JP2001520894A - 表面上の核酸類の単離及び精製のための方法 - Google Patents
表面上の核酸類の単離及び精製のための方法Info
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Abstract
Description
処理技術が用いられ、又は核酸類に基づく科学技術が実際に利用(access)の秘
訣である、作業分野のために極めて重要である。その例は、実父確定分析(pate
rnity analysis)、組織適合試験、遺伝病の同定、ゲノム(genome)分析、分子
診断、伝染病の決定、動物及び植物繁殖、移植遺伝子(transgenic)調査、生物
学及び医薬、並びに多数の関連領域における基礎調査を包含する。それらの中に
含まれる核酸類が、問題とされる分析手順において直接使用され得るようなやり
方で、生物学的又は臨床的試料を調製する際に、一般に困難に遭遇する。
Enzymology 100 (1983) 243]により、クローニング、及び同様に他の実験的方法
の目的のためにプラスミドDNAをどのように精製するかを知っている。この方法 において、細菌由来の透明な溶解物は、4〜24時間の間、塩化セシウム勾配(
gradient)に曝され、そして遠心分離される。この段階の後に、DNAの抽出及び 沈殿が通常行われる。この方法は、一方では非常に高価な装置を必要とし、他方
では、長時間を要し、費用集約的(costintensive)であり、かつ自動化するこ とができないという欠点を有する。
は、主に塩化セシウム勾配の代替として提供されるが、しかし、通常高濃度の塩
類を含み、かつ著しく希釈された溶液中で行われるので、装置を多数要する(ap
paratus-intensive)溶媒供給系及び得られたDNAフラクションの沈殿を要する。
(Vogelstein)ら[Proc. Nat. Acad. Sci. 76 (1979) 615]は、核酸類を含む抽 出物からのDNAが、高濃度のヨウ化ナトリウム又は過塩素酸ナトリウムに曝され る場合に、DNAのみは小さなガラスシンチレーション(scintillation)管、機械
的手法により細かく粒子状化された繊維ガラスシートのガラス繊維膜に密着する
一方、RNA及びタンパク質類はそうではないことを見出した。この手法において 結合されたDNAは、例えば、水を用いて溶出することができる。
りにこの膜を、全ての結合された核酸類とともに、PCRアタッチメント(attachme
nt)内に直接導入する。最終的に、この国際特許出願及び他の文献において、疎 水性表面又は膜は、ほぼ十分な収量で核酸類を固定化し得るために、一般に前も
って水又はアルコールを用いて湿らせなければならないことが記載されている。
A又はタクマン(TaqMan)テクノロジー及びPCRのためのほぼリアルタイムの定量
技術のような、いくつかの最近の応用のために、核酸類を、固体相から直接放出
でき得ることは、明らかに必要である。この関連において、WO 87/06621は、核 酸類が、この方法において使用された膜から事実回収され得る一方、この回収は
問題をはらみ、かつ核酸類の定量的な単離には全く適さないことを我々に教示し
ている。さらに、この方法において得られた核酸類は、比較的非常に希薄である
ので、それらを濃縮及び単離するための次の段階が、明らかに必要となる。
るための方法の自動化に関しては、工程設計の観点から、できる限り単純かつ生
産的な核酸の単離のための適当な開始点になり得ない。
いる方法の欠点を克服すること、及び多くのさらなる技術的消耗なしに、ほぼ完
全に自動化され得る方法を利用できるようにすることである。
応用、及び独立特許請求項56による自動装置により解決される。本発明のさら
に有利な局面及び態様は、独立特許請求項、説明及び添付の図から明らかになる
。
から、簡単な方法で固定化されることができ、かつ簡単な手順の(procedural)
段階によって再度放出され得る多孔性膜のような表面を使用する方法に関する。
特に、本発明が依存する簡単な手順は、この方法を完全に自動で行うことを可能
にする。
、かつ所望により、例えば、制限的消化、RT、PCR若しくはRT-PCR、又は上記に 記載のその他の適当な分析的若しくは酵素的反応のような、他の適用において使
用され得るような手法において、特に核酸類を固定化相、とりわけ膜へ結合する
ことである。 本発明は、以下の段階により、核酸類の単離のための手順を提供する。 - 核酸類を所定の方向から表面へ付加すること(loading); - 前記表面上での核酸類の固定化; - 前記表面からの固定化された核酸類の放出;及び - 主に付加方向における前記表面から放出された核酸類の除去。
るために使用され得る。固定化と放出段階との間に、固定化された核酸類の洗浄
が、少なくとも1種の洗浄バッファーを用いて行われ得る。各洗浄バッファーの
ために、この洗浄は、好ましくは以下の段階を含む。 - 予め決められた量の洗浄バッファーの表面への適用、及び - 吸引による前記表面を介しての洗浄バッファーの引き抜き(pulling)。
自動装置を用いて完全に自動で行われ得るという利点を有する。この手順におけ
る全ての段階は、自動装置により、導かれた一連の段階(a guided series of s
teps)において行われ得ることもまた、可能である。
に単離が行われ得ることが可能である。
で、少なくとも1回行われ得る。 - 核酸類を用いた少なくとも1つの化学反応の実施; - 前記表面における核酸類の固定化;及び - 前記表面からの固定化された核酸類の放出。
おける表面から主に溶出(放出)される。“同じ方向”とは、基本的に、180度 以下の角度からのいずれの方向をも意味し、よって、溶出の間、前記核酸類は、
いずれの環境下においても表面を貫通しないが、それらが表面へ適用された投入
方向の反対方向において、表面から除去される。好ましい態様において、一方、
他のバッファー、即ち、ある場合には洗浄バッファーを含む核酸類が投入中に見
出され得るバッファーは、表面を通して抜き取られ、さもなければ輸送される。
単離が、その膜がその装置の全直径を覆う装置中にある膜において行われる場合
、投入の好ましい方向は、上方からである。この場合には、除去段階は、再度上
方から行われる。図2は、例えば、上方から投入され、かつ核酸類の除去が上方
向において行われる漏斗型単離装置を示す。
ーは、真空装置によって反応装置から単離装置内に直接抜き取られることができ
、それにより、その核酸類が、単離装置において膜の底側へ結合されることが考
えられる。そのような場合には、表面からの核酸類の除去は、核酸類の放出後、
装置内の下側に排出される、下から抜き取られた溶出バッファーを用いて行われ
る。この場合には、核酸類の除去は、下側方向において行われる。
上に置かれたカラムは、溶解物を投入され、かつ水平に置かれたカラムが、核酸
類が結合された膜の側面において、溶出バッファーにより次いですすがれる際に
は、核酸類の横方向の除去でさえ、可能である。
ある。全てのバッファーと同様に、この溶出バッファーもまた、一方の側から来
て、他方の側へ流れ落ちる。この場合において、このバッファーの注入流及び核
酸類を含むバッファーの排出流の方向は、180度の角度を形成する。しかし、そ の除去は、固定化と同様にその表面の同じ側において常に行われる。
全ての核酸類と同様に、核酸類の全ての水溶液又はその他の溶液が包含される。
本発明の意味において、この用語はフリーの核酸類、又は核酸を含む試料、又は
、インビトロ(in vitro)転写、PCR反応、若しくはcDNA合成のために適した抽 出物として役立ち得る核酸類を含むサンプリング、又はサンプリング手順を用い
て[得られた]物質へ適用し得る。生物学的材料又は生物学的試料により、例えば
