに実行可能なカラムを得ることができるが、有意な改良は、この圧縮を加えることにより得ることができる。これらの改良は、競争商業カラム及びいくつかのタイプのカラムにおいて及びいくつかの適用のために競争的でないであろうものとの間の差をつくるために十分有意である。この圧縮により形成を防止されるボイド及び不均一な分離−有効開口部は、シールされた容器における重合の間のポリマーのシュリンケージにより生じる空間の不均一な分布より生じ得る。空間の不均一な分布は、カラム壁表面、ポリマー表面、窒素及びポロゲンの間の表面張力における差によるかもしれない。圧縮は、このシュリンケージを行うのに十分なものでなければならず、及び従って、重合の間のカラムの全量を低減する。この方法は、また、カラムにおける分離−有効開口部サイズに影響するかもしれず及び段階的方法において使用して、所望なら、分離−有効開口部サイズにおける変化を生じさせることができる。
洗浄工程２２は、ポロゲン及び未反応モノマー又は他の成分（特定カラムのために使用することができる）を除去することが意図されるが、カラムにおいて保持することが意図されない従来の工程である。この工程には、官能基、例えば、カラムがタンパクを分離することが意図される場合に重要である上記基を加える方法での反応が続く。いくつかの実施態様においては、洗浄工程は、プラグの膨張を生じ、後のシュリンケージが続く。シュリンケージは、チャンネリングボイドを生じ得るので、圧力は、シュリンキングの間のボイドの形成を防止するためにある実施態様において膨張したプラグに加えられる。
図２においては、圧力源２３、圧力をポリマー混合物３２、圧力ピストン２７及び制限(confinement)容器２１へ適用するための圧力移送メカニズム２５を有する重合装置２８の構成図が示される。好ましい実施態様においては、圧力源２３が、一定の油圧の規制された源であるが、他の源、例えば、スプリング又は空気の源又は不活性ガスを使用することができる。同様に、好ましい実施態様においては、メカニズム２５は、ピストン表面が重合の間にプレスされるが、他の源、例えば透過性モノリシックポリマー性プラグに直接適用されるガスが使用され得る重合されたプラグへ滑らかな表面を提供するための滑らかな表面を有するピストンである。好ましい実施態様においては、圧縮ピストン２７は、カラムデパートメント２１の内部に移動して、重合反応の間の区画３２内の重合混合物に圧力を施す。重合反応が終了する際、ポロゲンは、カラムからポンプされる溶剤により除去することができる。重合は、温度制御環境２９において生じ、それは、好ましい実施態様においては、水浴であるが、任意のそのような温度制御メカニズム、例えば、加熱チャンバーであってもよい。このデバイスのための材料は、当該技術分野において既知の従来の材料であってもよい。
図３においては、金属カラムケーシング１０２２、制限容器８８、移送メカニズム２５、圧縮ピストン１１２及び圧力キャップ８０を有する重合装置２８のある実施態様の断面図が示される。金属カラム１０２２は、それらの間にシール１０２１で制限容器８８に対してしっかりと保持される。シール１０２１の圧縮は、バレル１２２内のショルダー１０５２及び装置のレンチフラット１０２３Ａ及びＢにより提供され、それは、スレッド１０５３を有するカラム１０２２に結合され、従って、カラム１０２２及び制限容器８８の間のリークフリーコネクションを提供する。移送メカニズム２５は、圧縮ピストン１１２、ｏ−リング１１０、ロッド１０６、リテイニングカラー１０４、他のｏ−リング１００、及び油圧ピストンヘッド６０２からなり、それらの全ては、配列され、及び、圧縮ピストン１１２及びｏ−リング１１０が制限容器８８内部にしっかりしたシールを形成するようにバレル１２２へ固定される。圧力キャップ８０は、それらの間にガスケット９４を有する、バレル１２２に固定された流体インレットポート３３を含む。
圧力キャップ８０及びバレル１２２は、しっかりと接続され、流体インレット３３を通して適用される加圧流体の漏れを防止する。移送メカニズム２５は、次いで、示されるように位置され、制限容器８８における容量を生じる。制限容器８８の内部直径に対するｏ−リング１００でのバレル１２２の内部直径の比の二乗(square)は、圧力増倍率を提供する。カラム１０２２の反対端は、カラム区画３２における重合反応体に充填され、及びコンテインメントプラグ１０２４は、開口部内に固定される。コンテインメントキャップ６０４は、カラム１０２２上にスレッドされ、コンテインメントプラグ１０２４に開口部をシールするように強いる。好ましい実施態様は、ここで、シーリングを提供するためのタイトフィッティングプラグ１０２４を示し、代替シーリングアレンジメント、例えば、ｏ−リングは、容易に、使用して、フェイスシール又はラジアルシールのいずれかを提供する。流体インレット３３は、制御された圧力源、例えば、制御可能な流体ポンプ又は圧縮ガスの調節されたボトルに連通する。
好ましい実施態様のこの記載は、流体源；流体インレット３３を通して適用される圧縮ガス又は圧縮流体のいずれかを使用するが、圧縮力は、容易に、代替手段；例えば、制限されないが、移送メカニズム２５におけるスプリングプレッシング、圧縮を提供するために重力を用いる移送メカニズム２５においてスタックされる質量、又はカラム区画３２の内側のモノリシックポリマー性カラム材料を圧縮するための移送メカニズム２５を生じさせるように配列される求心力により供給される。
一旦組み立てられると、装置２８は、温度制御環境２９内に置かれ、それは、好ましい実施態様においては、熱的に制御された水浴である。流体圧力は、次いで、流体インレットポート３３を通して適用され、それは、圧力キャップ８０、ガスケット９４、油圧ピストンヘッド６０２及びｏ−リング１００により含まれる。この適用される力は、油圧ピストンヘッド６０２に、圧力キャップ８０から離れて移動させ、及びロッド１０６の末端に力を発揮する。このロッド１０６は、力を圧力ピストン１１２に伝達し、圧縮圧力を、好ましくは、滑らかな表面１１０１で、モノリシックポリマー性カラム材料へ適用する。この滑らかな表面は、究極適用において、分析流体に暴露されたモノリシックポリマー性材料上に連続均一表面をもたらし、及び、圧縮ピストン１１２へのモノリシックポリマー性カラム材料の接着を低減する。
コンテインメントプラグ１０２４、カラム１０２２、シール１０２１、制限容器８８、及び圧縮ピストン１１２は、モノリシックポリマー性材料を制限する。化学反応が進むと、モノリシックポリマー性材料の量が低減し、及び移送メカニズム２５が、更に、制限容器８８へ移動する。ｏ−リング１００及びｏ−リング１１０の間にトラップされる空気は、バレル１２２における空気エスケープ開口部６０３を通してエスケープすることが可能となる。この方法における反応体材料の圧縮は、モノリシックポリマー性材料における望ましくないボイドの形成を防止し、及び、モノリシックポリマー性材料及びカラム１０２２の間の壁効果を排除し、それは、使用においてカラムの性能を低減するであろう。
反応が進行し及びモノリシックポリマー性材料の容量が低減すると、圧縮ピストン１１２がカラム１０２２に接近して移動する。重合の終了付近で、リテイニングカラー１０４は、バレル１２２におけるショルダー１０５２と接触し、移送メカニズム２５の前方移動を中止する。新しく形成されたモノリシックポリマー性材料の破砕は、この作用により防止される。このピストンで、圧縮ピストン１１２の滑らかな表面１１０１は、カラムの末端についておよそ平ら(approximately even)であり、及びモノリシックポリマー性材料は、材料及びカラム１０２２の間の壁作用又は材料における望ましくないボイドなしにカラム１０２２を満たす。レンチフラット１０２３Ａ及び１０２３Ｂを用いて、ポリマー装置２８は、アセンブリーとしてのカラム１０２２から分離される。クロマトグラフのフィッティング(fitting)は、次いで、両末端においてインストールされる。
図４においては、ガラスカラムケーシング９２２、ピストンヘッドアセンブリー４０１、置換ピストン４０及びコンテインメントプラグ９２３を有する重合装置２８の実施態様に類似する重合装置２８Ａの別の実施態様の断面図が示される。いくつかの分析的化学適用において、湿潤表面は、金属成分を含んでいてはならない。この好ましい実施態様のこの議論は、ガラスカラム９２２及びプラスチック片に言及されるが、任意の金属材料；例えば、それらの制限されないが、ガラス、セラミック、又は許容可能な機械的特性を提供するプラスチックが使用することができる。更に、議論は、ここで、適切な流体圧力源により提供される加えられる圧力について言及され、スプリング、質量又は機械的手段を含むが、それらに限定されない圧縮を提供する代替手段を容易に使用することができる。
ピストンヘッドアセンブリー４０１は、ピストン７６、ｏ−リング３８及び中間ポーション５０を含み、アセンブルされ及びカラム９２２へ固定される。置換ピストン４０及びｏ−リング６４からなるプランジャーアセンブリー２０は、アセンブリされ及びリセス９２が油圧シリンダーポーション２１における流体インレットポート３３から離れるように油圧シリンダーポーション２１へ固定される。このプランジャーアセンブリー２０は、十分に、置換チャンバー６０へプッシュされる。
油圧シリンダーピストン２１及びプランジャーアセンブリー３０は、次いで、カラム９２２の上にスレッドされる。適切な道具を用いて、ピストンアセンブリー４０１は、環状ショルダー４２が置換ピストン４０に接触するまで油圧シリンダーポーションにプッシュされ、低減された直径ネック４８は、リセス９２へ固定される。カラム９２２は、反応体で充填され、及びコンテインメントプラグ９２３は、カラム９２２のオープンエンドに挿入される。コンテインメントキャップ９２４は、次いで、カラム９２２の末端上へスレッドされ、コンテインメントプラグ９２３をカラム９２２へしっかりと維持させる。この実施態様では、コンテインメントプラグ９２３及びカラム９２２の間のしっかりとした固定を用いるが、フェイス又はラジアルシールを生じるｏ−リングを含むが、それに制限されない代替方法を容易に使用することができる。
流体圧力源は、次いで、流体インレットポート３３を通して適用される。流体は、油圧シリンダーポーション２１、置換ピストン４０及びｏ−リング６４により置換チャンバー６０内に含まれる。組み立てられた構成要素は、次いで、温度−制御環境２９に置かれる。この環境のために、熱的に制御された水浴を使用したが、反応温度を制御する任意の適切な方法を使用することができる。
そのような流体圧力の適用は、置換ピストン４０に、流体インレットポート３３から離れて移動させる。置換ピストン４０のこの移動は、中間ポーション５０の環状ショルダー４２への力を適用し、それは、次いで、圧力を、ピストン７６を通してカラム９２２におけるモノリシックポリマー性材料に適用する。
反応体化学物質が重合すると、容量が減少する。モノリシックポリマー性材料への圧力の制御された適用は、モノリシックポリマー性材料内の望ましくないボイドの形成及び容量が減少するのでカラム９２２の壁及びモノリシックポリマー性材料の間の壁作用の形成を防止する。反応が進行すると、ピストン７６は、更に、カラム９２２へ移動して、容量のこの低減を置き換える。ピストンにおける滑らかな表面７４は、モノリシックポリマー性材料の均一な表面を生じて、一貫性のあるインターフェースをその最終使用において分析流体に提供し、及びモノリシックポリマー性材料がピストン７６の表面に付着するのを防止する。
反応の終了付近で、環状ショルダー４２は、カラム９２２の末端と接触するようになり、カラム９２２への中間ポーション５０の更なる移動を防止する。これは、ボイド及び壁効果が削除された後にモノリシックポリマー性材料の破砕を防止する。この環状ショルダー４２は、また、ピストンがトラベルする距離を制限し、カラム９２２における得られるモノリシックポリマー性材料のサイズ及び細孔性の制御が可能となる。
重合が終了した後、油圧シリンダーポーション２１は、カラム９２２から、置換ピストン４０及びそのｏ−リング６４と一緒に除去される。制限キャップ９２４及び制限プラグ９２３は、次いで除去され、最終的に、ピストンヘッドアセンブリー４０１が除去される。クロマトグラフのフィッティングは、両末端でインストールされる。
反応体化学物質の表面への直接的な圧縮ガスの直接適用により反応体化学物質における圧縮を提供することがまた可能である。そのような方法は、上の技術より劣っていると考えられ、なぜなら、得られるモノリシックポリマー性材料の表面が滑らか又は平らではなく、及び特定のカラムフォーマットが選択されるときにモノリシックポリマー性材料のボディより多孔性であり得るからである。他のカラムフォーマットにおいては、ガスの直接適用はより適用できるものであり得る。高い分解分離を達成するためにポリマーロッドの末端をカットオフすることが必要であるかもしれない。図５においては、不規則な表面領域及びより少ない程度で粒子の小球のよりスタックされたプレート様構造のために高い表面領域を有するそれらの間に細孔を有さないがチャンネルを有する粒子の小球を見せるために９０００倍に拡大した０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）油圧下でのカラムケーシング内部で重合された強カチオン交換体の走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）の図が示される。それらの表面領域をカバーするプロジェクションを有する粒子のラフな表面領域は、アクレーション(accretion)による成長を示し得るサインを示す。
図６においては、カラムにおいて分離されたタンパクサンプルからのピークを有するクロマトグラムが示されており、その中においては、膨張及びシュリンキングの問題が圧力の適用により避けられている。ピークは独特のものであり及び良好な解像力(resolution)を有する比較的高いものである。この特定のクロマトグラムは、勾配回避(gradient elusion)のための、３ｍｌ／分の流量で、コンアルブミン、オボアルブミン及びトリプシン抑制剤のタンパクサンプルにおける、１つの溶剤としてのｐＨ７．６の０．０１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー及び他の溶剤としての１Ｍ塩化ナトリウムを、５分以内で０〜５０％の第２溶剤の勾配で用いたものである。逆圧は、このカラムにおいて平方インチあたり２５０ポンドであるが、そのような補正のないカラムは、同一の勾配のためにより高い逆圧を有することが期待されるであろう。
図７においては、３つのプラグが示されており、左側の１つは、重合の間圧力を用いて製造され及び右側の２つは圧力なしに重合された。図７は、カラムの形成の間におけるシュリンケージにより生じるカラムの表面に形成される切れ目を図解する。予測できずに空間があいた比較的大きな開口部の形成においてカラムの内側に類似の切れ目がある。これらの図は、また、切れ目が除去することができ、クロマトグラフィーランの間の同一の組成物及び同一サイズ及び改良された分解のカラムの間により良い再現性が得られることを図解する。
図８においては、ポンピングシステム１２１、カラム及び検出器配列１４１、コレクターシステム１１７、コントローラー１１９、及びパージシステム１２３を有する予備液体クロマトグラフシステム１０１の構成図が示される。カラム及び検出器配列１４１は、それらの中に透過性プラグを有する複数のカラムを含む。好ましくは、プラグは、サイズ補正されたポリマー性プラグである。ポンピングシステム１２１は、溶剤をカラム及び検出器配列１４１へ、コントローラー１１９の制御下で供給する。パージシステム１２３は、ポンプ配列１３５と連通して、クロマトグラフランの間のカラム及びポンプの間のライン及びポンプをパージする。ポンプ配列１３５は、溶剤をカラム及び検出器配列１４１へ供給し、それから、流出物がコレクターシステム１１７へ、コントローラー１１９の制御下に流れる。コントローラー１１９は、溶質のバンドを示すカラム及び検出器配列１４１における検出器からシグナルを受け及び当該技術分野において既知の方法においてフラクションコレクターシステム１１７を活性化する。１つの適切なフラクションコレクターシステムは、Isco, Inc., 4700 Superior Street, Lincoln, NE 68504から入手可能なＦＯＸＹ７２００フラクションコレクターである。
ポンプ配列１３５に溶剤を供給するため、ポンピングシステム１２１は、複数の溶剤リザーバー及びマニホールド（その第１及び第２は、それぞれ１３１及び１３３で示される）、ポンプ配列１３５及びモニター１３７（それは、コントローラー１１９の制御下に駆動されて、ポンプ配列１３５を作動させる）を含む。コントローラー１１９は、また、ポンプ配列１３５におけるバルブを制御して、溶剤リザーバー及びマニホールド、例えば１３１及び１３３から溶剤を引き出す及び配列における複数のポンプから溶剤をポンプするのと同時にポンプ配列１３５における往復ポンプのピストンをモニターが作動させるとき勾配の形成及び溶剤の流れを制御する。
好ましい実施態様においては、往復ピストンポンプの配列を使用するが、ポンプのタイプは、往復であろうとなかろうと及びピストンタイプであろうとなかろうと適切である。多くの数の異なるポンプ及びポンピング原理は、当該技術分野において及び当該技術分野における当業者に知られており、任意のそのような既知のポンプ及びポンピング原理は、大抵のケースにおいて日常のエンジニアリングを用いて本件明細書に開示される発明に適用することができる。２つの溶剤が図１の実施態様において開示されているが、１つのみの溶剤又は２以上の溶剤を使用することができる。
流出物を処理するために、コレクターシステム１１７は、溶質を収集するためのフラクションコレクター１４１、マニホールド１４３及びマニホールド１４３からの廃棄物を取り扱うための廃棄物倉庫１４５を含む。１以上のフラクションコレクターがカラム及び検出器配列１４３に連通して、マニホールドを有する又は有しないカラムから溶質を受けとる。マニホールドを使用して、１以上のカラムからの溶質を組み合わせ及びそれらを単一の貯蔵所において一緒に堆積させてもよく又は各々のカラムは、その独自の貯蔵所内に溶質を堆積してもよく又はいくつかのカラムは、各々、その独自の対応する貯蔵所において溶質を堆積してもよく及び他のものは、同一の貯蔵所内に溶質を組み合せてもよい。マニホールド１４３は、カラム及び検出器配列１４１と連通して、各カラムからの流出物をチャンネルし及びそれを廃棄物倉庫１４５に堆積する。
図８のシステムは、各々が類似のタスクに含まれるカラムの配列を含むため、カラムの再現性は、特に重要であり、なぜなら、単一のタスクを行う各カラムについて、できるだけそのようなタスクを行うほかのカラムの全てに類似する特徴を有することが望ましいからである。従って、互いに接近して関連するサンプルの分離を行う際に協力することが意図される任意のグループのカラムにおいて実質的な利点があり、本発明の透過性ポリマー性カラムは特定の用途を有する。
プラグのボディにおいて大きな開口部又は側壁において開口部を有さない分離媒体としてポリマー性プラグを有するカラム又は他のデバイスを製造するために、重合装置のある実施態様は、重合の間重合混合物を含むように適用された温度制御反応チャンバー及び該温度制御反応チャンバーにおける該重合混合物に圧力を付するための手段を含む。重合混合物は、モノマー、ポリマー及びポロゲンを含む。好ましい実施態様においては、圧力を付する手段は、移動性部材で圧力を付する手段である。重合混合物は、架橋試薬及び架橋モノマーを含む。剛性、キャパシティ及び分離−有効開口部分布は、架橋試薬、モノマー、重合温度及び圧力の量により制御される。
重合は、接近する容器内において起こり、オーブンのケースにおいては溶剤の損失を回避し又は水浴反応チャンバーにおいては水での混合物の希釈又は汚染を回避する。圧力は、いくつかの混合物、例えば、シュリンケージにより形成される真空をバランスするためのイオン交換カラム用混合物の重合の間に付される。ポリマープラグは、重合の後に洗浄されて、ポロゲンが除去される。いくつかのポリマーのケースにおいては、プラグは、洗浄間又はクロマトグラフランの間（水性液体混合物が適用される場合、例えば、プラグが逆相プラグである場合）に膨張する傾向を有していてもよい。
混合物をその構成成分に分離するために、透過性ポリマー性プラグを上述したように形成する。それは、ライトレギュラーチューブ状シリンダー、又は毛管、又はマイクロチップである従来の液体クロマトグラフカラムを含み又は任意の寸法又は形状を有する、任意のサイズ又は形状のカラムにおいて形成することができる。サンプルは、プラグに並列して置かれ、及びサンプルの構成成分は、それらがプラグから移動した際に他のものから分離されたものである。
例えば、液体クロマトグラフィーによりサンプルにおけるタンパク混合物からタンパクを分離するために、カラムは、プラグとして形成され及びポロゲンを有する場所において重合される。シュリンケージは、使用前に補正される。サンプルは、カラム及びカラムを通して流れる溶剤に注入され、それにより、サンプルは、それがプラグを通して行われるときにその構成成分に分離される。ある実施態様においては、複数のサンプルは、高い再現性を有する分離カラムにおけると同時に分離される。
分離方法において使用されるクロマトグラフカラムのある実施態様は、内部ケーシング壁を有するクロマトグラフケーシングを有し及びケーシング壁内に透過性モノリシックポリマー性プラグを有する。プラグは、分離−有効開口部を有するポリマーであり、それは、重合前に重合混合物におけるポロゲンによりポリマーにおいて形成される制御されたサイズを有していてもよく及び重合の間における圧力により部分的に少なくともサイズにおいて制御され得る。透過性モノリシックポリマー性プラグは、滑らかな壁を有し及び透過性モノリシックポリマー性プラグ内には実質的に細孔を有さない。好ましい実施態様においては、プラグは、ビニルポリマーから形成されるが、他のもの、例えば、尿素ホルムアルデヒド又はシリカから形成されてもよい。これらは、表面基、例えば、水性溶剤での膨張を低減するための疎水性基又はキャバシティを上昇するための親水性基を含んでいてもよい。
異なるプラグにおける成分及び重合混合物における成分の割合のいくつかの例は、説明に役立つ。例えば、チャンネリング開口部を有さない弱イオン交換透過性モノリシックポリマー性プラグは、主に、メタクリレートポリマーから形成される。有利には、透過性モノリシックポリマー性プラグは、主に、１：１〜７：３の範囲の比、好ましくは３：２の質量比でグリシジルメタクリレートの及びエチレンジメタクリレートのポリマーから形成される。
強アニオン交換体は、その主要成分として、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）及びエチレンジビニルメタクリレート（ＥＤＭＡ）を、．８〜１．２の範囲の値対２．８〜３．２の範囲の値の比、好ましくは、１：３の比で含む。好ましい実施態様における重合液体混合物は、０．４ｇのＧＭＡ、０．５ｇの２−（アクリロイルオキシエチル）トリメチルアンモニウムメチルスルフェート、１．２ｇのＥＤＭＡ、１．５ｇの１，４−ブタンジオール、１．３５ｇのプロパノール、０．１５ｇの水及び０．０２ｇのＡＩＢＮを含む。
弱カチオン交換体は、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ＧＭＡ及びＥＤＭＡの重合混合物を、４．５〜５．５の範囲のＭＭＡ値対．８〜１．２の範囲のＧＭＡ値対１１〜１３の範囲のＥＤＭＡ値の比、好ましくは、５対１対１２の比で含んでいた。重合液体混合物は、０．２ｇのＡＡ、０．５ｇのメチルメタクリレート（ＭＭＡ）、０．１ｇのＧＭＡ、１．２ｇのＥＤＭＡ、２．５５ｇのドデカノール、０．４５ｇのシクロヘキサノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮを含む。重合後、このカラムは、０．２５Ｍクロロ酢酸ナトリウムにおいて、５Ｍ（モル）水酸化ナトリウムＮａＯＨにおいて、６０℃で、６時間加水分解される。
他の例は、（１）１：１〜２：１の範囲の質量比でのグリシジルメタクリレート及びエチレンジメタクリレート；又は（２）３：１〜９：１の範囲の比でのジビニルベンゼン及びスチレン；又は（３）４：１の範囲の比でのジビニルベンゼン及びスチレン又はジビニルベンゼンの量は、３５〜８０質量％、及び好ましくは６４質量％であり；又は（４）ジビニルベンゼン、スチレン及びポロゲンは、それぞれ、８：２：１５であり；又は（５）開始剤と組み合わせて、７〜９ユニットのジビニルベンゼン対１．５〜２．５ユニットのスチレン対１３〜１７ユニットのドデカノールの範囲内の割合でのジビニルベンゼン、スチレン及びドデカノール；又は（６）開始剤と組み合わせて、それぞれ、８：２：１５の範囲のジビニルベンゼン、スチレン及びドデカノール；又は（７）開始剤と組み合せて、７〜９対１．５〜２．５対９〜１３対２．５〜３．５のそれぞれの割合でのジビニルベンゼン、スチレン、ドデカノール及びトルエン；又は（８）開始剤と組み合わせて、８：２：１１：３のそれぞれの割合で組み合せられるジビニルベンゼン、スチレン、ドデカノール及びトルエン；又は（９）開始剤と組み合わせて、０．５〜０．７対０．３〜０．５対１〜２対０．１〜２．５の割合でのグリシジルメタクリレート、エチレンジメタクリレート、シクロヘキサノール及びドデカノール；又は（１０）０．６：０．４：１．３２５：０．１７５のそれぞれの割合でのグリシジルメタクリレート、エチレンジメタクリレート、シクロヘキサノール及びドデカノールである。
一般に、標的適用のための分離−有効開口部を有するモノリシックポリマー性支持体を製造する方法は、以下の工程を含み得る：（１）選択された式で重合混合物を製造すること；（２）所望の形状及びサイズを有する、本発明の実施態様のいくつかにおいてカラムと称されることがある容器内に混合物を置くこと；（３）不圧シーリング又は加圧フィッティングでカラムをシールすること；（４）重合混合物を、加熱浴又はオーブンにおいて、制御された温度で、選択された圧力で又は圧力なしに重合すること；（５）加熱浴又はオーブンからカラムを取り出し及び選択された又は所望の昨日のためにデザインされたフィッティングを施すこと；（６）ポロゲン及び可溶性材料をカラムから選択された溶剤を用いて好ましくはプログラムされた流れにより洗浄すること；（７）いくつかの実施態様においては、配合された改質液体混合物をポンプして、相互作用のための所望の機能性を得ること；（８）特定の改質を加熱浴又はオーブンにおいて制御された条件下で行うこと；（９）カラムから、好ましくは、プログラムされた流れを用いて、改質液体混合物を洗浄すること；（１０）高分解(high resolution)で所望の条件でその使用のためにカラムを安定化、アセンブリー及びコンディショニングすること；（１１）標的適用においてサンプル分離でカラムを特徴付けること；（１２）液体をカラム内に選択された貯蔵液体混合物で置き換えること。工程７〜９は、任意であり、又は、使用される媒体の官能性に依存して反復的である。工程１〜５は、２又は複数の段階的重合工程において繰り返され又は改質される。
