JP2001520894A

JP2001520894A - 表面上の核酸類の単離及び精製のための方法

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Publication number: JP2001520894A
Application number: JP2000518111A
Authority: JP
Inventors: ヘルゲバスチャン; シモーヌガウチ; ウーベオエルミュラー; スザンヌウルマン
Original assignee: キアゲンゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2001-11-06
Anticipated expiration: 2018-10-23
Also published as: US20100021925A1; WO2000024927A1; EP1049801A1; JP2008245649A; ATE335846T1; EP2251440A2; US20100159460A1; AU1231899A; EP1049801B1; US20050244882A1; DE59813680D1; WO1999022021A1; US20030152974A1; EP1121460A1; DE19746874A1; EP2251440A3; JP4440458B2; JP2008263978A; US8008475B1; EP1121460B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも以下の段階による表面上の核酸類の単離のための方法を包含する。核酸類を所定の方向から表面へ投入すること；前記表面上での核酸類の固定化；前記表面からの固定化された核酸類の放出；及び、主に投入方向における放出された核酸類の除去。付加は、好ましくは上方から行われる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、表面上の核酸類の単離及び精製のための新しい方法に関する。

【０００２】生物学的及び臨床的試料材料からの核酸類の単離及び精製は、核酸類に基づく
処理技術が用いられ、又は核酸類に基づく科学技術が実際に利用（access）の秘
訣である、作業分野のために極めて重要である。その例は、実父確定分析（pate
rnity analysis）、組織適合試験、遺伝病の同定、ゲノム（genome）分析、分子
診断、伝染病の決定、動物及び植物繁殖、移植遺伝子（transgenic）調査、生物
学及び医薬、並びに多数の関連領域における基礎調査を包含する。それらの中に
含まれる核酸類が、問題とされる分析手順において直接使用され得るようなやり
方で、生物学的又は臨床的試料を調製する際に、一般に困難に遭遇する。

【０００３】技術水準（the state of the art）は、DNAの精製のための多くの方法を既に包含している。我々は、例えば、バーンボイム（Birnboim）の方法[Methods in
Enzymology 100 (1983) 243]により、クローニング、及び同様に他の実験的方法
の目的のためにプラスミドDNAをどのように精製するかを知っている。この方法において、細菌由来の透明な溶解物は、４〜２４時間の間、塩化セシウム勾配（
gradient）に曝され、そして遠心分離される。この段階の後に、DNAの抽出及び沈殿が通常行われる。この方法は、一方では非常に高価な装置を必要とし、他方
では、長時間を要し、費用集約的（costintensive）であり、かつ自動化することができないという欠点を有する。

【０００４】 DNAの単離のために透明な溶解物が使用されるその他の技術は、イオン交換クロマトグラフィー[Colpan et al., J. Chromatog. 296 (1984) 339]及びゲル濾過[Moreau et al., Analyt. Biochem. 166 (1987) 188]からなる。これらの方法
は、主に塩化セシウム勾配の代替として提供されるが、しかし、通常高濃度の塩
類を含み、かつ著しく希釈された溶液中で行われるので、装置を多数要する（ap
paratus-intensive）溶媒供給系及び得られたDNAフラクションの沈殿を要する。

【０００５】マルコ（Makco）ら[Analyt. Biochem.,121 (1982) 382]及びヴォゲルスタイン
（Vogelstein）ら[Proc. Nat. Acad. Sci. 76 (1979) 615]は、核酸類を含む抽出物からのDNAが、高濃度のヨウ化ナトリウム又は過塩素酸ナトリウムに曝される場合に、DNAのみは小さなガラスシンチレーション（scintillation）管、機械
的手法により細かく粒子状化された繊維ガラスシートのガラス繊維膜に密着する
一方、RNA及びタンパク質類はそうではないことを見出した。この手法において結合されたDNAは、例えば、水を用いて溶出することができる。

【０００６】例えば、WO 87/06621において、PVDF膜上での核酸類の固定化が説明されている。しかし、PVDF膜と結合した核酸類は、次の段階においては溶出しない。代わ
りにこの膜を、全ての結合された核酸類とともに、PCRアタッチメント(attachme
nt)内に直接導入する。最終的に、この国際特許出願及び他の文献において、疎水性表面又は膜は、ほぼ十分な収量で核酸類を固定化し得るために、一般に前も
って水又はアルコールを用いて湿らせなければならないことが記載されている。

【０００７】一方、例えば、PCR、逆転写PCR、サンライズ（SunRise）、LCX-分岐DNA、NASB
A又はタクマン（TaqMan）テクノロジー及びPCRのためのほぼリアルタイムの定量
技術のような、いくつかの最近の応用のために、核酸類を、固体相から直接放出
でき得ることは、明らかに必要である。この関連において、WO 87/06621は、核酸類が、この方法において使用された膜から事実回収され得る一方、この回収は
問題をはらみ、かつ核酸類の定量的な単離には全く適さないことを我々に教示し
ている。さらに、この方法において得られた核酸類は、比較的非常に希薄である
ので、それらを濃縮及び単離するための次の段階が、明らかに必要となる。

【０００８】上述の理由のために、技術水準において知られている方法は、特に核酸類を得
るための方法の自動化に関しては、工程設計の観点から、できる限り単純かつ生
産的な核酸の単離のための適当な開始点になり得ない。

【０００９】本発明の目的は、それ故、核酸類の単離のために、技術水準において知られて
いる方法の欠点を克服すること、及び多くのさらなる技術的消耗なしに、ほぼ完
全に自動化され得る方法を利用できるようにすることである。

【００１０】本発明に関して、前記方法は、独立特許請求項１、独立特許請求項５１による
応用、及び独立特許請求項５６による自動装置により解決される。本発明のさら
に有利な局面及び態様は、独立特許請求項、説明及び添付の図から明らかになる
。

【００１１】この関連において、本発明は、例えば、核酸類が、核酸類を含有する試験試料
から、簡単な方法で固定化されることができ、かつ簡単な手順の（procedural）
段階によって再度放出され得る多孔性膜のような表面を使用する方法に関する。
特に、本発明が依存する簡単な手順は、この方法を完全に自動で行うことを可能
にする。

【００１２】本発明の他の態様は、後続の段階においてそれらがこの相から直ちに放出され
、かつ所望により、例えば、制限的消化、RT、PCR若しくはRT-PCR、又は上記に記載のその他の適当な分析的若しくは酵素的反応のような、他の適用において使
用され得るような手法において、特に核酸類を固定化相、とりわけ膜へ結合する
ことである。本発明は、以下の段階により、核酸類の単離のための手順を提供する。 - 核酸類を所定の方向から表面へ付加すること（loading）； - 前記表面上での核酸類の固定化； - 前記表面からの固定化された核酸類の放出；及び - 主に付加方向における前記表面から放出された核酸類の除去。

【００１３】投入(charging)は、好ましくは上方(top)から行われる。この場合には、重力は放出のため、及びそれ自身の放出のために使用されるべきバッファーを回収す
るために使用され得る。固定化と放出段階との間に、固定化された核酸類の洗浄
が、少なくとも１種の洗浄バッファーを用いて行われ得る。各洗浄バッファーの
ために、この洗浄は、好ましくは以下の段階を含む。 - 予め決められた量の洗浄バッファーの表面への適用、及び - 吸引による前記表面を介しての洗浄バッファーの引き抜き(pulling)。

【００１４】核酸類の付加及び固定化は、再度以下の段階を含むことができる。 - 固定化バッファーと核酸類との混合、 - 前記表面へ固定化バッファーとともに核酸類を適用すること、及び - 主に付加方向における前記表面を介しての液体成分の抜き取り。

【００１５】この手順は、それが容易に自動化でき、その結果、少なくとも１つの段階が、
自動装置を用いて完全に自動で行われ得るという利点を有する。この手順におけ
る全ての段階は、自動装置により、導かれた一連の段階（a guided series of s
teps）において行われ得ることもまた、可能である。

【００１６】これらの場合において特に、手動操作においてもまた、核酸類の大部分が同時
に単離が行われ得ることが可能である。

【００１７】最終的に、本発明に関する方法において、以下の段階が放出と除去段階との間
で、少なくとも１回行われ得る。 - 核酸類を用いた少なくとも１つの化学反応の実施； - 前記表面における核酸類の固定化；及び - 前記表面からの固定化された核酸類の放出。