、欧州特許出願第95909684.3.号に記載されたような、例えば、血漿、血液、唾 液、尿、糞、***のような体液、細胞、血清、白血球フラクション、クルスタ催
炎(crusta phlogistica)、なすりつけ標本(smears)、あらゆる種類の組織試
料、植物及び植物の部分、ウイルス、酵母等が意味される。本発明の意味におい
て、核酸類により、例えば、2本鎖、1本鎖、環状及び鎖状、分岐等のような、
全ての長さ及び配置(configuraions)の、リボ核酸類(RNA)及びデオキシリボ
核酸類(DNA)、モノマーヌクレオチド類、オリゴマー類、ウイルス性及び細菌 性DNA並びにRNA、並びに動物及び植物細胞又は他の白血球からのゲノム、又は非
ゲノムDNA及びRNA、処理された、又は未処理の形態のt-RNA、mRNA、hn-RNA、rRN
A、及びcDNA、並びに他の想像し得る核酸類のような、全ての可能な種類の核酸 類が意味される。
ル(類)を含有する溶液内へ導入され、次いで、適当な場合においては、その試
料を溶出し、かつ混合し、かつ、真空を用いて、遠心分離機の使用を介し、プラ
スの圧力を用いて、毛管現象の力により、又は表面上で核酸類が固定化される方
法により、多孔性表面を介する他の適当な手段により、この方法において得られ
た混合物を通す。
カリ土類金属類の塩類、特に、アルカリ又はアルカリ土類ハロゲン化物又は硫酸
塩、とりわけ好ましくは、硫酸ナトリウム又はカリウム又はマグネシウムのハロ
ゲン化物を包含する。
(polyfunctional)有機酸類もまた、本発明の方法を行うために適合される。こ
れらは、シュウ酸、マロン酸、又は琥珀酸のような有機ジカルボン酸類を有する
、又はヒドロキシ若しくはポリヒドロキシカルボン酸類を有する、例えば、好ま
しくはクエン酸を有するナトリウム、カリウム、又はマグネシウム塩類を特に包
含する。
。カオトロピック物質は、水素結合の3次元構造を妨害することができる。この
方法はまた、第1、第2、第3又は第4構造(primary, secondary, tertiary
or quanternary structures)を包含する、生物分子内における空間構造の形成に
関与する分子内結合力を弱める。この種のカオトロピック剤は、技術水準におい
て専門家に知られている(H.Dellwegにより発行されたRompp,Lexikon of Biotec
hnologie、 R.D.Schmid 及びW.E.Fromm,Thieme Verlag,Stuttgart 1992)。
ロロ酢酸塩、チオシアン酸塩、過塩素酸塩又はヨウ化物群又は塩酸グアニジニウ
ム及び尿素からの塩類である。
溶液中で、最も好ましくは0.2〜5Mの水溶液中で使用される。上記のカオトロピ ック剤は、単独で又は組み合わせて使用され得る。特に、過塩素酸ナトリウム、
塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又
はヨウ化カリウムの0.01〜10Mの水溶液、好ましくは0.1〜7Mの水溶液、最も好ま
しくは0.2〜5Mの水溶液。
は不飽和炭化水素類の全てのヒドロキシル誘導体をまず第一に包含する。問題と
なる化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はグリセリンを
包含する多価C1-C5アルカノール類のように、1-、2、3又はそれ以上の水酸基
を含むか否かは、最初は重要ではない。
様に、糖誘導体、いわゆるアルダイト類(aldites)を包含する。
、第3(tertiary)ブタノール及びペンタノール類のようなC1-C5アルカノール 類は、とりわけ好ましい。
化におけるpHは、3〜11の間であることができる。好ましくは、固定化はpH4〜8 の間で行われる。RNAが単離されなければならない場合は、そのpHは、好ましく は中性領域にあり、一方、DNAの単離に関しては、酸性pHがより有利であり得る 。よって、RNAの単離のためのpHは、例えば、6〜8の間に、好ましくは6.5〜7.5 の間にあり得る。DNA単離のためには、そのpHは4〜8の間において最も有利であ り、好ましくは4〜6の間であり得る。
、水と容易に混合し、又は水を吸収するような材料又は膜に適用する。
、水中に浸透しないで、又はその逆の、かつその中に留まることができないよう
な材料又は膜に適用する。
ous-separating)層をも意味される。膜の場合には、その表面はポリマー材料の
フィルムから成る。そのポリマーは、好ましくは極性基を有するモノマーから成
り得る。
は、粒子又は粒状体又は例えばシリカゲルフリース(fleece)のような滑らかな
(even)繊維の層を包含する。
販の疎水化(hydrophobisized)ナイロン膜のように、親水性物質からなり、か つ今日の技術水準において知られている後続の化学的処理により疎水性にされ得
る膜が好ましい。本発明の目的のために、疎水化膜は、初めは親水性であること
もないこともあり、かつ以下に記載の疎水性コート剤を用いてコートされるそれ
らの膜を一般に包含する。この種の疎水性コート剤は、かなり長いアルキル鎖又
はシロキサン基のような、疎水基の薄膜を用いて親水性物質を覆う。適当な疎水
性コート剤は、技術水準において多数知られている。本発明の目的のために、こ
れらは、必要ならばアルミニウム又はジルコニウム塩類、四級有機化合物類、尿
素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコーン類、有機亜鉛化合物類、グル
タル酸(glutaric)ジアルデヒド及び類似物質の添加剤とともに、パラフィン類
、ワックス類、金属石鹸類等を包含する。
その基材が極性基を含むものである。これらの基準によれば、例えば以下の群か
らの材料、特に疎水化されたものが、本発明における使用のために適当である。
ポリアクリレート類及びアクリル酸共重合体類、ポリウレタン類、ポリアミド類
、ポリ塩化ビニル、フルオロカーボネート類、ポリテトラフルオロエチレン類、
ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、エチレン-テトラフ ルオロエチレン、ポリエチレン-クロロトリフルオロエチレン共重合化物(copol
ymerisate)、又はポリフェニレンスルフィド、及びセルロース混合(cellulose
-mix)エステル類、又はニトロセルロース類、並びに疎水化ガラス繊維膜。とり
わけ好ましくは疎水化ナイロン膜。
材料をも包含する。例えば、以下の物質が使用され得る。親水性ナイロン、親水
性ポリエーテルスルホン類、親水性ポリカーボネート類、ポリエステル類、ポリ
プロピレン組織上の親水性ポリテトラフルオロエチレン類、ポリプロピレンフリ
ース上の親水性ポリテトラフルオロエチレン類、親水化(hydrophilisized)ポ リビニリデンフルオルリド、ポリビニリデンジフルオリド、親水化ポリテトラエ
チレン類、親水性ポリアミド類。
〜20μmそして最も好ましくは0.05〜10μmの細孔直径を有する。
リフェノール類が使用され得る。洗浄段階における温度は、通常10〜30℃の範囲
内であり得る一方、より高い温度もまた、良好に使用され得る。
は水性塩溶液である。塩溶液としては、技術水準において知られたバッファー溶
液、例えばモルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、トリス(ヒロドキシメチル)
アミノメタン(TRIS)、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン
酸(HEPES)が、0.001〜0.5モル/リットル、好ましくは0.01〜0.2モル/リットル
の濃度において、最も好ましくは0.01〜0.05Mの溶液が使用され得る。0.001〜0.