本発明のいくつかの実施態様においては、重合混合物は、以下のものを単独で又は複数含む：（１）モノマー；（２）ポロゲン；（３）開始剤又は触媒；及び／又は（４）添加剤又は充填剤（任意）。重合混合物は、ヘリウムを用いて、１５分間以上、又は真空により、又はカラムへの充填又は注入前の双方の組み合わせにより脱気することができる。この脱気のゴールは、混合物内の酸素を脱することである。酸素は、抑制剤又は開始剤として、異なる状況で作用し得、いくらかの予測不可能な重合のふるまいを生じ、それは、カラムの再現性及び分解に有害である。
上記方法のための適切なモノマーは、モノ、ジ及び複数の官能モノマー（当該技術分野において既知）、好ましくはビニル又はヒドロキシルシリカ官能基を含有するモノマーを含み、それは、現場で、中間体として生じる得る。典型的なモノビニルモノマーは、スチレン及びヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、スルホン酸、カルボン酸、ニトロ基及び異なるアルキル鎖、例えばＣ４、Ｃ８、Ｃ１２及びＣ１８を含有するその誘導体、又はそれらの保護されたフォーマットを含み、それは、使用されて、重合の前又は後にその官能性を生じ；及びアクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルピロリドン、ビニルアセテート、アクリル酸、メタクリル酸、ビニルスルホン酸、及びこれらの化合物を現場で生じるように使用され得るこれらの基を含む。これらのモノマーの混合物を使用することができる。ヒドロキシル基、ビニル基、アルキル基又はそれらの誘導体及びそれらの混合物を有するシロキサンが好ましい。モノ官能性モノマーの量は、本発明の実施態様において全モノマーの２〜６０％で変動する。それらは、媒体のタイプに依存して劇的に変化する。
典型的なジ又は多官能性モノマーは、好ましくは、橋かけ成分を有するジ又は複数のビニル含有モノマー、例えば、ベンゼン、ナフタレン、ピリジン、アルキルエチレングリコール又はそのオリゴである。これらのポリビニル化合物の例は、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、アルキレンジアクリレート、ジメタクリレート、ジアクリルアミド及びジメタクリルアミド、ジビニルピリジン、エチレングリコールジメタクリレート及びジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート及びアクリレート、ペンタエリスリトールジ−、トリ−又はテトラメタクリレート及びアクリレート、トリメチロプロパントリメタクリレート及びアクリレート、及びこれらの化合物の混合物である。現場で生じることが多い、ジ、トリ及びテトラヒドロキシル基を有するシロキサンは、また、本発明において好ましい。多機能性モノマーの典型的量は、本発明の実施態様において４０〜８０％である。
開始剤は、当該技術分野において知られる開始剤のすべて、例えば、アゾ化合物及びペルオキシロを含む。典型的な開始剤の例は、アゾビスイソブチロニトリル、ベンゾイルペルオキシド、２，２’−アゾビス（イソブチルアミド）デヒドレート、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライドである。開始剤の典型的量は、本発明の実施態様において、全モノマーの０．５〜２％である。シロキサンを用いる場合、触媒、例えば酸を、開始剤の代わりに使用する。触媒の量は、重合混合物のリットルあたりでミリモルからモルである。重合混合物に開始剤を導入することのない重合への他のアプローチは、当該技術分野において知られており及び使用することができ、例えば、ポリマーを形成するための放射線である。
ポロゲンは、分離−有効開口部構造を生じるための重合後に除去される任意の材料又は化合物である。使用することができる典型的なポロゲンは、有機溶剤、水、オリゴマー、ポリマー、分解可能な又は溶解性ポリマーである。有機溶剤のいくつかの例は、アルコール、エステル、エーテル、脂肪族及び芳香族炭化水素、ケトン、ジ、トリ、テトラエチレングリコール、ブタンジオール、グリセロール又はこれらの溶剤の組み合わせである。ポロゲンの選択は、分離−有効開口部サイズ及び分離−有効開口部分布（必要とされる）に依存する。
いくつかの実施態様においては、ポロゲン溶剤の単一又は組み合わせが選択される。単一の又は組み合わせのポロゲン溶剤は、モノマー及び開始剤と混合可能であり、均一な流体混合物を形成するが、単一の又は組み合わせのポロゲン溶剤は、形成されるポリマーに対する溶媒力が乏しい。重合は、通常、開始剤により開始する。オリゴマーの形成には、架橋されたポリマー又は中心部分を形成する架橋、及びポリマー又は中心部分の連続成長が続く。これらのポリマー鎖及び中心部分は、ポロゲン溶剤の溶媒力により可能となるサイズで液体混合物から沈殿する。これらのポリマー鎖及び中心部分は、最初に液体混合物中に懸濁され及びコリジョン(collision)及び架橋により小さな粒子を形成する。小さな粒子は、ポロゲン及びモノマーにより膨張し、及び他の中心部分又は粒子での重合及び凝集の双方により成長し続ける。大きな粒子は、コリジョンにより一緒に凝集し、及び架橋により適所に保持される。ポリマー及び中心部分の沈殿の時間及び速度は、粒子、凝集体又はクラスター及びこれらの粒子のサイズ及び凝集体の間に形成される分離−有効開口部サイズ並びに分離−有効開口部サイズ分布に劇的に影響する。
非常に乏しい溶剤及びかなり良好な溶剤の組み合わせは、通常、液体混合物中におけるポリマーの溶解性又は膨張性を調整するのにより良いことを発見し、それは、所望の多孔性及び分離−有効開口部サイズ分布をもたらす。乏しい溶剤の選択は、より重要であり、なぜなら、大きな分離−有効開口部の発生が最も重要であるからである。大きな分離−有効開口部の発生後、いつも、良好な又はかなり良好な溶剤を見つけ出し、分離−有効開口部サイズダウンを調整することが容易である。ヒドロキシル基又は複数のヒドロキシル基を含有するアルコール又は天然化合物は、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド及びポリメタクリルアミドからなる媒体用の乏しい溶剤のより良い選択であることを見い出した。溶解又は溶媒和力は、容易に、異なる鎖長及び多くのヒドロキシル基を有するアルコールを用いて調整され得る。ポリマーのための良好な溶剤は、多くの従来の良好な溶剤、例えば、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトアミド、ＤＭＳＯから選択することができる。ポロゲンの典型的量は、本発明の実施態様において、２０〜８０％、より好ましくは、４０〜６０％で変動する。
本発明において使用される添加剤又は充填剤は、特定の所望の特徴を媒体に加えることが可能な材料である。分離−有効開口部を有するポリマーのある重要な特徴は、ポリマーの剛性である。不溶性の剛性ポリマー粒子、シリカ粒子、又は他の無機粒子は、重合混合物に添加して、重合後に分離−有効開口部を有するポリマーを強化することができる。非常に大きな数及び量の分離−有効開口部を有するポリマーは、通常、良好な強度又は硬度を有さない。それらは、大体の場合、脆い。剛性粒子は、ポリマーのフレームワークとして作用することができる。別の実施態様においては、大きな直径のカラムの製造の間の熱移動の問題は、非常にモノ−分散非多孔性粒子を重合混合物に添加することにより低減される。かなり頻繁に、大きな直径のカラムは、ほんの低い逆圧で高い流量を可能にするために高い流れ準備クロマトグラフィー又は触媒床のために必要とされる。
分離−有効開口部を有するポリマーの実施態様においては、モノ−分散大非多孔性粒子又はビーズが、深いパッキングに近いパターンでしっかりとパックされる。重合混合物は、大きなビーズの間質腔に充填され及びこれらのスペースにおいて重合される。流れパターン及びカラム効率は、深くパックされたモノ分散ビーズにより改良される。非常に大きな数又は量の分離−有効開口部を有する材料は、低い剛性を有する媒体の崩壊(collapse)の恐れなしにこの大きな直径のカラムにおいて製造することができ、なぜなら、大きなモノ分散ビーズは、大きなカラムのための支持材料であるからである。高い流量は、大きな数の又は量の分離−有効開口部だが、ポリマーの頑丈な構造により達成することができる。
別の実施態様においては、放熱問題は、充填剤として分離−有効開口部を有するポリマーを導入する２又は複数の段階的重合での大きなカラムの製造において避けられる。本発明のある実施態様においては、同一の重合混合物から製造された分離−有効開口部を有する複数の薄いカラムを充填剤として使用して、大きなカラムの現場での製造の間放熱問題を低減する。本発明の別の実施態様においては、ポリマーロッドを同一の目的のために充填剤として使用する。本発明のある実施態様においては、充填剤材料は、大きな非多孔性シリカビーズである。
ポリマー、モノマー、開始剤、ポロゲン、添加剤及び重合温度を選択して、カラムの特徴を改良し、及び、重合の間に圧力を用いる重合の実施態様について又は他の方法について使用することができる。この方法のいくつかの態様は、遊離基反応以外の重合方法、例えば、重縮合反応及びゾル・ゲル法（それはシリカモノリスを形成する）において形成されるモノマー及びポリマーに適用することができる。
本発明のある実施態様におけるカラムハードウェアは、円筒型、円錐形、長方形、及び多角形を含む種々の形態を有するクロマトグラフカラムとして使用される剛性チューブ又はこれらのチューブのアセンブリーを含む。チューブは、金属、ガラス、シリカ、プラスチック又は他のポリマー、より好ましくは、ステンレス鋼又はガラスを含む当該技術分野において知られる従来の材料から製造することができる。このチューブの内部寸法は、直径、厚さ、幅又は深さにおいてミクロメートルからメートルであってもよい。透過性固形材料は、チューブの全断面領域にわたり、ここで、サンプルの分離は、軸方向に又は半径方向にチューブを通過することにより行われ（Lee, W-C,ら, “Radial Flow Affinity Chromatography for Trypsin Purification”, Protein Purification (book), ACS Symposium Series 427, Chapter 8, American Chemical Society, Washington, D. C., 1990）、分離のモード、より具体的には軸上の又は直接流クロマトグラフィー又は放射状流クロマトグラフィーに依存する。重合液体混合物が重合の間に接触するカラム又は金型の内部表面は、非反応性であってもよく又は処理して、プラグの表面への付着を上昇させるてもよい。チューブは、当該技術分野において知られた使用に適したフィッティングを導入して、それを他の器具、より具体的には、クロマトグラフィー器具でそれを連通することができる。
本発明の実施態様においては、モノリシックポリマー性固形ポリマーは、毛管において形成され、それは、例えば、内部直径１５０μｍ（１５０ミクロン）の毛管であってもよい。他の特に有意な実施態様においては、モノリシック透過性剛性材料は、多くの場合、圧力下で、取り外し可能な80.mm i.d. Teflon(登録商標)シーリングリングにおいて形成され及びシールされる。このリング及びカラムは、低コストの、信頼性のある、高キャパシティの、高分解の、非常に早い、容易に置換可能な、置換クロマトグラフカラムとして販売されているかもしれない。他の実施態様においては、チューブの直径は、１０ｍｍである。別の実施態様においては、チューブ直径は、４．６ｍｍであり及び材料はステンレス鋼である。本発明の別の実施態様においては、プラスチックシリンジバレルをカラムとして使用する。別の実施態様においては、モノリシックマトリックスが、金属容器、シーリングプレート及び複数の円筒孔を有するインサートを含有する金型において形成される。インサートの厚さは、１〜１０ｍｍで変動する。金型は、シリカ又は剛性ポリマーからなるプレート上に複数のチャンネル又はグルーブを有するミクロデバイスであってもよい。モノリシック材料は、任意のサイズ及び形状で形成することができ、それを、特定のデザインされたミクロサイズのデバイス、例えば、対象媒体を含有し及び場合により底に小さな溶離ポートを有する複数のウェルを有するミクロタイタープレートに適するものとする。これらのデバイスについてのデザインされた形状及びサイズ又は適用について制限はない。
重合混合物は、固形支持体として使用するための分離−有効開口部を有するプラグを形成するために重合される生成物の最終用途に依存して所望のサイズ及び形状を有するカラムに充填又は注入される。有利には、重合は、カラムの中において行われ、その中においては、プラグが、例えば、クロマトグラフカラム、触媒床、抽出チャンバーなどで使用されるものである。本発明のある実施態様においては、陽圧が、重合の間に重合混合物に与えられて、凝集体の粒子サイズを制御し及び重合の間の容量シュリンケージを補正する。凝集体の粒子サイズは、非加圧重合のものより均一で大きいことが分かった。重合の間の容量シュリンケージは、正の空気圧又は陽圧での移動ピストンにより補正される。
より具体的には、重合混合物は、好ましい実施態様におけるカラム又はいくつかの他の適切な金型に適用される。重合は、カラム又は金型内で開始される。カラム又は金型は、十分にシールされて、重合がオーブン内における場合にポロゲン又はモノマーの蒸発により計画されていない損失を回避し、又は重合が水浴における場合に汚染又は希釈を回避する。重合の間、圧力は、重合液体混合物に適用される。好ましくは、圧力は、凝集体のサイズ及びそのポリマー内における分布を制御するため、及びポリマー壁表面上における及びシュリンケージによる媒体内のボイド形成を防止するため、及びギャップ又は壁チャンネルを通して代替流体を形成するカラムの壁から媒体が分離するのを防止するため大気圧より高いレベルで維持され、これは、重合が終了するまでである。シュリンケージを適合するために大気圧でカラムを維持することは、各ケースにおいてボイドの形成を及び提供される乏しい再現性を防止しなかった。圧力源は、ガス圧、非相溶性液体からの圧力、空気圧により駆動されるピストン、スプリント力又は油圧であってもよい。
本発明のある実施態様においては、多くの加圧金型（チューブ）は、一定の又は制御された温度で、単一の水浴において維持され、及び同じように単一の（例えば、窒素、水など）マニホールドから加圧される。これは、生成の均一性及び速度の双方を上昇させる。
本発明の別の実施態様においては、選択された圧力が高い圧力窒素により重合混合物に与えられる。本発明の更に別の実施態様においては、選択された圧力は、図２、３又は４に示される圧力デバイスによる重合の間の重合混合物に与えられる。カラムは、一端においてシールされ及び重合混合物はこのカラムに充填される。他の末端は、図２、３又は４に示されるデバイスによりシールされる。カラムを含む重合フィクスチャーの全体的アセンブリーは、図２、３又は４に示される。圧力は、シリンジポンプから油圧により駆動される滑らかなテフロン（登録商標）プラグを有するピストンにより重合へ施される。重合混合物は、カラムにおいてテフロン（登録商標）プラグ及びｏ−リングによりシールされる。一定の陽圧が重合混合物に適用される場合、実際の圧力は、油圧及びフリクションの間の差である。重合の間、ピストンは、ポリマーのシュリンケージのため生成されるボイドを補正するためにモノマーからポリマーへの添加の際にカラムに移動する。これは、陰圧及びこのシュリンケージのためにシールされたカラムの内側に生じたボイドスペースを防止し、従って、カラム効率を改良する。
シュリンケージは、各々において直接的なものであると考えられている。得られるボイドは、オソラク、ＡＩＢＮにより生じる窒素ガスにより又はカラムの内部の陰圧での溶剤蒸気により占められる。ボイドは、ポリマー壁における大きな不規則デント又は完全なポリマー表面を広げる小さな不規則デントであってもよい。ボイドは、また、分離−有効開口部サイズ分布の不均一性を生じるポリマー内部に分配され得る。これらの不規則ボイド及びギャップは、壁効果又はカラムのゾーン拡散(spreading)を生じる。それらは、カラム効率に有害であり、及び、カラムの分解を低減する。これらのボイド及びギャップは、また、生成のバッチからバッチへ又は生成の同一バッチにおいて代わる代わるカラムの性能の低再現性を生じる。
本発明のある実施態様においては、選択された圧力は、重合混合物へ与えられて、凝集体のサイズ及び分離−有効開口部サイズ分布を制御する。粒子サイズは、重合の間の重合混合物における圧力の変化で変化する。粒子サイズは、高い圧力でより大きい。陽圧下で、重合の間のポリマーのシュリンケージは、圧力の方向でのみ起こる。これは、カラム壁に隣接する壁表面上におけるボイド／ギャップ及びポリマー内部のボイドの形成を防止する。
重合方法の間、モノマー濃度は、モノマーのポリマーへの上昇転化により低減し続ける。架橋ポリマーは、液体混合物及び凝集体から互いにより大きな粒子又はクラスターを形成するように沈殿し続ける。これらの粒子は、沈殿し及び架橋剤、例えば、ビニル基を有する活性ポリマー鎖により互いに結合する。これらの相互接続粒子は、カラムの底に堆積し、それは、カラムのトップ部分で低モノマー濃度を生じる。
分離−有効開口部サイズは、全モノマー濃度及びそれらの比により高度に影響を受ける。不均一分離−有効開口部サイズ勾配は、重力方向に従って形成され、それは、ゾーン拡散を生じる。粒子サイズは、部分的に重合の圧力により制御されるので、分離−有効開口部サイズの勾配は、重合の間の圧力を調節することにより補正され得る。ある実施態様においては、直線的に上昇する圧力が、重合の間の重合混合物に与えられる。別の好ましい実施態様においては、段階的圧力勾配が重合の間の重合混合物に与えられる。圧力を上昇させる／低減させる速度及びパターンは、完全な重合方法の間の凝集体の粒子サイズ及びその分布を制御するように選択される。分離−有効開口部分布の直線的勾配が望ましい場合、それは、また、異なる速度及び異なる最大圧力での重合の間の圧力を変化させることにより達成される。
重合温度は、開始剤の選択に依存する。ＡＩＢＮ及びベンゾイルペルオキシドを使用する場合、典型的な温度範囲は、５０〜９０℃である。加熱源は、当該技術分野において知られる任意のものであってもよい。好ましい方法は、温度制御された加熱浴又はオーブンである。反応時間は、開始剤の選択及び反応温度に依存して０．５〜４８時間であってもよい。本発明のある実施態様においては、重合は、温度制御された水浴において、６０℃で、２０時間行う。
放射線、例えば、ＩＲ、ＵＶ−ｖｉｓ又はＸ線は、光感受性開始剤を使用する場合の重合のための源として使用される。ある実施態様においては、反応は、開始剤の熱活性により開始する。他のものにおいては、それは、エネルギー照射、例えば、Ｘ線の適用により、化学開始剤を用いて又は用いずにいずれかで開始する。Ｘ線を使用する場合、開始剤は、重合温度より十分上の温度で熱的に活性化するように選択すべきである。一方、開始剤は、活性を受ける反応塊のために望ましい所定の領域における温度でのＸ線照射下での場合に活性化する。開始剤は、また、解離のための活性時間及び温度が、モノマーのみのためよりかなり低いように選択される。活性開始剤（遊離基）の生成は、Ｘ線の強度によってのみ制御される。Ｘ線強度は制御可能なので、反応速度が制御可能であり、“ランアウェイ”又はオーバーヒートでないであろう。更に、開始剤は、活性を受ける反応塊のために望ましい所定の領域における温度でのＸ線照射下での場合に活性化するように選択することができる。
ある実施態様においては、Ｘ線は、重合のためのエネルギーの全て又は部分を供給する。Ｘ線光子のエネルギーは、ポリマーの製造に及び暑さ又は断面の相違に従って変動する。低エネルギーＸ線は、小さな直径のポリマーロッドの製造のために使用され及び長期間の低エネルギーＸ線への暴露又は高いエネルギーＸ線は、大きな直径のポリマーロッドの製造のために使用することができる。好ましい実施態様においては、重合温度は、Ｘ線をオン／オフにスイッチすることにより制御される。Ｘ線をオフにスイッチする際、重合は、数秒以内に急速に止められ、なぜなら、遊離基の寿命が典型的に１秒付近であるからである。
ある実施態様においては、光開始剤を使用して、エネルギー源としてＸ線を用いて重合を開始する。光開始剤は、γ線、Ｘ線、ＵＶ、可視的及びＩＲ感受性光開始剤を含むポリマーフィールドにおける光重合において使用される典型的な光開始剤である。光開始剤は、アゾ化合物、例えば、アゾビスイソブチロニトリル、ペルオキシド、例えば、ジフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド、ケトン、例えば、フェナントレンキノン、２−クロロチオキサンテン−９−オン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’−ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベゼボフェノン(bezebophenone)、２−クロロチオキサンテン−９−オン、ベンジルジメチルケタール、有機金属複合体を含む。これらの光開始剤は、カチオン及び遊離基重合の双方において使用されるものを含む。ある実施態様においては、ＡＩＢＮは、光開始剤として使用される。別の実施態様においては、フェナントレンキノンが光開始剤として使用される。
ある実施態様においては、シンチレーター及び増感剤を使用して、光開始剤の活性を強化する。例えば、Ｘ線は、添加される既知のシンチレーターへエネルギーを移送するように溶剤へエネルギーを与えることにより又はシンチレーション特性を有する溶剤のシンチレーションを直接引き起こすことによりシンチレーションを引き起こし得る。好ましくは、シンチレーション光は、蛍光増感剤を添加して、重合を生じる際に光開始剤の活性を上昇させることにより助長される。シンチレーター及び増感剤は、光開始剤の吸収バンド内の十分な波長において光の照射及びシンチレーターによりＸ線からエネルギーの十分な吸収をもたらすように選択される。
使用することができるシンチレーターは、従来技術における発光材料の任意のものを含む。一般に、シンチレーターは、ベンゼン環を含む化合物、例えば、テルフェニル、第四フェニル、ナフタレン、アントラセン、複素環を含む化合物、カルボニル基を有する化合物、２以上のルロロホル(lurorophor)を有する化合物及び有機金属化合物、及び無機化合物、例えば、ＺｎＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＣｓＩ、Ｇｄ2Ｏ2Ｓ及びＣａＷＯ4を含む。いくつかの実施態様においては、２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）、２−フェニル−５−（４−ビフェニルイル）１，３，４−オキサジアゾール（ＰＢＤ）、２−（１−ナフチル）−５−フェニルオキサゾール（ａ−ＮＰＯをシンチレーターとして使用する。ある実施態様においては、テルフェニルをシンチレーターとして使用する。別の実施態様においては、ＺｎＳｅをシンチレーターとして使用する。
好ましくは、複数の段階の開始方法が、光開始剤を用いるＸ線助長重合のために使用される。シンチレーター及び光開始剤の組み合わせを用いる開始のメカニズムは、複数の段階の開始方法であると考えられる。最初に、Ｘ線は、溶剤分子を活性化して、電子的に励起された溶剤分子を形成する。励起された溶剤分子は、急速に、それらの励起エネルギーを、電気的に励起されたシンチレーションを形成するシンチレーターに移送する。次いで、シンチレーターの励起状態は、光子の放出により基底状態へリラックスされる。放出される光子は、光開始剤により吸収され及び活性遊離基を形成する。遊離開始剤遊離基は、モノマーのビニル官能基と接触し及び重合方法を開始する。方法は、以下のように表現され得る：Ｘ線ｈγ--励起溶剤分子*--励起シンチレーター分子*--ＵＶ又は可視的ｈγ'--励起開始剤分子*--開始剤遊離基-ポリマー基。
Ｘ線照射重合は、ホモポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリテトラヒドロフラン、樹脂、エポキシ又は架橋された材料、及び多孔性ポリマー支持体、例えば、分離媒体をカラム、膜又は他のハウジングにおける材料の形状に製造するために使用することができる。方法は、任意の形状において成形された部分の製造のために使用され得る。ある実施態様においては、ポリスチレンが、エネルギー源としてＸ線照射を用いることにより製造される。ポリスチレンは、狭い開口部を有するガラスバイアルの金型において及びシリンダーの形状において製造される。液体混合物重合及びバルク重合の双方は、ホモ多孔性スチレン（ホモポリスチレン）材料を製造するために使用される。他の実施態様においては、ポリグリシジルメタクリレート樹脂は、同一の方法を用いることにより製造される。別の実施態様においては、多孔性ポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）が製造される。別の実施態様においては、多孔性ポリ（グリシジルメタクリレート−ｃｏ−エチレングリコールジメタクリレート）ポリマー支持体が製造される。
Ｘ線は、ミクロメートルからメートルの断面を有する多孔性モノリシックポリマー支持体のために使用することができる。Ｘ線照射された重合は、毛管及びミクロボア(microbore)の分析カラム、従来の分析カラム、及び予備及び方法カラムを含むモノリシック液体クロマトグラフカラムを製造するために使用される。ある実施態様においては、１ｃｍの内部直径を有するガラスカラムにおける多孔性モノリシック支持体が製造される。カラムは、ＳＥＭ、ポロシメトリー及びクロマトグラフィーにより特徴付けられる。
このガラスハウジングにおけるポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）モノリシックカラムは、ペプチドの優秀な分離を示す。Ｘ線は、深さにおいて材料を貫通することができる。有機及び無機ポリマーの双方は、Ｘ線又はγ線を用いて製造される。高エネルギーＸ線及びγ線は、高度な深さにおいて材料をトラベルする。より高度なそのような深さが必要とされる場合には、未重合混合物がＸ線ビームにおいて置かれてもよく、及び全体的な時間平均照射が、重合されるボディをとおして十分均一であるように選択される方法で回転及びトランスレートされる。クロマトグラフ流の意図される方向において調整される照射は、照射ビームの吸収のために床において有意なクロマトグラフ不均一性を生じないことに留意されたい。軸に関する不均一性は、必ずしも、放射状不均一性のように性能を悪化させない。
低エネルギーＸ線は、浅い深さで材料を貫通するが、使用に安全である。ある実施態様においては、低エネルギーＸ線を使用して、３．５ｃｍの直径を有するガラスカラム内の多孔性モノリシック支持体を製造した。他の実施態様においては、８８ｍｍの直径を有するポリマー性カラムハウジングにおけるモノリシック支持体を製造する。重合の温度は、Ｘ線光子の強度及びエネルギーを制御することにより及び少なくとも片側の反応混合物が制御されるようなウォータージャケットにより制御される。好ましくは、そのような水冷却は、その軸方向においてカラムを冷却するが、熱勾配を避けるためにラジアル方向においては異なり及び不均一性を形成する。全ての流路が、クロマトグラフ流の方向において同一の不均一性を経験し、及び従って、分離の際の影響を有さない。この大きな直径のカラムの中心における重合温度は、全体的重合方法の間のカラムのエッジにおける重合温度とほぼ同一である。モノマーの転化は、４日間の重合後に完了する。
