JP2008048725A - 核酸配列の増幅方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
エンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基を含有するオリゴヌクレオチドプライマー、エンドヌクレアーゼV、および鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを用いることによって、試料中の標的とする核酸を選択的に増幅する、核酸配列の増幅方法[EVA(Endonuclease V−dependent Amplification)法]および該方法による核酸の検出方法。
【選択図】なし
Description
核酸増幅の最も代表的な技術として、Polymerase Chain Reaction(PCR)法がよく知られている(例えば特許文献1〜3、非特許文献1)。この方法は、標的とする2本鎖DNA領域の両端で、それぞれ別のDNA鎖にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用い、DNAポリメラーゼ活性の作用によって標的配列をin vitroで合成するものである。また、RNA中の標的配列を増幅するため、PCRに逆転写酵素活性を組合せた逆転写PCR(RT−PCR)法も知られている(例えば非特許文献2)。これはRNAから逆転写反応によって生成されたcDNAに対してPCRを行う方法である。
このような問題を解決するため、等温状態で実施可能な標的核酸の増幅法がいくつか開発されてきた。その1つとしてStrand Displacement Amplification (SDA)法が知られる(例えば特許文献7および8、非特許文献5および6)。この方法では、反応に必要な酵素として、5´→3´ エキソヌクレアーゼ活性を欠損したDNAポリメラーゼ(または鎖置換型DNAポリメラーゼ)を用い、さらに制限酵素も使用する。SDAの反応中、制限酵素は2本鎖を形成したDNAの一方の鎖を切断して(ニッキング )、伸長反応の起点となる3´末端を提供し、鎖置換型DNAポリメラーゼは該3´末端を伸長して、その下流のDNA鎖を置換する。
別の等温標的核酸増幅法として、バクテリオファージなどでみられるローリングサークル型のDNA複製に類似した反応を利用するRolling Circle Amplification(RCA)法が公知である(例えば非特許文献7)。この方法では、鎖置換型DNAポリメラーゼが、環状の鋳型核酸上でプライマーを伸長し、鋳型の相補鎖が連続的に結合したコピーを生成させる。また、該生成物に対してさらにプライマーをアニールさせてその相補鎖を伸長させることによって、高度な増幅を可能としている。しかしながら、RCA法では連続的な相補鎖合成反応のために、環状の鋳型核酸が提供される必要があり、そのためには、例えばリガーゼを用いたライゲーションなどの付加的な工程が必要となる。またRCA法の増幅産物は、同じ配列からなる領域が繰り返し連続した異なる長さの核酸断片の混合物となる。よってRCA法によって得られた増幅産物を次工程に利用するためには、例えば制限酵素によって増幅産物を切断するなどの付加的な工程が必要となる場合がある。このような付加的な工程の必要性は、RCA法の汎用性や利便性を制限している。
別の等温標的核酸増幅法として、Loop−mediated Isothermal Amplification(LAMP)法が知られる(例えば特許文献13、非特許文献8および9)。この方法では、標的核酸の末端領域に、配列が自己相補的となるような領域を導入してループ構造を形成させる。伸長反応の起点となる3´末端は、このループ構造形成の際の自己相補的なハイブリダイゼーションよって、またループ構造形成によって生じた1本鎖ループ領域へのプライマーのアニーリングによって提供され、鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって該3´末端が伸長され、その下流のDNA鎖が置換される。
別の等温標的核酸増幅法として、Isothermal and Chimeric Primer−initiated Amplification of Nucleic Acids (ICAN)法が知られる(例えば特許文献14、非特許文献10)。この方法では、DNAで構成される領域とRNAで構成される領域の両方を含有するキメラプライマーを使用し、リボヌクレアーゼHと鎖置換型DNAポリメラーゼの作用によって反応が進行する。該反応において、リボヌクレアーゼHはキメラプライマーのアニーリングに由来して形成された2本鎖核酸のDNA/RNAハイブリッド部分のRNA鎖を切断してニックを生じさせ、伸長反応の起点となる3´末端を提供する。一方、鎖置換型DNAポリメラーゼは提供された3´末端を伸長し、その下流のDNA鎖を置換する。ICAN法も、高価な温度サイクリング装置の必要性を排除しているという点で、優れた核酸増幅法である。また、キメラプライマーを用いる別の核酸増幅法として、例えば特許文献15および16などの方法も開示されている。
別の等温標的核酸増幅法として、Helicase−dependent Amplification(HDA)法が知られる(例えば特許文献17、非特許文献11および12)。この方法は、DNAポリメラーゼとDNAヘリカーゼおよびその他のアクセサリータンパク質によって進行される生体内のDNA複製のメカニズムを、試験管内で模倣したものである。HDA法では、プライマーの鋳型DNAへのアニーリングとそれに続くDNAポリメラーゼによる伸長を可能とするために、DNAヘリカーゼ(例えばUvrD)が2本鎖DNAを分離して1本鎖の鋳型を生成させる。
1.以下の工程(I)および(II)を含む、核酸配列の増幅方法。
(I)少なくとも以下を含有する反応混合物を調製する工程
(i)鋳型核酸
(ii)デオキシリボヌクレオチド3リン酸
(iii)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ
(iv)エンドヌクレアーゼV
(v)少なくとも1種類のプライマー(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。)
(II)工程(I)で調製された反応混合物を、以下の反応が行える温度条件で増幅産物を生成するのに充分な時間インキュベートする工程
(i)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
(ii)DNAポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
(iii)エンドヌクレアーゼVによる塩基Xを含む核酸鎖中の塩基Xの認識および該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合の切断反応
2.反応混合物中に少なくとも2種類のプライマーが含まれる、前項1に記載の核酸配列の増幅方法。
3.以下の工程(a)〜(f)を含む、前項1または2に記載の核酸配列の増幅方法[ここで工程(c)〜(f)は連続的に反復される。]。
(a)少なくとも1種類のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(b)DNAポリメラーゼによって、工程(a)で鋳型核酸にアニーリングさせたプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(c)エンドヌクレアーゼVによって、工程(b)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(d)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(c)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(e)エンドヌクレアーゼVによって、工程(d)で生成された2本鎖核酸のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(f)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(e)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
4.以下の工程(a)〜(l)を含む、前項1〜3のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法[ここで工程(c)〜(f)、および工程(i)〜(l)は連続的に反復される。]。
(a)少なくとも1種類の第1のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(b)DNAポリメラーゼによって、工程(a)で鋳型核酸にアニーリングさせた第1のプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(c)エンドヌクレアーゼVによって、工程(b)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(d)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(c)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(e)エンドヌクレアーゼVによって、工程(d)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(f)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(e)で新たに提供された第1のプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(g)工程(d)または(f)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、少なくとも1種類の第2のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、該鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(h)DNAポリメラーゼによって、工程(g)で鋳型核酸にアニーリングさせた第2のプライマー鎖から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(i)エンドヌクレアーゼVによって、工程(f)で生成された2本鎖核酸における第2のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(j)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(i)で第2のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(k)エンドヌクレアーゼVによって、工程(j)で生成された2本鎖核酸における第2のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(l)工程(k)でプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
5.さらに以下の工程(m)〜(y)を含む、前項4に記載の核酸配列の増幅方法[ここで工程(m)〜(y)は連続的に反復される。]。
(m)工程(j)または(l)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程(a)に記載の第1のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
(n)DNAポリメラーゼによって、工程(m)で鋳型核酸にアニーリングした第1のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(o)エンドヌクレアーゼVによって、工程(n)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(p)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(o)で第1のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(q)エンドヌクレアーゼVによって、工程(p)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(r)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(q)で第1のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(s)工程(p)または(r)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程(g)に記載の第2のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
