JP2008064661A

JP2008064661A - 酸素測定装置および酸素測定方法

Info

Publication number: JP2008064661A
Application number: JP2006244070A
Authority: JP
Inventors: Hiroki Kumazawa; 弘樹熊沢
Original assignee: Aloka Co Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2008-03-21

Abstract

【課題】溶液の溶存酸素に関する測定量の新しい測定技術を提供する。
【解決手段】試料ガイド１１０には、擂鉢状の導入領域とその底に繋がる円筒状の微小領域とが形成される。試料ガイド１１０に投入された生物試料１４０は、擂鉢状の導入領域の底に向かって沈むことにより、作用極１２２の上方に形成された微小領域内に導入される。そして、作用極１２２と対極１２４を介して流れる微小電流に基づいて、試料ガイド１１０の微小領域内に導入された生物試料１４０の近傍の溶存酸素濃度が測定される。
【選択図】図１

Description

本発明は、溶存酸素に関する測定量を測定するための技術に関する。

近年、細胞などの生物試料の活性を示す指標の一つと考えられている呼吸活性を溶液中の溶存酸素濃度などから測定する研究が盛んに行われている。例えば、溶液中において生物試料が消費する酸素量などを溶液中の溶存酸素濃度などから測定する研究である。

溶液中の溶存酸素濃度を測定する方法としては、電気化学的分析が最も一般的である。例えば、溶液内に挿入された二つの電極を介して流れる電流に基づいて、溶液内の酸素濃度を測定する技術である。

ところが、受精卵や胚などのような酸素消費が極めて少ない生物試料の場合には、溶存酸素濃度の変化も極めて小さいものとなり、溶存酸素濃度から酸素消費量を測定することは容易ではない。

こうした背景において、生物試料の近傍に生じる酸素濃度の勾配を測定する方法が提案されている（特許文献１参照）。例えば、生物試料の近傍の２箇所以上の場所で酸素濃度を測定することにより生物試料の呼吸活性を求める方法である。

しかし、この方法の場合、電極は空間の濃度勾配に影響を与えないように、酸素の自己消費量が生物試料に比べて少なく、また、移動により空間の酸素濃度分布を乱さないように先端部が極めて小さいことなどが要求される。さらに、電極と生物試料の位置や間隔を正確に制御するための駆動機構や顕微鏡のような観察装置が必要になるなど、その方法を実現するめの装置の複雑化や高額化が懸念される。

特開２００４−１０８８６３号公報

本発明は、このような背景において成されたものであり、その目的は、溶液の溶存酸素に関する測定量の新しい測定技術を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明の好適な態様である酸素測定装置は、溶液を収容する容器と、容器内に設けられる一対の電極と、容器内に配置された一対の電極のうちの一方の電極の付近に生物試料を導く試料ガイドと、を有し、前記試料ガイドには、一方の電極を取り囲む微小領域とその微小領域内へ生物試料を導く導入領域とが形成され、一対の電極を介して流れる微小電流に基づいて、試料ガイドの微小領域内に導入された生物試料の近傍の溶存酸素に関する測定量が測定される、ことを特徴とする。

望ましい態様において、前記一対の電極のうちの一方の電極は、容器の底面に設けられ、前記試料ガイドは、容器の底面に設けられた一方の電極の上方に配置されてその電極の上方に微小領域を形成することを特徴とする。

望ましい態様において、前記試料ガイドには、擂鉢状の導入領域とその底に繋がる円筒状の微小領域とが形成され、試料ガイドに投入された生物試料が擂鉢状の導入領域の底に向かって沈むことにより、一方の電極の上方に形成された微小領域内に生物試料が導入されることを特徴とする。

望ましい態様において、前記試料ガイドに蓋部材が投入されて擂鉢状の導入領域の底に向かって沈むことにより、沈んだ蓋部材が生物試料を収容した円筒状の微小領域の蓋として機能することを特徴とする。望ましい態様において、前記試料ガイドにピペットが挿入され、挿入されたピペットの先端が生物試料を収容した円筒状の微小領域の蓋として機能することを特徴とする。

また上記目的を達成するために、本発明の好適な態様である酸素測定方法は、溶液に浸された試料ガイドが形成する微小領域内に生物試料を導入する工程と、試料ガイドが形成する微小領域内で溶液に接する電極と試料ガイドの外部で溶液に接する電極の二つの電極を介して流れる微小電流に基づいて、生物試料の近傍の溶存酸素に関する測定量を測定する工程と、を含むことを特徴とする。望ましい態様において、生物試料を収容した微小領域の開口に蓋を設ける工程をさらに含むことを特徴とする。