Ｘ線照射された重合は、熱重合と組み合せることができる。重合速度及び多孔性は、重合の速度により制御することができ、それは、Ｘ線のエネルギー及び強度、及び重合の温度により制御することができる。照射された重合方法の経済性及び安全性の考慮において、Ｘ線の低エネルギー及び強度は、好ましくは、大きな直径のモノリシックポリマー支持体の製造において使用される。モノマーの転化は、３．５ｃｍ直径カラムにおいて重合の４８時間後に７０％を越えて完了である。重合速度をスピードアップし及び短時間での転化を終了するために、開始剤に対応する所望の温度での熱的重合が使用される。ある実施態様においては、多孔性ポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）が、Ｘ線を用いて、それに次ぐ、Ｘ線照射された重合後の７０℃での熱的重合により製造される。ポリマーの多孔性は、モノマー組成、Ｘ線強度及びエネルギー、開始剤及びシンチレーターの組み合わせの選択、及びＸ線照射された重合及び熱的重合の双方における重合温度により制御され得る。重合方法において使用されるポロゲン溶剤は、先に記載した純粋な熱的重合において使用されるものと同一である。優秀なポリマー支持体は、液体クロマトグラフィーの使用のために得られる。
紫外線及び可視光線照射は、従来は、ホモポリマー、スラブ型ポリマー樹脂及び多孔性ポリマー表面コーティングを含むが、本発明におけるポリマー材料は含まないポリマーを製造するために使用されてきている。ＵＶ及び可視光線の双方は、薄い、固形の透明材料を貫通し得る。紫外線及び可視光線は、薄い、透明材料、例えば、膜を製造するために使用されてきている。多孔性ポリマーの均一性は、材料の厚さが上昇すると問題が大きくなる。これは、多孔性固形材料を通した光の分散及び弱化による。光が固形材料をトラベルする深さは、材料の屈折率及び官能基に依存して急速に低減する。２相：アクリル樹脂屈折率約１．５及び空気（屈折率１．００）からなるアクリル酸の、乾燥多孔性カラムを考慮されたい。これは、この材料が白墨、白色及び不透明にみえるように完全に光を散乱させる。従来は、これらの外観の相違は、重合のためにＵＶ又は可視光の使用を防止してきた。
紫外線及び可視光は、高い均一性を有する上記に挙げた材料を含むポリマー材料を製造するため及び多インチ厚さであるポリマー材料を製造するために使用することができる。紫外線及び可視光を用いてカラムを製造する方法及びカラムのある実施態様においては、光の選択された波長で標的ポリマー樹脂に非常に似た又は同一の屈折率の溶剤を重合のために選択する。選択された波長での光は、わずかに使用されたクリスティアンゼン効果(Christiansen Effect)のために重合の間ポリマーを通してトラベルし、その中において、標的多孔性樹脂は、完全に半透明又は透明になる。特定の波長範囲における光は、透明性を示し、なぜなら、差遺贈が溶剤で満たされているからである。好ましくは、そのポリマー固形体及び溶剤の双方における屈折率が非常に近い単色光が重合のために選択される。熱よりむしろ光により活性化される開始剤は、光開始剤と共に使用される。白色光が使用される場合、透過光線は、特定の波長に相当し、そこでは、ポリマー固形体及び溶剤又は溶剤の組み合わせの双方における光の屈折率が非常に似ている。光開始剤は、付近の透明ポリマー及び溶剤波長範囲において光により吸収及び活性化されるように選択される。開始剤は、この波長範囲を吸収する。
好ましくは、光開始剤が活性化される場合、それは、オリジナルの発色団を欠くフラグメントに崩壊(break up)される。そのようなフラグメントは、光の選択された波長の範囲において吸収性を有さない。光線が、光開始分子における発色団により吸収される場合、結果は、表面での局所的重合である。発色団がこの反応を切り抜ける場合、それらは、次の光開始剤分子を活性化することから次の光線をブロックするようにそこに存在し、従って、重合をオリジナルの表面に制限するであろう。従って、光は、より深くポリマー混合物を通してトラベルし得及び光の透過率が上昇する。この効果は、漂白効果として知られる。これに関連して良好な光開始剤は、２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンであることを見い出した。漂白効果及びクリスティアンゼン効果は、非常に厚い層、又は深い多孔性ポリマーの生成において光開始又はｅ−線開始により相乗的である。後者のケースにおいては、Ｘ線は、溶剤を励起し、それは、次いで、蛍光を発して開始剤を活性化するいわゆる“増感剤”に第２エネルギーを伝える。Ｘ線により励起されたときの溶剤がまたそれ自体蛍光を発する場合、追加の程度の相乗効果が存在する。多くの場合、ｐ−テルフェニルはＸ線重合のための増感剤として使用される。使用される蛍光溶剤は、多くのアリール化合物、例えば、トルエン、ｏ−、ｍ−、又はｐ−キシレン、又は１，２，３（又は他の異性体）メスチレン(mestylene)を含む。ある実施態様においては、ホモ−ポリ（グリシジルメタクリレート）は、ポロゲン溶剤としてｏ−キシレンを用いる普通の液体混合物重合により製造される。Ｏ−キシレン、モノマー及び特にはポリマーの屈折率が近い。液体混合物における得られるポリマーは、透明に近いが、白色光のマイナーな散乱のためにすこし透明である。
標的ポリマーの屈折率が測定される。良好な及び乏しい双方の溶剤は、標的ポリマーの屈折率に近い屈折率を有するように選択される。溶剤の比を調整することにより、溶剤混合物の屈折率は、ポリマーとほぼ同一であろう。従って、溶剤により膨張されるポリマーを通した光の透過率は、最大に達し得る。ある実施態様においては、多孔性ポリメタクリレートベースのモノリスは、溶剤の組み合わせを用いることにより製造される。
大きな直径を有する温度−時間適切化ポリマープラグを製造する際、重合の間、不均一重合温度により生じる不均一ポリマー性モノリスを避けることが必要である。均一ポリマーは、所定の断面において分離−有効開口部の細孔サイズ分布のモードにおいて２５％未満の変化を有するべきであり及び好ましくは、行われる大抵の分離について２％未満の変化を有するべきである。本件明細書においては、モードは、分布曲線のピークである。分布曲線は、細孔サイズ（開口部）の異なる直径での多孔性材料のユニット質量あたりの細孔量の割合である。不均一重合温度は、放熱よりも発熱の速度が速いときに生じる。不均一重合温度を有する傾向は、重合の自動促進(self-acceleration)により上昇され、それは、幾何学的に不均一な方法において時々制御することが困難な方法において熱の上昇を生じる。重合の自動促進の傾向は、重合温度の上昇及びゲル効果の組み合わせにより上昇される。
均一重合温度を有するために、発熱速度は、放熱速度と同一である必要がある。所望の重合温度は、重合の間の発熱及び放熱の平衡速度により決定される。放熱速度は、重合温度を最適化することにより発熱速度と等しいように制御することができる。
重合の自動促進は、重合温度が十分に低いときに生じない。低い重合温度では、開始剤及び重合からの遊離基発生の速度が遅い。ポリマーラジカルは、ゲルの高い粘度のためにポリマーラジカル又は開始剤ラジカルのコリジョンにより終了する傾向にないが、低い重合速度及び遊離基発生速度は、水素移動又はポリマー鎖再配列のために重合の終了の機会を上昇させる。全体的重合速度は、活性ポリマーラジカルの終了の逆効果のために上昇されない。
重合の自動促進は、重合温度が閾値温度より高い場合に生じる。この閾値温度は、モノマーの重合又は共重合速度により変動し及び重合混合物、例えば、ポロゲン及びモノマーの環境に依存する。異なるポロゲンは、ポリマー及び開始剤ラジカルにおけることなる終了効果を有していてもよい。異なるモノマーは、異なる重合速度及び終了速度を有する。従って、低温度は、ゲル効果のために重合の自動促進を避けつつ発熱及び放熱をバランス化するために選択することができる。本発明の実施態様においては、低温度は、重合の自動促進を避けるために及び重合方法の一部の間で大きな直径のカラムを含む異なる直径のカラムにおいて発熱及び放熱速度を制御するために重合のために使用され及びゲル効果は、重合方法の他の部分において高温を後に可能にする。例えば、この方法を用いるある重合においては、周囲重合温度を使用して、直径５０ｍｍ及び長さ２５ｃｍのカラムにおいて多孔性分離媒体を製造した。
しかしながら、低温で重合するいくつかの環境下における不利な点は、剛性の欠如である。これは、おそらくは、ポリマーマトリックスの架橋の程度が、多孔性ポリマーが溶剤において膨張するように十分高くないことによる。それは、また、低温でのモノマーの転化が十分に高くなく、それにより、マトリックスにおいて分離−有効開口部の巨大なサイズが生じることによる。追加の大きな細孔は、多孔性ポリマーが、中又は高圧、又は中又は高流量下でクロマトグラフィー分離のために有用でないように劇的にポリマーの強度を低減する。しかしながら、低温での初期重合後の重合温度の上昇は、架橋の程度及びモノマーの転化を改良し得る。本発明においては、重合温度は、多孔性ポリマーマトリックスの剛性を改良するために架橋の程度及びモノマーの転化を改良すべく初期重合後に上昇される。高温硬化プロセスを使用して、多孔性ポリマーの剛性を改良する。本発明のある実施態様においては、７０℃を使用して、周囲重合温度での低温度重合後の多孔性ポリマーを硬化する。本発明の別の実施態様においては、６０℃を使用して、４０℃での低温重合の血のポリマーを硬化する。
クロマトグラフィー分離のための多孔性ポリマーマトリックスの非常に重要な特徴は、分離−有効開口部サイズの分布の均一性である。低温及び高温重合の組み合わせは、多くの場合、異なる位置での異なる重合温度により生じる分離−有効開口部のサイズの相違によりマトリックス内に分離−有効開口部のサイズの不均一な分布を生じる。多孔性ポリマーマトリックスの分離−有効開口部のサイズは、ある程度のモノマーの転化及びある程度の架橋後に多孔性ポリマーのクロマトグラフ特性に影響するのに十分高い温度により変化しなかった。この点に達した後の重合温度の更なる上昇は、多孔性ポリマーのクロマトグラフ特性に影響するのに十分な分離−有効開口部のサイズの分布を変化させないが、代わりに、モノマーの転化の程度及び架橋の程度を上昇させることによりポリマーマトリックスの剛性が改良される。
本発明においては、重合温度及び時間を最適化して、高い程度のモノマーの転化及び架橋を達成し、及び重合の発熱及び放熱速度を釣り合わせて、クロマトグラフィー分離に十分良好である分離−有効開口部の均一なサイズ分布を達成した。重合温度を、更に、上昇させて、モノマーの転化及び架橋の程度を改良した。重合温度及び重合時間の段階のプログラムを使用して、クロマトグラフ用途及び均一な分離−有効開口部サイズ分布を必要とする他の用途のための多孔性分離媒体を製造した。例えば、本発明のある実施態様においては、所望の重合長さで重合温度を周囲温度から７０℃に上昇させる最適化されたプログラム段階を使用して、良好なクロマトグラフ特性を有する多孔性ポリマーマトリックスを製造した。
いくつかの重合について、安全点で重合温度及び時間におけるプログラムされた段階での上昇は、良好な分離媒体を提供したが、他の重合については、これは、十分に良好ではなかった。代替手段をそのようなケースにおいてプラグを改良するために利用可能である。また、代替手段は、所望の程度の転化及び架橋を達成するための重合時間を低減し得る。この代替手段は、その状況下で利用可能であり、その中においては、所望の架橋程度及び転化が、重合温度があまりに低いために達成されないかもしれず、それは、発熱及び放熱速度を釣り合わせるため及び／又は最初の手段における重合の自動促進を避けるために必要とされる。
代替手段は、低温重合でモノマーのある量の転化後に重合温度のゆっくりとした直線的上昇を使用する。この代替方法では、重合の間に発熱及び放熱の釣り合いを維持しつつ重合速度を上昇させ、重合時間を短縮し、モノマーのポリマーへの転化の程度を上昇させる。この状況において上昇温度での発熱は、ある量のモノマーの転化後の重合の間のモノマーの濃度の低減のために早くなかった。重合の自動促進は、また、モノマーの低減された濃度のために生じない。本発明においては、重合温度の線状的勾配を最適化して、重合温度及び高温硬化方法を結合して、クロマトグラフ分離のための多孔性ポリマーの分離−有効開口部のサイズの最適分布を達成した。
本発明のある実施態様においては、周囲温度から７０℃の重合温度の直線的勾配を、良好なクロマトグラフ特性を有する多孔性ポリマーの製造のために使用した。本発明の別の実施態様においては、４０℃での初期重合及び６０℃での硬化の組み合わせでの４０℃から６０℃の重合温度の直線的勾配を使用して、良好なクロマトグラフ特性を有する分離媒体を製造した。
重合温度のプログラムされた段階、複数段階又は直線的上昇は、大きな直径のカラムに適用可能であるだけでなく、媒体のクロマトグラフ特性を改良するための小さな直径のカラムの製造のために特に有用である。この方法が、小さなものから大きな直径のカラムのクロマトグラフカラムの製造をスケールアップするために使用できることを見い出した。本発明のある実施態様においては、全く同じプログラムの温度を使用して、４．６及び３４ｍｍの直径を有するカラムを製造して、分離媒体の同一のクロマトグラフ特性を達成した。本発明の別の実施態様においては、プログラムされた温度を改良して、３４ｍｍ直径のカラムを製造する。
図１８においては、時間の横軸、温度の左軸縦座標及び重合の完了の割合の縦座標の右軸を有し、２つの実線曲線３５４及び３５６及び２つの点線曲線３６４及び３６６を有するグラフ３５２が示される。曲線３５４は、温度を示す曲線であり、及び、曲線３６４は、自己持続温度未満の重合混合物における温度を維持するカラムの表面における低い一定の温度での重合のための経過時間の異なる量についての完了の割合を示す曲線である。重合は、急速に上昇し、及び次いで、あまりに低い重合の値でレベルオフする。低温は、剛性及び不均一ポリマーの欠如を生じる。剛性の欠如は、ゲル硬化が有意になり及び分離−有効開口部のサイズを望ましくないサイズに上昇させるとすぐに架橋を低値へ低減する低温の結果である。一般に、不均一性ポリマーを生じるいくつかの摂氏温度の表面及びカラムの中心の間の温度の上昇があるであろう。曲線３６６は、重合の温度勾配方法のための安全点３６０から実質的に完全な点３６２へ及び制御開始点３５８及び安全点３６０の間の経過時間の異なる量のための完了の割合を説明する。
カラムの表面の温度は、よりゆっくりと上昇し及び制御開始点３５８及び安全点３６０の間の重合速度は、ゆっくりと上昇し及び安全点３６０まで重合混合物の温度の有意な上昇をもららさない。制御開始点３５８前の温度は、重合が開始される点まで早く上昇し及び次いで立体障害がほとんどなく及び反応するためのアンプルモノマーが存在するため非常にゆっくりである。安全点３６０で、立体障害が上昇し、及び、低減されるモノマー及び温度の量が上昇されて、一層の架橋を引き起こし、及び、重合反応を完了に導く。カラムの表面での上昇速度は、重合混合物の組成及びモノリスの所望の特徴により変動するが、制御開始点及び安全点の間において、一般に、時間あたり５℃未満で及び安全点に達した後は、一般に、時間あたり１５℃より高い。
図１９においては、その温度を測定するのに十分近くに位置するサーミスタ３８０を有する中心縦軸３７４及びカラムにおけるこの４分の１の点でその温度を測定するために十分近くに位置するサーミスタ３８２を有する中心縦軸及び外表面３７８の間の中ほどに想像上の同心カラム３７６を有するカラム３７２の断片的断面図が示される。外部表面の温度は、加熱又は冷却手段により制御されるが、好ましい実施態様においては、水浴であり、その温度は、任意の手段、例えば、サーミスタ３８４により測定することができる。
カラム３７２を横切る温度プロフィール３７０は、それが、温度勾配重合の１つのモードの間に現れうるので示される。このモードの温度勾配重合においては、カラムの外側温度は、カラムの中心での温度と同一温度で維持され及び双方の温度は、カラムの外側表面での温度を制御することにより次第に上昇するように引きこされる。温度プロフィール３７０により説明されるように、放熱及び外部温度と実質的に同一に発熱の発生速度を維持するレベルに反応速度を制御するようにゆっくりした速度で外側温度が上昇する温度は、中心での上昇速度と等しい外側表面での上昇速度でゆっくりと上昇し、同心円筒で低い点が存在する。この低い点は、外側温度の２及び２分の１程度内(within two and one half degrees)及び好ましくは均一性の１程度内(within one degree)で維持されるべきである。温度が次第に上昇することは、ゲル効果のために部分的に補正することが意図され、及び、重合のために必要とされる時間を低減するために開始点及び安全点の間のカラムにおける発熱の観点から均一ポリマーでの良好な速度の重合を維持する。
図２１は、以下のクロマトグラフ条件を有する温度−時間適切化カラムにおける分離のクロマトグラムである：（ａ）サンプル：（１）リボヌクレアーゼＡ、（２）シトクロムＣ及び（３）リゾチーム；（ｂ）カラム：２４時間における４０〜６０℃の勾配温度での重合及び次いで１２時間６０℃で硬化することにより製造されるＷＣＸ（３５ｍｍ Ｉ．Ｄ．による２５０）；（ｃ）移動相：バッファーＡ：１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ＝７．６、バッファーＢ：１Ｍ ＮａＣｌ（バッファーＡ中）、ｐＨ＝７．６、勾配：２０〜５０％Ｂ（４ＣＶ中）、次いで、５０〜１００％Ｂ（０．８ＣＶ中）；流量：５０ｍｌ／分。
本件明細書において記載される透過性ポリマーは、ある適切な構造より一層有し得る。ある構造は、いくつかの標的用途のために望ましい分離−有効開口部サイズ分布を有する。一般に、それは、分離のために高い表面積を提供する少なくとも１つの方向において３００ｎｍより小さな分離−有効開口部、及び例えば、通過する主要移動相のための５００ｎｍより大きな、分離をほとんど又は全く提供しない大きな不規則開口部を含む。好ましくは、分離−有効開口部のサイズは、５０〜２００ナノメートルであり、及び、大きな不規則開口部は、中及び低圧分離について２〜５μｍ（２〜５ミクロン）及び高圧分離について０．６〜２μｍ（０．６〜２ミクロン）である。分離−有効開口部サイズ分布及び不規則特徴サイズ分布は、ポロゲン、モノマー、開始剤及び重合温度、時間及び圧力のタイプ及び量により制御することができる。ある実施態様においては、モノマーは、所望の官能性を有するのみならず、重合の反応速度論及びポリマー構造を変化させることによりカラム効率を改良するのを助長するように選択され、それは、より一層同じ分離−有効開口部サイズ分布を生じる。モノマーの比は、同一目的のために選択される。ポロゲンのタイプ及び量は、所望の分離−有効開口部サイズ分布の発生についての慎重な研究後に選択される。重合の間の圧力の使用及び選択は、所望の分離−有効開口部サイズ分布の発生及びカラム全体にわたる分離−有効開口部サイズ分布の均一性のために特に重要である。それはまた、従来のシールされた又はオープン重合において生じる不規則なボイド及び壁チャンネルの形成を防止する。
微小孔の形成が、重合の間の圧力を用いること及び他の重合条件及び試薬の慎重な調整により劇的に低減又は予防され得ることを見い出した。分離−有効開口部を有するこのポリマーの走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）の研究から、ポリマー粒子形態は、サンゴのいくつかの形態に似ていることを見い出した。サンゴ様ポリマーは、増大(accretion)により明らかに成長する相互接続波型粒子から形成される。これらの粒子の内部は非多孔性である。表面は、高度に波型をとり及び種々のサイズの開口部を有する、非常に多くの小さなオープンシャローグルーブ(open shallow groove)を含む。ポリマーの１つのＳＥＭ研究においては、粒子は、浅い深さの開口部を有する構造のコア−シェルである。個々の粒子において細孔を通すことなしのこれらの例外的な波型ポリマー構造及びコア−シェル粒子構造は、粒子又はビーズ内に微小孔及びメソ細孔を多く含有する従来のマクロ多孔性媒体において物質移動問題を避けつつ規則的非多孔性分離媒体に比べてモノリスのキャパシティを高度に改良する。これらの構造は、また、文献に開示された細孔を通すいわゆる“撒き散らしビーズ(Perfusion Beads)”又はモノリスとは劇的に相違する。内部力がポリマーを膨張又は拡大する傾向にあるとき拡大に対して容量を保持することにより又は圧力の適用によりいくつかのカラムにおいて粒子の凝集を調節することは、粒子の凝集された実質的に円形の凝集体よりむしろスタックされた一般にフラットなネスト化構造を生じる。
本発明におけるモノリスは、非多孔性粒子パッキング及び高いキャパシティのマクロ多孔性パッキングの高い分解(resolution)の利点を、それらの問題を避けつつ組み合せる。これらの波型粒子は、モノマー及び活性オリゴマーにより包囲され及び膨張されるポリマー核からの増大、及び他のポリマー核でのマージング(merging)により成長し得る。これらの粒子は、各々、凝集し、及び架橋により強化される。この構造は、微小孔において、及び粒子の細孔においてサンプル分子のトラッピングの防止により高度にカラム効率を改良し、それは、理論モデルに従ったゾーン拡大のための主要理由の１つである。粒子、凝集体又はクラスターのサイズは、より均一であるように微細に調整され、及び分離−有効開口部サイズ分布は、改良されて、先に議論した他の因子の選択との組み合わせでの圧力の慎重な制御により高い分解分離が得られる。
液体クロマトグラフィーにおけるより親水性の化合物の満足のいく分離は、多くの場合、有機溶剤を用いないで１００％の水である出発移動相を必要とする。このタイプの分離は、純粋なスチレン／ジビニルベンゼン、ポリメタクリレート及びＣ４、Ｃ８、Ｃ１２及びＣ１８を含むそれらの誘導体（非常に疎水性である）では満足のいく程度まで達成され得ない。ポリマーは、低有機溶剤含量で水性移動相においてシュリンクする。シュリンケージは、カラム壁及びポリマー媒体の間にボイドスペースを生じ、それは、クロマトグラフィーにおいていわゆる“壁チャンネリング”を導く。結果として、サンプル及び移動相は、媒体をバイパスし及び媒体の代わりに壁チャンネルを通過する。サンプルは、保持されず又は部分的に保持され、それは、各純粋サンプルのために複数のピークを生じる。
ある実施態様においては、壁効果が避けられるが、これは、最初に、純粋な水又は塩液体混合物を媒体に通すことによる最大程度まで媒体をシュリンクすること、及び次いで、壁及びポリマー媒体間のボイドスペースがシールされるまでピストンフィッティングで媒体を圧縮することによる。ピストンは、ナットフィッティングにより場所に置かれる。フィッティングは、図３及び４に示される。壁ボイドのシュリンケージ及びシーリングは、カラムの逆圧を最初に低減し次いで上昇させることによりモニターすることができる。この方法は、分離方法の間、“壁チャンネリング”の形成を防止する。ある実施態様においては、ポリマーは、純粋な水のシュリンクであり及びＰＥＥＫピストンフィッティングで圧縮される。本発明の別の態様においては、ポリマーは、１モル／ｌ ＮａＣｌ混合物におけるシュリンクであり及びＰＥＥＫピストンフィッティングで圧縮される。
高度に極性の環境においては、線状ポリマー鎖、及びポリマー表面上のＣ４、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１８の鎖は、サンプル分子及び媒体の表面の間の乏しい相互作用を生じる表面へ崩壊(collapse)する。また、床は、媒体及び移動相の極性の極度の差のために移動相により非常に乏しく湿潤される。物質移動及びサンプル及び静止相の間の相互作用は非常に乏しく、それは、低いカラム効率及び分解を生じる。これらの問題及び“壁チャンネリング”の問題は、サンプル保持及び分離のために望ましい疎水性を維持しつつポリマーマトリックスの親水性を上昇させることにより低減される。
ポリマーマトリックスは、親水性官能基、例えば、ヒドロキシル、アミド、カルバミド又はポリマー繰り返しユニット中の親水性成分を含む。ポリマーは、ポリマーマトリックスの親水性のために水により湿潤及び膨張され得る。ポリマー媒体の表面は、更に、高度に疎水性のポリスチレン鎖、又は逆相クロマトグラフィーにおける疎水性相互作用のためのＣ４、Ｃ８、Ｃ１２及びＣ１８鎖を含む。水中のポリマーのシュリンケージは、低減され又は完全に防止され、それは、また、壁チャンネリングの問題を解決する。親水性は、親水性基を含むモノマーの直接共重合により、又は親水性基を導入するためのポリマーの改質により改良され得る。
本発明のある実施態様においては、親水性ヒドロキシルエチルメタクリレートが、水中の疎水性相互作用の崩壊及び“壁チャンネリング”の防止のためにスチレン及びジビニルベンゼンと共重合される。本発明のある実施態様においては、ステアリルアクリルアミドが、ステアリルメタクリレート及びエチレングリコールジメタクリレートと共重合される。親水性モノマーの添加は、また、逆相カラムにおいてタンパク変性を低減し得る。ある好ましい実施態様においては、アクリロニトリルが、スチレン及びジビニルベンゼンと共重合される。ポリマーは、親水性モノマーの親水性が上昇するにつれ一層膨張する。親水性基を含有するポリマーで構築された逆相分離媒体は、水性及び非水性液体混合物の双方において膨張するであろう。これは、水性移動相における逆相分離媒体の適用性を大きくする。
現場での重合を使用して、任意のサイズ及び形状を有するカラムを製造することができる。ある実施態様においては、内部直径７５マイクロメートルの環状形を有する毛細血管カラムを製造した。別の実施態様においては、４．６ｍｍＩＤを有するカラムを製造した。別の実施態様においては、８８ｍｍＩＤを有するカラムを製造した。別の実施態様においては、１００マイクロメートル及び７００マイクロメートルまでの断面を有する正方形毛細血管カラムを製造した。別の実施態様においては、３ｍｍ厚さ及び１ｃｍ内部直径のポリマーディスクを製造した。別の実施態様においては、１ｃｍの外径４．６ｍｍの内径を有するドーナツ型モノリスを製造した。別の実施態様においては、１００マイクロメートルの内部直径グルーブを有するマイクロチップカラムを製造した。
疎水性の相互作用クロマトグラフィーは、マイルドな疎水性を有する非常に親水性の分離媒体を必要とする。低い疎水性炭素鎖又はポリマー鎖を有するマトリックスの親水性の更なる上昇の際、逆相媒体は、疎水性相互作用媒体へ調整することができる。
通常の相クロマトグラフィーは、親水性媒体を必要とし、その表面は、親水性官能基により十分にカバーされている。ポリ（グリシジルメタクリレート−ｃｏ−エチレングリコールジメタクリレート）におけるエポキシ基の加水分解を、従来技術において使用して、通常の相分離媒体を得た。通常の相分離媒体は、親水性官能基、例えば、ヒドロキシル及びアミドを含有する親水性モノマーの現場での直接重合により製造される。ある実施態様においては、ヒドロキシルエチルメタクリレートを、架橋剤、例えば、ＥＤＭＡを用いて共重合して、通常の相媒体を得る。本発明のある実施態様においては、カラムハードウェアは、ガラス繊維で強化されたポリプロピレンバレルである。
