JPH10234389A - 一本鎖ｄｎａ結合タンパク質を使用する核酸の複製 - Google Patents
一本鎖ｄｎａ結合タンパク質を使用する核酸の複製Info
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- JPH10234389A JPH10234389A JP10052850A JP5285098A JPH10234389A JP H10234389 A JPH10234389 A JP H10234389A JP 10052850 A JP10052850 A JP 10052850A JP 5285098 A JP5285098 A JP 5285098A JP H10234389 A JPH10234389 A JP H10234389A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 効率よく増幅することができない長い標的の
増幅効率を有意に改善する。 【解決手段】 一本鎖結合タンパク質は、長い標的の鎖
置換複製効率を高めることが確認されており、SDA など
の増幅反応に加えると、加えなければ余りにも長くて効
率よく増幅することができない標的の増幅効率を有意に
改善する。T4のgp32タンパク質は、長さ約800 〜1,000b
p の場合、SDA において15〜20分で約106〜108 倍の増
幅をもたらすことが明らかにされている。この長さの標
的の場合、gp32の非存在下では、検出可能な増幅は本質
的に皆無である。長さ約400 〜500bpの標的は、gp32の
存在下で約10億倍増幅可能であり、長さ100 bp未満の標
的の場合、SSB の非存在下では、従来のSDA 反応で確認
されたものとほぼ同等の増幅率を示す。他の一本鎖DNA
結合タンパク質も長い標的の複製効率および増幅効率を
改善することが証明されている。
増幅効率を有意に改善する。 【解決手段】 一本鎖結合タンパク質は、長い標的の鎖
置換複製効率を高めることが確認されており、SDA など
の増幅反応に加えると、加えなければ余りにも長くて効
率よく増幅することができない標的の増幅効率を有意に
改善する。T4のgp32タンパク質は、長さ約800 〜1,000b
p の場合、SDA において15〜20分で約106〜108 倍の増
幅をもたらすことが明らかにされている。この長さの標
的の場合、gp32の非存在下では、検出可能な増幅は本質
的に皆無である。長さ約400 〜500bpの標的は、gp32の
存在下で約10億倍増幅可能であり、長さ100 bp未満の標
的の場合、SSB の非存在下では、従来のSDA 反応で確認
されたものとほぼ同等の増幅率を示す。他の一本鎖DNA
結合タンパク質も長い標的の複製効率および増幅効率を
改善することが証明されている。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸標的配列の増
幅方法、特に核酸増幅反応における一本鎖ＤＮＡ結合タ
ンパク質の使用に関する。
幅方法、特に核酸増幅反応における一本鎖ＤＮＡ結合タ
ンパク質の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】in vitro核酸増幅技術は、少量の核酸の
検出及び分析のための強力な道具であり、これらの方法
は感度が高いため、感染性疾患や遺伝的疾患の診断、分
析のための遺伝子の分離、法医学的な特異的核酸の検出
のための方法を開発することに関心が持たれた。核酸増
幅方法には、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（Polyme
rase Chain Reaction;ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（Li
gase Chain Reaction;ＬＣＲ）、自立配列複製（Self S
ubstained Sequence Repolication ; ３ＳＲ）、核酸配
列による複製（Nucleic Acid Sequence Baced Amplific
ation ; ＮＳＡＢＡ）、転写介在性複製（Transcriptio
n Mediated Replication; ＴＭＲ）および鎖置換増幅
（Strand Displlacement Amplification; ＳＤＡ）など
がある。鎖置換増幅は、低温で３０分以内に標的配列の
１０億倍以上の増幅を行うことができる等温増幅反応で
ある（G.T. Walker, et al. 1992. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89, 392-396、G.T. Walker, et al. 1992. Nu
c. Acids. Res. 20, 1691-1696、米国特許第５，４５
５，１６６号、米国特許第５，２７０，１８４号、欧州
特許第０ ６８４ ３１５号）。
検出及び分析のための強力な道具であり、これらの方法
は感度が高いため、感染性疾患や遺伝的疾患の診断、分
析のための遺伝子の分離、法医学的な特異的核酸の検出
のための方法を開発することに関心が持たれた。核酸増
幅方法には、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（Polyme
rase Chain Reaction;ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（Li
gase Chain Reaction;ＬＣＲ）、自立配列複製（Self S
ubstained Sequence Repolication ; ３ＳＲ）、核酸配
列による複製（Nucleic Acid Sequence Baced Amplific
ation ; ＮＳＡＢＡ）、転写介在性複製（Transcriptio
n Mediated Replication; ＴＭＲ）および鎖置換増幅
（Strand Displlacement Amplification; ＳＤＡ）など
がある。鎖置換増幅は、低温で３０分以内に標的配列の
１０億倍以上の増幅を行うことができる等温増幅反応で
ある（G.T. Walker, et al. 1992. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89, 392-396、G.T. Walker, et al. 1992. Nu
c. Acids. Res. 20, 1691-1696、米国特許第５，４５
５，１６６号、米国特許第５，２７０，１８４号、欧州
特許第０ ６８４ ３１５号）。
【０００３】ＳＤＡ反応(strand displacement amplifi
cation) は、約３５℃から４５℃の間の定温または増幅
効率および特異性を改善するためにより高い定温で実施
することが可能である（好熱性ＳＤＡまたはｔＳＤＡと
呼ばれ、公開済の欧州特許出願第０ ６８４ ３１５号
に記載されている）。どちらの形式でも、ＳＤＡは、
１）半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位又は切断部
位にニックを入れる制限エンドヌクレアーゼ、および、
２）ニックから伸び、標的配列のコピーを置換する一方
で、標的配列を鋳型として使用して、新しい鎖を重合す
るポリメラーゼを含む。ニックを入れたり、置換を行う
繰り返されたサイクルにより、さらなる標的配列のコピ
ーが作成される。ＳＤＡは、ＤＮＡポリメラーゼが標的
複製の配列周期の相補鎖を分離できる鎖置換能力を使用
する点で、核酸反復方法の中で独特である。この方法は
鎖置換複製と呼ばれる。
cation) は、約３５℃から４５℃の間の定温または増幅
効率および特異性を改善するためにより高い定温で実施
することが可能である（好熱性ＳＤＡまたはｔＳＤＡと
呼ばれ、公開済の欧州特許出願第０ ６８４ ３１５号
に記載されている）。どちらの形式でも、ＳＤＡは、
１）半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位又は切断部
位にニックを入れる制限エンドヌクレアーゼ、および、
２）ニックから伸び、標的配列のコピーを置換する一方
で、標的配列を鋳型として使用して、新しい鎖を重合す
るポリメラーゼを含む。ニックを入れたり、置換を行う
繰り返されたサイクルにより、さらなる標的配列のコピ
ーが作成される。ＳＤＡは、ＤＮＡポリメラーゼが標的
複製の配列周期の相補鎖を分離できる鎖置換能力を使用
する点で、核酸反復方法の中で独特である。この方法は
鎖置換複製と呼ばれる。
【０００４】ＳＤＡ反応は、米国特許第５，４５５，１
６６号、米国特許第５，２７０，１８４号および欧州特
許第０６８４３１５号に記載されている。ＳＤＡ反応の
ステップは、使用する温度および酵素に関係なく同じで
あり、標的配列を増幅するために数種の特異的な酵素活
性を必要とする。ＳＤＡポリメラーゼは、１）５’−
３’エキソヌクレアーゼ活性が欠損していなければなら
ない（この活性の欠損は、天然に生じたものでも、不活
化したものであっても良い）、２）ＳＤＡが必要とする
誘導されたデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）
（αチオ−ｄＮＴＰなどのヌクレオチド類似体）を組込
みこまなければならない、かつ、３）一本鎖ニックで開
始する二本鎖分子由来の下流の一本鎖を置換しなければ
ならない。ＳＤＡ制限エンドヌクレアーゼは、１）認識
部位又は切断部位が半修飾されているとき、その二本鎖
の認識部位又は切断部位にニックを入れなければ（すな
わち、二本鎖認識部位又は切断部位の一本鎖を切断しな
ければ）ならない、かつ、２）その認識部位又は切断部
位から分離して、ポリメラーゼを結合させ、標的を増幅
しなければならない。ｄＮＴＰ類似体を制限エンドヌク
レアーゼ認識部位に組込むと、制限エンドヌクレアーゼ
によるニックが挿入される。チオール化されたｄＮＴＰ
は、ＳＤＡで最もよく使用されるヌクレオチド類似体で
あるが、ホウ素置換ｄＮＴＰのメチル置換体もニックを
挿入する。上記特許公報には、ＳＤＡに適当な生物活性
を有するポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼの
例が記載されている。欧州特許第０ ６８４ ３１５号
には、ＳＤＡによる増幅に関する用語が記載されてい
る。
６６号、米国特許第５，２７０，１８４号および欧州特
許第０６８４３１５号に記載されている。ＳＤＡ反応の
ステップは、使用する温度および酵素に関係なく同じで
あり、標的配列を増幅するために数種の特異的な酵素活
性を必要とする。ＳＤＡポリメラーゼは、１）５’−
３’エキソヌクレアーゼ活性が欠損していなければなら
ない（この活性の欠損は、天然に生じたものでも、不活
化したものであっても良い）、２）ＳＤＡが必要とする
誘導されたデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）
（αチオ−ｄＮＴＰなどのヌクレオチド類似体）を組込
みこまなければならない、かつ、３）一本鎖ニックで開
始する二本鎖分子由来の下流の一本鎖を置換しなければ
ならない。ＳＤＡ制限エンドヌクレアーゼは、１）認識
部位又は切断部位が半修飾されているとき、その二本鎖
の認識部位又は切断部位にニックを入れなければ（すな
わち、二本鎖認識部位又は切断部位の一本鎖を切断しな
ければ）ならない、かつ、２）その認識部位又は切断部
位から分離して、ポリメラーゼを結合させ、標的を増幅
しなければならない。ｄＮＴＰ類似体を制限エンドヌク
レアーゼ認識部位に組込むと、制限エンドヌクレアーゼ
によるニックが挿入される。チオール化されたｄＮＴＰ
は、ＳＤＡで最もよく使用されるヌクレオチド類似体で
あるが、ホウ素置換ｄＮＴＰのメチル置換体もニックを
挿入する。上記特許公報には、ＳＤＡに適当な生物活性
を有するポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼの
例が記載されている。欧州特許第０ ６８４ ３１５号
には、ＳＤＡによる増幅に関する用語が記載されてい
る。
【０００５】ＳＤＡは、高速で且つ効率のよい増幅方法
であるが、効率よく増幅することができる標的の長さに
より制限を受ける。すなわち、ＳＤＡは、短い標的（一
般に約１００ｂｐ以下）を増幅するとき最も効率がよ
く、増幅率は、標的の長さが５０ｂｐ増加するごとに５
〜１００分の１低下する。４．５×１０8 （５２ｂｐの
標的）から３．０×１０4 （１９８ｂｐの標的）に増幅
率が低減したことが観察されている。これは、制限エン
ドヌクレアーゼによるニック挿入の効率低下（標的の長
さと無関係であると考えられる）に起因する公算は低い
が、重合および置換が完全になる前にＤＮＡポリメラー
ゼ終結増幅産物が生じた結果と考えられる。複製が不完
全な状態で終結すると、それ以上増幅することができな
い中断した、部分的アプリコンを生じることになり、こ
のような不完全な状態の終結がおこる可能性は、標的の
長さが増加するにつれて増大し、それ故、増幅反応の効
率が減少すると考えられる。反応を弱める標的内の局所
配列の存在、ポリメラーゼ前進性が低いこと、より長い
鎖が十分に置換しないこと、ポリメラーゼが置換された
鎖の複製に切り替わってしまうこと、修飾されたｄＮＴ
ＰやｄＵＴＰの負の影響などを含め、多くの因子がＳＤ
Ａがより長い標的を効率よく増幅することができない一
因となり得る。対照的に、ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ
による鎖置換複製を必要としない。ＰＣＲでは、相補的
鎖の全分離は高温にすることによって遂行されるため、
ＰＣＲは長さ数百塩基対の標的を効率よく増幅すること
ができる。
であるが、効率よく増幅することができる標的の長さに
より制限を受ける。すなわち、ＳＤＡは、短い標的（一
般に約１００ｂｐ以下）を増幅するとき最も効率がよ
く、増幅率は、標的の長さが５０ｂｐ増加するごとに５
〜１００分の１低下する。４．５×１０8 （５２ｂｐの
標的）から３．０×１０4 （１９８ｂｐの標的）に増幅
率が低減したことが観察されている。これは、制限エン
ドヌクレアーゼによるニック挿入の効率低下（標的の長
さと無関係であると考えられる）に起因する公算は低い
が、重合および置換が完全になる前にＤＮＡポリメラー
ゼ終結増幅産物が生じた結果と考えられる。複製が不完
全な状態で終結すると、それ以上増幅することができな
い中断した、部分的アプリコンを生じることになり、こ
のような不完全な状態の終結がおこる可能性は、標的の
長さが増加するにつれて増大し、それ故、増幅反応の効
率が減少すると考えられる。反応を弱める標的内の局所
配列の存在、ポリメラーゼ前進性が低いこと、より長い
鎖が十分に置換しないこと、ポリメラーゼが置換された
鎖の複製に切り替わってしまうこと、修飾されたｄＮＴ
ＰやｄＵＴＰの負の影響などを含め、多くの因子がＳＤ
Ａがより長い標的を効率よく増幅することができない一
因となり得る。対照的に、ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ
による鎖置換複製を必要としない。ＰＣＲでは、相補的
鎖の全分離は高温にすることによって遂行されるため、
ＰＣＲは長さ数百塩基対の標的を効率よく増幅すること
ができる。
【０００６】有機溶剤が存在すると、ＳＤＡの効率を改
善し、生じる増幅産物の量が増加するが、検出できるよ
うに増幅することができる標的の長さは増加しない。溶
剤はＤＮＡポリメラーゼの性能に特別の影響を与えない
が、プライマーハイブリダイゼーション、鎖置換効率、
および一般的な酵素活性を含め、反応の多くの局面に影
響することが予測され得る。したがって、長い標的、特
に長さが約１００ｂｐを超える標的のＳＤＡ増幅効率を
改善する試薬および／または方法を発見する必要があ
る。
善し、生じる増幅産物の量が増加するが、検出できるよ
うに増幅することができる標的の長さは増加しない。溶
剤はＤＮＡポリメラーゼの性能に特別の影響を与えない
が、プライマーハイブリダイゼーション、鎖置換効率、
および一般的な酵素活性を含め、反応の多くの局面に影
響することが予測され得る。したがって、長い標的、特
に長さが約１００ｂｐを超える標的のＳＤＡ増幅効率を
改善する試薬および／または方法を発見する必要があ
る。
【０００７】一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質(single-stra
nd DNA binding protein; ＳＳＢ）は、一本鎖ＤＮＡ
（ｓｓＤＮＡ）に対する配列非特異的に親和性は高い
が、二本鎖ＤＮＡに対する親和性は低い。その大部分
は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に対する親和性も高
い。通常、ＤＮＡ複製、組換え、および生物ゲノムの修
復には、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が必要である。Ｓ
ＳＢはその同族ＤＮＡポリメラーゼを特異的に刺激し、
ＤＮＡ合成の忠実度を高め、らせんの不安定化によりＤ
ＮＡポリメラーゼの前進性を改善し、ポリメラーゼ結合
を促進し、複製開始点を組織化および安定化する。多く
のＳＳＢは組換えにも参加し、ＤＮＡの復元を容易にす
る。ＳＳＢは、バクテリオファージＴ４（ｇｐ３２タン
パク質、K.R. Williams et al. 1980. Proc. Natl. Aca
d. Sci. 77: 4614-4617; D.P. Giedroc, et al. 1986.
Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8452-8456; D.K. Sandhu
and P. Keohavong. 1994. Gene 144: 53-58; D.P. Gied
roc, et al. 1990. J. Biol Chem.265: 11444-1145
5）、バクテリオファージＴ７（遺伝子２．５タンパク
質; Y.T.Kim, et al. 1992. J. Biol Chem. 267:15022-
15031）、バクテリオファージΦ２９（タンパク質ｐ
５；C. Gutierrez, et al. 1991. J. Biol Chem. 266:2
104-2111）、酵母（S.G. LaBonne and L.B. Dumas. 198
3. Biochem. 22:3214-3219;A.Y.S. Jong, et al. 1985.
J. Biol Chem. 260: 16367-16374; E. Alani, et al.
1992. J. Mol. Biol. 227: 54-71; E. Van Dyck, et a
l. 1992. EMBO 11:3421-3430）およびアデノウイルス
（G. Kitchingman. 1995. Virology 212: 91-101; P.N.
Kanellopoulos and H. Van Der Zandt. 1995. J. Stru
ct. Biol. 115: 113-116）を含め、多くの種（J.W. Cha
se and K.R. Williams. 1986. Ann. Rev.Biochem. 55:
103-136）で同定されており、かつ特徴付けられてい
る。
nd DNA binding protein; ＳＳＢ）は、一本鎖ＤＮＡ
（ｓｓＤＮＡ）に対する配列非特異的に親和性は高い
が、二本鎖ＤＮＡに対する親和性は低い。その大部分
は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に対する親和性も高
い。通常、ＤＮＡ複製、組換え、および生物ゲノムの修
復には、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が必要である。Ｓ
ＳＢはその同族ＤＮＡポリメラーゼを特異的に刺激し、
ＤＮＡ合成の忠実度を高め、らせんの不安定化によりＤ
ＮＡポリメラーゼの前進性を改善し、ポリメラーゼ結合
を促進し、複製開始点を組織化および安定化する。多く
のＳＳＢは組換えにも参加し、ＤＮＡの復元を容易にす
る。ＳＳＢは、バクテリオファージＴ４（ｇｐ３２タン
パク質、K.R. Williams et al. 1980. Proc. Natl. Aca
d. Sci. 77: 4614-4617; D.P. Giedroc, et al. 1986.
Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8452-8456; D.K. Sandhu
and P. Keohavong. 1994. Gene 144: 53-58; D.P. Gied
roc, et al. 1990. J. Biol Chem.265: 11444-1145
5）、バクテリオファージＴ７（遺伝子２．５タンパク
質; Y.T.Kim, et al. 1992. J. Biol Chem. 267:15022-
15031）、バクテリオファージΦ２９（タンパク質ｐ
５；C. Gutierrez, et al. 1991. J. Biol Chem. 266:2
104-2111）、酵母（S.G. LaBonne and L.B. Dumas. 198
3. Biochem. 22:3214-3219;A.Y.S. Jong, et al. 1985.
J. Biol Chem. 260: 16367-16374; E. Alani, et al.
1992. J. Mol. Biol. 227: 54-71; E. Van Dyck, et a
l. 1992. EMBO 11:3421-3430）およびアデノウイルス
（G. Kitchingman. 1995. Virology 212: 91-101; P.N.
Kanellopoulos and H. Van Der Zandt. 1995. J. Stru
ct. Biol. 115: 113-116）を含め、多くの種（J.W. Cha
se and K.R. Williams. 1986. Ann. Rev.Biochem. 55:
103-136）で同定されており、かつ特徴付けられてい
る。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】ＳＳＢは、プローブの
核酸標的へのハイブリダイゼーションを増進し（米国特
許第５，５３４，４０７号および第５，４４９，６０３
号）、核酸ポリマーにハイブリダイゼーションした隣接
プローブの特異的配列を促進する（米国特許第５，５４
７，８４３号）ためにin vitroで使用されてきた。ＳＳ
Ｂは、ｓｓＤＮＡ検出の標識手段としても使用されてき
た（米国特許第４，９６３，６５８号および５，４２
４，１８８号）。Ｔ４のｇｐ３２は、ＰＣＲによるクロ
ーニングのポリメラーゼ活性を増強するために使用され
（米国特許第５，３５４，６７０号）、ｇｐ３２遺伝子
は組換えタンパク質生産の発現システムに使用されてき
た（米国特許第５，１８２，１９６号）。Φ２９のＳＳ
Ｂは、新しい鋳型での再開始数を増加することによりΦ
２９のＤＮＡの複製を刺激することが証明されている
（G. Martin, et al. 1989. Nucl. Acids Res. 17:3663
-3672; C. Gutierrez, etal. 1991. J. Biol. Chem. 26
6: 2104-2111)。しかし、in vitroで鎖置換複製によっ
て効率よく複製することができる標的の長さまたは鎖置
換複製を必要とする核酸増幅反応で増幅される標的の長
さがＳＳＢの存在下で増加することは、これまで認めら
れていなかった。
核酸標的へのハイブリダイゼーションを増進し（米国特
許第５，５３４，４０７号および第５，４４９，６０３
号）、核酸ポリマーにハイブリダイゼーションした隣接
プローブの特異的配列を促進する（米国特許第５，５４
７，８４３号）ためにin vitroで使用されてきた。ＳＳ
Ｂは、ｓｓＤＮＡ検出の標識手段としても使用されてき
た（米国特許第４，９６３，６５８号および５，４２
４，１８８号）。Ｔ４のｇｐ３２は、ＰＣＲによるクロ
ーニングのポリメラーゼ活性を増強するために使用され
（米国特許第５，３５４，６７０号）、ｇｐ３２遺伝子
は組換えタンパク質生産の発現システムに使用されてき
た（米国特許第５，１８２，１９６号）。Φ２９のＳＳ
Ｂは、新しい鋳型での再開始数を増加することによりΦ
２９のＤＮＡの複製を刺激することが証明されている
（G. Martin, et al. 1989. Nucl. Acids Res. 17:3663
-3672; C. Gutierrez, etal. 1991. J. Biol. Chem. 26
6: 2104-2111)。しかし、in vitroで鎖置換複製によっ
て効率よく複製することができる標的の長さまたは鎖置
換複製を必要とする核酸増幅反応で増幅される標的の長
さがＳＳＢの存在下で増加することは、これまで認めら
れていなかった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】一本鎖ＤＮＡ結合タンパ
ク質(single-strand DNA binding protein; ＳＳＢ）を
ＳＤＡなどの増幅反応に加えると、加えなければ効率よ
く増幅することができないほど長い標的の増幅効率が有
意に改善されることが判明している。ＳＳＢは、反応の
鎖置換複製ステップに影響を及ぼして、ポリメラーゼの
分離前に複製することができる鋳型の長さを増加するこ
とが可能となるため、同様に、ＳＳＢは鎖置換複製ステ
ップを含む他の反応における長い標的の複製効率を改善
すると考えられる。本発明を作製する間に試験したＳＳ
Ｂのうち、ｇｐ３２、酵母ＲＰＡ−１およびΦ２９タン
パク質５が、鎖置換複製反応で長い標的を複製する効率
を高めるのに最も有効であった。その結果、鎖置換複製
を使用する増幅反応における増幅効率が有意に改善し、
ＳＳＢの非存在下では検出可能な増幅が不可能な長さの
標的を効率よく増幅することが可能になる。たとえば、
長さ約８００〜１，０００ｂｐの標的の場合、ｇｐ３２
は、１５〜２０分で約１０6 〜１０8 倍増幅することが
証明されている。対照的に、この長さの標的の場合、Ｓ
ＳＢの非存在下では、本質的に検出可能な増幅は本質的
に皆無であった。ｇｐ３２の存在下で、長さ約４００〜
５００ｂｐの標的を約１０億倍増幅することが可能であ
り、ＳＳＢを含有しない従来のＳＤＡ反応で長さ１００
ｂｐ未満の標的で見られるものとほぼ同等の増幅率であ
る。
ク質(single-strand DNA binding protein; ＳＳＢ）を
ＳＤＡなどの増幅反応に加えると、加えなければ効率よ
く増幅することができないほど長い標的の増幅効率が有
意に改善されることが判明している。ＳＳＢは、反応の
鎖置換複製ステップに影響を及ぼして、ポリメラーゼの
分離前に複製することができる鋳型の長さを増加するこ
とが可能となるため、同様に、ＳＳＢは鎖置換複製ステ
ップを含む他の反応における長い標的の複製効率を改善
すると考えられる。本発明を作製する間に試験したＳＳ
Ｂのうち、ｇｐ３２、酵母ＲＰＡ−１およびΦ２９タン
パク質５が、鎖置換複製反応で長い標的を複製する効率
を高めるのに最も有効であった。その結果、鎖置換複製
を使用する増幅反応における増幅効率が有意に改善し、
ＳＳＢの非存在下では検出可能な増幅が不可能な長さの
標的を効率よく増幅することが可能になる。たとえば、
長さ約８００〜１，０００ｂｐの標的の場合、ｇｐ３２
は、１５〜２０分で約１０6 〜１０8 倍増幅することが
証明されている。対照的に、この長さの標的の場合、Ｓ
ＳＢの非存在下では、本質的に検出可能な増幅は本質的
に皆無であった。ｇｐ３２の存在下で、長さ約４００〜
５００ｂｐの標的を約１０億倍増幅することが可能であ
り、ＳＳＢを含有しない従来のＳＤＡ反応で長さ１００
ｂｐ未満の標的で見られるものとほぼ同等の増幅率であ
る。
【００１０】異種(heterologous)酵素複製系やＳＤＡな
どの増幅系において、ＳＳＢが鎖置換複製を改善するよ
うに機能することは、予想外の発見であった。ＳＳＢの
機能および活性に関する多くの研究で、ＳＳＢ機能が効
率よく発現されるためには一対になるＳＳＢとポリメラ
ーゼは相同(homologous)（すなわち、同じ種に由来す
る）でなければならないことが証明されている。対照的
に、ＳＤＡでは、ポリメラーゼは一般にＳＳＢのものと
は異なる微生物の種に由来する（たとえば、バクテリオ
ファージのＳＳＢと一緒に使用されるBacillus属のポリ
メラーゼ）。ＳＤＡの反応条件で、これらの異種ポリメ
ラーゼ／ＳＳＢ対は意外にも、増幅可能な標的の長さが
増加する点で非常に効率がよかった。
どの増幅系において、ＳＳＢが鎖置換複製を改善するよ
うに機能することは、予想外の発見であった。ＳＳＢの
機能および活性に関する多くの研究で、ＳＳＢ機能が効
率よく発現されるためには一対になるＳＳＢとポリメラ
ーゼは相同(homologous)（すなわち、同じ種に由来す
る）でなければならないことが証明されている。対照的
に、ＳＤＡでは、ポリメラーゼは一般にＳＳＢのものと
は異なる微生物の種に由来する（たとえば、バクテリオ
ファージのＳＳＢと一緒に使用されるBacillus属のポリ
メラーゼ）。ＳＤＡの反応条件で、これらの異種ポリメ
ラーゼ／ＳＳＢ対は意外にも、増幅可能な標的の長さが
増加する点で非常に効率がよかった。
【００１１】
【発明の実施の形態】鎖置換複製を必要とする反応で、
標的の長さによる負の影響を受ける公算が高い酵素はポ
リメラーゼであるという仮説をたてた。そこで、長い標
的の増幅を容易にする目的で、ポリメラーゼの作用を増
強する方法を探索した。標的または標的配列は、複製ま
たは増幅の対象であり、場合によっては検出の対象であ
る、選択されたオリゴヌクレオチドである。本願明細書
で使用される「長い標的」は、余りにも長いため、鎖置
換複製を必要とする従来の反応で効率よく複製または増
幅することができないオリゴヌクレオチド配列と定義さ
れる。長い標的は一般に長さ１００ヌクレオチド以上で
ある。たとえば、核酸増幅反応または鎖置換反応での長
い標的は、一般に長さ約１００〜５，０００ヌクレオチ
ドであり、好ましくは長さ約１５０〜約２，０００ヌク
