JP2008048725A - 核酸配列の増幅方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】核酸の合成方法として有用な、標的核酸を選択的に増幅する方法および該方法による核酸の検出方法を提供する
【解決手段】
エンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基を含有するオリゴヌクレオチドプライマー、エンドヌクレアーゼＶ、および鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、試料中の標的とする核酸を選択的に増幅する、核酸配列の増幅方法［ＥＶＡ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法］および該方法による核酸の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸の合成方法として有用な、標的核酸を選択的に増幅する方法および該方法による核酸の検出方法に関する。
標的核酸を増幅する技術は、近年のバイオテクノロジーにおける極めて重要な技術の1つであり、生物学、医学、農学、法医学、および考古学などを含む多様な分野において、基礎研究ならびに応用のために広く用いられている。
１．ＰＣＲ
核酸増幅の最も代表的な技術として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法がよく知られている（例えば特許文献１〜３、非特許文献１）。この方法は、標的とする２本鎖ＤＮＡ領域の両端で、それぞれ別のＤＮＡ鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＤＮＡポリメラーゼ活性の作用によって標的配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成するものである。また、ＲＮＡ中の標的配列を増幅するため、ＰＣＲに逆転写酵素活性を組合せた逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法も知られている（例えば非特許文献２）。これはＲＮＡから逆転写反応によって生成されたｃＤＮＡに対してＰＣＲを行う方法である。
これらのＰＣＲ法では、鋳型となる２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの解離(変性)、１本鎖核酸へのプライマーのハイブリダイゼーション(アニーリング)、およびプライマーからの鋳型依存的な相補鎖の合成(伸長)の３つの段階からなる反応を繰り返すことにより、２つのプライマーの５´端で規定された特定のＤＮＡ断片が増幅産物として指数関数的に蓄積される。よって、ＰＣＲ法では、反応溶液を上記３段階のそれぞれに適した温度に調節する計３工程の繰り返し（サーマルサイクル）が必要とされる。
ＰＣＲ法の有用な点の１つとして、２つのプライマー（一般的にはそれぞれ約２０塩基前後の長さである）の配列によって標的核酸の増幅範囲が規定されれば、増幅反応が進行することから、必ずしも標的核酸の配列の全てが既知である必要はないという点が挙げられる。このことは、既知の限られた配列情報から、ＰＣＲ法によって未知の核酸配列を得ることを可能にする。これはすなわち、ＰＣＲ法が、未知遺伝子のクローニングや変異遺伝子の取得、次工程で未知配列を分析することを目的とした核酸の調製法としての使用などを含む、広い分野における様々な目的に利用されてきた理由の１つの側面である。
最も初期のＰＣＲ法では、アニールしたプライマーの伸長に大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片が用いられていた。ＰＣＲのサーマルサイクルの１工程である変性ステップは１００℃に近い高温が必要とされ、当該温度ではＫｌｅｎｏｗ断片が失活してしまうため、新しい酵素を各サイクル毎に加える必要があった。このため、当初のＰＣＲ法の実施は極めて煩雑な作業を伴った。この問題は、伸長に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることによって解決され（例えば特許文献４および５、非特許文献３）、温度サイクリング装置により反応が自動化されたことによって（例えば特許文献６）、ＰＣＲは利用しやすい一般的な方法となった。
このようにＰＣＲ法の作業の煩雑さは改善されたが、一方で、反応温度と時間を繰り返し正確に制御する温度サイクリング装置が高価なものになるという問題点が残された。またサーマルサイクル中には、反応液の温度を多数回にわたって上昇／下降させる必要があり、その温度変化に要する時間の繰り返しが、全反応工程終了までの所要時間を長引かせる原因となっていた。ガラスキャピラリーを反応容器として用い、反応液量を最小限とし、高速な温度変化を可能とした温度サイクリング装置が開発された（例えば非特許文献４）。この装置の使用はＰＣＲの所要時間を大きく短縮させたが、それと引き替えに装置はより高価なものとなった。
２．ＳＤＡ
このような問題を解決するため、等温状態で実施可能な標的核酸の増幅法がいくつか開発されてきた。その１つとしてＳｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＳＤＡ）法が知られる（例えば特許文献７および８、非特許文献５および６）。この方法では、反応に必要な酵素として、５´→３´ エキソヌクレアーゼ活性を欠損したＤＮＡポリメラーゼ(または鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ)を用い、さらに制限酵素も使用する。ＳＤＡの反応中、制限酵素は2本鎖を形成したＤＮＡの一方の鎖を切断して（ニッキング ）、伸長反応の起点となる３´末端を提供し、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは該３´末端を伸長して、その下流のＤＮＡ鎖を置換する。
ＳＤＡ法で制限酵素によるニッキングを可能とするためには、プライマーをアニールさせた配列に使用する制限酵素認識配列が存在するように、反応をデザインしておく必要がある。さらに、通常の制限酵素は核酸の２本の鎖を切断するので、該酵素に１本鎖のみを切断させるために、その認識部位は、一方の鎖が酵素消化に耐性を持つような半修飾された（ｈｅｍｉ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）部位として提供される必要がある。そのためには、ＤＮＡ合成用の基質として、修飾されたｄＮＴＰ、例えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたα−Ｓ−ｄＮＴＰなど、を大量に用いる必要がある。修飾ｄＮＴＰの必要性は、ＳＤＡ反応組成のコスト上昇をもたらす。また修飾ｄＮＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれる効率が通常のｄＮＴＰとは異なる場合がある。ＳＤＡ法によって生成した標的の増幅産物は修飾ヌクレオチドを含むため、増幅産物の次工程での使用（例えば産物を制限酵素処理してその消化の有無や断片長を解析することや、産物を用いた遺伝子クローニングなど）は制限される。
初期のＳＤＡ法は約３７〜４２℃の一定の温度で反応が進行するものであったが、バックグラウンド反応が起こりやすいなどの問題があった。このような問題を改善するため、耐熱性酵素を使用し、約５０〜７０℃の一定温度で好適に反応が進行する、いわゆる好熱ＳＤＡ法が開発された（例えば特許文献９および１０）。一方で、このことは使用可能な制限酵素の選択肢を狭めた。ＳＤＡ法の利点の１つは、それが単一温度で進行するため、高価な温度サイクリング装置の必要性を回避できることである。しかしながら、ＳＤＡ法は長い標的配列の増幅には不向きである。また標的核酸の配列がその内部にＳＤＡで用いる制限酵素の認識配列を含む場合には、ＳＤＡの原理の性質上、そのような標的配列の増幅は干渉を受ける。この問題は、使用する制限酵素の種類を変えることで回避できるが、使用可能な制限酵素の選択肢は限られている。さらに、標的核酸が未知の配列を含む場合には、この問題の発生を予測することは困難である。
ＳＤＡ法の欠点を改善するいくつかの方法が開示されている。例えばＴｓｐＲＩのような５´ 突出末端を生じさせる制限酵素の使用（例えば特許文献１１）や、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩのようなニッキングエンドヌクレアーゼの使用（例えば特許文献１２）は、修飾ヌクレオチドの使用に関係する制限からＳＤＡを解放する。しかしながら、このような改良ＳＤＡ法においても、上述の問題点の全てを回避できるわけではない。
３．ＲＣＡ
別の等温標的核酸増幅法として、バクテリオファージなどでみられるローリングサークル型のＤＮＡ複製に類似した反応を利用するＲｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法が公知である（例えば非特許文献７）。この方法では、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが、環状の鋳型核酸上でプライマーを伸長し、鋳型の相補鎖が連続的に結合したコピーを生成させる。また、該生成物に対してさらにプライマーをアニールさせてその相補鎖を伸長させることによって、高度な増幅を可能としている。しかしながら、ＲＣＡ法では連続的な相補鎖合成反応のために、環状の鋳型核酸が提供される必要があり、そのためには、例えばリガーゼを用いたライゲーションなどの付加的な工程が必要となる。またＲＣＡ法の増幅産物は、同じ配列からなる領域が繰り返し連続した異なる長さの核酸断片の混合物となる。よってＲＣＡ法によって得られた増幅産物を次工程に利用するためには、例えば制限酵素によって増幅産物を切断するなどの付加的な工程が必要となる場合がある。このような付加的な工程の必要性は、ＲＣＡ法の汎用性や利便性を制限している。
４．ＬＡＭＰ
別の等温標的核酸増幅法として、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法が知られる（例えば特許文献１３、非特許文献８および９）。この方法では、標的核酸の末端領域に、配列が自己相補的となるような領域を導入してループ構造を形成させる。伸長反応の起点となる３´末端は、このループ構造形成の際の自己相補的なハイブリダイゼーションよって、またループ構造形成によって生じた１本鎖ループ領域へのプライマーのアニーリングによって提供され、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって該３´末端が伸長され、その下流のＤＮＡ鎖が置換される。
ループ構造を介した連鎖的なＤＮＡ合成反応を可能とするためには、その起点構造として、両末端にループ構造を有する、いわゆるダンベル型構造を形成しうる鋳型が提供される必要がある。そのためには、標的の核酸配列の中の６つの領域を認識する適切に設計された４つのプライマーを用いる必要がある。このようなプライマーセットの設計は、ＰＣＲ用のプライマーセット（２つの領域を認識する１対のプライマー）の設計に比べると、格段に複雑性が増す。ＬＡＭＰ法のためのプライマー設計を、専用のプライマー設計支援ソフトウェアの助けなしに行うのは極めて煩雑な作業であり、間違いを起こしやすい。ＬＡＭＰ法のプライマー設計の複雑性は、該増幅反応の標的に対する特異性の高さという利点と表裏一体でもある。
ＬＡＭＰ法の他の主な利点は、それが高価な温度サイクリング装置が不要な単一温度で進行する反応であることと、増幅効率が極めて高いという点である。しかしながら、ＬＡＭＰ法は長い標的配列の増幅に制限がある。一般的にＬＡＭＰ法の好適な標的となりうる鋳型の長さは、２つのインナープライマーによって規定される領域として、約１３０〜３００ｂｐ程度である。ただし当該鋳型領域の中の、約８０塩基程度はインナープライマーを設計するために配列が既知でなければならない。また反応効率を向上させるためにループプライマーを併用する方法（例えば非特許文献９）では、当該鋳型領域の中の約１２０塩基程度分の配列が、インナープライマーとループプライマーを設計するために既知でなければならない。従って、未知の配列を含む標的核酸を増幅するためのＬＡＭＰ法の利用は大きく制限されている。さらにＬＡＭＰ法は短い標的配列の増幅にも制限がある。標的とする配列の長さが約１２０ｂｐよりも短い場合は、連鎖反応に好適なダンベル構造を形成させることが困難なためである。
ＬＡＭＰ法によって得られる標的核酸の増幅産物は、同一鎖上で互いに相補的な配列を持つ繰り返し構造からなる、異なる長さの核酸断片の混合物となる。よってＬＡＭＰ法によって得られた増幅産物を次工程に利用するためには、例えば制限酵素によって増幅産物を切断するなどの付加的な工程が必要となる。このような付加的な工程の必要性は、ＬＡＭＰ法の汎用性や利便性を制限している。
５．ＩＣＡＮ
別の等温標的核酸増幅法として、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ （ＩＣＡＮ）法が知られる（例えば特許文献１４、非特許文献１０）。この方法では、ＤＮＡで構成される領域とＲＮＡで構成される領域の両方を含有するキメラプライマーを使用し、リボヌクレアーゼＨと鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの作用によって反応が進行する。該反応において、リボヌクレアーゼＨはキメラプライマーのアニーリングに由来して形成された２本鎖核酸のＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッド部分のＲＮＡ鎖を切断してニックを生じさせ、伸長反応の起点となる３´末端を提供する。一方、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは提供された３´末端を伸長し、その下流のＤＮＡ鎖を置換する。ＩＣＡＮ法も、高価な温度サイクリング装置の必要性を排除しているという点で、優れた核酸増幅法である。また、キメラプライマーを用いる別の核酸増幅法として、例えば特許文献１５および１６などの方法も開示されている。
キメラプライマーを用いる増幅法では、ＲＮＡがＤＮＡに比べて非常に不安定で分解されやすいという困難に直面する。ＲＮＡを分解する酵素は、生物由来試料やヒトの汗、唾液、皮膚、および実験室環境、野外環境中の様々なところに普遍的に存在し、また熱に対する安定性も高く、例えば１２１℃でオートクレーブ処理してもその活性は残る。ＲＮＡ分子は、その取扱いおよび保存において、前記のような分解酵素の汚染から注意深く保護されなければならない。またキメラプライマーの合成は、一般的なＤＮＡプライマーの合成よりも高いコストが要求されるという問題がある。
６．ＨＤＡおよびＲＰＡ
別の等温標的核酸増幅法として、Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＨＤＡ）法が知られる（例えば特許文献１７、非特許文献１１および１２）。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡヘリカーゼおよびその他のアクセサリータンパク質によって進行される生体内のＤＮＡ複製のメカニズムを、試験管内で模倣したものである。ＨＤＡ法では、プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリングとそれに続くＤＮＡポリメラーゼによる伸長を可能とするために、ＤＮＡヘリカーゼ（例えばＵｖｒＤ）が２本鎖ＤＮＡを分離して１本鎖の鋳型を生成させる。
また別の等温標的核酸増幅法として、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＲＰＡ）法が知られる（例えば特許文献１８、非特許文献１３）。この方法では、リコンビナーゼ（例えばｕｖｓＸ）をプライマーと結合させて複合体を形成させる。該複合体（ヌクレオプロテインプライマー）が、鋳型の２本鎖ＤＮＡに侵入して、プライマーの鋳型へのアニーリングを可能にし、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが該プライマーを伸長し、その下流のＤＮＡ鎖を置換する。
ＨＤＡ法もＲＰＡ法も、高価な温度サイクリング装置を必要としないという点で、優れた核酸増幅法である。しかしながらＨＤＡ法では、ヘリカーゼ活性のためのエネルギー供給物質として、ＡＴＰやｄＡＴＰなどのコファクターが反応中に大量に提供される必要がある。またさらに、ＨＤＡ法において反応を効率的に進行させるためには、ｇｐ３２などの１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と、ＭｕｔＬなどのアクセサリータンパク質が、ヘリカーゼ活性を支援するために反応組成中に提供されることが必要な場合がある（例えば非特許文献１１）。一方、ＲＰＡ法においても、反応液中にはリコンビナーゼが機能するためのエネルギー源として大量のＡＴＰが必要であり、加えて、ｇｐ３２などのＳＳＢ、ｕｖｓＹなどのリコンビナーゼ ローディング タンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびポリエチレングリコールなどのクラウディング（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）剤の存在が、増幅反応の実現に必須である。さらに、ＲＰＡ法では、十分な増幅効率を実現するためには、ＡＴＰ再生系（例えばクレアチンキナーゼとホスホクレアチン）を反応中に共存させる必要がある（例えば非特許文献１３）。このような付加的な試薬やタンパク質の必要性は、反応組成を複雑にし、このことは反応の至適化を困難にしたり、反応のコストを上昇させる原因となる。
以上のように、等温状態で実施可能ないくつかの標的核酸増幅法が考案されており、それらはいずれも温度サイクリング装置が不要で、ＰＣＲ法に比して利点を有している。また上に例示した以外にも、いくつか標的核酸を等温で増幅する方法が開示されている。しかしながらこれらの方法にも、それぞれ一長一短がある。またいくつかの核酸増幅法では、その原理の性質上、プライマーの設計において、ＰＣＲ用プライマーの設計に比してより大きな制約があり、ある種の核酸配列を標的とした場合には、該配列を好適に増幅するプライマーを設計することが不可能または困難であるという場合がある。このような背景のもと、新しい等温標的核酸増幅法の開発が求められていた。
特許第２０９３７３０号公報 特許第２０９３７３１号公報 特許第２６２２３２７号公報 特許第１８１４７１３号公報 特許第２５０２０４１号公報 特許第２６１３８７７号公報 米国特許５４５５１６６号明細書 米国特許５７１２１２４号明細書 米国特許５６４８２１１号明細書 米国特許５７４４３１１号明細書 国際公開第９９／０９２１１号パンフレット 国際公開第０１／９４５４４号パンフレット 国際公開第００／２８０８２号パンフレット 国際公開第００／５６８７７号パンフレット 米国特許５９１６７７７号明細書 国際公開第９７／０４１２６号パンフレット 国際公開第０４／０２７０２５号パンフレット 国際公開第０５／１１８８５３号パンフレット Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N : Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230, p.1350-1354 (1985) 木下朝博，下遠野邦忠：ＰＣＲ法によるＲＮＡの解析，蛋白質核酸酵素，35, p.2992-3002 (1990) Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA : Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 29, p.487-491 (1989) Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV, David DA, Gundry RA, Balis UJ : The LightCycler, a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques, 22, p.176-181 (1997) Walker GT, Little MC, Nadeau JG, Shank DD : Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc Natl Acad Sci USA, 89, p.392-396 (1992) Walker GT, Fraiser MS, Schram JL, Little MC, Nadeau JG, Malinowski DP : Strand displacement amplification - an isothermal, in vitro DNA amplification technique. Nucleic Acids Res, 20, p.1691-1696 (1992) Lizardi PM, Huang X, Zhu Z, Bray-Ward P, Thomas DC, Ward DC : Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet, 19, p.225-232 (1998) Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T : Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res, 28, E63, (2000) Nagamine K, Hase T, Notomi T : Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes, 16, p.223-229 (2002) 嶌田雅光、日野文嗣、佐川裕章、向井博之、浅田起代蔵、加藤郁之進：等温遺伝子増幅法（ICAN）による結核菌検出試薬の開発、臨床病理、50、p.528-532 (2002) Vincent M, Xu Y, Kong H : Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep, 5, p.795-800 (2004) An L, Tang W, Ranalli TA, Kim HJ, Wytiaz J, Kong H : Characterization of a thermostable UvrD helicase and its participation in helicase-dependent amplification. J Biol Chem, 280, p.28952-28958 (2005) Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA : DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol, 4, e204 (2006)
本発明の課題は、核酸の合成方法として有用な、標的核酸を選択的に増幅する方法および該方法による核酸の検出方法を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討した結果、エンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基を含有するオリゴヌクレオチドプライマー、エンドヌクレアーゼＶ、および鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下において、標的とする核酸配列領域のＤＮＡを合成する方法を見出し、核酸の増幅反応系を構築し、本発明を完成するに至った。なお本発明の方法は、エンドヌクレアーゼＶの核酸切断活性に依存した核酸増幅方法であり、本明細書中でＥＶＡ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と呼ぶ場合がある。
すなわち、本願は以下の発明を提供するものである。
１．以下の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、核酸配列の増幅方法。
（Ｉ）少なくとも以下を含有する反応混合物を調製する工程
(ｉ)鋳型核酸
(ｉｉ)デオキシリボヌクレオチド３リン酸
(ｉｉｉ)鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
(ｉｖ)エンドヌクレアーゼＶ
(ｖ)少なくとも１種類のプライマー（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。）
（ＩＩ）工程（Ｉ）で調製された反応混合物を、以下の反応が行える温度条件で増幅産物を生成するのに充分な時間インキュベートする工程
(ｉ)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
(ｉｉ)ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
(ｉｉｉ)エンドヌクレアーゼＶによる塩基Ｘを含む核酸鎖中の塩基Ｘの認識および該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合の切断反応
２．反応混合物中に少なくとも２種類のプライマーが含まれる、前項１に記載の核酸配列の増幅方法。
３．以下の工程（ａ）〜（ｆ）を含む、前項１または２に記載の核酸配列の増幅方法［ここで工程（ｃ）〜（ｆ）は連続的に反復される。］。
（ａ）少なくとも１種類のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ａ）で鋳型核酸にアニーリングさせたプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｃ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｂ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｃ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｅ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｄ）で生成された２本鎖核酸のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｆ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｅ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
４．以下の工程（ａ）〜（ｌ）を含む、前項１〜３のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法［ここで工程（ｃ）〜（ｆ）、および工程（ｉ）〜（ｌ）は連続的に反復される。］。