従来技術に従って製造される逆相モノリシック媒体は、極度に低いキャパシティを有し、及び、分離の間圧縮される。媒体の剛性及び液体クロマトグラフィー媒体の荷重キャパシティは、媒体の架橋密度を上昇させることにより上昇される。架橋密度は、多量の架橋剤、例えば、ジビニルベンゼンを、ポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）モノリスにおいて使用することにより上昇される。本発明のある実施態様においては、１００％の架橋剤が、ジビニルベンゼン（８０％純度、それは、商業的に入手可能な最も高い純度グレードである）である。キャパシティは、従来技術において製造されるモノリスより６倍高い。加圧重合下で製造される高キャパシティモノリスは、高分解性及び高キャパシティを有する。本発明のある実施態様においては、全モノマーにおいて９０％のジビニルベンゼン（８０％純度）が使用される。別の実施態様においては、全モノマーにおいて８０％のジビニルベンゼン（８０％純度）が使用される。
媒体の剛性及び分解性を改良する別の方法は、カラム内の全ポリマー密度を上昇させることによる。全ポリマー含量は、混合物における全モノマー含量を上昇させることにより上昇される。重合混合物における全モノマー含量を上昇させることにより、カラムの分解性が良好に改良される。分離−有効開口部サイズ及びその分布は、重合混合物における全モノマー濃度により高度に影響を受ける。本発明のある実施態様においては、全モノマーの４６質量％を使用して、媒体の剛性及び分解性を改良する。
従来技術において製造されるモノリシック媒体は、分解性が乏しく、分解速度が低く、剛性が低く及びキャパシティが極度に低い。従来技術のモノリシックポリメタクリレートベースの弱アニオン交換体は、ニートなジエチルアミンでのポリ（グリシジルメタクリレート−ｃｏ−エチレングリコールジメタクリレート）の改質により製造した。それは、水において、大規模に膨張し及び高い流速では使用することができない。この媒体は、非常に低い剛性を有し、及び、６ｃｍ／分より高い流速で安定でない。カラムの逆圧は、ランの間上昇を維持する。親水性媒体の剛性を改良する２つの方法が提供される。
第１に、媒体の剛性は、ポリマーマトリックスの架橋密度を上昇させることにより改良することができる。低い架橋密度では、水により溶媒和され及び溶剤へ広がる多くの非架橋線状ポリマー鎖が存在する。ポリマーマトリックスは、この高溶媒和のために膨張する。ポリマーにおけるポリマーマトリックスの膨張は、相互関連粒子間の間質腔及び分離−有効開口部のサイズを狭める。多孔性が、また、低減される。これらは、高い逆圧を生じる。高度に溶媒和された多孔性ポリマーは、ソフトゲルの特徴を有する。圧力下で、ソフトポリマーは、容易に圧縮することができ、及び、高い圧力を導く。圧力の上昇は、更に、媒体を圧縮し及び更に高い圧力を導く。圧力上昇及び圧縮のサイクルは、従来のモノリスを、高速分離における適用に有用でなくする。
架橋密度の上昇の際、膨張性線状ポリマー鎖は、短縮され及び膨張は低減される。分離−有効開口部を有するポリマーは、より剛性になる。分離有効開口部を有する構造は、水性溶剤において保持される。高い多孔性及び大きな分離−有効開口部サイズは、高度に架橋されたポリマーマトリックスについて得ることができ、それは、圧縮及び圧力上昇の有害サイクルなしに使用されるべき高い流速を可能にする。高速分離は、高い流速を用いることにより達成することができる。
本発明のある実施態様においては、鉄交換体の架橋密度は、７０％架橋剤、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）を用いることにより高度に改良される。好ましい実施態様においては、ＥＤＭＡの量は、５０％である。別の好ましい実施態様においては、ＥＤＭＡの量は、６０％である。ＥＤＭＡは、鉄イオン交換基を含有するそのコポリマーより一層疎水性である。ＥＤＭＡの量を上昇させることにより、ポリマーマトリックスの親水性が低減される。これは、膨張の低減をもたらし及び剛性を改良する。これは、水性相におけるポリマーの高い剛性が高度に望まれるときに親水性の架橋剤のかわりにより疎水性の架橋剤を用いることによる更なる利点である。
第２には、ポリマー分離媒体の剛性及びカラム効率は、双方とも、本発明において制御された改質により改良される。グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）は、それが、鉄交換体官能基を含むように改質される前は疎水性である。従来技術のモノリシック弱アニオン交換体（ＷＡＸ）におけるＧＭＡは、ニートのジエチルアミンを用いて６０℃で３時間反応させることにより改質される。ニートのジエチルアミンは、ポリマーを膨張させ得及びポリマー粒子に拡散して、ＧＭＡエポキシド基にアクセスする。この改質反応は、分離−有効開口部表面におけるＧＭＡ基のみならず、ポリマーマトリックス内のものも改質する。鉄交換官能基を含有する親水性基は、改質の後、分離−有効開口部の内側及び外側の双方で疎水性主鎖と混ざる。非選択的改質は、全ポリマーマトリックスを水において拡大的に膨張させるが、いくつかの疎水性主鎖は、分離有効開口部の表面に暴露される。分離開口部の表面における疎水性パッチは、イオン交換クロマトグラフィー分離の間の第２疎水性相互作用を生じ、それは、ゾーン拡大を導く。
ポリマー粒子の表面上のＧＭＡの制御された改質は、粒子の内部をより疎水性に及び水においてより少ない膨張性に維持し得る。表面ＧＭＡの改質後、粒子の表面は、高度により親水性となり及び水分子を引き込む。そのより疎水性の主鎖は、ポリマー粒子の内部へリトリート(retreat)して、粒子のより親水性のコアに滞在し、及びクロマトグラフィー分離の間非常に極性のバッファー環境から離れる。これは、親水性イオン交換基を有する表面のカバーを上昇させ及び第２疎水性相互作用からのゾーン拡大を防止する。制御された表面改質は、低い温度での水性液体混合物において触媒された改質反応により達成される。触媒は、好ましくは、現場でプロトンを生じ得る三又は試薬である。
本発明の好ましい実施態様においては、ジアルキルアミン塩化水素塩を触媒として使用する。塩液体混合物は、非常に極性であり及び疎水性ポリマーを膨張させる傾向が低い。イオン性触媒は、非常に疎水性の内部マトリックスへ拡散する代わりに液体混合物に滞在する傾向がある。より低い反応温度は、ポリマーの膨張性を低減する。ジエチルアミンは、ポリマーマトリックスに拡散するが、低温でのＧＭＡとのジエチルアミンの反応は、非常に遅く及びたいしたことがない。本発明のある実施態様においては、ジアルキルアミン塩化水素触媒は、ジエチルアミン塩化水素である。本発明の別の実施態様においては、触媒は、トリメチルアミン塩化水素である。本発明のある実施態様においては、反応温度は、２５℃である。本発明の別の実施態様においては、改質温度は、３０℃である。
モノリシック弱カチオン交換体の合成のための従来の方法は、膜、ビーズ及びゲルをベースとしており及びそれらの全てが、モノリシックカラムの現場での製造方法において直接的に使用することができない。弱カチオン交換体を製造する７つの方法を以下に記載する。これらの方法における全ての改質反応は、選択された温度で連続的にカラムを通して改質液体混合物をポンプすることにより行われ、又は、試薬は、カラム内部にシールされ及び試薬がカラムにポンプされた後、加熱浴又はオーブンにおいて加熱する。
第１方法は、クロロ酢酸塩でのポリ（グリシジルメタクリレート−ｃｏ−エチレングリコールジメタクリレート）（ＰＧＭＡＥＤＭＡ）の２段階改質である。クロロ酢酸ナトリウムを使用して、ヒドロキシルエチルメタクリレートベースの材料を改質して、文献におけるカルボン酸基を得た。モノリスの改質のための上記反応の利点を得るために、ＧＭＡにおけるエポキシド環を最初に開いて、ヒドロキシル基を得たが、これは、１Ｍ Ｈ2ＳＯ4水性液体混合物を用いて加水分解することによる。第２段階においては、クロロアセテートが、ポリマー内のヒドロキシル基と結合して、カルボン酸基をポリマーに結合させる。この反応は、強塩基、例えば、水酸化ナトリウムにより触媒される。反応温度は、４０〜８０℃、好ましくは、５０〜７０℃である。反応時間は、１〜２４時間で変動し、好ましくは６時間未満である。本発明のある実施態様においては、改質反応は、５Ｍ水酸化ナトリウム水性液体混合物をモノリシックカラムを通して６０℃で２時間ポンプすることにより行う。この媒体のキャパシティは、理想的ではないが、カラム効率は良好である。キャパシティは、より長い反応及びより高い反応温度で上昇させることができる。しかしながら、分離媒体は、ポリマー内のエステルの副加水分解反応のためにソフトになる。架橋密度は、架橋剤ＥＤＭＡが良好に加水分解されるので低減される。
第２方法は、試薬としてグリコール酸を用いてカルボン酸官能基を得るためのポリマーにおけるＧＭＡの１段階改質である。グリコール酸は、ＰＧＭＥＤＭＡと、４０〜９０℃の温度で、１〜２４時間反応させる。この反応は、自己触媒反応であり、なぜなら、グリコール酸が触媒自体であるからである。反応は、他の強酸、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により触媒することができる。反応は、単純であるが、弱カチオン交換体のキャパシティは、パラレルな副反応のために低い。エポキシド環は、副反応としての加水分解により開かれ得る。この反応を防止するために、非水性溶剤を使用する。好ましくは、プロトン含有溶剤を使用する。本発明のある実施態様においては、ギ酸含有ＴＦＡ触媒におけるグリコール酸液体混合物をカラムを通して３時間８０℃でポンプする。
第３方法は、グリコール酸及びクロロアセテートの双方でのＰＧＭＥＤＭＡの二重改質である。二重改質反応のいくつかの利点がある。第１には、それらが、全て、水性液体混合物において行われ得ることである。第２には、両反応段階が所望の生成物を導くことである。第３には、第１工程の副反応が、第２段階改質のための所望の官能基を導くことである。第４には、二重改質反応の条件が、マトリックスの剛性を維持する主鎖の加水分解を避けつつ同一又はより高いキャパシティを得るため単一反応よりマイルドであり得ることである。本発明のある実施態様においては、第１反応は、触媒としてＴＦＡを含有するグリコール酸水性液体混合物において行われ及び第２反応は、ＮａＯＨ水性液体混合物によるクロロアセテートの置換反応である。
第４方法は、グリコール酸及びクロロアセテートのワンポット反応である。二重逐次反応の代わりに、両試薬を重合の間一緒に液体混合物に置く。グリコール酸との反応は、酸触媒の代わりに塩基触媒である。この方法は、第３方法の利点を有するが、水中のグリコール酸による塩基性触媒環開口部反応の反応性が低いためにキャパシティが低い。
第５方法は、アクリレート又はメタクリレートの加水分解反応である。エステル基の加水分解により、カルボン酸官能基が導かれる。ＰＧＭＥＤＭＡ膜又はビーズの直接加水分解は、当該技術分野において知られている。しかしながら、得られる媒体は、良好なキャパシティ又は分離のいずれも有していなかった。研究において発見したことは、分解性及びキャパシティの双方が親水性及び疎水性アクリレート又はメタクリレートをハイブリッドすることにより劇的に改良され得ることである。加水分解反応は、高度により効率的であり、なぜなら、水分子が粒子の表面に拡散し及びアクリレートの親水性基のためによりよく表面を湿潤させ得るからである。反応は、酸及び塩基、例えば、ＴＦＡ又はＮａＯＨ水性液体混合物により触媒され得る。本発明のある実施態様においては、ポリ（メチルメタクリレート−ｃｏ−ヒドロキシルエチルメタクリレート−ｃｏ−エチレングリコールジメタクリレート）を製造し及び加水分解して、弱カチオン交換体を得る。本発明の別の実施態様においては、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート−ｃｏ−エチレングリコールジメタクリレート）を加水分解する。本発明の別の実施態様においては、ＰＧＭＥＤＭＡを、最初酸により及び第２工程において塩基により加水分解する。この方法において得られる弱カチオン交換体は、主鎖架橋剤の加水分解のためによりソフトである。
第６方法は、アクリル酸又はメタクリル酸の直接共重合である。酸の直接共重合は、ある工程において弱カチオン交換体を導く。この方法は、製造方法を非常に単純化させる。弱カチオン交換体のキャパシティは、改質方法より比較的高いが依然理想的ではない。架橋モノマーに対する酸性モノマーの比は、２〜３０％、好ましくは、５〜１５％である。酸モノマーの高い含量について、キャパシティは、高いが、媒体はよりソフトである。直接重合方法は、モノリシック膜、カラム、チップ、チューブ又は任意のフォーマット（従来技術において知られる）の製造に適用可能である。
第７方法は、直接共重合及び制御修飾の組み合わせである。この組み合わせが、媒体の剛性を保持する間、高キャパシティに至ることが、本発明において発見された。得られた媒体は、高流速を用いて、高処理の分離のために使用され得る。アクリル又はメタクリル酸の直接重合により改良されたキャパシティは、多量の酸を含む媒体の柔軟さに起因して極限に達する。酸性モノマーは、不規則に、これらのマトリックスの至る所に重合及び分散される。これらの酸は、バッファにおいて塩に転換され及び水性移動相において媒体の広範囲の増大をもたらされる。また、炭素鎖及びエステルからなる疎水性の主鎖は、イオン交換クロマトグラフィ分離の間、二次疎水性相互作用をもたらす表面に暴露される。これは、ゾーンの広がり及びテーリング（tailling）に到る。疎水性表面は、キャパシティを改良する間、更に、修飾されて、親水性になり得る。制御修飾（controlled modiｆication）は、媒体の柔軟さを防止する間、キャパシティを改良し及び媒体の親水性を改良する。過修飾媒体（overmodified media）は、表面での修飾のそばで粒子の内部で修飾に到る。弱アニオン交換の分離において議論されるように、粒子の内部の修飾は、圧力上昇及び圧縮の有害な循環に到る形態の分離−有効開口部又は変化を阻害する広範囲の増大をもたらす。本発明のある実施態様において、弱カチオン交換は、第一工程における、アクリル酸、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）及びＥＤＭＡの共重合、及び第二工程におけるメチルメタクリレートの加水分解により製造される。ＭＭＡの加水分解は、及び極めて親水性のアクリレート塩の存在により促進され及び塩基触媒され、それは、ＮａＯＨと反応後のアクリル酸の変換産物である。
直接重合及び修飾の組み合わせのこの手順は、多数の官能基及びマトリックスの剛性を同時に必要とするすべての親水性高分子支持体の製造に適用できる。それは、モノリシックチューブ又はカラム、モノリシック細胞膜、モノリシック毛管及びシップ又は異なる型におけるいくつかの他のモノリス、及びポリマー粒子、ゲル、細胞膜又はいくつかの他のタイプのポリマー分離媒体の製造において、適用できる。特に、モノリシック細胞膜の分解及びキャパシティは、この方法を用いて改良され得る。改良は、その場方法により又はオフライン方法により達成され得る。直接重合により得られるモノリシック又はビーズは、反応液体混合物を充填カラム又は細胞膜を通してポンプ移送すること、又は変性液体混合物内にそれらを浸すことにより修飾され得る。ビーズは、変性液体混合物において懸濁され得る。この方法を使用することにより、高キャパシティ強アニオン交換（ＳＡＸ）及び強カチオン交換（ＳＣＸ）は、開発された。
モノリシック強アニオン交換を製造するための先行技術方法は、細胞膜、ビーズ及びゲルに基づき及びモノリシック強アニオン交換カラムの製造のために適用されない。そのままでモノリシック強アニオン交換カラムを製造する方法は、下に提供される。
方法１は、高度硬質ポリマー及び表面の制御修飾の組み合わせである。トリメチルアミン塩化水素でのＰＧＭＥＤＭＡの変性を、使用して、細胞膜及びビーズベース強アニオン交換を得られている。反応が、モノリシック強アニオン交換の製造のために使用される場合、得られる媒体は、柔軟であり及び高速分離のために使用され得ない。剛性は、本発明におけるモノリシック弱アニオン交換の製造におけるような２つの方法：高架橋結合密度及び制御修飾反応において改良される。
ＳＡＸのための塩基性ポリマーは、架橋結合モノマー対機能性モノマーの高い比を使用することにより、配合されて、高架橋結合密度を含む。架橋剤の量は、ポリマーにおける全モノマーの５０％より多くに増加される。本発明のある実施態様において、全モノマーにおける６０％のＥＤＭＡが、使用される。ポロゲン及びそれらの比は、比較的低圧で、選択されて、最適な分解を提供する。
制御修飾は、ＰＧＭＥＤＭＡの触媒アミノ化により達成される。触媒は、当該技術分野において知られるいくつかの基本であり得る。本発明のある実施態様において、トリメチルアミンは、触媒として利用される。触媒の量は、液体混合物の１％〜５０％、好ましくは１０％〜３０％の間の値である。反応温度は、１０〜６０℃の間、好ましくは２０〜５０℃の間である。反応時間は、１０分間〜２４時間の間、好ましくは１〜４時間の間である。選択される触媒反応は、粒子の内部より粒子の表面を修飾し、それは、媒体をもたらして、高流速で使用される。本発明のある実施態様において、反応は、４０℃で３時間実行される。
方法２は、第四アミンを含むモノマーの直接共重合、又はそのままで第四アミンを発生し得るそれらの中間体である。本発明のある実施態様において、第四アミンを含む機能性モノマーは、２−（アクリロイルオキシエチル）トリメチルアンモニウム硫酸メチル（ＡＴＭＳ）である。ポリマーは、高架橋結合密度を有する。全モノマーにおける架橋結合モノマーの比は、５０〜７０％の間である。本発明のある実施態様において、６０％のＥＤＭＡが、使用される。ＡＴＭＳの量は、２％〜２０％の間、好ましくは５％〜１５％の間である。モノマーの残りを作る第三モノマーは、親水性モノマー例えばＨＥＭＡであることが好ましいが、疎水性モノマーは、同様に使用され得る。
方法３は、方法２と１において示される直接重合及び制御表面修飾の組み合わせである。方法１により得られる強アニオン交換は、硬質であり及び高分解を有する。しかしながら、それは、非理想性キャパシティに悩まされる。方法２は、キャパシティを改良するが、十分ではなく及び低分解に悩まされる。直接重合及び制御表面修飾の組み合わせは、キャパシティを二倍にし及び分解及び回復を改良する。タンパク質の回復は、表面が、親水性タンパク質の良性基により、十分に覆われるときから、改良される。低タンパク質回復のための主な理由である第二疎水性相互作用は、最小減にされる。ポロゲンは研究され及び、所望な流速を提供するために選択される。本発明のある好ましい実施態様において、ブタンジオール、プロパノール及び水の組み合わせが、ポロゲンとして使用される。重合混合物及び条件が、配合されて、所望の流量で最適な分解を提供する。
モノリシック強カチオン交換を製造する先行技術方法は、細胞膜、ビーズ及びゲルに基づき及びモノリシック強カチオン交換カラムのその場調整に移転可能ではない。そのままでモノリシック強カチオン交換カラムを製造する３つの方法は、下に提供される。
方法１は、有機溶剤において可溶である強塩基により触媒されるブタンサルトン又はプロパンサルトンでのＰＧＭＥＤＭＡの修飾である。触媒としてＮａＯＨ液体混合物を使用して、プロパンサルトンでのＰＧＭＥＤＭＡの修飾が、使用されて、細胞膜又はビーズ−塩基性強カチオン交換を製造されている。反応は、プロパンサルチンが、ＮａＯＨ水性液体混合物において可溶でないときから、２相反応であった。２相反応混合物は、カラムを通してポンプ移送されず、修飾を実行し得ない。それぞれのアプローチが、なされて、修飾反応を実行している。
アプローチ１は、第一工程において、強塩基例えばｔ−ブトキシドカリウムでの媒体の活性化次いで、ブタンサルトンでの求核性の環−開始反応からなる２−工程の変性反応である。ブタンサルトンは、それが、液体であり及びプロパンサルトンが、固体である（室温で）ときから、好ましい。ｔ−ブトキシドカリウムは、それが、そのナトリウム対応品より高度な溶解度を有するときから、好ましい。溶剤は、試薬例えばジメチルスルホン（ＤＭＳＯ）の良好な溶剤である。変性液体混合物は、その場変性のためにカラムを通してポンプ移送されるために、均質でなければならない。アプローチ２は、活性化及び変性工程の双方からなるワンポット反応である。強塩基及びブタンサルトンの双方は、強溶剤において溶解される。液体混合物は、継続的にカラムを通してポンプ移送され又は選択される温度で数時間シールされる。反応温度は、好ましくは、８０〜１２０℃の間である。本発明のある実施態様において、９０℃が、使用される。本発明の別の実施態様において、１２０℃が、使用される。
方法２は、強カチオン交換基を含むモノマーの直接重合である。本発明の好ましい実施態様において、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）は、スルホン酸基を含む機能性モノマーとして使用される。ＡＭＰＳの量は、２％〜２０％、好ましくは、５％〜１５％の間である。このポリマーのキャパシティは、第一方法と比較して大いに改良される。重合混合物が、配合されて、所望の流速で最適な分解を提供する。
方法３は、直接重合及び制御修飾の組み合わせである。本発明のある実施態様において、ＡＭＰＳは、ＧＭＡ及びＥＤＭＡで共重合される。ポリマーは、更に、方法１において記載されるように制御修飾により修飾される。キャパシティ及び分解の双方は、方法１及び２と比較して、大いに改良される。ＥＤＭＡの量は、好ましくは、５０％〜７０％の間である。ＡＭＰＳの量は、好ましくは、２％〜１５％の間である。モノマーの残りは、ＧＭＡである。本発明の別の態様において、ＡＭＰＳは、ＨＥＭＡ及びＥＤＭＡで共重合される。ポロゲンは、研究され及び選択されて、所望の流速を提供する。重合混合物は及び条件は、改良されて、高分解及び高速クロマトグラフィを提供する。
ＳＣＸのためにスルホン酸基を含むためのヒドロキシ含有ポリマーマトリックスのヒドロキシルの制御修飾は、以下の方法を使用することによりかなり有効であることがわかった。この方法のある実施態様において、コポリマーマトリックスにおけるグリシジルメタクリレートは、加水分解されて、２つのヒドロキシル基を含んだ。これらのヒドロキシル基は、更に、クロロスルホン酸で修飾された。この方法の代替バージョンにおいて、修飾は、クロロスルホン酸のピリジン塩液体混合物で実行された。第一方法は、図２０の式１及び２において示され及びこの方法の第二変法は、図２０の式３において示される。
その場重合方法による有効なクロマトグラフィ分離のための大きな直径のモノリシックカラムの製造は、発熱重合により形成されるポリマーの熱遮断効果に起因して、極めて異なるタスクである。熱移送が、モノリスの中心とモノリスの表面の間で最も短い距離（この文書において半径として記載される）が、カラムハ−ドウェアの物質に依存して、８ｍｍ未満である限り、重合温度の不均一を防止するのに十分な速度であることが見つけられた。
重合課題の低減熱を用いて、大きい直径のモノリシックカラムを製造するためのある技術は、複数の段階的な重合を使用することである。この技術において、重合の型が、良好な熱移送物質でできている場合、重合の各段階において得られるポリマーモノリスは、最大８ｍｍまで有する。これは、８ｍｍ未満の半径を有するカラムを第一製造すること及び第二段階重合のために充填剤としてそれらを使用することにより達成され、その中において、充填剤及びカラム壁の間で重合液体混合物の半径はまた、８ｍｍ未満であり、及び充填剤間の距離は、２ｍｍ未満である。２ｍｍ未満の充填剤間で重合液体混合物の厚さは、重合温度の変化に重要でない効果を有することが、この研究において、知られる。複数の薄いポリマーカラムは、大きな直径のカラム内に充填され及び第二段階の重合混合物で充填される。カラムは、重合の間、標準のフィッティング（fitting）でシールされて、加圧を可能にする。大きな直径のカラムは、次いで、恒温加熱槽又はオーブン内に置かれて、第二段階重合を実行する。薄いカラムは、加圧又は非加圧重合を伴う上に開示される方法により製造される。第一段階重合において製造される薄いモノリシックカラムは、好ましくは、洗浄することなしに及び更に修飾なしに保存される。第二段階重合のための重合混合物は、媒体のタイプに依存して、第一段階重合の重合混合物と同一又は異なる。
この方法において、８ｍｍ未満の半径を有する薄いカラムは、固体ロッド、ディスク、８ｍｍ未満のシリンダー壁の厚さを有する中空管、又は膜であり得る。上の厚さのカラムの形は、当該技術分野において知られるいくつかの形、例えば丸い、長方形
、三角形などであり得る。充填剤は、この明細書における充填材の部分において記載される他の粒子であり得る。
本発明のある実施態様において、５ｍｍの半径を有する複数の薄いカラムが、使用される。本発明のある好ましい実施態様において、５０ｍｍ×１０ｍｍサイズのＩ．Ｄ.を有するモノリシックポリマーロッドは、充填剤として使用される。本発明の別の好ましい実施態様において、１０ｍｍ×３４ｍｍのサイズのＩ．Ｄ.を有するモノリシックポリマーロッドは、充填材として使用される。本発明の別の好ましい実施態様において、種々の内外の直径を有するモノリシックポリマーシリンダーは、充填剤として使用される。
大きな直径のカラムを製造するための別の技術は、早く記載されるように温度−時間節度を使用することである。この技術を使用することにおいて、弱カチオンカラム及び強アニオンカラムは、製造されていて及びそれは、他のタイプのカラムが、同様に温度−時間節度で製造され得るこれらの結果から理解される。弱カチオンカラムを製造するある方法は、容器内に１部のＧＭＡを４〜６部のＭＭＡ及び１０〜１４部のＥＤＭＡに対して及び開始剤を含む重合混合物を適用すること及び混合物が、均質液体混合物にまるまで、穏やかに混合物を振動することの工程を含む。次いで、ポロゲンは、均質液体混合物内に添加され及び新規混合物が、均質になり、重合液体混合物を形成するまで振動される。重合液体混合物は、通常、この時点で脱水され及びカラムは、重合液体混合物で充填される。もちろん、液体混合物は、ポリマー混合物を混合するために容器又は容器の一部としてカラムを使用して、最初に、製造され得た。重合液体混合物は、温度−時間節度条件下でカラムにおいて重合されて、プラグを形成し及びプラグは、洗浄されて、ポロゲンを除去する。
いくつかのタイプのカラムについて、カラムは、好ましくは、更に圧力を重合液体混合物に適用する意味を含む。これらの実施態様において、カラムが、シールされ及び重合が開始した後、圧力は、早くに記載されるように重合混合物に適用され得る。ある実施態様において、重合混合物は、３５〜４５℃の間の制御開始点で出発して勾配温度で重合され及び１２時間で安全点に徐々に増加し及び５５〜６５℃の間の温度で２４時間硬化される。別の実施態様において、重合混合物は、３５〜４５℃の間の温度で７２時間重合され及び次いで、５５〜６５℃の間の温度で２４時間硬化される。