【００１８】上述のように、核酸類は、それが適用され、かつ固定化されたのと同じ方向に
おける表面から主に溶出（放出）される。“同じ方向”とは、基本的に、180度以下の角度からのいずれの方向をも意味し、よって、溶出の間、前記核酸類は、
いずれの環境下においても表面を貫通しないが、それらが表面へ適用された投入
方向の反対方向において、表面から除去される。好ましい態様において、一方、
他のバッファー、即ち、ある場合には洗浄バッファーを含む核酸類が投入中に見
出され得るバッファーは、表面を通して抜き取られ、さもなければ輸送される。
単離が、その膜がその装置の全直径を覆う装置中にある膜において行われる場合
、投入の好ましい方向は、上方からである。この場合には、除去段階は、再度上
方から行われる。図２は、例えば、上方から投入され、かつ核酸類の除去が上方
向において行われる漏斗型単離装置を示す。

【００１９】しかし、他の装置（arrangement）、即ち下からの核酸類の除去も考えられると理解すべきである。例えば、溶解物バッファーのような核酸類を含むバッファ
ーは、真空装置によって反応装置から単離装置内に直接抜き取られることができ
、それにより、その核酸類が、単離装置において膜の底側へ結合されることが考
えられる。そのような場合には、表面からの核酸類の除去は、核酸類の放出後、
装置内の下側に排出される、下から抜き取られた溶出バッファーを用いて行われ
る。この場合には、核酸類の除去は、下側方向において行われる。

【００２０】例えば、流出（flow-through）過程のために配置された膜とともに、その側面
上に置かれたカラムは、溶解物を投入され、かつ水平に置かれたカラムが、核酸
類が結合された膜の側面において、溶出バッファーにより次いですすがれる際に
は、核酸類の横方向の除去でさえ、可能である。

【００２１】可能な最大角度である180度のための例は、その上を種々の溶液又はバッファーが、下側へ流れる、核酸類の結合のために適当な表面を有する傾斜した表面で
ある。全てのバッファーと同様に、この溶出バッファーもまた、一方の側から来
て、他方の側へ流れ落ちる。この場合において、このバッファーの注入流及び核
酸類を含むバッファーの排出流の方向は、180度の角度を形成する。しかし、その除去は、固定化と同様にその表面の同じ側において常に行われる。

【００２２】本発明の意味において、核酸類により、生物学的材料又は生物学的試料を含む
全ての核酸類と同様に、核酸類の全ての水溶液又はその他の溶液が包含される。
本発明の意味において、この用語はフリーの核酸類、又は核酸を含む試料、又は
、インビトロ（in vitro）転写、PCR反応、若しくはcDNA合成のために適した抽出物として役立ち得る核酸類を含むサンプリング、又はサンプリング手順を用い
て[得られた]物質へ適用し得る。生物学的材料又は生物学的試料により、例えば
、欧州特許出願第95909684.3.号に記載されたような、例えば、血漿、血液、唾液、尿、糞、***のような体液、細胞、血清、白血球フラクション、クルスタ催
炎（crusta phlogistica）、なすりつけ標本（smears）、あらゆる種類の組織試
料、植物及び植物の部分、ウイルス、酵母等が意味される。本発明の意味におい
て、核酸類により、例えば、２本鎖、１本鎖、環状及び鎖状、分岐等のような、
全ての長さ及び配置（configuraions）の、リボ核酸類（RNA）及びデオキシリボ
核酸類（DNA）、モノマーヌクレオチド類、オリゴマー類、ウイルス性及び細菌性DNA並びにRNA、並びに動物及び植物細胞又は他の白血球からのゲノム、又は非
ゲノムDNA及びRNA、処理された、又は未処理の形態のt-RNA、mRNA、hn-RNA、rRN
A、及びcDNA、並びに他の想像し得る核酸類のような、全ての可能な種類の核酸類が意味される。

【００２３】本発明の方法において、前述の核酸類を含む試料は、適当な塩類又はアルコー
ル（類）を含有する溶液内へ導入され、次いで、適当な場合においては、その試
料を溶出し、かつ混合し、かつ、真空を用いて、遠心分離機の使用を介し、プラ
スの圧力を用いて、毛管現象の力により、又は表面上で核酸類が固定化される方
法により、多孔性表面を介する他の適当な手段により、この方法において得られ
た混合物を通す。

【００２４】膜上での核酸類の固定化のための適当な塩類は、鉱酸類とのアルカリ又はアル
カリ土類金属類の塩類、特に、アルカリ又はアルカリ土類ハロゲン化物又は硫酸
塩、とりわけ好ましくは、硫酸ナトリウム又はカリウム又はマグネシウムのハロ
ゲン化物を包含する。

【００２５】アルカリ又はアルカリ土類金属類を有する一若しくは多塩基酸類又は多官能性
（polyfunctional）有機酸類もまた、本発明の方法を行うために適合される。こ
れらは、シュウ酸、マロン酸、又は琥珀酸のような有機ジカルボン酸類を有する
、又はヒドロキシ若しくはポリヒドロキシカルボン酸類を有する、例えば、好ま
しくはクエン酸を有するナトリウム、カリウム、又はマグネシウム塩類を特に包
含する。

【００２６】いわゆるカオトロピック剤の使用が、とりわけ効果的であることが立証された
。カオトロピック物質は、水素結合の３次元構造を妨害することができる。この
方法はまた、第１、第２、第３又は第４構造(primary, secondary, tertiary
or quanternary structures)を包含する、生物分子内における空間構造の形成に
関与する分子内結合力を弱める。この種のカオトロピック剤は、技術水準におい
て専門家に知られている（H.Dellwegにより発行されたRompp,Lexikon of Biotec
hnologie、 R.D.Schmid 及びW.E.Fromm,Thieme Verlag,Stuttgart 1992）。

【００２７】本発明における使用のために好ましいカオトロピック物質は、例えば、トリク
ロロ酢酸塩、チオシアン酸塩、過塩素酸塩又はヨウ化物群又は塩酸グアニジニウ
ム及び尿素からの塩類である。

【００２８】前記カオトロピック物質は、0.01〜10Mの水溶液中で、好ましくは0.1〜7Mの水
溶液中で、最も好ましくは0.2〜5Mの水溶液中で使用される。上記のカオトロピック剤は、単独で又は組み合わせて使用され得る。特に、過塩素酸ナトリウム、
塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又
はヨウ化カリウムの0.01〜10Mの水溶液、好ましくは0.1〜7Mの水溶液、最も好ま
しくは0.2〜5Mの水溶液。

【００２９】本発明の方法の実施のために適当なアルコール類は、脂肪族又は非環式飽和又
は不飽和炭化水素類の全てのヒドロキシル誘導体をまず第一に包含する。問題と
なる化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はグリセリンを
包含する多価C1-C5アルカノール類のように、１-、２、３又はそれ以上の水酸基
を含むか否かは、最初は重要ではない。

【００３０】さらに、本発明のアルコール類は、ポリフェノールのようなフェノール類と同
様に、糖誘導体、いわゆるアルダイト類（aldites）を包含する。

【００３１】上述のヒドロキシル化合物の間で、メタノール、エタノール、n-プロパノール
、第３（tertiary）ブタノール及びペンタノール類のようなC1-C5アルカノール類は、とりわけ好ましい。

【００３２】固定は、酸性、中性又はアルカリ性条件下において行われ得る。それ故、固定
化におけるpHは、3〜11の間であることができる。好ましくは、固定化はpH4〜8 の間で行われる。RNAが単離されなければならない場合は、そのpHは、好ましくは中性領域にあり、一方、DNAの単離に関しては、酸性pHがより有利であり得る。よって、RNAの単離のためのpHは、例えば、6〜8の間に、好ましくは6.5〜7.5 の間にあり得る。DNA単離のためには、そのpHは4〜8の間において最も有利であり、好ましくは4〜6の間であり得る。

【００３３】本発明の意味において、親水性という用語は、それらの化学的性質に基づいて
、水と容易に混合し、又は水を吸収するような材料又は膜に適用する。

【００３４】本発明の意味において、疎水性という用語は、それらの化学的性質に基づいて
、水中に浸透しないで、又はその逆の、かつその中に留まることができないよう
な材料又は膜に適用する。

【００３５】本発明の意味において、表面という語により、いずれの微細孔分離（micropor
ous-separating）層をも意味される。膜の場合には、その表面はポリマー材料の
フィルムから成る。そのポリマーは、好ましくは極性基を有するモノマーから成
り得る。

【００３６】本発明の方法の他の好ましい態様において、より広い意味における表面の概念
は、粒子又は粒状体又は例えばシリカゲルフリース（fleece）のような滑らかな
（even）繊維の層を包含する。

