DE69219125T2 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis von kontaminationsspuren - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren und eine Vorrichtung, die für chromatographische Verfahren zweckdienlich sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Detektion löslicher Kontaminationsspuren in einer Produktprobe.
Grundlagen der Erfindung
• Lösliche Verunreinigungen können in einer gereinigten Produktprobe in Spurenmengen vorhanden sein, die mit Hilfe herkömmlicher Mittel schwierig zu detektieren sind, die aber signifikante biologische Wirkungen besitzen können. Folglich muß das Vorhandensein von gelösten Verunreinigungsspuren häufig während oder nach Synthese oder Reinigung des Produkts bestimmt werden. Es kann notwendig sein, die Qualität einer Produktpräparation, einschließlich des Vorhandenseins von gelösten Verunreinigungsspuren, bei jedem Schritt eines präparativen Verfahrens und am Ende des präparativen Verfahrens zu beurteilen, wenn das Produkt gebrauchsfertig ist. Bundesverordnungen schreiben Reinheitsanforderungen für viele Verbrauchsprodukte vor, insbesondere für Nahrungsmittel und pharamzeutische Produkte. Im allgemeinen wird die Qualität einer Produktpräparation mit einem zuvor etablierten Identifizierungskriterium, beispielsweise einer charakteristischen Dosisaktivität, bestimmt. Wenn das Produkt von Interesse ein Protein ist, kann die Identifizierung ebenfalls mittels Molekulargewichtsbestimmung, tryptischen Verdaus/Peptid-Kartierung und/oder Immunoaffinitätsbestimmung durchgeführt werden. Das Vorhandensein von gelösten Kontaminationsspuren in der Produktpräparation wird häufig durch das Vorhandensein des Produkts selbst verdeckt, insbesondere wenn das Produkt ein hochkonzentriertes Präparat umfaßt.
• Die Detektion von gelösten Verunreinigungsspuren in einer Produktpräparation kann schwierig, unerwünscht zeitaufwendig und sogar unmöglich sein, ohne große Mengen des Produkts zu verbrauchen, falls die in der Probe vorhandene Produktmenge in großem Überschuß im Verhältnis zu den vorhandenen Verunreinigung vorliegt. Dies kann ein Problem sein, wenn in einem medizinisch zweckdienlichen Produkt vorhandene sehr geringe Mengen einer Verunreinigung ernste physische Nebenwirkungen hervorrufen können, wenn das Produkt einem Patienten verabreicht wird. Die Detektion der Kontaminationsspuren sollte genau, schnell, adaptierbar und reproduzierbar sein.
• Spurenbeimengungungen sind mit Hilfe polyklonaler Antisera, die gegen Hintergrundkomponenten einer rekombinanten Proteinmischung gerichtet sind, detektiert worden. Zum Beispiel wenn das rekombinante Protein in Bakterien hergestellt wird, können Antisera gegen alle Proteine eines identischen Bakterienstammes, der nicht mit der das rekombinante Protein codierenden DNS transformiert worden ist, gerichtet sein. Dieses Antiserum wird nur bakterielle Proteine detektieren und nicht das rekombinante Produkt. Allerdings ist die Empfindlichkeitsgrenze eines Immuntests, der diesen Antiserumtyp verwendet, die Empfindlichkeitsgrenze des Immuntests selbst (das heißt, 10&supmin;¹² Mol). Auch ist die Reproduzierbarkeit eines derartigen Tests, bei dem gegen eine komplexe Antigenmischung gerichtete polyklonale Antisera verwendet werden, äußerst gering.
• Chromatographische und elektrophoretische Techniken sind auf dem Fachgebiet als Mittel zur Trennung von in einer Mischung vorhandener Komponenten (gelöster Stoffe) gut bekannt. Diese Techniken sind insbesondere in der Chemie und Biotechnologie zweckdienlich. Die eigentliche Chromatographie beschreibt die Trennung von gelösten Stoffen entsprechend deren unterschiedlichen Verteilung zwischen zwei (oder drei) Phasen. Die Phasen sind im allgemeinen fest und flüssig und die Verteilung gelöster Stoffe hat deren unterschiedliche Mobilität durch eine Feststoffschicht, typischerweise partikuläre Matrix in Anwesenheit einer fließenden Phase zur Folge. Der Transport der gelösten Stoffe durch die Schicht geschieht entlang eines Druckgradienten, im allgemeinen als "Flüssigchromatographie" bezeichnet. Im Gegensatz dazu trennen elektrophoretische Systeme gelöste Stoffe aufgrund deren elektrophoretischer Mobilität, isoelektrischen Punkts und/oder unterschiedlicher Wanderung durch eine Größen unterscheidende Matrix. Der Transport der gelösten Stoffe in diesen Systemen erfolgt durch einen Spannungsgradienten eines angelegten elektrischen Felds.
• Chromatographische Martices können Komponenten mittels mehrerer beliebiger Kriterien, einschließlich Größe, elektrischer Ladung, hydrophober Wechselwirkung und/oder spezifischer Affinität für die Matrix oder deren Bindungsstellen getrennt werden. Da die Komponenten in der Mischung in ihrer Affinität für die Matrix variieren, trennt die Verteilung die Komponenten, wenn sie die Matrix durchlaufen, so daß die Komponenten nacheinander, zeitlich und räumlich getrennt, die Matrix verlassen. Die Bestimmung der Stelle von den verschiedenen getrennten Komponenten oder von gegebenen Komponenten von Interesse innerhalb der Reihenfolge wird erreicht durch Sammeln der flüssigen Phase, die die Matrix verläßt (d.h. der Auslauf), als Fraktionsreihen und Untersuchen dieser Fraktionen, um ihre Inhalte mit einem beliebigen in der Technik bekannten Mittel zu bestimmen.
• Die Auftrennung der verschiedenen Komponenten in der Mischung hängt von mehreren Umständen ab, wobei im wesentlichen das Trennvermögen der Matrix und die Höhe und Anzahl der theoretischen Böden des Systems (siehe unten) entscheidend sind. Im allgemeinen ist ein großes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen gewünscht. Matrices für Flüssigchromatographie-Systeme befinden sich typischerweise in zylindrischen Chromatographie-Systemen, auch als Säulen bekannt. In Elektrophorese-Systemen erfordert eine hohe Auftrennung auch eine effiziente Abgabe der Wärme, die durch das angelegte elektrische Feld entsteht. Kapillarelektrophorese oder andere Elektrophoresemodule, die ein großes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen liefern, geben die Joule Wärme gut ab, was eine schnelle Analyse ohne signifikante Minderung der Auftrennung erlaubt.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die Erfindung kennzeichnet ein Detektionsverfahren einer Spurenbeimengung in einer Lösung, die eine große Menge eines gelösten Produkts umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Durchfluß der Lösung durch Produkt- Extraktionsmittel um einen Auslauf zu bilden, der im wesentlichen frei von dem Produkt ist, aber die verbleibenden Spurenbeimengung oder -beimengungen enthält; Durchfluß des Auslaufs durch ein eine Spurenbeimengung adsorbierendes Mittel, um darin die Spurenbeimengung(en) zunehmend zu akkumulieren; und Elution der Spurenbeimengung(en) von dem Adsorptionsmittel, um eine Eluentfraktion, die eine detektierbare Menge der Spurenbeimengung enthält, zu bilden.