(t)DNAポリメラーゼによって、工程(s)で鋳型核酸にアニーリングした第2のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(u)エンドヌクレアーゼVによって、工程(t)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(v)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(u)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(w)エンドヌクレアーゼVによって、工程(v)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合を切断することによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(x)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(w)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(y)工程(v)または(x)で鎖置換によって遊離した核酸が、鋳型核酸として工程(m)に利用される工程
6.以下の(i)〜(iii)のいずれか2または3が同一の鋳型核酸分子上で行われる、前項1〜5のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
(i)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
(ii)DNAポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
(iii)エンドヌクレアーゼVによる塩基Xを含む核酸鎖中の塩基Xの認識および該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合の切断反応
7.鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによる、第1のプライマー鎖の3´末端からの鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成、および第2のプライマー鎖の3´末端からの鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成が、同一鋳型核酸分子上で互いに向かい合う方向で行われる、前項4または5に記載の核酸配列の増幅方法。
8.鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成が鋳型交換反応を伴う、前項7に記載の核酸配列の増幅方法。
9.各工程が等温で行われる、前項1〜8のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
10.鋳型核酸が、1本鎖DNA、2本鎖DNAまたは部分的に1本鎖領域を有する2本鎖DNAである、前項1〜9のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
11.鋳型核酸が2本鎖DNAであり、2本鎖DNAを1本鎖DNAにする工程の後に実施される、前項10に記載の核酸配列の増幅方法。
12.2本鎖DNAを1本鎖DNAにする工程が熱変性によって行われる、前項11に記載の核酸配列の増幅方法。
13.鋳型核酸がRNAを鋳型とする逆転写反応によって得られたcDNAである、前項10〜12のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
14.RNAを鋳型とする逆転写反応によってcDNAを合成する工程の後に実施される、前項13に記載の核酸配列の増幅方法。
15.逆転写酵素活性を有するDNAポリメラーゼを逆転写酵素として逆転写反応に使用する、前項13または14に記載の核酸配列の増幅方法。
16.鋳型核酸中の増幅する領域かつプライマーがアニーリングしない領域に、1塩基以上からなる未知の塩基配列領域が含まれる、前項1〜15のいずれか1項に記載の方法による未知の核酸配列の増幅方法。
17.反応混合物中に融解温度調整試薬が含まれる、前項1〜16のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
18.融解温度調整試薬がベタインである、前項17に記載の核酸配列の増幅方法。
19.反応混合物中に1本鎖核酸安定化剤が含まれる、前項1〜18のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
20.反応混合物に塩基Xを含有するプライマーがアニーリングする領域より上流側(5´側)の領域にアニーリングするアウタープライマーがさらに含まれる、前項1〜19のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
21.塩基Xが、ヒポキサンチン、キサンチン、ウラシル、オキサニンおよびAPサイト(apurinic/apyrimidinic siteまたはabasic site)からなる群より選択されるものである、前項1〜20のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
22.塩基Xがヒポキサンチンまたはウラシルである、前項21に記載の核酸配列の増幅方法。
23.塩基Xの5´側に隣接する塩基がアデニンまたはチミンである、前項1〜22のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
24.塩基Xの3´側に隣接する塩基がアデニンまたはチミンである、前項1〜23のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
25.プライマーにおいて塩基Xより下流側(3´側)の塩基が存在しないか、またはプライマーの塩基Xより下流側(3´側)の塩基数が1〜50塩基である、前項1〜24のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
26.プライマーにおいて塩基Xより上流側(5´側)の塩基数が10〜100塩基である、前項1〜25のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
27.プライマーに1以上のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドが含まれる、前項1〜26のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
28.プライマーの塩基Xの上流側(5´側)の全ヌクレオチド中のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドの含有量が60%以下である前項27に記載の核酸配列の増幅方法。
29.修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチドのα位のリン原子に結合している酸素原子が硫黄原子に置換された(α−S)ヌクレオチドである、前項27または28に記載の核酸配列の増幅方法。
30.鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼが、大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、バクテリオファージφ29由来のphi29 DNAポリメラーゼ、バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼおよびバチルス カルドテナックス(Bacillus caldotenax)由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼのいずれか1である、前項1〜29のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
31.エンドヌクレアーゼVが、非特異的な核酸切断活性を示さず、かつ、特異的な核酸切断活性を示す変異型の特異的エンドヌクレアーゼVである、前項1〜30のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
32.特異的な核酸切断活性がデオキシイノシン特異的な核酸切断活性である、前項31に記載の核酸配列の増幅方法。
33.変異型の特異的エンドヌクレアーゼVが、野生型エンドヌクレアーゼVのアミノ酸配列における、
(a)80位のアミノ酸、またはサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)エンドヌクレアーゼVの80位と同等位置のアミノ酸が、他のアミノ酸Z1に変異されており、かつ、
(b)105位のアミノ酸、またはサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼVのアミノ酸配列における105位と同等位置のアミノ酸が、他のアミノ酸Z2に変異されている、前項31または32に記載の核酸配列の増幅方法。
34.アミノ酸Z1がアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンのいずれか1である前項33に記載の核酸配列の増幅方法。
35.アミノ酸Z2がアラニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、グリシン、セリン、トレオニンおよびヒスチジンのいずれか1である、前項33または34に記載の核酸配列の増幅方法。
36.アミノ酸Z1およびZ2がともにアラニンである、前項33〜35のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
37.野生型エンドヌクレアーゼVが好熱性細菌または好熱性古細菌由来である、前項33〜36のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
38.野生型エンドヌクレアーゼVがサーモトガ・マリチマ由来である、前項33〜37のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
39.野生型エンドヌクレアーゼVが配列番号1に示すアミノ酸配列を有する、前項33〜38のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
40.エンドヌクレアーゼVが耐熱性を有する、前項31〜39のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
41.変異型の特異的エンドヌクレアーゼVが配列番号2に示すアミノ酸配列を有する、前項31〜36のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
42.試料中の標的核酸を検出するための方法であって、前項1〜41のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法により標的核酸を増幅する工程、該工程により増幅産物が生成したか否かを検知する工程を含む、標的核酸の検出方法。
43.核酸の検出剤存在下で前項1〜41のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法により標的核酸を増幅する工程、該工程により増幅産物が生成したか否かを検出剤由来のシグナル変化に基づいて検知する工程を含む、前項42に記載の標的核酸の検出方法。
44.エンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの使用を指示する指示書を記録した媒体を含んでなる、前項1〜41のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法に使用される、核酸増幅用試薬キット。
45.少なくともエンドヌクレアーゼV、または少なくともエンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを含有する、前項44に記載の核酸増幅キット。
46.エンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの使用を指示する指示書を記録した媒体を含んでなる、前項42または43に記載の標的核酸の検出方法に使用される、核酸検出用試薬キット。
47.少なくともエンドヌクレアーゼV、または少なくともエンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを含有する、前項46に記載の核酸検出用試薬キット。
48.エンドヌクレアーゼVが変異型エンドヌクレアーゼVである前項44〜47のいずれか1項に記載の核酸増幅用試薬キット。
本発明は「エンドヌクレアーゼV依存性増幅」(EVA)と呼ぶ本発明の増幅方法を提供する。EVAではエンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの2種類の酵素の活性に基づいて反応が進行する。また、EVAの反応は、エンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基を少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で実施される。
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[8]Huang J, Lu J, Barany F, Cao W : Mutational analysis of endonuclease V from Thermotoga maritima. Biochemistry, 41, p.8342-50 (2002).