（ａ）少なくとも１種類の第１のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ａ）で鋳型核酸にアニーリングさせた第１のプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｃ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｂ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｃ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｅ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｄ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｆ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｅ）で新たに提供された第１のプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｇ）工程（ｄ）または（ｆ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、少なくとも１種類の第２のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、該鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（ｈ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｇ）で鋳型核酸にアニーリングさせた第２のプライマー鎖から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｉ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｆ）で生成された２本鎖核酸における第２のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｊ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｉ）で第２のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｋ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｊ）で生成された２本鎖核酸における第２のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｌ）工程（ｋ）でプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
５．さらに以下の工程（ｍ）〜（ｙ）を含む、前項４に記載の核酸配列の増幅方法［ここで工程（ｍ）〜（ｙ）は連続的に反復される。］。
（ｍ）工程（ｊ）または（ｌ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程（ａ）に記載の第１のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
（ｎ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｍ）で鋳型核酸にアニーリングした第１のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｏ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｎ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｐ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｏ）で第１のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｑ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｐ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｒ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｑ）で第１のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｓ）工程（ｐ）または（ｒ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程（ｇ）に記載の第２のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
（ｔ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｓ）で鋳型核酸にアニーリングした第２のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｕ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｔ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｖ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｕ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｗ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｖ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合を切断することによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｘ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｗ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｙ）工程（ｖ）または（ｘ）で鎖置換によって遊離した核酸が、鋳型核酸として工程（ｍ）に利用される工程
６．以下の(ｉ)〜(ｉｉｉ)のいずれか２または３が同一の鋳型核酸分子上で行われる、前項１〜５のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
(ｉ)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
(ｉｉ)ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
(ｉｉｉ)エンドヌクレアーゼＶによる塩基Ｘを含む核酸鎖中の塩基Ｘの認識および該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合の切断反応
７．鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによる、第１のプライマー鎖の３´末端からの鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成、および第２のプライマー鎖の３´末端からの鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成が、同一鋳型核酸分子上で互いに向かい合う方向で行われる、前項４または５に記載の核酸配列の増幅方法。
８．鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成が鋳型交換反応を伴う、前項７に記載の核酸配列の増幅方法。
９．各工程が等温で行われる、前項１〜８のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
１０．鋳型核酸が、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡまたは部分的に１本鎖領域を有する２本鎖ＤＮＡである、前項１〜９のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
１１．鋳型核酸が２本鎖ＤＮＡであり、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡにする工程の後に実施される、前項１０に記載の核酸配列の増幅方法。
１２．２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡにする工程が熱変性によって行われる、前項１１に記載の核酸配列の増幅方法。
１３．鋳型核酸がＲＮＡを鋳型とする逆転写反応によって得られたｃＤＮＡである、前項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
１４．ＲＮＡを鋳型とする逆転写反応によってｃＤＮＡを合成する工程の後に実施される、前項１３に記載の核酸配列の増幅方法。
１５．逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを逆転写酵素として逆転写反応に使用する、前項１３または１４に記載の核酸配列の増幅方法。
１６．鋳型核酸中の増幅する領域かつプライマーがアニーリングしない領域に、１塩基以上からなる未知の塩基配列領域が含まれる、前項１〜１５のいずれか１項に記載の方法による未知の核酸配列の増幅方法。
１７．反応混合物中に融解温度調整試薬が含まれる、前項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
１８．融解温度調整試薬がベタインである、前項１７に記載の核酸配列の増幅方法。
１９．反応混合物中に１本鎖核酸安定化剤が含まれる、前項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
２０．反応混合物に塩基Ｘを含有するプライマーがアニーリングする領域より上流側（５´側）の領域にアニーリングするアウタープライマーがさらに含まれる、前項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
２１．塩基Ｘが、ヒポキサンチン、キサンチン、ウラシル、オキサニンおよびＡＰサイト（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅまたはａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ）からなる群より選択されるものである、前項１〜２０のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
２２．塩基Ｘがヒポキサンチンまたはウラシルである、前項２１に記載の核酸配列の増幅方法。
２３．塩基Ｘの５´側に隣接する塩基がアデニンまたはチミンである、前項１〜２２のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
２４．塩基Ｘの３´側に隣接する塩基がアデニンまたはチミンである、前項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
２５．プライマーにおいて塩基Ｘより下流側（３´側）の塩基が存在しないか、またはプライマーの塩基Ｘより下流側（３´側）の塩基数が１〜５０塩基である、前項１〜２４のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
２６．プライマーにおいて塩基Ｘより上流側（５´側）の塩基数が１０〜１００塩基である、前項１〜２５のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
２７．プライマーに１以上のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドが含まれる、前項１〜２６のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
２８．プライマーの塩基Ｘの上流側（５´側）の全ヌクレオチド中のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドの含有量が６０％以下である前項２７に記載の核酸配列の増幅方法。
２９．修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチドのα位のリン原子に結合している酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）ヌクレオチドである、前項２７または２８に記載の核酸配列の増幅方法。
３０．鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バクテリオファージφ２９由来のｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス ステアロサーモフィラス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびバチルス カルドテナックス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ)由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼのいずれか１である、前項１〜２９のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
３１．エンドヌクレアーゼＶが、非特異的な核酸切断活性を示さず、かつ、特異的な核酸切断活性を示す変異型の特異的エンドヌクレアーゼＶである、前項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
３２．特異的な核酸切断活性がデオキシイノシン特異的な核酸切断活性である、前項３１に記載の核酸配列の増幅方法。
３３．変異型の特異的エンドヌクレアーゼＶが、野生型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列における、
（ａ）８０位のアミノ酸、またはサーモトガ・マリチマ(Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ)エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸が、他のアミノ酸Ｚ1に変異されており、かつ、
（ｂ）１０５位のアミノ酸、またはサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列における１０５位と同等位置のアミノ酸が、他のアミノ酸Ｚ２に変異されている、前項３１または３２に記載の核酸配列の増幅方法。
３４．アミノ酸Ｚ１がアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンのいずれか１である前項３３に記載の核酸配列の増幅方法。
３５．アミノ酸Ｚ２がアラニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、グリシン、セリン、トレオニンおよびヒスチジンのいずれか１である、前項３３または３４に記載の核酸配列の増幅方法。
３６．アミノ酸Ｚ１およびＺ２がともにアラニンである、前項３３〜３５のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
３７．野生型エンドヌクレアーゼＶが好熱性細菌または好熱性古細菌由来である、前項３３〜３６のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
３８．野生型エンドヌクレアーゼＶがサーモトガ・マリチマ由来である、前項３３〜３７のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
３９．野生型エンドヌクレアーゼＶが配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、前項３３〜３８のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
４０．エンドヌクレアーゼＶが耐熱性を有する、前項３１〜３９のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
４１．変異型の特異的エンドヌクレアーゼＶが配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、前項３１〜３６のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
４２．試料中の標的核酸を検出するための方法であって、前項１〜４１のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法により標的核酸を増幅する工程、該工程により増幅産物が生成したか否かを検知する工程を含む、標的核酸の検出方法。
４３．核酸の検出剤存在下で前項１〜４１のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法により標的核酸を増幅する工程、該工程により増幅産物が生成したか否かを検出剤由来のシグナル変化に基づいて検知する工程を含む、前項４２に記載の標的核酸の検出方法。
４４．エンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を指示する指示書を記録した媒体を含んでなる、前項１〜４１のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法に使用される、核酸増幅用試薬キット。
４５．少なくともエンドヌクレアーゼＶ、または少なくともエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有する、前項４４に記載の核酸増幅キット。
４６．エンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を指示する指示書を記録した媒体を含んでなる、前項４２または４３に記載の標的核酸の検出方法に使用される、核酸検出用試薬キット。
４７．少なくともエンドヌクレアーゼＶ、または少なくともエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有する、前項４６に記載の核酸検出用試薬キット。
４８．エンドヌクレアーゼＶが変異型エンドヌクレアーゼＶである前項４４〜４７のいずれか１項に記載の核酸増幅用試薬キット。
本発明の核酸増幅方法によれば、高価な温度サイクリング装置が不要な等温反応条件の下で核酸の合成と増幅を達成することができる。また、本発明の核酸増幅方法に使用するプライマーは、その設計上の制約が少ないという利点がある。
また、本発明の核酸増幅方法によれば、ＤＮＡ合成用の基質として、コスト高につながる修飾ｄＮＴＰ（例えばα−Ｓ−ｄＮＴＰなど）を大量に用いる必要がない。また、修飾ヌクレオチドを多量に含む核酸断片や、標的配列が何度も繰り返した異なる長さの核酸断片の混合物といった、次工程での利用に制約のあるような増幅産物を与えない、という利点がある。また、本発明の核酸増幅方法によれば、標的配列中に特定の制限酵素認識部位が存在するか否かに依存しないで、任意の配列領域を標的とすることができる。
さらに、本発明の核酸増幅方法において、環状の鋳型核酸を調製するための付加的な前工程は必須ではなく、またある1つの標的配列の増幅を達成するのに多数の領域に対して複雑かつ制約の多いプライマー配列の設計をするような必要がない。また、本発明の核酸増幅方法によれば、不安定で分解されやすいＲＮＡ成分をプライマー分子中に含有せしめる必要がない。また、本発明の核酸増幅方法によれば、反応に酵素活性のためのエネルギー供給物質としてのＡＴＰやｄＡＴＰなどのコファクターを反応中に大量に存在させる必要がなく、また反応中にＡＴＰ再生系を共存させる必要がない。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、「エンドヌクレアーゼＶ依存性増幅」（ＥＶＡ；Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と呼ぶ新しい増幅方法について記載する。本発明のＥＶＡではエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素の活性に基づいて反応が進行する。またＥＶＡの反応は、エンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で実施される。
本明細書において「エンドヌクレアーゼＶ」とは、国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法において酵素番号ＥＣ ３．１．２１．７として分類される酵素を示す。本酵素はデオキシイノシン ３´ エンドヌクレアーゼと呼ばれることもある。また本酵素は過去の分類において、ＥＣ ３．１．２２．３ あるいはＥＣ ３．１．−．−と記されていたこともある。なお、バクテリオファージＴ４由来のＤＮＡ修復酵素であるＴ４エンドヌクレアーゼＶは、類似した名前で呼ばれているが、これはＥ．Ｃ．３．１．２５．１に分類される酵素であり、本発明で記述するエンドヌクレアーゼＶとは異なる活性を有する酵素である。
本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸の塩基配列に従って新たな相補鎖の合成を行う場合に、合成の進行方向に存在する既に鋳型鎖と２本鎖を形成している古い相補鎖を、新生相補鎖に置き換えながら進行して、古い相補鎖を遊離させること、すなわち「鎖置換」、を行うことができる活性のことをいう。該活性による反応を「鎖置換反応」といい、該活性を有するＤＮＡポリメラーゼを「鎖置換型」ＤＮＡポリメラーゼともいう。
本明細書における「核酸」とは、２本鎖または１本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ分子を表し、さらにＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッドも表す。「２本鎖」とは、全体または一部が２本鎖であるような核酸分子のことをいう。２本鎖核酸分子は、ニックが入ったもの、無傷（ｉｎｔａｃｔ）のもののいずれであってもよい。２本鎖は、平滑末端を持つものであってもよいし、１本鎖テイル部分を有していてもよい。１本鎖核酸分子は、ヘアピンやループおよびステムの形状の二次構造を有していてもよい。
本発明に使用する核酸は、どのような供給源から調製または分離されたものでもよく、例えば、環境資源、食物、農産物、発酵物、生体の体液や組織、または細胞やウィルスなどの供給源から単離したものであってよい。生体の体液や組織とは、例えば、血液、乳、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺吸引液、粘膜組織や組織試料のスワブなどが含まれる。核酸試料は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む染色体外ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ＤＮＡ断片、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、または細胞やウィルス内に見られる他のＲＮＡのいずれかを含む。
また、本発明に使用する核酸は、単離したものでも、クローニングしたものでも、または化学的手法によって合成したものでもよい。上述の核酸のいずれかが、その核酸内の個々のヌクレオチドに化学的な変化（例えばメチル化）といった修飾を受けたものでもよい。該修飾は、自然に起こるものであっても、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成によって起こるものであってもよい。
本明細書において「実質的に相補的な」塩基配列とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリングすることのできる塩基配列を意味する。すなわち、実質的に相補的な塩基配列とは、対象となる塩基配列領域の全体に対して少数の非相補的な部分を有してもよいことを意味し、好ましくは、完全に相補的であるか１個〜数個の非相補的な塩基を有するものである。
本明細書において「３´末端側」および「３´側」とは、核酸鎖中のある領域もしくは位置から５´→３´の方向に見た場合に、該核酸鎖の３´末端に近い側あるいは方向を指す。また、核酸鎖の全体から見た場合には、該核酸鎖の中央より３´末端にかけての部分あるいは方向を指す。同義の用語として「下流側」も用いる。
本明細書において「５´末端側」および「５´側」とは、核酸鎖中のある領域もしくは位置から５´→３´の方向に見た場合に、該核酸鎖の５´末端に近い側あるいは方向を指す。また、核酸鎖の全体から見た場合には、該核酸鎖の中央より５´末端にかけての部分あるいは方向を指す。同義の用語として「上流側」も用いる。
本明細書において、酵素が「活性を示す」とは、ある特定のまたはある特定の範囲内の反応組成および反応条件の下で酵素が作用しうることを含み、また当該反応組成および反応条件の下においてのみ酵素が作用しうることも含む。これには至適な反応組成および反応条件の下において酵素が作用しうることも含まれる。
本明細書において、酵素が「活性を示さない」とは、酵素に完全に活性が無いことのみに限定されるものではなく、使用される条件の下で活性が検出されないこと、あるいは実質的に無視できるほど活性が小さいことも含まれる。
１．本発明の核酸配列の増幅方法
本発明は「エンドヌクレアーゼＶ依存性増幅」（ＥＶＡ）と呼ぶ本発明の増幅方法を提供する。ＥＶＡではエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素の活性に基づいて反応が進行する。また、ＥＶＡの反応は、エンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で実施される。
エンドヌクレアーゼＶ［ＥＣ ３．１．２１．７］は、デオキシイノシン３´エンドヌクレアーゼとも呼ばれ、ＤＮＡ鎖中のデオキシイノシンの塩基（ヒポキサンチン）を認識し、その近傍のホスホジエステル結合（主には認識塩基の３´側の第２番目のホスホジエステル結合）を加水分解する酵素である。
また、エンドヌクレアーゼＶはこのデオキシイノシン特異的な切断活性に加えて、ＤＮＡ鎖中のデオキシウリジンの塩基（ウラシル）、デオキシキサントシンの塩基（キサンチン）、デオキシオキサノシンの塩基(オキサニン)、およびＡＰサイト（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅまたはａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ）などを認識してＤＮＡ鎖を切断する活性も有している。
さらに、エンドヌクレアーゼＶは、塩基のミスマッチ、塩基の挿入／欠損、フラップ構造、偽Ｙ構造（ｐｓｅｕｄｏ−Ｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）などを含む多様なＤＮＡ構造を認識してＤＮＡ鎖を切断する活性も有している。エンドヌクレアーゼVあるいはそれをコードする遺伝子は、多くの生物種において見出され、あるいは単離されており、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のものについては、その性質が比較的良く調べられている。
上記のようなエンドヌクレアーゼＶの性質については、例えば下記の文献［１］〜［１１］に詳しく述べられている。
［１］Yao M, Hatahet Z, Melamede RJ, Kow YW :Purification and characterization of a novel deoxyinosine-specific enzyme, deoxyinosine 3’ endonuclease, from Escherichia coli. J Biol Chem, 269, p.16260-8 (1994).
［２］Yao M, Kow YW : Strand-specific cleavage of mismatch-containing DNA by deoxyinosine 3’-endonuclease from Escherichia coli. J Biol Chem, 269, p.31390-6 (1994).
［３］Yao M, Kow YW : Interaction of deoxyinosine 3’-endonuclease from Escherichia coli with DNA containing deoxyinosine. J Biol Chem, 270, p.28609-16 (1995).