• In einem weiteren Aspekt kennzeichnet die Erfindung eine Vorrichtung zur Detektion einer Spurenbeimengung in einer Lösung, die eine große Menge eines gelösten Produkts umfaßt, wobei die Vorrichtung umfaßt: ein Mittel zur Extraktion des Produkts aus der Lösung um einen Auslauf zu bilden, der im wesentlichen frei von dem Produkt ist, aber die Spurenbeimengung oder -beimengungen enthält; ein Mittel zur Adsorption der Spurenbeimengung(en) aus dem Auslauf, um darin die Spurenbeimengung(en) zunehmend zu akkumulieren; und ein Mittel zur Elution der Spurenbeimengung von dem Adsorptionsmittel, um eine Eluentfraktion, die eine detektierbare Menge der Spurenbeimengung enthält, zu bilden.
• Wie in den beiden letzten vorausgehenden Absätzen definiert, ist Gegenstand der Erfindung das Problem, die Maskierung oder Überlagerung der Verunreinigungen durch das Produkt von Interesse zu überwinden, um eine qualitative oder quantitative Bestimmung der Verunreinigungen zu ermöglichen. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung, per contra, beschreibt eindrucksvoll C.K. Lim, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 7, Nr. 9, 1988, Seiten 340- 345, das Entfernen und Verwerfen von Verunreinigungen, um die Bestimmung des Produkts von Interesse zu erlauben. Folglich versucht Lim Verunreinigungen zu extrahieren oder zu entfernen (sie zu verwerfen), bevor das Produkt von Interesse (das Analyt) auf eine analytische Säule zur Analyse geleitet wird.
• Folglich ist die Erfindung zur Identifizierung des Vorhandenseins und der Menge an Kontaminationsspuren, die mit dem Produkt von Interesse aufgereinigt werden, in einer Probe zweckdienlich. Damit ist eine Information über die Qualität und Reinheit des Produkts von Interesse durch Analysieren der Verunreinigungen nach Entfernen des möglicherweise interferierenden Produkts zu erhalten.
• In bevorzugten Anwendungen beider Erfindungsaspekte kann eine Chromatographie-Matrix, vorzugsweise eine Perfusionschromatographie-Matrix, am bevorzugtesten eine Affinitätschromatographie-Matrix, verwendet werden, um die Hauptkomponente der Probenlösung, d.h. das Probenprodukt, aus der Lösung zu extrahieren. In anderen bevorzugten Anwendungen ist der Adsorber der Spurenbeimengung eine Perfusionsmatrix, die in der Lage ist, Proteine nichtselektiv zu binden; und die Vorrichtung kann außerdem Mittel zur Detektion der von dem Adsorptionsmittel eluierten Spurenbeimengungen umfassen. Die Spurenbeimengung kann beispielsweise ein oder mehrere Pyrogene oder andere bakterielle Proteine sein, wo das gelöste Produkt ein rekombinantes Protein ist.
• Wie hier verwendet, bezieht sich "Produkt" auf den Hauptbestandteil der Probenlösung vor Extraktion; "Spurenbeimengung" bezieht sich auf eine lösliche Komponente der Produktprobe außer das Produkt selbst, wobei diese Komponente in Spurenmengen vorhanden ist, d.h. weniger als 10%, typischerweise weniger als 1,0 Gew.% der Produktprobe; "Extraktion" bezieht sich auf das Entfernen von im wesentlichen allem, d.h. > 95%, einer Komponente der Probenlösung; "Adsorption" einer Komponente der Probenlösung heißt, daß die Komponente auf der Oberfläche, mit der sie in Kontakt kommt, haftet; "Effluent" bezieht sich auf einen Auslauf; "Eluent" bezieht sich auf ein eluiertes Volumen; "Pyrogen" bezieht sich auf ein Protein oder einen anderen Typus einer Verunreinigung, die in einem Patienten Fieber hervorruft; "detektierbare Menge" bezieht sich auf eine Menge einer Komponente, die mit herkömmlichen Mitteln detektierbar ist;
• "rekombinantes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das mit Hilfe rekombinanter DNS-Techniken hergeleitet ist.
• Die Erfindung liefert ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion von Spurenmengen löslicher Verunreinigungen, z.B. Pyrogene, in einer biologischen Probe eines relativ reinen Produkts. Vorteile des Verfahrens und der Vorrichtung der Erfindung umfassen Schnelligkeit, Qualität und Zuverlässigkeit der Detektion von Verunreinigungsspuren. Ein Hauptvorteil ist die Vermeidung des Einsatzes von polyklonalen Antikörpern für bakterielle Epitope und ihre damit verbundene Variabilität und Kosten. Ein weiterer Hauptvorteil der Testtechnik der Erfindung ist, daß sie eigentlich unendlich empfindlich ist, d.h. mit dem Verfahren und der Vorrichtung der Erfindung können Verunreinigungen detektiert werden, die um Größenordnungen verdünnter sind, als bei Immunoassay- Techniken, vorausgesetzt ein hinreichendes Probenvolumen ist verfügbar. Weil die Hauptproduktkomponente der Probe aus der Probenlösung in dem Produktextraktionsschritt entfernt wird und die löslichen Kontaminationsspuren in dem Adsorptionsschritt aus einem hinreichend großen Volumen einer produktarmen Probenlösung akkumuliert werden, um eine nach Elution detektierbare Menge an Spurenbeimengungen zu liefern, ergibt die Elution der Spurenbeimengung in einem kleinen Volumen eine Probenlösung, die relativ frei ist von Produkt und mit Verunreinigungen beträchtlich angereichert ist. Der mit Verunreinigungen angereicherte Auslauf kann dann detektiert und/oder mit herkömmlichen Mitteln quantifiziert werden. Das Verfahren und die Vorrichtung liefert einen schnellen Flüssigkeitstransport und es gibt keine signifikante Minderung der Auftrennung zwischen dem ersten und zweiten Auslauf. Ein weiterer Hauptvorteil ist, daß die eluierten Verunreinigungen in weitere Komponenten mittels Gradientenelution aufgetrennt werden können und deshalb getrennt detektiert und möglicherweise indentifiziert werden können.
• Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung von bevorzugten Anwendungen der Erfindung ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Abb. 1 ist eine schematische Darstellung von einer Anwendung der Vorrichtung der Erfindung.
• Abb. 2 ist eine Darstellung von Chromatogrammen (280 nm) einer Probenlösung (a) vor einem Test auf Kontaminationsspuren, wo das gelöste Produkt in der Probe vorhanden ist, und (b) nach einem Test auf Kontaminationsspuren gemäß der Erfindung, wo das Produkt in der Probe fehlt.
Beschreibung
• Das Verfahren und die Vorrichtung dieser Erfindung kann mit Blick auf die schematische Darstellung von einer in Abbildung 1 veranschaulichten Anwendung der Erfindung verstanden werden. Eine Probe 10, die eine Mischung aus Produkt und Verunreinigungsspuren enthält, wird einem ersten System 12 bereitgestellt, das in der Lage ist, die Proben-Produktkomponente selektiv zu binden und folglich sie aus der Probe zu extrahieren. Die Kapazität des Extraktionsmittels 12 ist mindestens groß genug und ist vorzugsweise weitaus größer, um praktisch das gesamte Produkt aus der Probenlösung zu extrahieren. Der die Verunreinigungsspuren enthaltende Auslauf 14 aus diesem ersten System wird durch Hahn 32 und ein zweites System 16 geleitet, das in der Lage ist, die Verunreinigungsspuren zu adsorbieren und folglich diese aus der Probe zu entfernen. Ein relativ großes Volumen an Probe und folglich an Produkt-extrahiertem Auslauf 14 wird über das zweite System geleitet, das die Spurenbeimengungen aus der Probenlösung adsorbiert, typischerweise nichtselektiv, und folglich die gelösten Kontaminationsspuren akkumuliert. Der Auslauf aus dem zweiten System 16 geht zum Ausguß durch Hahn 34 und Ausgußleitung 36 oder wird durch einen Detektor 18 geleitet, um sicherzustellen, daß der Auslauf keine nicht adsorbierten Verunreinigungen enthält. Die Spurenbeimengungen werden dann von dem zweiten System 16 mit einem durch Leitung 30 und Hahn 32 zugeführten Eluent eluiert und durch den Detektor 18 geleitet, um Ausgabedaten 20 zu erhalten, die beispielsweise die zeitliche und/oder räumliche Reihenfolge der das zweite System verlassenden Kontaminationsspuren beschreiben. Wo die Spurenbeimengungen Proteine sind, kann das zweite System 16 eine beliebige Protein bindende Matrix; reverse Phase, hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenaustausch etc. sein, und Detektion kann mittels eines herkömmlichen Detektors erfolgen, z.B. ein Detektor, der Ultraviolett-Absorption durch einen Film oder Flüssigkeit mißt. Spurenbeimengungen außer Proteine können mit geeigneten herkömmlichen Mitteln detektiert werden.
• Die sehr hohe Empfindlichkeit der Vorrichtung ist eine Folge der Fähigkeit des zweiten Systems, die Verunreinigungen aufzukonzentrieren durch: (1) ihre Akkumulierung, weil ein relativ großes Volumen der Produktextrahierten Probe das zweite System durchfließt, und (2) Abgabe der Verunreinigungen an ein relativ kleines Volumen an Eluent. Folglich können beispielsweise 100 ml Probe, die 10&supmin;³ g/ml Produkt und 10&supmin;¹² g/ml Verunreinigungen enthalten, durch die Vorrichtung geleitet werden. Das Produkt (0,1 g) wird im ersten System 12 extrahiert, und die Verunreinigungen (10&supmin;¹&sup0; g) im zweiten System 16 akkumuliert. Als nächstes werden die Verunreinigungen im zweiten System 16 mit z.B. 10 Mikroliter Eluent eluiert, um einen Auslauf mit einer detektierbaren Konzentration von 10&supmin;¹&sup0; g/10&supmin;&sup5; Liter oder 10&supmin;&sup5; g/l zu bilden, der zum Detektor 18 geleitet wird. Das im ersten System 12 extrahierte Produkt wird dann mittels Durchlauf einer Elutionslösung aus Leitung 11, durch Hahn 28, Extraktor 12, Hahn 32 und Leitung 33 wiedergewonnen.
• Die Vorrichtung umfaßt vorzugsweise Mehrwege-Hähne 28, 32 und 34, die beispielsweise bei automatisierten, dem Fachmann bekannten Protein-Produktionssystemen Verwendung finden. Der Mehrwege-Hahn 28 kann verwendet werden, um wahlweise die Probe über Leitung 9, den Eluent über Leitung 11 oder den Äquilibrierungspuffer über Leitung 13 dem ersten System 12 zuzuführen, um alle notwendigen Durchflüsse zu liefern. Hahn 32 kann eingestellt werden, um den Probenauslauf oder den System 12 verlassenden Puffer in das System 16 zu führen, um einen Eluent in System 16 zu leiten, um einen Eluent aus System 12 in Leitung 33 als Vorbereitung für den nächsten Test zu lenken oder das Produkt zu sammeln. Hahn 34 erlaubt die Durchleitung eines Auslaufs aus dem zweiten System 16 zum Ausguß 36 oder eines Eluents, der die Verunreinigungen enthält oder frei von Verunreinigungen ist, zum Detektor 18. Hahnstellungen für alle Mehrwege-Hähne können entweder manuell oder Computer-gesteuert sein und die Fließmittelförderung kann mit einer oder mehreren Meßpumpen erfolgen (nicht gezeigt). Die Mehrwege-Hähne können "Fluß-Splitter" oder andere Mittel zur Reduktion und/oder Steuerung ausschließlich der gewünschten Durchflußrate für das erste und zweite System umfassen.