[9]Liu J, He B, Qing H, Kow YW : A deoxyinosine specific endonuclease from hyperthermophile, Archaeoglobus fulgidus: a homolog of Escherichia coli endonuclease V. Mutat Res, 461, p.169-77 (2000).
[10]Hitchcock TM, Gao H, Cao W : Cleavage of deoxyoxanosine-containing oligodeoxyribonucleotides by bacterial endonuclease V. Nucleic Acids Res, 32, p.4071-80 (2004).
[11]Feng H, Klutz AM, Cao W : Active Site Plasticity of Endonuclease V from Salmonella typhimurium. Biochemistry, 44, p.675-83 (2005).
(I)少なくとも以下を含有する反応混合物を調製する工程
(i)鋳型核酸
(ii)デオキシリボヌクレオチド3リン酸
(iii)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ
(iv)エンドヌクレアーゼV
(v)少なくとも1種類のプライマー(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(II)工程(I)で調製された反応混合物を、以下の反応が行える温度条件で増幅産物を生成するのに充分な時間インキュベートする工程
(i)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
(ii)DNAポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
(iii)エンドヌクレアーゼVによる塩基Xを含む核酸鎖中の塩基Xの認識および該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合の切断反応。
本発明の好ましい1実施形態は、以下の工程(a)〜(f)を含む核酸増幅方法である[ここで工程(c)〜(f)は連続的に反復される。]。
(a)少なくとも1種類のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(b)DNAポリメラーゼによって、工程(a)で鋳型核酸にアニーリングさせたプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(c)エンドヌクレアーゼVによって、工程(b)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(d)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(c)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(e)エンドヌクレアーゼVによって、工程(d)で生成された2本鎖核酸のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(f)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(e)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
本発明の好ましい1実施形態は、以下の工程(a)〜(l)を含む核酸増幅方法である[ここで工程(c)〜(f)、および工程(i)〜(l)は連続的に反復される。]。
(a)少なくとも1種類の第1のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(b)DNAポリメラーゼによって、工程(a)で鋳型核酸にアニーリングさせた第1のプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(c)エンドヌクレアーゼVによって、工程(b)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(d)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(c)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(e)エンドヌクレアーゼVによって、工程(d)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(f)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(e)で新たに提供された第1のプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(g)工程(d)または(f)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、少なくとも1種類の第2のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、該鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(h)DNAポリメラーゼによって、工程(g)で鋳型核酸にアニーリングさせた第2のプライマー鎖から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(i)エンドヌクレアーゼVによって、工程(f)で生成された2本鎖核酸における第2のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(j)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(i)で第2のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(k)エンドヌクレアーゼVによって、工程(j)で生成された2本鎖核酸における第2のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(l)工程(k)でプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
本発明の好ましい1実施形態は、以下の工程(a)〜(y)を含む核酸増幅方法である[ここで工程(c)〜(f)、(i)〜(l)、および(m)〜(y)は連続的に反復される。]。本実施形態では、第2のプライマー鎖が伸長される下記工程(j)および(l)において、鎖置換反応によって遊離される核酸鎖に、再び第1のプライマーの核酸配列がアニーリング可能である。
(a)少なくとも1種類の第1のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(b)DNAポリメラーゼによって、工程(a)で鋳型核酸にアニーリングさせた第1のプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(c)エンドヌクレアーゼVによって、工程(b)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(d)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(c)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(e)エンドヌクレアーゼVによって、工程(d)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(f)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(e)で新たに提供された第1のプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(g)工程(d)または(f)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、少なくとも1種類の第2のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、該鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(h)DNAポリメラーゼによって、工程(g)で鋳型核酸にアニーリングさせた第2のプライマー鎖から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(i)エンドヌクレアーゼVによって、工程(f)で生成された2本鎖核酸における第2のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(j)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(i)で第2のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(k)エンドヌクレアーゼVによって、工程(j)で生成された2本鎖核酸における第2のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(l)工程(k)でプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(m)工程(j)または(l)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程(a)に記載の第1のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
(n)DNAポリメラーゼによって、工程(m)で鋳型核酸にアニーリングした第1のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(o)エンドヌクレアーゼVによって、工程(n)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(p)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(o)で第1のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(q)エンドヌクレアーゼVによって、工程(p)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(r)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(q)で第1のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(s)工程(p)または(r)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程(g)に記載の第2のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