【００３７】疎水性膜の使用に関連して、本発明の意味において、それらの膜としては、市
販の疎水化（hydrophobisized）ナイロン膜のように、親水性物質からなり、かつ今日の技術水準において知られている後続の化学的処理により疎水性にされ得
る膜が好ましい。本発明の目的のために、疎水化膜は、初めは親水性であること
もないこともあり、かつ以下に記載の疎水性コート剤を用いてコートされるそれ
らの膜を一般に包含する。この種の疎水性コート剤は、かなり長いアルキル鎖又
はシロキサン基のような、疎水基の薄膜を用いて親水性物質を覆う。適当な疎水
性コート剤は、技術水準において多数知られている。本発明の目的のために、こ
れらは、必要ならばアルミニウム又はジルコニウム塩類、四級有機化合物類、尿
素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコーン類、有機亜鉛化合物類、グル
タル酸（glutaric）ジアルデヒド及び類似物質の添加剤とともに、パラフィン類
、ワックス類、金属石鹸類等を包含する。

【００３８】さらに、本発明の目的のために使用され得る疎水性膜は、疎水性にされ、かつ
その基材が極性基を含むものである。これらの基準によれば、例えば以下の群か
らの材料、特に疎水化されたものが、本発明における使用のために適当である。

【００３９】ナイロン、ポリスルホン類、ポリエーテルスルホン類、ポリカーボネート類、
ポリアクリレート類及びアクリル酸共重合体類、ポリウレタン類、ポリアミド類
、ポリ塩化ビニル、フルオロカーボネート類、ポリテトラフルオロエチレン類、
ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、エチレン-テトラフルオロエチレン、ポリエチレン-クロロトリフルオロエチレン共重合化物（copol
ymerisate）、又はポリフェニレンスルフィド、及びセルロース混合（cellulose
-mix）エステル類、又はニトロセルロース類、並びに疎水化ガラス繊維膜。とり
わけ好ましくは疎水化ナイロン膜。

【００４０】好ましい親水性表面は、それ自体が親水性の材料、かつ親水性にされた疎水性
材料をも包含する。例えば、以下の物質が使用され得る。親水性ナイロン、親水
性ポリエーテルスルホン類、親水性ポリカーボネート類、ポリエステル類、ポリ
プロピレン組織上の親水性ポリテトラフルオロエチレン類、ポリプロピレンフリ
ース上の親水性ポリテトラフルオロエチレン類、親水化（hydrophilisized）ポリビニリデンフルオルリド、ポリビニリデンジフルオリド、親水化ポリテトラエ
チレン類、親水性ポリアミド類。

【００４１】本発明の方法において使用される膜は、例えば0.001〜50μm、好ましくは0.01
〜20μmそして最も好ましくは0.05〜10μmの細孔直径を有する。

【００４２】洗浄バッファーのために、上述の塩類又はアルコール類、フェノール類又はポ
リフェノール類が使用され得る。洗浄段階における温度は、通常10〜30℃の範囲
内であり得る一方、より高い温度もまた、良好に使用され得る。

【００４３】本発明の目的のために結合された核酸類の溶出のために適当な溶出剤は、水又
は水性塩溶液である。塩溶液としては、技術水準において知られたバッファー溶
液、例えばモルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、トリス（ヒロドキシメチル）
アミノメタン（TRIS）、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン
酸（HEPES）が、0.001〜0.5モル/リットル、好ましくは0.01〜0.2モル/リットル
の濃度において、最も好ましくは0.01〜0.05Mの溶液が使用され得る。0.001〜0.
5、好ましくは0.01〜0.2M、最も好ましくは0.01〜0.05Mを含むアルカリ又はアル
カリ土類金属塩類、特に、それらのハロゲン化物の水溶液、塩化ナトリウム、塩
化リチウム、塩化カリウム又は二塩化マグネシウムの水溶液もまた、使用のため
に好ましい。シュウ酸又は酢酸のようなカルボン酸又はジカルボン酸を有するア
ルカリ又はアルカリ土類金属類の塩類の水溶液、酢酸ナトリウム又はシュウ酸エ
ステルの水溶液もまた、上記の濃度範囲、例えば、0.001〜0.5、好ましくは0.01
〜0.2M、最も好ましくは0.01〜0.05Mにおいて、使用のために好ましい。

【００４４】例えば、脱炭酸された（dimineralized）、二重蒸留された、又はミリポア（M
ilepore）水のような純水は、溶出手段としてとりわけ好ましい。

【００４５】溶出は、10℃〜70℃の温度において、例えば、10℃〜30℃、そしてより高い温
度においてでさえ、良好に行われる。蒸気を用いた溶出もまた、可能である。

【００４６】個々の段階に関して、本発明の方法は、以下のように行われ得る。

【００４７】核酸類又は本来フリーの核酸（類）の回収のために使用される試料の溶解物は
、例えば、膜が固定された（プラスチック）カラム中に、例えば、底部の上に、
ピペットで移される。それは、この膜が機械的支持体として作用するグリッドへ
固定される場合に、より能率的である。この溶解物は、その後膜を通して運ばれ
、それはカラムの排出口における真空の適用により達成され得る。その輸送はま
た、溶解物へのプラスの圧力の適用によって達成され得る。さらに、上述の通り
、溶解物の輸送は、遠心分離により、又は毛管現象力の効果により行われ得る。
後者は、例えば溶解物又は濾過に接触させた膜の下に導入されるスポンジ様の材
料を用いて行われ得る。

【００４８】本発明の好ましい態様において追加された洗浄段階は、表面又は膜を通して洗
浄バッファーが輸送されたことにより、又はそれが核酸類として、同じ側に残さ
れたことにより、行うことができる。もし、洗浄バッファーが通過され、又は抜
き取られるならば、これは、例えば膜の他方の上に置かれたスポンジにより、真
空若しくは高圧装置により、又は遠心分離若しくは重力により、様々な方法で行
うことができる。

【００４９】装置の利点は、濾過液の供給のための簡単な、確かなかつ便利な可能性からな
り、この場合においては、濾過液を用いて直ちに多少湿らされるスポンジのみが
交換されることを要する。この点において、カラムは継続的に、又はバッチ法で
用いられることができ、かつこれらの操作モードの両方が、膜が核酸により完全
に飽和されるまで、全て自動で行われ得ることが明らかであろう。最終段階は、
ピペットにより抜き取られ、若しくは除去され、又はその他の方法において上側
へ除去されることができる核酸の溶出である。いずれに場合においても、本発明
の基礎である手順における溶出段階のために重要なことは、核酸類が、その膜の
、それらが膜へ適用されたのと同じ側から除去される、即ち、膜を通した核酸類
の移動はないことである。この一連の手順は、当初の溶解バッファー又は洗浄バ
ッファーのような、もはや必要とされない全ての流体を、真空又は重力により“
消耗側”へ輸送することを可能にし、一方、溶出液は、もう一方の側に残存する
。この種の装置は、溶解物の添加又は溶出液の除去のためのピペッティング（pi
petting）装置が、表面の一方の側にのみ備えられなければならず、一方、表面の他方の側は、いかなる“清浄域（clean area）”をも有することを必要しない
ので、本発明が基づく方法を特に簡単な手法において自動化することを可能にす
る。この方法において、空間分離により、核酸類の未汚染（contamination-free
）単離、とりわけRNaseからの解放は、非常に簡単な手段により保証され得る。さらに、この単離装置、例えば洗浄カラムは、別の場所へ移される必要はなく、
一方では、消耗を回避し、他方では、装置の同じ開口部を通して溶出液を回収す
る。これはまた、手順の自動化方法の簡略化を意味する。

【００５０】非常に希釈された溶液中に所望の核酸類を含有し、かつ後続の濃縮が要求され
るフラクションの捕獲は、本発明の方法を用いると完全に必要なくなる。代わり
に、所望の核酸類は、全ての分子生物学的分析手順のために極めて有用である、
わずかな塩を含み、又は塩を含まない、非常に少量の溶液において得られる。な
ぜなら、これらは高濃度を有すると同時に可能な最少量において純粋な核酸類を
要求するからである。可能な限り最少量の溶出液を得るという目的を達成するた
めに、それらの膜は、表面として可能な限り薄いことが特に好ましく、それによ
り、わずかな流体のみがそれらの中に回収され得る。一方、シリカゲルフリース
のようなフリースは、これらが比較的多量の溶出液を吸収しうるため、あまり望
ましくなく、上側の溶出液の上方への除去をより困難にし、かつ好ましくない手
法において溶出液の必要量を増加する条件も、あまり望ましくない。

【００５１】さらに、本発明は、その装置が垂直位置に配置される（この膜はその後水平位
置にされる）とき、膜の上側の空間は、反応領域として使用され得るという利点
を有する。よって、例えば本発明の基礎である方法により生成された核酸類の単
離及び放出の後は、それらを除去しないことだけでなく、それらを単離装置内に
残留させ、かつそれらに制限消化、RT、PCR、RT-PCR又は酵素反応のような分子生物学的応用を施すこと、本発明が基づく手順に従い、これらの反応により膜内
に生成された核酸類を再度結合すること、ある場合にはそれらを説明されたよう
に洗浄すること、かつ次いでそれらを溶出すること、それらを単離、又は例えば
顕微鏡、蛍光計、又は同様の測定技術により分析することが可能である。