• Bei Betrieb wird die Probe 10, z.B. mit einer Meßpumpe, in den ersten Systemextraktor 12 über Leitung 9 des Mehrwege-Hahns 28 geladen. Wenn die Probe durch den Extraktor 12 fließt, wird die Produktkomponente in System 12 zurückgehalten, und der Auslauf fließt aus dem ersten System 12 über Leitung 14 und Mehrwege-Hahn 32 in das zweite System 16. Die Spurenbeimengungen, die in der Auslaufprobe vorhanden sind, werden vom zweiten System 16 zurückgehalten. Wenn der gesamte Auslauf durch das zweite System 16 geflossen ist, kann der Mehrwege-Hahn 32 gedreht werden, um ein Waschen von System 16 mit einer Waschlösung zu ermöglichen, die in System 16 über Leitung 30 fließt. Die Waschlösung kann System 16 über Mehrwege- Hahn 34 und Leitung 36 verlassen. Die Spurenbeimengungen können von System 16 mit Hilfe eines Elutionspuffers, der ebenfalls System 16 über Leitung 30 und Hahn 32 zugeführt werden kann, eluiert werden. Das relativ kleine Elutionsvolumen, das die Spurenbeimengungen enthält, fließt über Hahn 34 in Detektor 18. Die Detektion kann mit Hilfe eines geeigneten Tests erfolgen, z.B. falls UV-Absorption verwendet wird, kann ein Absorptionsspektrum (Chromatogramm) 20 aufgenommen werden, das das Vorhandensein und die Menge einer oder mehrerer Spurenbeimengungen anzeigt, die in der mit Hilfe des chromatographischen Mittels von System 16 getrennten eluierten Probe vorhanden sind. Falls das extrahierte Produkt vom ersten System 12 wiedergewonnen werden soll, kann System 12 mit Hilfe einer Waschlösung, die System 12 über Leitung 13 zugeführt wird, gewaschen werden, und ein Eluent kann System 12 über Leitung 11 zugeführt werden. Die eluierte Produktprobe kann aus System 12 über Leitungen 14 und 33 wiedergewonnen werden, sobald der Mehrwege-Hahn in die richtige Position gedreht ist. Beliebige oder alle obigen Schritte können durch Computerbefehle automatisiert werden.
• Als Teil des Produktprüfungs- oder Produktkontrollsystems ist das Verfahren und die Vorrichtung dieser Erfindung zur Identifizierung des Vorhandenseins von Kontaminationsspuren zweckdienlich, die mit dem Produkt von Interesse mitgereinigt werden. Vorausgesetzt, daß das erste System im wesentlichen das gesamte Produkt von Interesse aus der flüssigen Phase ohne signifikante Beeinflussung der Menge oder Zusammensetzung der Kontaminationsspuren in der Probenmischung selektiv extrahiert, kann das Vorhandensein und die Konzentration von Verunreinigungsspuren in der Probe gemäß der Erfindung detektiert werden.
• Schlüsselmerkmale dieser Erfindung, die diese als Teil eines Produkt-und/oder Prozeßkontrollprotokolls zweckdienlich machen, sind die Geschwindigkeit, Qualität und Zuverlässigkeit der Detektion von gelösten Kontaminationsspuren. Während das Verfahren und die Vorrichtung theoretisch unter Verwendung herkömmlicher HPLC für das erste und zweite System realisiert werden kann, muß für den praktischen Gebrauch ein rascher Flüssigkeitstransport durch beide Systeme in der Vorrichtung erfolgen, und es darf kein signifikanter Auftrennungsverlust zwischen dem ersten Auslauf und dem Eluent geben.
• Die Auftrennung der verteilten Beimengungen in einer Mischung ist eine Funktion sowohl der Affinität der verschiedenen Beimengungen für die trennende Komponente (im allgemeinen eine Matrix) als auch der theoretischen Bodenhöhe des Systems. Ein "Boden" in der Säulenchromatographie kann als die größte einheitliche Zone, die eine Beimengung aufnehmen kann, betrachtet werden. Je kleiner die Bodenhöhe einer Säule ist, desto mehr diskrete Schritte (höhere Bodenzahl) wird eine Beimengung durchlaufen, die durch die Matrix wandert, was für eine bessere Trennung ähnlicher Komponenten sorgt. Allgemein, je größer das Verhältnis von Matrix-Oberfläche zu Säulenvolumen ist, desto kleiner ist die Bodenhöhe und desto größer ist die erreichbare Bodenzahl. Die Säulenabmessung richtet sich im allgemeinen nach der Abmessung des kleinsten möglichen Matrixvolumens, das eine hinreichende Bodenzahl liefert, um die Komponenten von Interesse aufzutrennen. Kleinere Volumina erhöhen die Geschwindigkeit des Flüssigkeitstransports durch das System und vermindern die Zonenverbreiterung. Bevorzugte Matrices bestehen aus porösen Partikeln, da diese ein wesentlich größeres Verhältnis von Oberfläche zu Volumen als eine gepackte Matrix fester (nichtporöser) Partikel liefern.
• Ein besonders zweckdienliches differentiales Migration-Trennungssystem ist heute das HPLC System (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie). HPLC Säulen verwenden Matrices aus homogenen porösen kleinen kugelförmigen Partikeln. Weil das dichte Packen dieser kleinen Kügelchen einen hohen Widerstand für den Durchfluß schafft, ist die Apperatur für den Betrieb bei hohen Drücken ausgelegt, was einen schnellen Flüssigkeitstransport erlaubt. Die dicht gepackten Partikel bilden ein großes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was die Auftrennung von Beimengungen mit kleinen Molekulargewichten gut bewirkt. Allerdings sind herkömmliche HPLC Systeme wesentlich weniger erfolgreich, wenn sie für die Auftrennung von Beimengungen mit hohen Molekulargewichten, wie beispielsweise Proteinen, eingesetzt werden. Die Durchflußrate von Beimengungen mit hohen Molekulargewichten, wie beispielsweise Proteine, durch eine herkömmliche HPLC Matrix ist begrenzt, hauptsächlich weil der Stofftransport innerhalb der Partikelporen als Diffusion erfolgt, im Vergleich zum Stofftransport zwischen den Partikeln, der als Konvektion erfolgt. Während man die Flußraten zum Nachteil von Hochdruckabfällen erhöhen kann, trägt dies zu einer verminderten Trennqualität bei.
• Diese Einschränkungen der herkömmlichen HPLC Analyse werden durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeitsmatrices umgangen, die für Perfusionschromatographie geeignet sind. Diese Matrices bestehen aus Partikeln, die die gleiche Gesamtgröße wie die gelegentlich in herkömmlichen Matrices verwendeten Partikel besitzen, haben aber eine erhöhte innere Porengröße. Zusätzlich zu durchgängigen inneren Poren mit größerem Durchmesser, z.B. 600-800 nm (6000-8000 Å), haben Partikel, die für die Perfusionschromatographie geeignet sind, ein Netz aus 50- 150 nm (500-1500 Å) Poren, die von den größeren durchgängigen Poren abzweigen. Das resultierende Netz begrenzt die Diffusionsstreckenlängen innerhalb der Partikel, so daß der Stofftransport innerhalb der Partikelporen über einen großen Fließgeschwindigkeitsbereich hauptsächlich durch Konvektion bestimmt ist. Dieser Effekt erlaubt eine Erhöhung der Geschwindigkeit der mobilen Phase dieser Systeme um mehr als das 10-100fache als bei herkömmlichen HPLC Systemen (mehr als 1000 cm/h), ohne wesentliche Minderung der Trennung. Eine detailliertere Beschreibung der Perfusionschromatographie ist im U.S. Patent, Nr. 5.019.270, erteilt am 28. Mai 1991, und in Afeyan et al. (1990) Bio/Technology 8:203-206 gegeben. Perfusionschromatographie-Matrixmaterialien sind von PerSeptive Biosystems, Inc., in Cambridge, MA U.S.A., im Handel erhältlich. Die erhöhte Porösität von Partikeln, die für die Perfusionschromatographie geeignet sind, erhöht im wesentlichen die verfügbare Oberfläche der Säule, typischerweise auf Werte im Bereich von etwa 30-50 m²/ml, was die Bodenhöhe der Säule wesentlich vermindert. Demgemäß können Minisäulen (Mikrosäulen) verwendet werden, und die Analyse kann mit bis heute nicht erreichbaren Geschwindigkeiten ohne wesentliche Minderung der Auftrennung durchgeführt werden.