［４］Yao M, Kow YW : Cleavage of insertion/deletion mismatches, flap and pseudo-Y DNA structures by deoxyinosine 3’-endonuclease from Escherichia coli. J Biol Chem, 271, p.30672-6 (1996).
［５］Yao M, Kow YW : Further characterization of Escherichia coli endonuclease V. Mechanism of recognition for deoxyinosine, deoxyuridine, and base mismatches in DNA. J Biol Chem, 272, p.30774-9 (1997).
［６］Zvonimir Siljkovic : Crystal structure of the DNA repair enzyme endonuclease V from Thermotoga maritima. Master's Thesis, Purdue University, Thesis p.46615 MS (2000).
［７］Huang J, Lu J, Barany F, Cao W : Multiple cleavage activities of endonuclease V from Thermotoga maritima: recognition and strand nicking mechanism. Biochemistry, 40, p.8738-48. (2001).
［８］Huang J, Lu J, Barany F, Cao W : Mutational analysis of endonuclease V from Thermotoga maritima. Biochemistry, 41, p.8342-50 (2002).
［９］Liu J, He B, Qing H, Kow YW : A deoxyinosine specific endonuclease from hyperthermophile, Archaeoglobus fulgidus: a homolog of Escherichia coli endonuclease V. Mutat Res, 461, p.169-77 (2000).
［１０］Hitchcock TM, Gao H, Cao W : Cleavage of deoxyoxanosine-containing oligodeoxyribonucleotides by bacterial endonuclease V. Nucleic Acids Res, 32, p.4071-80 (2004).
［１１］Feng H, Klutz AM, Cao W : Active Site Plasticity of Endonuclease V from Salmonella typhimurium. Biochemistry, 44, p.675-83 (2005).
本発明の核酸増幅方法を好ましく実施するには、反応に必要な物質が含まれる反応混合物を調製する工程と、該反応混合物を増幅産物を生成するのに充分な時間インキュベートする工程とを、実施すればよい。すなわち、本発明の好ましい１実施形態は、以下の（Ｉ）と（ＩＩ）の２つの工程を包含することによりなる核酸配列の増幅方法である；
（I）少なくとも以下を含有する反応混合物を調製する工程
(ｉ)鋳型核酸
(ｉｉ)デオキシリボヌクレオチド３リン酸
(ｉｉｉ)鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
(ｉｖ)エンドヌクレアーゼＶ
(ｖ)少なくとも１種類のプライマー（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（II）工程（Ｉ）で調製された反応混合物を、以下の反応が行える温度条件で増幅産物を生成するのに充分な時間インキュベートする工程
(ｉ)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
(ｉｉ)ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
(ｉｉｉ)エンドヌクレアーゼＶによる塩基Ｘを含む核酸鎖中の塩基Ｘの認識および該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合の切断反応。
また、本発明の１つの好ましい実施形態は、前記反応混合物中のプライマーが少なくとも２種類のプライマーであることを特徴とする方法である。
以下に本発明の核酸増幅方法によって核酸が増幅される反応の様式の例について、理解を助けるための模式図をもって説明する。なお本発明はこれらの様式によって限定されるものではない。
（１）実施形態１：少なくとも１つのプライマーを用いる場合
本発明の好ましい1実施形態は、以下の工程（ａ）〜（ｆ）を含む核酸増幅方法である［ここで工程（ｃ）〜（ｆ）は連続的に反復される。］。
（ａ）少なくとも１種類のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ａ）で鋳型核酸にアニーリングさせたプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｃ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｂ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｃ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｅ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｄ）で生成された２本鎖核酸のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｆ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｅ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
本実施形態の反応様式を説明するための模式図の一例を図１に表す。図１に示したように、本実施形態の核酸増幅反応の進行に伴い、プライマーを起点とした核酸鎖の合成が繰り返し行われ、標的核酸配列の増幅が達成される。本反応では、エンドヌクレアーゼＶの活性によってプライマー鎖の切断がなされる場合、塩基Ｘの下流側の近傍位置（主には塩基Ｘの３´側の第２番目のホスホジエステル結合）が切断されるため、該切断によって塩基Ｘはプライマー鎖中から除去されない。
本発明の核酸増幅方法において、エンドヌクレアーゼＶは塩基Ｘ近傍の相補鎖に存在するホスホジエステル結合は切断しないことが好ましい。当該エンドヌクレアーゼＶの能力のため、核酸増幅反応中にＤＮＡポリメラーゼの伸長の起点となる３´末端を何度でも提供することが可能となる。このことから、本実施形態では、理論的には鋳型となる核酸少なくとも１分子から、プライマー少なくとも１分子を介して、反応時間の経過に伴って増幅産物が蓄積される。理想的には反応は停止することなく継続され、実際的には核酸増幅反応中の各種成分（例えばＤＮＡ合成基質など）の濃度低下や枯渇、酵素の活性の低下または失活などの要因によってやがて停止する。
ＰＣＲや他のいくつかの増幅方法では起こり得るプライマーの枯渇は、本発明の核酸増幅方法では理論的には起こらない。本発明の好ましい実施形態においては、核酸増幅反応が停止するまで継続する必要は必ずしもなく、所望する増幅が達成されるのに充分な時間反応を実施すればよい。図１より、本実施形態においては、増幅産物が一次関数的に蓄積されることが理解できる。なお図１には、鋳型核酸が１本鎖の場合を表したが、実際には鋳型核酸は２本鎖であってもよい。
（２）実施形態２：第１のプライマーと第２のプライマーを用いる場合
本発明の好ましい1実施形態は、以下の工程（ａ）〜（ｌ）を含む核酸増幅方法である［ここで工程（ｃ）〜（ｆ）、および工程（ｉ）〜（ｌ）は連続的に反復される。］。
（ａ）少なくとも１種類の第１のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ａ）で鋳型核酸にアニーリングさせた第１のプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｃ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｂ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｃ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｅ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｄ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｆ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｅ）で新たに提供された第１のプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｇ）工程（ｄ）または（ｆ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、少なくとも１種類の第２のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、該鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（ｈ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｇ）で鋳型核酸にアニーリングさせた第２のプライマー鎖から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｉ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｆ）で生成された２本鎖核酸における第２のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｊ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｉ）で第２のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｋ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｊ）で生成された２本鎖核酸における第２のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｌ）工程（ｋ）でプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
本実施形態の反応様式を説明するための模式図の一例を図２に表す。図２に示したように、第１のプライマーと第２のプライマーを用いる場合、核酸増幅反応の進行にともなって、プライマーを起点とした核酸鎖の合成が繰り返し行われ、標的核酸配列の増幅が達成される。また、本実施形態では、第１のプライマーを起点とした核酸鎖の合成と、第２のプライマーを起点とした核酸鎖の合成が、それぞれ繰り返し行われ、標的核酸配列の増幅が達成される。本実施形態では、理論的には鋳型核酸少なくとも１分子から、第１のプライマー少なくとも１分子と第２のプライマー少なくとも１分子を介して、反応時間の経過に伴って増幅産物が蓄積される。
本実施形態の場合も、理想的には核酸増幅反応は停止することなく継続される。また、第１のプライマーと、第２のプライマーのいずれについても、理論的には核酸増幅反応の進行よってプライマーの枯渇が起こることはない。
図２より、本実施形態では、第１のプライマーを合成の起点として生じた増幅産物と、第２のプライマーを合成の起点として生じた増幅産物は、互いに相補的な核酸配列を有することが理解できる。従って、核酸増幅反応中にそれらの増幅産物の互いに相補的な核酸配列が２本鎖を形成することが可能であることは容易に理解でき、すなわち本実施形態では、増幅産物が２本鎖核酸として存在し得ることが理解できる。
（３）実施形態３：第１のプライマーと第２のプライマーを用いる場合
本発明の好ましい1実施形態は、以下の工程（ａ）〜（ｙ）を含む核酸増幅方法である［ここで工程（ｃ）〜（ｆ）、（ｉ）〜（ｌ）、および（ｍ）〜（ｙ）は連続的に反復される。］。本実施形態では、第２のプライマー鎖が伸長される下記工程（ｊ）および（ｌ）において、鎖置換反応によって遊離される核酸鎖に、再び第１のプライマーの核酸配列がアニーリング可能である。
（ａ）少なくとも１種類の第１のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ａ）で鋳型核酸にアニーリングさせた第１のプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｃ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｂ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｃ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｅ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｄ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｆ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｅ）で新たに提供された第１のプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｇ）工程（ｄ）または（ｆ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、少なくとも１種類の第２のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、該鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
（ｈ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｇ）で鋳型核酸にアニーリングさせた第２のプライマー鎖から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｉ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｆ）で生成された２本鎖核酸における第２のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｊ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｉ）で第２のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｋ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｊ）で生成された２本鎖核酸における第２のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｌ）工程（ｋ）でプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｍ）工程（ｊ）または（ｌ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程（ａ）に記載の第１のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
（ｎ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｍ）で鋳型核酸にアニーリングした第１のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｏ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｎ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｐ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｏ）で第１のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｑ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｐ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｒ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｑ）で第１のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｓ）工程（ｐ）または（ｒ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程（ｇ）に記載の第２のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
（ｔ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｓ）で鋳型核酸にアニーリングした第２のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
（ｕ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｔ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｖ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｕ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｗ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｖ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合を切断することによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
（ｘ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｗ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
（ｙ）工程（ｖ）または（ｘ）で鎖置換によって遊離した核酸が、鋳型核酸として工程（ｍ）に利用される工程
本実施形態の反応様式を説明するための模式図の一例を図３に表す。図３においては、エンドヌクレアーゼＶおよび鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを表す図形は省略している。本実施形態では、先に図２とともに説明した実施形態と同じ様式の増幅反応（すなわち工程（ａ）〜（ｌ））が起こるばかりでなく、さらに付加的な核酸鎖の合成の連鎖的サイクル（すなわち工程（ｍ）〜（ｙ））がもたらされる。本実施形態による標的核酸配列の増幅は、理論的には、鋳型核酸少なくとも１分子から、少なくとも２分子以上の第１のプライマーと少なくとも２分子以上の第２のプライマーのアニーリングを介して達成されることが、図３から理解される。
本実施形態の場合も、理想的には反応は停止することなく継続される。また、第１のプライマーと、第２のプライマーのいずれについても、理論的には反応の進行よってプライマーの枯渇が起こることはない。さらに、本実施形態においても、第１のプライマーを合成の起点として生じた増幅産物と、第２のプライマーを合成の起点として生じた増幅産物は、互いに相補的な核酸配列を有する。従って、反応中にそれらの増幅産物の互いに相補的な核酸配列が２本鎖を形成することが可能であり、増幅産物が２本鎖核酸として存在し得る。
なお図２および図３は、反応様式を簡便に説明する都合上、鋳型核酸が１本鎖の場合を表したが、実際には鋳型核酸は２本鎖であってもよい。鋳型核酸が２本鎖の場合には、該２本鎖を構成する各鎖について、図２および図３により説明したような増幅反応が起こる。すなわち、該２本鎖の鋳型の一方の鎖については、図２および図３を用いて説明したような増幅反応が起こることは既述したとおりだが、該鋳型のもう一方の鎖については、前記の図２および図３による説明において、前記第１のプライマーを新たに第２のプライマーと読み替え、かつ前記第２のプライマーを新たに第１のプライマーと読み替えれば、同じように増幅反応が起こることが理解できる。したがって、２種類のプライマーのどちらを第１のプライマーと見なしてもよく、２本鎖の鋳型のいずれの鎖において起こる増幅反応も、本発明の核酸増幅方法の実施形態に含まれるものである。
図１〜３は、本発明の実施形態の反応様式を簡便に説明する都合上、各工程を段階的に示した模式図であるが、現実の反応においては、各工程が同時多発的に起こり得ることは自明である。そのような場合の例を模式的に図４に表した。図４（ａ）は同一鋳型分子上で、エンドヌクレアーゼＶによる切断と２以上のＤＮＡポリメラーゼの伸長反応が起きている様子を模式的に表したものである。また、図４（ｂ）は鋳型より置換されている相補鎖に対して、プライマーのアニーリング、エンドヌクレアーゼＶによる切断、およびＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応と鎖置換反応が起きている様子を模式的に表したものである。本発明の範囲は図４に示した例に限定されるものではなく、またここで可能性のある全ての例を示すことはしないが、本発明の好ましい実施形態においては、核酸増幅反応中に、プライマーのアニーリング、エンドヌクレアーゼＶによる切断、およびＤＮＡポリメラーゼによる伸長と鎖置換などの複数の工程の、いずれかの２以上の工程が、同一の鋳型分子上で起こり得る。
また、図２および図３により示した、第１のプライマーと第２のプライマーを用いる実施形態においては、第１のプライマー鎖を起点としたＤＮＡポリメラーゼによる伸長および鎖置換と、第２のプライマー鎖を起点としたＤＮＡポリメラーゼによる伸長および鎖置換が、同一鋳型分子上で同時あるいはほぼ同時に互いに向かい合う方向で起こり得る。そのような場合の例を模式的に図５に示した（なお図５中、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを表す図形は省略している）。
図５（ａ）および（ｂ）は同一鋳型分子上で、両側からＤＮＡポリメラーゼによる伸長と鎖置換が、互いに向かい合う方向に起こっている様子を模式的に表したものである。このような場合、伸長鎖の合成の途中において、該伸長鎖のそれぞれの鋳型からもう一方の伸長鎖への鋳型の交換が行われる、いわゆる「鋳型交換反応」（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）が、ある確率で起こり得る。図５（ｃ）は鋳型交換反応を模式的に表し、図５（ｄ）は鋳型交換反応の後にＤＮＡポリメラーゼによる伸長が進行した様子を模式的に表す。本発明の１つの実施形態は、増幅反応中に鋳型交換反応を伴うことを特徴とする核酸配列の増幅方法である。
前記「鋳型交換反応」とは、２本鎖核酸の両側からの鎖置換反応による相補鎖の合成が行われる際に、ＤＮＡポリメラーゼがその鋳型を交換し、もう一方のＤＮＡポリメラーゼが新規に合成してきた相補鎖をそれぞれ鋳型として、以降の相補鎖合成を行う反応を言う。すなわち、鋳型となる２本鎖核酸をそれぞれのプライマーおよび鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼで処理し、該鋳型核酸に相補的な伸長鎖を生成せしめる反応において、該伸長鎖を合成中に、ＤＮＡポリメラーゼがプライマー伸長鎖を、当初の鋳型から、他方のプライマー伸長鎖へと能動的に鋳型をスイッチングせしめる反応を言う。ある条件下でこのような反応が起こり得ることは公知であり、例えば国際公開０２／１６６３９号パンフレットや「革新的な等温遺伝子増幅法（ＩＣＡＮ法）の開発」（宝酒造株式会社 ニュースリリース、２０００年９月２５日）などに開示されている。
上記のような、第１のプライマーと第２のプライマーを用いる実施形態では、図２に示した反応様式に加えて、さらに付加的な核酸鎖の合成の連鎖的サイクル（すなわち工程（ｍ）〜（ｙ））が起こり得ること、および／または、図５に示した鋳型交換反応が起こり得ること、から好ましい実施形態において指数関数的な増幅産物の蓄積が可能であることが理解される。また、第１のプライマーと第２のプライマーを用いる本発明の好ましい実施形態においては、主たる増幅産物は、２つのプライマーが鋳型核酸にアニールする位置に基づいて予測可能な長さのＤＮＡ断片となる。
以下に本発明に使用される各反応構成物および反応条件について、さらに詳しく説明する。
２．エンドヌクレアーゼＶ
本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶは、どのような生物あるいはウイルス由来のものであってもよいが、例えば細菌由来のものや古細菌由来のものが選択でき、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のものなどが挙げられる。また本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶは、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組換えタンパク質のいずれであってもよい。
本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶは、広く一般に市販されているものを用いることができる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶは、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社やＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社によって市販されている。また、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＶはＦｅｒｍｅｎｔａｓ社によって市販されている。
また、本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶは、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであってもよく、このようなエンドヌクレアーゼＶの例としては特願２００５−３０８５３３に開示された変異型エンドヌクレアーゼＶなどがある。
本発明におけるエンドヌクレアーゼＶの「特異的な核酸切断活性」とは、核酸分子に含まれる特定のヌクレオチドや塩基あるいは特定の構造、例えばデオキシイノシンまたはその塩基（ヒポキサンチン）、デオキシウリジンまたはその塩基（ウラシル）、デオキシキサントシンの塩基（キサンチン）、デオキシオキサノシンの塩基（オキサニン）、ＡＰサイト（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅまたはａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ）、塩基のミスマッチ、塩基の挿入／欠損、フラップ構造、偽Ｙ構造（ｐｓｅｕｄｏ−Ｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、あるいは天然のＤＮＡ中に見られる無傷の塩基（アデニン、チミン、グアニン、シトシン）のいずれかの誘導体またはその誘導体を含むヌクレオチド残基など、を当該酵素が認識し、その認識部位近傍のホスホジエステル結合を切断する活性を指す。例えば、エンドヌクレアーゼＶの「デオキシイノシン特異的な核酸切断活性」と言う場合は、前記の特異的な核酸切断活性の中の、デオキシイノシンまたはその塩基（ヒポキサンチン）に対する当該酵素の特異的な認識を伴う核酸切断活性を指す。
本発明におけるエンドヌクレアーゼＶの「非特異的な核酸切断活性」とは、前述の「特異的な核酸切断活性」に含まれない、当該酵素の核酸切断活性を指す。例えばＤＮＡ鎖のランダムニッキング活性などがこれに含まれる。エンドヌクレアーゼＶのそのような活性は、例えば、国際公開公報２００４／０４６３８３号パンフレットに開示されている。
本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶは、エンドヌクレアーゼＶの特異的な核酸切断活性のうち、少なくとも１種類の塩基に対する特異的な核酸切断活性を有していればよい。例えば、デオキシイノシンの塩基（ヒポキサンチン）、デオキシウリジンの塩基（ウラシル）、デオキシキサントシンの塩基（キサンチン）、デオキシオキサノシンの塩基(オキサニン)、およびＡＰサイト（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅまたはａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ）のうちの、少なくとも１種類に対する特異的な核酸切断活性を有していればよい。
