JP2007532135A - 高血糖症および関連障害の処置のための、ヒトgタンパク質共役レセプターおよびそのモジュレーター - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、1以上の候補化合物がGタンパク質共役レセプター(GPCR)のモジュレーターであるか、または血中グルコース濃度のモジュレーターであるかを同定する方法に関する。特定の実施形態では、GPCRはヒトGPCRである。本発明はまた、GPCRのモジュレーターを用いる方法に関する。好ましいモジュレーターはアゴニストである。本発明のアゴニストは、血中グルコース濃度を低下させるための治療剤として、特定の代謝障害(例えば、インスリン抵抗性、グルコース寛容減損、および糖尿病)を予防または処置するための治療剤として、そして上昇した血中グルコース濃度の合併症(例えば、アテローム性動脈硬化症、心臓病、発作、高血圧症および末梢脈管疾患)を予防または処置するための治療剤として、有用である。
以下の考察は、本発明の理解を促進することを意図するが、本発明の先行技術であることを意図するわけでも認めるわけでもない。
血中グルコース濃度は、代表的に、狭い範囲に維持される。血中グルコース濃度の上昇は通常、インスリンの放出増加をもたらし、次いでこれは、標的細胞に作用して、グルコース取り込みを増加させる。血中グルコースホメオスタシスの調節不全は、血中グルコース濃度の持続した上昇、すなわち、高血糖症をもたらし得る。高血糖症を有する一部の個体は、2型糖尿病を発症することになり得る。組織が高血糖に慢性的にさらされることにより、ニューロパシー、網膜症および腎症の微小血管の問題ならびに発作、冠状心臓病、および末梢脈管疾患の大血管(macrovascular)合併症を含む多様な合併症がもたらされ得る。高血糖症は、より良好な管理選択肢を必要とする、主な、そして増えつつある医療問題である[非特許文献1;この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される]。
多数のレセプタークラスがヒトに存在するが、これまでのところ、最も豊富でかつ治療的に適切であるのは、Gタンパク質共役レセプター(GPCR)クラスによって表される。約30,000〜約40,000の遺伝子がヒトゲノムに存在すると見積もられ、そしてこれらのうち、約2%がGPCRをコードすると見積もられる。
RUP43(ここで、内因性RUP43がGPR131(例えば、GenBank(登録商標)登録番号NM_170699)であり得ることが理解される)は、胆汁酸についてのレセプターとして作用すると近年報告された[特許文献1として2004年1月7日に公開された欧州特許出願第02717114.9号;および非特許文献5;これらの各々の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される]。白血球内でのRUP43発現は、単球に特異的であることが報告され、そして単球のRUP43において作用する胆汁酸は、腫瘍壊死因子α(TNFα)の発現を阻害することが報告された。特許文献1に開示される化合物は、本発明の方法において用いられ得る。
出願人は、RUP43のアゴニストが脂肪細胞および骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを増加させることを予想外に見出した。出願人は、RUP43のアゴニストが、哺乳動物において血中グルコース濃度を低下させる予想外の有用性を有することを開示する。出願人はさらに、RUP43においてアゴニスト活性を有する新規化合物およびそのための用途を開示する。
(a)配列番号2のアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸2−330;
(c)RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;
(d)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号3のプライマーおよび配列番号4のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(e)配列番号6のアミノ酸配列;
(f)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(g)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸配列;
(h)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸2−330;
(i)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;および
(j)ストリンジェントな条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Gタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列。
候補化合物を、GPR131アミノ酸配列を含むGPCRと接触させる工程であって、ここでこのレセプターがGタンパク質と共役する、工程;および
このレセプターの機能性が調節されるか否かを決定する工程;
を包含し、ここで、レセプターの機能性における変化は、この候補化合物が、哺乳動物における血中グルコース濃度のモジュレーターであることを示す。
(a)配列番号2のアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸2−330;
(c)RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;
(d)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号3のプライマーおよび配列番号4のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(e)配列番号6のアミノ酸配列;
(f)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(g)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸配列;
(h)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸2−330;
(i)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;および
(j)ストリンジェントな条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Gタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列。
R1は、HまたはC1−6アルキルであり;
R2は、2−メチル−4,5,6,7−テトラヒドロ−2H−インダゾール−3−イル基である;または
R1およびR2は、それらが結合する窒素と一緒になって、3,4−ジヒドロ−2H−キノリン−1−イル基を形成し;そして
R10およびR11は、各々独立して、Hまたはハロゲンである
第三の局面では、本発明は、第一の局面の方法に従って同定されたGPCRのモジュレーターを特徴とする。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗原結合誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定の実施形態では、このモジュレーターは胆汁酸ではない。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、ヒトまたは動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、上記モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態では、上記モジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局面による化合物である。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症。
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患。
(a)配列番号2のアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸2−330;
(c)RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;
(d)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号3のプライマーおよび配列番号4のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(e)配列番号6のアミノ酸配列;