レオチドである。上記サイズ範囲の上限（たとえば、長
さ約２，０００〜約５，０００ヌクレオチド）の標的の
場合、検出可能な増幅産物または複製産物を得るため
に、反応時間を増加することが有用なこともある。所与
の長さの長い標的に適当な反応時間は、当該技術で既知
のルーチンの方法を使用して経験的に決定することが可
能である。
標的の長さによる負の影響を受ける公算が高い酵素はポ
リメラーゼであるという仮説をたてた。そこで、長い標
的の増幅を容易にする目的で、ポリメラーゼの作用を増
強する方法を探索した。標的または標的配列は、複製ま
たは増幅の対象であり、場合によっては検出の対象であ
る、選択されたオリゴヌクレオチドである。本願明細書
で使用される「長い標的」は、余りにも長いため、鎖置
換複製を必要とする従来の反応で効率よく複製または増
幅することができないオリゴヌクレオチド配列と定義さ
れる。長い標的は一般に長さ１００ヌクレオチド以上で
ある。たとえば、核酸増幅反応または鎖置換反応での長
い標的は、一般に長さ約１００〜５，０００ヌクレオチ
ドであり、好ましくは長さ約１５０〜約２，０００ヌク
レオチドである。上記サイズ範囲の上限（たとえば、長
さ約２，０００〜約５，０００ヌクレオチド）の標的の
場合、検出可能な増幅産物または複製産物を得るため
に、反応時間を増加することが有用なこともある。所与
の長さの長い標的に適当な反応時間は、当該技術で既知
のルーチンの方法を使用して経験的に決定することが可
能である。
【００１２】ＳＳＢは複製補助タンパク質であり、ＳＤ
Ａで発生するような鎖置換合成に対してＳＳＢが与える
影響を試験した。試験では、簡単な、非指数関数系を考
案した。この系は、ＳＤＡに重要な基本的ニック挿入お
よび伸長反応を使用したプライマーを含まない本質的に
線状ＳＤＡ反応であった。５’末端付近のニック挿入可
能な制限部位を含み、かつ、チオール化されたｄＮＴＰ
ですべて置換された二本鎖ＤＮＡ鋳型を合成した。ＳＤ
Ａ様反応条件に似せるために、この鋳型を適当な制限酵
素、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸およ
び緩衝液と共にインキュベートしたとき、半チオール化
された制限部位にニックが入り、ポリメラーゼがそのニ
ックから伸び、鎖置換合成により一本鎖産物が生じた。
ＳＤＡの場合と同様、鎖置換合成によりニック挿入可能
な制限部位が再生され、このステップを繰り返した。加
えた試薬がニック挿入過程および鎖置換過程に与える影
響を、本試験系でＳＤＡおよび鎖置換複製ステップを含
む他の反応のモデルとして観察することができた。
Ａで発生するような鎖置換合成に対してＳＳＢが与える
影響を試験した。試験では、簡単な、非指数関数系を考
案した。この系は、ＳＤＡに重要な基本的ニック挿入お
よび伸長反応を使用したプライマーを含まない本質的に
線状ＳＤＡ反応であった。５’末端付近のニック挿入可
能な制限部位を含み、かつ、チオール化されたｄＮＴＰ
ですべて置換された二本鎖ＤＮＡ鋳型を合成した。ＳＤ
Ａ様反応条件に似せるために、この鋳型を適当な制限酵
素、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸およ
び緩衝液と共にインキュベートしたとき、半チオール化
された制限部位にニックが入り、ポリメラーゼがそのニ
ックから伸び、鎖置換合成により一本鎖産物が生じた。
ＳＤＡの場合と同様、鎖置換合成によりニック挿入可能
な制限部位が再生され、このステップを繰り返した。加
えた試薬がニック挿入過程および鎖置換過程に与える影
響を、本試験系でＳＤＡおよび鎖置換複製ステップを含
む他の反応のモデルとして観察することができた。
【００１３】線状ＳＤＡスクリーニング系を組み立てる
ために、マルチクローニング部位のいずれかの側にＳＤ
Ａプライミング領域を挿入することによってｐＵＣプラ
スミドを修飾した。次に、様々な長さのλＤＮＡをベク
ターのＢａｍＨＩ部位に挿入した。このようにして得ら
れた「ＳＤＡ標的プラスミド」は、１組の増幅プライマ
ーを使用して全部を増幅することができる範囲の挿入長
さを提供した。ＳＤＡの場合、標的は半チオール化され
た制限部位（たとえば、ＢｓｏＢＩ）を含有し、且つ規
定された３’末端を具有しなければならない。このよう
な標的を提供するために、様々なλ挿入物を含むＳＤＡ
ベクターに３０サイクルのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ
に使用したプライマーは、ＳＤＡ増幅（Ｓ）プライマー
（ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧ
ＴＡＡＧＧＣＧＴＡＣＴＣＧＡＣＣ、配列番号１）およ
びＳＤＡバンパープライマー（ＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧ
ＡＴ、配列番号２）であった。ｄＣＴＰαＳは、半修飾
ＢｓｏＢＩ部位を作成するための反応において、ｄＣＴ
Ｐの代わりに全置換されていた。ＰＣＲ反応は、１×Ｐ
ｒｏｍｅｇａ熱ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（５０ｍＭの
ＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ
９．０）、および１．０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０）、３．９ｍＭのＭｇＣｌ2 （１ｍＭの遊離ＭｇＣｌ
2 ）、０．１μＭの各プライマー、１．４ｍＭのｄＣＴ
ＰαＳ、各々０．５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびＴ
ＴＰ、１ｎｇのＳＤＡプラスミド、５μＬのシークエン
シング級Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で構成
されていた。ベクターを増幅するために、反応混合物に
ミネラルオイルを重層し、９５℃に５分間加熱した。ホ
ットスタートのために９５℃でポリメラーゼを加え、９
６℃、５５℃および７２℃で３０回の１分温度周期を実
施した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １００カラムを通過さ
せ、続いて６５℃で３０分間プロテイナーゼＫ消化
（１．２５μｇ）することにより、線状ＳＤＡの各ＰＣ
Ｒ産物を精製した。ＳＤＡ鋳型をクロロホルム抽出し、
エタノール析出し、分光分析法で測量した。
ために、マルチクローニング部位のいずれかの側にＳＤ
Ａプライミング領域を挿入することによってｐＵＣプラ
スミドを修飾した。次に、様々な長さのλＤＮＡをベク
ターのＢａｍＨＩ部位に挿入した。このようにして得ら
れた「ＳＤＡ標的プラスミド」は、１組の増幅プライマ
ーを使用して全部を増幅することができる範囲の挿入長
さを提供した。ＳＤＡの場合、標的は半チオール化され
た制限部位（たとえば、ＢｓｏＢＩ）を含有し、且つ規
定された３’末端を具有しなければならない。このよう
な標的を提供するために、様々なλ挿入物を含むＳＤＡ
ベクターに３０サイクルのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ
に使用したプライマーは、ＳＤＡ増幅（Ｓ）プライマー
（ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧ
ＴＡＡＧＧＣＧＴＡＣＴＣＧＡＣＣ、配列番号１）およ
びＳＤＡバンパープライマー（ＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧ
ＡＴ、配列番号２）であった。ｄＣＴＰαＳは、半修飾
ＢｓｏＢＩ部位を作成するための反応において、ｄＣＴ
Ｐの代わりに全置換されていた。ＰＣＲ反応は、１×Ｐ
ｒｏｍｅｇａ熱ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（５０ｍＭの
ＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ
９．０）、および１．０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０）、３．９ｍＭのＭｇＣｌ2 （１ｍＭの遊離ＭｇＣｌ
2 ）、０．１μＭの各プライマー、１．４ｍＭのｄＣＴ
ＰαＳ、各々０．５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびＴ
ＴＰ、１ｎｇのＳＤＡプラスミド、５μＬのシークエン
シング級Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で構成
されていた。ベクターを増幅するために、反応混合物に
ミネラルオイルを重層し、９５℃に５分間加熱した。ホ
ットスタートのために９５℃でポリメラーゼを加え、９
６℃、５５℃および７２℃で３０回の１分温度周期を実
施した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １００カラムを通過さ
せ、続いて６５℃で３０分間プロテイナーゼＫ消化
（１．２５μｇ）することにより、線状ＳＤＡの各ＰＣ
Ｒ産物を精製した。ＳＤＡ鋳型をクロロホルム抽出し、
エタノール析出し、分光分析法で測量した。
【００１４】バクテリオファージから真核生物まで、広
く様々な起源から多数のＳＳＢの例が分離されている。
ＳＳＢが長い標的の増幅効率に与える作用を評価するた
めに、以下のＳＳＢ、すなわち、ビール酵母(Saccharom
yces cerevisiae)由来の複製タンパク質Ａ−１（ｒｐａ
−１）およびミトコンドリアタンパク質（ｒｉｍ−１）
における複製、Ｔ７由来の遺伝子２．５タンパク質（ｇ
ｐ２．５）、バクテリオファージΦ２９のタンパク質ｐ