【００５２】本発明に従って単離された核酸類は、核酸類を分解する酵素から影響を受けず
、かつ、それらが非常に多様な手法で直ちに処理され、かつ加工され得る程度に
非常に高い精製の値を有する。

【００５３】本発明により生成された核酸類は、クローニングのために使用することができ
、かつ、DNAポリメラーゼ類、DNA制限酵素類、DNAリガーゼ、及び逆転写酵素のような非常に多様な酵素のための基質として用いることができる。本発明の方法により生成された核酸類は、増幅のために、特にPCR（ポリメラーゼ鎖反応）、鎖置換増幅(strand displacement amplification)、回転円法（r
olling circle procedure）、リガーゼ鎖反応（LCR）、及び同様の手法のために
とりわけ良好に適合される。

【００５４】さらに、本発明が基づく方法は、診断における使用のため、特に本発明の方法
により精製された核酸が、後続の段階において増幅され、かつこの手法で増幅さ
れた核酸が、その後続けて、又は直ちに検出されるという事実を特徴とする診断
手順のための核酸類の調製のために特に良好に適合される（z.B.Holland,P.M. e
t al.,1991. Proc.Natl.Acad.Sci.88,7276？7280.Livak,K.J. et al.,1995. PCR
Methods Applic.4,357？362;Kievits,T.et al.,1991. J.Virol.Meth.35,273？2
86;Uyttendaele,M.et al.,1994.J.Appl.Bacteriol.77,694？701）。

【００５５】その上、本発明が基づく方法は、本発明が基づく方法により生成された核酸類
が、特に、“分岐核酸類”、とりわけ以下の文献（例えば、Bresters,D.et al.,
1994.J.Med.Virol.43(3),262-286;Collins M.L. et al.,1997.Nucl.Acids Res.2
5(15),2979-2984）において説明された分岐DNA若しくは分岐RNA又は樹枝状（den
dritic）核酸類と接触されることができ、かつ生じるシグナルが検出され得ると
いう事実を特徴とするハイブリッド形成（hybridization）反応に基づくシグナル増幅段階へ続く段階において行われ得る核酸類の調製のために特に良好に適合
される。

【００５６】本発明の方法の自動化のための例は、以下に説明され、かつ異なる表面及び核
酸類を用いる方法を行うための例もまた、説明されている。この説明において、
参照は、以下に記載する添付図により得られる。

【００５７】図１は、様式化された（stylized）グラフにおいて本発明の方法を行うために
適当な自動装置を示す。

【００５８】図２は、本発明の方法を行うための単離装置及び収集管(collection tube)の第１の態様を示す。

【００５９】図３は、本発明の方法を行うための単離装置及び収集管の第２の態様を示す。

【００６０】図４は、本発明の方法を行うための単離装置及び収集管の第３の態様を示す。

【００６１】図５は、本発明による上部を有する単離装置の態様を示す。

【００６２】図６は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の臭化エチジウム染色
ゲルを示す。

【００６３】図７は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム
染色ゲルを示す。

【００６４】本発明の方法は、部分的にも、又は完全にも、即ち全ての段階において、自動
手段において好ましくは行われる。適当な自動装置のための例は、図１に説明さ
れ、そこには、主部１が、コントロールエレクトロニクス並びに作業プラットフ
ォーム３及び可動アーム２を有する運転エンジンとともに備えられている。様々
な装置を保持する領域４のように、様々な構成要素が、その作業プラットフォー
ム上に配置される。真空マニホールド（manifold）５は、それらの上に置かれた
単離装置から液体を吸収し、かつ底において開放するために、又、別の方法にお
いてはその真空マニホールドと結合された装置とともに働く。例えば、生物試料
を溶解するために使用され得る振とう機６もまた、提供される。使用される単離
装置アセンブリー（assemblies）は、例えば、本発明による表面が含まれる、統
合された単離装置を有する射出成形部である。典型的に、８、１２、２４、４８
、９６又は１５３６までの単離装置は、これらが例えば現代のマルチウェルプレ
ート（multi-well-plates）の形態において見られるように、使用され得る。対応する基準が利用できるならば、１つのプレートにおいてより多数の単離装置を
有する場合であっても許容され得る。しかし、ルアーアダプター（Luer-adapter
s）の助けにより、そのアセンブリーの個々の底を利用可能にすること及び必要に応じて１つ又はそれ以上の単離装置とともにこれらを備えることもまた可能で
ある。ルアーアダプターなしで個別に使用される単離装置もまた、本発明に包含
される。

【００６５】真空分配メカニズム８の下で、前記単離装置アセンブリーは、自動装置内に配
置され、そしてこれらにより、液体が導入され、かつ排出され得る。このアセン
ブリーにおいて、いくつかの単一真空管は、単離及び反応装置の同時処理を可能
にするように使用され得る。その真空分配メカニズム８は、それ故ピペットとし
て働く。真空及び圧力は、管９を介して真空分配メカニズム８へ与えられる。

【００６６】核酸類の単離のために、細胞を用いる反応装置は、例えば、溶解バッファーが
分配メカニズムの助けにより導入される振とう機/保持具（holder）６内に配置されることができる。混合の後に、その細胞溶解物は、単離装置へ輸送される。
この溶解バッファーは、単離装置内の表面を介して続けて通される。次いで、こ
の表面は、細胞溶解物残留物の除去のために、洗浄バッファーを用いて洗浄され
ることができ、そこで洗浄バッファーもまた、下側へ排出される。最終的に、溶
出バッファーは、単離装置内へ分配され、かつ繰り返された振とうの後に、分離
された核酸類は、上方から除去され、そして収集管へ輸送される。

【００６７】試料の汚染防止のために、ディスポーザブルチップが真空分配メカニズム８に
おいて、通常用いられる。図２〜４は、本発明において使用されるべき適当な単離装置のための異なる概
略例を示す。

【００６８】図２において、漏斗型単離装置１０には、表面１１、例えば溶解及び洗浄バッ
ファーを吸収するために働くスポンジ様材料１３を含む収集管１２上に配置され
る膜が施される。スポンジ様材料１３の下で、超吸収性（superabsorbent）層１
４は、真空効率を改善するために配置されることがある。代わりに、層１４は、
アクリル酸塩のように、水と化学的に反応し得る材料をも含有することがある。
この水も、それ故この手順から除去される。核酸類の溶解物又は他の調製物は、
漏斗内に置かれる。スポンジ様材料１３は、膜１１を通して適用された液体を吸
収する。溶出バッファーの添加前に、そのスポンジは、例えば収集管１２の内部
メカニズム（図示されていない）により膜からいくらか動かされる。これは、最
後の段階において溶出バッファーが、膜１１を通して吸い出されることをも防ぎ
得る。このバッファーは、主に表面（図1b）上に留まり、かつ上方から核酸類と
ともに除去され得る。このアセンブリーを使用する際は、自動装置内の真空メカ
ニズム５は、もはや必要ではない。

【００６９】図３は、この場合にはスポンジは含まないが、マフ(muff)１８を介して真空メ
カニズムに連結されるルアーアダプター１７を介して、底に設置されたルアー接
続（Luer-connection）を介して収集管１６に連結される単離装置の他の例を示す。溶解及び洗浄バッファーは、この場合には真空の適用により膜１１を通して
吸引され得る。溶出バッファーが導入される際、その真空は止められたままであ
り、そのため、この溶出液は、上方から除去され得る。ルアー接続の使用により
、個々の単離装置は、単離装置アセンブリーから除去され得る。しかし、真空収
集管が固定された単離装置と組み合わせることもできることを忘れるべきではな
い。

【００７０】図４は、その中で前記バッファーが重力又は遠心分離されることにより抜き取
られる真空管のために提供する態様を最終的に示す。少量使用されるその溶出バ
ッファーは、本来、自然に膜１１を貫通するのに十分なほど重くはなく、かつ上
方から再度除去され得る。

【００７１】上述の手順は、以下の実施例により説明される。これに関連して、実施例１〜
１７は、疎水性表面の使用を、かつ実施例1b〜2bは、親水性表面の使用を主に包
含する。これらの手順の使用の異なる様々な手法は、専門家には、前述の説明か
ら、及び前記実施例から明らかであろう。参照は、これらの実施例及び対応する
説明が、説明の目的のために単独で示され、かつ本発明における限界と見なされ
ないという事実を明らかにする。

【００７２】実施例１ヒーラー(HeLa)細胞からの全RNAの単離化学的後処理により疎水性にされた市販の疎水性ナイロン膜（例えば、MSI製材料：細孔直径12μmのマグナ（Magna）SH又はパル社（Pall GmbH）製材料：細孔直径1.2μmのヒドロロン（Hydrolon））が、プラスチックカラム内に単一層で
設けられる。これらの膜は、機械的支持体として働くポリプロピレングリッド上
に配置される。これらの膜は、リングを用いてプラスチックカラム内に固定され
る。