本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶの好ましい特異的活性の例は、デオキシイノシン特異的またはデオキシウリジン特異的な核酸切断活性である。従って、本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶは、前記の少なくとも１種類の特異的な核酸切断活性を有していれば、それ以外の活性が、遺伝子工学的あるいはその他の手法による置換、欠失、付加、挿入等の改変によって、あるいは天然の性質として、消失しているものでもよい。
本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶは、非特異的な核酸切断活性を有していてもよいが、好ましくは、非特異的な核酸切断活性を示さず、かつ特異的な核酸切断活性を示すエンドヌクレアーゼＶがよい。そのようなエンドヌクレアーゼＶの例としては特願２００５−３０８５３３に開示された変異型エンドヌクレアーゼＶなどがある。本発明に使用する１つの好ましい変異型エンドヌクレアーゼＶの例は、特異的な核酸切断活性として、デオキシイノシン特異的な核酸切断活性を有する変異型エンドヌクレアーゼＶである。
また、本発明に使用する特異的エンドヌクレアーゼＶの好適な例は、野生型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列における（ａ）８０位のアミノ酸またはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸が他のアミノ酸Ｚ１に変異されており、かつ（ｂ）１０５位のアミノ酸またはサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸が他のアミノ酸Ｚ２に変異されていること、を特徴とする変異型の特異的エンドヌクレアーゼＶである。
本発明において、「サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸」および「サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸」とは、本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列を、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＤ３６９２７）と比較した場合に、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位および１０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
前記アミノ酸の位置は、それぞれのエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列と、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列の相同性を比較することによって容易に求められる。これには、例えば既製のソフトウェア（例えばＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発社製））などのアミノ酸配列相同性解析機能などを使用することができる。野生型エンドヌクレアーゼＶにおいて、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸としては例えばチロシンが、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸としては例えばアスパラギン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＣ７６９７２）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は７５位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は１００位のアスパラギン酸である。
例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＬ２２９９６）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は７３位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は９８位のアスパラギン酸である。
例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＢＡＤ７１１７０）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸はのチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は１０５位のグルタミン酸である。
例えば、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＣ１１６０２）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸はサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は１８３位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は２０４位のアスパラギン酸である。
例えば、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿１１１３００）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は１７８位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は１９９位のトレオニンである。
例えば、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿１４７２８６）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は４３位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は６８位のアスパラギン酸である。
例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿１２７０５７）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は６７位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は９０位のアスパラギン酸である。
例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｏ５８３９４）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は６７位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は９０位のアスパラギン酸である。
例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｑ９７４Ｔ１）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は７０位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は９３位のアスパラギン酸である。
例えば、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍエンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＺＰ＿０００５１８３１）においては、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸は８１位のチロシンであり、サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸は１０６位のアスパラギン酸が当該位置のアミノ酸である。
野生型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列における（ａ）８０位のアミノ酸またはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸、および（ｂ）１０５位のアミノ酸またはサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸に変異を与える場合、置換後のアミノ酸はどのようなアミノ酸であってもよい。
野生型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列における８０位のアミノ酸またはサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸と置換されるアミノ酸Ｚ１としては、例えばアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン等が好ましく、アラニンがより好ましい。野生型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列における１０５位のアミノ酸またはサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶの１０５位と同等位置のアミノ酸と置換されるアミノ酸Ｚ２としては、例えばアラニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、グリシン、セリン、トレオニン、ヒスチジン等が好ましく、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンがより好ましい。
本発明に使用する変異型エンドヌクレアーゼＶの元となる野生型エンドヌクレアーゼＶは、どのような生物あるいはウイルス由来のものでもよく、例えば細菌由来のものや古細菌由来のものが挙げらる。細菌由来のものや古細菌由来のエンドヌクレアーゼＶとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のエンドヌクレアーゼＶなどが挙げられる。細菌由来のものや古細菌由来の野生型エンドヌクレアーゼＶの好ましい例としては、好熱性細菌または好熱性古細菌由来のものが挙げられ、さらに好ましい例としてはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のものが挙げられる。また、変異型エンドヌクレアーゼＶの元となる野生型エンドヌクレアーゼＶの常温性細菌の由来の好ましい例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のものが挙げられる。
本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶの特異的活性のいかなる至適温度はいかなる温度であってもよく、本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶは例えば耐熱性を有するエンドヌクレアーゼＶであってもよい。本発明において酵素が「耐熱性」を有するとは、酵素が活性を示す至適温度が常温域（２０〜４０℃）よりも高い温度であることを示し、例えば酵素が活性を示す至適温度が中高温域（４５〜６５℃）、高温域（６０〜８０℃）、あるいは超高温域（８０℃以上または９０℃以上）の温度であることを示す。
本発明に使用する変異型の特異的エンドヌクレアーゼＶの好適な一例は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するエンドヌクレアーゼＶである。
３．塩基Ｘ
本発明の核酸増幅方法に使用するプライマーは、エンドヌクレアーゼＶによって認識され得る塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。本発明における塩基Ｘは、使用するエンドヌクレアーゼＶによって認識されうるものであればどの様なものであってもかまわないが、例えばヒポキサンチン（デオキシイノシンの塩基）、ウラシル（デオキシウリジンの塩基）、キサンチン（デオキシキサントシンの塩基）、オキサニン（デオキシオキサノシンの塩基）、ＡＰサイト（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅまたはａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ）、または天然のＤＮＡ中に見られる無傷の塩基（アデニン、チミン、グアニン、シトシン）のいずれかの誘導体などが挙げられる。本発明における塩基Ｘのいくつかの好適な例について、その構造を図６に示した。
本発明における塩基Ｘは、酵素学的手法、化学的手法、またはその他の公知の手法を適宜用いることによりオリゴヌクレオチドプライマー中に好適に存在させることができる。特に、ヒポキサンチンおよびウラシルは、当業者が通常行う化学的なプライマー合成の手法（例えばホスホアミダイト法など）において、他の通常の塩基（アデニン、チミン、グアニン、シトシンなど）と同様に、プライマー中の任意の位置に存在させることが可能である。
本発明における塩基Ｘは、鋳型核酸と相補的な塩基であってもよい。また、本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーが鋳型核酸に実質的に相補的であれば、本発明における塩基Ｘは、鋳型核酸と相補的でなくてもよく、ミスマッチを形成し得るものでもよい。ヒポキサンチンは、どのような塩基ともミスマッチを形成しないことが知られており、本発明における塩基Ｘとして好適に使用できる。
４．オリゴヌクレオチドプライマー
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはデオキシリボヌクレオチドで構成される。また、本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、１以上のリボヌクレオチドを含有していてもよい。本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはその３´末端からのＤＮＡ鎖の伸長が可能であるように、該３´末端に３´−ＯＨ基を有しているものがよい。しかし該３´−ＯＨ基は、本発明の好ましい実施形態において、エンドヌクレアーゼＶの核酸切断活性はプライマー鎖に新たな３´−ＯＨ基を有する３´末端を提供する能力があるため必須ではない。
本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば市販の自動ＤＮＡ合成装置を用いて、例えばホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。
本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、通常、該プライマーから向かって下流側に増幅しようとする領域があるような位置関係で鋳型核酸にアニーリングできるように設計される。該プライマーは、アニーリングさせようとする領域の塩基配列に対して実質的に相補的であるように設計される。該プライマーの設計は、当業者であれば、ＰＣＲ用のプライマー（および他の増幅方法のプライマー）の設計とほぼ同様な手法で設計することができる。一般的に、プライマーの塩基配列中に、使用される条件下においてプライマー間およびプライマー内で塩基対を形成しうる塩基配列を有するプライマーが好ましくない場合があることは当業者に公知である。また、そのような好ましくない塩基配列を避けたり最小限となるようにするなどして、好ましい塩基配列を有するプライマーを設計する手法は、当業者に公知である。
また本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列が、使用される条件下で好ましく鋳型核酸にアニーリングできるような塩基配列であることが好ましい。そのような塩基配列は、例えば、使用される条件下における該配列の融解温度、ＧＣ含量、塩基配列情報や長さなどに基づいて設計することができ、当該手法は当業者に公知である。好ましいプライマー塩基配列の設計には、例えば、「バイオ実験イラストレイテッド第３巻」（須磨春樹編、細胞工学別冊，、須磨春樹 編，秀潤社 発行，1996１９９６年、ｐ．１３〜５９）などを参考に設計することができ、また、例えば市販のプライマー設計ソフトウェア、例えば、ＯＬＩＧＯ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）などを使用することができる。
本発明に使用するプライマーの設計に際して、鋳型核酸上のプライマーがアニーリングする領域の塩基配列は既知であることが好ましいが、鋳型核酸上の該領域以外の領域の塩基配列は必ずしも既知でなくてもよい。さらに、鋳型核酸上のプライマーがアニーリングする領域の塩基配列が完全に明らかでなくても、該領域に実質的に相補的なプライマーの設計に必要とされる情報があればよい。例えば、該領域の塩基配列に、未知の置換、欠失、付加、挿入等の変異の可能性があってもよく、または、類推、予測される、若しくは推定される配列であってもよい場合がある。すなわち、本発明の好ましい実施形態においては、標的核酸の配列の全てが既知である必要はない。
本発明の核酸増幅方法によれば、既知の配列情報から、未知の核酸配列を含む増幅産物を得ることが可能となる。例えば、既知の配列情報から設計した少なくとも１種類のプライマーを用いることで、当該プライマーのアニールする領域から伸長反応が進行する方向に存在する未知の核酸配列を含む核酸を、増幅させることが可能である。また例えば、既知の配列情報から設計した少なくとも２種類のプライマーを用いることで、当該プライマーのアニールする領域によって規定される領域内の未知の塩基配列を含む核酸を増幅することが可能である。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、使用するエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる少なくとも１つの塩基Ｘを含有していればよい。本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーにおいて複数の塩基Ｘを含有する場合、該塩基Ｘは１種類の塩基に限定されず、プライマーの配列中に連続して存在または散在してもよい。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、塩基Ｘが、鋳型核酸に実質的に相補的なプライマーの塩基配列における５´側領域以外の部分に存在するものが好ましく、中央周辺ないし３´側領域に存在するものが好ましい。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に制限はないが、約１１〜１００塩基が好ましく、約１５〜５０塩基がより好ましい。また本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーにおける塩基Ｘより下流側（３´側）に塩基が存在しないか、または塩基Ｘより下流側（３´側）の長さの塩基数が約１〜５０塩基であることが好ましい。また、塩基Ｘより上流側（５´側）の長さは約１０〜１００塩基が好ましく、約１０〜５０塩基がより好ましい。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーの好適な例としては、塩基Ｘより下流側の長さが１〜３塩基で、塩基Ｘより上流側の長さが約１２〜３０塩基である、全長が１４〜３４塩基程度のプライマーである。また別の好適な例は、塩基Ｘより下流側の長さが約１５〜３０塩基で、塩基Ｘより上流側の長さが約１５〜３０塩基である、全長が３１〜６１塩基程度のプライマーである。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸に実質的に相補的な塩基配列の他に、該配列の上流側および／または下流側に鋳型核酸にアニーリングしない付加的な配列を、当該プライマーの機能を失わない範囲であれば有していてもよい。例えば鋳型核酸に実質的に相補的なプライマーの塩基配列の上流側に、当該付加的な配列を有していてもよい。該付加的な配列としては、例えば、制限酵素の認識配列、ＤＮＡ結合タンパク質の認識配列、他のタンパク質や核酸、または化学試薬に認識されうる配列、自己アニーリングによってヘアピン構造やステム・ループ構造を形成しうる配列、あるいは任意の塩基配列や無意味な塩基配列などが挙げられる。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、塩基Ｘの５´側の隣の塩基がアデニンまたはチミンであるか、塩基Ｘの３´側の隣の塩基がアデニンまたはチミンであるか、あるいはその両方であるものが好ましい。そのようなプライマーを用いると、好適にエンドヌクレアーゼＶにより切断され、より好適に核酸配列が増幅される。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの機能を失わない範囲で１以上の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。プライマーの塩基Ｘの上流（５´）側における全ヌクレオチドのうち、該修飾ヌクレオチドの含有量は６０％以下とすることが好ましく、１個から６０％の範囲内とすることがより好ましい。該修飾ヌクレオチドとしては、特に限定されないが、例えばヌクレアーゼ活性による切断に耐性を付与するような性質のヌクレアーゼ耐性修飾ヌクレオチドが挙げられる。該ヌクレアーゼ耐性修飾ヌクレオチドの例としては、ヌクレオチドのα位のリン原子に結合している酸素原子を硫黄原子に置換した（α−Ｓ）ヌクレオチドなどが挙げられる。当該修飾ヌクレオチドは、化学的な合成手法、例えばホスホアミダイト法などの公知の方法を適宜使用することにより、プライマー中の任意の位置に存在させることができる。当該修飾ヌクレオチドは、プライマーの配列中に複数連続して存在または散在してもよい。
本発明に使用するプライマーとして、１以上のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドを含有するプライマーを使用することは、エンドヌクレアーゼＶによるプライマーの非特異的な切断や、アニーリングしていないプライマーの切断を制御し得る点において有用である。該ヌクレアーゼ耐性修飾ヌクレオチド含有プライマーは、塩基Ｘの上流側と下流側の両方あるいは一方の領域に１以上の該修飾ヌクレオチドを含有してもよい。該ヌクレアーゼ耐性修飾ヌクレオチド含有プライマーの一例としては、塩基Ｘの上流側の領域に１以上の該修飾ヌクレオチドを含有したプライマーが挙げられる。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの機能を失わない限り、ランダムプライマーまたは縮重プライマーであってもよい。
本発明の核酸増幅方法に使用するオリゴヌクレオチドプライマーの種類は特に限定されないが、好ましくは少なくとも１種類または２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。本発明の核酸増幅方法においては、３種類以上のプライマーを用いてもよく、例えば異なる標的領域にアニーリングする３種類以上のプライマーを用いてもよい。また、例えば少なくとも２種類のプライマーからなる群を１つのプライマーセットとし、第１のプライマーセットと第２のプライマーセットを反応混合物中に共存させてもよく、３以上のプライマーセットを用いてもよい。このように、本発明の核酸増幅方法によれば、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）増幅を行うことも可能である。
本発明の核酸増幅方法においては、本発明に使用する塩基Ｘを含有するプライマーのアニーリングする領域よりも、該プライマーから見て上流側の領域にアニーリングする、付加的なプライマーをさら使用してもよい。本発明において、該付加的なプライマーを「アウタープライマー」という。アウタープライマーは、前記上流領域の核酸配列に対して実質的に相補的であり、その３´ 末端からのＤＮＡ鎖の伸長が可能であるように、該３´末端に３´−ＯＨ基を有しているものがよい。アウタープライマーの設計において、該プライマーの塩基配列、長さ、および融解温度は、該プライマーが使用される条件で好適にアニーリングできるようなものであれば、特に制限はない。本発明に使用される好ましいアウタープライマーの例は、該アウタープライマー使用のされる条件下の融解温度が、本発明に使用される塩基Ｘを含有するプライマーの使用される条件下の融解温度の約＋５℃〜約−１０℃の範囲、より好ましくは、ほぼ同じ温度〜約−５℃の範囲のものである。
本発明の核酸増幅方法に使用されるアウタープライマーの好ましいアニーリング位置は、塩基Ｘを含有するプライマーのアニーリング位置よりも上流であれば特に制限されないが、好ましくは該塩基Ｘを含有するプライマーのアニーリング位置から０塩基〜約１００塩基、好ましくは０塩基〜約６０塩基離れた位置が好ましい。
本発明の核酸増幅方法において、アウタープライマーは必須ではないが、アウタープライマーの使用がより良好な増幅産物の産生をもたらす場合がある。
本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの機能を失わない範囲で、蛍光または化学発光標識、およびビオチン標識などで修飾されていてもよい。また他の標識の例としては、放射性同位体元素や発色団などが挙げられる。また他の標識の例としては、直接は検出できないが標識物質と特異的に結合する物質（例えばアビジンなど）との反応によって間接的に検出可能となるような物質、例えばハプテンや抗体などが挙げられる。
また本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの機能を失わない範囲で、それ自身を固相に結合させてもよい。該プライマーは、直接的に固相に結合させてもよいし、また、直接は固定されないがその特異的結合相手（例えばアビジンなど）を介して固定化可能な、ハプテンや抗体などによって、間接的に固相に結合させてもよい。
５．鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ
本発明には、ＤＮＡの鎖置換活性を有する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。また、該鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５´→３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないものが特に好ましい。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有するものであれば特に限定されず、例えば以下のようなものが挙げられる：
大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、
バクテリオファージφ２９由来のｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、
バクテリオファージＴ７由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＳｅｑｕｅｎａｓｅなど）、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼなど）、
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＤｅｅｐ ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼやＤｅｅｐ ＶｅｎｔＲ （ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼなど）、
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼやＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼなど）、
Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＺ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼやＴｏｐｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど）、
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ΔＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなど）、
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ−７由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（例えば９°Ｎｍ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅやＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ （ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼなど）および、