(f)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(g)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸配列;
(h)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸2−330;
(i)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;および
(j)ストリンジェントな条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Gタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列。
(a)放射性同位体;
(b)酵素;および
(c)発蛍光団。
(a)配列番号2のアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸2−330;
(c)RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;
(d)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号3のプライマーおよび配列番号4のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(e)配列番号6のアミノ酸配列;
(f)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(g)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸配列;
(h)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸2−330;
(i)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;および
(j)ストリンジェントな条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Gタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列。
(定義)
レセプター周辺で発展してきた科学文献は、レセプターに対して種々の影響を有するリガンドを言及するために多数の用語を適応させた。明確さおよび一貫性のために、以下の定義が、本特許文書全体を通して用いられる。これらの定義がこれらの用語についての他の定義と矛盾しない程度まで、以下の定義が優先する:
「アゴニスト」は、レセプターに結合した際に細胞内応答を活性化する物質(例えば、リガンド、候補化合物)を意味するものとする。いくつかの実施形態では、アゴニストは、レセプターに結合する際に細胞内応答を活性化する(例えば、膜へのGTPγS結合を増強するかまたは細胞内cAMPレベルを上昇させる)ことが以前には公知でなかった物質である。いくつかの実施形態では、アゴニストは、レセプターに結合する際に、哺乳動物から得た脂肪細胞または骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを刺激することが以前には公知でなかった物質である。
用語「C1−6アルキル」とは、示した数の炭素を含む、直鎖または分枝鎖の炭素ラジカルを示す。例えば、いくつかの実施形態では、アルキルは、「C1−4アルキル」であり、そしてこの基は1〜4個の炭素を含み、なお他の実施形態では、アルキルは、「C2−6アルキル」であり、そしてこの基は2〜6個の炭素を含む。アルキルは、いくつかの実施形態では、1〜3個の炭素を含み、いくつかの実施形態では、1〜2個の炭素を含み、そしていくつかの実施形態では、1個の炭素を含む。アルキルの例としては、メチル、エチル、n−プロピル、イソ−プロピル、n−ブチル、イソ−ブチル、t−ブチル、sec−ブチル、n−ペンチル、iso−ペンチル、sec−ペンチル、neo−ペンチル、ヘキシル、iso−ヘキシル、sec−ヘキシル、neo−ヘキシルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
(導入)
以下のセクションの順序は、提示上の効果のために示されており、以下の開示または特許請求の範囲の限定として意図されてはおらず、解釈もされるべきでない。
(B.レセプター発現)
(1.目的のGPCRポリペプチド)
本発明のRUP43 GPCRは、GPR131アミノ酸配列を含む。本明細書において使用される場合、「GPR131アミノ酸配列」は、配列番号2の内因性ヒトGPR131アミノ酸配列、および配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%もしくは少なくとも約99%同一な、改変体アミノ酸配列を包含することを意図される。言い換えると、配列番号2のアミノ酸配列の改変体を含むGPCRはまた、本方法に使用され得る。特定の実施形態において、本方法に使用され得るGPCRは、配列番号2のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体を含み得る。特定の実施形態において、配列番号2のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体は、プライマー(配列番号3および配列番号4)を使用してヒトDNAサンプルにおいてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができる、内因性GPR131ヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、配列番号2のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体は、配列番号3を含むプライマーおよび配列番号4を含むプライマーを使用してヒトDNAサンプルにおいてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができる、内因性GPR131ヌクレオチド配列によってコードされる。特定の実施形態において、ヒトDNAサンプルは、ヒトゲノムDNAである。特定の実施形態において、このプロセスは、RT−PCR(逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応)である。RT−PCR技術は、当業者に周知である。特定の実施形態において、ヒトcDNAサンプルは、ヒト単球またはヒトマクロファージのcDNAである。特定の実施形態において、ヒトcDNAサンプルは、ヒト脂肪細胞cDNAである。特定の実施形態において、ヒトcDNAサンプルは、ヒト骨格筋細胞cDNAである。特定の実施形態において、ヒトDNAサンプルは、提供される。特定の実施形態において、ヒトDNAサンプルは、販売元から得ることができる。特定の実施形態において、本方法に使用され得る改変体アミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸配列の哺乳動物オルソログである。例としてであり限定ではなく、ウサギ(例えば、GenBank(登録商標)登録番号BAC55237)、牝ウシ(例えば、GenBank(登録商標)登録番号NP_778219)、マウス(例えば、GenBank(登録商標)登録番号NP_778150)およびラット(例えば、GenBank(登録商標)登録番号NP_808797)のGPR131アミノ酸配列が、「GPR131アミノ酸配列」の範囲内として想定されることが理解される。本明細書において使用される場合「GPR131 GPCR」は、内因性RUP43 GPCRである;例としてであり限定ではなく、内因性ヒトRUP43 GPCRは、GenBank(登録商標)登録番号NM_170699のヒトGPR131(配列番号2と同一なアミノ酸配列を有する)およびその対立遺伝子改変体であり、内因性ウサギRUP43 GPCRは、GenBank(登録商標)登録番号BAC55237のウサギGPR131およびその対立遺伝子改変体であり、内因性牝ウシRUP43 GPCRは、GenBank(登録商標)登録番号NP_778219の牝ウシGPR131およびその対立遺伝子改変体であり、内因性マウスRUP43 GPCRは、GenBank(登録商標)登録番号NP_778150のマウスGPR131およびその対立遺伝子改変体であり、そして内因性ラットRUP43 GPCRは、GenBank(登録商標)登録番号NP_808797のラットGPR131およびその対立遺伝子改変体である。