5、好ましくは0.01〜0.2M、最も好ましくは0.01〜0.05Mを含むアルカリ又はアル
カリ土類金属塩類、特に、それらのハロゲン化物の水溶液、塩化ナトリウム、塩
化リチウム、塩化カリウム又は二塩化マグネシウムの水溶液もまた、使用のため
に好ましい。シュウ酸又は酢酸のようなカルボン酸又はジカルボン酸を有するア
ルカリ又はアルカリ土類金属類の塩類の水溶液、酢酸ナトリウム又はシュウ酸エ
ステルの水溶液もまた、上記の濃度範囲、例えば、0.001〜0.5、好ましくは0.01
〜0.2M、最も好ましくは0.01〜0.05Mにおいて、使用のために好ましい。
ilepore)水のような純水は、溶出手段としてとりわけ好ましい。
度においてでさえ、良好に行われる。蒸気を用いた溶出もまた、可能である。
、例えば、膜が固定された(プラスチック)カラム中に、例えば、底部の上に、
ピペットで移される。それは、この膜が機械的支持体として作用するグリッドへ
固定される場合に、より能率的である。この溶解物は、その後膜を通して運ばれ
、それはカラムの排出口における真空の適用により達成され得る。その輸送はま
た、溶解物へのプラスの圧力の適用によって達成され得る。さらに、上述の通り
、溶解物の輸送は、遠心分離により、又は毛管現象力の効果により行われ得る。
後者は、例えば溶解物又は濾過に接触させた膜の下に導入されるスポンジ様の材
料を用いて行われ得る。
浄バッファーが輸送されたことにより、又はそれが核酸類として、同じ側に残さ
れたことにより、行うことができる。もし、洗浄バッファーが通過され、又は抜
き取られるならば、これは、例えば膜の他方の上に置かれたスポンジにより、真
空若しくは高圧装置により、又は遠心分離若しくは重力により、様々な方法で行
うことができる。
り、この場合においては、濾過液を用いて直ちに多少湿らされるスポンジのみが
交換されることを要する。この点において、カラムは継続的に、又はバッチ法で
用いられることができ、かつこれらの操作モードの両方が、膜が核酸により完全
に飽和されるまで、全て自動で行われ得ることが明らかであろう。最終段階は、
ピペットにより抜き取られ、若しくは除去され、又はその他の方法において上側
へ除去されることができる核酸の溶出である。いずれに場合においても、本発明
の基礎である手順における溶出段階のために重要なことは、核酸類が、その膜の
、それらが膜へ適用されたのと同じ側から除去される、即ち、膜を通した核酸類
の移動はないことである。この一連の手順は、当初の溶解バッファー又は洗浄バ
ッファーのような、もはや必要とされない全ての流体を、真空又は重力により“
消耗側”へ輸送することを可能にし、一方、溶出液は、もう一方の側に残存する
。この種の装置は、溶解物の添加又は溶出液の除去のためのピペッティング(pi
petting)装置が、表面の一方の側にのみ備えられなければならず、一方、表面 の他方の側は、いかなる“清浄域(clean area)”をも有することを必要しない
ので、本発明が基づく方法を特に簡単な手法において自動化することを可能にす
る。この方法において、空間分離により、核酸類の未汚染(contamination-free
)単離、とりわけRNaseからの解放は、非常に簡単な手段により保証され得る。 さらに、この単離装置、例えば洗浄カラムは、別の場所へ移される必要はなく、
一方では、消耗を回避し、他方では、装置の同じ開口部を通して溶出液を回収す
る。これはまた、手順の自動化方法の簡略化を意味する。
るフラクションの捕獲は、本発明の方法を用いると完全に必要なくなる。代わり
に、所望の核酸類は、全ての分子生物学的分析手順のために極めて有用である、
わずかな塩を含み、又は塩を含まない、非常に少量の溶液において得られる。な
ぜなら、これらは高濃度を有すると同時に可能な最少量において純粋な核酸類を
要求するからである。可能な限り最少量の溶出液を得るという目的を達成するた
めに、それらの膜は、表面として可能な限り薄いことが特に好ましく、それによ
り、わずかな流体のみがそれらの中に回収され得る。一方、シリカゲルフリース
のようなフリースは、これらが比較的多量の溶出液を吸収しうるため、あまり望
ましくなく、上側の溶出液の上方への除去をより困難にし、かつ好ましくない手
法において溶出液の必要量を増加する条件も、あまり望ましくない。
置にされる)とき、膜の上側の空間は、反応領域として使用され得るという利点
を有する。よって、例えば本発明の基礎である方法により生成された核酸類の単
離及び放出の後は、それらを除去しないことだけでなく、それらを単離装置内に
残留させ、かつそれらに制限消化、RT、PCR、RT-PCR又は酵素反応のような分子 生物学的応用を施すこと、本発明が基づく手順に従い、これらの反応により膜内
に生成された核酸類を再度結合すること、ある場合にはそれらを説明されたよう
に洗浄すること、かつ次いでそれらを溶出すること、それらを単離、又は例えば
顕微鏡、蛍光計、又は同様の測定技術により分析することが可能である。
、かつ、それらが非常に多様な手法で直ちに処理され、かつ加工され得る程度に
非常に高い精製の値を有する。
、かつ、DNAポリメラーゼ類、DNA制限酵素類、DNAリガーゼ、及び逆転写酵素の ような非常に多様な酵素のための基質として用いることができる。 本発明の方法により生成された核酸類は、増幅のために、特にPCR(ポリメラ ーゼ鎖反応)、鎖置換増幅(strand displacement amplification)、回転円法(r
olling circle procedure)、リガーゼ鎖反応(LCR)、及び同様の手法のために
とりわけ良好に適合される。
により精製された核酸が、後続の段階において増幅され、かつこの手法で増幅さ
れた核酸が、その後続けて、又は直ちに検出されるという事実を特徴とする診断
手順のための核酸類の調製のために特に良好に適合される(z.B.Holland,P.M. e
t al.,1991. Proc.Natl.Acad.Sci.88,7276?7280.Livak,K.J. et al.,1995. PCR
Methods Applic.4,357?362;Kievits,T.et al.,1991. J.Virol.Meth.35,273?2
86;Uyttendaele,M.et al.,1994.J.Appl.Bacteriol.77,694?701)。
が、特に、“分岐核酸類”、とりわけ以下の文献(例えば、Bresters,D.et al.,
1994.J.Med.Virol.43(3),262-286;Collins M.L. et al.,1997.Nucl.Acids Res.2
5(15),2979-2984)において説明された分岐DNA若しくは分岐RNA又は樹枝状(den
dritic)核酸類と接触されることができ、かつ生じるシグナルが検出され得ると
いう事実を特徴とするハイブリッド形成(hybridization)反応に基づくシグナ ル増幅段階へ続く段階において行われ得る核酸類の調製のために特に良好に適合
される。
酸類を用いる方法を行うための例もまた、説明されている。この説明において、
参照は、以下に記載する添付図により得られる。
適当な自動装置を示す。
ゲルを示す。
染色ゲルを示す。
手段において好ましくは行われる。適当な自動装置のための例は、図1に説明さ
れ、そこには、主部1が、コントロールエレクトロニクス並びに作業プラットフ
ォーム3及び可動アーム2を有する運転エンジンとともに備えられている。様々
な装置を保持する領域4のように、様々な構成要素が、その作業プラットフォー