【００７３】この手法において調製されたカラムは、ルアー接続により真空チャンバーに接
続される。全ての単離段階は、真空の適用を介して行われる。

【００７４】単離のために、５×10⁵のヒーラー細胞が、遠心分離によりペレット状にされた。それらの細胞は、技術水準において完全に普通の手法で、市販のイソチオシ
アン酸グアニジニウムバッファー、例えば、キアゲン社（Qiagen Company）製の
RLTバッファーの150μlの添加により溶解される。この溶解は、約5秒間のピペッ
ティング又は攪拌（vortexing）によるおおまかな混合により促進される。その後、150μlの70%エタノールが、約５秒間、ピペッティング又は攪拌（vortexing
）により添加されかつ混入される。

【００７５】前記溶解物は、その後プラスチックカラム内へ輸送され、かつ真空チャンバー
を取り去ることにより膜を通して吸引される。そのように得られた条件の下で、
RNAは膜に結合したままである。次に、洗浄はイソチオシアン酸グアニジニウムを含む第１市販洗浄バッファー、例えば、キアゲンのRW1バッファーを用いて、かつその後、TRIS又はTRIS及びアルコールを含む第２洗浄バッファー、例えば、
キアゲンのRPEバッファーを用いて行われる。それぞれの場合における洗浄バッファーは、真空チャンバーの取り除きにより、膜を通して吸引される。最終洗浄
段階の後に、真空は、膜を乾燥するために約１０分の間維持され、その後真空チ
ャンバーはスイッチを切られる。

【００７６】溶出のために、70μlのRNaseを含まない（Rnase-free）水が、膜から精製され
たRNAを放出するために膜上に輸送される。10〜30℃の範囲の温度における１分間のインキュベーションの後に、溶出液は上方から、膜から輸送され、そして溶
出段階は、溶出が完全であることを確実にするために繰り返された。

【００７７】この方法において得られた単離された全RNA量は、260nmの波長における吸光度
の分光学的測定によりその後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比
率から、RNA純度の評価を得る（図５参照：（ヒドロロン1.2を通して単離された
）全RNA）。

【００７８】一方では親水性ナイロン（ニアフロ（Nyaflo））（３番）及びシリカ膜（４番
）が使用された実験と比較して、疎水性ナイロン膜（１番及び２番）を用いた２
つの単離の結果が、表１に示される。この表において報告された値は、印象的な
（impressive）単離収量のための説得力のある（convincing）支持及び本発明に
従って使用された材料の分離効果を提供する。それらは、シリカゲルフリースは
、恐らくそのフリース様構造と大部分の溶出バッファーのその後の吸収に恐らく
起因する、明らかにわずかな収量しかもたらさないことをも示す。

【００７９】

【表１】

【００８０】単離されたRNAは、臭化エチジウムを用いて染色されたアガロースゲル上で分析されることもできる。この目的のために、例えば、1.2%ホルムアルデヒドアガ
ロースゲルが構築される。結果は、図６において示される。

【００８１】図６において、レーン（Lane）１は、細孔直径1.2μmのマグナSHからの疎水性
ナイロン膜によって単離された全RNAである。

【００８２】レーン２は、細孔直径1.2μmのヒドロロンからの疎水性ナイロン膜によって単
離された全RNAである。

【００８３】レーン３は、シリカ膜によって単離された全RNAのクロマトグラムを示す。

【００８４】それぞれの場合において、50μlの全RNA単離物が分析された。図６は、シリカ膜が使用された際に、全RNAの測定可能な部分は何ら単離され得ないという説得力のある証拠を提供する。

【００８５】実施例２種々の塩-アルコール混合物を用いたRNAの疎水性膜への結合によるフリーのRN
Aの単離。この実施例において、溶解物及び洗浄溶液は、真空の適用により疎水性膜を通して導かれる。

【００８６】疎水性ナイロン膜（例えば、パル社（Pall Company）製1.2μmヒドロロン）は
、実施例１と同様の方法において、真空チャンバーと連結されたプラスチックカ
ラム内へ導入される。

【００８７】全RNAを含む100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウムを含む350μ
lの市販の溶解バッファー（例えば、キアゲン製RLTバッファー）、350μlの1.2M
酢酸ナトリウム溶液、350μlの2M塩化ナトリウム溶液及び350μmの4M塩化リチウ
ム溶液とそれぞれピペッティングにより混合され、さらにそれぞれピペッティン
グにより混合される。

【００８８】次に、250μlのエタノールが、同様にピペッティングにより、各混合物へ添加
され、そして混入される。その後、RNAを含むこれらの溶液は、プラスチックカラム内へ輸送され、そして真空チャンバーを取り除くことにより膜を通して吸引
される。記載された条件の下で、RNAは膜へ結合して残存する。これらの膜は、実施例１に記載されたように、その後洗浄される。

【００８９】上記RNAは、実施例１にも記載されたように、最終的に上方からピペッティングにより膜から除去される。

【００９０】単離された全RNA量は、260nmにおける吸光度の分光学的測定により決定される
。260及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。

【００９１】

【表２】

【００９２】実施例３ヒーラー細胞からの全RNAの単離市販の疎水性ナイロン膜が、プラスチックカラム内に単一層で設けられる。こ
れらの膜は、機械的支持体として働くポリプロピレングリッド上に設けられる。
これらの膜は、リングを用いてプラスチックカラム内に固定される。この方法に
おいて調製されたカラムは、収集管内に配置される。全ての単離段階は、遠心分
離を介して行われる。

【００９３】単離のために、5×10⁵のヒーラー細胞が、遠心分離によりペレット状にされ、
かつ上清物質が除去される。これらの細胞は、技術水準において完全に普通の方
法で、150μlの市販のイソチオシアン酸グアニジニウムバッファー、例えばキア
ゲン製RLTバッファーの添加により溶解される。溶解は、約５分間のピペッティング又は攪拌（vortexing）によるおおまかな混合により促進される。150μlの7
0%エタノールが、約5分間のピペッティング又は攪拌（vortexing）によりその後
添加されかつ混入される。

【００９４】前記溶解物は、プラスチックカラム内へ続けて輸送され、かつ1分間10000×g における遠心分離により膜の中を通される。次いで、イソチオシアン酸グアニジ
ニウムを含有する市販の洗浄バッファー、例えばキアゲンのRW-１バッファーを用い、その後、例えばキアゲン製RPEバッファーのようなトリス及びアルコールを含有する第２洗浄バッファーにより洗浄が行われる。これらの洗浄バッファー
は、遠心分離により膜の中を通される。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために
2分間20000×gにおいて行われる。

【００９５】溶出のために、70μlのRNaseを含まない（RNase-free）水は、膜から精製され
たRNAを放出するために膜の上へ輸送される。10〜30℃の範囲の温度における1〜
2分間のインキュベーションの後に、その溶出物は、上方から膜から輸送され、かつその溶出段階は、溶出が完全であることを確実にするために繰り返される。

【００９６】この方法において得られた単離された全RNA量は、260nmの波長における吸光度
の分光学的測定によりその後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比
率から、RNA純度の評価を得る。異なる疎水性ナイロン膜を用いた単離の結果は、表３に示される。

【００９７】膜当たり3〜5回の並行試験が行われ、そしてその平均値が計算される。シリカ
膜の使用により、溶出物がそれを膜から上方から除去することにより回収される
場合、測定可能な量の全RNAは、単離され得ない。

【００９８】

【表３】

【００９９】実施例４水溶液からのフリーのRNAの単離実施例１に従って、プラスチックカラムは、異なる疎水性膜と組み合わされた
。全RNAを含有する100μlの水溶液は、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する市販の溶解バッファー、例えばキアゲン製RLTバッファー、350μlと混合される。次いで、250μlのエタノールが、ピペッティングにより添加され、そして
混合される。この混合物は、その後カラムへ輸送され、遠心分離（10000×g；１
分）により、膜の中を通される。これらの膜は、続けてバッファー、例えばキア
ゲン製RPEにより２回洗浄される。このバッファーは、遠心分離により膜の中を通過させられる。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために20000×gで行われる。

【０１００】次いで、実施例３で既に記載された通り、RNAは、RNaseを含まない水を用いて
溶出され、そしてピペッティングにより上方から膜から除去される。

【０１０１】単離された全RNAの量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定により続
けて決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。

【０１０２】種々の疎水性膜を用いた単離結果を、以下の表４に記載する。膜当たり3〜5回の並行試験が行われ、そしてその平均値が計算される。シリカ
膜の使用により、溶解物がそれを膜から上方から除去することにより回収される
場合、測定可能な量の全RNAは、単離され得ない。