クエリ配列(例えば、配列番号2のアミノ酸配列)と検索(interrogate)されるべき配列との間の最も良好に重複したマッチを決定するための好ましい方法はまた、グローバル配列アラインメントと称され、Brutlagら[Comp App Biosci(1990)6:237−245;この開示は、その全体が本明細書により参考として援用される]のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいて、クエリ配列および検索配列は、両方ともアミノ酸配列である。このグローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性である。FASTDBアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメータは、以下である:マトリクス=PAM 0、k−tuple=2、ミスマッチペナルティ=1、連結ペナルティ=20、ランダム化グループ=25、長さ=0、カットオフスコア=1、ウインドウサイズ=配列長、ギャップペナルティ=5、ギャップサイズペナルティ=0.05、ウインドウサイズ=247または検索アミノ酸配列の長さ(短いほう)。
特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、融合タンパク質であり、例えば、親和性タグドメインまたはレポータードメインを含み得る。適切な親和性タグとしては、別の部分(通常、別のポリペプチド、最も通常には、抗体)に特異的に結合し得る任意のアミノ酸配列が挙げられる。適切な親和性タグとしては、当該分野で公知であるように、エピトープタグ(例えば、V5タグ、FLAGタグ、HAタグ(血球凝集素インフルエンザウイルス由来)、mycタグなど)が挙げられる。適切な親和性タグとしてはまた、当該分野で公知であるように、結合する基質が知られているドメイン(例えば、HIS、GSTおよびMBPタグ)、ならびに特定の結合パートナー(例えば、抗体、特にモノクローナル抗体)が利用可能な他のタンパク質由来のドメインが挙げられる。適切な親和性タグとしてはまた、適切な結合パートナー(例えば、IgG Fcレセプター)を使用して特異的に結合されて検出され得る、任意のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン(例えば、IgG Fc領域)が挙げられる。このような融合タンパク質が、代替的アミノ酸で欠失もしくは置換されたN末端メチオニン残基を有していたGPCRとインフレームで融合した異種N末端ドメイン(例えば、エピトープタグ)を含み得ることが、明らかに企図される。
遺伝暗号および核酸を操作するための組換え技術は公知であり、そして目的のGPCRポリペプチドのアミノ酸配列が上記されているので、目的のGPCRポリペプチドをコードする核酸の設計および生成は、十分当業者の技術範囲内である。特定の実施形態において、標準的な組換えDNA技術法(Ausubelら,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley & Sons,1995;Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)が使用される。例えば、GPCRをコードする配列は、GPCRをコードする配列のライブラリから、種々の組換え法(本明細書において記載する必要はない)のいずれか1つまたはその組み合わせを使用して、単離され得る。その後、タンパク質をコードする核酸配列におけるヌクレオチドの置換、欠失および/もしくは付加が、標準的な組換えDNA技術を使用してまた行われ得る。
本発明は、本発明の核酸を含むベクター(「構築物」とも称される)をさらに提供する。本発明の多くの実施形態において、本発明の核酸配列は、配列が発現制御配列(例えば、プロモーターが挙げられる)に作動可能に連結された後、宿主細胞中で発現される。本発明の核酸はまた、代表的に、エピソームとしてかまたは宿主の染色体DNAの組み込まれた一部としてのいずれかで宿主細胞中で複製され得る、発現ベクター中に配置される。一般的に、発現ベクターは、選択マーカー(例えば、テトラサイクリンもしくはネオマイシン)を含み、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にする(例えば、米国特許第4,704,362号を参照のこと、これは、本明細書において参考として援用される)。ベクター(単一および二重発現カセットベクターを含む)は、当該分野で周知である(Ausubelら,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley & Sons,1995;Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)。適切なベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体(ヒト人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体など)、小型染色体などが挙げられる。レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが使用され得る。
本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞としては、原核生物(例えば、細菌細胞(例えば、E.coli))ならびに真核生物細胞(例えば、動物細胞(例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類、もしくは爬虫類の細胞)、植物細胞(例えば、トウモロコシもしくはシロイヌナズナ細胞)、または真菌細胞(例えば、S.cerevisiae細胞))が挙げられる。特定の実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な任意の細胞が、宿主細胞として使用され得る。通常、動物宿主細胞株が使用される例としては、以下である:サル腎臓細胞(COS細胞)、SV40によって形質転換されたサル腎臓CVI細胞(COS−7、ATCC CRL 165 1);ヒト胚腎臓細胞(HEK−293(「293」)、Grahamら,J.Gen Virol.36:59(1977));HEK−293T(「293T」)細胞;新生仔ハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO,UrlaubおよびChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4216,(1980);シリアンゴールデンハムスター細胞MCB3901(ATCC CRL−9595);マウスセルトーリ細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243−251(1980));サル腎臓細胞(CVI ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL 51);TRI細胞(Matherら,Annals N.Y.Acad.Sci 383:44−68(1982));NIH/3T3細胞(ATCC CRL−1658);およびマウスL細胞(ATCC CCL−1)。特定の実施形態において、メラニン保有細胞が使用される。メラニン保有細胞は、下等脊椎動物に見出される皮膚細胞である。関連する材料および方法は、米国特許第5,462,856号および同第6,051,386号の開示に従う。これらの特許の開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される。さらなる細胞株は、当業者に明らかであり、種々の細胞株が、American Type Culture Collection(10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110−2209)から利用可能である。
(1.一般的GPCRスクリーニングアッセイ技術)
Gタンパク質レセプターが活性になる場合、それは、Gタンパク質(例えば、Gq,Gs,Gi,Gz,Go)に結合して、GTPのGタンパク質への結合を刺激する。次いで、Gタンパク質は、GTPaseとして作用し、GTPをGDPへとゆっくりと加水分解する。これによって、レセプターは、通常の条件下で、脱活性化される。しかし、活性化したレセプターは、GDPをGTPへと変換し続ける。GTPの非加水分解性アナログである[35S]GTPγSは、活性化されたレセプターを発現する膜への増強された結合をモニタリングするために使用され得る。リガンドの存在下および非存在下で膜へのGタンパク質共役をモニタリングするために、[35S]GTPγSが使用され得ることが報告されている。とりわけ当業者に周知であり、利用可能であるモニタリングの例は、TraynorおよびNahorskiによって1995年に報告された。このアッセイの好ましい使用は、候補化合物の初期スクリーニングのための使用である。なぜなら、この系は、特定のGタンパク質に関わらず、レセプターの細胞内ドメインと相互作用するあらゆるGタンパク質共役レセプターに対して、一般的に適用可能だからである。