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼなど）。
本発明に使用するＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応を行う能力を有していてもよい。
本発明に使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、天然資源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組換えタンパク質のいずれであってもよい。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであってもよい。
本発明に使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの特に好ましい例として、古くから使用されている大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片や、鎖置換活性が特に高いことが知られるバクテリオファージφ２９由来のｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
６．鋳型核酸
本発明の核酸増幅方法における鋳型核酸は、該核酸を含む可能性があるいかなる供給源から調製または単離したものでもよい。このような核酸を含む供給源は、例えば、環境資源、食物、農産物、発酵物、生体の体液や組織、または細胞やウィルスなどが挙げられる。生体の体液や組織とは、例えば、血液、乳、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺吸引液、粘膜組織や組織試料のスワブなどが含まれる。また、これらの試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であってもよい。また鋳型核酸は、前記の試料等または核酸含有調製物より、公知の方法で増幅したＤＮＡやＲＮＡ等の核酸でもよい。また、制限酵素や他の核酸切断または分解酵素などによって、完全にまたは部分的に処理されたものでもよい。
本発明の鋳型核酸として特に限定されないが例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいはＰＣＲや他の増幅方法による増幅産物のような２本鎖ＤＮＡ、およびトータルＲＮＡやメッセンジャーＲＮＡなどから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような１本鎖ＤＮＡ等が、本発明の方法における鋳型となる核酸として好適に使用できる。また２本鎖ＤＮＡを完全にあるいは部分的に１本鎖ＤＮＡとなるように変性または不安定化させたものも好適に使用できる。
本発明の核酸増幅方法により、ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅する場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって調製したｃＤＮＡを、本発明の方法における鋳型核酸として好適に用ることができる。そのような逆転写によるｃＤＮＡの調製方法は公知である。
７．デオキシリボヌクレオチド３リン酸
本発明の核酸増幅方法に使用するデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）としては、ＤＮＡポリメラーゼによる一般的なＤＮＡ合成反応において通常使用する基質、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。また、該ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのいずれか１以上のｄＮＴＰを含まないｄＮＴＰであってもよい場合もある。
また本発明に使用するｄＮＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼの基質となり得るものであれば、他のｄＮＴＰまたはｄＮＴＰの誘導体を含んでいてもよい。他のｄＮＴＰまたはｄＮＴＰの誘導体の例としては、、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、α位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたα−Ｓ−ｄＮＴＰ、放射性同位体元素や蛍光物質などで標識されたｄＮＴＰ等が挙げられる。
８．エンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼの組合せ
本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼの組合せは、上述の好ましいエンドヌクレアーゼＶと、上述の好ましいＤＮＡポリメラーゼとで、好適な組合せを選択すればよい。すなわち、核酸増幅反応の反応混合物中において、エンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼがそれぞれ好適に作用し得るような組合せが好ましい。好ましくは、同じ温度条件下で、エンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼがそれぞれ好適に作用し得るような組合せがよい。例えば、エンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼがともに常温性の酵素である組合せや、エンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼがともに耐熱性の酵素である組合せが好ましい。
好ましい組合せの例としては、これに限定されないが、エンドヌクレアーゼＶが、大腸菌由来のエンドヌクレアーゼＶまたはそれに置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであって、ＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片若しくはバクテリオファージφ２９由来のｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらのいずれかに置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものである組合せが挙げられる。また別の好ましい組合せの例としては、エンドヌクレアーゼＶが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のエンドヌクレアーゼＶまたはそれに置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたもの、例えば特願２００５−３０８５３３に開示されたＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来の変異型エンドヌクレアーゼＶであって、ＤＮＡポリメラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはそのいずれかに置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものである組合せが挙げられる。また、２種類以上のエンドヌクレアーゼＶまたは２種類以上のＤＮＡポリメラーゼを含む組合せであってもよい。
また本発明に使用するエンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼは、それぞれの酵素活性を失わない限りにおいて、両酵素が結合した形で提供されてもよい。例えば、エンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼを融合タンパク質として提供してもよい。当該融合タンパク質は、例えば公知の遺伝子工学的手法によって、両酵素をコードする遺伝子から融合遺伝子を作製し、該融合遺伝子を用いて組換えタンパク質として調製することができる。
９．反応混合物の組成
本発明の核酸増幅方法における反応混合物は、酵素活性に好適な条件（例えばｐＨ、金属イオン濃度、塩濃度など）を与える緩衝剤、金属イオン供給物質、塩類などを含有することが好ましい。緩衝剤としては、特に限定されないが、当業者が通常使用する公知の緩衝剤、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、キャプス（ＣＡＰＳ）、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などが挙げられる。
前記金属イオン供給物質としては、当業者が通常使用する公知の物質でよく、特に限定されないが、例えば所望する金属イオンがＭｇ２＋の場合は、例えば塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。また塩類も当業者が通常使用する公知の物質でよく、特に限定されないが、例えば塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどを用いることができる。なお当然であるが、これらの物質の好適な選択および好適な濃度は、使用する酵素の種類と組合せに応じて変わり得る。さらに、これらの物質が核酸の融解温度に影響を及ぼし得ることや、ｄＮＴＰが金属イオンをキレートし遊離の金属イオン濃度に影響を及ぼし得ることなどが公知であり、当業者であればこれらの事実も勘案して至適な反応組成を選択することができる。
前記反応混合物における緩衝剤の濃度は、１〜１００ｍＭが好ましく、５〜５０ｍＭがより好ましい。また、緩衝剤のｐＨは、ｐＨ６．０〜９．５が好ましく、ｐＨ７．０〜８．８がより好ましい。塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩の濃度は、０．２〜２０ｍＭが好ましく、２〜１２ｍＭがより好ましい。また、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの塩の濃度は１〜２００ｍＭが好ましく、２〜１２５ｍＭがより好ましい。
例えば、エンドヌクレアーゼＶとして特願２００５−３０８５３３に開示されたＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来の変異型エンドヌクレアーゼＶを、ＤＮＡポリメラーゼとしてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、好ましい緩衝剤の例としてはヘペスなどが挙げられ、該緩衝剤の濃度は５〜３０ｍＭが好ましく、ｐＨはｐＨ７．０〜８．８が好ましい。
前記反応混合物における各デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）の濃度は、０．１〜３．０ｍＭが好ましく、０．２〜１．２ｍＭがより好ましい。
前記反応混合物における各プライマーの量は、反応混合物５０μｌあたり１０〜１０００ｐｍｏｌが好ましく、１〜２００ｐｍｏｌがより好ましい。アウタープライマーを使用する場合、アウタープライマーの量は対応する塩基Ｘ含有プライマーの量に対して、等〜１／１００モル量が好ましく、１／４〜１／５０モル量がより好ましい。
前記反応混合物における酵素の量は、反応混合物５０μｌあたりエンドヌクレアーゼＶは１〜１０００ｐｍｏｌが好ましく、ＤＮＡポリメラーゼは０．２〜３２Ｕが好ましい。ただし、酵素の量は、使用する酵素の種類や性質、および組合せによって適宜変化し得る。また酵素の活性を表す単位Ｕ（ユニット）は、酵素の種類や酵素標品の調製者によって定義が異なる場合があることは当業者には周知である。また、好適な増幅を達成するための酵素の至適量は、使用条件、プライマーの量、鋳型核酸の量、およびその他の反応組成などによっても変化し得る。
さらに、前記反応混合物中には、添加剤を共存させてもよい。該添加剤としては、特に限定されないが、例えば１０％以下のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３Ｍ以下のベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）、５％以下のホルムアミド、１００ｍＭ以下の塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、１％以下の界面活性剤（例えばＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００など）、１０％以下のグリセロール、１０％以下の糖類（デキストランなど）、１０％以下のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０ｍＭ以下のジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０.１％以下のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＳＳＢタンパク質（１本鎖結合タンパク質）などが挙げられる。
前記反応混合物中に融解温度調整剤を添加して、核酸の融解温度を調節してもよい。該融解温度調整剤としては、例えばベタイン、ジメチルグリシン、トリエチルアミン Ｎ-オキシド、ＤＭＳＯなどが挙げられ、特に好ましくはベタインが挙げられる。反応混合物中におけるベタインの濃度は、その等安定化（ｉｓｏｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）濃度である約５．２Ｍを超えない範囲が好ましく、０．３〜１．５Ｍがより好ましい。
反応混合物中に共存させる該添加剤として１本鎖核酸安定化剤を用いてもよい。１本鎖核酸安定化剤の例としては１本鎖核酸結合タンパク質が挙げられる。１本鎖核酸結合タンパク質の例としては、大腸菌ＳＳＢタンパク質（１本鎖結合タンパク質）、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４ファージｇｐ３２、あるいは他の生物・ウイルス由来のこれらに相当するタンパク質などが挙げられる。これらの１本鎖核酸結合タンパク質の反応混合物中の濃度は、当業者が適宜選択することが可能であるが、例えば、反応混合物５０μｌあたり大腸菌ＳＳＢタンパク質を０．５〜１．５μｇ、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質およびＴ４ファージｇｐ３２を０．５〜３μｇの範囲内とすることが好ましい。また、必要に応じてこれらの１本鎖核酸結合タンパク質とともにその補助因子（例えばＡＴＰやその誘導体など）を共存させてもよい。
１０．インキュベーション工程
本発明の核酸増幅方法において、反応混合物をインキュベートする工程は、（ｉ）鋳型核酸へのプライマーの特異的なアニーリング、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応および（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼＶによる塩基Ｘを含む核酸鎖中の塩基Ｘの認識および該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合の切断反応、が行える条件であれば特に限定はない。当該インキュベーション工程の温度条件は、変温あるいは等温のいずれであってもよく、等温がより好ましい。
本発明において「変温」とは、各反応の段階を好適に実施できるように反応温度を変化させることを意味する。例えば、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の各工程に適した温度に変化させることをいう。また変温のインキュベーション工程には、２本鎖核酸を１本鎖に変性させる温度条件を含んでもよい。また、本発明において「等温」とは、各反応の段階を実施する温度を変化させず、インキュベーション工程を実質的に一定の温度で実施することを意味する。
本発明の核酸増幅方法の利点として、インキュベーション工程における温度の上下、すなわち温度サイクリングが不要であるという点が挙げられる。したがって、本発明によれば等温核酸増幅法が可能となる。該等温核酸増幅法は高価な温度サイクリング装置を用いる必要とせず、反応混合物を実質的に一定の温度に保持すればよい。該反応混合物を実質的に一定の温度に保持する方法としては、特に限定されないが、例えば温度制御のための装置（例えばブロックインキュベータ）の使用、保温若しくは発熱の状態にある物体または物質と反応混合物との接触（例えば湯浴中に反応混合物の入った容器を存在させる、あるいは温石や懐炉などと反応混合物若しくは反応混合物の入った容器とを接触させるなど）が挙げられる。
前記等温核酸増幅法の温度条件は、エンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼが共に好適に活性を発揮し得る温度が好ましく、例えば約２０〜８０℃の範囲から選択される。例えば、エンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼがともに常温性の酵素である場合は、２０〜４０℃が好ましい。また、例えば、エンドヌクレアーゼＶが大腸菌由来のエンドヌクレアーゼＶまたはそれに置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであって、ＤＮＡポリメラーゼが大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片若しくはバクテリオファージφ２９由来のｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらのいずれかに置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであるには、３０〜４０℃が好ましく、３０℃または３７℃がより好ましい。
また、前記等温核酸増幅法の温度条件は、例えばエンドヌクレアーゼＶとＤＮＡポリメラーゼがともに耐熱性の酵素である組合せの場合は、５０〜８０℃が好ましい。また、例えばエンドヌクレアーゼＶが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のエンドヌクレアーゼＶまたはそれに置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたもの（例えば特願２００５−３０８５３３に開示されたＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来の変異型エンドヌクレアーゼＶ）であって、ＤＮＡポリメラーゼがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ若しくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、またはそのいずれかに置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものである場合には、５０〜７０℃が好ましく、５５〜６５℃がより好ましい。
また、前記等温核酸増幅法の温度条件は、反応混合物中におけるプライマーの非特異的アニーリングが低減され、かつ鋳型核酸配列にプライマーが特異的にアニーリングするような温度としてもよい。当該温度は、プライマーの使用する反応混合物中における融解温度を参考にして決めることができ、例えば約２０〜８０℃の範囲から選択される。勿論、先にインキュベーション温度を決めておき、当該温度の下で反応を好適に実施できるようにプライマー設計をしてもよく、あるいは融解温度調整剤やその他の反応構成物の種類や濃度を選択してもよい。
本発明の核酸増幅方法において、反応混合物をインキュベートする時間は、所望する増幅反応を達成するのに充分な時間であれば、特に制限はない。好ましいインキュベーション時間は、例えば４時間以内であり、より好ましくは２０分〜２時間である。
本発明の核酸増幅方法において、インキュベーション工程中の反応は理想的には継続されるが、実際には反応混合物中の各種成分の濃度低下や枯渇、酵素活性の低下または失活などの要因によって、反応が停滞または停止する場合がある。そのような理由によって、所望する増幅反応を達成することが困難な場合には、インキュベーション工程において、反応を継続するために必要な物質を、継続的または断続的に反応混合物中に供給してもよい。
本発明の核酸増幅方法においては、実質的に等温で増幅反応させる場合であっても、より好ましい増幅反応を達成するために熱変性段階（２本鎖核酸が完全あるいは部分的に１本鎖核酸となるように変性または不安定化させるようなインキュベーション段階）を最初に１回経る方がよい場合がある。例えば鋳型核酸が２本鎖ＤＮＡである場合には、該熱変性段階を経る方がよい場合がある。該熱変性段階としては、これに限定されないが、例えば９５℃で１〜１０分間程度インキュベーションする。また、変性段階を通じて酵素活性が完全にあるいは有意に失われる場合には、変性段階を実施した後に、該酵素活性が失活されない温度に調節した該反応混合物に、該酵素を添加し、続いて単一の温度でインキュベーションするのが好ましい。
しかしながら、本発明の核酸増幅方法においては、鋳型核酸が２本鎖ＤＮＡであっても、前記熱変性段階は必ずしも必要なわけではない。例えばベタインなどの融解温度調整剤が好適な濃度で反応混合物中に含まれていれば、鋳型核酸が２本鎖ＤＮＡであっても、熱変性段階を含まない工程で、好適な増幅反応が達成される場合がある。さらに、本発明の核酸増幅方法によれば、鋳型核酸が２本鎖ＤＮＡであっても、融解温度調整剤を使用することなく、かつ熱変性段階を含まない工程で、好適な増幅反応を達成することができる。従って、必要に応じてベタインなどの融解温度調整剤の使用、および熱変性段階の実施の有無を選択すればよい。
また、本発明の核酸増幅方法においては、前記熱変性段階の後で、増幅産物の蓄積を与える単一温度のインキュベーション前に、プライマーを鋳型核酸に好適にアニーリングさせるインキュベーション段階をさらに経ることが効果的な場合がある。ただし該アニーリング段階も必須ではなく、好ましくは不要であるから、当業者は必要に応じて該アニーリング段階の実施の有無を選択すればよい。
１１．標的核酸の検出方法
さらに本発明は、本発明の核酸増幅方法（ＥＶＡ）によって標的核酸を増幅する工程と、該工程により増幅産物が生成したか否かを検知する工程、を含むことを特徴とする標的核酸の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、様々な試料における標的核酸の存在あるいは不在の検出に用いることができる。
本発明の検出方法の使用は特に限定されないが、例えば、標的核酸が特定の核酸または特定の集団に属する生物またはウイルス由来の核酸である場合には、本発明の検出方法により被検試料中の該生物またはウイルスを検出することができる。該生物が病原体である場合には、被検試料中の病原体を検出することができる。また、生物の遺伝子型の判別や遺伝子の発現状態の解析、疾病関連遺伝子や薬剤反応性関連遺伝子等の検出などに本発明の方法を使用することもできる。
本発明の検出方法では、増幅された核酸を様々な方法で検出することができ、核酸結合剤（例えば臭化エチジウムやＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなど）を用いる染色、および、放射性物質、蛍光物質、蛍光消光物質または酵素などの種々の標識によって検出することができる。本発明の検出方法において、増幅産物が生成したか否かを検知するための手段は、特に限定されず、例えば電気泳動やハイブリダイゼーションアッセイ、あるいはそれらの組合せなどの常套的な手段を用いることができる。またＰＣＲや他の増幅方法の産物の検出に用いられる当業者に公知の種々の手段も本発明の核酸増幅方法による産物の検出に好適に使用できる。
例えば、増幅産物に実質的に相補的な配列を有する核酸をプローブとして用い、該プローブの増幅産物へのハイブリダイゼーションに基づくシグナルまたはシグナルの変化を検知してもよい。該プローブは固相に固定化されていても、されていなくてもよい。例えば、蛍光物質で標識した核酸プローブを用いて、その蛍光偏光の解消度の変化に基づいて増幅産物を検出する方法、すなわち蛍光偏光法［例えば「食品産業のための高機能バイオセンサー」（社団法人農林水産先端技術産業振興センター 高機能バイオセンサー事業部会 編、化学工業日報社発行、２００３年、ｐ．７３〜８２および２６１〜２９２、Tsuruoka M, Karube I: Rapid hybridization at high salt concentration and detection of bacterial DNA using fluorescence polarization. Comb Chem High Throughput Screen, 6, p. 225-34 (2003) ］によって検出してもよい。また、例えば、プローブのハイブリダイゼーションを、表面プラズモン共鳴による検出［例えば、Kai E, Sawata S, Ikebukuro K, Iida T, Honada T, Karube I : Detection of PCR products in solution using surface plasmon resonance. Anal Chem, 71, p.796-800 (1999)］や、水晶発振子マイクロバランス（ｑｕａｒｔｚ ｃｒｙｓｔａｌ ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）による検出［例えば、宮本敬久：ＰＣＲ法およびＤＮＡ固定化水晶振動子によるサルモネラ迅速検出法、日本食品微生物学会誌、１７、２０００年、ｐ．２１７−２２４］などで行ってもよい。
また本発明の検出方法では、核酸の増幅に伴って副次的に生成する物質を検知することによって、増幅産物が生成したか否かを検知してもよい。例えば核酸鎖の合成に伴ってｄＮＴＰから遊離されるピロリン酸またはその塩、例えばピロリン酸マグネシウムを、例えば濁度の測定や沈殿物の観察、あるいは酵素的方法［例えば、遠藤美砂子、齋藤紀行、丸山昇：食品病原微生物の簡易迅速検出方法の開発、平成１４年度 宮城県産業技術総合センター研究報告、１、２００２年、１０−１４］により検出してもよい。
本発明の検出方法において、増幅産物が生成したか否かを検知する工程は、本発明の核酸増幅方法における増幅工程の後に実施してもよいが、該増幅工程の実施中に行ってもよく、例えば標的核酸の増幅をリアルタイムにモニタリングしてもよい。そのような好ましい１つの実施形態としては、反応混合物中に核酸の検出剤を存在させておき、検出剤由来のシグナル変化に基づいて増幅産物を検知することが挙げられる。該核酸の検出剤の例としては、核酸結合剤（臭化エチジウムやＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなど）、標識核酸プローブ（例えば蛍光標識プローブや蛍光エネルギー転移プローブなど）等が挙げられる。また、核酸の検出剤はｄＮＴＰであってもよく、この場合、核酸鎖の合成に伴ってｄＮＴＰから遊離されるピロリン酸またはその塩、例えばピロリン酸マグネシウム、に基づくシグナルを、例えば濁度の測定などにより検出することができる。
１２．キット
本発明の１つの実施形態は、本発明の核酸配列の増幅方法に使用される試薬キット、すなわち核酸増幅試薬キットである。該キットは、エンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を指示した指示書を記録した媒体を含んでなることが好ましい。該キットはさらに、少なくともエンドヌクレアーゼＶ、または少なくともエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有することがより好ましい。
また別の本発明の実施形態は、本発明の核酸配列の検出方法に使用される試薬キット、すなわち核酸検出試薬キットである。該キットはエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を指示した指示書を記録した媒体を含んでなることが好ましい。該キットはさらに、少なくともエンドヌクレアーゼＶ、または少なくともエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有することがより好ましい。
本発明の核酸増幅キットおよび核酸検出キットには、使用する酵素の他に、使用者が本発明の方法を実施しやすいように、使用する酵素のためのあらかじめ調製された反応液、あるいは当該反応液を調製する材料となる緩衝液、基質または基質溶液、プライマー、およびマグネシウムイオンなどの金属イオンの供給物質などを必要に応じて構成要素としてもよい。また必要に応じて、核酸の検出剤を構成要素としてもよい。当該構成要素は、本発明の方法が好ましく実施できる濃度あるいは当該濃度の一定倍の濃度（例えば当該濃度の１０倍の濃度）の溶液として提供することができる。また当該構成要素は、１回あるいは複数回の反応に使用する量を、１つの容器中に存在させてもよい。また、本発明の方法を行うための手順や、その実施例などを記録した媒体なども、必要に応じて本発明のキットの構成要素としてもよい。
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。なお本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞野生型および変異型エンドヌクレアーゼＶの調製
（１）野生型エンドヌクレアーゼＶ遺伝子の作製