(t)DNAポリメラーゼによって、工程(s)で鋳型核酸にアニーリングした第2のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(u)エンドヌクレアーゼVによって、工程(t)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(v)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(u)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(w)エンドヌクレアーゼVによって、工程(v)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合を切断することによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(x)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(w)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(y)工程(v)または(x)で鎖置換によって遊離した核酸が、鋳型核酸として工程(m)に利用される工程
本発明に使用するエンドヌクレアーゼVは、どのような生物あるいはウイルス由来のものであってもよいが、例えば細菌由来のものや古細菌由来のものが選択でき、例えばEscherichia coli、Salmonella typhimurium、Thermotoga maritima、Thermus thermophilus、Thermoplasma acidophilum、Thermoplasma volcanium、Aeropyrum pernix、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus horikoshii、Sulfolobus tokodaii、Archaeoglobus fulgidus由来のものなどが挙げられる。また本発明に使用するエンドヌクレアーゼVは、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組換えタンパク質のいずれであってもよい。
本発明の核酸増幅方法に使用するプライマーは、エンドヌクレアーゼVによって認識され得る塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。本発明における塩基Xは、使用するエンドヌクレアーゼVによって認識されうるものであればどの様なものであってもかまわないが、例えばヒポキサンチン(デオキシイノシンの塩基)、ウラシル(デオキシウリジンの塩基)、キサンチン(デオキシキサントシンの塩基)、オキサニン(デオキシオキサノシンの塩基)、APサイト(apurinic/apyrimidinic siteまたはabasic site)、または天然のDNA中に見られる無傷の塩基(アデニン、チミン、グアニン、シトシン)のいずれかの誘導体などが挙げられる。本発明における塩基Xのいくつかの好適な例について、その構造を図6に示した。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはデオキシリボヌクレオチドで構成される。また、本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、1以上のリボヌクレオチドを含有していてもよい。本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはその3´末端からのDNA鎖の伸長が可能であるように、該3´末端に3´−OH基を有しているものがよい。しかし該3´−OH基は、本発明の好ましい実施形態において、エンドヌクレアーゼVの核酸切断活性はプライマー鎖に新たな3´−OH基を有する3´末端を提供する能力があるため必須ではない。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの機能を失わない限り、ランダムプライマーまたは縮重プライマーであってもよい。
本発明には、DNAの鎖置換活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼを使用することができる。また、該鎖置換型DNAポリメラーゼは、実質的に5´→3´エキソヌクレアーゼ活性を有していないものが特に好ましい。
大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、
バクテリオファージφ29由来のphi29 DNAポリメラーゼ、
バクテリオファージT7由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(例えばSequenaseなど)、
Bacillus stearothermophilus由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼ、
Bacillus caldotenax由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼ(例えばBcaBEST DNAポリメラーゼなど)、
Pyrococcus sp.GB−D由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(例えばDeep VentR DNAポリメラーゼやDeep VentR (exo−)DNAポリメラーゼなど)、
Pyrococcus furiosus由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(例えばPfu DNAポリメラーゼやPfu Turbo DNAポリメラーゼなど)、
Thermus aquaticus由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(例えばZ−Taq DNAポリメラーゼやTopoTaq DNAポリメラーゼなど)、
Thermus thermophilus由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(例えば、ΔTth DNAポリメラーゼなど)、
Thermococcus sp.9°N−7由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(例えば9°Nm DNA PolymeraseやTherminator DNA Polymeraseなど)、
Thermococcus litoralis由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(例えばTli DNAポリメラーゼ、VentR DNAポリメラーゼ、VentR (exo−)DNAポリメラーゼなど)および、
Thermococcus kodakaraensis KOD1株由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(例えば、KOD DNAポリメラーゼ、KOD Dash DNAポリメラーゼ、KOD−Plus− DNAポリメラーゼなど)。
本発明の核酸増幅方法における鋳型核酸は、該核酸を含む可能性があるいかなる供給源から調製または単離したものでもよい。このような核酸を含む供給源は、例えば、環境資源、食物、農産物、発酵物、生体の体液や組織、または細胞やウィルスなどが挙げられる。生体の体液や組織とは、例えば、血液、乳、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺吸引液、粘膜組織や組織試料のスワブなどが含まれる。また、これらの試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であってもよい。また鋳型核酸は、前記の試料等または核酸含有調製物より、公知の方法で増幅したDNAやRNA等の核酸でもよい。また、制限酵素や他の核酸切断または分解酵素などによって、完全にまたは部分的に処理されたものでもよい。
本発明の核酸増幅方法に使用するデオキシヌクレオチド3リン酸(dNTP)としては、DNAポリメラーゼによる一般的なDNA合成反応において通常使用する基質、すなわちdATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合物が好適に使用できる。また、該dNTPは、dATP、dCTP、dGTP、dTTPのいずれか1以上のdNTPを含まないdNTPであってもよい場合もある。
本発明に使用するエンドヌクレアーゼVとDNAポリメラーゼの組合せは、上述の好ましいエンドヌクレアーゼVと、上述の好ましいDNAポリメラーゼとで、好適な組合せを選択すればよい。すなわち、核酸増幅反応の反応混合物中において、エンドヌクレアーゼVとDNAポリメラーゼがそれぞれ好適に作用し得るような組合せが好ましい。好ましくは、同じ温度条件下で、エンドヌクレアーゼVとDNAポリメラーゼがそれぞれ好適に作用し得るような組合せがよい。例えば、エンドヌクレアーゼVとDNAポリメラーゼがともに常温性の酵素である組合せや、エンドヌクレアーゼVとDNAポリメラーゼがともに耐熱性の酵素である組合せが好ましい。
本発明の核酸増幅方法における反応混合物は、酵素活性に好適な条件(例えばpH、金属イオン濃度、塩濃度など)を与える緩衝剤、金属イオン供給物質、塩類などを含有することが好ましい。緩衝剤としては、特に限定されないが、当業者が通常使用する公知の緩衝剤、例えば、トリス(Tris)、トリシン(Tricine)、ビシン(Bicine)、へペス(HEPES)、モプス(MOPS)、テス(TES)、タプス(TAPS)、ピペス(PIPES)、キャプス(CAPS)、リン酸塩(リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等)などが挙げられる。
本発明の核酸増幅方法において、反応混合物をインキュベートする工程は、(i)鋳型核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、(ii)DNAポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応および(iii)エンドヌクレアーゼVによる塩基Xを含む核酸鎖中の塩基Xの認識および該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合の切断反応、が行える条件であれば特に限定はない。当該インキュベーション工程の温度条件は、変温あるいは等温のいずれであってもよく、等温がより好ましい。
さらに本発明は、本発明の核酸増幅方法(EVA)によって標的核酸を増幅する工程と、該工程により増幅産物が生成したか否かを検知する工程、を含むことを特徴とする標的核酸の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、様々な試料における標的核酸の存在あるいは不在の検出に用いることができる。
本発明の1つの実施形態は、本発明の核酸配列の増幅方法に使用される試薬キット、すなわち核酸増幅試薬キットである。該キットは、エンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの使用を指示した指示書を記録した媒体を含んでなることが好ましい。該キットはさらに、少なくともエンドヌクレアーゼV、または少なくともエンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを含有することがより好ましい。
(1)野生型エンドヌクレアーゼV遺伝子の作製