一旦候補化合物が「一般的」Gタンパク質共役レセプターアッセイ(すなわち、アゴニストもしくは逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ)を使用して同定された場合、いくつかの実施形態において、化合物がレセプター部位で相互作用することを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「一般的」アッセイによって同定される化合物はレセプターに結合していなくともよいが、代わりに、細胞内ドメイン由来のGタンパク質に「結合しない」だけでもよい。
Gsは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。Gi(およびGzおよびGo)は、一方で、アデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼは、ATPからcAMPへの変換を触媒する。したがって、Gsタンパク質に結合する活性化されたGPCRは、cAMPの細胞レベルの増加に関連する。一方、Gi(またはGz,Go)タンパク質に結合する活性化されたGPCRは、cAMPの細胞レベルの減少に関連する。一般的に、「Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission」第8章,From Neuron To Brain(第3版)Nichols,J.G.ら編、Sinauer Associates,Inc.(1992)を参照のこと)。従って、cAMPを検出するアッセイは、候補化合物(例えば、逆アゴニスト)がレセプターに対する(すなわち、このような化合物は、cAMPレベルを減少させる)ものか否かを決定するために利用され得る。当該分野で公知のcAMPを測定するための種々のアプローチが、利用され得る。いくつかの実施形態において、好ましいアプローチは、ELISAベースの形式における抗cAMP抗体の使用に依存する。使用され得る別の型のアッセイは、全細胞セカンドメッセンジャーレポーターシステムアッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックAMPは、cAMP反応性DNA結合Gタンパク質、またはcAMP反応性エレメントと呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合してその遺伝子の発現を駆動する転写因子(CREB)への結合を促進することによって、遺伝子発現を駆動する。レポーター遺伝子の前に複数のcAMP反応性エレメントを含むプロモーターを有するレポーターシステムが構築され得る(例えば、β−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ)。したがって、活性化されたGs結合レセプターは、次に遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化させるcAMPの蓄積を引き起こす。レポータータンパク質(例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼは、次いで、標準的な生化学的アッセイを使用して検出され得る(Chenら1995)。
GqおよびGoは、酵素ホスホリパーゼCの活性化に関与する。これは次に、リン脂質PIP2を加水分解し、2つの細胞内メッセンジャー(ジアシルグリセロール(DAG)およびイノシトール1,4,5−三リン酸(IP3))を放出する。IP3の蓄積の増加は、Gq関連およびGo関連レセプターの活性化に関する。一般的に、「Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission」,第8章,From Neuron To Brain(第3版)Nichols,J.G.ら編,Sinauer Associates,Inc.(1992)を参照のこと。IP3蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、Gq関連およびGo関連レセプターの逆アゴニストである(すなわち、このような化合物は、IP3のレベルを減少させる)か否かを決定するために使用され得る。Gq関連レセプターはまた、APIレポーターアッセイを使用して調べられ得る。このアッセイにおいては、Gq依存性ホスホリパーゼCは、APIエレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こし、したがって、活性化されたGq関連レセプターは、このような遺伝子の発現の増加を証明し、それによってその逆アゴニストは、このような発現の減少を証明し、そしてアゴニストは、このような発現の増加を証明する。このような検出のための市販のアッセイが利用可能である。
逆アゴニストもしくはアゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングに使用するための、内因性の、構成的に活性なGPCRまたは非内因性の、構成的に活性化されたGPCRの使用は、興味深いスクリーニングの課題を提供する。ここで、定義によると、レセプターは、それに結合する内因性リガンドの非存在下でもなお活性である。したがって、このような化合物が逆アゴニストもしくはアゴニストであり得るか、またはこのようなレセプターに何の影響も有さないか否かについて理解することを可能にするために、例えば、候補化合物の存在下での非内因性レセプターと、その化合物の非存在下での非内因性レセプターとを区別するため、いくつかの実施形態において、利用されるアプローチがそのような区別を増強し得ることが好ましい。いくつかの実施形態において、好ましいアプローチは、GPCR融合タンパク質の使用である。
Gi結合レセプターは、アデニリルシクラーゼを阻害し、それによってcAMP産生のレベルを減少させることが知られている。このことは、cAMPレベルの評価をやりがいのあるものとさせ得る。特定の実施形態において、活性によって優先的にGiに結合するレセプターの活性化の指標としてのcAMPの産生の減少の測定に有効な技術は、シグナルエンハンサー(例えば、活性化によってGsに優先的に結合する非内因性の、構成的に活性化されたレセプター(例えば、TSHR−A623I;下記参照))とGi結合GPCRとの同時トランスフェクションによって達成され得る。明らかであるように、Gs結合レセプターの活性化は、cAMPの産生の増加に基づいて決定され得る。Gi結合レセプターの活性化は、cAMPの産生の減少をもたらす。したがって、これらの「対照的」影響を有利に活用する同時トランスフェクションアプローチが意図される。例えば、非内因性の、構成的に活性化されたGs結合レセプター(「シグナルエンハンサー」)と発現ベクター単独との同時トランスフェクションは、ベースラインcAMPシグナルを提供する(すなわち、Gi結合レセプターはcAMPレベルを減少させるが、この「減少」は、構成的に活性化されたGs結合シグナルエンハンサーによって確立されたcAMPレベルの実質的な増加と関連する)。従って、シグナルエンハンサーと「標的」レセプターとの同時トランスフェクションによって、Gi結合標的レセプターの逆アゴニストは、測定されたcAMPシグナルを増加させ、一方Gi結合標的レセプターのアゴニストは、このシグナルを減少させる。
(候補化合物)
当該分野で公知の任意の分子は、本発明のGPCRの活性を調節(増加もしくは減少)するその能力について試験され得る。活性を調節する化合物を同定するため、候補化合物は、レセプターを発現する細胞に直接的に提供され得る。
一般的に、このようなスクリーニングの結果は、独特のコア構造を有する化合物である。その後、これらの化合物は、好ましいコア構造の周りでさらなる化学的修飾に供されて、その医薬特性をさらに増強され得る。このような技術は、当業者に公知であり、本特許文献においては詳細を扱わない。
本発明の1つの局面は、式(II)の化合物:
ここで、
R1は、HまたはC1−6アルキルであり;
R2は、2−メチル−4,5,6,7−テトラヒドロ−2H−インダゾール−3−イル基であるか;または、
R1およびR2は、それらが結合する窒素と一緒になって、3,4−ジヒドロ−2H−キノリン−1−イル基を形成し;そして
R10およびR11は、各々独立して、Hまたはハロゲンである。
(本発明の化合物の調製−一般的合成方法)
本発明の新規化合物は、種々の合成方法に従って容易に調製され得る。これらの合成方法の全ては、当業者によく知られている。本発明の化合物の調製のために特定の方法としては、下記のスキーム1〜3に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、処置(または予防)を必要とする個体に、治療有効量の本発明のモジュレーターを投与することによる処置(および予防)方法を提供する[また、例えばPCT出願番号PCT/IB02/01461(2002年8月29日にWO 02/066505として公開)を参照のこと;これらの各々の開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される]。好ましい局面において、上記モジュレーターは、アゴニストである、好ましい局面において、上記モジュレーターは、実質的に精製されている。上記個体は、好ましくは、動物であり(牝ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウスなどのような動物が挙げられるが、これらに限定されない)、好ましくは、哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。