【０１０３】

【表４】

【０１０４】実施例５膜の細孔サイズに依存するヒーラー細胞からの全RNAの単離実施例１に従って、プラスチックカラムが異なる細孔サイズを有する異なる疎
水性膜と組み合わされた。実施例３に従って、細胞溶解物が5×10⁵のヒーラー細胞から得られ、そしてこ
れらのカラムへ輸送される。次いで、これらの膜は、市販のバッファーであるキ
アゲンのRW1及びRPEを用いて洗浄される。最後の遠心分離段階が、膜を乾燥する
ために2分間20000×gにおいて行われる。溶出は、実施例１に記載の通りに行われる。それらの結果を以下の表5に記載する。膜当たり3〜5回の並行試験が行われ、そしてそれぞれの平均値が計算される。

【０１０５】

【表５】

【０１０６】実施例６水溶液からのゲノミック（genomic）DNAの単離実施例３に従って、プラスチックカラムが、疎水性膜（例えばMSI社製マグナ-
SH、5μm）と組み合わされる。精製は、市販のキアゲンバッファーを用いて行わ
れる。 200μlの肝臓組織からのゲノミックDNAの水溶液が、PBSバッファー内へ導入さ
れる。200μlの塩酸グアニジニウムを含有するバッファー、例えばキアゲンのAL
がこの溶液へ添加され、そして混合される。次いで210μlのエタノールが添加さ
れ、そして攪拌（vortexing）を介して混合される。この混合物は、実施例３に従ってカラムへ輸送され、そして遠心分離の方法により膜の中を通される。この
膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲンのRWを用いてその後洗浄され
、そして乾燥される。溶出は、実施例３に記載されたように行われる。３回の並
行試験が行われ、その平均値が計算される。

【０１０７】単離されたDNAの量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定により、次
いで決定され、開始量のおよそ30%である。260nmから280nmにおける吸収比率は、1.82である。

【０１０８】実施例７組織からのゲノミックDNAの単離実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜（例えばMSI製マグナ-SH、
5μm）と組み合わされる。精製は、キアゲンの市販のバッファーを用いて行われ
る。 180μlのATLバッファーが10mgの腎臓組織（マウス）へ添加され、機械的ホモジナイザー（homogenizer）内ですり潰される。次いでプロテイナーゼ（protein
ase）K（20μlの水において溶出されたおよそ0.4mg）が、添加され、そして55℃
において10分間インキュベートされる。200μlの塩酸グアニジニウムを含有する
バッファー、例えばキアゲン製ALを添加した後で、かつ70℃における10分間のイ
ンキュベーションの後に、200μlのエタノールが添加され、そしてこの溶液と混
合される。この混合物は、カラム上へ置かれ、そして遠心分離により膜の中を通
される。この膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン製AW1及びRWを用いてその後洗浄され、次いで遠心分離により乾燥される。溶出は、実施例３に
記載されたように行われる。３回の並行試験が行われ、そしてその平均値が計算
される。

【０１０９】単離されたDNAの量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定により続け
て決定され、平均は9.77μgである。260nmから280nmにおける吸収比率は、1.74 である。

【０１１０】実施例８異なるカオトロピック剤の使用による水溶液からの全RNAの固定化実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。 100μlの全RNAを含有する水溶液が、異なる濃度においてイソチオシアン酸グアニジニウム（GITC）又は塩酸グアニジニウム（GuHCl）を含有するの異なる溶解バッファー350μlと混合される。次いで、250μlのエタノールが、ピペッティ
ングにより添加され、そして混合される。この混合物は、その後カラム上に置か
れ、そして遠心分離（10000×g；1分）の方法によって膜の中を通される。これらの膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン製RPEを用いて次いで２回洗浄される。このバッファーは、遠心分離の方法により膜の中を通過させられ
る。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために20000×gにおいて行われる。溶出は
、実施例３に記載されたように行われる。２回の試験が行われ、平均値を決定す
る。結果を表６に記載する。

【０１１１】

【表６】

【０１１２】実施例９異なるアルコール類の使用による水溶液からの全RNAの固定化実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。全RNA を含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度4M）を含
有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、異なる量のエタノールと
イソプロパノールが添加され、そして700μlまでのRNaseを含まない水とともに付加され、そして混合される。この混合物は、実施例３に従ってその後カラムへ
輸送され、そして膜の中を通され、そして洗浄される。溶出は、実施例３と同様
に行われた。２回の試験が行われ、平均値が決定される。結果を表７に記載する。

【０１１３】

【表７】

【０１１４】実施例１０種々のpH値を有する水溶液からの全RNAの固定化実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。全RNA を含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度4M）を含
有する350μlの溶解バッファーと混合される。このバッファーは、25mMのクエン
酸ナトリウムを含有し、そしてHCl又はNaOHにより異なるpH値に調整される。次いで250μlのエタノールが添加され、そして混合される。この混合物は、実施例
４に従ってその後カラムへ輸送され、かつ膜の中を通され、そして洗浄される。
溶出は、実施例３と同様に行われた。２回の試験が行われ、平均値が決定される
。結果を表８に記載する。

【０１１５】

【表８】

【０１１６】種々の塩類を含有する水溶液からの全RNAの固定化実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。 100μlの全RNA含有水溶液が、350μlの塩含有溶解バッファー（NaCl、KCL、Mg
SO₄）と混合される。次いで、250μlの水又はエタノールが添加され、そして混合される。この混合物は、実施例４に従って、その後カラムへ輸送され、かつ膜
の中を通され、洗浄され、かつ溶出される。２回の試験が行われ、平均値が決定
される。結果を表９に記載する。

【０１１７】

【表９】

【０１１８】実施例１２種々のバッファー条件による水溶液からの全RNAの固定実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度2
.5M）を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。この溶解バッファーは、種々の濃度のpH7のクエン酸ナトリウム、又はpH7.2のシュウ酸ナトリウムと混
合される。次いで、250μlのエタノールが、添加されそして混合される。この混
合物は、実施例４に従ってその後カラムへ輸送され、かつ膜の中を通され、そし
て洗浄され、かつ溶出される。それらの結果を表１０に記載する。２回の試験が行われ、その平均値が決定さ
れる。

【０１１９】

【表１０】

【０１２０】実施例１３フェノールによる水溶液からの全RNAの固定化実施例３のように、疎水性膜を有するプラスチックカラム（例えば、パルゲル
マンサイエンス社製ヒドロロン、1.2μm）が、組み立てられる。 RNA水溶液は、700μlのフェノールと混合され、遠心分離により膜全面に分配される。実施例４のように、この膜は洗浄され、RNAが溶出される。二重測定が行われ、そしてそれぞれの場合において平均値が示される。260及び280nmにおける吸光度の間の比率から、RNA純度の評価を得る。

【０１２１】実施例１４異なる塩条件下において固定化された全RNAの洗浄実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度4
M）を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、250μlのエタノールが、添加され、そして混合される。この混合物は、実施例４に従い、その後
カラムへ輸送され、かつ膜の中を通される。この膜は、種々の濃度のNaClを含有
するバッファー及び80%エタノールを用いて、その後２回洗浄される。そのバッファーは、遠心分離により膜の中を通される。最後の洗浄段階は、膜を乾燥させ
るために20000×gにおいて行われる。溶出もまた、実施例３に従って行われる。
２回の試験が行われ、その平均値が決定される。結果を表１１に記載する。

【０１２２】

【表１１】

【０１２３】実施例１５異なる塩及びバッファー条件の下において固定化されたRNAの溶出実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度4
M）を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、250μlのエタノールが、添加され、そして混合される。この混合物は、実施例３に従いカラムへ
輸送され、かつ膜の中を通過させられ、そして洗浄される。溶出において、膜から精製されたRNAを溶出するために、70μlのNaCl含有溶液
、トリス/HClバッファー（pH7）又はシュウ酸ナトリウム水溶液（pH7.2）が、膜
上へ滴下される（pipetted）。1〜2分のインキュベーションの後に、10〜30℃の
間の温度において、溶出物が膜から上方から滴下される。この溶出段階は、完全
な溶出を達成するために、一度繰り返される。２回の試験が行われ、その平均値
が決定される。結果を表１２に要約する。

【０１２４】溶出バッファーにおけるNaCｌ又はトリス/HClを含有する水溶液からのRNA収量

【表１２】

【０１２５】実施例１６ β-アクチン(actin)mRNAの増幅及び検出のための5'ヌクレアーゼPCR分析を使用する‘リアルタイム’定量RT-PCRにおける全RNAの使用実施例３に従って、プラスチックカラムが市販の膜（パルゲルマンサイエンス
、1.2μmの細孔サイズを有するヒドロロン）と組み合わされる。 RNAを単離するために、１×10⁵のヒーラー細胞が使用され、そして全RNAの精製が、実施例３に記載されたように行われる。溶出は、実施例３に記載されたよ
うに、2×60μlの水を用いて行われる。DNAの残留量の完全な除去のために、試料は、分析前にDnaseを用いて処理される。