同様に、強アニオンカラムは、容器内に２〜４部のＧＭＡを２〜４部のＡＴＭＳに対して、７〜１１部のＥＤＭＡに対して及び開始剤を含む重合混合物を適用すること、混合物が、均質液体混合物になるまで穏やかに混合物を振動すること、均質液体混合物内にポロゲンを秤量すること及びそれを、新規混合物が、均質になって、重合液体混合物を形成するまで振動すること、液体混合物を脱水すること、重合液体混合物で充填すること及び重合液体混合物をカラムにおいて温度−時間節度条件下で重合して、プラグを形成することにより製造されている。プラグは、次いで、洗浄されて、ポロゲンを除去し得る。
弱カチオン交換の製造におけるように、カラムは、圧力を、更にカラムをシールすることの工程を含む重合液体混合物に適用し及び圧力を重合混合物に適用するための意味を含み得る。ある実施態様において、重合混合物は、３５〜４５℃の間の値での制御開始点で出発し及び５５〜６５℃の間の安全点に徐々に増加する勾配温度で１２時間重合され及び５５〜６５℃の間の温度で２４時間硬化される。別の実施態様において、重合混合物は、３５〜４５℃の間の温度で７２時間重合され及び次いで、５５〜６５℃の温度で２４時間硬化される。
毛管カラムの性能はまた、早くに記載される手順により改良され得る。ある方法は、ポロゲン溶剤（porogenic solvent）の正しい組み合わせを選択して、圧力を伴うか伴わないかで分離媒体を作り出すことである。ポリマーの正しい極性及び溶媒力を有する溶剤の選択は、カラムの分離有効性に影響を与え得る小気孔又は微小孔を伴わない多孔質ポリマー支持体をもたらし得る。重合の間の圧力の使用は、更に、媒体の均一性を改良し及び微小孔の生成を回避するであろう。ある実施態様において、内部直径３２０マイクロメーターの毛管カラムは、クロロシクロヘキサン及び１−デカノールを含む溶剤の組み合わせを用いて製造されて、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）の圧力を伴うか伴わないかでサンプル分子の弱い物質移動もたらす微小孔又は小気孔を含まないモノリシック多孔質ポリマー支持体を作り出す。別の実施態様において、１−エチルヘキサン酸を含む溶剤及び鉱油の組み合わせは、使用されて、圧力を伴うか伴わないかで微小孔を含まないモノリシック多孔質材を製造する。
Ｘ−線、ＵＶ−ビス（bis）の使用は、毛管の性能を大いに改良し得る。Ｘ線は、低エネルギーで及び低い強度損失で貫通し得る。Ｘ−線は、ほとんど強度損失なしで毛管を貫通し得る。感光剤又はシンチレータは、効果的に溶剤により移送されるＸ−線エネルギーを吸収し及び蛍光又はリン光を液体混合物において均質的に放出し得る。均質の蛍光及びリン光は、重合液体混合物において均質的に重合を開始する開始剤により吸収され得る。これは、モノリシック分離媒体及び粒子を含む多孔質ポリマー支持体の多孔質構造の均質性に到る。これは、モノシリック毛管のカラム有効性を大いに改良する。エネルギー源としてＸ−線を使用する低温度重合は、低重合温度に起因して遅い重合比をもたらす。Ｘ−線の強度及びエネルギーの細かい調節は、均質な分離媒体の生成に到り得る所望な重合比をもたらす。重合の間の、Ｘ−線、シンチレータ／感光剤、正しい溶剤力を有する溶剤及び圧力の使用は、大いに改良された性能に到るサンプル分子と同様のサイズを有する微小孔又は小気孔を有さない分離媒体の生成に到り得る。ある実施態様において、毛管カラムは、Ｘ−線をエネルギー源として使用して製造されている。別の実施態様において、マイクロチップカラムは、エネルギー源としてＸ−線で製造されている。
ポリマーにとても近い反射指数を有する溶剤の正しい選択は、光が、少ない損失の光強度で毛管を通して移動するのを可能にし、それは、クリスチャンセン効果として知られ及び早く記載される。漂白効果を有する開始剤の使用は、強度のごくわずかな損失でＵＶ−ビス光が毛管カラムを通して移動するのを可能にする。光は、重合液体混合物において均質である。均質光の吸収は、クリスチャンセン効果及び漂白効果の考慮なしで重合を開始されるＵＶ−ビス又は熱加熱(thermal heating)により進む開始と異なる重合の均質開始をもたらす。これは、液体混合物における均質重合の生成に到る。結果として、より均質多孔質構造は、形成され得る。これは、毛管カラムのかなり改善された性能に到る。良好な溶剤力の溶剤、加圧された重合での上の方法の組み合わせは、カラム性能に影響を有さない微小孔又は小気孔を含まない均質媒体の生成に到り得る。ある実施態様において、毛管カラムは、ＵＶ−ビス光を使用して製造されていない。べつの実施態様において、マイクロチップは、ＵＶ−ビス光を使用して製造されていない。
実施例
以下の実施例における可変の多くの他の値が、予想できる結果でのこの記載から選択されるが、以下の制限されない実施例は、本発明を説明する：
概要
通常、以下の実施例における各タイプの媒体の製造は、３つの主な工程を含み、それは、以下である：（１）ポリマーマトリックスの製造；（２）所望な官能基を含むためのポリマーマトリックスの修飾；及び（３）媒体の特性決定。
初めに、製造の主な工程は、個々のサブ工程を含み、それは、以下である：（１ａ）モノマー、ポロゲン及び開始剤のタイプ及び量を変化することによる重合混合物の配合；（１ｂ）真空及びヘリウムパージにより重合混合物を脱水すること。（１ｃ）型としての管組織の異なる直径及び物質を有し、高い頻度で、キャップ又はストッパーでシールされたカラムの１つの端を有する空カラムの集成；（１ｂ）重合混合物でカラムを充填すること；（１ｅ）キャップ又は特別に所望なフィッティングで型の他の端をシールして、重合の間加圧すること；（１ｆ）ガラスカラムが、使用される場合、液体混合物を１つの開口端を有する型において余熱し及び水圧、気圧又は機械圧を含む多様な圧力源を使用して選択された圧力を適用すること；（１ｇ）恒温加熱槽又はオーブンにおいて選択された温度で型を置くこと；（１ｈ）種々の量の時間で重合すること；（１ｉ）重合後、加熱槽の外にカラムを出し及び通る洗浄液体をポンプ移送するためのカラムフィッティングを有する加圧デバイス又はシーリングキャップを交換すること；及び（１ｊ）有機溶剤及び／又は水でカラムを洗浄すること。
第二に、修飾方法は、以下を含む：（２ａ）種々のタイプ及び量の反応物質及び触媒で修飾反応混合物を配合すること；（２ｂ）５床容量より多くの修飾液体混合物をカラムを通して移送し及びそれをシールすること、又は継続して液体混合物をよりポンプ移送すること；（２ｃ）恒温加熱曹において種々の温度及び時間で修飾反応を実行すること；及び（２ｂ）カラムを有機溶剤及び水で洗浄すること。
カラムは、液体クロマトグラフィ分離、ポロシメータ、ＢＥＴ表面積測定、走査電子顕微鏡法、ＵＶ光分法及び目視観測を含む種々の方法を使用して特性決定される。液体クロマトグラフィ特性決定は、異なる速さで分離の種々のモードを含む。通常使用されるデバイス、方法は、以下の先行具体例において記載される。
重合液体混合物のガス抜き
重合混合物は、超音波脱気剤を使用して、５分間水流吸引器により作り出される真空によりガス抜きされる。それは、最小２０分間液体混合物をパージすることにより続けられる。
安定及び調整方法
イオン交換カラムは、修飾反応後の洗浄工程に続く安定及び調整の手順に付された。強アニオン交換のガラスカラム（１００×１０ｍｍＩ．Ｄ．）のための安定及び調整の手順は、以下のようであった：ｐＨ７．６で０．０１ｍｏｌ／ｌのトリス．ＨＣｌバッファーの流速は、直線的に、１分で０ｍｌ／分〜２０ｍｌ／分増加し及び０．５分間維持した。圧縮液体は、２分での勾配により同一バッファーにおいて１ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌに変化し、０．５分間維持した。ピーク−ライン（PEEK-lined））ステンレススチールカラムのための安定及び調整の手順は、最大流速が、２０ｍｌ／分の代わりに５ｍｌ／分だったことを除いて、上と同一である。最大流速に依存して他のイオン交換カラムのための手順は、可能であった。
特徴決定の手順
１．液体クロマトグラフィ（ＬＣ）分離での特性決定
１ａ．ＬＣ特性決定の方法１：タンパク質及びペプチドの液体クロマトグラフィ分離
移動相：
移動相Ａ（又はバッファーＡ）：
アニオン交換クロマトグラフィ：０．０１Ｍ トリス．ＨＣｌ（ｐＨ７．６）
カチオン交換クロマトグラフィ：０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
逆相クロマトグラフィ：水中の０．１５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
移動相Ｂ（又はバッファーＢ）：
イオン交換クロマトグラフィ：バッファーＡ中の１Ｍ ＮａＣｌ
逆相クロマトグラフィ：アセトニトリル（ＡＣＮ）クロマトグラフィ中の０．１５％ＴＦＡ
サンプル：
アニオン交換クロマトグラフィ：
０．６ｍｇ／ｍｌのミオグロビン、１ｍｇ／ｍｌのコンアルブミン（connalbumin）、１ｍｇ／ｍｌのオボアルブミン及び１ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤。
カチオン交換クロマトグラフィ：
１ｍｇ／ｍｌのコンアルブミン、１ｍｇ／ｍｌのオボアルブミン及び１ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤。
タンパク質のための逆相クロマトグラフィ：
１．５ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ、０．５ｍｇ／ｍｌのシトクロムＣ、１．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．９ｍｇ／ｍｌのカルボニックアンヒドラーゼ、１．５ｍｇ／ｍｌのオブアルブミン。
ペプチドのための逆相クロマトグラフィ：
３３ｇ／ｍｌのメチオニン−エンケファリン、レット−エンケファリン（Let-Enkephalin）、アンジオテンシンＩＩ、フィザレミン、物質Ｐ
サンプル製造：
１５ｍｌの目盛りのあるプラスティックのサンプル管において８ｍｌのバッファーＡを充填した；タンパク質サンプルの適切な量を秤量し及びそれらをこのサンプル管内に置いた；管をキャップでシールし及びすべてのタンパク質が、溶解するまで、穏やかに管をタンブル（tumble）した；サンプル管が達する１０ｍｌの印まで、バッファー液体混合物において添加した。
カラムは、以下によるタンパク質の製造により特性決定された
手順：カラムは、ｌｓｃｏ２３５０の２つのポンプシステムに結合された。ポンプＡは、０．０１ｍｏｌ／ｌのトリス．ＨＣｌバッファー（バファーＡ）を含み及びポンプＢは、１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌを含んだ（バッファーＡ（バッファーＢ）において）。移動相を、使用前に２０分間より多くヘリウムパージすることで脱水した。ＵＶ検出器を、０．０５の検出感度及びタンパク質分離のために２８０ｎｍ波長で（ペプチドのために２１４ｎｍ）セットした。サンプル注入の容量を、２０マイクトリットルだった。カラムは、２０床容量のバッファーＢにより第一清浄し及び４．６ｍｍＩ．Ｄ．カラムのための３ｍｌ／分（１０ｍｍＩ．Ｄ．カラムのための１０ｍｌ／分）で１５床容量のバッファーＡにより含んだ。分離を、４．６ｍｍＩ．Ｄ．カラムのための３ｍｌ／分及び１０ｍｍＩ．Ｄ．カラムのためのｌ０ｍｌ／分の流速で２０床容量のための０〜５０％勾配のバッファーＢにより達成した。
１ｂ．ＬＣ特性決定方法２：イオン交換の結合能力測定
イオン交換カラムの結合能力を、前端分析により測定した。カラムを、バッファーＢの２０床容量で清浄し及びバッファーＡの１５床容量で調節した。カラムを、溶離剤の吸収度の更なる増加がなくなるまで、バッファーＡ中の５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ又はリゾチーム液体混合物（アニオン交換及び逆相ためのＢＳＡ、及びカチオン交換のためのリゾチーム）を、カラムを通して移送することにより、サンプルタンパク質で飽和し、次いで１００％バッファーＡで非吸収タンパク質を清浄した。カラムに結合するタンパク質を、２０床容量のための、０〜５０％の勾配のバッファーＢにより溶離した。溶離されたタンパク質を、サンプルバイアルにおいて収集し及びタンパク質濃縮物を、２８０ｎｍでＵＶスペクトロメータにより決定した。カラムの全結合能力を、収集の容量で収集されたタンパク質の濃縮物を掛け算することにより計算した。
１ｃ．ＬＣ特性決定方法３：疎水性相互作用クロマトグラフィ
このカラムを、タンパク質の疎水性相互作用クロマトグラフィのために特徴決定した。リボヌクレアーゼ、シトクロムＣ、リゾチーム、ウシ血清アルブミン及びカルボニックアンヒドラーゼを含むタンパク質の混合物（ｐＨ７．０で０．０１Ｍ トリス．ＨＣｌバッファー液体混合物において１、０．３、０．２、１及び０．５ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍｌ／分の流速で、同一バッファーに対して、０．０１ｍｏｌ／ｌトリス．ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．６）中の０．５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌの１５分の勾配により製造した。
１ｄ．ＬＣ特性決定方法４：沈殿−再分解クロマトグラフィによるポリマー分子量決定
特性決定方法６を、沈殿／再分解クロマトグラフィを使用してポリマー分子量決定のために使用した。それぞれのポリマースタンダード（Mp：12,900、20,650、34,500、50,400、96,000、214,500、982,000）を、２．６ｍｌ／分の流速でメタノールにおいて１５％〜８０％ＴＨＦの６分の勾配により製造した。ポリマースタンダードを、５６ｍｇ／ｍｌの全濃物を有するメタノール中の５０％ＴＨＦにおいて溶解した。注入容量は、２０Ｆｌだった。
１ｅ．ヌクレオチドのＬＣ分離
Ｐｄ（Ａ）12-18のサンプル（水中の２．４ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍｌ／分の流速で、バッファーＡ中の３０％〜６０％勾配のバッファーＢ（Ａ＝２０％アセトニトリル及び８０％２０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム；Ａ中のＢ＝１ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）により分離した。
１ｆ．アニオン交換でのヌクレオチドのＬＣ分離
ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰのサンプル（水中のそれぞれ０．４、０．８、０．８ｍｇ／ｍｌ）を、ＬＣ特性決定方法１において特定されるように、バッファーＡにおける０〜５０％勾配のバッファーＢにおいて分離した。
番号実施例
実施例１
重合液体混合物を、以下のように製造した：１．２ｇのグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、０．８０ｇのエチレンジメタクリレート（ＥＤＭＡ）（重合混合物１）及び０．０２ｇの２，２＝−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を２０ｍｌのサンプルバイアル内に秤量し及びそれが、均質液体混合物になるまで、穏やかに混合物を振動した；２．５５ｇのシクロヘキサノール（ＣＨＯＨ）及び０．４５ｇのドデカノール（ＤＯＤＯＨ）をこの液体内に秤量し及びそれが、均質になるまで、それを振動した。重合混合物を、脱水手順におけるように脱水した。
空ステンレススチールカラム（４．６ｍｍの内部ｉ．ｄ．及び５０ｍｍ長さ）（その１つの端を、図４において示される圧縮デバイスによりシールした）を、カラムが、充填されるまで、この液体混合物で充填した。ステンレススチールのねじぶたにおいて包含されるピーク−プラグ（PEEK-plug）（それは、同一の形において示されるカラムのためのオリジナルのキャップだった）を、使用して、カラムの他の端をシールした。図３のデバイスを、注射器ポンプに接続した。水を、媒体として使用して、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）の圧力を作り出した。空気は、カラムの内側になかった。このカラムを、６０℃で垂直に水槽内に置き及び２０時間維持した。重合後、カラムを、水槽の外に出し及び室温に冷却した。
図３のデバイスは、圧力を解除した後、注射器から分離した。図３のデバイスを、開け及び注意深く、カラムから除去した。白色ポリマーは、カラムの外側に拡大した。ポリマーの長さは、図３のカラム及びデバイス内の重合液体混合物の高さより約２ｍｍ短いことがわかった。ポリマーのこの拡大した部分を、かみそりの刃により除去した。これを、次いで、オリジナルＨＰＬＣカラムフィッティングで取り付けた。カラムを、ＨＰＬＣポンプに接続し及び４５℃で２０分間０．５ｍｌ／分でアセトニトリルで洗浄した。
カラムのある端からのフィッティングを、分離し及び媒体を、他の端を通してカラム内に１０ｍｌ／分のアセトニトリルを移送することによりカラム外で加圧した。ポリマー媒体の壁面は、滑らかであることがわかった。ポリマーの頂点は、平らだった。
実施例１の比較バージョン
重合液体混合物を、以下のように製造した：（１）１．２ｇのグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、０．８０ｇのエチレンジメタクリレート（ＥＤＭＡ）(重合混合物１)及び０．０２ｇの２，２＝−アゾビイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を、２０ｍｌサンプルバイアル内に秤量し及びそれが、均質の液体混合物になるまで穏やかに混合物を振動し；及び（２）２．５５ｇのシクロヘキサノール（ＣＨＯＨ）及び０．４５ｇのドデカノール（ＤＯＤＯＨ）を、この液体混合物内に秤量し及びそれが、均質になるまでそれを振動した。重合液体混合物を、上の脱水手順で脱水した。
空のステンレススチールカラム（４．６ｍｍの内部ｉ．ｄ．及び５０ｍｍの長さ）（その１つの端を、ピーク−プラグによりシールした）を、カラムのためのオリジナルのふただったステンレススチールのねじぶたにおいて含んだ。カラムを、それが、充填されるまで、上の液体混合物で充填した。ピーク−プラグを、注意深く、カラムの頂点に置き及別のねじぶたでシールした。空気をカラムの内側に維持するべきではない。カラムを、垂直に水槽に６０℃で置き及び２０分間維持した。重合後、カラムを、水槽から出し及び室温に冷却した。
ピーク−プラグを、分離し及び白色ポリマーを、カラム内に観察した。カラムを
、次いで、オリジナルＨＰＬＣカラムフィッティングで取り付けた。カラムを、ＨＰＬＣポンプに接続し及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で０．５ｍｌ／分で２０分間洗浄した。
カラムの１つの端からのフィッティングを、分離し及び媒体を、他の端を通してカラム内に１０ｍｌ／分のアセトニトリル（ＡＣＮ）をポンプ移送することによりカラム外で加圧した。媒体の壁面は、多くの小さな不規則なくぼみを含んでいることがわかった。
他のカラムを、異なるモノマーを使用して製造した。不規則な空間を、ポリマーロッドの壁面で見つけた。２つのこれらのロッド及び加圧下で製造された１つのロッドのピクチャー（Picture）を、取り出し及び図７において示した。
実施例１の代替バージョン
実施例１の手順を、異なる重合混合物を、異なる割合及び機能性モノマー及び架橋剤の組み合わせを有して使用したことを除いて続けた。使用される機能性モノマーは、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、２−ヒドロエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、２−（アクリロイルオキシエチル）硫酸トリメチルアンモニウムメチル（ＡＴＭＳ）、アクリル酸（ＡＡ）、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、ステアリールメタクリレート（ＳＭＡ）、ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、スチレン（ＳＴ）及び４−エチルスチレン（ＥＳＴ）を含む。使用される架橋モノマー（架橋剤）は、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）を含む。異なる割合の機能性モノマー、架橋モノマー及びポロゲンを、使用した。ポロゲンは、異なるアルコール例えばシクロヘキサノール、ドデカノール、デカノール、１−ヘキサデカノール、ブタノール、プロパノール、イソ−プロパノール、エタノール、メタノール、１，４−ブタンジオール及び他のもの例えばトルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、１，２−ジメトキシエタン、１，２−ジクロロエタン、フタル酸ジメチル、２，２，４−トリメチルペンタン、１，４−ジキサン、２−メチルオキシメタノール、１，４−ブタンジオール、ｍ−キシレン、フタル酸ジイソブチル、テトラ（エチレングリコール）ジメチルエーテル、テトラ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）（Ｆ．Ｗ．１０００）、ポリ（プロピレングリコール）モノブチルエーテル（Ｆ．Ｗ．３４０、１０００、２５００）を含む。使用される開始剤は、２，２−プライム−アゾビソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）及びベンゾイルペルオキシドを含んだ。
モノマー及びポロゲンの各組み合わせのために、カラムを、製造し、研究し及び特徴決定した。
個々のカラムを、各重合混合物で個々の加圧条件下で製造した。加圧条件は、以下を含んだ：（１）重合の間、周囲に開口されたカラム；（２）重合の間、シールされたカラム；（３）ガスとして窒素を使用して、重合混合物に直接適用されたガスでカラムに適用されている加圧；及び（４）重合混合物と接触していて及びスプリング、水圧、ガス圧力のいずれかから又は上に記載されるデバイスを使用してピストン下位に又は機械力例えばスプリングが、使用される場合の修飾デバイスにねじ山をつけることにより加圧を適用する各々のゴム、プラスチック及び金属ピストン。
結果は、以下であった：（１）周囲圧が、存在するときの場合について、高いパーセンテージのカラム表面で不連続であった。カラム有効性又は分解は、再現可能ではなく；（２）カラムをシールした加圧条件について、高いパーセンテージのカラムが、表面で不連続を有し、カラム有効性及び分解は、再現可能ではなく；（３）ガスを適用したカラムについて、カラムの頂点の端表面は、柔軟及び不規則であり、及び壁面は、滑らかであった。分離クロマトグラフィは、より良好な再現性を有した。溶離ピークは、加圧が適用されなかった時よりも著しく；及び（４）再現性は、ピストンを使用した時とても高く及び分解は、使用されたすべての上の方法より良好であった。
実施例２
重合液体混合物を、実施例１のように以下の重合液体混合物で製造した：２．０ｇのＧＭＡ、２．５ｇの２−（アクリロイルオキシエチル）トリメチルアンモニウム硫酸メチル（ＡＴＭＳ、８０％）、６．０ｇのＥＤＭＡ、７．５ｇの１，４−ブタンジオール、６．７５ｇのプロパノール、０．７５ｇの水及び０．１ｇのＡＩＢＮ。
空のガラスカラム（１０ｍｍの内部ｉ．ｄ．及び１００ｍｍの長さ）（その１つの端は、図４において示される加圧デバイスによりシールした）を、カラムが充填されるまで、この液体混合物で充填した。ピークにおいて、同一の図において示されるねじぶたを含んだテフロン（登録商標）−プラグ（TEFLON-plug）を、使用して、カラムの他の端をシールした。図４のデバイスを、注射器ポンプに接続した。カラムの内側に空気はなかった。カラムを、６０℃で水槽内に垂直に置き及び１５分間維持した。カラムを、媒体として水を使用して注射器ポンプにより０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）に加圧し、及び２０分間維持した。重合後、カラムを、水槽から取り出し及び室温に冷却した。
図４のデバイスを、加圧が解除された後、注射器ポンプから分離した。図４のデバイスを、開口し及び注意深くカラムから除去した。ポリマーロッドの高さが、カラム内部の重合液体混合物の高さより４ｍｍ短かったことがわかった。カラムは、次いで、オリジナルＨＰＬＣカラムフィッティングで、取り付けた。カラムを、ＨＰＬＣポンプに接続し及び２ｍｌ／分で２０分間４５℃でアセトニトリルで洗浄した。
カラムのある端からのフィッティングを、分離し及び媒体を、他の端を通してカラム内に１０ｍｌ／分のアセトニトリルをポンプ輸送することによりカラムの外で加圧した。ポリマー媒体の壁面は、滑らかであることがわかった。ポリマーの頂点は、平らであった。
実施例２の代替バージョン
実施例２の方法を、加圧の変化及び加圧を適用する方法で続けた。異なる一定の加圧を、重合の間使用した。使用される加圧は、０．５５ＭＰａ、１．０３ＭＰａ、１．２４ＭＰａ、１．３８ＭＰａ、１．６５ＭＰａ及び２．０７ＭＰａ（８０ｐｓｉ、１５０ｐｓｉ、１８０ｐｓｉ、２００ｐｓｉ、２４０ｐｓｉ及び３００ｐｓｉ）を含む。これらのカラムの背圧は、異なった。これらのポリマーの粒子サイズがわかるポリマー構造の走査電子顕微鏡法はまた、異なった。
加圧の工程勾配を、重合の間重合混合物に適用した。勾配は、以下である：０．０２８ＭＰａ／分（４ｐｓｉ／分）は、０．０６９ＭＰａ（１０ｐｓｉ）から５分間増加し、０．０１４ＭＰａ／分（２ｐｓｉ／分）は、１０分間増加し、０．００６９ＭＰａ／分（１ｐｓｉ／分）は、２０分間増加し、０．００５５ＭＰａ／分（０．８ｐｓｉ／分）は、３０分間増加し及び次いで１時間内に１．２４ＭＰａ（１８０ｐｓｉ）に加圧を増加した。１．２４ＭＰａ（１８０ｐｓｉ）の最終加圧を、重合の間、２０分間維持した。
２時間の１．０３ＭＰａ〜１．２４ＭＰａ（１５ｐｓｉ〜１８０ｐｓｉ）の直線勾配を使用して、重合の早い段階で反応を加圧した。１．２４ＭＰａ（１８０ｐｓｉ）を、残りの重合の間、別の１８時間維持した。
これらのカラムを、トリメチルアミン水性液体混合物中（５０％容量）の０．４５ｇ／ｍｌの塩酸トリメチルアミンの５ｍｌの液体混合物においてポンプ移送することにより修飾した。カラムを、シールし及び水槽において４０℃で３時間加熱した。それらを、水の２０床容量で、修飾後すぐに洗浄した。これらのカラムを、ベッドスタビライゼーション（Bed Stabilization）にふし及び上に記載されるように調整した。それらを、イオン交換のための上のＬＣ特性決定方法のように特性決定した。すべてのこれらのカラムの背圧、粒子サイズ及び分離分解は、加圧方法で変化した。
異なる重合時間をまた、使用した。カラムを、重合時間が、２０時間の代わりに４４時間であったことを除いて、実施例２におけるように製造した。.