適切な投与経路としては、当該分野で公知の方法を使用する、経口投与、経鼻投与、直腸投与、経粘膜投与、経皮投与または腸管投与、非経口送達(筋肉内注射、皮下注射、髄内注射)、ならびに髄腔内注入、直接心室内注入、静脈内注入、腹腔内注入、鼻腔内注入、肺内注入(吸入)または眼内注入が挙げられる。他の特定の好ましい投与経路は、エアロゾルおよび貯蔵(depot)処方である。本発明の医薬の徐放性処方物(特に貯蔵)は、明確に企図される。特定の実施形態において、投与経路は、経口である。
本発明に従う使用のための薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物および医薬は、1つ以上の生理学的に受容可能なキャリア(賦形剤および補助剤を包含する)を使用して、従来の様式で処方され得る。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。
本発明における使用に適切な薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物としては、活性成分が、それらの意図される目的を達成するための有効量で含有されている組成物が挙げられる。さらに具体的には、治療有効量は、処置されるべき被験体の現存する症状の発生を予防するか、またはその症状を改善するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、当業者の能力の範囲内である。
本発明は、とりわけ、以下に挙げられる方法に関するが、これらに限定されない:血中グルコース濃度を低下させる方法、特定の代謝障害(例えば、インスリン抵抗性および糖尿病)を予防もしくは処置する方法、ならびに上昇した血中グルコース濃度の合併症(例えば、アテローム性動脈硬化症、心臓疾患、発作、高血圧症、および末梢血管疾患)を予防もしくは処置する方法。上記方法は、このような処置を必要とする個体に本発明のモジュレーターを提供する工程を包含する。特定の実施形態において、モジュレーターは、アゴニストである。いくつかの実施形態において、モジュレーターは、経口的にバイオアベイラビリティーがある。いくつかの実施形態において、この経口的にバイオアベイラビリティーがあるモジュレーターは、さらに血液脳関門を横切ることができる。特定の実施形態において、モジュレーターは、薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物中において個体に提供される。特定の実施形態において、モジュレーターは、薬学的組成物中において個体に提供される。特定の実施形態において、モジュレーターは、生理学的に受容可能な組成物中において個体に提供される。特定の実施形態において、モジュレーターは、経口的に摂取される薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物中において個体に提供される。特定の実施形態において、上記個体は、非ヒト哺乳動物である。特定の実施形態において、上記個体は、哺乳動物である。特定の実施形態において、上記個体または哺乳動物は、ヒトである。
RUP43レセプター機能を調節(すなわち、増加、減少またはブロック)する因子は、候補化合物とRUP43レセプターとを接触させ、そしてRUP43レセプター機能に対する候補化合物の効果を決定することによって同定され得る。RUP43レセプターの機能を調節する化合物の選択性は、RUP43レセプターに対するその効果を他のGタンパク質共役レセプターに対するその効果と比較することによって、評価され得る。例であり限定ではなく、内因性RUP43レセプターのモジュレーターは、同じ種に由来する1つ以上の他の内因性Gタンパク質共役レセプターと比較して、選択的であることが示され得る。例であり限定ではなく、内因性RUP43レセプターのアゴニストは、このアゴニストの内因性RUP43レセプターに対するEC50が、同じ種に由来する1つ以上の他の内因性Gタンパク質共役レセプターに対するアゴニストのEC50に対して少なくとも100倍低い場合、選択的RUP43アゴニストであることが示され得る。RUP43レセプター機能を調節する化合物の同定に続いて、このような候補化合物は、それらの活性を確認もしくは定量するために、他のアッセイ(インビトロモデルが挙げられるが、これらに限定されない)においてさらに試験され得る。RUP43レセプター機能のモジュレーターは、正常または異常なRUP43レセプター機能が関与する疾患および生理学的状態の処置において、治療上有用である。
A.トリチウムガスによる触媒的還元−この手順は、通常、高い比放射能の生成物を生じ、ハロゲン化されているかもしくは不飽和の前駆物質を必要とする。
B.水素化ホウ素ナトリウム[3H]による還元−この手順は、より費用がかからず、還元性の官能基(例えば、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなど)を含有する前駆体を必要とする。
C.水素化アルミニウムリチウム[3H]による還元−この手順は、ほぼ理論どおりの比放射能にある生成物を提供する。これはまた、還元性官能基(例えば、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなど)を含有する前駆体を必要とする。
D.トリチウムガス暴露標識−この手順は、適切な触媒の存在下で、交換可能なプロトンを含有する前駆体をトリチウムガスに暴露する工程を包含する。
E.N−ヨウ化メチル[3H]を使用するメチル化−この手順は、高い比放射能のヨウ化メチル(3H)で適切な前駆体を処理することによって、O−メチルまたはN−メチル(3H)生成物を調製するために通常利用される。この方法は、一般的に、高い比放射能(例えば、約70〜90Ci/mmol)を可能にする。
A.サンドマイヤー反応および類似の反応−この手順は、アリールもしくはヘテロアリールアミンをジアゾニウム塩(例えば、テトラフルオロホウ酸塩)に変換し、次いでNa125Iを使用して125I標識化合物に変換する。代表的方法は、Zhu,D.−G.および共同研究者(J.Org.Chem.2002,67,943−948)によって報告された。
B.フェノールのオルト125ヨウ素化−この手順は、Collier,T.L.および共同研究者(J.Labeled Compd Radiopharm.1999,42,S264−S266)に報告されるように、フェノールのオルト位における125Iの取り込みを可能にする。
C.125I−による臭化アリールおよび臭化ヘテロアリールの交換−この方法は、一般的に2工程プロセスである。第一の工程は、臭化アリールもしくは臭化ヘテロアリールの、対応するトリアルキルスズ中間体への変換である。この変換には、トリアルキルスズハライドもしくはヘキサアルキル二スズ[例えば、(CH3)3SnSn(CH3)3]の存在下で、例えば、Pdに触媒される反応[すなわち、Pd(Ph3P)4]を使用するか、またはアリールリチウムもしくはヘテロアリールリチウムを介する。代表的手順は、Bas,M.−D.および共同研究者(J.Labeled Compd Radiopharm.2001,44,S280−S282)によって報告された。
(ヒトGPCRの全長クローニング)
(内因性ヒトRUP43(配列番号1および2))
全長内因性ヒトRUP43(GPR131、例えば、GenBank(登録商標)登録番号NM_170699)をコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書において記載されるようにクローニングされ得る。配列番号1は、内因性ヒトRUP43(GPR131)ポリヌクレオチドをコードする配列であり、本明細書において記載されるようにクローニングされ得る。配列番号2は、対応するコードされた内因性ヒトRUP43(GPR131)ポリペプチドである。
5’−GACAAGCATGACGCCCAACAGCACTGGCGAG−3’(5’−プライマー;配列番号3)、および
5’−CTTGAATTAGTTCAAGTCCAGGTCGACACTGC−3’(3’−プライマー;配列番号4)
を使用して、ヒトDNAをテンプレートとしたPCRによってクローニングされる。このヒトDNAは、ゲノムDNAまたはcDNAであり得る。使用されるサイクル条件は、95℃で40秒間、60℃で50秒間、および72℃で1分間を25サイクルである。1.0kbのPCR産物を、pCRII−TOPOTMベクター(Invitrogen)にクローニングする。