以下の手順で野生型エンドヌクレアーゼＶ遺伝子を取得した。まず、サーモトガ・マリチマＡＴＣＣ ４３５８９株を、理化学研究所微生物系統保存施設（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＪＣＭ）より購入した（ＪＣＭ Ｎｏ．１００９９）。該菌株液１ｍｌを所定の培地１００ｍｌに植菌して、嫌気条件下８０℃にて４８時間静置培養した。その培養液２０ｍｌを１３０００×ｇで、５分間遠心分離し、沈殿した菌体を１ｍｌの超純水に懸濁した。懸濁液を超音波破砕処理した後、１３０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し、サーモトガ・マリチマの染色体ＤＮＡが含まれる破砕上清液を取得した。
次に以下の手順に示すＰＣＲにより、サーモトガ・マリチマのエンドヌクレアーゼＶ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＤ３６９２７）を増幅した。サーモトガ・マリチマの破砕上清液１μｌを鋳型として、反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。緩衝液として、ＫＯＤ ｐｌｕｓ製品に添付された１０倍濃度の緩衝液（１０×ＫＯＤ−ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、配列番号３および４で表されるオリゴヌクレオチドをそれぞれ終濃度０．３μＭとなるように反応液に添加した。ｄＮＴＰ混合物は終濃度が０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。
サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用し、９４℃で２分間を１回、続いて９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で１分間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、超純水５０μｌで溶出した。精製操作の手順は、当該キットに付属の仕様書に従った。
得られた増幅産物を常法に従って、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列を有する大腸菌組換えタンパク質発現用ベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖｏｇｅｎ社製）へ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ（以下ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶという）のエンドヌクレアーゼＶ遺伝子の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。解読した配列は、既知のサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＥ００１８２３）と一致した。
（２）変異型エンドヌクレアーゼＶ遺伝子の作製
以下の手順で野生型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列に２重の部位特異的変異を導入した。まず、１つ目の変異導入として、野生型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列の８０位に位置するチロシンをコードする塩基配列を、アラニンをコードする塩基配列に置換（Ｙ８０Ａ変異）したエンドヌクレアーゼＶ遺伝子を作製した。ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＩＩ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、目的の塩基配列に部位特異的変異を導入した。鋳型としてｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶを５０ｎｇ、Ｙ８０Ａ変異導入用のプライマーとして配列番号５および６で示したオリゴヌクレオチドを用い、反応液の全量を５１μｌとした。反応液組成および操作手順は、キットに付属された仕様書に準じた。このようにしてＹ８０Ａ変異を導入した変異型エンドヌクレアーゼＶ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（以下、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ１という）を得た。
次に２つ目の変異導入として、上記の方法と同様に、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ１にコードされたエンドヌクレアーゼＶ（Ｙ８０Ａ）のアミノ酸配列の１０５位に位置するアスパラギン酸をコードする塩基配列を、アラニンをコードする塩基配列に置換（Ｄ１０５Ａ変異）した。鋳型としてｐＥＴ１６ＴｍａＥＶＭ１を、Ｄ１０５Ａ変異導入用プライマーとして配列番号７および８で表されるオリゴヌクレオチドを用いた。このようにして、Ｙ８０ＡおよびＤ１０５Ａの２重のアミノ酸変異が導入された変異型エンドヌクレアーゼＶ遺伝子を有する組換え体ＤＮＡ（以下、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２という）を得た。ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２のエンドヌクレアーゼＶ遺伝子の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読し、目的とする塩基の置換が存在することを確認した。また変異を導入した部分以外の塩基配列は、既知のサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ００１８２３）と一致した。以上のようにして変異型エンドヌクレアーゼＶの遺伝子を取得した。
（３）野生型および変異型エンドヌクレアーゼＶの発現と精製
大腸菌組換えタンパク質発現系を利用し、以下の手順で野生型エンドヌクレアーゼＶおよび変異型エンドヌクレアーゼＶを発現させた。野性型サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶ遺伝子を有するｐＥＴ１６ＴｍａＥＶ、または変異型サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶ遺伝子を有するｐＥＴ１６ＴｍａＥＶＭ２を用いて、宿主大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖｏｇｅｎ社製）を常法によって形質転換した。得られた形質転換体を、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地８ｍｌ（ペプトン １０ｇ／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）に接種し、培地のＯＤ６００が０．６になるまで３７℃にて振とう培養を行った。続いて、その培養液をアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地 ８００ｍｌに接種し、培地のＯＤ６００が０．６になるまで３７℃で振とう培養を行った。その後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（終濃度が１ｍＭ）を培養液に添加することによって目的タンパク質の発現を誘導し、３０℃にて５時間振とう培養を行った。その培養液を１３０００×ｇで１０分間遠心分離した。沈殿した菌体を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）を含む緩衝液［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌ］３０ｍｌに懸濁した。その懸濁液３０ｍｌを超音波破砕処理した後、１３０００×ｇで１０分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清を７５℃にて１５分間熱処理することによって、上清中に含まれる宿主大腸菌由来のタンパク質を変性させた。
その後、熱処理した液を１３０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を孔径０．２μｍのフィルターでろ過した後、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質精製用カラムＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、野生型エンドヌクレアーゼＶまたは変異型エンドヌクレアーゼＶを精製した。このとき緩衝液として、真空脱気した緩衝液Ａ［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＤＴＴ、］５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］および緩衝液Ｂ［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］を用いて、ステップワイズ溶出を行った。得られた溶出画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、予測される分子量に単一のタンパク質バンドが観測され、野生型エンドヌクレアーゼＶまたは変異型エンドヌクレアーゼＶが精製されたことを確認した。
以上の様にして調製した２重変異（Ｙ８０ＡおよびＤ１０５Ａ変異）サーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶ（以下、これを変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶという）を以下に示す実施例で使用した。
＜実施例２＞線状ＤＮＡ断片を鋳型とする増幅
（１）鋳型ＤＮＡの調製
ＥＶＡの鋳型として用いるＤＮＡ断片をＰＣＲによって調製した。ＰＣＲのための鋳型としてプラスミドｐＵＣ１８（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｌ０９１３６）を２０ｎｇ、プライマーとして配列番号９および１０で示したオリゴヌクレオチドを２０ｐｍｏｌ用いた。これらのプライマーは、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトを含む２４３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されるように設計したもので、かつデオキシイノシンをそれぞれ１つ含んでいる。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを使用し、反応バッファーおよびｄＮＴＰ混合物は同製品に付属されたものを用いた。
全量１００μｌのＰＣＲ反応液を調製し、ＰＣＲを行った。サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用し、９４℃で１分間を１回、続いて９４℃で３０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。反応終了後、得られたＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、超純水５０μｌで溶出した。精製操作は、当該精製キットに添付された取扱説明書に従った。精製された試料を１.５％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で、約２４０ｂｐの長さのＤＮＡ断片の存在を確認した。
（２）ＥＶＡによる増幅反応
実施例２（１）に記載の方法で調製したＤＮＡ断片を鋳型として用い、ＥＶＡ法による核酸増幅を実施した。プライマーとして配列番号９および１０で示したオリゴヌクレオチドを用いた。これらはそれぞれデオキシイノシンを１つ含む。エンドヌクレアーゼＶは、実施例１において取得した２重変異（Ｙ８０ＡおよびＤ１０５Ａ変異）を有するサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶ（以下、変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶという）を使用した。
ＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、２ｐｍｏｌ、２００ｆｍｏｌまたは２０ｆｍｏｌの各プライマー、１０ｆｍｏｌの鋳型ＤＮＡ、８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１９ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を、全量２５μｌとなるように調製した。また対照として、鋳型ＤＮＡを含まない同様の反応液も調製した。
調製した上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて２時間保温して反応させた。反応終了後、反応液５μｌを分取し、１.５％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムで染色後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無、およびその濃淡を確認した。その結果を図７に示す。
図７において、レーン１およびレーン８は分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）であり、レーン２、３および４は、プライマーをそれぞれ２ｐｍｏｌ、２００ｆｍｏｌおよび２０ｆｍｏｌ使用したＥＶＡ反応液を用いた結果である。また、レーン５、６および７は、それぞれ、プライマーを２ｐｍｏｌ、２００ｆｍｏｌおよび２０ｆｍｏｌ使用した鋳型ＤＮＡを含まないＥＶＡ反応液を用いた結果である。図７のレーン２および３において、増幅産物の予想されるサイズ付近に単一なバンドが検出され、目的とするＤＮＡ断片の増幅が確認された。一方、レーン５〜７（鋳型ＤＮＡを含まない反応）からは、増幅産物は検出されなかった。
（３）増幅産物の制限酵素消化
実施例２（２）で得られた増幅産物が、目的とする核酸配列を有するＤＮＡ断片であるかどうか確認するため、制限酵素による消化を行った。前記のプライマーを２ｐｍｏｌ使用したＥＶＡ反応液（図７、レーン２）を２０μｌ用いて、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて増幅産物を精製し、超純水３５μｌで溶出した。精製操作は、当該キットに添付された取扱説明書に従った。
精製した増幅産物を８μｌ用い、制限酵素ＢａｍＨＩ １０ＵまたはＨｉｎｄＩＩＩ １０Ｕ（ニッポンジーン社製）による制限酵素処理を行った。反応バッファーは酵素製品に付属されたバッファー溶液を使用した。２０μｌの反応液を調製し、３７℃にて１時間保温した。反応終了後、試料を１０μｌ分取し、１.５％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下でＤＮＡ断片のサイズを観測した結果を図８に示す。
図８において、レーン１は分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）、レーン２は制限酵素で処理していない増幅産物、レーン３はＢａｍＨＩ消化物、レーン４はＨｉｎｄＩＩＩ消化物である。増幅産物が特異的な増幅によって生成したものであれば、その塩基配列中にはＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識サイトがそれぞれ１ヶ所存在し、各酵素で消化したとき２つのＤＮＡ断片が生じる。予測される消化断片の長さは、ＢａｍＨＩ消化の場合は１０９ｂｐおよび１３４ｂｐ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化の場合は７９ｂｐと１６４ｂｐであった。レーン３および４に示したように、増幅産物をＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化した結果、元の増幅産物のバンドは消失し、消化物の予測された分子量付近にバンドが検出された。このことから、実施例２（２）で得られたＥＶＡの増幅産物は、目的とする核酸配列を有する特異的な増幅産物であることがわかった。
＜実施例３＞環状プラスミドＤＮＡを鋳型とする増幅（１）
環状プラスミドｐＵＣ１８を鋳型として用い、ＥＶＡ法により核酸を増幅した。プライマーとして、配列番号９および１０に示したオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトを含む約２４０ｂｐの領域であった。
ＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、４ｐｍｏｌの各プライマー、２ｆｍｏｌまたは２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を、全量５０μｌとなるように調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて２時間保温して反応させた。反応終了後、反応液５μｌを分取し、１.５％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムで染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無、およびその濃淡を確認した結果を図９に示す。
図９において、レーン１は分子量サイズマーカー １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）であり、レーン２および３は、それぞれ２ｆｍｏｌおよび２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８を鋳型としてＥＶＡを行った場合の結果である。レーン３に示したように、予測されるサイズの増幅産物の存在が検出された。
＜実施例４＞環状プラスミドＤＮＡを鋳型とする増幅（２）
鋳型として環状プラスミドｐＵＣ１８、プライマーとして、配列番号１１および１２に示したオリゴヌクレオチドを用いて、ＥＶＡ法による核酸増幅を実施した。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトを含む約２４０ｂｐの領域であった。
ＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ、４ｐｍｏｌの各プライマー、２ｆｍｏｌまたは２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を全量５０μｌとなるように調製した。
上記ＥＶＡ反応液を６５℃にて９０分間保温して反応させた。反応終了後、反応液５μｌを検体として１.５％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１０に示す。
図１０において、レーン１は分子量サイズマーカー １００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）、レーン２および３は、それぞれ２ｆｍｏｌおよび２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８を鋳型としてＥＶＡを行った場合の結果である。図１０に示したように、レーン２および３において予測されるサイズの増幅産物の存在が検出された。
＜実施例５＞環状プラスミドＤＮＡを鋳型とする増幅（３）
鋳型として環状プラスミドｐＵＣ１８、プライマーとして配列番号１３および１４に示したオリゴヌクレオチドを用いて、ＥＶＡ法により核酸を増幅した。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、約６３０ｂｐの領域であった。
ＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ、４ｐｍｏｌの各プライマー、２ｆｍｏｌまたは２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を全量５０μｌとなるように調製した。
上記ＥＶＡ反応液を６５℃にて９０分間保温して反応させた。反応終了後、５μｌの反応液を検体として１.５％ アガロースゲル電気泳動かけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１１に示す。
図１１において、レーン１および２はそれぞれ、２ｆｍｏｌおよび２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８を鋳型としてＥＶＡを行った場合の結果である。レーン３は分子量サイズマーカー１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）である。レーン１および２に示したように、予測される増幅産物のサイズである６３０ｂｐ付近の位置にＤＮＡ断片のバンドが検出された。
＜実施例６＞鋳型の熱変性段階を含むＥＶＡ
鋳型として環状プラスミドｐＵＣ１８、プライマーとして配列番号１３および１４に示したオリゴヌクレオチドを用いて、ＥＶＡ法により核酸を増幅した。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、約６３０ｂｐの領域であった。
以下の手順で反応液を調製した。まず、２種類の酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよび変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ）を除く全ての成分を含む反応液を全量４６μｌとなるように調製した。次に鋳型の熱変性のために、この反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよび変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌとなるようにＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、４ｐｍｏｌの各プライマー、２０ｆｍｏｌ ｐＵＣ１８、１６Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３．８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を６５℃にて１時間保温し反応させた。反応終了後、反応液５μｌを検体として、１.５％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無およびその濃淡を確認した結果を図１２に示す。
図１２において、レーン１は上記の方法による増幅産物、レーン２は分子量サイズマーカー１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）である。レーン１において、増幅産物の予測されるサイズである６３０ｂｐ付近にバンドを検出した。
＜実施例７＞プラスミド増幅産物の制限酵素消化
鋳型として環状プラスミドｐＵＣ１８、プライマーとして配列番号１１および１２に示したオリゴヌクレオチドを用い、ＥＶＡ法により核酸を増幅した。これらのプライマーを用いた場合の予測される増幅範囲は、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトを含む約２４０ｂｐの領域であった。
以下の手順で反応液を調製した。まず、使用する２種類の酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ）を除く全ての成分を含む反応液を全量９２μｌとなるように調製した。次にこの反応液を９５℃で５分間保持し、その後氷上で急冷した。続いて、反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量１００μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、０．５ｍＭ ベタイン、３２ｐｍｏｌの各プライマー、４ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、３２ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、７．６ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を６５℃で７５分間保温して反応させた。反応終了後、反応液５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で、約２４０ｂｐの増幅産物が得られたことを確認した。
上記反応で得られた増幅産物を制限酵素により消化して、目的とする核酸配列を有するＤＮＡ断片であるかどうか確認した。増幅反応後の反応液を９０μｌとり、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて増幅産物を精製し、超純水５０μｌで溶出した。精製操作は、当該精製キットに添付された取扱説明書に従った。得られた溶出液１０μｌを、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０Ｕ、ＨｉｎｄＩＩＩ ２０ＵまたはＸｈｏＩ １５Ｕ（ニッポンジーン社製）でそれぞれ消化した。緩衝液は各酵素製品に付属されたものを使用し、反応液は超純水で全量２０μｌに調製し、３７℃にて２時間保温して制限酵素により消化した。その後２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて、臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１３に示す。
図１３において、レーン１および６は分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）、レーン２は制限酵素処理していない増幅産物、レーン３はＨｉｎｄＩＩＩ消化物、レーン４はＢａｍＨＩ消化物、レーン５はＸｈｏＩ消化物である。増幅産物が特異的な増幅によって生成したものであれば、その塩基配列中には、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの認識サイトがそれぞれ１ヶ所存在し、各酵素で消化したとき２つのＤＮＡ断片が生じると予測された。ＨｉｎｄＩＩＩで消化したときに生じる断片は７９ｂｐおよび１６４ｂｐの長さであり、ＢａｍＨＩで消化したときに生じる断片は１０９ｂｐおよび１３４ｂｐの長さであった。一方、ＸｈｏＩ認識サイトは増幅領域内の核酸配列中に存在しないため、増幅産物は該酵素によって切断されないと予測された。レーン３および４に示したように、増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩで消化した結果、元の増幅産物のバンドは消失し、予測される消化物の分子量付近にバンドが検出された。レーン５において、ＸｈｏＩで処理した場合には、増幅産物が切断されなかったことを確認した。このことから、上記ＥＶＡ法により、目的とする特異的な増幅産物が得られたことがわかった。
＜実施例８＞本発明の核酸増幅方法の反応に必要な成分を示す対照試験
ＥＶＡのための反応液１を次の手順で調製した。まず、使用する２種類の酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ）を除く全ての成分を含む反応液を全量４６μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、０．５ｍＭ ベタイン、１６ｐｍｏｌの配列番号１１のプライマー、１６ｐｍｏｌの配列番号１２のプライマー、２ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３．８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
さらに上記ＥＶＡ反応液１と同様であるが、ＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼＶ、プライマーセット、ｄＮＴＰ、および鋳型ＤＮＡのいずれかを含まない反応液２〜６をそれぞれ調製した。調製したこれらのＥＶＡ反応液を、６５℃にて７５分間保温して反応させた。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて、臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１４に示す。
図１４において、レーンＭは、分子量サイズマーカー１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）であり、レーン１は全ての成分を含むＥＶＡ反応液１、レーン２〜６はいずれかの成分を含まない反応液２〜６による結果である。各ＥＶＡ反応液に含まれる成分を表１に示した。
この結果、全ての成分が含まれるＥＶＡ反応液１（レーン１）では予想されるサイズ付近にバンドが検出され、目的とする増幅産物が得られたことがわかった。一方、いずれかの成分を含まない反応液２〜６（レーン２〜６）においては、増幅産物は検出されなかった。従って、ＥＶＡの反応によって増幅産物を生成するためには、反応液中にＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼＶ、プライマー、ｄＮＴＰ、および鋳型ＤＮＡの存在が必要であることがわかった。
＜実施例９＞１種類のプライマーを用いた増幅