• Perfusionschromatographie-Matrices sind zur Zeit die bevorzugten Matrices sowohl für das erste als auch zweite System der Vorrichtung dieser Erfindung. Perfusionsmatrices zur Verwendung in der Vorrichtung, die für die Verteilung und Auftrennung der Beimengungen in einer Mischlösung entwickelt sind, können wie gewünscht mit Hilfe herkömmlicher, dem Fachmann bekannter Verfahren derivatisiert werden, um ein spezielles Chromatographie- System zu bilden. Geeignete Perfusionschromatographie- Säulen für die Durchführung der Erfindung sind auch im Handel erhältlich (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA). Vorzugsweise ist das erste System 12 eine Perfusionsaffinitätschromatographie-Matrix, die immobilisiertes bindendes Protein, z.B. polyklonale oder monoklonale Antikörper für das Produkt-Protein, enthaltende poröse Polystyroldivinylbenzol-Partikel aufweist. Das zweite System 16 kann die gleiche Matrix, die zur unspezifischen Adsorption des Proteins derivatisiert ist, aufweisen.
• Ein weiteres Verfahren zur Trennung von Beimengungen, das für das Verfahren dieser Erfindung, besonders für das zweite System 16, zweckdienlich ist, ist die Elektrophorese. Insbesondere die Kapillarelektrophorese liefert die geeignete Geometrie (hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen), die zum Ableiten der Joule-Wärme, die durch die angelegten hohen elektrischen Felder entsteht, benötigt wird. Durch die Tolerierung dieser hohen elektrischen Felder erlaubt das Kapillarelektrophorese-System ähnlich wie die Perfusions- HPLC einen schnellen Durchsatz ohne Minderung der Auftrennung. Zusätzlich kann durch die kapillare Geometrie die notwendige Zahl an theoretischen Böden in einem kleinen Volumen erreicht werden, was erlaubt, das System als Mikrosäule laufen zu lassen. Demgemäß erlaubt das Kapillarelektrophorese-System wie mit Perfusions-HPLC- Systemen eine wesentliche Verkleinerung der Probengröße und eine schnelle Analyse.
• Die Elektrophorese kann Moleküle auf zahlreiche verschiedene Arten trennen, und alle können in Kapillarsystemen durchgeführt werden. Als zweckdienlichste Arten sind die Zonen oder "Free-flow"-("offene") Elektrophorese, Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung zu nennen. Die Zonenelektrophorese ist durch Fehlen fester Träger gekennzeichnet, und Trennung erfolgt innerhalb einer einzigen Phase (z.B. flüssigen Phase). Dennoch ähnelt das Trennungsergebnis bei der Zonenelektrophorese, insbesondere Kapillarelektrophorese, dem Ergebnis, das für die Standard-Elutionschromatographie erhalten wird, und die wesentlichen Vorstellungen von Bodenzahl und Auflösung, wie für die Säulenchromatographie definiert, sind umfassend anerkannt.
• Im allgemeinen können beliebige Elektrophorese- Systeme, einschließlich herkömmlicher Polyacrylamid "Platten"-Gele, verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß die Einschränkungen, die eine Zonenverbreiterung in dem System bedingen (z.B. durch Diffusion, Joule-Wärme und/oder Konduktivitätsänderungen verursacht) verstanden und minimiert sind. Zum Beispiel werden isoelektrische Fokussierungssysteme und Zonenelektrophorese- Systeme mit Kanaldicken von weniger als etwa 200 µm im allgemeinen für das Verfahren und die Vorrichtung dieser Erfindung als zweckdienlich erachtet. Weitere Information über die Elektrophorese-Theorie, Anwendungen, Geräte und Automatisierung, einschließlich Kapillarelektrophorese, können zahlreichen Quellen entnommen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Spezielle zweckdienliche Quellen umfassen Karger et al., (1989) J. Chromatogr. 492:585- 614; Foret et al., (1990) Electrophoresis 11:661-664; und Novotny et al. (1990) Electrophoresis 11:735-749.
• Wie oben erwähnt, sollte das erste System die Konzentration der in Lösung verbleibenden löslichen Verunreinigungen nicht wesentlich beeinflussen. Dies bedeutet, daß die Geometrie des Systems entscheidend ist. Das minimale der Matrixvolumen, das im wesentlichen die gesamte Beimengung von Interesse hinreichend bindet, sollte vorzugsweise verwendet werden. Glücklicherweise ist dies schon an sich ein Merkmal der Matrices, die für Durchführung der Perfusionschromatographie entwickelt sind, da die Beschaffenheit der Matrix dazu neigt, die Adsorption in der obersten verfügbaren Region der Säule zu fördern. Zudem bietet die Säulenform eine effiziente Extraktion über die vielen Stufen (Böden), die sie für die durchlaufenden Beimengungen darstellt. Ein wichtiger Vorteil bei Verwendung des Perfusionschromatographie- Systems ist, daß bei sehr kleinen Mengen an Kontaminationsspuren die Fließgeschwindigkeit hoch sein sollte, um die sehr großen Mengen an Probe in einer angemessenen Zeit aufzutragen, und dies wird am besten durch Verwendung von Perfusionschromatographie-Matrices erreicht.
• Falls das Produkt auf die Säule zehnmal so schnell geladen werden kann, reduziert dies die erforderliche Testzeit um den Faktor zehn. Zum Beispiel läuft eine HPLC-Säule mit 4,6 mm Durchmesser gewöhnlicherweise mit etwa 1,0 ml/min. Perfusionsmatrices laufen leicht mit 10 ml/min. Demgemäß würde ein Laden einer 100 ml Probe auf eine Perfusionsmatrix zehn Minuten und 100 Minuten auf eine konventionelle HPLC Matrix erfordern.