全長内因性ヒトRUP43(GPR131)ポリペプチド(N末端メチオニンを欠く)およびN末端HAエピトープタグとC末端に置かれたV5Hisエピトープタグとをコードするポリヌクレオチドを、本明細書において記載されるようにクローニングした。「HA」エピトープタグは、アミノ酸配列MYPYDVPDYAを含む。「V5」は、アミノ酸配列GKPIPNPLLGLDSTを含む。「His」は、アミノ酸配列HHHHHHを含む。配列番号5は、内因性ヒトRUP43(GPR131)ポリヌクレオチドをコードし、5’末端HAエピトープタグと3’末端V5Hisエピトープタグとを有する配列(N末端メチオニンをコードするコドンを欠く)である。配列番号6は、対応するコードされたHA/V5His二重タグ化RUP43 ポリペプチドである。
5’−GACAAGCTTGACGCCCAACAGCACTGGCGAG−3’(配列番号7)
3’PCRプライマーは、EcoRI部位を組み込み、以下の配列を有した:
5’−CTTGAATTCGTTCAAGTCCAGGTCGACACTGC−3’(配列番号8)。
(非内因性、構成的に活性化されたヒトRUP43の調製)
当業者は、核酸配列の変異のための技術を選択する能力を有すると考えられる。以下に提示されるのは、非内因性バージョンのヒトGPCRを作製するために利用され得るアプローチである。本明細書において開示される内因性ヒトRUP43(GPR131)のための変異は保存プロリン(または、それらの内因性構成的置換)残基(GPCRのTM6領域に位置する、TM6/IC3界面近く)に対してN末端の第16番アミノ酸(GPCRのIC3領域に位置する)が、好ましくはヒスチジンアミノ酸、アルギニンアミノ酸、またはリジンアミノ酸に、最も好ましくはリジンアミノ酸残基に変異されるアルゴリズム的アプローチに基づく。
非内因性ヒトGPCRの調製は、ヒトGPCRにおいて、特に、Transformer Site−DirectedTMMutagenesis Kit(Clontech)を使用して、製造者の指示書に従って、達成され得る。2つの突然変異誘発性プライマー、最も好ましくは、リジン変異を引き起こすリジン突然変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチドが利用される。便宜上、ヒトGPCRに組み込まれるべきコドン変異はまた、標準的な形態で注記される。
非内因性ヒトGPCRの調製はまた、QuikChangeTMSite−DirectedTM Mutagenesis Kit(Stratagene、製造者の指示書に従う)を使用して達成され得る。内因性GPCRは、好ましくは、テンプレートとして使用され、そして2つの突然変異誘発プライマー、同じく最も好ましくは、リジン突然変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチド(キットに含まれる)が利用される。便宜上、新規のヒトGPCRに組み込まれるコドン変異およびそれぞれのオリゴヌクレオチドは、標準的な形態で注記される。
(レセプター発現)
タンパク質の発現のために種々の細胞が当該分野で利用可能であるが、哺乳動物細胞またはメラニン保有細胞は、利用されるのに最も好ましい。この主な理由は、実用性によって断定される。すなわち、例えば、GPCRの発現のための酵母細胞の利用は、おそらく、このプロトコールへ、哺乳動物系のために進化したレセプター結合、遺伝的機構および分泌経路を含まない可能性のある非哺乳動物細胞(酵母の場合は事実含まない)を導入するので、非哺乳動物細胞から得られた結果は、潜在的に有用であるが、哺乳動物細胞もしくはメラニン保有細胞から得られる結果ほど好ましくないからである。哺乳動物細胞のうち、CHO細胞、COS−7細胞、MCB3901細胞、293細胞および293T細胞は、特に好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は、当業者の特定の必要性によって決められ得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物由来の脂肪細胞または骨格筋細胞が使用され得る。実施例10に含まれるメラニン保有細胞に関する下記を参照のこと。
第1日目、6×106/10cmディッシュの293細胞がプレートされる。第2日目、2つの反応チューブが調製される(各チューブについていう割合は、プレートあたりである):チューブAは、0.5mlの無血清DMEM(Gibco BRL)中で4μgのDNA(例えば、pCMVベクター;レセプターcDNAを有するpCMVベクターなど)を混合することによって調製される;チューブBは、0.5ml無血清DMEM中で24μlのリポフェクタミン(Gibco BRL)を混合することによって調製される。チューブAおよびBを転倒混和(数回)し、続いて室温で30〜45分間インキュベーションする。この混合物を、「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレートされた293細胞を1×PBSで洗浄し、続いて5mlの無血清DMEMで洗浄する。1mlのトランスフェクション混合物を細胞に添加し、続いて37℃、5%CO2で4時間インキュベーションする。このトランスフェクション混合物を吸引によって除去し、続いて10mlのDMEM/10%ウシ胎仔血清を添加する。細胞を37℃、5%CO2でインキュベートし、48時間後、細胞を分析のために利用した。
約12×106個の293細胞を15cmの組織培養プレートにプレートする。10%のウシ胎仔血清および1%のピルビン酸ナトリウム、L−グルタミン、ならびに抗生物質を含有するDME高グルコース培地中で増殖させる。293細胞のプレーティングの24時間後(または約80%コンフルエントまでにして)、この細胞を、12μgのDNA(例えば、レセプターcDNAを有するpCMVベクター)を用いてトランスフェクトする。この12μgのDNAを、60μlのリポフェクタミンおよび2mlの血清を含まないDME高グルコース培地と合わせる。この培地を、プレートから吸引し、そして細胞を、血清を含まない培地で一回洗浄し、DNA、リポフェクタミンおよび培地混合物を添加して、10mlの血清を含まない培地にプレートする。37℃で4〜5時間のインキュベーション後、培地を吸引して、25mlの血清含有培地を加える。トランスフェクションの24時間後、この培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクションの48時間後、この培地を吸引し、最終濃度でゲネチシン(G418薬物)を含有する血清を含む培地を加える。約12×106の293細胞を15cmの組織培養プレートにプレートする。10%のウシ胎仔血清および1%のピルビン酸ナトリウム、L−グルタミン、ならびに抗生物質を含有するDME高グルコース培地中で増殖させる。293細胞のプレーティングの24時間後(または約80%コンフルエントまでにして)、この細胞を、12μgのDNA(例えば、レセプターcDNAを有するpCMVベクター)を用いてトランスフェクトする。この12μgのDNAを、60μlのリポフェクタミンおよび2mlの血清を含まないDME高グルコース培地と合わせる。この培地を、プレートから吸引し、そして細胞を、血清を含まない培地で一回洗浄する。DNA、リポフェクタミンおよび培地混合物を添加して、10mlの血清を含まない培地にプレートする。37℃で4〜5時間のインキュベーション後、培地を吸引して、25mlの血清含有培地を加える。トランスフェクションの24時間後、この培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクションの48時間後、この培地を吸引し、500μg/mlの最終濃度でゲネチシン(G418薬物)を含有する血清を含む培地を加える。トランスフェクトした細胞は、ここでG418耐性遺伝子を含む陽性にトランスフェクトされた細胞について、選択を受ける。選択が起こる場合、培地を4〜5日ごとに交換する。選択の間、細胞を安定なプールを生成するように増殖させるか、または安定なクローン選択のために分ける。
(GPCR活性化の決定のためのアッセイ)
ヒトGPCRの活性化の評価のために種々のアプローチが利用可能である。以下は、例証であり、当業者は、当業者の必要性にとって特に有益なこれらの技術を決定する能力を有すると考えられる。
Gタンパク質共役レセプターがその活性状態にある場合、リガンド結合または構成的活性のいずれかの結果として、レセプターはGタンパク質へ結合してGDPの放出およびGタンパク質へのGTPのその後の結合を刺激する。Gタンパク質レセプター複合体のαサブユニットはGTPaseとして作用し、そしてGTPをGDPへとゆっくりと加水分解する。ここで、レセプターは、通常脱活性化される。活性化レセプターは、GDPをGTPと交換し続ける。非加水分解性GTPアナログ、[35S]GTPγSは、活性化レセプターを発現する膜への[35S]GTPγSの増強された結合を実証するために利用され得る。活性化を測定するために[35S]GTPγS結合を使用する利点は、以下である:(a)全Gタンパク質共役レセプターに対して全般的に利用可能であること;(b)膜表面に近接しており、細胞内カスケードに影響を与える分子を拾う可能性がより低くなること。