ム上に配置される。真空マニホールド(manifold)5は、それらの上に置かれた
単離装置から液体を吸収し、かつ底において開放するために、又、別の方法にお
いてはその真空マニホールドと結合された装置とともに働く。例えば、生物試料
を溶解するために使用され得る振とう機6もまた、提供される。使用される単離
装置アセンブリー(assemblies)は、例えば、本発明による表面が含まれる、統
合された単離装置を有する射出成形部である。典型的に、8、12、24、48
、96又は1536までの単離装置は、これらが例えば現代のマルチウェルプレ
ート(multi-well-plates)の形態において見られるように、使用され得る。対 応する基準が利用できるならば、1つのプレートにおいてより多数の単離装置を
有する場合であっても許容され得る。しかし、ルアーアダプター(Luer-adapter
s)の助けにより、そのアセンブリーの個々の底を利用可能にすること及び必要 に応じて1つ又はそれ以上の単離装置とともにこれらを備えることもまた可能で
ある。ルアーアダプターなしで個別に使用される単離装置もまた、本発明に包含
される。
置され、そしてこれらにより、液体が導入され、かつ排出され得る。このアセン
ブリーにおいて、いくつかの単一真空管は、単離及び反応装置の同時処理を可能
にするように使用され得る。その真空分配メカニズム8は、それ故ピペットとし
て働く。真空及び圧力は、管9を介して真空分配メカニズム8へ与えられる。
分配メカニズムの助けにより導入される振とう機/保持具(holder)6内に配置 されることができる。混合の後に、その細胞溶解物は、単離装置へ輸送される。
この溶解バッファーは、単離装置内の表面を介して続けて通される。次いで、こ
の表面は、細胞溶解物残留物の除去のために、洗浄バッファーを用いて洗浄され
ることができ、そこで洗浄バッファーもまた、下側へ排出される。最終的に、溶
出バッファーは、単離装置内へ分配され、かつ繰り返された振とうの後に、分離
された核酸類は、上方から除去され、そして収集管へ輸送される。
おいて、通常用いられる。 図2〜4は、本発明において使用されるべき適当な単離装置のための異なる概
略例を示す。
ファーを吸収するために働くスポンジ様材料13を含む収集管12上に配置され
る膜が施される。スポンジ様材料13の下で、超吸収性(superabsorbent)層1
4は、真空効率を改善するために配置されることがある。代わりに、層14は、
アクリル酸塩のように、水と化学的に反応し得る材料をも含有することがある。
この水も、それ故この手順から除去される。核酸類の溶解物又は他の調製物は、
漏斗内に置かれる。スポンジ様材料13は、膜11を通して適用された液体を吸
収する。溶出バッファーの添加前に、そのスポンジは、例えば収集管12の内部
メカニズム(図示されていない)により膜からいくらか動かされる。これは、最
後の段階において溶出バッファーが、膜11を通して吸い出されることをも防ぎ
得る。このバッファーは、主に表面(図1b)上に留まり、かつ上方から核酸類と
ともに除去され得る。このアセンブリーを使用する際は、自動装置内の真空メカ
ニズム5は、もはや必要ではない。
カニズムに連結されるルアーアダプター17を介して、底に設置されたルアー接
続(Luer-connection)を介して収集管16に連結される単離装置の他の例を示 す。溶解及び洗浄バッファーは、この場合には真空の適用により膜11を通して
吸引され得る。溶出バッファーが導入される際、その真空は止められたままであ
り、そのため、この溶出液は、上方から除去され得る。ルアー接続の使用により
、個々の単離装置は、単離装置アセンブリーから除去され得る。しかし、真空収
集管が固定された単離装置と組み合わせることもできることを忘れるべきではな
い。
られる真空管のために提供する態様を最終的に示す。少量使用されるその溶出バ
ッファーは、本来、自然に膜11を貫通するのに十分なほど重くはなく、かつ上
方から再度除去され得る。
17は、疎水性表面の使用を、かつ実施例1b〜2bは、親水性表面の使用を主に包
含する。これらの手順の使用の異なる様々な手法は、専門家には、前述の説明か
ら、及び前記実施例から明らかであろう。参照は、これらの実施例及び対応する
説明が、説明の目的のために単独で示され、かつ本発明における限界と見なされ
ないという事実を明らかにする。
設けられる。これらの膜は、機械的支持体として働くポリプロピレングリッド上
に配置される。これらの膜は、リングを用いてプラスチックカラム内に固定され
る。
続される。全ての単離段階は、真空の適用を介して行われる。
アン酸グアニジニウムバッファー、例えば、キアゲン社(Qiagen Company)製の
RLTバッファーの150μlの添加により溶解される。この溶解は、約5秒間のピペッ
ティング又は攪拌(vortexing)によるおおまかな混合により促進される。その 後、150μlの70%エタノールが、約5秒間、ピペッティング又は攪拌(vortexing
)により添加されかつ混入される。
を取り去ることにより膜を通して吸引される。そのように得られた条件の下で、
RNAは膜に結合したままである。次に、洗浄はイソチオシアン酸グアニジニウム を含む第1市販洗浄バッファー、例えば、キアゲンのRW1バッファーを用いて、 かつその後、TRIS又はTRIS及びアルコールを含む第2洗浄バッファー、例えば、
キアゲンのRPEバッファーを用いて行われる。それぞれの場合における洗浄バッ ファーは、真空チャンバーの取り除きにより、膜を通して吸引される。最終洗浄
段階の後に、真空は、膜を乾燥するために約10分の間維持され、その後真空チ
ャンバーはスイッチを切られる。
たRNAを放出するために膜上に輸送される。10〜30℃の範囲の温度における1分 間のインキュベーションの後に、溶出液は上方から、膜から輸送され、そして溶
出段階は、溶出が完全であることを確実にするために繰り返された。
の分光学的測定によりその後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比
率から、RNA純度の評価を得る(図5参照:(ヒドロロン1.2を通して単離された
)全RNA)。
)が使用された実験と比較して、疎水性ナイロン膜(1番及び2番)を用いた2
つの単離の結果が、表1に示される。この表において報告された値は、印象的な
(impressive)単離収量のための説得力のある(convincing)支持及び本発明に
従って使用された材料の分離効果を提供する。それらは、シリカゲルフリースは
、恐らくそのフリース様構造と大部分の溶出バッファーのその後の吸収に恐らく
起因する、明らかにわずかな収量しかもたらさないことをも示す。
ロースゲルが構築される。結果は、図6において示される。
ナイロン膜によって単離された全RNAである。
離された全RNAである。
Aの単離。この実施例において、溶解物及び洗浄溶液は、真空の適用により疎水 性膜を通して導かれる。
、実施例1と同様の方法において、真空チャンバーと連結されたプラスチックカ
ラム内へ導入される。
lの市販の溶解バッファー(例えば、キアゲン製RLTバッファー)、350μlの1.2M
酢酸ナトリウム溶液、350μlの2M塩化ナトリウム溶液及び350μmの4M塩化リチウ
ム溶液とそれぞれピペッティングにより混合され、さらにそれぞれピペッティン
グにより混合される。
され、そして混入される。その後、RNAを含むこれらの溶液は、プラスチックカ ラム内へ輸送され、そして真空チャンバーを取り除くことにより膜を通して吸引
される。記載された条件の下で、RNAは膜へ結合して残存する。これらの膜は、 実施例1に記載されたように、その後洗浄される。