• Vorzugsweise sollte eine nichtspezifische Adsorption geringer als etwa 1 ng/10 µl sein. Demgemäß sollte die bindende Oberfläche oder Matrix im wesentlichen inert sein und in der Lage sein, den gelösten Stoff oder die gelösten Stoffe (Produkt) von Interesse selektiv zu extrahieren, vorzugsweise quantitativ, ohne Verunreinigungen in der Probe signifikant zu adsorbieren. Falls gewünscht, kann ein nichtspezifisches Binden in dem ersten System durch zuerst Beschichten der potentiellen nichtspezifischen Bindungsstellen vor dem Laden der Probe minimiert werden. Der Fachmann weiß, daß dieses "beschichtende" Molekül hinreichend binden sollte, so daß es nicht mit dem austretenden Auslauf interferiert. Zum Beispiel kann eine Kontrollprobe mit in der Testprobe vorhandenen, bekannten Verunreinigungen auf die Affinitätssäule geladen werden, und anschließend die Säule gewaschen werden, bis die Verunreinigung nicht mehr in der die Säule verlassenden Waschlösung detektiert werden kann. Eine weitere Möglichkeit, eine Passage von Verunreinigungen durch den Produktextraktor 12 sicherzustellen, ist, die Säule wiederholt mit einem selektiven Eluent zu waschen und die Waschlösung durch das zweite System 16 zu leiten.
• Bevorzugte Matrices für die selektive Extraktion des gelösten Produkts sind in der Lage, spezifische Bindungswechselwirkungen mit dem gelösten Stoff einzugehen. Vorzugsweise sind diese Wechselwirkungen reversibel, und das System kann mit Hilfe eines oder mehrerer Regenerationslösemittel regeneriert werden, die in der Lage sind, den Stoff von der Säule zu lösen, und das System für eine weitere Probe vorzubereiten. Falls die Bindungswechselwirkung irreversibel ist, sollte die Kapazität der Matrix vorzugsweise groß genug sein, um viele Proben irreversibel zu binden. Zweckdienliche Produkt-spezifische Bindungsstellen umfassen Immunoadsorbentien (z.B. für das Produkt spezifische Immunoglobuline) und andere Proteine, die in der Lage sind, spezifisch mit dem Produkt von Interesse in Wechselwirkung zu treten. Zum Beispiel kann man sich die Produkt oder Produkt-spezifische Bindungsstelle vorstellen, die aus einer beliebigen Ligand/Enzym-Kombination, einschließlich Hormone, Toxine, Lektine und ihren geeigneten Rezeptoren, besteht. Wo das Produkt von Interesse ein Enzym ist, kann die Bindungsstelle aus einem Pseudosubstrat oder einem Inhibitor bestehen. Im allgemeinen kann die Produkt-spezifische Bindungsstelle (Produktspezifisches Affinitätsadsorbens) ein beliebiger immobilisierter Ligand sein, der eine Bioaffinität für das gegebene Produkt von Interesse zeigt. Die Matrixoberfläche kann derivatisiert sein, so daß die Produktspezifische Bindungsstelle irreversibel an der Matrixoberfläche gebunden wird.
• Nachdem der Test beendet ist, und die Spurenbeimengungen im Detektor detektiert sind, kann das gebundene Produkt eluiert werden und, wie oben beschrieben, die Säule für nachfolgende Proben regeneriert werden. Eine bestimmte Produkt-spezifische Bindungsstelle kann von dem System mit Hilfe eines oder mehrerer regenerierender Lösemittel entfernt werden, und eine zweite Bindungsstelle, spezifisch für einen zweiten, anderen gelösten Stoff kann auf das System gegeben werden. Zum Beispiel kann Protein A oder Protein G auf der Matrixoberfläche kovalent gebunden sein, was vielen, verschiedenen Produkt-spezifischen Antikörpern erlaubt, an die Matrix der Reihe nach zu binden.
• Die Produkt-spezifischen Matrices des ersten Systems können in einem Flüssigchromatographie-System oder in einem Elektrophorese-System (z.B. Kapillarelektrophorese-System) eingesetzt werden. Wahlweise kann das Produkt bindende System auf die innere Oberfläche eines Kapillarröhrchens oder eine beliebige Oberfläche, die in der Lage ist, eine hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu liefern, gebunden werden. Die Kapillarchromatographie kann dann mit Hilfe eines Druckgradienten oder eines Spannungsgradienten durchgeführt werden.
• Das zweite System ist vorzugsweise in der Lage, im Auslauf des ersten Systems vorhandene Kontaminationsspuren nichtselektiv zu binden. Zum Beispiel kann die Säule eine Perfusionsmatrix aufweisen, die mit anionischen Gruppen, kationischen Gruppen oder hydrophoben Gruppen, die Proteine nichtselektiv binden, derivatisiert ist. Ein großes Auslaufvolumen kann das zweite Ssytem passieren, so daß faktisch alle Kontaminationsspuren der Probe, die das System durchlaufen, akkumuliert werden. Folglich muß das erste System die Kapazität besitzen, relativ große Mengen des Produkts zu binden, so daß große Volumina einer Produkt-freien Probenlösung für das zweite System gebildet werden. Nachdem die Probe das zweite System durchlaufen hat, kann das zweite System vor Elution der Spurenkomponenten gewaschen werden, oder die Spurenkomponenten können von dem zweiten System direkt eluiert werden. Der Eluent, der ein sehr konzentriertes Volumen der Verunreinigungsspuren aus der ursprünglichen Probe ohne die Hauptkomponente dieser Probe, d.h. das Produkt von Interesse, enthält, kann dann auf das Vorhandensein von Verunreinigungsspuren getestet werden. Die Detektion der im Eluent vorhandenen Verunreinigungsspuren kann entsprechend der in der Technik bekannten Verfahren, z.B. UV-Absorption, durchgeführt werden.
• Die Chromatogramme der Abbildungen 2(a) und (b) veranschaulichen den Erfolg der Erfindung. Die Chromatogramme stellen Diagramme von Absorption auf der Abszisse gegen den Fluß auf der Ordinate aufgetragen dar. Das Chromatogramm von Abbildung 2(a) stellt ein typisches Profil eines "gereinigten" Produkts dar, das einen einzigen großen Peak 44 zeigt, was die Elution des Produkts darstellt. Verborgen durch Peak 44 sind drei Peaks der Kontaminationsspuren 46, 46' und 46", die fiktiv dargestellt sind, und nicht auf dem Chromatogramm zu sehen sind. Das Chromatogramm von Abbildung 2(b) stellt ein typisches Profil von Verunreinigungen dar, wie sie das zweite System 16 verlassen und von Detektor 18 gemessen werden. Weil diese Verunreinigungen in System 16 zunehmend akkumuliert wurden, da ein relativ großes Volumen des Produkt-freien Auslaufs Säule 12 passierte, und dann mit Hilfe eines relativ kleinen Volumens an Eluent eluiert wurden, wird das Vorhandensein und die relative Konzentration der Verunreinigungen einfach detektiert. Man kann die Peaks integrieren, um die Menge jeder vorhandenen Verunreinigung zu bestimmen, und wenn das Volumen der in das System gegebenen Probe bekannt ist, kann man die Konzentrationen der Verunreinigungen berechnen.