１種類のプライマーを用いたＥＶＡを実施した。プライマーは、配列番号１１または１２で示したオリゴヌクレオチドを用いた。
ＥＶＡ反応液を次の手順で調製した。まず、使用する２種類の酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ）を除く全ての成分を含む反応液を全量４６μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、０．５ｍＭ ベタイン、１６ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１１または１２のプライマー）、２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３．８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて３時間保温して反応させた。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１５レーン１〜４に示す。
図１５において、レーン１は分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）、レーン２は配列番号１１のプライマーを用いたＥＶＡ増幅産物、レーン３は配列番号１２のプライマーを用いたＥＶＡ増幅産物、レーン４はプライマーを反応液に加えなかったサンプルである。レーン２および３において、レーン全体にわたって増幅産物が検出され、１種類のプライマーを用いたＥＶＡによる核酸の増幅が示された。
また、上記と同様の手順で、２ｆｍｏｌ ｐＵＣ１８を鋳型としたＥＶＡ反応を実施した。そのときの電気泳動結果を図１５レーン５〜８に示した。図１５において、レーン５は分子量サイズマーカー １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、レーン６は配列番号１１のプライマーを用いたＥＶＡ増幅産物、レーン７は配列番号１２のプライマーを用いたＥＶＡ増幅産物、レーン８はプライマーを反応液に加えなかったサンプルである。この場合も同様に、レーン６およびレーン７において、レーン全体にわたって増幅産物が検出され、１種類のプライマーを用いたＥＶＡによる核酸の増幅が示された。さらに、配列番号１１のプライマーを用いた同様なＥＶＡ反応において、反応液に鋳型を加えなかった陰性コントロール（反応時間２時間）の電気泳動結果を図１５のレーン９〜１１に示した。
図１５において、レーン９は分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、レーン１０は鋳型２０ｆｍｏｌを反応液に添加したサンプル、レーン１１は鋳型を添加しなかったサンプルである。レーン１０において増幅産物が検出されたのに対して、レーン１１において反応中に鋳型が存在しないときには増幅産物が生成しないことを確認した。
＜実施例１０＞種々の反応組成・条件におけるＥＶＡ
（１）エンドヌクレアーゼＶの量
ＥＶＡ反応液中のエンドヌクレアーゼＶの量を３．８〜７７ｐｍｏｌの範囲としてＥＶＡを実施した。まず、反応液を次の手順で調製した。酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ）を除く全ての成分を含む反応液を全量４４μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、４ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号１１および１２のプライマー）、２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１９〜７７ｐｍｏｌの範囲の一定量の変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。調製したこれらのＥＶＡ反応液を、６５℃にて１時間保温して反応させた。
また上記と同様の手順で、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの各プライマー、２０ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、０または３．８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。調製したこれらのＥＶＡ反応液を、６５℃にて９０分間保温して反応させた。
反応終了後、各ＥＶＡ反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した。そのときの電気泳動の結果を図１６に示す。
図１６において、レーン１および７は、分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）、レーン２〜６はエンドヌクレアーゼＶの量を、それぞれ１９、２９、３８、５８および７７ｐｍｏｌとした場合の結果である。またレーン８はエンドヌクレアーゼＶを加えなかった場合、レーン９はエンドヌクレアーゼＶの量を３．８ｐｍｏｌとした場合の結果である。ここで実施した条件においては、エンドヌクレアーゼＶの量が３．８〜３８ｐｍｏｌの範囲の場合に、特異的な単一バンド（約２４０ｂｐ）の増幅産物が生成された（レーン２、３、４および９）。また、エンドヌクレアーゼＶを加えなかった場合は、全く増幅が観測されなかった（レーン８）。
（２）プライマーの量および鋳型の量
プライマーの量が異なるＥＶＡ反応液を調製し、ＥＶＡを実施した。まず、酵素を除く全ての成分を含む反応液を全量４６μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型ＴｍａエンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、２、４または８ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号１１および１２のプライマー）、２ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１９ｐｍｏｌまたは２９ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
また、上記と同様の手順で、鋳型の量が異なるＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの各プライマー、２００ａｍｏｌまたは２０ａｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１９ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて１時間保温して反応させた。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１７に示す。
図１７において、レーン１および７は、分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒである。レーン２〜４は、１９ｐｍｏｌのエンドヌクレアーゼＶ、それぞれ８、４、２ｐｍｏｌのプライマーを使用した場合の結果である。また、１９ｐｍｏｌのエンドヌクレアーゼＶ、１６ｐｍｏｌのプライマー、２００ａｍｏｌおよび２０ａｍｏｌの鋳型を用いた場合の結果はそれぞれレーン５および６である。レーン８〜１０は、２９ｐｍｏｌのエンドヌクレアーゼＶ、それぞれ８、４、２ｐｍｏｌのプライマーを用いた場合の結果である。これらの結果から、上記条件においては、４〜１６ｐｍｏｌのプライマー、また２０ａｍｏｌ、２００ａｍｏｌ、２ｆｍｏｌの鋳型量を使用した場合、特異的な単一バンド（約２４０ｂｐ）の増幅産物が得られることがわかった。
（３）塩化マグネシウム濃度およびｄＮＴＰ濃度
反応液中の塩化マグネシウム濃度を２〜１２ｍＭの範囲としてＥＶＡにより核酸を増幅した。まず、ＥＶＡ反応液を次の手順で調製した。酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ）を除く全ての成分を含む反応液を全量４７μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ へペスバッファー（ｐＨ７．４）、２、４、５、６、７、８または１２ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号１１および１２のプライマー）、２００ａｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１９ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃で１時間保温して反応させた。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後のアガロースゲルを臭化エチジウムで染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した。その結果、上記条件においては、塩化マグネシウムが終濃度４ｍＭの場合に最も明瞭に目的とする増幅産物が検出されることがわかった。
次に、反応液中のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）濃度を０．２〜１．０ｍＭとしてＥＶＡにより核酸を増幅した。まず、上記と同様の手順で、ＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、０．２、０．４、０．６、０．８または１．０ｍＭの各ｄＮＴＰ、１６ｐｍｏｌの各プライマー、２００ａｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１９ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
調製したこれらのＥＶＡ反応液を、６５℃で１時間保温して反応させた。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後のアガロースゲルを臭化エチジウムで染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した。その結果、上記条件においては、各ｄＮＴＰが終濃度０．２〜０．４ｍＭのとき、明瞭に目的とする増幅産物が得られることがわかった。
図１７のレーン５および６に、４ｍＭ 塩化マグネシウム、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、２００および２０ａｍｏｌの鋳型を用いた場合の結果をそれぞれ示した（他の反応組成、反応条件は上記と同様）。
（４）塩類の種類と濃度およびベタインの濃度
反応液中に共存させる塩類として酢酸カリウムを用い、その濃度を５０〜１５０ｍＭとしてＥＶＡにより核酸を増幅した。まず、ＥＶＡ反応液を次の手順で調製した。酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ）を除く全ての成分を含む反応液を全量４６μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、５０、７５、１００、１２５または１５０ｍＭの酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号１１および１２のプライマー）、２００ａｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３．８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて９０分間または２時間保温して反応させた。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後のアガロースゲルを臭化エチジウムで染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した。その結果、上記条件においては、酢酸カリウムが終濃度１００〜１２５ｍＭの範囲で目的とする増幅産物が得られることがわかった。
また、上記と同様の手順で、反応液中に共存させる塩類として塩化カリウム（１０〜１３０ｍＭ）を用いてＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１０、３０、５０、７０、９０、１１０または１３０ｍＭの塩化カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号１１および１２のプライマー）、２００ａｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、７．７ｐｍｏｌの変異型ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて２時間保温した。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した。その結果、上記条件においては、塩化カリウムが終濃度７０〜９０ｍＭとした場合、目的とする増幅産物が確認された。
さらに、上記と同様の手順でＥＶＡ反応液中のベタイン（Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルグリシン）の濃度を０．５〜１．５ＭとしてＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、０．５、１．０または１．５Ｍのベタイン、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号１１および１２のプライマー）、２００ａｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、３．８ｐｍｏｌの変異型ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて９０分間保温して反応させた。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１８に示す。
図１８において、レーン１は分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）であり、レーン２は終濃度１．５Ｍ ベタイン、レーン３は終濃度１．０Ｍ ベタイン、レーン４は終濃度０．５Ｍ べタインを用いた場合の結果である。この結果から、上記条件においては、ベタインの終濃度が０．５〜１．０Ｍの場合に目的とする増幅産物が得られることがわかった。
（５）インキュベーションの温度
反応のインキュベーションの温度を４８〜７０℃の範囲としてＥＶＡにより核酸を増幅した。まず、反応液を次の手順で調製した。酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ）を除く全ての成分を含む反応液を全量４６μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号１１および１２のプライマー）、２０ａｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１９ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を複数調製し、グラジエントサーマルサイクラーＭＪ Ｏｐｔｉｃｏｎ（エムジェイジャパン社製）上でそれぞれを４８〜７０℃の範囲の異なる一定温度に保持し、１時間インキュベートすることにより反応させた。反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した。その結果、上記条件においては、インキュベーション温度が６４℃のときに、良好な増幅が確認された。
＜実施例１１＞Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼを使用したＥＶＡ
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ）を使用し、ＥＶＡにより核酸を増幅した。反応液を次の手順で調製した。まず、酵素を除く全ての成分を含む反応液を全量４５．５μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼと変異型ＴｍａエンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号１１および１２のプライマー）、２ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、５ＵのＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、タカラバイオ社製）、３．８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６０℃にて１時間保温して反応させた。反応終了後、反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後のアガロースゲルを臭化エチジウムで染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した。そのときの電気泳動像を図１８のレーン5に示した。この結果、予測される長さの特異的なバンド（約２４０ｂｐ）が確認され、増幅産物が得られたことがわかった。
＜実施例１２＞アウタープライマーを用いたＥＶＡ
アウタープライマーを用いてＥＶＡにより核酸を増幅した。鋳型として環状プラスミドｐＵＣ１８を、プライマーとして配列番号１１および１２に示したオリゴヌクレオチドを、アウタープライマーとして配列番号１５および１６に示したオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号１５のアウタープライマーは、ｐＵＣ１８鋳型上において、配列番号１１のプライマーがアニーリングする領域の１７塩基ほど上流の位置にアニーリングするように設計した。また、配列番号１６のアウタープライマーは、ｐＵＣ１８鋳型上において、配列番号１２のプライマーがアニーリングする位置の１７塩基ほど上流の位置にアニーリングするように設計した。
ＥＶＡ反応液を次の手順で調製した。まず、酵素を除く全ての成分を含む反応液を全量４６μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと変異型ＴｍａエンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、０．５ｍＭ ベタイン、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの配列番号１１のプライマー、１６ｐｍｏｌの配列番号１２のプライマー、４ｐｍｏｌの配列番号１５のアウタープライマー、４ｐｍｏｌの配列番号１６のアウタープライマー、２０ａｍｏｌのｐＵＣ１８、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３．８ｐｍｏｌの変異型ＴｍａエンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて９０分間保温した。反応終了後、反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１８のレーン６に示す。この結果から、予測される長さの特異的なバンド（約２４０ｂｐ）が確認され、増幅産物が得られたことがわかった。
＜実施例１３＞非標的核酸の共存下における標的核酸の増幅
標的核酸配列を有する鋳型として環状プラスミドｐＵＣ１８を用い、標的ではない核酸（非標的核酸）が大量に存在する条件下で、ＥＶＡにより核酸を増幅した。
ＥＶＡ反応液を次の手順で調製した。まず、酵素を除く全ての成分を含む反応液を全量４６μｌとなるように調製した。次に反応液を９５℃にて５分間保持し、その後氷上で冷却した。続いて、その反応液にＢｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼと変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶを添加して混合し、最終的に全量５０μｌのＥＶＡ反応液［最終組成：１０ｍＭ ヘペスバッファー（ｐＨ７．４）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭ 酢酸カリウム、０．５ｍＭ ベタイン、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１６ｐｍｏｌの配列番号１１のプライマー、１６ｐｍｏｌの配列番号１２のプライマー、２ｆｍｏｌのｐＵＣ１８、１μｇのｐＥＴ１６ｂ、１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、３．８ｐｍｏｌの変異型Ｔｍａ エンドヌクレアーゼＶ、超純水］を調製した。ここで使用した環状プラスミドｐＥＴ１６ｂは、使用したプライマーの標的となる核酸配列を持っていない。また使用したｐＥＴ１６ｂの量は、増幅なしに電気泳動で観測可能なほど大量である。
上記ＥＶＡ反応液を、６５℃にて９０分間保温した。反応終了後、反応液から５μｌを分取して、２．０％ アガロースゲル電気泳動にかけて臭化エチジウムでゲルを染色した後、ＵＶ照射下で増幅産物の有無を確認した結果を図１８のレーン８に示す。なお、図１８のレーン７は分子量サイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社製）である。この結果、レーン８において、分子量の大きな大量のｐＥＴ１６ｂに由来するバンドとは別に、予測される長さの特異的なバンド（約２４０ｂｐ）が増幅産物として確認された。このことから、ＥＶＡ反応液中において、微量の標的核酸核酸配列の存在に対して、非標的核酸配列が大過剰に共存する場合でも、標的核酸配列のみが特異的に増幅されることがわかった。
＜実施例１４＞様々な変異型エンドヌクレアーゼＶを用いた増幅
実施例１（２）で作製したＹ８０ＡおよびＤ１０５Ａ変異を導入した変異型エンドヌクレアーゼＶ遺伝子を有する組換え体ＤＮＡ（ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２）を鋳型として用い、実施例１（２）と同様の方法で、アミノ酸Ｚ２をさらに別のアミノ酸に変えた変異型エンドヌクレアーゼＶの遺伝子を作製した。
表２に示すオリゴヌクレオチドを変異導入用プライマーとして用い、アミノ酸Ｚ２が、グリシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンの変異型エンドヌクレアーゼＶ遺伝子を有する組換え体ＤＮＡを作製した（それぞれ、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２−２、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２−３、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２−４、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２−５、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２−６、ｐＥＴ１６ ＴｍａＥＶＭ２−７と呼ぶ）。
さらに実施例１（３）と同様の方法で、各々の変異型エンドヌクレアーゼＶの発現と精製を行った。このようにして、アミノ酸Ｚ２が、グリシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンの変異型エンドヌクレアーゼＶ酵素標品を得た（それぞれ、ＴｍａＥＶＭ２−２、ＴｍａＥＶＭ２−３、ＴｍａＥＶＭ２−４、ＴｍａＥＶＭ２−５、ＴｍａＥＶＭ２−６、ＴｍａＥＶＭ２−７と呼ぶ）。これらの酵素はいずれも特願２００５−３０８５３３に開示されたエンドヌクレアーゼＶの切断活性測定法と同様の方法によって、野生型エンドヌクレアーゼＶよりも高い特異性を有し、実施例１で作製したＹ８０ＡおよびＤ１０５Ａ変異を導入した変異型エンドヌクレアーゼＶと同等またはそれ以上の高い特異性を有することが確認された。これらの酵素を用い、実施例８と同様の方法でＥＶＡを実施したところ、いずれの酵素もＥＶＡに使用できることが示された。さらに、アミノ酸Ｚ２がグルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンの変異型エンドヌクレアーゼＶ（ＴｍａＥＶＭ２−５、ＴｍａＥＶＭ２−６、およびＴｍａＥＶＭ２−７）は、実施例１で作製した変異型エンドヌクレアーゼＶよりもさらに特異性が高く、より好ましくＥＶＡに使用することができるエンドヌクレアーゼＶの例であることが示された。
＜実施例１５＞（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの使用
（α−Ｓ）ヌクレオチドを様々な位置および割合で含有するプライマーセットを用いて、実施例８と同様のＥＶＡ反応を実施した。使用したプライマーセットおよびその増幅結果を表３に示す。
表３から分かるように、プライマーセットＳ０１〜Ｓ０５を使用した反応では増幅産物が得られた。すなわち、プライマーの塩基Ｘの上流側の領域の全ヌクレオチドのうち、少なくとも１つ以上、約６０％以下のヌクレオチドが（α−Ｓ）ヌクレオチドであるプライマーセットでは増幅産物が得られた。一方、プライマーの塩基Ｘの上流側の領域の全ヌクレオチドが（α−Ｓ）ヌクレオチドであるプライマー（プライマーセットＳ０６）では増幅が起こらなかった。
＜実施例１６＞１本鎖核酸結合タンパク質の使用
実施例８と同様の反応組成のＥＶＡ反応液５０μｌ中に、さらに０．５〜３μｇの大腸菌ＳＳＢタンパク質（ＳＩＧＭＡ）、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質（ＮＥＢ）、またはＴ４ファージｇｐ３２（ＮＥＢ）をそれぞれ添加し、実施例８と同様の反応条件でＥＶＡを実施した。この結果、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質およびＴ４ファージｇｐ３２について、試験をした範囲において増幅反応が起きた。大腸菌ＳＳＢタンパク質では１．５μｇより多く添加した場合に増幅反応が起こらず、ＥＶＡ反応が阻害されることが示された。従って、ＥＶＡに用いる１本鎖核酸結合タンパク質の好ましい量は、反応混合物５０μｌ中に大腸菌ＳＳＢタンパク質は約０．５〜１．５μｇ、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質およびＴ４ファージｇｐ３２は約０．５〜３μｇの範囲内であることが分かった。
本発明の核酸増幅方法は、次の（１）〜（９）の利点を有しており、産業上非常に有用である。
（１）高価な温度サイクリング装置が不要な等温反応条件の下で核酸の合成と増幅を達成する核酸配列の増幅方法を提供できる。
（２）使用するプライマーが少なくとも１つの塩基Ｘを含んでいればよいことから、プライマー設計における制約が少ない。
（３）ＤＮＡ合成用の基質として、コスト高につながる修飾ｄＮＴＰ［例えばα−Ｓ−ｄＮＴＰなど）を大量に用いる必要のない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
（４）修飾ヌクレオチドを多量に含む核酸断片や、標的配列が何度も繰り返した異なる長さの核酸断片の混合物といった、次工程での利用に制約のあるような増幅産物を与えない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
（５）標的配列中に特定の制限酵素認識部位が存在するか否かに依存しないで、任意の配列領域を標的とすることのできる、核酸配列の増幅方法を提供できる。
（６）環状の鋳型核酸を調製するための付加的な前工程を必須としない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
（７）ある1つの標的配列の増幅を達成するのに多数の領域に対して複雑かつ制約の多いプライマー配列の設計をするような必要のない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
（８）不安定で分解されやすいＲＮＡ成分をプライマー分子中に含有せしめる必要のない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
（９）反応に酵素活性のためのエネルギー供給物質としてのＡＴＰやｄＡＴＰなどのコファクターを反応中に大量に存在させる必要がなく、また反応中にＡＴＰ再生系を共存させる必要のない、核酸配列の増幅方法を提供できる。
（１０）必ずしも標的核酸の配列の全てが既知である必要はなく、既知の限られた配列情報に基づいて設計したプライマーを用い、未知の核酸配列を含む増幅産物を得ることが可能である。