。260及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。
れらの膜は、機械的支持体として働くポリプロピレングリッド上に設けられる。
これらの膜は、リングを用いてプラスチックカラム内に固定される。この方法に
おいて調製されたカラムは、収集管内に配置される。全ての単離段階は、遠心分
離を介して行われる。
かつ上清物質が除去される。これらの細胞は、技術水準において完全に普通の方
法で、150μlの市販のイソチオシアン酸グアニジニウムバッファー、例えばキア
ゲン製RLTバッファーの添加により溶解される。溶解は、約5分間のピペッティ ング又は攪拌(vortexing)によるおおまかな混合により促進される。150μlの7
0%エタノールが、約5分間のピペッティング又は攪拌(vortexing)によりその後
添加されかつ混入される。
ニウムを含有する市販の洗浄バッファー、例えばキアゲンのRW-1バッファーを 用い、その後、例えばキアゲン製RPEバッファーのようなトリス及びアルコール を含有する第2洗浄バッファーにより洗浄が行われる。これらの洗浄バッファー
は、遠心分離により膜の中を通される。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために
2分間20000×gにおいて行われる。
たRNAを放出するために膜の上へ輸送される。10〜30℃の範囲の温度における1〜
2分間のインキュベーションの後に、その溶出物は、上方から膜から輸送され、 かつその溶出段階は、溶出が完全であることを確実にするために繰り返される。
の分光学的測定によりその後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比
率から、RNA純度の評価を得る。 異なる疎水性ナイロン膜を用いた単離の結果は、表3に示される。
膜の使用により、溶出物がそれを膜から上方から除去することにより回収される
場合、測定可能な量の全RNAは、単離され得ない。
。 全RNAを含有する100μlの水溶液は、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有 する市販の溶解バッファー、例えばキアゲン製RLTバッファー、350μlと混合さ れる。次いで、250μlのエタノールが、ピペッティングにより添加され、そして
混合される。この混合物は、その後カラムへ輸送され、遠心分離(10000×g;1
分)により、膜の中を通される。これらの膜は、続けてバッファー、例えばキア
ゲン製RPEにより2回洗浄される。このバッファーは、遠心分離により膜の中を 通過させられる。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために20000×gで行われる。
溶出され、そしてピペッティングにより上方から膜から除去される。
けて決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価 を得る。
膜の使用により、溶解物がそれを膜から上方から除去することにより回収される
場合、測定可能な量の全RNAは、単離され得ない。
水性膜と組み合わされた。 実施例3に従って、細胞溶解物が5×105のヒーラー細胞から得られ、そしてこ
れらのカラムへ輸送される。次いで、これらの膜は、市販のバッファーであるキ
アゲンのRW1及びRPEを用いて洗浄される。最後の遠心分離段階が、膜を乾燥する
ために2分間20000×gにおいて行われる。溶出は、実施例1に記載の通りに行わ れる。 それらの結果を以下の表5に記載する。 膜当たり3〜5回の並行試験が行われ、そしてそれぞれの平均値が計算される。
SH、5μm)と組み合わされる。精製は、市販のキアゲンバッファーを用いて行わ
れる。 200μlの肝臓組織からのゲノミックDNAの水溶液が、PBSバッファー内へ導入さ
れる。200μlの塩酸グアニジニウムを含有するバッファー、例えばキアゲンのAL
がこの溶液へ添加され、そして混合される。次いで210μlのエタノールが添加さ
れ、そして攪拌(vortexing)を介して混合される。この混合物は、実施例3に 従ってカラムへ輸送され、そして遠心分離の方法により膜の中を通される。この
膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲンのRWを用いてその後洗浄され
、そして乾燥される。溶出は、実施例3に記載されたように行われる。3回の並
行試験が行われ、その平均値が計算される。
いで決定され、開始量のおよそ30%である。260nmから280nmにおける吸収比率は 、1.82である。
5μm)と組み合わされる。精製は、キアゲンの市販のバッファーを用いて行われ
る。 180μlのATLバッファーが10mgの腎臓組織(マウス)へ添加され、機械的ホモ ジナイザー(homogenizer)内ですり潰される。次いでプロテイナーゼ(protein
ase)K(20μlの水において溶出されたおよそ0.4mg)が、添加され、そして55℃
において10分間インキュベートされる。200μlの塩酸グアニジニウムを含有する
バッファー、例えばキアゲン製ALを添加した後で、かつ70℃における10分間のイ
ンキュベーションの後に、200μlのエタノールが添加され、そしてこの溶液と混
合される。この混合物は、カラム上へ置かれ、そして遠心分離により膜の中を通
される。この膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン製AW1及びRWを 用いてその後洗浄され、次いで遠心分離により乾燥される。溶出は、実施例3に
記載されたように行われる。3回の並行試験が行われ、そしてその平均値が計算
される。
て決定され、平均は9.77μgである。260nmから280nmにおける吸収比率は、1.74 である。
ングにより添加され、そして混合される。この混合物は、その後カラム上に置か
れ、そして遠心分離(10000×g;1分)の方法によって膜の中を通される。これ らの膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン製RPEを用いて次いで2 回洗浄される。このバッファーは、遠心分離の方法により膜の中を通過させられ
る。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために20000×gにおいて行われる。溶出は
、実施例3に記載されたように行われる。2回の試験が行われ、平均値を決定す
る。 結果を表6に記載する。
有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、異なる量のエタノールと
イソプロパノールが添加され、そして700μlまでのRNaseを含まない水とともに 付加され、そして混合される。この混合物は、実施例3に従ってその後カラムへ
輸送され、そして膜の中を通され、そして洗浄される。溶出は、実施例3と同様
に行われた。 2回の試験が行われ、平均値が決定される。 結果を表7に記載する。
有する350μlの溶解バッファーと混合される。このバッファーは、25mMのクエン
酸ナトリウムを含有し、そしてHCl又はNaOHにより異なるpH値に調整される。次 いで250μlのエタノールが添加され、そして混合される。この混合物は、実施例
4に従ってその後カラムへ輸送され、かつ膜の中を通され、そして洗浄される。
溶出は、実施例3と同様に行われた。2回の試験が行われ、平均値が決定される