Claims (14)

1. Ein Verfahren zur Detektion einer Spurenbeimengung in einer Lösung, die eine große Menge eines gelösten Produkts umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

Durchfluß der Lösung (10) durch Produkt- Extraktionsmittel (12), das eine Chromatographie-Matrix umfaßt, die das Produkt ohne wesentliche Extraktion besagter Spurenbeimengung dabei selektiv extrahiert, um einen Auslauf (14) zu bilden, der im wesentlichen frei von besagtem Produkt ist und besagte Spurenbeimengung enthält und der durch einen Auslaß aus besagtem Extraktionsmittel (12) fließt,

Durchfluß besagten Auslaufs (14), der aus besagtem Produkt-Extraktionsmittel austritt, durch ein eine Spurenbeimengung adsorbierendes Mittel (16), um darin besagte Spurenbeimengung zunehmend zu akkumulieren; und Elution besagter Spurenbeimengung von besagtem Adsorptionsmittel (16), um eine Eluentfraktion, die eine detektierbare Menge an besagter Spurenbeimengung enthält, zu bilden.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem gleichzeitige Detektion zusätzlicher in besagter Lösung verteilter Spurenbeimengungen umfaßt.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin besagtes Extraktionsmittel (12) eine Perfusionschromatographie- Matrix umfaßt.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, worin besagte Chromatographie-Matrix eine Produkt-spezifische Affinitätschromatographie-Matrix umfaßt.

5. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin besagtes eine Spurenbeimengung adsorbierendes Mittel (16) ein Mittel für unspezifisch bindende Proteine, z.B. eine Perfusionschromatographie-Matrix, umfaßt.

6. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin besagte Spurenbeimengung ein oder mehrere Pyrogene umfaßt.

7. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin besagtes gelöstes Produkt ein rekombinantes Protein umfaßt.

8. Eine Vorrichtung zur Detektion einer Spurenbeimengung in einer Lösung, die eine große Menge eines gelösten Produkts umfaßt, wobei die Vorrichtung umfaßt:

Mittel (12) zur Extraktion des Produkts aus der Lösung (10), um einen Auslauf (14), der im wesentlichen frei von besagtem Produkt ist und die besagte Spurenbeimengung enthält, zu bilden;

Mittel (16) zur Adsorption der Spurenbeimengung aus besagtem Auslauf (14), um darin besagte Spurenbeimengung zunehmend zu akkumulieren; und

Mittel (30,32) zur Elution besagter Spurenbeimengung von besagtem Adsorber (16), um eine Eluentfraktion zu bilden, die eine detektierbare Menge an besagter Spurenbeimengung enthält.

9. Die Vorrichtung nach Anspruch 8, die außerdem Mittel (18) zur Detektion von besagter eluierter Spurenbeimengung umfaßt.

10. Die Vorrichtung nach Anspruch 8, worin besagtes Extraktionsmittel (12) eine Chromatographie-Matrix, z.B. eine Perfusionschromatographie-Matrix oder eine Produkt- spezifische Affinitätschromatographie-Matrix, umfaßt.

11. Die Vorrichtung nach Anspruch 8, worin besagtes Adsorptionsmittel (16) eine Protein bindende Matrix, z.B. eine Chromatographie-Matrix, wie beispielsweise eine Perfusionschromatographie-Matrix, umfaßt.

12. Die Vorrichtung nach Anspruch 8, worin besagte Spurenbeimengung ein oder mehrere Pyrogene umfaßt und/oder besagtes gelöstes Produkt ein rekombinantes Protein umfaßt.

13. Die Vorrichtung nach Anspruch 8, die außerdem Mittel (28) zum Passieren wahlweise einer Probe (10), eines Eluents (11) und einer Pufferlösung (13) in besagtem Mittel (12) zur Extraktion umfaßt und/oder außerdem ein Mittel (32) zum Passieren wahlweise besagten Auslaufs (14) und eines Eluents (32) in besagtem Mittel (16) zur Adsorption umfaßt.

14. Die Vorrichtung nach Anspruch 8, die außerdem Mittel (32, 33) zum Sammeln besagten Produkts von besagtem Mittel (12) zur Extraktion umfaßt.