本発明の一態様である、少なくとも１つのプライマーを用いる核酸配列の増幅方法を説明するための模式図を示す。 本発明の一態様である、第1のプライマーと第２のプライマーを用いる核酸配列の増幅方法を説明するための模式図を示す。 本発明の一態様である、第1のプライマーと第２のプライマーを用いる核酸配列の増幅方法を説明するための模式図を示す。 本発明の一態様である、プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応若しくは鎖置換反応およびエンドヌクレアーゼＶによるホスホジエステル結合の切断反応のいずれか２または３が、同一の鋳型核酸上で行われる核酸配列の増幅方法を説明するための模式図を示す。 本発明の核酸の増幅方法の一態様における鋳型交換反応を説明するための模式図を示す。 本発明に使用する塩基Ｘおよび塩基Ｘを有するヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチドの場合）の例を示す図である。 線状ＤＮＡ断片を鋳型として、本発明の核酸増幅方法により得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。 本発明の核酸増幅方法により得られた増幅産物の制限酵素消化物のアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 環状プラスミドＤＮＡを鋳型として、本発明の核酸増幅方法により得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。 環状プラスミドＤＮＡを鋳型として、本発明の核酸増幅方法により得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。 環状プラスミドＤＮＡを鋳型として、本発明の核酸増幅方法により得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。 鋳型の熱変性段階を含む本発明の核酸増幅方法により得られた増幅産物のアガロースゲル電気泳動の写真を示す。 本発明の核酸増幅方法による増幅産物の制限酵素消化物のアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 本発明の核酸増幅方法における反応組成の必須成分を検討し、アガロース電気泳動像により解析した結果を示す図である。 １種類のプライマーを用いて、本発明の核酸増幅方法により得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。 本発明の方法により増幅された増幅産物をアガロース電気泳動像により解析した結果を示す図である。 本発明の方法により増幅された増幅産物をアガロース電気泳動像により解析した結果を示す図である。 本発明の方法により増幅された増幅産物をアガロース電気泳動像により解析した結果を示す図である。
配列番号１：エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列。
配列番号２：変異型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列。
配列番号３：エンドヌクレアーゼＶ遺伝子増幅用上流側プライマーとして設計されたＤＮＡ。
配列番号４：エンドヌクレアーゼＶ遺伝子増幅用下流側プライマーとして設計されたＤＮＡ。
配列番号５：Ｙ８０Ａ変異導入用オリゴヌクレオチド１として設計されたＤＮＡ。
配列番号６：Ｙ８０Ａ変異導入用オリゴヌクレオチド２として設計されたＤＮＡ。
配列番号７：Ｄ１０５Ａ変異導入用オリゴヌクレオチド１として設計されたＤＮＡ。
配列番号８：Ｄ１０５Ａ変異導入用オリゴヌクレオチド２として設計されたＤＮＡ。
配列番号９：デオキシイノシン含有プライマー ＰＩＴ３２１−０１として設計されたＤＮＡ。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号１０：デオキシイノシン含有プライマー ＰＩＴ５４１−０１として設計されたＤＮＡ。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号１１：デオキシイノシン含有プライマー ＰＩＴ３２１−０４として設計されたＤＮＡ。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号１２：デオキシイノシン含有プライマー ＰＩＴ５４１−０４として設計されたＤＮＡ。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号１３：デオキシイノシン含有プライマー ＰＩＴ１８４９−０２として設計されたＤＮＡ。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号１４：デオキシイノシン含有プライマー ＰＩＴ２４５４−０２として設計されたＤＮＡ。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号１５：アウタープライマー ＰＩＴ３２１−ＯＰ１として設計されたＤＮＡ。
配列番号１６：アウタープライマー ＰＩＴ５４１−ＯＰ１として設計されたＤＮＡ。
配列番号１７：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号１８：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号１９：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２０：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２１：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２２：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２３：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２４：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２５：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２６：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２７：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２８：変異導入用プライマーの塩基配列。
配列番号２９：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３０：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３１：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３２：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３３：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３４：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３５：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３６：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３７：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３８：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号３９：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。
配列番号４０：（α−Ｓ）ヌクレオチド含有プライマーの塩基配列。ヌクレオチド配列中のｉはデオキシイノシンを示す。

Claims (48)

  1. 以下の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、核酸配列の増幅方法。
    （Ｉ）少なくとも以下を含有する反応混合物を調製する工程
    (ｉ)鋳型核酸
    (ｉｉ)デオキシリボヌクレオチド３リン酸
    (ｉｉｉ)鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
    (ｉｖ)エンドヌクレアーゼＶ
    (ｖ)少なくとも１種類のプライマー（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである。）
    （ＩＩ）工程（Ｉ）で調製された反応混合物を、以下の反応が行える温度条件で増幅産物を生成するのに充分な時間インキュベートする工程
    (ｉ)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
    (ｉｉ)ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
    (ｉｉｉ)エンドヌクレアーゼＶによる塩基Ｘを含む核酸鎖中の塩基Ｘの認識および該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合の切断反応
  2. 反応混合物中に少なくとも２種類のプライマーが含まれる、請求項１に記載の核酸配列の増幅方法。
  3. 以下の工程（ａ）〜（ｆ）を含む、請求項１または２に記載の核酸配列の増幅方法［ここで工程（ｃ）〜（ｆ）は連続的に反復される。］。
    （ａ）少なくとも１種類のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
    （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ａ）で鋳型核酸にアニーリングさせたプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
    （ｃ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｂ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｃ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
    （ｅ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｄ）で生成された２本鎖核酸のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｆ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｅ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
  4. 以下の工程（ａ）〜（ｌ）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法［ここで工程（ｃ）〜（ｆ）、および工程（ｉ）〜（ｌ）は連続的に反復される。］。
    （ａ）少なくとも１種類の第１のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
    （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ａ）で鋳型核酸にアニーリングさせた第１のプライマーから、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
    （ｃ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｂ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｃ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
    （ｅ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｄ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｆ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｅ）で新たに提供された第１のプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
    （ｇ）工程（ｄ）または（ｆ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、少なくとも１種類の第２のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程（ここで該プライマーは、該鋳型核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、かつエンドヌクレアーゼＶによって認識されうる塩基Ｘを少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドプライマーである）
    （ｈ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｇ）で鋳型核酸にアニーリングさせた第２のプライマー鎖から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
    （ｉ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｆ）で生成された２本鎖核酸における第２のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｊ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｉ）で第２のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
    （ｋ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｊ）で生成された２本鎖核酸における第２のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｌ）工程（ｋ）でプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
  5. さらに以下の工程（ｍ）〜（ｙ）を含む、請求項４に記載の核酸配列の増幅方法［ここで工程（ｍ）〜（ｙ）は連続的に反復される。］。
    （ｍ）工程（ｊ）または（ｌ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程（ａ）に記載の第１のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
    （ｎ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｍ）で鋳型核酸にアニーリングした第１のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
    （ｏ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｎ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｐ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｏ）で第１のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
    （ｑ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｐ）で生成された２本鎖核酸における第１のプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｒ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｑ）で第１のプライマー伸長鎖に新たに提供された３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
    （ｓ）工程（ｐ）または（ｒ）で鎖置換によって遊離した核酸を鋳型核酸とし、工程（ｇ）に記載の第２のプライマーを該鋳型核酸にアニーリングさせる工程
    （ｔ）ＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｓ）で鋳型核酸にアニーリングした第２のプライマーから、鋳型核酸に相補的な伸長鎖を合成して２本鎖核酸を生成させる工程
    （ｕ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｔ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合が切断されることによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｖ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｕ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
    （ｗ）エンドヌクレアーゼＶによって、工程（ｖ）で生成された２本鎖核酸におけるプライマー伸長鎖中の塩基Ｘが認識され、該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合を切断することによりプライマー伸長鎖に新しい３´末端を提供する工程
    （ｘ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、工程（ｗ）で新たに提供されたプライマー伸長鎖の３´末端から、鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成による２本鎖核酸の生成と、鎖置換を行う工程
    （ｙ）工程（ｖ）または（ｘ）で鎖置換によって遊離した核酸が、鋳型核酸として工程（ｍ）に利用される工程
  6. 以下の(ｉ)〜(ｉｉｉ)のいずれか２または３が同一の鋳型核酸分子上で行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
    (ｉ)プライマーの鋳型核酸への特異的なアニーリング
    (ｉｉ)ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応および鎖置換反応
    (ｉｉｉ)エンドヌクレアーゼＶによる塩基Ｘを含む核酸鎖中の塩基Ｘの認識および該塩基Ｘより下流側（３´側）に位置するホスホジエステル結合の切断反応
  7. 鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによる、第１のプライマー鎖の３´末端からの鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成、および第２のプライマー鎖の３´末端からの鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成が、同一鋳型核酸分子上で互いに向かい合う方向で行われる、請求項４または５に記載の核酸配列の増幅方法。
  8. 鋳型核酸に相補的なプライマー伸長鎖の合成が鋳型交換反応を伴う、請求項７に記載の核酸配列の増幅方法。
  9. 各工程が等温で行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  10. 鋳型核酸が、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡまたは部分的に１本鎖領域を有する２本鎖ＤＮＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  11. 鋳型核酸が２本鎖ＤＮＡであり、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡにする工程の後に実施される、請求項１０に記載の核酸配列の増幅方法。
  12. ２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡにする工程が熱変性によって行われる、請求項１１に記載の核酸配列の増幅方法。
  13. 鋳型核酸がＲＮＡを鋳型とする逆転写反応によって得られたｃＤＮＡである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  14. ＲＮＡを鋳型とする逆転写反応によってｃＤＮＡを合成する工程の後に実施される、請求項１３に記載の核酸配列の増幅方法。
  15. 逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを逆転写酵素として逆転写反応に使用する、請求項１３または１４に記載の核酸配列の増幅方法。
  16. 鋳型核酸中の増幅する領域かつプライマーがアニーリングしない領域に、１塩基以上からなる未知の塩基配列領域が含まれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法による未知の核酸配列の増幅方法。
  17. 反応混合物中に融解温度調整試薬が含まれる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  18. 融解温度調整試薬がベタインである、請求項１７に記載の核酸配列の増幅方法。
  19. 反応混合物中に１本鎖核酸安定化剤が含まれる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  20. 反応混合物に塩基Ｘを含有するプライマーがアニーリングする領域より上流側（５´側）の領域にアニーリングするアウタープライマーがさらに含まれる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  21. 塩基Ｘが、ヒポキサンチン、キサンチン、ウラシル、オキサニンおよびＡＰサイト（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅまたはａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ）からなる群より選択されるものである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  22. 塩基Ｘがヒポキサンチンまたはウラシルである、請求項２１に記載の核酸配列の増幅方法。
  23. 塩基Ｘの５´側に隣接する塩基がアデニンまたはチミンである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  24. 塩基Ｘの３´側に隣接する塩基がアデニンまたはチミンである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  25. プライマーにおいて塩基Ｘより下流側（３´側）の塩基が存在しないか、またはプライマーの塩基Ｘより下流側（３´側）の塩基数が１〜５０塩基である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  26. プライマーにおいて塩基Ｘより上流側（５´側）の塩基数が１０〜１００塩基である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  27. プライマーに１以上のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドが含まれる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  28. プライマーの塩基Ｘの上流側（５´側）の全ヌクレオチド中のヌクレアーゼ耐性を示す修飾ヌクレオチドの含有量が６０％以下である請求項２７に記載の核酸配列の増幅方法。
  29. 修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチドのα位のリン原子に結合している酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）ヌクレオチドである、請求項２７または２８に記載の核酸配列の増幅方法。
  30. 鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バクテリオファージφ２９由来のｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス ステアロサーモフィラス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびバチルス カルドテナックス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ)由来の５´→３´エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼのいずれか１である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  31. エンドヌクレアーゼＶが、非特異的な核酸切断活性を示さず、かつ、特異的な核酸切断活性を示す変異型の特異的エンドヌクレアーゼＶである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  32. 特異的な核酸切断活性がデオキシイノシン特異的な核酸切断活性である、請求項３１に記載の核酸配列の増幅方法。
  33. 変異型の特異的エンドヌクレアーゼＶが、野生型エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列における、
    （ａ）８０位のアミノ酸、またはサーモトガ・マリチマ(Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ)エンドヌクレアーゼＶの８０位と同等位置のアミノ酸が、他のアミノ酸Ｚ1に変異されており、かつ、
    （ｂ）１０５位のアミノ酸、またはサーモトガ・マリチマ エンドヌクレアーゼＶのアミノ酸配列における１０５位と同等位置のアミノ酸が、他のアミノ酸Ｚ２に変異されている、請求項３１または３２に記載の核酸配列の増幅方法。
  34. アミノ酸Ｚ１がアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンのいずれか１である請求項３３に記載の核酸配列の増幅方法。
  35. アミノ酸Ｚ２がアラニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、グリシン、セリン、トレオニンおよびヒスチジンのいずれか１である、請求項３３または３４に記載の核酸配列の増幅方法。
  36. アミノ酸Ｚ１およびＺ２がともにアラニンである、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  37. 野生型エンドヌクレアーゼＶが好熱性細菌または好熱性古細菌由来である、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  38. 野生型エンドヌクレアーゼＶがサーモトガ・マリチマ由来である、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  39. 野生型エンドヌクレアーゼＶが配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  40. エンドヌクレアーゼＶが耐熱性を有する、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  41. 変異型の特異的エンドヌクレアーゼＶが配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法。
  42. 試料中の標的核酸を検出するための方法であって、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法により標的核酸を増幅する工程、該工程により増幅産物が生成したか否かを検知する工程を含む、標的核酸の検出方法。
  43. 核酸の検出剤存在下で請求項１〜４１のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法により標的核酸を増幅する工程、該工程により増幅産物が生成したか否かを検出剤由来のシグナル変化に基づいて検知する工程を含む、請求項４２に記載の標的核酸の検出方法。
  44. エンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を指示する指示書を記録した媒体を含んでなる、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の核酸配列の増幅方法に使用される、核酸増幅用試薬キット。
  45. 少なくともエンドヌクレアーゼＶ、または少なくともエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有する、請求項４４に記載の核酸増幅キット。
  46. エンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を指示する指示書を記録した媒体を含んでなる、請求項４２または４３に記載の標的核酸の検出方法に使用される、核酸検出用試薬キット。
  47. 少なくともエンドヌクレアーゼＶ、または少なくともエンドヌクレアーゼＶと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有する、請求項４６に記載の核酸検出用試薬キット。
  48. エンドヌクレアーゼＶが変異型エンドヌクレアーゼＶである請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の核酸増幅用試薬キット。
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