５（ｐ５）、Ｔ４の遺伝子３２タンパク質（ｇｐ３２）
および大腸菌のＳＳＢを線状ＳＤＡ系で試験した。ＳＤ
Ａ反応は、当初、中温性ポリメラーゼおよび制限エンド
ヌクレアーゼを使用して起こし、約３５〜４５℃で実施
した。これは、非常に効率のよい増幅系をもたらした。
その後、熱安定なポリメラーゼと制限エンドヌクレアー
ゼを使用してｔＳＤＡを改良すると、バックグラウンド
が低減して、増幅効率が上昇し、反応に要する時間が有
意に減少した。中温ＳＤＡの温度は、成長に最適な温度
が約２５〜３７℃の中温生物からこれまで得られていた
ＳＳＢと一致する。しかし、最も効率のよいＳＤＡ増幅
系は、約４５〜６０℃で作用する好熱反応（すなわち、
ｔＳＤＡ）であるため、さらに増幅を改良して増強する
ためには、ｔＳＤＡ温度でＳＳＢを使用することが有利
であろう。既知の中温ＳＳＢは、ｔＳＤＡの温度で安定
ではないと予測された。
く様々な起源から多数のＳＳＢの例が分離されている。
ＳＳＢが長い標的の増幅効率に与える作用を評価するた
めに、以下のＳＳＢ、すなわち、ビール酵母(Saccharom
yces cerevisiae)由来の複製タンパク質Ａ−１（ｒｐａ
−１）およびミトコンドリアタンパク質（ｒｉｍ−１）
における複製、Ｔ７由来の遺伝子２．５タンパク質（ｇ
ｐ２．５）、バクテリオファージΦ２９のタンパク質ｐ
５（ｐ５）、Ｔ４の遺伝子３２タンパク質（ｇｐ３２）
および大腸菌のＳＳＢを線状ＳＤＡ系で試験した。ＳＤ
Ａ反応は、当初、中温性ポリメラーゼおよび制限エンド
ヌクレアーゼを使用して起こし、約３５〜４５℃で実施
した。これは、非常に効率のよい増幅系をもたらした。
その後、熱安定なポリメラーゼと制限エンドヌクレアー
ゼを使用してｔＳＤＡを改良すると、バックグラウンド
が低減して、増幅効率が上昇し、反応に要する時間が有
意に減少した。中温ＳＤＡの温度は、成長に最適な温度
が約２５〜３７℃の中温生物からこれまで得られていた
ＳＳＢと一致する。しかし、最も効率のよいＳＤＡ増幅
系は、約４５〜６０℃で作用する好熱反応（すなわち、
ｔＳＤＡ）であるため、さらに増幅を改良して増強する
ためには、ｔＳＤＡ温度でＳＳＢを使用することが有利
であろう。既知の中温ＳＳＢは、ｔＳＤＡの温度で安定
ではないと予測された。
【００１５】４０℃と５０℃の両方でＳＳＢの効率を試
験するために、線状ＳＤＡアッセイを実施した。２５ｍ
ＭのＫｉＰＯ4 （ｐＨ７．５）、０．１μｇ／μＬのＢ
ＳＡ、１．４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、各々０．５ｍＭのｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ（合計２．９ｍＭのｄＮ
ＴＰ）、６．９ｍＭのＭｇＣｌ2 （４ｍＭの遊離ＭｇＣ
ｌ2 ）、各々０．５μＬのα32Ｐ−ＴＴＰおよびｄＡＴ
Ｐ（３，０００Ｃｉ／ｍｍ）および上述の通りに作成し
た１０ｎＭの４００−ｍｅｒ ＳＤＡ鋳型を含有する反
応で、様々な量のＳＳＢを試験した。酵素およびＳＳＢ
以外の全反応成分を集め、反応温度で５分間予熱した。
予熱後、２５単位のＢｓｏＢＩおよび５０単位のｅｘｏ
- Ｋｌｅｎｏｗ（４０℃反応）または８単位のＢｃａポ
リメラーゼ（５０℃反応）を様々な量のＳＳＢと共に加
えた。反応を４０℃で３０分間、または５０℃で１５分
間インキュベートした。１サイクルの線状ＳＤＡ中に生
成される増幅産物の量を測定するためのコントロール反
応は、ＳＳＢ反応と同じ緩衝液成分、同量のＳＤＡ鋳型
および同じポリメラーゼを含んでいたが、制限酵素やＳ
ＳＢは含んでいなかった。コントロール反応はＳＤＡ鋳
型（上記参照）の生成に使用したバンパープライマー１
６６μＭを含有していた。等量の９５％ホルムアミド、
２０ｍＭのＥＤＴＡ、各々０．０５％のブロムフェノー
ルブルー／キシレンシアノールを加え、０．５μｇのプ
ロテイナーゼＫで、６５℃で３０分間処理することによ
って反応を停止させた。試料を１００℃で３分間変成さ
せ、氷上で急冷後、６％シークエンシングゲルで電気泳
動を実施した。PhosphorImager（Molecular Dynamics）
でゲルを分析すると、約４００−ｍｅｒが置換された、
生じた線状ＳＤＡ産物の量を示すピクセル値が得られ
た。PhosphorImagerは、相対ピクセル値を選択されたバ
ンドに存在する放射能の量として、測定された各レーン
のバックグラウンドをこの値から減算することにより、
量を提供する。コントロール反応を含有するレーンを使
用して、１つの伸長事象から得られた産物の量を計量し
た。試験反応で生じた置換された鎖（ＳＤＡターンオー
バー事象）の数は、ＳＳＢ反応レーンにおける４００ｍ
ｅｒ増幅産物の量を、１つの伸長事象から得られた産物
の量で割ることによって求めた。置換鎖総数を反応期間
で割って、反応における分当たりのＳＤＡサイクル数
（すなわち、増幅速度）を求めた。
験するために、線状ＳＤＡアッセイを実施した。２５ｍ
ＭのＫｉＰＯ4 （ｐＨ７．５）、０．１μｇ／μＬのＢ
ＳＡ、１．４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、各々０．５ｍＭのｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ（合計２．９ｍＭのｄＮ
ＴＰ）、６．９ｍＭのＭｇＣｌ2 （４ｍＭの遊離ＭｇＣ
ｌ2 ）、各々０．５μＬのα32Ｐ−ＴＴＰおよびｄＡＴ
Ｐ（３，０００Ｃｉ／ｍｍ）および上述の通りに作成し
た１０ｎＭの４００−ｍｅｒ ＳＤＡ鋳型を含有する反
応で、様々な量のＳＳＢを試験した。酵素およびＳＳＢ
以外の全反応成分を集め、反応温度で５分間予熱した。
予熱後、２５単位のＢｓｏＢＩおよび５０単位のｅｘｏ
- Ｋｌｅｎｏｗ（４０℃反応）または８単位のＢｃａポ
リメラーゼ（５０℃反応）を様々な量のＳＳＢと共に加
えた。反応を４０℃で３０分間、または５０℃で１５分
間インキュベートした。１サイクルの線状ＳＤＡ中に生
成される増幅産物の量を測定するためのコントロール反
応は、ＳＳＢ反応と同じ緩衝液成分、同量のＳＤＡ鋳型
および同じポリメラーゼを含んでいたが、制限酵素やＳ
ＳＢは含んでいなかった。コントロール反応はＳＤＡ鋳
型（上記参照）の生成に使用したバンパープライマー１
６６μＭを含有していた。等量の９５％ホルムアミド、
２０ｍＭのＥＤＴＡ、各々０．０５％のブロムフェノー
ルブルー／キシレンシアノールを加え、０．５μｇのプ
ロテイナーゼＫで、６５℃で３０分間処理することによ
って反応を停止させた。試料を１００℃で３分間変成さ
せ、氷上で急冷後、６％シークエンシングゲルで電気泳
動を実施した。PhosphorImager（Molecular Dynamics）
でゲルを分析すると、約４００−ｍｅｒが置換された、
生じた線状ＳＤＡ産物の量を示すピクセル値が得られ
た。PhosphorImagerは、相対ピクセル値を選択されたバ
ンドに存在する放射能の量として、測定された各レーン
のバックグラウンドをこの値から減算することにより、
量を提供する。コントロール反応を含有するレーンを使
用して、１つの伸長事象から得られた産物の量を計量し
た。試験反応で生じた置換された鎖（ＳＤＡターンオー
バー事象）の数は、ＳＳＢ反応レーンにおける４００ｍ
ｅｒ増幅産物の量を、１つの伸長事象から得られた産物
の量で割ることによって求めた。置換鎖総数を反応期間
で割って、反応における分当たりのＳＤＡサイクル数
（すなわち、増幅速度）を求めた。
【００１６】酵母ｒｐａ−１、ｇｐ２．５、ｐ５および
ｇｐ３２を両反応温度で試験した。ｒｉｍ−１および大
腸菌ＳＳＢは、４０℃のみで試験した。試験結果を図１
に示す。大腸菌ＳＳＢを除き、試験したＳＳＢの各々に
より、４０℃における４００塩基の線状ＳＤＡ産物の生
成が改善した。０．２４μｇ／μＬのｐ５（０．７９サ
イクル／分）を使用すると、この温度での増幅産物の最
大量が生成した。さらに、ｇｐ３２（０．１９６μｇ／
μｌ）およびｒｐａ−１（０．０２４μｇ／μｌ）は十
分に機能した（それぞれ、０．５４サイクル／分および
０．６４サイクル／分）。上記条件下で、最小有効ＳＳ
Ｂでさえも（ｇｐ２．５では、０．１８サイクル／分、
およびｒｉｍ−１では、０．１５サイクル／分）、ＳＳ
Ｂの非存在下で生じた産物の量（０．０５サイクル／
分）より少なくとも３倍の改善をもたらした。思いがけ
ず、試験したＳＳＢのうち１つを除くすべてが存在する
条件下で、５０℃で、増幅効率の有意な改善が認められ
た。ＳＳＢを含まない反応（０．１２サイクル／分）と
比較して、ｇｐ２．５タンパク質は、増幅効率を３倍の
改善し（０．３７周期／分）、ｇｐ３２は１０倍改善し
（１．２サイクル／分）、ｒｐａ−１は約８倍改善した
（０．９２サイクル／分）。ｐ５（０．１４サイクル／
分）の改善の大きさは極微であったが、それでもなお、
ＳＳＢを含まない反応以上の効率が検出された。５０℃
で長い標的の増幅効率が増強することは、起源生物が成
長する温度範囲からは予測されなかった。
ｇｐ３２を両反応温度で試験した。ｒｉｍ−１および大
腸菌ＳＳＢは、４０℃のみで試験した。試験結果を図１
に示す。大腸菌ＳＳＢを除き、試験したＳＳＢの各々に
より、４０℃における４００塩基の線状ＳＤＡ産物の生
成が改善した。０．２４μｇ／μＬのｐ５（０．７９サ
イクル／分）を使用すると、この温度での増幅産物の最
大量が生成した。さらに、ｇｐ３２（０．１９６μｇ／
μｌ）およびｒｐａ−１（０．０２４μｇ／μｌ）は十
分に機能した（それぞれ、０．５４サイクル／分および
０．６４サイクル／分）。上記条件下で、最小有効ＳＳ
Ｂでさえも（ｇｐ２．５では、０．１８サイクル／分、
およびｒｉｍ−１では、０．１５サイクル／分）、ＳＳ
Ｂの非存在下で生じた産物の量（０．０５サイクル／
分）より少なくとも３倍の改善をもたらした。思いがけ
ず、試験したＳＳＢのうち１つを除くすべてが存在する
条件下で、５０℃で、増幅効率の有意な改善が認められ