。 結果を表8に記載する。
SO4)と混合される。次いで、250μlの水又はエタノールが添加され、そして混 合される。この混合物は、実施例4に従って、その後カラムへ輸送され、かつ膜
の中を通され、洗浄され、かつ溶出される。2回の試験が行われ、平均値が決定
される。 結果を表9に記載する。
.5M)を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。この溶解バッファーは 、種々の濃度のpH7のクエン酸ナトリウム、又はpH7.2のシュウ酸ナトリウムと混
合される。次いで、250μlのエタノールが、添加されそして混合される。この混
合物は、実施例4に従ってその後カラムへ輸送され、かつ膜の中を通され、そし
て洗浄され、かつ溶出される。 それらの結果を表10に記載する。2回の試験が行われ、その平均値が決定さ
れる。
マンサイエンス社製ヒドロロン、1.2μm)が、組み立てられる。 RNA水溶液は、700μlのフェノールと混合され、遠心分離により膜全面に分配 される。実施例4のように、この膜は洗浄され、RNAが溶出される。 二重測定が行われ、そしてそれぞれの場合において平均値が示される。260及 び280nmにおける吸光度の間の比率から、RNA純度の評価を得る。
M)を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、250μlのエタノ ールが、添加され、そして混合される。この混合物は、実施例4に従い、その後
カラムへ輸送され、かつ膜の中を通される。この膜は、種々の濃度のNaClを含有
するバッファー及び80%エタノールを用いて、その後2回洗浄される。そのバッ ファーは、遠心分離により膜の中を通される。最後の洗浄段階は、膜を乾燥させ
るために20000×gにおいて行われる。溶出もまた、実施例3に従って行われる。
2回の試験が行われ、その平均値が決定される。 結果を表11に記載する。
M)を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、250μlのエタノ ールが、添加され、そして混合される。この混合物は、実施例3に従いカラムへ
輸送され、かつ膜の中を通過させられ、そして洗浄される。 溶出において、膜から精製されたRNAを溶出するために、70μlのNaCl含有溶液
、トリス/HClバッファー(pH7)又はシュウ酸ナトリウム水溶液(pH7.2)が、膜
上へ滴下される(pipetted)。1〜2分のインキュベーションの後に、10〜30℃の
間の温度において、溶出物が膜から上方から滴下される。この溶出段階は、完全
な溶出を達成するために、一度繰り返される。2回の試験が行われ、その平均値
が決定される。 結果を表12に要約する。
、1.2μmの細孔サイズを有するヒドロロン)と組み合わされる。 RNAを単離するために、1×105のヒーラー細胞が使用され、そして全RNAの精 製が、実施例3に記載されたように行われる。溶出は、実施例3に記載されたよ
うに、2×60μlの水を用いて行われる。DNAの残留量の完全な除去のために、試 料は、分析前にDnaseを用いて処理される。
(TaqMan)(TM)PCR試薬キット)の使用により行われる。β-アクチンのための
特異的プライマー及び特異的タクマンプローブ(パーキンエルマー製タクマン(
TM)β-アクチン検出キット)の使用により、全RNA試料中のβ-アクチンmRNA分 子は、β-アクチンcDNAにまず転換され、次いで全反応は、同じ反応装置におい て、妨害なしに直ちに増幅され、かつ検出される。この反応見本は、製造業者の
指示に従い作成される。3種の異なる量の単離された全RNAが使用され(1、2、4
μlの溶出液)、そして3回の決定試験が行われる。コントロールとして、RNAな
しの3つの見本もまた、試験される。
Rが行われる。それらの反応及び分析は、パーキンエルマー・アプライド・バイ オシステムズ(Perkin Elmer Applied Biosystems)により組み立てられたABI P
RISM(TM)7700配列検出器において行われる。PCRサイクル中に発生したどのアン プリコン(amplicon)もみな、タクマンプローブからの***により発生した光放
射分子を生成する。発生した全ての光シグナルは、発生したアンプリコン量に正
比例し、従って全RNA試料において利用可能な転写物の当初の量に基づく。放射 された光は、それらの装置により測定され、そしてコンピュータープログラムに
より評価される。その間に光シグナルがバックグラウンドノイズ上で最初に検出
されなければならないPCRサイクルは、“スレッシュホルドサイクル(Threshold
Cycle)(ct) ”として呼ばれる。この値は、試料において利用可能な特異的に 増幅されたRNA量のための尺度である。
、平均ct値が17.1であり、全RNAにおける2μlに対して、ct値は16.4であり、か つ4μlの全RNAに対して、そのct値は15.3である。これは、全RNAとct値との間で
一次従属する結果となり、このことは、全RNAが増幅反応を阻害し得る物質を含 まないことを示す。RNAを含まないコントロール見本は、いずれのシグナルをも もたらさない。
、1.2又は3μmの細孔サイズを有するヒドロロン;サルトリウス(Sartorius)、
0.45μmの細孔サイズを有するサルトロン(Sartolon))と組み合わされる。
RNA及びRNAを含まない試料が使用される。
に、2つの異なるプライマー対が、β-アクチンのために使用される。150Bpのサ
イズに形成された(150Bp-sized)フラグメントは、感度の証拠として役立ち、1
.7kBpのサイズに形成されたフラグメントは、RNAの完全な状態(integrity)を 評価する。RT反応から、1μlが除去され、かつ後続のPCRへ輸送される。25サイ クルは、小フラグメントに対して行われ、かつ27サイクルは大フラグメントに対
して行われる。アニーリング(annealing)温度は55℃である。増幅された試料 は、非変性(non-denaturizing)ゲル上に、次いで配置され、そして分析される
。
ラグメントがRT-PCRにおいて示され得る。ここで使用される条件は、ヒトβ-ア クチンのために調整されているので、マウス肝臓由来の全RNAを使用する際には 、転写は何ら示されない。RNAを含まないコントロール見本は、いずれのシグナ ルをももたさらない。
られる。実施例3の通りに、その膜はポリプロピレングリッド上へ置かれ、そし
てリングを用いて固定される。
めの以降の段階は、実施例3に記載されたように行われた。
後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を 得る。
算された。溶出物が、それが上方から抜き取られることにより膜から採取される
場合に、シリカ膜の使用により測定可能量の全RNAは単離され得ない。
られる。 全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有 する市販の溶解バッファー、例えばキアゲンのRLTバッファー 350μlと混合され
る。その後、250μlのエタノールが、ピペッティングにより添加され、そして混
合される。この混合物は、その後カラムへ輸送され、そして実施例4のように膜
の中を通され、洗浄され、そして乾燥される。 その後、そのRNAは実施例3において既に説明されたようにRNaseを含まない水
を用いて溶出され、そしてピペットにより膜から抜き取られる。