細胞ベースのアッセイのために設計されたFlash PlateTMアデニリルシクラーゼキット(New England Nuclear;カタログ番号SMP004A)を、粗細胞膜との使用のために改変し得る。Flash Plateウェルは、cAMPを認識する特異的抗体をまた含有するシンチラントコーティングを含有し得る。ウェル中で生成されたcAMPは、cAMP抗体への放射活性cAMPトレーサーの結合についての直接競合によって定量化され得る。以下は、レセプターを発現する全細胞におけるcAMPレベルにおける測定の変化についての簡単なプロトコールとして役立つ。
TSHRは、活性の際にcAMPの蓄積を引き起こすGs結合GPCRである。TSHRは、アミノ酸残基623を変異すること(すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変更すること)によって構成的に活性化される。Gi結合レセプターは、アデニリルシクラーゼを阻害し、それによってcAMP生成のレベルを低下させると予測され、cAMPレベルの評価をやりがいのあるものにさせ得る。Gi結合レセプターの活性化の指標としてcAMPの生成の低下を測定するために有効な技術は、最も好ましくは、非内因性の、構成的に活性化されたTSHR(TSHR−A623I)(もしくは、内因性の、構成的に活性なGs結合レセプター)を、「シグナルエンハンサー」として、cAMPレベルのベースラインを確立するためのGiに連結された標的GPCRとともに同時トランスフェクションすることによって達成され得る。Gi結合レセプターの非内因性バージョンの生成において、標的GPCRのこの非内因性バージョンは、次にシグナルエンハンサーとともに同時トランスフェクトされる。スクリーニングに使用され得るのは、この物質である。本発明者らは、cAMPアッセイが使用される場合、シグナルを効率的に生成するためにこのようなアプローチを使用する。いくつかの実施形態において、このアプローチは、好ましくは、Gi結合レセプターに対する候補化合物の直接的同定に使用される。Gi結合GPCRについては、このアプローチが使用される場合、標的GPCRの逆アゴニストはcAMPシグナルを増大させ、そしてアゴニストはcAMPシグナルを減少させるということに留意すること。
(CRE−Lucレポーターアッセイ(Gs関連レセプター))
293細胞および293T細胞を、2×104細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートにプレートし、製造者の使用説明書に従って、リポフェクタミン試薬(BRL)を使用してトランスフェクトした。各々6ウェルのトランスフェクションについて、以下のようにDNA/脂質混合物を調製する:100μlのDMEM中の260ngのプラスミドDNAを、100μlのDMEM中の2μlの脂質とともに穏やかに混合する(この260ngのプラスミドDNAは、200ngの8xCRE−Lucレセプタープラスミド、50ngの内因性レセプターもしくは非内因性レセプターを含むpCMVまたはpCMV単独、および10ngのGPRS発現プラスミド(pcDNA3(Invitrogen)中のGPRS)から構成される。この8xCRE−Lucレセプタープラスミドを、以下のように調製した:ベクターSRIF−β−galを、pβgal−Basicベクター(Clontech)中のBgIV−HindIII部位においてラットソマトスタチンプロモーター(−71/+51)をクローニングすることによって得た。8コピーのcAMP反応エレメントを、アデノウイルステンプレートAdpCF126CCRE8からのPCRによって得て(Suzukiら,Hum Gene Ther(1996)7:1883−1893を参照のこと;この開示は、その全体が本明細書において参考として援用される)、SRIF−β−galベクター中にKpn−BglV部位においてクローニングし、8xCRE−β−galレセプターベクターを得た。8xCRE−Lucレセプタープラスミドを、8xCRE−β−gal レセプターベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、pGL3−basicベクター(Promega)中のHindIII−BamHI部位から得られるルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることによって生成した。室温でのインキュベーションの30分後、DNA/脂質混合物を400μlのDMEMで希釈し、そしてこの100μlの希釈混合液を、各ウェルに添加する。10%FCSを含む100μlのDMEMを、細胞培養インキュベーター内での4時間のインキュベーションの後、各ウェルに添加する。翌日、トランスフェクトされた細胞を、200μl/ウェルの10%FCSを含むDMEMで交換し、8時間後、ウェルを一回PBSで洗浄した後、100μl/ウェルのフェノールレッドを含まないDMEMと交換する。翌日、LucLiteTMレセプター遺伝子アッセイキット(Packard)を使用して、製造者の使用説明書に従ってルシフェラーゼ活性を測定し、1450 MicroBetaTMシンチレーションおよび発光カウンター(Wallac)で読み取る。
Gq刺激を検出する方法は、Gq依存性ホスホリパーゼCの、そのプロモーター中にAP1エレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こすという公知の性質に依存する。PathdetectTMAP−1 cis−Reporting System(Stratagene,カタログ番号219073)を、リン酸カルシウム沈殿物の成分が410ngのpAP1−Luc、80ngのpCMV−レセプター発現プラスミド、および20ngのCMV−SEAPであったことを除いて、CREBレセプターアッセイに関する上記のプロトコールに従って使用し得る。
Gq刺激を検出する方法は、Gq依存性ホスホリパーゼCが、そのプロモーター中に血清反応因子を含む遺伝子の活性化を引き起こすという公知の性質に依存する。PathdetectTMSRF−Luc−Reporting System(Stratagene)を、例えば、COS7細胞でのGq結合活性についてのアッセイに使用し得る。細胞を、製造者の使用説明書に従ってMammalian TransfectionTM Kit(Stratagene,カタログ番号200285)を使用して、このシステムのプラスミド構成要素および内因性もしくは非内因性GPCRをコードする指示された発現プラスミドでトランスフェクトする。簡単にいうと、410ngのSRF−Luc、80ngのpCMV−レセプター発現プラスミド、および20ngのCMV−SEAP(分泌性アルカリホスファターゼ発現プラスミド;アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間でのトランスフェクション効率の変動を制御するために、トランスフェクトされた細胞の培地中で測定される)を、製造者の使用説明書に従ってリン酸カルシウム沈殿物中に混合する。沈殿物の半分を、96ウェルプレートの3つのウェルに等分し、細胞を無血清培地中に24時間保存する。最後の5時間、細胞を、例えば1μMの試験化合物とともに、インキュベートする。次いで、細胞を溶解し、LucliteTMキット(Packard,カタログ番号6016911)および「Trilux 1450 Microbeta」液体シンチレーションおよび発光カウンター(Wallac)を使用して、製造者の使用説明書に従ってルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、GraphPad PrismTM2.0a(GraphPad Software Inc.)を使用して分析し得る。