た。ＳＳＢを含まない反応（０．１２サイクル／分）と
比較して、ｇｐ２．５タンパク質は、増幅効率を３倍の
改善し（０．３７周期／分）、ｇｐ３２は１０倍改善し
（１．２サイクル／分）、ｒｐａ−１は約８倍改善した
（０．９２サイクル／分）。ｐ５（０．１４サイクル／
分）の改善の大きさは極微であったが、それでもなお、
ＳＳＢを含まない反応以上の効率が検出された。５０℃
で長い標的の増幅効率が増強することは、起源生物が成
長する温度範囲からは予測されなかった。
【００１７】アッセイ系としての線状ＳＤＡの結果およ
び分析から、鎖置換複製は、効率よく増幅または複製す
ることができる標的の長さを限定するステップであるこ
とがわかる。したがって、本願明細書に記載の線状ＳＤ
Ａスクリーニングアッセイは、特に鎖置換複製機構を使
用する核酸増幅反応において、長い標的の鎖置換複製の
効率改善に関する有用性を評価するために発見されたも
のであるため、このアッセイを日常的に使用して、上記
以外の既知のＳＳＢや新規ＳＳＢをスクリーニングする
ことが可能である。スクリーニングアッセイで線状に複
製されるべき長い標的配列の長さを選択することによ
り、ＳＳＢが長い標的の効率よい鎖置換複製を促進でき
る相対的能力を評価することも可能である。さらに、線
状反応にも指数反応にも同じ反応機構が存在するため、
線状増幅スクリーニング分析の結果から、鎖置換複製を
使用する指数増幅反応における、長い標的の増幅効率の
改善がわかる。本願明細書でスクリーニングした６種の
ＳＳＢのうち、１種を除くすべてが本発明の実行に必要
な活性および有用性を示した。活性なＳＳＢ５種のうち
４種は、長い標的の増幅効率改善に極めて有効であり、
１種は中等度に有効であった。したがって、当業者は、
本願明細書に開示されているスクリーニング方法を使用
して、記載されている特性および有用性を有する別のＳ
ＳＢを日常的に同定することが可能である。
び分析から、鎖置換複製は、効率よく増幅または複製す
ることができる標的の長さを限定するステップであるこ
とがわかる。したがって、本願明細書に記載の線状ＳＤ
Ａスクリーニングアッセイは、特に鎖置換複製機構を使
用する核酸増幅反応において、長い標的の鎖置換複製の
効率改善に関する有用性を評価するために発見されたも
のであるため、このアッセイを日常的に使用して、上記
以外の既知のＳＳＢや新規ＳＳＢをスクリーニングする
ことが可能である。スクリーニングアッセイで線状に複
製されるべき長い標的配列の長さを選択することによ
り、ＳＳＢが長い標的の効率よい鎖置換複製を促進でき
る相対的能力を評価することも可能である。さらに、線
状反応にも指数反応にも同じ反応機構が存在するため、
線状増幅スクリーニング分析の結果から、鎖置換複製を
使用する指数増幅反応における、長い標的の増幅効率の
改善がわかる。本願明細書でスクリーニングした６種の
ＳＳＢのうち、１種を除くすべてが本発明の実行に必要
な活性および有用性を示した。活性なＳＳＢ５種のうち
４種は、長い標的の増幅効率改善に極めて有効であり、
１種は中等度に有効であった。したがって、当業者は、
本願明細書に開示されているスクリーニング方法を使用
して、記載されている特性および有用性を有する別のＳ
ＳＢを日常的に同定することが可能である。
【００１８】ＳＤＡ反応でＳＳＢを使用して増幅可能な
標的の長さを増加することは、核酸増幅の検出で知られ
ている様々な検出系と一致する。たとえば、Walker et
al.（Nucl. Acids Res., 前出）が記述しているよう
な、標識プローブのハイブリダイゼーションまたは検出
プローブのハイブリダイゼイーションおよび伸長は、Ｓ
ＳＢの存在下で増幅や複製の増幅産物を検出するのに有
用である。ＳＤＡの増幅産物を検出するための好ましい
方法は、米国特許第５，５４７，８６１号および米国特
許第５，５５０，０２５号に記載されているシグナルプ
ライマー系であり、この方法はＳＢＢ存在下でのＳＤＡ
にも有用である。
標的の長さを増加することは、核酸増幅の検出で知られ
ている様々な検出系と一致する。たとえば、Walker et
al.（Nucl. Acids Res., 前出）が記述しているよう
な、標識プローブのハイブリダイゼーションまたは検出
プローブのハイブリダイゼイーションおよび伸長は、Ｓ
ＳＢの存在下で増幅や複製の増幅産物を検出するのに有
用である。ＳＤＡの増幅産物を検出するための好ましい
方法は、米国特許第５，５４７，８６１号および米国特
許第５，５５０，０２５号に記載されているシグナルプ
ライマー系であり、この方法はＳＢＢ存在下でのＳＤＡ
にも有用である。
【００１９】
【実施例】実施例１ 指数ｔＳＤＡ増幅系でさらに試験するため、ＧＰ３２を
選択した。最初の実験で、１０μｇのｇｐ３２を加える
と、５００ｂｐの標的の１０8 倍の増幅が証明された。
増幅反応の検出感度を評価するための第２の実験で、様
々な量の５００ｂｐ標的を、５μｌ〜４０μｌの反応緩
衝液（２５ｍＭのＫｉＰＯ4 （ｐＨ７．６）、０．１ｍ
ｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．５μＭのＳ１およびＳ２ ＳＤ
Ａ増幅プライマー、０．０５μＭのＢ１およびＢ２ Ｓ
ＤＡバンパープライマー、１．４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、
０．５ｍＭのｄＵＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２
ｍＭのｄＧＴＰ、１０．５％グリセロール、７ｍＭの酢
酸マグネシウム、５００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ）に加え
た。この実験に使用されるＳＤＡ増幅プライマーおよび
バンパープライマーは、C.A. Spargo et al. (1996. Mo
lec. Cell. Probes10, 247-256)により記述されてい
る。ヒト胎盤ＤＮＡのみ（１００ｎｇ／μＬ）をゼロ標
的コントロール試料に加えた。この試料を、沸騰水浴
中、１００℃で３分間変成させ、５２℃に移し、４分間
平衡化させた。酵素（３０単位のＡｖａＩ、３６単位の
ｅｘｏ- ＢＳＴ）およびＳＳＢ（ｇｐ３２ １０μｇ）
を５μＬの各試料に加え、混合して５２℃で３０分間置
いた。１００℃で５分間加熱することにより、反応を停
止させた。増幅産物は、Walker et al. （Nucl. Acads
Res., 上述）に記載されたように、ハイブリダイゼーシ
ョン及び末端標識検出用プローブの伸長により検出し
た。６μＬの検出用混合物（３５ｍＭのＫｉＰＯ4 （ｐ
Ｈ７．６）５μＬ、６ｍＭのＭｇＯＡｃ、１ｍＭの各ｄ
ＮＴＰ、１μＬの標識プローブ）をＳＤＡ反応に加え
た。１００℃で３分間変性した後、３７℃に移し、３分
間平衡化させた。２μＬのｅｘｏ- Ｋｌｅｎｏｗ（５０
％グリセロール中１Ｕ／μＬ）を加え、伸長反応を３７
℃で１５分間インキュベートした。ホルムアミド停止溶
液（９０％ホルムアミド、０．０５％ＢＰＢ、１×ＴＢ
Ｅ）１３μＬを加えることによって反応を停止させた。
各試料の半分（１３μＬ）を８％シークエンシングゲル
に供し、５７ワットで約１時間電気泳動した。ＵＤＧを
使用してアンプリコン汚染除去をするためにｄＵＴＰを
この実験に含めたが、ＴＴＰをｄＵＴＰの代わりに使用
することが可能であり、この場合、リン酸緩衝液を３０
ｍＭまで増加させ、他のｄＮＴＰ（一般に約０．２ｍ
Ｍ）と同量でＴＴＰを含むことが有利である。
選択した。最初の実験で、１０μｇのｇｐ３２を加える
と、５００ｂｐの標的の１０8 倍の増幅が証明された。
増幅反応の検出感度を評価するための第２の実験で、様
々な量の５００ｂｐ標的を、５μｌ〜４０μｌの反応緩
衝液（２５ｍＭのＫｉＰＯ4 （ｐＨ７．６）、０．１ｍ
ｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．５μＭのＳ１およびＳ２ ＳＤ
Ａ増幅プライマー、０．０５μＭのＢ１およびＢ２ Ｓ
ＤＡバンパープライマー、１．４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、
０．５ｍＭのｄＵＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２
ｍＭのｄＧＴＰ、１０．５％グリセロール、７ｍＭの酢
酸マグネシウム、５００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ）に加え
た。この実験に使用されるＳＤＡ増幅プライマーおよび
バンパープライマーは、C.A. Spargo et al. (1996. Mo
lec. Cell. Probes10, 247-256)により記述されてい
る。ヒト胎盤ＤＮＡのみ（１００ｎｇ／μＬ）をゼロ標
的コントロール試料に加えた。この試料を、沸騰水浴
中、１００℃で３分間変成させ、５２℃に移し、４分間
平衡化させた。酵素（３０単位のＡｖａＩ、３６単位の
ｅｘｏ- ＢＳＴ）およびＳＳＢ（ｇｐ３２ １０μｇ）
を５μＬの各試料に加え、混合して５２℃で３０分間置
いた。１００℃で５分間加熱することにより、反応を停
止させた。増幅産物は、Walker et al. （Nucl. Acads
Res., 上述）に記載されたように、ハイブリダイゼーシ
ョン及び末端標識検出用プローブの伸長により検出し
た。６μＬの検出用混合物（３５ｍＭのＫｉＰＯ4 （ｐ
Ｈ７．６）５μＬ、６ｍＭのＭｇＯＡｃ、１ｍＭの各ｄ
ＮＴＰ、１μＬの標識プローブ）をＳＤＡ反応に加え
た。１００℃で３分間変性した後、３７℃に移し、３分
間平衡化させた。２μＬのｅｘｏ- Ｋｌｅｎｏｗ（５０
％グリセロール中１Ｕ／μＬ）を加え、伸長反応を３７
℃で１５分間インキュベートした。ホルムアミド停止溶
液（９０％ホルムアミド、０．０５％ＢＰＢ、１×ＴＢ