カラムを、１つの加圧源のみで１０チャンネルマニホールドを使用して、平行して製造した。製造されたカラムは、個別の製造方法より良好な再現性を有した。
粒子のポリマー形態及び内部構造を、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）で研究した。これらの粒子の内部構造が、当該技術分野において知られる他のモノリシック媒体において、多孔質の代わりに無孔であることがわかった。
実施例３
カラムを、実施例１及び２におけるように、以下の液体混合物で製造した：１７．５ｇのＤＶＢ、１９．８ｇのテトラ（エチレングリコール）、１０．２ｇのテトラ（エチレングリコール）ジエチルエーテル、及び０．１８ｇのＡＩＢＮ。アセトニトリルで洗浄後、カラムを、更に、１６ｍｌ／分の流速で２０床容量の水で洗浄した。双方の端に手動で置かれたピストンを、カラム内に圧縮した。カラムを、次いで、０．１５％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルで洗浄し及びＬＣ特徴決定方法１ａ及び１ｂにより特性決定した。
タンパク質及びペプチド双方の分離のためのこれらのカラムの分解を、比較例において製造されたカラムを超えて、大いに、改良した。キャパシティは、５回より多く高度であった。これらのカラムの背圧は、低かった。高度な分解を、０．１５％のＴＦＡを含む１００％の水から出発して移動相勾配で達成した。これらのカラムにおいて壁の効果は、見つからなかった。タンパク質及びペプチドを、水性相における壁効果に起因して、比較例からのカラムにおいてカラムの外で予備−溶離した。
実施例の比較バージョン
液体混合物の重合を、実施例１の比較例のように、以下の試薬を用いて製造した：３ｍｌのスチレン、２ｍｌのジビニルベンゼン、７．５ｍｌのドデカノール及び０．５ｇのＡＩＢＮ。カラムを、ＬＣ特性決定１ａ及び１ｂのように記載される逆相タンパク質及びペプチド分離で特性決定した。
実施例３の代替バージョン
実施例３を、ポロゲンの異なる組み合わせ、異なる炭素鎖の長さを含む異なるモノマー、異なる量の全モノマー含量物、異なる開始剤及び異なる収縮溶剤で続けた。
使用されるポロゲンは、以下を含む：Ｃ１〜Ｃ１２を含むアルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、１，２−ジメトキシエタン、１，２−ジクロロエタン、フタル酸ジメチル、２，２，４−トリメチルペンタン、１，４−ジキサン、２−メチルオキシエタノール、１，４−ブタンジオール、トルエン、ｍ−キシレン、フタル酸ジイソブチル、テトラ（エチレングリコール）ジメチルエーテル、テトラ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）（Ｆ．Ｗ．１０００）、ポリ（プロピレングリコール）モノブチルエーテル（Ｆ．Ｗ．３４０、１０００、２５００）。いくつかのこれらの溶剤の組み合わせにより、同様に、高度な分解カラムにいたった。アルコール及びそれらの組み合わせは、移動相のための大きなチャンネルを提供して、高度な分解を提供する間、低背圧を終えて流れ得る。分解を、同様に他の良好な溶剤で、細かく調節し得る。
使用されるモノマーは、メタクリル酸ブチル及びメタクリル酸ステアリルを、ポロゲンの上の組み合わせで含んだ。あるカラムを、以下の重合液体混合物で製造した：７ｇのＳＭＡ、１０．５ｇのＤＶＢ、１９．５ｇのエタノール、１３．０ｇのブタノール及び０．１８ｇのＡＩＢＮ。別のカラムを、以下の重合液体混合物で製造した：７ｇのメタクリル酸ラウリル（ＬＭＡ）、１ｇのＨＥＭＡ、１２ｇのＥＤＭＡ、３０ｇのドデカノール及び０．２ｇのＡＩＢＮ。他のカラムを、以下の重合液体混合物で製造した：７ｇのメタクリル酸ブチル（ＢＭＡ）、１ｇのＨＥＭＡ、１２ｇのＥＤＭＡ、３ｇの水、１６．５ｇのプロパノール、１０．５ｇの１，４−ブタンジオール及び０．２ｇのＡＩＢＮ。異なる炭素鎖の長さを含むこれらのモノマーの組み合わせは、異なる疎水性及び相互作用を提供し、それは、異なる疎水性及び特性決定で、サンプルのために高度な分解及び回復を提供した。例えば、メタクリル酸ブチルをベースとした媒体を、より疎水性タンパク質分離のために使用し及びメタクリル酸ステアリルをベースとした媒体は、より疎水性タンパク質、ペプチド又はオリゴヌクレオチド分離のために使用され得る。
架橋剤に対するモノマーの異なる比をまた、使用して、選択性及び分離を調節することができた。あるカラムを、以下の重合液体混合物で製造した：１．０５ｇのＳＭＡ、０．７５ｇのＤＶＢ、３．２５ｇのエタノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。
異なる開始剤をまた、使用した。カラムを、以下の重合液体混合物で製造した：１０ｍｌのジビニルベンゼン（８０％の純度）、３０ｍｌのドデカノール、１０ｍｌのスチレン及び０．２０ｇのベンゾイルペルオキシド。
異なる重合時間をまた、使用した。カラムを、重合時間が、２０時間の代わりに４４時間であったことを除いて、実施例３におけるように製造した。
異なる極性溶剤を、使用して、圧縮前にポリマーを収縮した。カラムを、実施例３のように製造し及び水洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌの２０床容量で洗浄した。手動で置いたピストンを、塩洗浄後、カラム内に圧縮した。０．１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ４．０）を出発移動相として使用した時、カラムは、壁効果を示さなかった。
これらの実験を、プラグを、重合後及び異なる加圧を用いて、異なる洗浄液体混合物及び異なる触媒で、水性液体混合物の存在下で加圧を伴うか伴わないかで、繰り返した。各ケースにおいて、加圧を、適用しなかった場合、外壁において不連続があり、及び特性決定の上で、再現性の欠如があり及びクロマトグラムのピークは、加圧を、水性液体混合物で洗浄することによる膨張後適用しなかった場合、より少なくプロナウンス（pronounce）した。
試験を、良好な結果で０．４１ＭＰａ（６０ｐｓｉ（平方インチあたりのポンド））及び０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）及び４．１４ＭＰａ（６００ｐｓｉ）を含む低加圧及び高加圧の双方の複数の加圧で行った。必要な圧力の量が、カラムの直径及び特定の重合混合物で変化するであろうが、満足の高い結果が、すべてのケースにおいてかなり低い加圧で得られ得ることが信じられる。加圧の上限値は、カラム壁及びフィッティングの長さである。
加圧の量はまた、加圧が、所望な分離−有効開口部サイズ、分離−有効性サイズの分布及びカラムの再現性と一緒に選択されるべきであるように、分離−有効開口部のサイズに影響を与える。
実施例４
カラムを、以下の液体混合物で実施例２のように製造した：９ｇのメタクリル酸グリシジル、９ｇのジメタクリル酸エチレン、０．１８ｇ、２１．６ｇのシクロヘキサノール及び６．３ｇのドデカノール。ポリマーの長さは、カラム内側の重合液体混合物の高さより約７ｍｍ短いことがわかった。カラムを、次いで、オリジナルカラムフィッティングで取り付けた。カラムを、ＨＰＬＣポンプに接続し及び４ｍｌ／分で２０分間４５℃でアセトニトリルで洗浄した。カラムを更に、以下のように修飾した：
５７０ｍｇのトリメチルアミン塩酸塩、２４ｍｌのジエチルアミン及び６ｍｌの水を、１８分間２ｍｌ／分の流速でこれらのカラム内にポンプ移送した。カラムを、次いで、３０℃で水槽に３時間置いた。各カラムを、１００ｍｌの水で洗浄した。カラムを、更に、０．０１ｍｏｌ／ｌのトリス．ＨＣｌバッファーでｐＨ７．６で４ｍｌ／分で３０分間洗浄した。カラムを、安定及び調整方法により安定化及び調整した。オリジナルカラムフィッティングからのピストンを、洗浄後完全に圧縮した。カラム背圧は、このバッファーにおいて１０ｍｌ／分で約２．４８ＭＰａ（約３６０ｐｓｉ）だった。カラムを、上記のＬＣ特性決定方法のように特徴決定した。
実施例５
重合液体混合物を、１ｇのスチレン、１ｇのジビニルベンゼン（ＤＶＢ）（８０％のジビニルベンゼン及び２０％のエチルスチレン（ＥＳＴ））、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮを混合することにより製造した。
この液体混合物を、２０分間Ｎ2パージすることにより脱水し及びステンレススチールカラム（５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．）内に充填し、その１つの端を、カラムフィッティングからのねじぶたの内側のピークプラグでシールした。カラムの他の端を、別のピークプラグでシールした。それを、７０セ氏温度で水槽で２４時間重合した。カラムを、オリジナルカラムフィッティングで取り付け及びそれを、タンパク質の分離のために使用する前に、ＴＨＦで１ｍｌ／分の流速で１０分間洗浄した。このカラムの背圧は、１０ｍｌ／分の流速で約１．５９ＭＰａ（約２３０ｐｓｉ）だった。１０ｍｌ／分のアセトニトリルでポリマーの圧縮は、約２．９ｍｍだった。このカラムを、ＬＣ特性決定方法１ａ及び１ｂのように逆相タンパク質及びぺプチド分離のために使用した。
実施例５の代替バージョン
別のカラムを、実施例５におけるように、しかしより多い全モノマー含量で製造した。重合液体混合物は、１．２ｇのスチレン、１．２ｇのジビニルベンゼン、及び２．６ｇのドデカノール及び０．０２４ｇのＡＩＢＮを含んだ。カラムの背圧は、１０ｍｌ／分のアセトニトリルで１．５２ＭＰａ（２２０ｐｓｉ）であり及びポリマーの圧縮は、０．９ｍｍのみであった。より多い全モノマー含量は、カラムを少ない圧縮性にする。
２２ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、２．１ｍｍ、１ｍｍ、５４２マイクロメータ、及び３２０マイロメータを含む異なる直径のカラムを、実施例４におけるように製造した。１０ｍｍ×２．１ｍｍｉ．ｄ．のサイズを有する短いカラムをまた、製造した。カラムを、ＬＣ特性決定方法により、しかしカラムの直径に相当する同一流速で逆相タンパク質分離で特性決定した。その場重合方法は、異なる直径を有するカラムにおいて適用できる。含まれる他のパッキング工程がない時から、小さな直径カラム又はミクロ流体チャンネルのために特に有用である。
実施例６
別のカラムを、実施例５により製造した。
カラムを、ピストンを含むオリジナルカラムフィッティングで取り付け及びアセトニトリルで１ｍｌ／分の流速で１０分間洗浄した。カラムを、更に、水で１０分間洗浄した。双方の端のピストンを、カラム内に圧縮した。カラムを、ＬＣ特性決定方法により特性決定した。ピストンによる水における及び圧縮後のこのピストンにより保持されるポリマーの圧縮は、水中のポリマーの収縮に由来する壁効果を回避した。
実施例６の代替バージョン
別のカラムを、実施例５のように以下の液体混合物で製造した：１．８ｇのジビニルベンゼン、０．２ｇのスチレン、２．３３７５ｇのドデカノール、０．６６２５ｇのトルエン、０．０２ｇのＡＩＢＮ及び３．０ｇのドデカノール。全試薬を、吸引器を使用する真空により５分間脱水し、次いで、ヘリウムで２０分間パージした（秤量する前に）。重合液体混合物を、ステンレススチールカラム（５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．）内に充填し、その１つの端を、ねじぶたにおいて含まれるピーク−プラグによりシールした。カラムの他の端を、別のピーク−プラグでシールした。それを、６６℃で水槽において２４時間重合した。カラムを、ピストンを含むオリジナルカラムフィッティングで取り付け及び１ｍｌ／分の流速でアセトニトリルで１０分間洗浄した。カラムを、更に、水で１０分間洗浄した。双方の端におけるピストンを、カラム内に圧縮した。カラムを、ＬＣ特性決定方法により特性決定した。多い含量の架橋剤は、キャパシティを改良した。カラムの変法は、実施例６に従って製造されたいくつかの他のカラムより３回より多いキャパシティを有した。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で製造した：１０ｍｌのジビニルベンゼン（８０％の純度）、１０ｍｌのスチレン及び０．２０ｇのベンゾイルペルオキシド。
重合液体混合物を、Ｎ2により２０分間パージした。それを、ステンレススチールカラム（５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．）内に充填し、その１つの端を、ねじぶたにおいて含まれるピーク−プラグによりシールした。カラムの他の端を、別のピーク−プラグでシールした。それを、７０℃で水槽において２４時間重合した。カラムを、オリジナルカラムフィッティングで取り付け及びテトラヒドロフランで１ｍｌ／分の流速で１０分間洗浄した。それを、逆相タンパク質及びペプチド分離によりＬＣ特性決定方法において記載されるように特性決定した。異なる開始剤例えばベンゾイルはまた、モノリシック媒体を製造することにおいて有効である。
小さなサイズのステンレスカラム（５０×２．１ｍｍｉ．ｄ．）及びピークカラム（５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．）を、上の実施例のように製造し及び特性決定した。
実施例７
カラムを、実施例６におけるように以下の液体混合物で製造した：ジビニルベンゼン、０．２ｇのヒドロキシルエチルメタクリレート及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。それを、７０℃で水槽において２４時間重合した。カラムを、オリジナルカラムフィッティングで取り付けた。それを、アセトニトリルで１ｍｌ／分の流速で１０分間洗浄し、及び更に、０．０１ｍｏｌ／ｌのトリス．ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．６）中の０．５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ及び水で洗浄した。このカラムを、ＬＣ特性決定方法におけるように逆相タンパク質分離により特性決定した。
実施例７の代替バージョン
カラムを、ヒドロキシルエチルメタクリレート及びジビニルベンゼンの重量を、０．４ｇ及び１．６ｇに変化したことを除いて、上の手順に従って製造及び特性決定した。
別のカラムを、ヒドロキシルエチルメタクリレート及びジビニルベンゼンの重量を、１ｇ及び１ｇに変化したことを除いて、上の手順に従って製造及び特性決定した。
別のカラムを、実施例７におけるように以下の重合液体混合物で製造した：−１．８ｇのジビニルベンゼン、０．１６ｇのスチレン、０．０４ｇのヒドロキシルエチルメタクリレート及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。
カラムを、ピストンを含むオリジナルカラムフィッティングで重合後取り付けた。それを、アセトニトリルで１ｍｌ／分の流速で１０分間洗浄し及び更に、０．０１ｍｏｌ／ｌのトリス．ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．６）中の０．５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ及び水で洗浄した。カラムを、ピストンで圧縮し及びＬＣ特性決定方法におけるようにタンパク質及びペプチドの逆相分離により特性決定した。
実施得例８
空の注射器バレル（70×12mm i.d.Redisep barrel for Combiflash chromatography from Isco、Inc.、4700Superior Street、Lincoln、NE、68504）を、１つの端でシールし及び以下の重合液体混合物で充填した：１．６ｇのメタクリル酸ヒドロキシルエチル、６．４ｇのジビニルベンゼン、８９ｍｇのＡＩＢＮ、１２ｇのドデカノール（Ｎ2で２０分間脱水後）。バレルの頂点を、ブロック針（blocked needle）でシールした。このバレルを、水槽において７０℃で２４時間加熱した。それを、ＨＰＬＣポンプに接続し及びＴＨＦで１ｍｌ／分の流速で３０分間洗浄した。それを、次いで、フェノール化合物の正常相及び逆相分離の双方のために使用した。
実施例９
重合液体混合物を、以下のように製造した：（１）１ｇのメタクリル酸ヒドロキシルエチル、１ｇのジメタクリル酸エチレン及び０．０２ｇのＡＩＢＮを、２０ｍｌのサンプルバイアル内に秤量し及びそれが、均質液体混合物になるまで穏やかに混合物を振動し；及び（２）１ｇのシクロヘキサノール及び２ｇのドデカノールを、この液体混合物内に秤量し及びそれが均質になるまでそれを振動した。全試薬を、５分間吸引器を使用する真空により脱水し、次いで秤量前にヘリウムで２０分間パージした。
空のステンレススチールカラム（４．６ｍｍの内部ｉ．ｄ．及び５０ｍｍの長さ）（その１つの端を、図４のデバイスによりシールした）を、カラムが、充填されるまで、この液体混合物で充填した。ステンレススチールのねじぶたにおいて含まれるピーク−プラグ（カラム用のオリジナルキャップである）を、使用して、カラムの他の端をシ−ルした。図４のデバイスを、注射器ポンプに接続した。水を、媒体として使用して、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）の加圧を作り出した。カラム内に空気を維持するべきではない。カラムを、水槽内に垂直に６０℃で置き及び２０分間維持した。重合後、カラムを、水槽の外に出し及び室温に冷却した。カラムを、ＨＰＬＣポンプに接続し及び乾燥ＴＨＦ（分子篩により乾燥した）により０．５ｍｌ／分で２０分間洗浄した。カラムを、薬剤Nの正常相分離のために使用した。
実施例９の代替バージョン
カラムを、実施例９におけるように以下の重合液体混合物で製造した：０．５ｇのＧＭＡ、０．５ｇのＨＥＭＡ、１ｇのＥＤＭＡ、１．８ｇのシクロヘキサノール、１．２ｇのドデカノール、０．０２ｇのＡＩＢＮ。
カラムを、０．５ｍｌ／分の流速で２０分間ＴＨＦ洗浄後、水で洗浄した。水中の１．０ｍｏｌ／ｌの硫酸１０ｍｌを、カラムを通して、ポンプ移送した。カラムを、カラムプラグでシールし及び水槽内に８０℃で３時間置いた。それらを、修飾反応後、２０ｍｌの水で洗浄し及び正常相分離での特性決定前に、更に、乾燥ＴＨＦで洗浄した。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で製造した：１ｇのメタクリル酸グリシジル、１ｇのジメタクリル酸エチレン、２．４ｇのシクロヘキサノール、０．６ｇのドデカノール、０．０２ｇのＡＩＢＮ。
カラムを、０．５ｍｌ／分の流速で２０分間ＴＨＦで洗浄後、水で洗浄した。水中の１．０ｍｏｌ／分の硫酸１０ｍｌを、カラムを通してポンプ移送した。カラムを、カラムプラグでシールし及び水槽内に８０℃で３時間置いた。それらを、修飾反応後、２０ｍｌの水で洗浄し及び正常相分離で特性決定前に、更に、乾燥ＴＨＦで洗浄した。
実施例１０
ステンレススチールカラム（５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．）を、実施例３におけるように、０．７ｇのメタクリル酸ラウリル（ＬＭＡ）、０．１ｇのＨＥＭＡ、１．２ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮを含んだ以下の重合液体混合物で製造した。
実施例１０の代替バージョン
カラムを、０．８ｇのメタクリル酸ラウリル（ＬＭＡ）、１．２ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮを含む以下の重合液体混合物で製造した。別のカラムを、０．１７５ｇのメタクリル酸ステアリル（ＳＭＡ）、１．５７５ｇのＤＶＢ（８０％の純度）、３．２５ｇの１−ヘキサデカノール及び０．０１８ｍｇのＡＩＢＮを含む以下の重合液体混合物で製造して、比ＳＭＡ／ＤＶＢ＝１０／９０を有する混合物を形成した。別のカラムを、０．７ｇのＳＭＡ、１．０５ｇのＤＶＢ、３．２５ｇのオクタノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮを含む以下の重合液体混合物で製造して、４０／６０のＳＭＡ／ＤＶＢの比を提供した。
別のカラムを、１．０５ｇのＳＭＡ、０．７ｇのＤＶＢ、３．２５ｇのエタノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮを含む以下の重合液体混合物で製造して、６０／４０の比のＳＭＡ／ＤＶＢを提供した。
別のカラムを、０．７ｇのＳＭＡ、１．０５ｇのＤＶＢ、１．９５ｇのエタノール、１．３０ｇのブタノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮを含む以下の重合液体混合物で製造して、４０／６０の比のＳＭＡ／ＤＶＢを提供した。
他のカラムを、テトラデカノール、デカノール、オクタノール、ヘキサノール、ブタノール、プロパノール、エタノール及びメタノール及びポロジェニック溶剤（porogenic solvent）としてそれらの組み合わせを使用して上のように製造した。
別のカラムを、以下の重合液体混合物：０．７ｇのＳＭＡ、１．０５ｇのＤＶＢ、２．９２５ｇのエタノール、０．３３ｇのメタノール、０．３３ｇのイソプロパノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮで上のように製造して、４０／６０の比のＳＭＡ／ＤＶＢを提供した。
別のカラムを、以下の重合混合物：０．７ｇのＳＭＡ、１．０５ｇのＤＶＢ、２．６ｇのエタノール、０．３３ｇのメタノール、０．３３ｇのプロパノール、０．３３ｇのブタノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮで上のように製造して、４０／６０の比のＳＭＡ／ＤＶＢを提供した。
別のカラムを、以下の重合液体混合物：０．７ｇのＳＭＡ、１．０５ｇのＤＶＢ、２．７６２ｇのエタノール、０．３３ｇのメタノール、０．３３ｇのプロパノール、０．３３ｇのブタノール、０．３３ｇのヘキサノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮで上のように製造して、４０／６０の比のＳＭＡ／ＤＶＢを提供した。
別のカラムを、以下の重合液体混合物：０．７ｇのＳＭＡ、１．０５ｇのＤＶＢ、２．４３５ｇのエタノール、０．３３ｇのメタノール、０．３３ｇのプロパノール、０．３３ｇのブタノール、０．３３ｇのヘキサノール、０．３３ｇのオクタノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮで上のように製造して、４０／６０の比のＳＭＡ／ＤＶＢを提供した。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：−１．０５ｇのＤＶＢ、３．０８ｇのエタノール、０．０１６ｇのエチルエステル及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。このカラムを、実施例１０におけるようにペプチド分離のために使用して、４０／６０の比のＳＭＡ／ＤＶＢを提供した。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：１．７５ｇのＤＶＢ、３．２５ｇのドデカノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。このカラムを、実施例１０の第一案におけるようにペプチド分離のために使用した。Ｃ１〜Ｃ１２を含むアルコールを有する一連のカラムを、上のように製造し及びペプチド分離で特性決定した。
一連のカラムを、以下のポロゲンをドデカノールの代わりに使用して上のように製造した：イソ−プロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、１，２−ジメトキシエタン、１，２−ジクロロエタン、フタル酸ジメチル、２，２，４−トリメチルペンタン、１，４−ジキサン、２−メチルオキシエタノール、１，４−ブタンジオール、トルエン、ｍ−キシレン、フタル酸ジイソブチル、テトラ（エチレングリコール）ジメチルエーテル、テトラ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）（Ｆ．Ｗ．１０００）、ポリ（プロピレングリコール）モノブチルエーテル（Ｆ．Ｗ．３４０、１０００、２５００）。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：１．７５ｇのＤＶＢ、２．９２５ｇのイソプロパノール、０．３２５ｇの１，４−ブタンジオール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：１．７５ｇのＤＶＢ、２．２７５ｇのイソプロパノール、０．９７５ｇの２−メチルオキシエタノール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：１．７５ｇのＤＶＢ、２．６０ｇのイソプロパノール、０．６５ｇのフタル酸ジメチル及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：１．７５ｇのＤＶＢ，２．７ｇのテトラエチレングリコール、０．３ｇのジエチレングリコール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：１．７５ｇのＤＶＢ、２．７ｇのテトラ（エチレングリコール）、０．３ｇのグリセロール及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：１．７５ｇのＤＶＢ、１．９８ｇのテトラ（エチレングリコール）、１．２０ｇのテトラ（エチレングリコール）ジメチルエーテル及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、以下の重合液体混合物で上のように製造した：１．７５ｇのＤＶＢ、１．９８ｇのテトラ（エチレングリコール）、１．２０ｇのテトラ（エチレングリコール）ジメチルエーテル及び０．０１８ｇのＡＩＢＮ。
実施例１１
カラム（５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．ステンレススチール、それは、５０ｍｍの長さ及び４．６ｍｍの内部ｉ．ｄ．）を、実施例１のように、１ｇのメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、１ｇのＥＤＭＡ、１．８ｇのシクロヘキサノール、１．２ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮを含む以下の重合液体混合物で製造し−それを、ＨＰＬＣポンプに接続し及びＴＨＦ及び水で０．５ｍｌ／分で２０分間で順に洗浄した。
このカラムを、加水分解反応に以下のように付した：（１）２ｍｌの６ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨを、カラムを通して０．５ｍｌ／分の流速でポンプ移送し；及び（２）カラムを、２つのカラムプラグによりシールし及び水槽において８０℃で１時間置いた。それを、２０ｍｌの水で０．５ｍｌ／分の流速で洗浄し及びタンパク質分離で及びキャパシティ測定を結び付けて特性決定した（ＬＣ特性決定方法において記載される）。
実施例１１の代替バージョン
カラムを、実施例１１のように以下の重合液体混合物で製造した：０．１ｇのアクリル酸（ＡＡ）、０．９ｇのメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、１ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。カラムのキャパシティを、加水分解前及び後に測定した。加水分解前のキャパシティは、ｍｌカラム容量あたり約１０ｍｇのリゾチームだった。それは、加水分解後、約３０ｍｇだった。
別のカラムを、実施例１１のように以下の重合液体混合物で製造した：０．２ｇのＡＡ、０．８ｇのＭＭＡ、１ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。カラムのキャパシティを、特性決定方法１１におけるように測定した。加水分解前のキャパシティは、ｍｌカラム容量あたり約２７ｍｇのリゾチームだった。それは、加水分解後、約５０ｍｇだった。
別のカラムを、実施例１１のように以下の重合液体混合物で製造した：０．３ｇのＡＡ、０．７ｇのＭＭＡ、１ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。カラムのキャパシティを、加水分解前及び後で測定した。加水分解前のキャパシティは、ｍｌカラム容量あたり約４３ｍｇのリゾチームだった。キャパシティは、加水分解後６０ｍｇより多かった。
別のカラムを、上のように以下の重合液体混合物で製造した：０．４ｇのＡＡ、０．６ｇのＭＭＡ、１ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、上のように以下の重合液体混合物で製造した：０．１ｇのＡＡ、０．９ｇのアクリル酸ｔ−ブチル、１ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。
カラムを、上のように以下の重合液体混合物で製造した：０．３ｇのＡＡ、０．３ｇのＭＭＡ、１．４ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、上のように以下の混合物で製造した：０．２ｇのＡＡ、０．７ｇのＭＭＡ、０．１ｇのＨＥＭＡ、１ｇのＥＤＭＡ、２．８５ｇのドデカノール、０．１５ｇのシクロヘキサノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。別のカラムを、上のように以下の重合液体混合物で製造した：０．４ｇのＡＡ、１．６ｇのＤＶＢ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、上のように以下の重合液体混合物で製造した：１ｇのＧＭＡ、１ｇのＥＤＭＡ、２．４ｇのシクロヘキサノール、０．６ｇのドデカノール、０．０２ｇのＡＩＢＮ。このカラムを、実施例１１におけるような塩基触媒加水分解反応前に、実施例９の変法におけるような酸触媒開環反応に付した。
別のカラムを、上のように以下の重合液体混合物で製造した：０．５ｇのＧＭＡ、０．５ｇのＨＥＭＡ、１ｇのＥＤＭＡ、１．８ｇのシクロヘキサノール、１．２ｇのドデカノール、０．０２ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、上のように以下の重合液体混合物で製造した；０．２ｇのＡＡ、０．６ｇのＭＭＡ、０．２ｇのＧＭＡ、１ｇのＥＤＭＡ、３ｇのドデカノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。このカラムを、上のような塩基触媒加水分解反応前に、酸触媒開環反応に付した。それを、以下の液体混合物で、更に、加水分解した：６０℃で６時間、５Ｍ ＮａＯＨ中の０．２５Ｍのクロロ酢酸ナトリウム。