後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を 得る。 種々の親水性膜を用いた単離の結果を、以下の表2b(表14)に示す。膜当 たり2〜5回の並行試験が行われ、そしてそれぞれの場合における平均値が計算さ
れた。溶出物が、それが上方から抜き取られることにより膜から採取される場合
に、シリカ膜の使用により測定可能量の全RNAは単離され得ない。
Claims (58)
- 【請求項1】 以下の段階により核酸類を単離するための方法。 − 核酸類を所定の方向から表面へ投入すること; − 前記表面上での核酸類の固定化; − 前記表面からの固定化された核酸類の放出;及び − 主に投入方向における前記表面から放出された核酸類の除去。
- 【請求項2】 前記チャージは上方(top)から行われるという事実を特徴とす る請求項1に記載の方法。
- 【請求項3】 固定化と放出段階との間で、少なくとも1種の洗浄バッファーを
用いて固定化された核酸類の洗浄を行うという事実を特徴とする請求項1又は2
に記載の方法。 - 【請求項4】 前記洗浄が、各洗浄バッファーのために以下の段階を含むという
事実を特徴とする請求項3に記載の方法。 − 予め決められた量の洗浄バッファーの表面への輸送;及び − 吸引による表面を通した前記洗浄バッファーの抜き取り。 - 【請求項5】 前記核酸類の投入及び固定化は以下の段階を含むという事実を特
徴とする前述の請求項の1項に記載の方法。 − 固定化バッファーとの前記核酸類の混合; − 表面上での固定化バッファーを用いた核酸類の投入; − 主に投入方向における表面を通した液体成分の抜き取り。 - 【請求項6】 前記段階の少なくとも1つは、自動機械によって完全に自動で行
われ得るという事実を特徴とする前述の請求項の1項に記載の方法。 - 【請求項7】 前記方法における全ての段階が制御配列(controlled sequence )における自動機械によって行われ得るという事実を特徴とする請求項6に記載
の方法。 - 【請求項8】 核酸類の単離の大部分が同時に行われ得るという事実を特徴とす
る前述の請求項の1項に記載の方法。 - 【請求項9】 放出と除去段階との間で、以下の段階の少なくとも1つが行われ
得るという事実を特徴とする前述の請求項の1項に記載の方法。 − 核酸類における少なくとも1つの化学反応の実施; − 表面上での核酸類の固定化;及び − 表面からの固定化された核酸類の放出。 - 【請求項10】 核酸類の固定化のために、鉱酸とアルカリ及びアルカリ土類金
属類との塩類の水溶液が使用されるという事実を特徴とする前述の請求項の1項
に記載の方法。 - 【請求項11】 核酸類の固定化のために、アルカリ又はアルカリ土類ハロゲン
化物類若しくは硫酸塩類が使用されるという事実を特徴とする請求項10に記載
の方法。 - 【請求項12】 核酸類の固定化のために、硫酸ナトリウム又はカリウム又はマ
グネシウムのハロゲン化物が使用されるという事実を特徴とする請求項11に記
載の方法。 - 【請求項13】 核酸類の固定化のために、アルカリ又はアルカリ土類金属と
、一塩基若しくは多塩基又は多官能性(polyfunctional)有機酸類とからの塩類
の水溶液が使用されるという事実を特徴とする請求項1〜9の1項に記載の方法
。 - 【請求項14】 核酸類の固定化のために、有機ジカルボン酸類のナトリウム、
カリウム、又はマグネシウム塩類の水溶液が使用されるという事実を特徴とする
請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 前記有機ジカルボン酸が、シュウ酸、マロン酸、又は琥珀酸で
あるという事実を特徴とする請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 核酸類の固定化のために、ナトリウム又はカリウム塩類の水溶
液が、ヒドロキシカルボン酸又はポリヒドロキシカルボン酸とともに使用され得
るという事実を特徴とする請求項13に記載の方法。 - 【請求項17】 前記ポリヒドロキシカルボン酸がクエン酸であるという事実を
特徴とする請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 核酸類の固定化のために、脂肪族又は非環式飽和又は不飽和炭
化水素のヒドロキシル誘導体が使用されるという事実を特徴とする請求項1〜9
に記載の方法。 - 【請求項19】 前記ヒドロキシル誘導体として、C1-C5アルカノール類が使用 されるという事実を特徴とする請求項18に記載の方法。
- 【請求項20】 前記C1-C5アルカノールとして、メタノール、エタノール、n- プロパノール、tert.-ブタノール又はペンタノールが使用されるという事実を特
徴とする請求項19に記載の方法。 - 【請求項21】 前記ヒドロキシル誘導体として、アルダイト(aldite)が使用
されるという事実を特徴とする請求項18に記載の方法。 - 【請求項22】 核酸類の固定化のために、フェノール又はポリフェノールが使
用されるという事実を特徴とする請求項1〜9に記載の方法。 - 【請求項23】 固定化された核酸類の洗浄のために、請求項4〜22の1項に
よる塩溶液又はバッファー溶液が使用されるという事実を特徴とする請求項3〜
22に記載の方法。 - 【請求項24】 核酸類の放出[のために]、水性塩又はバッファー溶液が使用さ
れるという事実を特徴とする前述の請求項の1項に記載の方法。 - 【請求項25】 核酸類の放出のために、水が使用されるという事実を特徴とす
る請求項1〜23の1項に記載の方法。 - 【請求項26】 核酸類の固定化のために、カオトロピック剤が使用されるとい
う事実を特徴とする前述の請求項の1項に記載の方法。 - 【請求項27】 前記カオトロピック剤が、トリクロロ酢酸塩類、チオシアン酸
塩類、過塩素酸塩類、ヨウ化物類、又は塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸
グアニジニウム又は尿素の群の塩であるという事実を特徴とする請求項26に記
載の方法。 - 【請求項28】 カオトロピック剤の0.01〜10Mの水溶液が、核酸類の固定化の ために、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴と
する請求項26又は27に記載の方法。 - 【請求項29】 カオトロピック剤の0.1〜7Mの水溶液が、核酸類の固定化のた めに、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴とす
る請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 カオトロピック剤の0.2〜5Mの水溶液が、核酸類の固定化のた めに、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴とす
る請求項29に記載の方法。 - 【請求項31】 過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸
グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又はヨウ化カリウムの水溶液が、核酸類の
固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項26〜30の1項に記
載の方法。 - 【請求項32】 前記表面が膜であるという事実を特徴とする前述の請求項の1
項に記載の方法。 - 【請求項33】 前記膜が、疎水性膜であるという事実を特徴とする請求項32