以下の手順で野生型エンドヌクレアーゼV遺伝子を取得した。まず、サーモトガ・マリチマATCC 43589株を、理化学研究所微生物系統保存施設(Japan Collection of Microorganisms、JCM)より購入した(JCM No.10099)。該菌株液1mlを所定の培地100mlに植菌して、嫌気条件下80℃にて48時間静置培養した。その培養液20mlを13000×gで、5分間遠心分離し、沈殿した菌体を1mlの超純水に懸濁した。懸濁液を超音波破砕処理した後、13000×gで5分間遠心分離して上清を回収し、サーモトガ・マリチマの染色体DNAが含まれる破砕上清液を取得した。
以下の手順で野生型エンドヌクレアーゼVのアミノ酸配列に2重の部位特異的変異を導入した。まず、1つ目の変異導入として、野生型エンドヌクレアーゼVのアミノ酸配列の80位に位置するチロシンをコードする塩基配列を、アラニンをコードする塩基配列に置換(Y80A変異)したエンドヌクレアーゼV遺伝子を作製した。QuikchangeII Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社製)を用いて、目的の塩基配列に部位特異的変異を導入した。鋳型としてpET16 TmaEVを50ng、Y80A変異導入用のプライマーとして配列番号5および6で示したオリゴヌクレオチドを用い、反応液の全量を51μlとした。反応液組成および操作手順は、キットに付属された仕様書に準じた。このようにしてY80A変異を導入した変異型エンドヌクレアーゼV遺伝子を含む組換え体DNA(以下、pET16 TmaEVM1という)を得た。
大腸菌組換えタンパク質発現系を利用し、以下の手順で野生型エンドヌクレアーゼVおよび変異型エンドヌクレアーゼVを発現させた。野性型サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼV遺伝子を有するpET16TmaEV、または変異型サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼV遺伝子を有するpET16TmaEVM2を用いて、宿主大腸菌株BL21(DE3)(Novogen社製)を常法によって形質転換した。得られた形質転換体を、アンピシリン(終濃度50μg/ml)を含むLB培地8ml(ペプトン 10g/l、酵母エキス 5g/l、NaCl 10g/l)に接種し、培地のOD600が0.6になるまで37℃にて振とう培養を行った。続いて、その培養液をアンピシリン(終濃度50μg/ml)を含むLB培地 800mlに接種し、培地のOD600が0.6になるまで37℃で振とう培養を行った。その後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(終濃度が1mM)を培養液に添加することによって目的タンパク質の発現を誘導し、30℃にて5時間振とう培養を行った。その培養液を13000×gで10分間遠心分離した。沈殿した菌体を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma社製)を含む緩衝液[20mM HEPES(pH7.4)、1mM EDTA(pH8.0)、0.1mM DTT、50mM NaCl]30mlに懸濁した。その懸濁液30mlを超音波破砕処理した後、13000×gで10分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清を75℃にて15分間熱処理することによって、上清中に含まれる宿主大腸菌由来のタンパク質を変性させた。
(1)鋳型DNAの調製
EVAの鋳型として用いるDNA断片をPCRによって調製した。PCRのための鋳型としてプラスミドpUC18(GenBank Accession No. L09136)を20ng、プライマーとして配列番号9および10で示したオリゴヌクレオチドを20pmol用いた。これらのプライマーは、pUC18のマルチクローニングサイトを含む243bpのDNA断片が増幅されるように設計したもので、かつデオキシイノシンをそれぞれ1つ含んでいる。DNAポリメラーゼとして、TaKaRa Taq(タカラバイオ社製)2.5Uを使用し、反応バッファーおよびdNTP混合物は同製品に付属されたものを用いた。
実施例2(1)に記載の方法で調製したDNA断片を鋳型として用い、EVA法による核酸増幅を実施した。プライマーとして配列番号9および10で示したオリゴヌクレオチドを用いた。これらはそれぞれデオキシイノシンを1つ含む。エンドヌクレアーゼVは、実施例1において取得した2重変異(Y80AおよびD105A変異)を有するサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼV(以下、変異型Tma エンドヌクレアーゼVという)を使用した。
実施例2(2)で得られた増幅産物が、目的とする核酸配列を有するDNA断片であるかどうか確認するため、制限酵素による消化を行った。前記のプライマーを2pmol使用したEVA反応液(図7、レーン2)を20μl用いて、QIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて増幅産物を精製し、超純水35μlで溶出した。精製操作は、当該キットに添付された取扱説明書に従った。
環状プラスミドpUC18を鋳型として用い、EVA法により核酸を増幅した。プライマーとして、配列番号9および10に示したオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、pUC18のマルチクローニングサイトを含む約240bpの領域であった。
鋳型として環状プラスミドpUC18、プライマーとして、配列番号11および12に示したオリゴヌクレオチドを用いて、EVA法による核酸増幅を実施した。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、pUC18のマルチクローニングサイトを含む約240bpの領域であった。
鋳型として環状プラスミドpUC18、プライマーとして配列番号13および14に示したオリゴヌクレオチドを用いて、EVA法により核酸を増幅した。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、約630bpの領域であった。
鋳型として環状プラスミドpUC18、プライマーとして配列番号13および14に示したオリゴヌクレオチドを用いて、EVA法により核酸を増幅した。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、約630bpの領域であった。
鋳型として環状プラスミドpUC18、プライマーとして配列番号11および12に示したオリゴヌクレオチドを用い、EVA法により核酸を増幅した。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、pUC18のマルチクローニングサイトを含む約240bpの領域であった。
EVAのための反応液1を次の手順で調製した。まず、使用する2種類の酵素(Bst DNA ポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼV)を除く全ての成分を含む反応液を全量46μlとなるように調製した。次に反応液を95℃にて5分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にBst DNAポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼVを添加して混合し、最終的に全量50μlのEVA反応液[最終組成:10mM ヘペスバッファー(pH7.4)、4mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオトレイトール、100mM 酢酸カリウム、各0.4mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、0.5mM ベタイン、16pmolの配列番号11のプライマー、16pmolの配列番号12のプライマー、2fmolのpUC18、16UのBst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製)、3.8pmolの変異型Tma エンドヌクレアーゼV、超純水]を調製した。
1種類のプライマーを用いたEVAを実施した。プライマーは、配列番号11または12で示したオリゴヌクレオチドを用いた。
(1)エンドヌクレアーゼVの量
EVA反応液中のエンドヌクレアーゼVの量を3.8〜77pmolの範囲としてEVAを実施した。まず、反応液を次の手順で調製した。酵素(Bst DNAポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼV)を除く全ての成分を含む反応液を全量44μlとなるように調製した。次に反応液を95℃にて5分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にBst DNAポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼVを添加して混合し、最終的に全量50μlのEVA反応液[最終組成:10mM ヘペスバッファー(pH7.4)、5mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオトレイトール、100mM 酢酸カリウム、各0.4mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、4pmolの各プライマー(配列番号11および12のプライマー)、20fmolのpUC18、16UのBst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製)、19〜77pmolの範囲の一定量の変異型Tma エンドヌクレアーゼV、超純水]を調製した。調製したこれらのEVA反応液を、65℃にて1時間保温して反応させた。
プライマーの量が異なるEVA反応液を調製し、EVAを実施した。まず、酵素を除く全ての成分を含む反応液を全量46μlとなるように調製した。次に反応液を95℃にて5分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にBst DNAポリメラーゼと変異型TmaエンドヌクレアーゼVを添加して混合し、最終的に全量50μlのEVA反応液[最終組成:10mM ヘペスバッファー(pH7.4)、5mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオトレイトール、100mM 酢酸カリウム、各0.4mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、2、4または8pmolの各プライマー(配列番号11および12のプライマー)、2fmolのpUC18、16UのBst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製)、19pmolまたは29pmolの変異型Tma エンドヌクレアーゼV、超純水]を調製した。