別のカラムを、上のように以下の重合液体混合物で製造した：０．２ｇのＡＡ、０．５ｇのＭＭＡ、０．１ｇのＧＭＡ、１．２ｇのＥＤＭＡ、２．５５ｇのドデカノール、０．４５ｇのシクロヘキサノール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。それを、５Ｍ ＮａＯＨ中の０．２５Ｍクロロ酢酸ナトリウムにより６０℃で６時間加水分解した。
すべてのこれらのカラムを、ベッドスタビライゼーション及び圧縮方法に付し及びタンパク質分離で及びキャパシティ測定を結び付けて特性決定した（上に記載される8ＬＣ特性決定方法におけるように）。
実施例１２
カラム（ピーク−ラインステンレススチール、５０×４．６ｍｍＩＤ）を、実施例１のように以下の重合液体混合物で製造した：３ｇのＧＭＡ、３ｇのＥＤＭＡ、６．９ｇのシクロヘキサノール、２．１ｇのドデカノール及び０．０６ｇのＡＩＢＮ。
カラムを、酸性状態で開環反応で第一修飾した。水中の０．５Ｍ硫酸の液体混合物５床容量を、カラムを通してポンプ移送した。カラムを、シールし及び水槽において５０℃で４時間加熱した。それを、修飾後、２０床容量の水で洗浄した。
このカラムを、エーテル化反応で更に修飾した。２０ｇのクロロ酢酸ナトリウム、２０ｇのＮａＯＨ及び６４７ｍｌの水を含む５床容量の液体混合物を、カラムを通してポンプ移送した。カラムを、カラムプラグでシールし及び水槽において６０℃で２．５時間加熱した。それを、水で洗浄し、安定化及び調整方法におけるように安定化及び調整した。このカラムを、ＬＣ特性決定方法におけるように特性決定した。
実施例１２の代替バージョン
実施例１２を、異なる修飾方法で続けた。
実施例１２におけるように製造されたカラムを、開環反応により以下の液体混合物で修飾した：６ｍｏｌ／ｌのグリコール酸及び０．５Ｍ ＴＦＩ（水中）で３時間。
別のカラムを、上の開環反応及び加水分解反応で（５Ｍ ＮａＯＨ液体混合物において）６０℃で２．５時間修飾した。
別のカラムを、開環反応により、４０ｇのグリコール酸、６０ｍｌの０．５Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む以下の液体混合物で２時間第一修飾した。それを、２０ｇのＣｌＣＨ2ＣＯＯＮａ及び６０ｍｌの５Ｍ ＮａＯＨを含む液体混合物で３時間、更に修飾した。
実施例１３
カラムを、実施例２のように以下の液体混合物で製造した：１２ｇのＡＡ、３０ｇのＭＭＡ、６ｇのＧＭＡ、７２ｇのＥＤＭＡ、２７ｇのシクロヘキサノール、１５３ｇのドデカノール及び１．２ｇのＡＩＢＮ。これらのカラムを、ある注射器ポンプに接続された３つマニホルドを使用して、平行合成により同時に製造して、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）の加圧を得られた（重合の間）。重合後、ポリマーを、以下の使用のために注射器ピストン（約９ｍｍｉ．ｄ．）によりカラムの外に押した。
上からのあるポリマーロッドを、トリム（trim）して、直径約８ｍｍに小さくした。それを、１ｃｍ厚さのディスクに切断した。これらのディスクを、第二段階重合のためのフィルターとして使用して、別のカラムを製造した。１．８ｍｌの液体混合物を、ガラスカラム（１００×１０ｍｍｉ．ｄ．）内に充填し、その１つの端を、図３において示される加圧デバイスによりシールした。６つのポリマーディスクを、一つずつカラム内に充填した。これらのディスクを、液体混合物により覆うべきである。テフロン（登録商標）ストッパーを、使用して、カラムの他の端をシールした。加圧デバイスを、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）の圧力を重合液体混合物に定圧モードで加えるために使用された注射器ポンプに接続した。カラムを、水槽において６０℃で２０時間加熱した。重合後、カラムを、水槽から出した。加圧デバイスを、圧力を解放した後、注射器ポンプから分離した。加圧デバイスを、開き及びカラムがまだ暖かい間、ゆっくりとカラムから除去した。このカラムを、２０床容量のアセトニトリル及び水で１ｍｌ／分の流速で順に洗浄した。それを、安定化及び調整方法におけるように安定化及び調整した。カラムを、５Ｍ ＮａＯＨ中の０．２５ｍｏｌ／ｌのクロロ酢酸ナトリウムで６０℃で６時間修飾した。それを、ＬＣ特性決定方法におけるように特性決定した。
実施例１３の代替バージョン
別のカラム（１００ｍｍ×３５ｍｍＩＤ、ガラス）を、２段階重合方法で、フィルターとしてポリマーロッドで製造した。このカラムを、ある端におけるテフロン（登録商標）プラグ（TEFLON plug）でシールした。カラムの他の端を、Ｎ2タンクに接続した。重合は、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）下で２０時間６０℃であった。
実施例１４
８つの短いポリマーロッド（１０ｍｍ×３４ｍｍＩＤ）を、以下の液体混合物で製造した：８ｇのアクリル酸、２０ｇのメタクリル酸メチル、４ｇのメタクリル酸グリシジル、４８ｇのジメタクリル酸エチレングリコール、１０２ｇのドデカノール、１８ｇのシクロヘキサノール及び０．８ｇのＡＩＢＮ。ポリマーロッドを、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）のＮ2圧力下で製造した。ロッドを、実施例１２におけるような第二段階重合方法を用いて、大きな直径の長いカラムの分離のためにフィルターとして使用した。ガラスカラム（１００ｍｍ×３５ｍｍＩＤ）は、短いカラムで充填され及び上のような同一重合だった。カラムの１つの端をテフロン（登録商標）プラグでシールし及び他の端を、Ｎ2タンクと接続した。重合を、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）圧力下で６０℃で２０時間実行した。カラムを、２０床容量のアセトニトリル及び水で洗浄した。それを、次のような加水分解反応に付した：５Ｍ ＮａＯＨ中の０．２５Ｍクロロ酢酸ナトリウムに６０℃で６時間。カラムを、上記のＬＣ特性決定方法のように特性決定した。
実施例１５
カラム（ピーク−ラインステンレススチール、５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ）を、実施例１におけるように以下の液体混合物で製造した：４ｇのＧＭＡ、４ｇのＥＤＭＡ、２．８ｇのドデカノール、９．２ｇのシクロヘキサノール及び０．０８ｇのＡＩＢＮ。
このカラムを、１Ｍ Ｈ2ＳＯ4液体混合物により４０℃で３時間第一加水分解した。加水分解後、それを、ＤＭＳＯ中の５床容量の５％ナトリウムｔ−ブトキシド液体混合物を、カラムを通してポンプ移送することにより活性化し及び水槽において９０℃で１時間加熱した。次いで、それを、８０℃で２０時間、活性化液体混合物の２０％及びブタンサルトンの８０％を含む液体混合物で修飾した。
実施例１５の代替バージョン
カラムを、プロパンサルトンが、ブタンサルトンの代わりに使用されることを除いて、実施例１５におけるように製造した。
別のカラムを、修飾及び活性化温度が、オイル・バスにおいて９０℃の代わりに１２０℃だったことを除いて、実施例１５におけるように製造した。
別のカラムを、実施例１５におけるように以下の液体混合物で製造した：４ｇのＨＥＭＡ、４ｇのＥＤＭＡ、９．４ｇのドデカノール、２．６ｇのシクロヘキサノール及び０．０８ｇのＡＩＢＮ。それを、実施例１５におけるように修飾した。
別のカラムを、実施例１におけるように以下の液体混合物で製造した；０．５５ｇのＧＭＡ、１．２ｇのＥＤＭＡ、０．２５ｇの２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、０．４８ｇのＮａＯＨ、０．５ｇの水、１．８６ｇのプロパノール、０．６４ｇのブタンジオール及び０．０２ｇのＡＩＢＮ。
別のカラムを、上のようなＡＭＰＳの直接重合により製造するが、実施例１５において記載される修飾方法で、更に修飾した。
すべてのこれらのカラムを、強カチオン交換タンパク質分離で及びキャパシティ測定を結びつけて（ＬＣ特性決定方法において記載される）特性決定した。
実施例１６
カラムを、実施例１のように以下の重合液体混合物で製造した：４５ｍｌのテトラメトキシシラン、１００ｍｌの０．０１ｍｏｌ／ｌ水性酢酸、９ｇのウレア及び１１．５ｇのポリ（エチレンオキシド）（ＭＷ１００００）。この液体混合物を、氷浴において３０分間この混合物を攪拌することにより製造した。重合を、カラムにおいて４．１４ＭＰａ（６００ｐｓｉ）の圧力下で及び４０℃で２４時間実行した。カラムを、次いで、２０ｍｌの水で０．５ｍｌ／分の流速で洗浄し及び５ｍｌの０．０１ｍｏｌ／ｌ水性水酸化アンモニウム液体混合物においてポンプ移送した。カラムを、シールし及び１２０℃で３時間維持し次いでエタノール洗浄した。
実施例１７
抑制剤例えばメチルエーテルヒドロキノン又はｔ−ブチルカテコールを、使用前、蒸留又は正常相クロマトグラフィによりモノマーから除去した。
重合液体混合物を、実施例１のように、しかし以下の重合液体混合物で製造した：２４０ｍｇのｐ−テルフェニル、８００ｍｇのＡＩＢＮ、１６ｇのスチレン及び１６ｇのジビニルベンゼン（８０％）、２６．４ｇの鉱油、及び２１．６ｇの２−エチルヘキサン酸。
空のガラスカラム（１０ｍｍの内部ｉ．ｄ．及び１００ｍｍの長さ）（その１つの端を、図４において示される加圧デバイスによりシールした）を、カラムが充填されるまで、この液体混合物で充填した。同一の図において示されるピークねじぶたにおいて含まれるテフロン（登録商標）−プラグを、使用して、カラムの他の端をシールした。重合を、６００Ｒ／時の用量で７２時間Ｘ−線管１１１ｋＶｐの電圧でＸ−線に暴露したままにした。得られたカラムを、７０℃に２時間更に加熱した。次いで、カラムを、ヘキサン次いでヘキサン／アセトン（５０／５０）、アセトン、アセトニトリル各々で、２０床用量の各溶剤で洗浄した。
図４のデバイスを、圧力を解除後、注射器ポンプから分離した。図４のデバイスを、開き及び注意深くカラムから除去した。ポリマーロッドの高さは、カラム内側の重合液体混合物の高さより４ｍｍ短いことがわかった。カラムを、次いで、オリジナルＨＰＬＣカラムフィッティングで取り付けた。カラムを、ＨＰＬＣポンプに接続し及びアセトニトリルで２ｍｌ／分で、２０分間４５℃で洗浄した。
製造されたカラムを、２０床容量の水で更に洗浄し及びピストンで圧縮して、空隙容量を取り除いた。カラムを、次いで、１ａにおいて記載されるＬＣ特性決定方法を使用して特性決定した。クロマトグラムを、図９において示す。
実施例１７の代替バージョン
別のカラムを、ガラスカラム（３５ｍｍｉ．ｄ．×１００ｍｍの長さ）において以下の混合物で実施例１７におけるように製造した：３０ｇのスチレン、３０ｇのジビニルベンゼン、３８．０５ｇの鉱油及び２２．１８ｇの２−エチルヘキサン酸、０．５１８ｇのｐ−テルフェニル及び１．３１ｇのＡＩＢＮ。カラムを、２０床容量のアセトニトリル及び水で各々洗浄した。それを、ＬＣ特性決定方法１ａで特性決定した。分離を、図９において示す。
別のカラムを、実施例１７におけるように製造した。カラムの１つの端からのフィッティングを、分離し及び媒体を、１０ｍｌ／分のアセトニトリルを他の端を通してカラム内にポンプ移送することによりカラムの外で加圧した。分離媒体を、ＳＥＭを使用するポロシメーター研究及び５０℃で２４時間真空における乾燥後の水銀ポロシメーターのために提示した。
別のカラムを、実施例１７におけるように、大きな直径のガラスカラム（３５ｍｍｉ．ｄ．×１００ｍｍの長さ）を用いて製造した。カラムを、図４におけるデバイスの代わりにテフロン（登録商標）ねじぶたにおいて含まれる２つのテフロン（登録商標）−プラグでシールした。ポリマーを、カラムの外に押し及び上の実施例におけるように乾燥した。ポリマーを、ＳＥＭ及びポロシメーター研究のために提示した。
別のカラムを、大きな直径のカラム（３５ｍｍ×１００ｍｍ）を用いるが、以下の重合液体混合物を用いて上におけるように製造した：２４０ｍｇのｐ−テルフェニル、８００ｍｇのＡＩＢＮ、３．２１３９ｇのスチレン、２８．８０８８ｇのジビニルベンゼン（８０％の純度）、３７．４０６０ｇの１−ドデカノール、１３．２５ｇのトルエン。
別のカラムを、大きな直径のカラム（３５ｍｍ×１００ｍｍ）を用いるが、以下の重合液体混合物を用いて上の実施例におけるように製造した：２４０ｍｇのｐ−テルフェニル及び８００ｍｇのＡＩＢＮを、３２．００３４ｇのジビニルベンゼン（８０％）のモノマー混合物において溶解した。モノマー混合物内に、３１．６９２６ｇのテトラエチレングリコール、１６．３２２４ｇのテトラエチレングリコールジエチルエステルを、添加した。
別のカラムを、図１２〜１５において記載される重合ハウジング内で上の実施例のように製造した。重合液体混合物は、７３．２ｇのジビニルベンゼン、７３．４ｇのスチレン、８５．２ｇの鉱油、６０．８ｇの２−エチルヘキサン酸、０．８８２ｇのｐ−テルフェニル及び２．９４ｇのＡＩＢＮを含んだ。カラムの中心における重合の温度は、カラムの先のものと約同一だった。モノマーの転化は、１１０ｋＶのＸ−線照射重合の４日後ほとんど完成した。完全な反応は、重大な弊害を有さない更なる発熱として熱的に達成された。
異なるシンチレータ、光開始剤、モノマー及びポロゲン溶剤を使用する多くの他のカラムは、製造されている。使用されるポロゲン溶剤は、他のアルカン例えばオクタン、アルコール例えばメタノール、プロパノール及びシクロヘキサノール、エーテル例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、オリゴマー例えばテトラエチレングリコール、テトラエチレングリコールジメチルエーテルを含む。使用される光開始剤は、２−クロロチオキサンテン−９−オン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’−ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノン、フェナントレンキノン、ジフェニル（２，４，６トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド及びアゾビスイソブチロニトリルを含む。使用されるシンチレータは、２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）、２−フェニル−５−（４−ビフェニリル）１，３，４−オキサジアゾール（ＰＢＤ）、２−（１−ナフチル）−５−フェニルオキサゾール（ａ−ＮＰＯ）を、ｐ−テルフェニル及びＺｎＳｅの側に含む。使用されるモノマーは、アクリロニトリル、メタクリル酸ブチルを、メタクリル酸グリシジル、ジメタクリル酸エチレングリコール、スチレン、ジビニルベンゼン、エチルスチレンの側に含む。図９において、以下の混合物の２つの異なる直径のカラムにおける分離のクロマトグラムを示す：（１）Ｍｅｔ−エンケファリン；（２）Ｌｅｕ−エンケファリン；（３）アンジオテンシン；（４）フィウサラエミン（Phyusalaemin）；及び直径１０ｍｍ及び３５ｍｍ及び長さ６５ｍｍのカラムにおいて重合を開始されたＸ−線照射により製造されたポリ（ＤＶＢ−ｃｏ−Ｓｔ）モノリシックカラム上の物質Ｐ；移動相：（Ａ）０．１５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを有する水；７床容量において５ｍｌ／分Ｉ．Ｄ．カラム及び３５Ｉ．Ｄ．カラムのための５０ｍｌ／分の流速でＡにおいて勾配：１０〜４０％Ｂ：検出：２１４ｎｍでのＵＶ
図１０において、固定上面１５２、回転上面１５６、固定支持体表面１５２に接続され及びそれらの回転を可能にするための回転表面１５６に固定される支持体部材１５７及び４つの蛍光灯ホルダー１５４Ａ−１５４Ｄを有する紫外線又は可視光重合装置１５０の上方視点を示す。可視又は紫外線蛍光灯は、これらのホルダーの代わりである。
図１１において、重合装置１６２を回転するためのモーター１５９により相互に回転される被動節１５６を示す重合装置１５０の側断面図の略図を示す。４つのランプ１６６Ｄ及び１６６Ｂの２つが、ランプホルダー１５４Ｄ及び１５４Ｂ及び対応ホルダーに、細長いランプ１６６Ｄ及び１６６Ｂの下の端で取り付けられて示される。ピストン１６４を、使用して、重合の間、１６２で重合混合物を加圧する。ファン１５８は、重合装置及びカバー上の反射コーティングを冷却することにおいて助け、サイド及びランプは、光を反射して容器１６２の光導体壁に戻る。この配置で、ランプ１６６Ａ−１６６Ｄ（１６６Ｂ＆１６６Ｄは、図１１において示される）は、光を引き起して、重合反応を開始及び制御するために重合混合物に影響を与える。比較的大きい直径のカラムの重合は、放射均一性を最終プラグにおいてカラムに沿うすべての位置で溶剤及び検体の流れの方向において維持する間、実行され得る。重合が、均一性の制御方法光において光及び温度の組み合わせの下行われ得るように、光を、所望のようにつけて及び消して、温度勾配を制御し得る。
図１２において、重合のための装置１７０の簡略化正面図を、放射プルーフキャビネット（radiation proof cabinet）１７２を有する、ドア１７４、アッパーウィンドウ１７６、ホルダー１７８及び反応混合物を１８２で含むための容器１８０を有する、主にＸ−線放射を用いて示す。ピストン１８４を、いくつかの実施態様において利用して、反応混合物１８２を加圧し得る。装置１７０において、Ｘ−線又は他の適切な放射例えばガンマ線を、使用して、安全便利な方法で重合容器において反応を制御し得る。
いくつかの実施態様において、圧力を、導管１８６を通して空気を適用することによりピストン１８４を通して適用して、反応混合物１８２に反して内部でピストン１８４を他の実施例に関連して上に記載される方法において移動し得る。好ましい実施態様において、装置１７０は、それが、ドアを有し及びキャビネットに取り付けられて制御を有することにおいてマイクロ波と似ているスモールユーザーの使いやすいキャビネットＸ−線デバイスである。
それは、それが、十分なしかしながら大きなカラムのための低浸透を有するので、低電圧レベルを使用し及びキャビネットの隣から安全に人材により作動され得る。それは、上文で記載される方法が、添加物質を使用して、重合例えば光開始剤、蛍光剤、又はポロゲン、Ｘ−線増感剤及び／又はシンチレータにおいて助けるので、本発明の重合に適切である。この装置は、重合及び他のデバイス例えばＦＩＧＳのもののＸ−線の制御を可能にする。１０及び１１は、重合の他の放射制御を可能にし、従って点まで放射の補助を伴い重合の実施例制御のために可能にし及び時間を低減するの過熱を用いて重合を終了し及び破壊的な熱増加を更に回避する。
図３において、反応物質入り口開口部２００、冷却流動体インレット２０３、冷却アウトレト２０５、ケーシング２０４及びオーバーフローアウトレット２０２を有する反応容器１８０の上面図が示される。冷却液は、好ましくは水である。重合混合物に反してそれらの圧力のために２１２（図１４）でプラグ１８２（図４）を移動するための空気のための開口部２０６は、提供される。発電対を、反応物質混合物を、容器１８０を回転することにより置いた後、開口部２００を通して提供し得及びプラグを同様に挿入し得る。この配置で、反応混合物を、所望なら圧力下で照射し及び照射及び重合の開始及び制御のために軸方向にＸ−線に付すことができる。放射及び圧力の組み合わせは、最終クロマトグラフィプラグ又は支持体において均一性を促進し及び温度勾配を制御し得るように、水は、それを通して冷却液として流れる。
図１４において、透明なＸ−放射ウィンドウ１９２を示す図１３の切断線１４−１４を通してなされる断面図、冷却水のためのポート２０２、反応物質のための開口部２００、発電対２１５及びその導体２１８及びその連続におけるピン、２１２における反応混合物を加圧するためのプラグ１８２を移動するための空気圧開口部２０６、反応対混合物を受けるための２１２でハウジングする反応対体、容器１８０が、カラムとして使用されるとき、クロマトグラフィの間、溶剤及び検体を分配するための２１３で第一分配プレート及び重合後２１２でカラムにおいて分離後、溶剤及び検体を受けるための第二ディストリビュータプレート２１５をを示す。この配置で、放射は、ウィンドウ１９２を通して通過して、反応物質の重合を制御する。これは、プラグ１８２により適用される圧力下でなされ得る。
図１５において、ピストン１８２示す図１３の線１５−１５を通してなされる重合容器１８０の断面図、２１２で反応物質を加圧するためピストン１８２に圧力を適用する空隙２１０を示すが、それは、Ｘ−線により照射されていて及びリザーバー１９０において水を流すことにより冷却されている。
上の記載から理解され得るように、ポロゲン又は溶剤を含み得る重合混合物は、放射の制御下で多孔質プラグ内で重合される。この目的のために、有効な重合に対する照射により引き起こされる少なくとも１つ物質がある。いくつかの物質は、順に重合を開始又は促進する他の物質をもたらす放射を揮散し得る。この目的のために、放射混合物は、少なくとも1つのモノマー、少なくともポロゲン又は溶剤及び物質（重合をもたらす）を含むべきである。Ｘ−線を、モノマーのみを伴い使用して、支持体を製造し得る。ポロゲン又は溶剤が、含まれる場合、支持体は、多孔質であり得る。Ｘ−線は、特に安全なタイプの放射であり及び高分子支持剤を形成することにおいて幅広い適用を有し得る。放射は、重合を引き起こし又は物質例えば重合の促進を引き起こす更なるエネルギーを揮散する溶剤を照射し得る。
実施例１８
ホモポリマー、ポリマー樹脂及び多孔質ポリマー支持体は、１１０ｋＶ Ｘ−線照射を用いて製造されている。ポリマーを、ガラスバイアル及びカラムにおいて製造した。スチレン中の０．１％ｐ−テルフェニル及び１％ＡＩＢＮを含む重合混合物を、記載されるように脱水方法において脱水し及び１ｍｌガラスバイアル内に充填した。バイアルを、ねじぶたでシールした。バイアルを、６００Ｒ／時のＸ−線において２日間１１１ｋＶｐの力を用いて暴露した。剛性多量ポリスチレンポリマーを、バイアルのガラスを破壊後、バイアルの形で得た。
実施例１８の代替バージョン
メタクリル酸ホモポリグリシジルを、上の方法に従って製造した。
ホモポリスチレンを、上の方法に従って液体混合物重合を用いて製造した。１％のＡＩＢＮ及び０．１％のｐ−テルフェニルを含むトルエン中の５０％のスチレンを、２日間６００Ｒ／時のＸ−線下で重合した。ポリスチレンを、放射について上のような同一条件下で重合後得た。
ポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）樹脂を、以下の１：１比のスチレン対ジビニルベンゼンを用いて上の方法に従って製造した。重合混合物は、０．９ｇのスチレン、０．９ｇのジビニルベンゼン、１７ｍｇのＡＩＢＮ、５．７ｍｇのｐ−テルフェニルを含む。ポリマー樹脂を、重合後得た。ゲル化は、重合の５時間後、放射について上のような同一の条件下で起きた。
ポリ（ジメタクリル酸グリシジル−コ−エチレングリコール）樹脂を、以下の1：1比のメタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）及びジメタクリル酸エチレングリコール（ＥＤＭＡ）を用いて上の方法に従って製造した。重合混合物は、０．９ｇのＧＭＡ、０．９ｇのＥＤＭＡ、１７ｍｇのＡＩＢＮ、５．７ｍｇのｐ−テルフェニルを含む。ポリマー樹脂を、重合後得た。ゲル化は、重合の５時間後、放射について上のような同一条件下で起きた。
ポリ（ジメタクリル酸グリシジル−コ−エチレングリコール）多孔質支持体を、以下の1：１比のメタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）及びジメタクリル酸エチレングリコール（ＥＤＭＡ）を用いて上の方法に従って製造した。重合混合物は、０．４５ｇのＧＭＡ、０．４６ｇのＥＤＭＡ、０．９１ｇのシクロヘキサノール、２０ｍｇのＡＩＢＮ、１．５ｍｇのｐ−テルフェニルを含む。多孔質ポリマーを、重合後得た。ゲル化は、重合の６時間後、放射について上のような同一条件下で起きた。
ポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）多孔質支持体を、０．４５ｇのスチレン、０．４５ｇのジビニルベンゼン（８０％の純度）、０．９１ｇのシクロヘキサノール、２０ｍｇのＡＩＢＮ、６．５ｍｇのｐ−テルフェニルを含む以下の重合混合物を用いて上の方法に従って製造した。多孔質ポリマーを、重合後得た。ゲル化は、重合の４．５時間後、放射について上のような同一条件下で起きた。
実施例１９
７５マイクロメータ、１００マイクロメータ、２００マイクロメータ、２５０マイクロメータ、３２０マイクロメータ、５３０マイクロメータ及び７００マイクロメータを含む、異なる内部直径を有するシリカ毛管を、１Ｍ水酸化ナトリウム液体混合物で９０℃で２時間オーブンにおいて修飾した。毛管を、次いで、６０カラム容量の脱イオン水及びアセトンで洗浄した。それを、カラムを通して２０分間窒素パージすることにより乾燥した。毛管を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の５０％（ｖ／ｖ）３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート及び０．０２％（ｗ／ｖ）ヒドロキノンを含むシラン処理液体混合物で充填した。毛管の両端をシールした後、それを、オーブンにおいて１００℃で約１０時間加熱し、及び次いで、ＤＭＦ及びアセトンで洗浄した。毛管を、洗浄後窒素パージすることで乾燥した。
重合液体混合物を、表１において挙げられる化合物の組成物で実施例１において記載されるように製造した。
各修飾毛管（通常１５〜２０ｃｍ）を、上の重合液体混合物で充填した。毛管の２つの端を、２つの１．８ｍＬガラスバイアルにおいて、各々シールし、それをまた、重合液体混合物で充填した。テフロン（登録商標）及びパラフィルム(parafilm)を使用して、バイアルのキャップを二重シールした。約５００マイクロリットルの空の空隙を、各バイアルに残し及び毛管の端は、バイアルの半分の高さで位置した。４つのカラムの２つは、同一のシーリングバイアルを用いることにより製造され得る。毛管を、水槽において表１において挙げられるある温度で２０時間、頂点バイアルを立てて固定することにより縦に吊り下げた。重合後、モノリシック毛管カラムを、約２０カラム容量の有機溶剤、通常アセトニトリル、鉱油がポロゲンとして使用される場合時にヘキサンで洗浄した。
カラムを、ＬＣ特性決定方法１ａで３、５及び１０マイクロリットル／分の流速で特性決定した。高い分解が、達成されている。


















表１．重合液体混合物組成物及び重合条件。
Figure 2008509397
実施例１９の代替バージョン
モノリシック毛管カラムを、上の実施例におけるように、以下の重合液体混合物で製造した：４０ｇのＢＭＡ，２．６ｇのＥＤＭＡ、３．８ｇの１−プロパノール、１．６ｇの１，４−ブタンジオール、０．６ｇの水及び０．０４ｇのＡＩＢＮ。重合を、６０℃で実行した。カラムを、ＬＣ特性決定方法１ａで、微量分析液体クロマトグラフィ系で特性決定した。流量は、５マイクロリットル／分だった。タンパク質の優良な分離が、達成された。
多くの他のポリ（アクリレート）ベースの毛管モノリスを、ＢＭＡ／ＥＤＭＡ比の変化（１／３〜３／２）及び異なるポロゲン濃度（全反応混合物の３４％〜３９重量％を有する１−プロパノールだが、２０〜１５重量％を有する１，４−ブタンジオール）で合成した。
別のカラムを、実施例１９におけるように以下の重合混合物で製造した：２．２ｇのＤＶＢ、１．３ｇのスチレン、０．９ｇのアクリロニトリル、４．７ｇの鉱油、０．８ｇのトルエン及び０．０４４ｇのＡＩＢＮ。重合温度は、７５℃である。このタイプの多くの他のカラムを、ポリマートリックス０〜５０％におけるアクリロニトリル含量の変化で製造した。ポリマーは、増加する親水性、しかしタンパク質の異なるレテンタティビティ（retentativity）を示した。別のカラムを、実施例１９におけるように以下の重合混合物で製造した：０．８ｇのＧＭＡ、２．４ｇのＥＤＭＡ、０．８ｇのＡＴＭＳ、３．１ｇの１−プロパノール、２．６ｇの１，４−ブタンジオール、０．３ｇの水及び０．０４ｇのＡＩＢＮ。重合反応を、６０℃で２０時間実行した。重合後、カラムにおけるポロゲン溶剤を、アセトニトリルで洗浄した。次いで、それらを、修飾液体混合物で充填し、それは、１対２の容量比の及び０．４５ｇ／ｍＬのＴＭＡ ＨＣｌを有する、ＴＭＡ及び水の混合物である。修飾を、４０℃で４時間実行した。
実施例２０
重合液体混合物を、実施例１におけるように、しかし以下の混合物で製造した：３．２１５４ｇのアクリル酸、８．００２６ｇのメタクリル酸メチル、１．６０６４ｇのメタクリル酸グリシジル、１９．２０５５ｇのジメタクリル酸エチレングリコール、４３．８９５２ｇの１−ドデカノール、９．００１７ｇのシクロヘキサノール、３２０ｍｇのジフェニル（２，４，６トリメチル（ベンゾール）ホスフィン・オキシド。重合混合物を、５分間超音波で分解し及びカラム内に注ぎ、その１つの端を、テフロン（登録商標）キャップによりシールし、次いで、カラムを、別のテフロン（登録商標）キャップでシールした。重合を、７日間普通のシーリングライト（ceiling light）に暴露した。カラムを、２０床容量のアセトニトリル次いで２０床容量の水で洗浄した。カラムを、クロマトグラフィで特性決定した。
実施例２０の代替バージョン
サイズ１０ｃｍ×１ｃｍＩＤのガラスカラムを、上の実施例のように以下の混合物で製造した：２．５０７４ｇのメタクリル酸グリシジル、２．５００３ｇのジメタクリル酸エチレングリコール、７．５００３ｇのｐ−キシレン、及び５８．２ｇのジフェニル（２，４，６トリメチル（ベンゾール）ホスフィン・オキシド。重合混合物を、普通のシーリングライトに２４時間暴露した。同一の重合を、別の２ｍｌのバイアルにおいて２４時間実行した。モノマーの転換は、９２％だった。
メタクリル酸ホモポリグリシジルを、バイアルにおいて以下の混合物で製造した：１０ｇのＧＭＡ及び０．１ｇのジフェニル（２，４，６トリメチル（ベンゾール）ホスフィン・オキシド。液体混合物を、普通のシーリングライトに２４時間暴露した。ポリマーは、３時間後ゲル化した。とても透明なポリマーを得た。
ホモポリ（メタクリル酸グリシジル）を、バイアルにおいて以下の重合混合物で製造した：１０ｇのＧＭＡ、１０ｇのキシレン及び０．１ｇのジフェニル（２，４，６トリメチル（ベンゾール）ホスフィン・オキシド。液体混合物を、普通のシーリングライトに２４時間暴露した。ポリマーは、３時間後ゲル化した。透明なポリマーを得た。