に記載の方法。 - 【請求項34】 前記疎水性膜が、極性基を有するポリマーから成るという事実
を特徴とする請求項33に記載の方法。 - 【請求項35】 前記膜が、疎水化された(hydrophobisized)表面を有する疎 水性膜であるという事実を特徴とする請求項32又は33に記載の方法。
- 【請求項36】 前記膜が、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、
ポリカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタ
ン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフル
オロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオルリド、ポ
リエチレン-テトラフルオロエチレン共重合化物(copolymerizate)、ポリエチ レン-クロロトリフルオロエチレン共重合化物、又はポリフェニレンスルフィド から成るという事実を特徴とする請求項33〜35に記載の方法。 - 【請求項37】 前記表面又は前記膜が、疎水化されたナイロンから成るという
事実を特徴とする請求項35又は36に記載の方法。 - 【請求項38】 前記膜が、ある場合には、アルミニウム又はジルコニウム塩類
、四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコーン類、
有機亜鉛化合物類、又はグルタル酸(glutaric)ジアルデヒドの混合物とともに
、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類の群からの疎水性コート剤を用いてコ
ートされるという事実を特徴とする請求項35〜37に記載の方法。 - 【請求項39】 前記膜が、親水性又は親水化された(hydrophilized)膜であ るという事実を特徴とする請求項35〜37に記載の方法。
- 【請求項40】 前記膜が、親水化されたナイロン、ポリエーテルスルホン、ポ
リカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタン
、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオ
ロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、ポリエ
チレン-テトラフルオロエチレン共重合化物、ポリエチレン-クロロトリフルオロ
エチレン共重合化物、又はポリフェニレンスルフィドから成るという事実を特徴
とする請求項39に記載の方法。 - 【請求項41】 前記膜における細孔が、0.001〜50μm、好ましくは0.01〜20μ
m、最も好ましくは0.05〜10μmの直径を有するという事実を特徴とする請求項3
2〜40に記載の方法。 - 【請求項42】 前記表面が、疎水性フリース(fleece)であるという事実を特
徴とする請求項1〜25に記載の方法。 - 【請求項43】 前記フリースが、シリカゲルフリースであるという事実を特徴
とする請求項42に記載の方法。 - 【請求項44】 核酸類の固定化のために、カオトロピック剤が使用されるとい
う事実を特徴とする請求項43に記載の方法。 - 【請求項45】 前記カオトロピック剤が、トリクロロ酢酸塩類、チオシアン酸
塩類、過塩素酸類、ヨウ化物類、又は塩酸グアニジニウ、イソチオシアン酸グア
ニジニウム、もしくは尿素の群からの塩であるという事実を特徴とする請求項4
4に記載の方法。 - 【請求項46】 0.01〜10Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の 塩類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とす
る請求項44又は45に記載の方法。 - 【請求項47】 0.1〜7Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の塩 類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする
請求項46に記載の方法。 - 【請求項48】 0.2〜5Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の塩 類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする
請求項47に記載の方法。 - 【請求項49】 過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸
グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又はヨウ化カリウムの水溶液が、核酸類の
固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項44〜48に記載の方
法。 - 【請求項50】 固定化が、pH3〜11において行われるという事実を特徴とする 前述の請求項の1項に記載の方法。
- 【請求項51】 前記膜の片側における核酸類の固定化、及び同じ側におけるそ
れらの単離のための核酸類の放出のための少なくとも1つの膜の使用。 - 【請求項52】 前記膜が、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、
ポリカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタ
ン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフル
オロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、ポリ
エチレン-テトラフルオロエチレン共重合化物、ポリエチレン-クロロジフルオロ
エチレン共重合化物、又はポリエチレンスルフィドからなるという事実を特徴と
する請求項51に記載の方法。 - 【請求項53】 前記膜が、疎水化されたナイロン膜であるという事実を特徴と
する請求項52に記載の方法。 - 【請求項54】 前記表面又は膜が、ある場合には、アルミニウム又はジルコニ
ウム塩類、四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコ
ーン類、有機亜鉛化合物類、又はグルタル酸(glutaric)ジアルデヒドの混合物
とともに、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類の群からの疎水性コート剤を
用いてコートされる親水性表面又は膜であるという事実を特徴とする請求項51
〜53の1項に記載の使用。 - 【請求項55】 前記膜の大部分が、マルチウェルプレート上の単離装置に設置
されるという事実を特徴とする請求項51〜54の1項に記載の使用。 - 【請求項56】 請求項1〜49の1項において作動するという事実を特徴とす
る自動装置。 - 【請求項57】 バッファー及び溶液の表面への及び表面から離す適用を実行す
る又は実行し得る少なくとも1つの真空装置とともに備えられるという事実を特
徴とする請求項55に記載の自動装置。 - 【請求項58】 前記核酸類の固定化が、pH3〜11において行われるという事実 を特徴とする請求項1〜50の1項に記載の方法。
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