Ｅ）１３μＬを加えることによって反応を停止させた。
各試料の半分（１３μＬ）を８％シークエンシングゲル
に供し、５７ワットで約１時間電気泳動した。ＵＤＧを
使用してアンプリコン汚染除去をするためにｄＵＴＰを
この実験に含めたが、ＴＴＰをｄＵＴＰの代わりに使用
することが可能であり、この場合、リン酸緩衝液を３０
ｍＭまで増加させ、他のｄＮＴＰ（一般に約０．２ｍ
Ｍ）と同量でＴＴＰを含むことが有利である。
【００２０】初期濃度と関係なく、ＳＳＢの非存在下で
は、５００ｂｐ標的の検出可能な増幅は全くみられなか
った。対照的に、ｇｐ３２が存在するとき、標的増幅は
容易に検出され、ＳＳＢによる増幅効率の有意な改善を
示した。ｇｐ３２およびｄＵＴＰの存在下における増幅
率を下表に示す。
は、５００ｂｐ標的の検出可能な増幅は全くみられなか
った。対照的に、ｇｐ３２が存在するとき、標的増幅は
容易に検出され、ＳＳＢによる増幅効率の有意な改善を
示した。ｇｐ３２およびｄＵＴＰの存在下における増幅
率を下表に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】ｄＵＴの代わりにＰＴＴＰが存在する条件
下で、増幅率は約２倍上昇した。これらの実験では１０
分子という僅かな５００ｂｐ標的を容易に検出でき、長
い標的の非常に感度のよいアッセイであることがわかっ
た。ＢｓｏＢＩおよびｅｘｏ- Ｂｓｔポリメラーゼを使
用して、同様のプロトコルで実験を繰り返し、同様の結
果が得られた。これらの反応は、ＴＴＰ系でもｄＵＴＰ
系でも、５００ｂｐ標的で約１０7 〜１０8 の増幅率を
達成した。これらの増幅率は、長さ１００ｂｐ未満の標
的（すなわち、ＳＳＢを全く加えていない短い標的）の
従来の典型的なＳＤＡの増幅率よりも僅かに少ないだけ
であった。
下で、増幅率は約２倍上昇した。これらの実験では１０
分子という僅かな５００ｂｐ標的を容易に検出でき、長
い標的の非常に感度のよいアッセイであることがわかっ
た。ＢｓｏＢＩおよびｅｘｏ- Ｂｓｔポリメラーゼを使
用して、同様のプロトコルで実験を繰り返し、同様の結
果が得られた。これらの反応は、ＴＴＰ系でもｄＵＴＰ
系でも、５００ｂｐ標的で約１０7 〜１０8 の増幅率を
達成した。これらの増幅率は、長さ１００ｂｐ未満の標
的（すなわち、ＳＳＢを全く加えていない短い標的）の
従来の典型的なＳＤＡの増幅率よりも僅かに少ないだけ
であった。
【００２３】実施例２ ＳＳＢの存在下で、様々な標的の長さが増幅に与える影
響を調査するため、様々な長さの標的をλＳＤＡ鋳型か
ら選択し、ｇｐ３２の存在下で増幅を試験した。図２に
示すように、ｇｐ３２の非存在下では、１００ｂｐでの
約１０10から２００ｂｐでの約１０4 まで、標的の長さ
が増加するにつれて増幅率が低下した。標的の長さが約
３００ｂｐに達すると、増幅は本質的に検出できない。
対照的に、ｇｐ３２は１００〜２００ｂｐで増幅効率の
低下を実質的に防止し、長さ約１，０００ｂｐの標的を
約１０6 倍増幅することが可能である。実際には、ＳＳ
Ｂを増幅反応に加えると、一般に５００ｂｐの標的では
約１０8 倍の増幅と１０〜１００分子検出感度をもたら
し、（ＴＴＰを使用した）８００ｂｐの標的では約１０
8 倍の増幅と１０〜１００分子検出感度をもたらし、
（ＴＴＰを使用した）１，０００ｂｐの標的では約１０
6 倍の増幅と１００〜１０００分子検出感度をもたらし
た。以上の結果から、ＳＳＢは長さ少なくとも約１００
ヌクレオチド、たとえば、長さ約１００〜５，０００ヌ
クレオチドの、標的の増幅効率および鎖置換複製効率の
改善をもたらす。しかし、ほとんどの複製反応および増
幅反応で、好ましい長い標的は一般に長さ約１５０〜約
２，０００ヌクレオチドである。標的の長さが増加する
と、反応産物を検出するために、反応時間を増加するこ
とが必要であるが、この長い標的は、増幅効率を高める
ためにＳＳＢを使用して容易に複製または増幅される。
響を調査するため、様々な長さの標的をλＳＤＡ鋳型か
ら選択し、ｇｐ３２の存在下で増幅を試験した。図２に
示すように、ｇｐ３２の非存在下では、１００ｂｐでの
約１０10から２００ｂｐでの約１０4 まで、標的の長さ
が増加するにつれて増幅率が低下した。標的の長さが約
３００ｂｐに達すると、増幅は本質的に検出できない。
対照的に、ｇｐ３２は１００〜２００ｂｐで増幅効率の
低下を実質的に防止し、長さ約１，０００ｂｐの標的を
約１０6 倍増幅することが可能である。実際には、ＳＳ
Ｂを増幅反応に加えると、一般に５００ｂｐの標的では
約１０8 倍の増幅と１０〜１００分子検出感度をもたら
し、（ＴＴＰを使用した）８００ｂｐの標的では約１０
8 倍の増幅と１０〜１００分子検出感度をもたらし、
（ＴＴＰを使用した）１，０００ｂｐの標的では約１０
6 倍の増幅と１００〜１０００分子検出感度をもたらし
た。以上の結果から、ＳＳＢは長さ少なくとも約１００
ヌクレオチド、たとえば、長さ約１００〜５，０００ヌ
クレオチドの、標的の増幅効率および鎖置換複製効率の
改善をもたらす。しかし、ほとんどの複製反応および増
幅反応で、好ましい長い標的は一般に長さ約１５０〜約
２，０００ヌクレオチドである。標的の長さが増加する
と、反応産物を検出するために、反応時間を増加するこ
とが必要であるが、この長い標的は、増幅効率を高める
ためにＳＳＢを使用して容易に複製または増幅される。
【００２４】ＳＳＢは、効率よく増幅することが可能な
標的の長さが有意に増加するＤＮＡ標的の場合でもＲＮ
Ａ標的（逆転写増幅）の場合でも、長い標的の増幅効率
改善に有用である。長い標的の増幅効率のＳＳＢ増強
は、たとえば、米国特許第５，５２３，２０４号に記載
されているような in situ増幅およひ複製反応に応用す
ることが可能である。本発明が機能する特定の機構に束
縛されたくないが、出願人は、非前進型複製中にポリメ
ラーゼが分離するとき、ＳＳＢは置換された一本鎖に結
合し、複製フォークの運動を容易にし、伸長される鎖と
置換される鎖の間の分岐移動を阻害するという仮説をた
てた。このような機構によって、ＳＤＡ中にみられる複
製中断数の明白な減少が説明され、この減少は、長い標
的の効率よい増幅の一助になると考えられる。同じＳＳ
Ｂ活性でミスプライミングが減少するため、観察された
非特異的バックグラウンド増幅の減少もこの機構に起因
すると考えられる。以上の実験から、ＳＳＢの存在下で
長い標的の鎖置換複製効率が改善されることがわかる。
鎖置換複製反応はＳＤＡの中枢であり、ＳＤＡで鎖置換
複製反応のモデルとして長い標的の増幅効率の増強を例
証してきた。しかし、ＤＮＡポリメラーゼを使用して鎖
置換複製を実施する反応で複製することができる標的の
長さの同様な増加が期待される。
標的の長さが有意に増加するＤＮＡ標的の場合でもＲＮ
Ａ標的（逆転写増幅）の場合でも、長い標的の増幅効率
改善に有用である。長い標的の増幅効率のＳＳＢ増強
は、たとえば、米国特許第５，５２３，２０４号に記載
されているような in situ増幅およひ複製反応に応用す
ることが可能である。本発明が機能する特定の機構に束
縛されたくないが、出願人は、非前進型複製中にポリメ
ラーゼが分離するとき、ＳＳＢは置換された一本鎖に結
合し、複製フォークの運動を容易にし、伸長される鎖と
置換される鎖の間の分岐移動を阻害するという仮説をた
てた。このような機構によって、ＳＤＡ中にみられる複
製中断数の明白な減少が説明され、この減少は、長い標
的の効率よい増幅の一助になると考えられる。同じＳＳ
Ｂ活性でミスプライミングが減少するため、観察された
非特異的バックグラウンド増幅の減少もこの機構に起因
すると考えられる。以上の実験から、ＳＳＢの存在下で
長い標的の鎖置換複製効率が改善されることがわかる。
鎖置換複製反応はＳＤＡの中枢であり、ＳＤＡで鎖置換
複製反応のモデルとして長い標的の増幅効率の増強を例
証してきた。しかし、ＤＮＡポリメラーゼを使用して鎖
置換複製を実施する反応で複製することができる標的の
長さの同様な増加が期待される。
【図１】４０℃および５０℃における線状ＳＤＡスクリ
ーニングアッセイにおける増幅効率に対してＳＳＢが与
える影響を示す図である。
ーニングアッセイにおける増幅効率に対してＳＳＢが与
える影響を示す図である。
【図２】長さが増加する標的の増幅効率に対してｇｐ３
２が与える影響を示す図である。
２が与える影響を示す図である。
配列番号：１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTAAGGC GTACTCGACC 40 配列番号：２ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGCTGAACCG GAT 13
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
Claims (10)
- 【請求項１】 鎖置換複製反応で長い標的を複製するこ
とを含んでなる長い標的の複製効率を高める方法であっ
て、前記反応には鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと一本鎖Ｄ
ＮＡ結合タンパク質とが関与し、前記一本鎖ＤＮＡ結合
タンパク質は、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が存在
しない条件下での長い標的の複製効率に比べて、長い標
的の複製効率を高めるのに十分な量で存在することを特
徴とする複製効率を高める方法。 - 【請求項２】 鎖置換複製反応は、核酸増幅反応で起こ
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 核酸増幅反応は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）
である請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ｇｐ３