【０１２６】 “１装置（one-device）‘リアルタイム’定量RT-PCR”は、M-MLV逆転写を使用することによるパーキンエルマー（Perkin-Elmer）の市販の反応系（タクマン
（TaqMan）（TM）PCR試薬キット）の使用により行われる。β-アクチンのための
特異的プライマー及び特異的タクマンプローブ（パーキンエルマー製タクマン（
TM）β-アクチン検出キット）の使用により、全RNA試料中のβ-アクチンmRNA分子は、β-アクチンcDNAにまず転換され、次いで全反応は、同じ反応装置において、妨害なしに直ちに増幅され、かつ検出される。この反応見本は、製造業者の
指示に従い作成される。３種の異なる量の単離された全RNAが使用され（1、2、4
μlの溶出液）、そして３回の決定試験が行われる。コントロールとして、RNAな
しの３つの見本もまた、試験される。

【０１２７】 cDNA合成は、37℃において１時間行われ、その後直ちに40サイクルから成るPC
Rが行われる。それらの反応及び分析は、パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ（Perkin Elmer Applied Biosystems）により組み立てられたABI P
RISM(TM)7700配列検出器において行われる。PCRサイクル中に発生したどのアンプリコン（amplicon）もみな、タクマンプローブからの***により発生した光放
射分子を生成する。発生した全ての光シグナルは、発生したアンプリコン量に正
比例し、従って全RNA試料において利用可能な転写物の当初の量に基づく。放射された光は、それらの装置により測定され、そしてコンピュータープログラムに
より評価される。その間に光シグナルがバックグラウンドノイズ上で最初に検出
されなければならないPCRサイクルは、“スレッシュホルドサイクル（Threshold
Cycle）(ct) ”として呼ばれる。この値は、試料において利用可能な特異的に増幅されたRNA量のための尺度である。

【０１２８】ここに記載された方法により単離された全RNAの１μlの使用量に対し、結果は
、平均ct値が17.1であり、全RNAにおける2μlに対して、ct値は16.4であり、かつ4μlの全RNAに対して、そのct値は15.3である。これは、全RNAとct値との間で
一次従属する結果となり、このことは、全RNAが増幅反応を阻害し得る物質を含まないことを示す。RNAを含まないコントロール見本は、いずれのシグナルをももたらさない。

【０１２９】実施例１７ β-アクチンmRNAの増幅及び検出のためのRT-PCRにおける全RNAの使用実施例３に従って、プラスチックカラムが市販の膜（パルゲルマンサイエンス
、1.2又は3μmの細孔サイズを有するヒドロロン；サルトリウス（Sartorius）、
0.45μmの細孔サイズを有するサルトロン（Sartolon））と組み合わされる。

【０１３０】 RNAの単離のために、２つの異なる原料が使用される。 1) 実施例４に記載の通りに精製、溶出が行われた、水溶液中の肝臓（マウス）由来の全RNA 、並びに 2) 実施例３に記載の通りに全RNAの精製及び溶出が行われた5×10⁵のヒーラー細胞。

【０１３１】それぞれの試験のために、20ngの単離された全RNAが使用される。コントロールとして、アールエヌイージー（RNeasy）キット（キアゲン）により精製された
RNA及びRNAを含まない試料が使用される。

【０１３２】 RT-PCRは、標準条件下において、これらの試料を用いて行われる。増幅のため
に、２つの異なるプライマー対が、β-アクチンのために使用される。150Bpのサ
イズに形成された（150Bp-sized）フラグメントは、感度の証拠として役立ち、1
.7kBpのサイズに形成されたフラグメントは、RNAの完全な状態（integrity）を評価する。RT反応から、1μlが除去され、かつ後続のPCRへ輸送される。25サイクルは、小フラグメントに対して行われ、かつ27サイクルは大フラグメントに対
して行われる。アニーリング（annealing）温度は55℃である。増幅された試料は、非変性（non-denaturizing）ゲル上に、次いで配置され、そして分析される
。

【０１３３】上述の方法において単離された全RNAの20ngの使用量に対して、対応するDNAフ
ラグメントがRT-PCRにおいて示され得る。ここで使用される条件は、ヒトβ-アクチンのために調整されているので、マウス肝臓由来の全RNAを使用する際には、転写は何ら示されない。RNAを含まないコントロール見本は、いずれのシグナルをももたさらない。

【０１３４】図７は、RT反応の電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。 A:レーン1〜8：150BpフラグメントのRT-PCR；レーン1、2：ヒドロロン1.2μm膜を用いて精製された水溶液からのRNA；レーン3、4：サルトロン膜を用いて精製されたヒーラー細胞からのRNA；レーン5、6ヒドロロン3μm膜を用いて精製されたヒーラー細胞からのRNA；レーン7：アールエヌイージー・ミニキットにより精製されたRNA；レーン8；RNAを含まないコントロール。 B:レーン1〜8：1.7kBpフラグメントのRT-PCR；レーン1、2：ヒドロロン1.2μm膜を用いて精製された水溶液からのRNA；レーン3、4：サルトロン膜を用いて精製されたヒーラー細胞からのRNA；レーン5、6：ヒドロロン3μm膜を用いて精製されたヒーラー細胞からのRNA；レーン7：アールエヌイージー・ミニキットにより単離されたRNA；レーン8：RNAを含まないコントロール。

【０１３５】実施例１ｂ親水性膜との結合によるヒーラー細胞からの全RNAの単離種々の材料から成る市販の親水性膜が、プラスチックカラム内に単一層で設け
られる。実施例３の通りに、その膜はポリプロピレングリッド上へ置かれ、そし
てリングを用いて固定される。

【０１３６】単離のために、5×10⁵のヒーラー細胞が挿入される。単離及び核酸の溶出のた
めの以降の段階は、実施例３に記載されたように行われた。

【０１３７】単離された全RNA量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定によりその
後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。

【０１３８】種々の親水性膜を用いた単離の結果は、以下の表1ｂ（表１３）に示される。膜当たり2〜5回の並行試験が行われ、そしてそれぞれの場合における平均値が計
算された。溶出物が、それが上方から抜き取られることにより膜から採取される
場合に、シリカ膜の使用により測定可能量の全RNAは単離され得ない。

【０１３９】

【表１３】

【０１４０】親水性膜との結合による水溶液からのフリーのRNAの単離実施例１ｂの通りに、種々の親水性膜とともにプラスチックカラムが組み立て
られる。全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する市販の溶解バッファー、例えばキアゲンのRLTバッファー 350μlと混合され
る。その後、250μlのエタノールが、ピペッティングにより添加され、そして混
合される。この混合物は、その後カラムへ輸送され、そして実施例４のように膜
の中を通され、洗浄され、そして乾燥される。その後、そのRNAは実施例３において既に説明されたようにRNaseを含まない水
を用いて溶出され、そしてピペットにより膜から抜き取られる。

【０１４１】単離された全RNA量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定によりその
後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。種々の親水性膜を用いた単離の結果を、以下の表2ｂ（表１４）に示す。膜当たり2〜5回の並行試験が行われ、そしてそれぞれの場合における平均値が計算さ
れた。溶出物が、それが上方から抜き取られることにより膜から採取される場合
に、シリカ膜の使用により測定可能量の全RNAは単離され得ない。