図１６において、温度表示装置２２２、カラムで熱移動を制御するための手段２２４及び熱制御手段２２６を有するクロマトグラフィカラムを重合するための装置２２０を示す。好ましい実施態様における熱移動装置２２４は、水槽であり、その中において、カラムは、浸されるが、カラム内に熱を導入するためのいくつかの他の便利な手段例えばオーブン又は輻射加熱器又は電熱器などであり得る。それは、検出するためにカラムの温度断面を持続的に測定するための重合混合物内に、単一のカラム内の温度測定デバイスの測定値の間の比較、カラムにおける異なる位置でいくつかの温度勾配又は温度における不連続により、挿入される温度測定デバイス例えば発電対を装備する。カラムのすべては、正確さのために測定され得るが、重合混合物が、同一であり及びカラムのサイズは、いくつかの環境の下同一である時、より少ないカラムが測定され得、又はかなり予測できる重合のケースにおいて、測定され得るカラムはないが、重合混合物温度特性の過去の過程は、代わりに利用され得る。
図１６において、６つのカラム２２８Ａ−２２８Ｆは、いくつかの便利な数が、利用され得る時からのみ、説明目的のために示される。カラム２２８Ｄは、それから延長する３つの導体２３０Ａ−２３０Ｃを有するように示される。導体の１つの端は、温度測定デバイス及び温度表示装置２２２に接続されて、温度変化の統計を提供し及びそれらの間のいくつかの差違を検出する。同様に、他のカラムは、それらから図式的に延長する導体を有し及び温度断面を測定し得る発電対のいくつかの数から導体のいくつかの数を表すことを意図する。通常、２つの導体は、カラムの中心及びカラムの壁近くにおいてあるもので十分である。
好ましい実施態様における熱制御デバイス２２６は、それらの対応デバイスにより制御される他のタイプのヒーターが、使用され得るけれど、水槽において浸される電熱器であり得るヒーター２３２である。好ましい実施態様においてヒーターを制御するための電力の源であるヒーター制御２３４及び好ましい実施態様において水槽において浸される温度調節デバイスである温度測定デバイス３３６。自動温度調節器の方法においてヒーター制御２３４に接続され得る制御２４０及び温度表示は、しかし少なくとも、カラム例えば水槽の環境において温度を表示するであろう。水循環系はまた、水を変化することの能力を伴い含まれて、所望なら、制御方法において水槽を冷却し得る。温度表示デバイス２２２は、３つの点で温度を記録するであろういくつかの種のストリップチャート記録計又はデジタル記録計の形態においてあり得る３つの表示デバイスを含む。比較検出器は、３つの点のいくつかが、発熱量の存在を示す一定量により、いくつかの他の点から逸脱する場合、含まれて、決定され得る。１つのそのようなデバイスは、２４２で示され及び他は、２４４で通常示される。各測定デバイスからの温度は、他方では、オペレーターにより個別に読まれ得及び必要とされる温度調節は、その時に製造した。
図１７において、重合混合物３４８で充填され及び３つの温度測定デバイスをそれに挿入されるカラム壁３４６、壁測定デバイス３５０Ａ、カラム３５０Ｂの中心の測定デバイス、及び中心及び壁３５０Ｃを介在する測定デバイスを有するカラム２２８Ｄの部分の断片的な概略図を示す。デバイスは、いくつかの適切な場所で置かれて、カラムから半径方向において温度勾配を決定するであろう統計を提供し得る。発電対は、それらの対応導体２３０Ａ、２３０Ｂ及び２３０Ｃに接続されて、温度測定デバイス２４２に温度を示す。
この配置で、水槽におけるカラムは、適切な架橋結合で重合を提供するであろう温度に上昇するが、重合により出される熱が、より作り出す高騰する方法において重合を続け及び更に加熱して、反応を促進し及び更に加熱を作り出すのに十分である自律温度より下で維持される。熱は、カラムの断面において、一定の温度断面を維持して、異なる比で重合を回避するペースで導入される。
重合は、そのタイプのカラムの過去の過程により又はカラム内で温度測定デバイスにおける温度読み取りからのいずれかで決定されるようなある温度で起こり得る。他方で、重合進展として、異なる量の温度は、温度急騰ゾーン内に移動することなしに許容され得、及び高温度は、カラムのための所望な特性を提供するために安全に利用され得る。このモードにおいて、水槽の温度は、一時期ある温度で維持され及びついで、別の温度に増加され得る。一連のそのような工程は、利用され得る。
実施例２１
７５ｍｍの長さ×３５ｍｍのＩＤカラムにおいて、タンパク質分離のための弱カチオン交換カラムを、以下の混合物を有して製造した：３６．０１ｇのＥＤＭＡ、３．０１ｇのＧＭＡ、１５．０１ｇのＭＭＡ、６．０９ｇのアクリル酸、０．９４ｇのＡＩＢＮ、８５．６７ｇの１−ドデカノール及び１０．５７ｇのキシロヘキサノール。重合は、水槽において４０℃で７２時間起き次いで、重合を６０℃で２４時間続けた。カラムを、１０床容量のアセトニトリルで４５℃で及び２．０７ＭＰａ（３００ｐｓｉ）の一定の圧力で洗浄した。カラムは、液体クロマトグラフィにより特性決定され及び良好なタンパク質分離を提供した。
実施例２２
７５ｍｍの長さ×３５ｍｍの内部直径を有する弱カチオン交換カラムを、以下の混合物で製造した：３６．０２ｇのＥＤＭＡ、３．０３ｇのＧＭＡ、１５．０３ｇのＭＭＡ、６．０８ｇのアクリル酸、０．９３ｇのＡＩＢＮ、８５．６４ｇの１−ドデカノール及び１０．５３ｇのシクロヘキサノール。
カラムを、４０℃で７２時間次いで６０℃で２４時間重合した。４５℃で２．０７ＭＰａ（３００ｐｓｉ）の一定の圧力で１０床容量のアセトニトリルのポロゲン洗浄が、使用された。良好なタンパク質分離を、得た。
実施例２３
３５ｍｍのＩＤ、１００ｍｍの長さの弱カチオンカラムを、以下の混合物で製造した：１２．８１ｇのアクリル酸、３２．０１ｇのＭＭＡ、６．４０ｇのＧＭＡ、７６．８３ｇのＥＤＭＡ、１７６．０４ｇの１−ドデカノール、１６．００ｇのシクロヘキサノール及び１．９６ｇのＡＩＢＮ。
重合を、水槽において４０℃〜６０℃の間の温度で１２時間次いで６０℃で２４時間行った。温度を、直線的に４０〜６０℃、最初の１２時間の間上昇した。カラムを、１０床容量のアセトニトリルで４５℃で２．０７ＭＰａ（３００ｐｓｉ）の一定の圧力で洗浄した。
実施例２４
弱カチオン交換カラムを、以下の混合物を有する３５ｍｍの内部直径及び３００ｍｍの長さのカラムハウジングで製造した：１２．８１ｇのアクリル酸、３２．０１ｇのＭＭＡ、６．４０ｇのＧＭＡ、７６．８３ｇのＥＤＭＡ、１７６．０４ｇの１−ドデカノール、１６．００ｇのシクロヘキサノール及び１．９６ｇのＡＩＢＮ。
重合は、４０〜６０℃の温度における直線的な増加で１２時間次いで６０℃で２４時間起きた。カラムを、上の実施例におけるように洗浄した。良好なタンパク質分離を、提供した。
実施例２５
弱カチオン交換カラムを、以下の混合物を有する３５ｍｍのＩＤ、３００ｍｍの長さのカラムハウジングにおいて製造した：１８．０５ｇのアクリル酸、４５．０６ｇのＭＭＡ、９．２１ｇのＧＭＡ、１０８．１３ｇのＥＤＭＡ、２３８．５２ｇの１−ドデカノール、３１．５６ｇのシクロヘキサノール及び３．１ｇのＡＩＢＮ。
混合物を、４０℃で７２時間及び次いで６０℃で２４時間重合した。カラムは、上に示されるように洗浄され及び良好なタンパク質分離を提供した。
実施例２６
７５ｍｍの長さ×３５ｍｍのＩＤの寸法を有する強アニオン交換カラムを、以下の混合物で製造した：８．１１ｇのＧＭＡ、２４．０９ｇのＥＤＭＡ、８．０７ｇのＡＴＭＳ、２８．０６ｇの１−プロパノール、２９．１４ｇの１，４−ブタンジオール、３．０５ｇの水及び０．４８ｇのＡＩＢＮ。
混合物を、４０℃で７２時間で重合し次いで６０℃で２４時間重合を続けた。カラムは、液体クロマトグラフィにより特性決定され及び良好なタンパク質を提供した。
実施例２７
３５ｍｍのＩＤ及び７５ｍｍの長さの寸法を有する今日アニオン交換カラムを、以下の混合物で製造した：８．０３１７ｇのＧＭＡ、２４．００８９ｇのＥＤＭＡ、８．０２９５ｇのＡＴＭＳ、２７．０１３４ｇの１−プロパノール、３０．０１７６ｇの１，４−ブンタンジオール、３．０３４４ｇの水及び０．６１７７ｇのＡＩＢＮ。それを、４０℃で７２時間次いで６０℃で１２時間重合した。カラムは、液体クロマトグラフィにより特性決定され及び良好なタンパク質分離を提供した。
実施例２８
３５ｍｍのＩＤ及び３００ｍｍの長さの寸法を有する強アニオン交換カラムを、重合して、強アニオン交換カラムを、以下の混合物を用いて提供した：２５．６６ｇのＧＭＡ、７６．８１ｇのＥＤＭＡ、２５．６４ｇのＡＴＭＳ、９６．０４ｇの１−プロパノール、８６．４９ｇの１，４−ブタンジオール、９．６２ｇの水及び１．９９ｇのＡＩＢＮ。
混合物を、４０℃〜６０℃の間の直線的な工程で２４時間重合し及び次いでそれを、６０℃で１２時間維持した。それを、１２時間徐々に増加する０．０６９〜１．０３ＭＰａ（１０〜１５０ｐｓｉ）の間の圧縮に付した。カラムは、液体クロマトグラフィにより特性決定され及び良好なタンパク質分離を提供した。
実施例２９
カラムを、３５ｍｍのＩＤ及び１００ｍｍの長さの寸法を有するペプチドの分離のための以下の混合物で製造した：１００．０６ｇのＤＶＢ、１０８．７７ｇのＴＥＧ、４１．２６ｇのＴＥＧ−ＤＭＥ及び１．２７ｇのＡＩＢＮ。
混合物を、４０℃〜６０℃の間で１２時間及び次いで６０℃で２４時間、４時間直線的に増加する０．０６９〜１．０３ＭＰａ（１０〜１５０ｐｓｉ）の間の圧縮で重合した。カラムは、液体クロマトグラフィにより特性決定され及び良好なペプチド分離を提供した。
実施例３０
多孔質モノリシックポリマーを、３４ｍｍのＩＤ及び２５ｃｍの長さを有するカラムにおいて製造し、実施例２におけるように以下の重合混合物で製造した：１２．８１ｇのＡＡ、３２．０１ｇのＭＭＡ、６．４０ｇのＧＭＡ、７６．３８ｇのＥＤＭＡ、１７６．０４ｇの１−ドデカノール、１６．００ｇのシクロヘキサノール、１．９６ｇのＡＩＢＮ。カラムを、１．０３ＭＰａ（１５０ｐｓｉ）の圧力下で２５℃で４８時間次いで６０℃で２４時間重合した。
それを、ＨＰＬＣポンプに接続し及び２０床容量のＴＨＦ及び水で各々洗浄した。
カラムを、加水分解反応に６ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨで８０℃で１時間付した。それを、２０床容量の水で洗浄し及びＬＣ特性決定方法において記載されるキャパシティ測定を結び付けて及びタンパク質分離で特性決定した。
実施例３０ａの代替バージョン
カラムを、実施例３０におけるように、２４時間における４０℃〜６０℃の重合温度のプログラム直線勾配以外で製造した。それを、次いで６０℃で別の１２時間保存した。
４．６ｍｍの直径及び５ｃｍの長さを有するカラムを、上の実施例におけるように、同一温度勾配で製造した。
１０ｍｍの直径及び１０ｃｍの長さを有するカラムを、上の実施例におけるように、同一温度勾配で製造した。
実施例３１
３４ｍｍの直径及び２５ｃｍの長さを有するカラムを、実施例２１におけるように以下の重合液体混合物で製造した：７８．８０ｇのＥＤＭＡ、３８．４６ｇのＧＭＡ、１１．９１ｇのＡＭＰＳ、１１．７２ｇの４．９Ｍ ＭａＯＨ水性液体混合物、１２，４４ｇの水、１６２．２３ｇの１−プロパノール、３８．７９ｇの１，４−ブタンジオール及び１．９７ｇのＡＩＢＮ。カラムを、２０床容量のアセトニトリル及び水で洗浄した。このポリマーを、更に、０．５Ｍ Ｈ2ＳＯ4において６０℃で３時間加水分解し及び次いで１０床容量の脱イオン水で洗浄した。この加水分解ポリマーを、更に、以下の手順で修飾した：このカラムを、５床容量の乾燥アセトニトリルで予備−洗浄して、カラムにおいて水を除去した。５床容量の修飾薬剤を、カラムを通して１．７２ＭＰａ（２５０ｐｓｉ）の一定圧力でポンプ移送した。修飾反応を、６０℃で３時間行った。反応後、修飾薬剤を、カラムから５床容量の０．５Ｍ Ｈ2ＳＯ4次いで別の１０床容量のナノ純度の水（nanopure water）で洗い落とした。修飾薬剤を、以下の手順のように製造した：１０％ピリジンを含むアセトニトリルを、氷バッチにおいて１０℃より低く冷却し、同等のクロロスルホン酸を、冷却液体混合物内に徐々に添加した。液体混合物の温度を、制御して、製造の全工程の間室温より低くした。
実施例３１ａの代替バージョン
カラムを、実施例３１におけるように、２４時間における４０〜６０℃の重合温度のプログラム化直線勾配を用いるのを除いて製造した。それを、次いで６０℃で別の１２時間保存した。
４．６ｍｍの直径及び５ｃｍの長さを有するカラムを、上の実施例におけるように同一温度勾配で製造した。
１０ｍｍの直径及び１０ｃｍの長さを有するカラムを、上の実施例におけるように同一温度勾配で製造した。
カラムを、実施例３１におけるように以下の重合混合物を使用することを除いて製造した：７８．８０ｇのＥＤＭＡ、３８．４６ｇのＧＭＡ、１１．９１ｇのＡＭＰＳ、１３．８９ｇの４．９Ｍ ＮａＯＨ水性液体混合物、６．２２ｇの水、１４０．８５ｇの１−プロパノール、３２．０２ｇの１，４−ブタンジオール及び１．９７ｇのＡＩＢＮ。
上の記載から、本発明の新規モノシリック固体支持体が、以下のいくつかの利点を有することが理解され得る：例えば（１）それは、クロマトグラムを先行技術よりも優れている方法において提供し；（２）それは、簡単及び安価に製造され得；（３）それは、いくつかの分離のために、先行技術分離より高流速を提供し、従っていくつかの分離の時間を低減し；（４）それは、いくつかの分離方法のためにいくつかの先行技術方法より低い圧力で高分解分離を提供し；（５）それは、使い捨てカラムでカラムのコストを低減することにより高分解を提供し；（６）それは、多くの異なる形のカラム、例えば環状クロマトグラフィのための環状カラムが簡単に製造されるのを、及びいくつかの寸法特に小さな寸法において例えばマイクロチップ及び毛管のための及び質量分析注入器のためのモノリシック透過ポリマーチップを用いて製造されるのを可能にし；（７）それは、小さな及び大きな分子の双方を早く分離し；（８）それは、数ある中でも抽出、クロマトグラフィ、電気泳動、触媒のための超臨界流体クロマトグラフィ及び固体支持体、ＴＬＣ及び集積ＣＥＴ分離又は化学反応を含む多くの方法のために優れた分離剤を提供し得；（９）それは、より良好な特性を提供して、既知の透過モノリシック分離媒体を確実にし得；（１０）それは、均質分離−有効開口部サイズ分布を有する大きな直径カラムの製造のための新規のアプローチを提供し；（１１）それは、壁有効性を伴わず高水性移動相において及び改良されたカラム有効性を伴い分離媒体を提供し：（１２）それは、分離有効性因子を改良し；及び（１３）それは、逆相カラムにおける膨張及び収縮の問題を低減する。
本発明の好ましい実施態様は、詳細に記載されているが、本発明における多くの変化は、上の技術の観点内で可能である。従って、添付のクレームの範囲内で、本発明は、具体的に記載される以外に行われ得ることが理解されるべきである。
図１は、本発明の実施態様に従ったクロマトグラフカラムを製造するための方法のある実施態様の説明図である。 図２は、重合の間のガラスカラムへ圧力を加えるためのフィクスチャーのアセンブリーである。 図３は、重合の間のステンレス鋼カラムへ圧力を加えるための別のフィクスチャーのアセンブリーである。 図４は、重合の間のガラスカラムへ圧力を加えるための更に別のフィクスチャーのアセンブリーである。 図５は、０．８２７ＭＰａ（１２０ｐｓｉ）油圧下でのシリンダーカラム内で重合された強カチオン交換体の走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）図である。 図６は、カラムについてのタンパクサンプルからのピークを示すクロマトグラムであり、その中においては、ねじれ(distortion)が重合の間の圧力により避けられている。 図７は、３つの絡むを示す写真であり、左側の１つは、重合の間の圧力を用いて製造され、及び、右側の２つは、圧力なしに重合されている。 図８は、カラムの配列を有し及び配列において互いに類似する再現可能な特性を有するクロマトグラフ系の構成図である。 図９は、媒体エネルギー（１１０ｋＥＶ）Ｘ線照射重合で達成されるクロマトグラフィー分離を示すクロマトグラフである。 図１０は、クロマトグラフカラムのためのＵＶ又は可視光重合装置の上面図である。 図１１は、図１０の装置の側断面図である。 図１２は、クロマトグラフカラムのためのＸ線重合装置の略正面図である。 図１３は、図１２の装置の部分の上面図である。 図１４は、ライン１４から１４で行われた図１２の装置の部分の断面立面図である。 図１５は、図１３のライン１５から１５で行われた断面立面図である。 図１６は、モノリシックカラムを形成するための混合物を重合するための装置の計画図である。 図１７は、図１６の実施態様において有用な温度勾配をモニターするためのその中における温度測定デバイスを有するカラムの切り欠き(broken-away)、単純化部分断面図である。 図１８は、正当な量の時間において得ることが可能な重合の程度について低温可変温度重合と低温一定温度重合を比較するグラフである。 図１９は、方法においてカラムのセンターから外表面までの温度を示すグラフであり、その中においては、外表面の温度は、カラムのセンターと同一の温度で維持されている。 図２０は、ＥＤＭＡ及びＧＭＡでのＡＭＰＳの共重合のための方法及び方法の改良を説明する式１、式２及び式３を有する図である。 図２１は、温度−時間適切化カラムにおける分離のクロマトグラムである。

Claims (49)

  1. サンプルインジェクター；サンプルインジェクターからサンプルを受け取るために位置するカラムケーシングの内側の少なくとも１つの透過性モノリシックポリマー性プラグ及びカラムケーシングを有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラム；溶剤を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムに供給し、それにより、サンプルが、その成分に、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラム内で分離されるためのクロマトグラフィーカラムに連通する溶剤系；内部カラム壁表面を有するカラムケーシング壁を含む前記少なくとも１つのカラムケーシング；及び前記クロマトグラフィーカラムから液体を受け取るためのユーティリティデバイスを含むクロマトグラフシステムであって、カラム壁の内側面と接触する切れ目のない滑らかな壁を有する少なくとも１つの透過性モノリシックポリマー性、温度−時間適切化プラグにより特徴付けられるクロマトグラフシステム。
  2. 少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムが、少なくとも１つの透過性モノリシックポリマー性、温度−時間適切化プラグの対応するものの中の対応する温度測定デバイスを含む請求項１に記載のクロマトグラフシステム。
  3. 少なくとも１つの透過性モノリシックポリマー性温度−時間適切化プラグが、ジビニルベンゼンを含む請求項１又は２に記載のクロマトグラフシステム。
  4. 少なくとも１つの透過性モノリシックポリマー性、温度−時間適切化プラグが、疎水性表面基を有するグリシジルメタクリレートを含む請求項１又は２に記載のクロマトグラフシステム。
  5. 少なくとも１つの透過性モノリシックポリマー性、温度−時間適切化プラグが、尿素ホルムアルデヒドを含む請求項１又は２に記載のクロマトグラフシステム。
  6. 少なくとも１つの透過性モノリシックポリマー性、温度−時間適切化プラグが、シリカを含む請求項１又は２に記載のクロマトグラフシステム。
  7. カラムケーシングがガラスである請求項１〜６のいずれか１項に記載のクロマトグラフシステム。
  8. 少なくとも１つの透過性モノリシックポリマー性、温度−時間適切化プラグが、サイズ補正されたものである請求項１〜７のいずれか１項に記載のクロマトグラフシステム。
  9. 発熱により生じる実質的に不均一な細孔サイズなしにポリマー性モノリシックパッキング及びカラムケーシングを有するクロマトグラフィーカラムにサンプルを供給する工程；及び溶剤をクロマトグラフィーカラムに供給し、それにより、サンプルが、その成分に、クロマトグラフィーカラム内で分離される工程を含むクロマトグラフィーを行う方法であって、ポリマー性モノリシックパッキングが、温度−時間適切化されている方法。
  10. ポリマー性モノリシックパッキング及びカラムケーシングを有するクロマトグラフィーカラムにサンプルを供給する工程が、サイズ補正されているクロマトグラフィーカラムにサンプルを供給する工程を含む請求項９に記載のクロマトグラフィーを行う方法。
  11. ポリマー性モノリシックパッキング及びカラムケーシングを有するクロマトグラフィーカラムにサンプルを供給する工程が、ビニル基を含む透過性モノリシックポリマー性プラグにサンプルを供給する工程を含む請求項９又は１０に記載の方法。
  12. ポリマー性モノリシックパッキング及びカラムケーシングを有するクロマトグラフィーカラムにサンプルを供給する工程が、尿素ホルムアルデヒドを含む透過性モノリシックポリマー性プラグにサンプルを供給する工程を含む請求項９又は１０に記載の方法。
  13. ポリマー性モノリシックパッキング及びカラムケーシングを有するクロマトグラフィーカラムにサンプルを供給する工程が、シリカポリマーを含む透過性モノリシックポリマー性プラグにサンプルを供給する工程を含む請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 内部カラム壁内の分離−有効開口部を有する透過性モノリシックポリマー性プラグ及び該カラム壁を有するクロマトグラフィーカラム支持体を含むクロマトグラフィーカラムであって、透過性モノリシックポリマー性プラグが、温度−時間適切化での重合により形成される断面均一性を有するポリマーであることを特徴とするクロマトグラフィーカラム。
  15. 分離−有効開口部のサイズが、重合の間の圧力により、少なくとも部分的に制御される請求項１４に記載のクロマトグラフィーカラム。
  16. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、滑らかな壁を有し、及び、圧力により補正されるサイズである請求項１４又は１５に記載のクロマトグラフィーカラム。
  17. 透過性モノリシックポリマー性プラグ内に実質的に細孔が存在せず、及び、透過性モノリシックポリマー性プラグが、滑らかな壁を有する請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  18. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、プラグの壁においてチャネリング開口部を有さない請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  19. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、主に、メタクリレートから形成される請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  20. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、主に、疎水性表面基を有するメタクリレートから形成される請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  21. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、主に、尿素ホルムアルデヒドから形成される請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  22. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、主に、シリカから形成される請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  23. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、主に、１：１〜２：１の範囲の質量比のグリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートとのポリマーから形成される請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  24. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、主に、３：２の質量比のグリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートとのポリマーから形成される請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  25. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、その主成分として、３：１〜９：１の範囲の比のジビニルベンゼンとスチレンとの混合物を含む請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  26. 透過性モノリシックポリマー性プラグが、その主成分として、４：１の範囲の比のジビニルベンゼンとスチレンとの混合物を含む請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  27. カラムが、３５〜８０質量％の範囲におけるジビニルベンゼンである請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  28. カラムが、６４質量％のジビニルベンゼンである請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  29. カラムが、その中に温度測定デバイスを有するポリマー性プラグを含む請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  30. １０ｍｍを越える直径を有する請求項１４〜２９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  31. 平方ミリメートルあたりのカラムの縦軸の方向における細孔開口部の平均サイズ及び平方ミリメートルあたりの細孔の容量が、位置によって変化せず及び５％を越えて変化しない請求項１４〜３０のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーカラム。
  32. 重合の間の温度変化のための手段とそれによる重合混合物が温度−時間適切化により特徴付けられる重合の間に重合混合物を含むように適応された温度制御反応チャンバーを含むクロマトグラフィーカラムを製造するための装置。
  33. 前記温度制御反応チャンバーにおける前記重合混合物に圧力を加えるための手段により特徴付けられる請求項３２に記載のクロマトグラフィーカラムを製造するための装置。
  34. 圧力を加えるための手段が、移動可能な部材で圧力を加えるための手段である請求項３３に記載の装置。
  35. 移動可能な部材が、圧力が重合の間に加えられるように、前記重合混合物と接触するように位置する滑らかな表面を有する請求項３４に記載の装置。
  36. プラグを形成するための重合の間に重合混合物を含むように適応された温度制御反応チャンバー；プラグに水溶液を加えるための水性処理手段；及び該プラグに圧力を加えて、プラグにおけるボイドを低減するための手段を含むクロマトグラフィーカラムを製造するための装置であって、温度制御反応チャンバーが、温度−時間適切化のための手段を含む装置。
  37. 放射線をプラグに照射するための放射手段；及び放射線を制御するための制御手段により特徴付けられる請求項３６に記載の装置。
  38. カラムケーシング内に重合混合物を置く工程を含む方法であって、低及び高温度重合の組み合わせを使用してカラムケーシング内の重合混合物を重合する工程により特徴付けられる方法。
  39. カラムケーシング内に重合混合物を置く工程が、少なくとも１０ｍｍの直径を有するカラムケーシング内に重合混合物を置く工程を含む請求項３８に記載の方法。
  40. カラムケーシング内に重合混合物を置く工程を含む方法であって、重合混合物が、スルホン酸基を含む官能モノマーを含み；及び混合物を直接重合して、強陽イオン交換体を提供することを特徴とする方法。
  41. カラムケーシング内に重合混合物を置く工程が、重合混合物内のポリマーを加水分解し及びクロロスルホン酸でポリマーを加水分解する工程において形成されたヒドロキシルを修飾する工程を含む請求項４０に記載の方法。
  42. カラムケーシング内に重合混合物を置く工程が、重合混合物内のポリマーを加水分解し及びクロロスルホン酸のピリジン塩溶液でポリマーを加水分解する工程において形成されたヒドロキシルを修飾する工程を含む請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 重合混合物を製造する工程を含むモノリシッククロマトグラフィーカラムを製造する方法であって、温度−時間適切下条件下で重合を行い、それにより、温度勾配が制御されて、モノリシッククロマトグラフィーカラムにおける空間断面変化を防止することを特徴とする方法。
  44. 重合を圧力下において行い、それにより、十分な圧力を加えて、重合の間のシュリンケージによる真空により引き起こされる、ボイドが形成されるのを防止する請求項４３に記載の方法。
  45. 温度−時間適切化で重合を行って、ポリマープラグを形成することにより特徴付けられるポロゲンを含む重合混合物を製造する工程；ポリマープラグを洗浄して、ポロゲンを除去する工程、ここでプラグが膨張する傾向にある；及び圧力を加えて、ポリマープラグの膨張を防止し及びボイドを排除する工程を含むモノリシッククロマトグラフィーカラムを製造する方法。
  46. ＧＭＡ、ＡＴＭＳ、ＥＤＭＡ、開始剤及びポロゲンを混合して、重合混合物を形成する工程；及びカラム内において混合物を重合する工程を含む強アニオンカラムを製造する方法であって、混合物を、温度−時間適切化条件下で重合して、プラグを形成することを特徴とする方法。
  47. 混合物を重合する工程が、低温での制御開始ポイントで出発し及び温度を安全ポイントまで次第に上昇させ及び高温で硬化する勾配温度で重合する工程を含み、温度ランナウェイが避けられ及び適切な重合及び架橋結合が得られる請求項４６に記載の方法。
  48. 混合物を重合する工程が、３５〜４５℃の値での制御開始ポイントで出発し及び温度を安全ポイントまで次第に上昇させ及び高温で硬化する勾配温度で重合する工程を含む請求項４６又は４７に記載の方法。
  49. 混合物を重合する工程が、制御開始ポイントで出発し及び安全ポイントまで次第に上昇され及び高温で硬化する勾配温度で重合する工程を含む請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
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