本発明の好適な態様により、溶液の溶存酸素に関する測定量の新しい測定技術が提供される。これにより、例えば、受精卵や胚などのように酸素消費量が極めて少ない生物試料の呼吸活性の評価を比較的簡易な装置構成で実現することが可能になる。

図１は、本発明の好適な実施形態を説明するための図であり、図１には、本発明に係る酸素測定装置１００が示されている。

酸素測定装置１００は、基板１０２と側壁１０４で構成された容器を有している。容器は、例えば、方形の基板１０２の外縁に沿って側壁１０４を設けることにより方形の枡状に形成される。もちろん容器の形状は円筒状などの他の形状でもよい。

容器内には、基板１０２上に、作用極（カソード）１２２と対極（アノード）１２４が設けられている。そして、これら一対の電極の間には、電源１２６と微小電流計１２８が接続されており、さらに、微小電流計１２８に記録・表示デバイス１３０が接続されている。

容器内には、試料ガイド１１０が配置されている。試料ガイド１１０は、基板１０２に設けられた作用極１２２の上方に配置されており、生物試料１４０を作用極１２２の付近に導く機能を担っている。なお、試料ガイド１１０の形状や機能は後に詳述する。

試料ガイド１１０が配置された容器内には培地１０６が収容されている。培地１０６は、生物試料１４０の生存に適した成分を含む液体である。生物試料１４０は、例えば、受精卵や胚などの生物細胞試料である。

図１の酸素測定装置１００は、作用極１２２で酸素による還元反応を生じさせることにより、培地１０６内の酸素の濃度（溶存酸素濃度）を測定する。もちろん、溶存酸素濃度以外の酸素に関する測定量が測定されてもよい。培地１０６内の溶存酸素濃度は、生物試料１４０の呼吸に応じて、つまり生物試料１４０による酸素消費量に応じて変化する。そのため、溶存酸素濃度から、例えば生物試料１４０の呼吸活性を評価することができる。

例えば受精卵や胚などの生物試料１４０は、酸素消費が極めて少ない。そのため、作用極１２２は、測定対象となる生物試料１４０の酸素消費速度に対し、十分小さな自己酸素消費速度であるように、有効面積などが設計される。

図２は、基板１０２上に設けられた作用極１２２と対極１２４を示す図である。作用極１２２と対極１２４は、例えば、微細加工技術により基板１０２上に設けられる。

作用極１２２は、例えばＰｔで形成される。また、作用極１２２は、例えば、直径が２〜１０μｍの円形に形成される。もちろん、円形以外の他の形状であってもよい。このように、作用極１２２は、微細加工技術により極めて小さな有効面積となるように基板１０２上に設けられる。

一方、対極１２４は、例えばＡｇ／ＡｇＣｌで形成される。また、対極１２４は、例えば、直径が２〜３ｍｍの円形に形成される。もちろん、円形以外の他に形状であってもよい。

図１に戻り、例えば受精卵や胚などの生物試料１４０の酸素消費が極めて少ないことは先に説明したとおりである。そのため、培地１０６内の溶存酸素濃度から生物試料１４０の酸素消費を評価するためには、作用極１２２の近傍で酸素が消費されることが望ましい。つまり、作用極１２２の付近に生物試料１４０が存在することが望ましい。そのため、本実施形態では、試料ガイド１１０が、生物試料１４０を作用極１２２の付近に誘導している。

図３は、試料ガイド１１０の斜視図である。試料ガイド１１０は、例えばプラスチックやセラミックなどによって円筒状に形成される。そして、試料ガイド１１０の上面には、導入領域１１２に繋がる開口があり、また、試料ガイド１１０の底面には、微小領域１１４に繋がる開口がある。

導入領域１１２は、試料ガイド１１０内に設けられた擂鉢状の空間である。また、微小領域１１４は、試料ガイド１１０内に設けられた円筒状の空間である。微小領域１１４は、擂鉢状の導入領域１１２の底に繋がるように形成されている。

図１に示したように、試料ガイド１１０は、容器内において作用極１２２の上方に配置される。つまり、微小領域１１４が作用極１２２の上方に位置するように試料ガイド１１０が配置される。

容器内に配置された試料ガイド１１０の導入領域１１２と微小領域１１４内は、培地１０６によって満たされる。そして、試料ガイド１１０の上面の開口から生物試料１４０が投入されることにより、培地１０６よりも比重が高い生物試料１４０が導入領域１１２の底に向かって沈んで行き、微小領域１１４内に生物試料１４０が導入される。そのため、円筒状の微小領域１１４の直径は、生物試料１４０よりも少し大きく形成される。例えば、ヒトの受精卵であればその直径が０．１〜０．１５ｍｍ程度であるため、微小領域１１４の直径は、０．２ｍｍ程度に形成される。