【０１４２】

【表１４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者オエルミュラーウーベドイツ連邦国、エルクラスＤ−40699、メールラゼルヴェグ 46 (72)発明者ウルマンスザンヌドイツ連邦国、エルクラスＤ−40699、トリルス 19 Ｆターム(参考） 4B063 QA05 QA11 QA17 QA18 QA19 QQ42 QR32 QR41 QR82 QS15 QS20 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の段階により核酸類を単離するための方法。 − 核酸類を所定の方向から表面へ投入すること； − 前記表面上での核酸類の固定化； − 前記表面からの固定化された核酸類の放出；及び − 主に投入方向における前記表面から放出された核酸類の除去。
【請求項２】前記チャージは上方（top）から行われるという事実を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】固定化と放出段階との間で、少なくとも１種の洗浄バッファーを
用いて固定化された核酸類の洗浄を行うという事実を特徴とする請求項１又は２
に記載の方法。
【請求項４】前記洗浄が、各洗浄バッファーのために以下の段階を含むという
事実を特徴とする請求項３に記載の方法。 − 予め決められた量の洗浄バッファーの表面への輸送；及び − 吸引による表面を通した前記洗浄バッファーの抜き取り。
【請求項５】前記核酸類の投入及び固定化は以下の段階を含むという事実を特
徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。 − 固定化バッファーとの前記核酸類の混合； − 表面上での固定化バッファーを用いた核酸類の投入； − 主に投入方向における表面を通した液体成分の抜き取り。
【請求項６】前記段階の少なくとも１つは、自動機械によって完全に自動で行
われ得るという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項７】前記方法における全ての段階が制御配列（controlled sequence ）における自動機械によって行われ得るという事実を特徴とする請求項６に記載
の方法。
【請求項８】核酸類の単離の大部分が同時に行われ得るという事実を特徴とす
る前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項９】放出と除去段階との間で、以下の段階の少なくとも１つが行われ
得るという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。 − 核酸類における少なくとも１つの化学反応の実施； − 表面上での核酸類の固定化；及び − 表面からの固定化された核酸類の放出。
【請求項１０】核酸類の固定化のために、鉱酸とアルカリ及びアルカリ土類金
属類との塩類の水溶液が使用されるという事実を特徴とする前述の請求項の１項
に記載の方法。
【請求項１１】核酸類の固定化のために、アルカリ又はアルカリ土類ハロゲン
化物類若しくは硫酸塩類が使用されるという事実を特徴とする請求項１０に記載
の方法。
【請求項１２】核酸類の固定化のために、硫酸ナトリウム又はカリウム又はマ
グネシウムのハロゲン化物が使用されるという事実を特徴とする請求項１１に記
載の方法。
【請求項１３】核酸類の固定化のために、アルカリ又はアルカリ土類金属と
、一塩基若しくは多塩基又は多官能性（polyfunctional）有機酸類とからの塩類
の水溶液が使用されるという事実を特徴とする請求項１〜９の１項に記載の方法
。
【請求項１４】核酸類の固定化のために、有機ジカルボン酸類のナトリウム、
カリウム、又はマグネシウム塩類の水溶液が使用されるという事実を特徴とする
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記有機ジカルボン酸が、シュウ酸、マロン酸、又は琥珀酸で
あるという事実を特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】核酸類の固定化のために、ナトリウム又はカリウム塩類の水溶
液が、ヒドロキシカルボン酸又はポリヒドロキシカルボン酸とともに使用され得
るという事実を特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】前記ポリヒドロキシカルボン酸がクエン酸であるという事実を
特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】核酸類の固定化のために、脂肪族又は非環式飽和又は不飽和炭
化水素のヒドロキシル誘導体が使用されるという事実を特徴とする請求項１〜９
に記載の方法。
【請求項１９】前記ヒドロキシル誘導体として、C1-C5アルカノール類が使用されるという事実を特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記C1-C5アルカノールとして、メタノール、エタノール、n- プロパノール、tert.-ブタノール又はペンタノールが使用されるという事実を特
徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記ヒドロキシル誘導体として、アルダイト（aldite）が使用
されるという事実を特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】核酸類の固定化のために、フェノール又はポリフェノールが使
用されるという事実を特徴とする請求項１〜９に記載の方法。
【請求項２３】固定化された核酸類の洗浄のために、請求項４〜２２の１項に
よる塩溶液又はバッファー溶液が使用されるという事実を特徴とする請求項３〜
２２に記載の方法。
【請求項２４】核酸類の放出[のために]、水性塩又はバッファー溶液が使用さ
れるという事実を特徴とする前述の請求項の1項に記載の方法。
【請求項２５】核酸類の放出のために、水が使用されるという事実を特徴とす
る請求項１〜２３の１項に記載の方法。
【請求項２６】核酸類の固定化のために、カオトロピック剤が使用されるとい
う事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項２７】前記カオトロピック剤が、トリクロロ酢酸塩類、チオシアン酸
塩類、過塩素酸塩類、ヨウ化物類、又は塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸
グアニジニウム又は尿素の群の塩であるという事実を特徴とする請求項２６に記
載の方法。
【請求項２８】カオトロピック剤の0.01〜10Mの水溶液が、核酸類の固定化のために、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴と
する請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】カオトロピック剤の0.1〜7Mの水溶液が、核酸類の固定化のために、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴とす
る請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】カオトロピック剤の0.2〜5Mの水溶液が、核酸類の固定化のために、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴とす
る請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸
グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又はヨウ化カリウムの水溶液が、核酸類の
固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項２６〜３０の１項に記
載の方法。
【請求項３２】前記表面が膜であるという事実を特徴とする前述の請求項の１
項に記載の方法。
【請求項３３】前記膜が、疎水性膜であるという事実を特徴とする請求項３２
に記載の方法。
【請求項３４】前記疎水性膜が、極性基を有するポリマーから成るという事実
を特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】前記膜が、疎水化された（hydrophobisized）表面を有する疎水性膜であるという事実を特徴とする請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３６】前記膜が、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、
ポリカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタ
ン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフル
オロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオルリド、ポ
リエチレン-テトラフルオロエチレン共重合化物（copolymerizate）、ポリエチレン-クロロトリフルオロエチレン共重合化物、又はポリフェニレンスルフィドから成るという事実を特徴とする請求項３３〜３５に記載の方法。
【請求項３７】前記表面又は前記膜が、疎水化されたナイロンから成るという
事実を特徴とする請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】前記膜が、ある場合には、アルミニウム又はジルコニウム塩類
、四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコーン類、
有機亜鉛化合物類、又はグルタル酸（glutaric）ジアルデヒドの混合物とともに
、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類の群からの疎水性コート剤を用いてコ
ートされるという事実を特徴とする請求項３５〜３７に記載の方法。
【請求項３９】前記膜が、親水性又は親水化された（hydrophilized）膜であるという事実を特徴とする請求項３５〜３７に記載の方法。
【請求項４０】前記膜が、親水化されたナイロン、ポリエーテルスルホン、ポ
リカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタン
、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオ
ロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、ポリエ
チレン-テトラフルオロエチレン共重合化物、ポリエチレン-クロロトリフルオロ
エチレン共重合化物、又はポリフェニレンスルフィドから成るという事実を特徴
とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記膜における細孔が、0.001〜50μm、好ましくは0.01〜20μ
m、最も好ましくは0.05〜10μmの直径を有するという事実を特徴とする請求項３
２〜４０に記載の方法。
【請求項４２】前記表面が、疎水性フリース（fleece）であるという事実を特
徴とする請求項１〜２５に記載の方法。
【請求項４３】前記フリースが、シリカゲルフリースであるという事実を特徴
とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】核酸類の固定化のために、カオトロピック剤が使用されるとい
う事実を特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】前記カオトロピック剤が、トリクロロ酢酸塩類、チオシアン酸
塩類、過塩素酸類、ヨウ化物類、又は塩酸グアニジニウ、イソチオシアン酸グア
ニジニウム、もしくは尿素の群からの塩であるという事実を特徴とする請求項４
４に記載の方法。
【請求項４６】 0.01〜10Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の塩類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とす
る請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】 0.1〜7Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の塩類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする
請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】 0.2〜5Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の塩類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする
請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸
グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又はヨウ化カリウムの水溶液が、核酸類の
固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項４４〜４８に記載の方
法。
【請求項５０】固定化が、pH3〜11において行われるという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項５１】前記膜の片側における核酸類の固定化、及び同じ側におけるそ
れらの単離のための核酸類の放出のための少なくとも１つの膜の使用。
【請求項５２】前記膜が、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、
ポリカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタ
ン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフル
オロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、ポリ
エチレン-テトラフルオロエチレン共重合化物、ポリエチレン-クロロジフルオロ
エチレン共重合化物、又はポリエチレンスルフィドからなるという事実を特徴と
する請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】前記膜が、疎水化されたナイロン膜であるという事実を特徴と
する請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】前記表面又は膜が、ある場合には、アルミニウム又はジルコニ
ウム塩類、四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコ
ーン類、有機亜鉛化合物類、又はグルタル酸（glutaric）ジアルデヒドの混合物
とともに、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類の群からの疎水性コート剤を
用いてコートされる親水性表面又は膜であるという事実を特徴とする請求項５１
〜５３の１項に記載の使用。
【請求項５５】前記膜の大部分が、マルチウェルプレート上の単離装置に設置
されるという事実を特徴とする請求項５１〜５４の１項に記載の使用。
【請求項５６】請求項１〜４９の１項において作動するという事実を特徴とす
る自動装置。
【請求項５７】バッファー及び溶液の表面への及び表面から離す適用を実行す
る又は実行し得る少なくとも１つの真空装置とともに備えられるという事実を特
徴とする請求項５５に記載の自動装置。
【請求項５８】前記核酸類の固定化が、pH3〜11において行われるという事実を特徴とする請求項１〜５０の１項に記載の方法。