反応液中の塩化マグネシウム濃度を2〜12mMの範囲としてEVAにより核酸を増幅した。まず、EVA反応液を次の手順で調製した。酵素(Bst DNAポリメラーゼと変異型TmaエンドヌクレアーゼV)を除く全ての成分を含む反応液を全量47μlとなるように調製した。次に反応液を95℃にて5分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にBst DNAポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼVを添加して混合し、最終的に全量50μlのEVA反応液[最終組成:10mM へペスバッファー(pH7.4)、2、4、5、6、7、8または12mMの塩化マグネシウム、1mM ジチオトレイトール、100mM 酢酸カリウム、各0.4mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、16pmolの各プライマー(配列番号11および12のプライマー)、200amolのpUC18、16UのBst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製)、19pmolの変異型Tma エンドヌクレアーゼV、超純水]を調製した。
反応液中に共存させる塩類として酢酸カリウムを用い、その濃度を50〜150mMとしてEVAにより核酸を増幅した。まず、EVA反応液を次の手順で調製した。酵素(Bst DNAポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼV)を除く全ての成分を含む反応液を全量46μlとなるように調製した。次に反応液を95℃にて5分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にBst DNAポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼVを添加して混合し、最終的に全量50μlのEVA反応液[最終組成:10mM ヘペスバッファー(pH7.4)、4mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオトレイトール、50、75、100、125または150mMの酢酸カリウム、各0.4mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、16pmolの各プライマー(配列番号11および12のプライマー)、200amolのpUC18、16UのBst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製)、3.8pmolの変異型Tma エンドヌクレアーゼV、超純水]を調製した。
反応のインキュベーションの温度を48〜70℃の範囲としてEVAにより核酸を増幅した。まず、反応液を次の手順で調製した。酵素(Bst DNAポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼV)を除く全ての成分を含む反応液を全量46μlとなるように調製した。次に反応液を95℃にて5分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にBst DNAポリメラーゼと変異型Tma エンドヌクレアーゼVを添加して混合し、最終的に全量50μlのEVA反応液[最終組成:10mM ヘペスバッファー(pH7.4)、4mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオトレイトール、100mM 酢酸カリウム、各0.4mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、16pmolの各プライマー(配列番号11および12のプライマー)、20amolのpUC18、16UのBst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製)、19pmolの変異型Tma エンドヌクレアーゼV、超純水]を調製した。
鎖置換型DNAポリメラーゼとして、Bacillus caldotenax由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ(Bca DNAポリメラーゼ)を使用し、EVAにより核酸を増幅した。反応液を次の手順で調製した。まず、酵素を除く全ての成分を含む反応液を全量45.5μlとなるように調製した。次に反応液を95℃にて5分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にBca DNAポリメラーゼと変異型TmaエンドヌクレアーゼVを添加して混合し、最終的に全量50μlのEVA反応液[最終組成:10mM ヘペスバッファー(pH7.4)、4mM 塩化マグネシウム、1mM ジチオトレイトール、100mM 酢酸カリウム、各0.4mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、16pmolの各プライマー(配列番号11および12のプライマー)、2fmolのpUC18、5UのBca DNAポリメラーゼ(BcaBEST DNAポリメラーゼ、タカラバイオ社製)、3.8pmolの変異型Tma エンドヌクレアーゼV、超純水]を調製した。
アウタープライマーを用いてEVAにより核酸を増幅した。鋳型として環状プラスミドpUC18を、プライマーとして配列番号11および12に示したオリゴヌクレオチドを、アウタープライマーとして配列番号15および16に示したオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号15のアウタープライマーは、pUC18鋳型上において、配列番号11のプライマーがアニーリングする領域の17塩基ほど上流の位置にアニーリングするように設計した。また、配列番号16のアウタープライマーは、pUC18鋳型上において、配列番号12のプライマーがアニーリングする位置の17塩基ほど上流の位置にアニーリングするように設計した。
標的核酸配列を有する鋳型として環状プラスミドpUC18を用い、標的ではない核酸(非標的核酸)が大量に存在する条件下で、EVAにより核酸を増幅した。
実施例1(2)で作製したY80AおよびD105A変異を導入した変異型エンドヌクレアーゼV遺伝子を有する組換え体DNA(pET16 TmaEVM2)を鋳型として用い、実施例1(2)と同様の方法で、アミノ酸Z2をさらに別のアミノ酸に変えた変異型エンドヌクレアーゼVの遺伝子を作製した。
(α−S)ヌクレオチドを様々な位置および割合で含有するプライマーセットを用いて、実施例8と同様のEVA反応を実施した。使用したプライマーセットおよびその増幅結果を表3に示す。
実施例8と同様の反応組成のEVA反応液50μl中に、さらに0.5〜3μgの大腸菌SSBタンパク質(SIGMA)、大腸菌RecAタンパク質(NEB)、またはT4ファージgp32(NEB)をそれぞれ添加し、実施例8と同様の反応条件でEVAを実施した。この結果、大腸菌RecAタンパク質およびT4ファージgp32について、試験をした範囲において増幅反応が起きた。大腸菌SSBタンパク質では1.5μgより多く添加した場合に増幅反応が起こらず、EVA反応が阻害されることが示された。従って、EVAに用いる1本鎖核酸結合タンパク質の好ましい量は、反応混合物50μl中に大腸菌SSBタンパク質は約0.5〜1.5μg、大腸菌RecAタンパク質およびT4ファージgp32は約0.5〜3μgの範囲内であることが分かった。
(1)高価な温度サイクリング装置が不要な等温反応条件の下で核酸の合成と増幅を達成する核酸配列の増幅方法を提供できる。
(2)使用するプライマーが少なくとも1つの塩基Xを含んでいればよいことから、プライマー設計における制約が少ない。
(3)DNA合成用の基質として、コスト高につながる修飾dNTP[例えばα−S−dNTPなど)を大量に用いる必要のない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
(5)標的配列中に特定の制限酵素認識部位が存在するか否かに依存しないで、任意の配列領域を標的とすることのできる、核酸配列の増幅方法を提供できる。
(6)環状の鋳型核酸を調製するための付加的な前工程を必須としない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
(7)ある1つの標的配列の増幅を達成するのに多数の領域に対して複雑かつ制約の多いプライマー配列の設計をするような必要のない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
(9)反応に酵素活性のためのエネルギー供給物質としてのATPやdATPなどのコファクターを反応中に大量に存在させる必要がなく、また反応中にATP再生系を共存させる必要のない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
(10)必ずしも標的核酸の配列の全てが既知である必要はなく、既知の限られた配列情報に基づいて設計したプライマーを用い、未知の核酸配列を含む増幅産物を得ることが可能である。
配列番号2:変異型エンドヌクレアーゼVのアミノ酸配列。
配列番号3:エンドヌクレアーゼV遺伝子増幅用上流側プライマーとして設計されたDNA。
配列番号4:エンドヌクレアーゼV遺伝子増幅用下流側プライマーとして設計されたDNA。
配列番号5:Y80A変異導入用オリゴヌクレオチド1として設計されたDNA。
配列番号6:Y80A変異導入用オリゴヌクレオチド2として設計されたDNA。
配列番号7:D105A変異導入用オリゴヌクレオチド1として設計されたDNA。
配列番号8:D105A変異導入用オリゴヌクレオチド2として設計されたDNA。
配列番号9:デオキシイノシン含有プライマー PIT321−01として設計されたDNA。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号10:デオキシイノシン含有プライマー PIT541−01として設計されたDNA。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号11:デオキシイノシン含有プライマー PIT321−04として設計されたDNA。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号12:デオキシイノシン含有プライマー PIT541−04として設計されたDNA。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号13:デオキシイノシン含有プライマー PIT1849−02として設計されたDNA。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号14:デオキシイノシン含有プライマー PIT2454−02として設計されたDNA。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号15:アウタープライマー PIT321−OP1として設計されたDNA。
配列番号16:アウタープライマー PIT541−OP1として設計されたDNA。