次に、図１の酸素測定装置１００を利用した測定方法について説明する。なお、測定の際には、培地１０６と作用極１２２と対極１２４は、生物試料１４０の活性と電極反応の安定とを考慮して、一定温度、例えば３７度程度に維持されることが望ましい。

まず、作用極１２２と対極１２４に電位差を与えて安定した電流推移を示すようになるまで待つ。作用極１２２と対極１２４の二つの電極間には、酸素による還元反応を生じさせるために必要な電位差が与えられる。作用極１２２がＰｔで形成され、対極１２４がＡｇ／ＡｇＣｌで形成されていれば、二つの電極間には、０．６〜０．６５Ｖ程度の電位差が与えられる。

電流推移が安定すると、生物試料１４０を少量の培地１０６と共に試料ガイド１１０の導入領域１１２（図３参照）に放出する。培地１０６よりも比重が高い生物試料１４０は導入領域１１２の底に向かって沈んで行き、微小領域１１４（図３参照）内に生物試料１４０が導入される。

なお、微小領域１１４内に生物試料１４０が導入された後に、微小領域１１４に蓋を設けるようにしてもよい。これについては後に図４を利用して説明する。

微小領域１１４内に導入された生物試料１４０は、呼吸により、微小領域１１４内とその近傍の培地１０６内の酸素を消費する。これにより、生物試料１４０の近傍の酸素濃度が低下する。特に、微小領域１１４内の培地１０６は、微小領域１１４外の培地１０６との間の拡散や対流による酸素供給が追いつかず、酸素濃度の低下が比較的大きくなる。

そして、培地１０６内の酸素濃度の低下に応じて、作用極１２２と対極１２４を介して流れる電極応答電流が低下する。つまり、微小電流計１２８で計測される電流値が低下する。微小電流計１２８で計測される電流値の時間的変化は、記録・表示デバイス１３０にデータとして記憶され、また、グラフなどによって表示される。

このように、本実施形態では、酸素濃度の変化を反映させた電流値が計測されるため、電流値の時間的変化を示すデータやグラフから、培地１０６内の酸素濃度の変化を測定することができる。また、その測定結果から、生物試料１４０の呼吸活性を評価することができる。
ちなみに、例えば、直径０．２ｍｍで高さが０．２ｍｍの円柱型の微小領域１１４について検討すると、その微小領域１１４の容積は、およそ６．３ｎｌとなる。また、摂氏３７度の水に含まれる飽和酸素量は２０５μＭ（２．０５×１０^−１３ｍｏｌ／ｎｌ）であり、６．３ｎｌの水中の酸素量は１．３×１０^−１２ｍｏｌとなる。また、例えば、ウシ胚の酸素消費率は、８４×１０^−１４ｍｏｌ／ｍｉｎ程度であることが知られている（例えば、文献「ref. Oxygen Consumption of Single Bovine Embryos Probed with Scanning Electrochemical Microscopy. H.Shiku, T.Shiraishi, H.Ohya, T.Matsue, H.Abe, H.Hoshi, M.Kobayashi, Anal.Chem.2001,73,3751-3759.」参照）。従って、計算上、ウシ胚の場合には６．３ｎｌの微小領域１１４内の水中の酸素を１．５分で消費し尽くすことになる。従って、本実施形態によれば、例えば、数分程度の短時間で生物試料１４０の呼吸活性を評価することが可能になる。もちろん、酸素のリークなどを考慮して、数時間程度の測定時間で評価を行ってもよい。

なお、本実施形態では、微小領域１１４内の培地１０６が、微小領域１１４外の培地１０６との間の拡散や対流による酸素供給が追いつかず、酸素濃度の低下が比較的大きくなることを利用している。そこで、拡散や対流による酸素供給をさらに小さくするために、微小領域１１４に蓋を設けるようにしてもよい。

図４は、試料ガイド１１０の微小領域１１４に蓋を設ける機能を説明するための図である。図４（Ａ）は、ビーズ１５０が蓋として機能している様子を示している。つまり、微小領域１１４の直径よりも大きな直径の球状のビーズ１５０が試料ガイド１１０内に投入され、擂鉢状の導入領域１１２の底に向かって沈むことにより、沈んだビーズ１５０が生物試料１４０を収容した円筒状の微小領域１１４の蓋として機能している。なお、ビーズ１５０の表面には穴が設けられていないことが望ましい。また、ビーズ１５０の形状も球状に限定されない。さらに、ビーズ１５０は、例えば、閉鎖する空間の体積を測定の度に大きく変更しない範囲で、柔らかさを備えて変形してもよい。もちろん、ビーズ１５０は、硬い球状のものでもよい。