２、ｒｐａ−１、ｒｉｍ−１、ｇｐ２．５およびｐ５か
ら成る群から選択される請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 長い標的は、長さ約１００〜約５，００
０ヌクレオチドである請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 鎖置換複製ステップを含む長い標的を増
幅する増幅反応の長い標的の増幅効率を高める方法であ
って、前記増幅反応には、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とが関与し、前記一本鎖Ｄ
ＮＡ結合タンパク質は、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク
質が存在しない条件下での長い標的の増幅効率に比べ
て、長い標的の増幅効率を高めるのに十分な量で存在す
ることを特徴とする増幅効率を高める方法。 - 【請求項７】 増幅反応は、鎖置換増幅である請求項５
に記載の方法。 - 【請求項８】 一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ｇｐ３
２、ｒｐａ−１、ｒｉｍ−１、ｇｐ２．５およびｐ５か
ら成る群から選択される請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】 長い標的は、長さ約１００〜約５，００
０ヌクレオチドである請求項６に記載の方法。 - 【請求項１０】 長い標的は、長さ約１５０〜約２，０
００ヌクレオチドである請求項９に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80510097A | 1997-02-24 | 1997-02-24 | |
| US08/805,100 | 1997-02-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10234389A true JPH10234389A (ja) | 1998-09-08 |
Family
ID=25190674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10052850A Pending JPH10234389A (ja) | 1997-02-24 | 1998-02-18 | 一本鎖ｄｎａ結合タンパク質を使用する核酸の複製 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0869187A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10234389A (ja) |
| CA (1) | CA2224120A1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005333920A (ja) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Aisin Seiki Co Ltd | 等温増幅可能な鎖置換ｄｎａポリメラーゼを用いたテンプレートｄｎａ分子の増幅方法 |
| WO2008013010A1 (fr) * | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Nishikawa Rubber Co., Ltd. | Procédé d'amplification d'une séquence nucléotidique |
| JP2010263845A (ja) * | 2009-05-15 | 2010-11-25 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸分析方法及び核酸分析装置 |
| JP2011512821A (ja) * | 2008-02-29 | 2011-04-28 | ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ | コールドショックタンパク質組成物、並びにその使用のための方法及びキット |
| US7973131B2 (en) | 2005-07-29 | 2011-07-05 | Aisin Seiki Kabushiki Kaisha | Extreme thermophile single-stranded DNA binding mutant protein, and nucleic acid isothermal amplification method of use thereof |
| US9422599B2 (en) | 2008-02-29 | 2016-08-23 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Cold shock protein compositions and methods and kits for the use thereof |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2365263A1 (en) * | 1999-03-12 | 2000-09-21 | Mcgill University | A method for increasing the processivity of a dna- or rna-dependent polymerase and compositions therefor |
| US7700281B2 (en) | 2004-06-30 | 2010-04-20 | Usb Corporation | Hot start nucleic acid amplification |
| CN114230644A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-25 | 南京巨匠生物科技有限公司 | 一种gp32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5648211A (en) * | 1994-04-18 | 1997-07-15 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification using thermophilic enzymes |
-
1998
- 1998-02-17 EP EP98102695A patent/EP0869187A3/en not_active Withdrawn
- 1998-02-18 JP JP10052850A patent/JPH10234389A/ja active Pending
- 1998-02-24 CA CA002224120A patent/CA2224120A1/en not_active Abandoned
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005333920A (ja) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Aisin Seiki Co Ltd | 等温増幅可能な鎖置換ｄｎａポリメラーゼを用いたテンプレートｄｎａ分子の増幅方法 |
| US7973131B2 (en) | 2005-07-29 | 2011-07-05 | Aisin Seiki Kabushiki Kaisha | Extreme thermophile single-stranded DNA binding mutant protein, and nucleic acid isothermal amplification method of use thereof |
| WO2008013010A1 (fr) * | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Nishikawa Rubber Co., Ltd. | Procédé d'amplification d'une séquence nucléotidique |
| JP2008048725A (ja) * | 2006-07-26 | 2008-03-06 | Nishikawa Rubber Co Ltd | 核酸配列の増幅方法 |
| JP2011512821A (ja) * | 2008-02-29 | 2011-04-28 | ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ | コールドショックタンパク質組成物、並びにその使用のための方法及びキット |
| US9422599B2 (en) | 2008-02-29 | 2016-08-23 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Cold shock protein compositions and methods and kits for the use thereof |
| JP2010263845A (ja) * | 2009-05-15 | 2010-11-25 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸分析方法及び核酸分析装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0869187A3 (en) | 2001-02-28 |
| CA2224120A1 (en) | 1998-08-24 |
| EP0869187A2 (en) | 1998-10-07 |
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