配列番号17:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号18:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号19:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号20:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号21:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号22:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号23:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号24:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号25:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号26:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号27:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号28:変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号29:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号30:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号31:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号32:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号33:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号34:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号35:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号36:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号37:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号38:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号39:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
配列番号40:(α−S)ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のiはデオキシイノシンを示す。
Claims (48)
- 以下の工程(I)および(II)を含む、核酸配列の増幅方法。
(I)少なくとも以下を含有する反応混合物を調製する工程
(i)鋳型核酸
(ii)デオキシリボヌクレオチド3リン酸
(iii)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ
(iv)エンドヌクレアーゼV
(v)少なくとも1種類のプライマー(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。)
(II)工程(I)で調製された反応混合物を、以下の反応が行える温度条件で増幅産物を生成するのに充分な時間インキュベートする工程
(i)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
(ii)DNAポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
(iii)エンドヌクレアーゼVによる塩基Xを含む核酸鎖中の塩基Xの認識および該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合の切断反応 - 反応混合物中に少なくとも2種類のプライマーが含まれる、請求項1に記載の核酸配列の増幅方法。
- 以下の工程(a)〜(f)を含む、請求項1または2に記載の核酸配列の増幅方法[ここで工程(c)〜(f)は連続的に反復される。]。
(a)少なくとも1種類のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(b)DNAポリメラーゼによって、工程(a)で鋳型核酸にアニーリングさせたプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(c)エンドヌクレアーゼVによって、工程(b)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(d)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(c)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(e)エンドヌクレアーゼVによって、工程(d)で生成された2本鎖核酸のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(f)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(e)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程 - 以下の工程(a)〜(l)を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法[ここで工程(c)〜(f)、および工程(i)〜(l)は連続的に反復される。]。
(a)少なくとも1種類の第1のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(b)DNAポリメラーゼによって、工程(a)で鋳型核酸にアニーリングさせた第1のプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(c)エンドヌクレアーゼVによって、工程(b)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(d)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(c)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(e)エンドヌクレアーゼVによって、工程(d)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(f)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(e)で新たに提供された第1のプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(g)工程(d)または(f)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、少なくとも1種類の第2のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程(ここで該プライマーは、該鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼVによって認識されうる塩基Xを少なくとも1つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである)
(h)DNAポリメラーゼによって、工程(g)で鋳型核酸にアニーリングさせた第2のプライマー鎖から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(i)エンドヌクレアーゼVによって、工程(f)で生成された2本鎖核酸における第2のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(j)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(i)で第2のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(k)エンドヌクレアーゼVによって、工程(j)で生成された2本鎖核酸における第2のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(l)工程(k)でプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程 - さらに以下の工程(m)〜(y)を含む、請求項4に記載の核酸配列の増幅方法[ここで工程(m)〜(y)は連続的に反復される。]。
(m)工程(j)または(l)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程(a)に記載の第1のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
(n)DNAポリメラーゼによって、工程(m)で鋳型核酸にアニーリングした第1のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(o)エンドヌクレアーゼVによって、工程(n)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(p)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(o)で第1のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(q)エンドヌクレアーゼVによって、工程(p)で生成された2本鎖核酸における第1のプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(r)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(q)で第1のプライマー伸長鎖に新たに提供された3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(s)工程(p)または(r)で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程(g)に記載の第2のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
(t)DNAポリメラーゼによって、工程(s)で鋳型核酸にアニーリングした第2のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して2本鎖核酸を生成させる工程
(u)エンドヌクレアーゼVによって、工程(t)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(v)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(u)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(w)エンドヌクレアーゼVによって、工程(v)で生成された2本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Xが認識され、該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合を切断することによりプライマー伸長鎖に新しい3´末端を提供する工程
(x)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、工程(w)で新たに提供されたプライマー伸長鎖の3´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による2本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