また、図４（Ｂ）は、試料ガイド１１０に挿入されたピペット１６０が蓋として機能している様子を示している。ピペット１６０は、ガラス管１６４とその内部に挿入されたプランジャ１６２を備えており、プランジャ１６２の先端が生物試料１４０を収容した円筒状の微小領域１１４の蓋として機能している。なお、ピペット１６０は、生物試料１４０を試料ガイド１１０に投入する際に利用されてもよい。また、ピペット１６０は、ピペットガイド１７０によって三次元的に移動される。

本実施形態では、二つの電極を介して流れる電極応答電流が局所的な溶存酸素濃度に大きく依存している。つまり、試料ガイド１１０に設けられた微小領域１１４内やその近傍の局所的な溶存酸素濃度に大きく依存している。そのため、例えば、容器を大きくすることができ、また、容器内の培地１０６の液量を多くすることもできる。さらに、必要に応じて、生物試料１４０から対極１２４を離して設けることも可能になる。培地１０６をフローさせて、対極１２４を下流側に配置するようにしてもよい。

なお、図１に示す酸素測定装置１００は、作用極１２２と対極１２４の一対の電極を利用しているが、電極は一対のみに限定されない。例えば、作用極１２２を複数設け、各作用極１２２に試料ガイド１１０を配置し、複数の作用極１２２により複数の生物試料１４０に関する測定を同時進行させてもよい。

また、作用極１２２と対極１２４に加えて参照電極を設け、測定の精度をさらに高めるようにしてもよい。

以上、本発明の好適な実施形態を説明したが、上述した実施形態は、例えば次のような効果を奏する。

溶液中の溶存酸素濃度を測定することにより、細胞の活性を示す指標の一つであると考えられる呼吸活性を評価することが可能になる。また、受精卵や胚のように酸素消費量が極めて少ない生物細胞試料の呼吸活性の測定を比較的単純な装置構成で実現することができる。そのため、装置の信頼性向上と低コスト化が期待できる。

以上、本発明の好適な実施形態を説明したが、上述した実施形態は、あらゆる点で単なる例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明は、その本質を逸脱しない範囲で各種の変形形態を包含する。

本発明に係る酸素測定装置を示す図である。基板上に設けられた作用極と対極を示す図である。試料ガイドの斜視図である。試料ガイドの微小領域に蓋を設ける機能を説明するための図である。

符号の説明

１００酸素測定装置、１１０試料ガイド、１２２作用極、１２４対極、１４０生物試料、１２８微小電流計、１３０記録・表示デバイス。

Claims

溶液を収容する容器と、
容器内に設けられる一対の電極と、
容器内に配置された一対の電極のうちの一方の電極の付近に生物試料を導く試料ガイドと、
を有し、
前記試料ガイドには、一方の電極を取り囲む微小領域とその微小領域内へ生物試料を導く導入領域とが形成され、
一対の電極を介して流れる微小電流に基づいて、試料ガイドの微小領域内に導入された生物試料の近傍の溶存酸素に関する測定量が測定される、
ことを特徴とする酸素測定装置。
請求項１に記載の酸素測定装置において、
前記一対の電極のうちの一方の電極は、容器の底面に設けられ、
前記試料ガイドは、容器の底面に設けられた一方の電極の上方に配置されてその電極の上方に微小領域を形成する、
ことを特徴とする酸素測定装置。
請求項２に記載の酸素測定装置において、
前記試料ガイドには、擂鉢状の導入領域とその底に繋がる円筒状の微小領域とが形成され、
試料ガイドに投入された生物試料が擂鉢状の導入領域の底に向かって沈むことにより、一方の電極の上方に形成された微小領域内に生物試料が導入される、
ことを特徴とする酸素測定装置。
請求項３に記載の酸素測定装置において、
前記試料ガイドに蓋部材が投入されて擂鉢状の導入領域の底に向かって沈むことにより、沈んだ蓋部材が生物試料を収容した円筒状の微小領域の蓋として機能する、
ことを特徴とする酸素測定装置。
請求項３に記載の酸素測定装置において、
前記試料ガイドにピペットが挿入され、挿入されたピペットの先端が生物試料を収容した円筒状の微小領域の蓋として機能する、
ことを特徴とする酸素測定装置。
溶液に浸された試料ガイドが形成する微小領域内に生物試料を導入する工程と、
試料ガイドが形成する微小領域内で溶液に接する電極と試料ガイドの外部で溶液に接する電極の二つの電極を介して流れる微小電流に基づいて、生物試料の近傍の溶存酸素に関する測定量を測定する工程と、
を含む、
ことを特徴とする酸素測定方法。
請求項６に記載の酸素測定方法において、
生物試料を収容した微小領域の開口に蓋を設ける工程をさらに含む、
ことを特徴とする酸素測定方法。