(y)工程(v)または(x)で鎖置換によって遊離した核酸が、鋳型核酸として工程(m)に利用される工程 - 以下の(i)〜(iii)のいずれか2または3が同一の鋳型核酸分子上で行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
(i)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
(ii)DNAポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
(iii)エンドヌクレアーゼVによる塩基Xを含む核酸鎖中の塩基Xの認識および該塩基Xより下流側(3´側)に位置するホスホジエステル結合の切断反応 - 鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによる、第1のプライマー鎖の3´末端からの鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成、および第2のプライマー鎖の3´末端からの鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成が、同一鋳型核酸分子上で互いに向かい合う方向で行われる、請求項4または5に記載の核酸配列の増幅方法。
- 鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成が鋳型交換反応を伴う、請求項7に記載の核酸配列の増幅方法。
- 各工程が等温で行われる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 鋳型核酸が、1本鎖DNA、2本鎖DNAまたは部分的に1本鎖領域を有する2本鎖DNAである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 鋳型核酸が2本鎖DNAであり、2本鎖DNAを1本鎖DNAにする工程の後に実施される、請求項10に記載の核酸配列の増幅方法。
- 2本鎖DNAを1本鎖DNAにする工程が熱変性によって行われる、請求項11に記載の核酸配列の増幅方法。
- 鋳型核酸がRNAを鋳型とする逆転写反応によって得られたcDNAである、請求項10〜12のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- RNAを鋳型とする逆転写反応によってcDNAを合成する工程の後に実施される、請求項13に記載の核酸配列の増幅方法。
- 逆転写酵素活性を有するDNAポリメラーゼを逆転写酵素として逆転写反応に使用する、請求項13または14に記載の核酸配列の増幅方法。
- 鋳型核酸中の増幅する領域かつプライマーがアニーリングしない領域に、1塩基以上からなる未知の塩基配列領域が含まれる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法による未知の核酸配列の増幅方法。
- 反応混合物中に融解温度調整試薬が含まれる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 融解温度調整試薬がベタインである、請求項17に記載の核酸配列の増幅方法。
- 反応混合物中に1本鎖核酸安定化剤が含まれる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 反応混合物に塩基Xを含有するプライマーがアニーリングする領域より上流側(5´側)の領域にアニーリングするアウタープライマーがさらに含まれる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 塩基Xが、ヒポキサンチン、キサンチン、ウラシル、オキサニンおよびAPサイト(apurinic/apyrimidinic siteまたはabasic site)からなる群より選択されるものである、請求項1〜20のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 塩基Xがヒポキサンチンまたはウラシルである、請求項21に記載の核酸配列の増幅方法。
- 塩基Xの5´側に隣接する塩基がアデニンまたはチミンである、請求項1〜22のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 塩基Xの3´側に隣接する塩基がアデニンまたはチミンである、請求項1〜23のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- プライマーにおいて塩基Xより下流側(3´側)の塩基が存在しないか、またはプライマーの塩基Xより下流側(3´側)の塩基数が1〜50塩基である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- プライマーにおいて塩基Xより上流側(5´側)の塩基数が10〜100塩基である、請求項1〜25のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- プライマーに1以上のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドが含まれる、請求項1〜26のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- プライマーの塩基Xの上流側(5´側)の全ヌクレオチド中のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドの含有量が60%以下である請求項27に記載の核酸配列の増幅方法。
- 修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチドのα位のリン原子に結合している酸素原子が硫黄原子に置換された(α−S)ヌクレオチドである、請求項27または28に記載の核酸配列の増幅方法。
- 鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼが、大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、バクテリオファージφ29由来のphi29 DNAポリメラーゼ、バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼおよびバチルス カルドテナックス(Bacillus caldotenax)由来の5´→3´エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼのいずれか1である、請求項1〜29のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- エンドヌクレアーゼVが、非特異的な核酸切断活性を示さず、かつ、特異的な核酸切断活性を示す変異型の特異的エンドヌクレアーゼVである、請求項1〜30のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 特異的な核酸切断活性がデオキシイノシン特異的な核酸切断活性である、請求項31に記載の核酸配列の増幅方法。
- 変異型の特異的エンドヌクレアーゼVが、野生型エンドヌクレアーゼVのアミノ酸配列における、
(a)80位のアミノ酸、またはサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)エンドヌクレアーゼVの80位と同等位置のアミノ酸が、他のアミノ酸Z1に変異されており、かつ、
(b)105位のアミノ酸、またはサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼVのアミノ酸配列における105位と同等位置のアミノ酸が、他のアミノ酸Z2に変異されている、請求項31または32に記載の核酸配列の増幅方法。 - アミノ酸Z1がアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンのいずれか1である請求項33に記載の核酸配列の増幅方法。
- アミノ酸Z2がアラニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、グリシン、セリン、トレオニンおよびヒスチジンのいずれか1である、請求項33または34に記載の核酸配列の増幅方法。
- アミノ酸Z1およびZ2がともにアラニンである、請求項33〜35のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 野生型エンドヌクレアーゼVが好熱性細菌または好熱性古細菌由来である、請求項33〜36のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 野生型エンドヌクレアーゼVがサーモトガ・マリチマ由来である、請求項33〜37のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 野生型エンドヌクレアーゼVが配列番号1に示すアミノ酸配列を有する、請求項33〜38のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- エンドヌクレアーゼVが耐熱性を有する、請求項31〜39のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 変異型の特異的エンドヌクレアーゼVが配列番号2に示すアミノ酸配列を有する、請求項31〜36のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法。
- 試料中の標的核酸を検出するための方法であって、請求項1〜41のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法により標的核酸を増幅する工程、該工程により増幅産物が生成したか否かを検知する工程を含む、標的核酸の検出方法。
- 核酸の検出剤存在下で請求項1〜41のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法により標的核酸を増幅する工程、該工程により増幅産物が生成したか否かを検出剤由来のシグナル変化に基づいて検知する工程を含む、請求項42に記載の標的核酸の検出方法。
- エンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの使用を指示する指示書を記録した媒体を含んでなる、請求項1〜41のいずれか1項に記載の核酸配列の増幅方法に使用される、核酸増幅用試薬キット。
- 少なくともエンドヌクレアーゼV、または少なくともエンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを含有する、請求項44に記載の核酸増幅キット。
- エンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの使用を指示する指示書を記録した媒体を含んでなる、請求項42または43に記載の標的核酸の検出方法に使用される、核酸検出用試薬キット。
- 少なくともエンドヌクレアーゼV、または少なくともエンドヌクレアーゼVと鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを含有する、請求項46に記載の核酸検出用試薬キット。
- エンドヌクレアーゼVが変異型エンドヌクレアーゼVである請求項44〜47のいずれか1項に記載の核酸増幅用試薬キット。
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