第1日目、レセプター(内因性もしくは非内因性)を含む細胞を、24ウェルプレートに、通常1×105細胞/ウェル(その数は最適化され得る)で配置し得る。第2日目、最初に50μlの無血清DMEM/ウェル中の0.25μgのDNAと50μlの無血清DMEM/ウェル中の2μlのリポフェクタミンとを混合することによって細胞をトランスフェクトし得る。この溶液を、穏やかに混合し、室温で15〜30分間インキュベートする。細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、400μlの無血清培地をトランスフェクション培地と混合して、細胞を添加する。次いで、3〜4時間、37℃/5%CO2で細胞をインキュベートし、そしてトランスフェクション培地を除去して1ml/ウェルの通常の増殖培地で置き換える。第3日目、細胞を3H−myo−イノシトールで標識する。簡単にいうと、培地を除去し、細胞を0.5mlのPBSで洗浄する。次いで、1ウェルあたり0.5mlのイノシトール非含有/無血清培地(GIBCO BRL)を、0.25μCiの3H−myo−イノシトール/ウェルとともに添加し、細胞を、16〜18時間、37℃/5%CO2でインキュベートする。第4日目、0.5mlのPBSで細胞を洗浄し、イノシトール非含有/無血清培地を含有する0.45mlのアッセイ培地に、10μMのパージリン、10mMの塩化リチウムを添加するか、または0.4mlのアッセイ培地および50μlの10×ケタンセリン(ket)を最終濃度10μMとする。次いで、細胞を30分間37℃でインキュベートする。次に細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、200μlの新鮮な/氷冷された停止溶液(1M KOH;18mMのホウ酸Na;3.8mMのEDTA)/ウェルを添加した。溶液を、氷上で5〜10分間または細胞が溶解するまで保存し、200μlの新鮮な/氷冷された中性化溶液(7.5% HCL)によって中性化する。溶解物を1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、1mlのクロロホルム/メタノール(1:2)/チューブを添加する。この溶液を15秒間ボルテックスし、上相をBiorad AG1−X8TMアニオン交換樹脂(100〜200メッシュ)に付与する。最初に、この樹脂を水(1:1.25W/V)で洗浄し、0.9mlの上相をカラムにロードする。このカラムを10mlの5mM myo−イノシトールおよび10mlの5mM ホウ酸Na/60mMのギ酸Naで洗浄する。イノシトールTrisリン酸を、2mlの0.1Mギ酸/1Mのギ酸アンモニウムを含む10mlのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルに溶出する。このカラムを10mlの0.1Mギ酸/3Mギ酸アンモニウムで洗浄することによって再生し、ddH2Oで2回リンスし、水中で4℃で保存する。
(融合タンパク質調製)
(a.GPCR:Gs融合構築物)
GPCR−Gタンパク質融合構築物の設計を、以下のように達成し得る:ラットGタンパク質Gsα(長鎖形態;Itoh,H.ら,83 PNAS 3776(1986))の5’末端および3’末端の両方を、その上にHindIII(5’−AAGCTT−3’)配列を含むように操作する。正しい配列(隣接するHindIII配列を含む)の確認に続いて、その配列全体を、ベクターのHindIII制限部位を使用してサブクローニングすることによってpcDNA3.1(−)(Invitrogen,カタログ番号V795−20)にシャトルする。Gsα配列の正確な向きを、pcDNA3.1(−)へのサブクローニング後に決定する。次いで、HindIII配列においてラットGsα遺伝子を含むこの改変されたpcDNA3.1(−)を検証する。このベクターは、ここで、「汎用」Gsαタンパク質ベクターとして利用可能である。pcDNA3.1(−)ベクターは、HindIII部位の上流に種々の周知の制限部位を含み、したがってGsタンパク質の上流に、内因性の、構成的に活性なGPCRのコード配列を挿入する能力を都合よく提供する。この同じアプローチを、他の「汎用」Gタンパク質ベクターを生成するために利用し得、そして当然ながら、当業者に公知の他の市販もしく所有されているベクターを使用し得る。重要な基準は、GPCRについての配列が、Gタンパク質の配列の上流およびフレーム内にあることである。
Gq(del)/Gi融合構築物の設計を、以下のように達成し得る:GαqサブユニットのN末端の6アミノ酸(アミノ酸2〜7、配列TLESIMを有する)を欠失させ、C末端の5アミノ酸(配列EYNLVを有する)を、Gαiタンパク質の対応するアミノ酸(配列DCGLFを有する)で置き換える。この融合構築物を、以下のプライマー:
5’−gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG−3’(配列番号9)、および
5’−gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG−3’(配列番号10)
ならびに血球凝集素タグを有するマウスGαq野生型バージョンを含むプラスミド63313をテンプレートとして使用するPCRによって得る。小文字のヌクレオチドは、スペーサーとして含まれる。
(A.膜調製)
いくつかの実施形態において、目的の、候補化合物を(例えば、逆アゴニスト、アゴニストもしくはアンタゴニスト)として同定することに使用するための標的GPCRを含む膜を、好ましくは、以下のように調製する:
(a.材料)
「膜擦過緩衝液(Membrane Scrape Buffer)」は、20mMのHEPESおよび10mMのEDTAから構成される(pH7.4);「膜洗浄緩衝液」は、20mMのHEPESおよび0.1mMのEDTAから構成される(pH7.4);「結合緩衝液」は、20mMのHEPES、100mMのNaClおよび10mMのMgCl2から構成される(pH7.4)。
全ての材料を、手順の間ずっと氷上で保存する。最初に、コンフルエントな細胞単層から培地を吸引し、その後10mlの冷PBSでリンスし、続いて吸引する。その後、5mlの膜擦過緩衝液を掻き取った細胞に添加する;続いて、細胞抽出物を50mlの遠沈管に移す(20,000rpmで17分間、4℃で遠心分離)。その後、上清を吸引し、ペレットを30mlの膜洗浄緩衝液で再懸濁し、続いて20,000rpmで17分間、4℃で遠心分離する。次いで、上清を吸引し、ペレットを結合緩衝液に再懸濁する。次に、Brinkman PolytronTMホモジナイザーを使用してこれをホモジナイズする(懸濁液中の全ての物質がつぶれるまで15〜20秒間)。これを、本明細書において、「膜タンパク質」と呼ぶ。
ホモジナイズに続いて、ブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して膜のタンパク質濃度を決定する。(タンパク質は、約1.5mg/mlに希釈され、アリコートにされて、後の使用のために凍結され得る(−80℃);凍結する場合、使用のためのプロトコールは以下である:アッセイの日、凍結膜タンパク質を室温で解凍し、その後ボルテックスし、次いで、Polytronによって約12×1,000rpmで約5〜10秒間ホモジナイズする。複数の調製のためには、異なる調製物のホモジナイズ間でホモジナイザーを徹底的にきれいにすべきであることに注意すること)
(a.材料)
結合緩衝液(上記のとおり);ブラッドフォード染色試薬;ブラッドフォードタンパク質標準を、製造者の使用説明書に従って使用する(Biorad,カタログ番号500−0006)。
2つのチューブを調製する。1つは膜を含み、1つはコントロールとして「ブランク」である。各々は、800μlの結合緩衝液を含む。その後、10μlのブラッドフォードタンパク質標準(1mg/ml)を各チューブに添加し、次いで10μlの膜タンパク質を1つのチューブにのみ添加する(ブランクではない)。その後、200μlのブラッドフォード染色試薬を各チューブに添加し、その後各々をボルテックスする。5分後、チューブを再度ボルテックスし、中の物質をキュベットに移す。キュベットをCECIL 3041分光光度計で、波長595にて読み取る。
(a.材料)
GDP緩衝液は、37.5mlの結合緩衝液および2mgのGDP(Sigma,カタログ番号G−7127)から構成され、結合緩衝液で連続希釈され、0.2μMのGDPとされた(各ウェルにおけるGDPの最終濃度は、0.1MのGDP);候補化合物を含む各ウェルは、100μlのGDP緩衝液(最終濃度、0.1MのGDP)、結合緩衝液中の膜タンパク質50μl、ならびに結合緩衝液中の[35S]GTPγS(0.6nM)、50μl(2.5μl[35S]GTPγS/10mlの結合緩衝液)から構成される、200μlの最終容量を有する。
候補化合物を、好ましくは、96ウェルプレート形式(これらは、−80℃で凍結され得る)を使用してスクリーニングする。膜タンパク質(もしくは、コントロールとして、標的GPCR以外の発現ベクターを含む膜)を、懸濁するまで短時間ホモジナイズする。次いで、上記のブラッドフォードタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を決定する。膜タンパク質(およびコントロール)を、次に結合緩衝液中において0.25mg/mlに希釈する(最終アッセイ濃度、12.5μg/ウェル)。その後、100μlのGDP緩衝液を、Wallac ScintistripTM(Wallac)の各ウェルに添加した。次いで、5μlのピンツールを使用して、そのようなウェルに5μlの候補化合物を移送する(すなわち、200μlの総アッセイ容量中5μlは、1:40比であり、したがって候補化合物の最終スクリーニング濃度は、10μMである)。やはり、汚染を避けるため、各移送工程の後に、ピンツールを3つのレザバ(水(1×)、エタノール(1×)および水(2×)を含む)内でリンスしなければならない。過剰の液体を各リンスの後でツールから振り落とし、紙およびキムワイプで乾燥させる。その後、50μlの膜タンパク質を各ウェルに添加し(標的GPCRを含まない、膜を含むコントロールウェルもまた利用した)、5〜10分間室温であらかじめインキュベートする。その後、50μlの結合緩衝液中の[35S]GTPγS(0.6nM)を各ウェルに添加し、その後、振盪機で60分間室温でインキュベートする(再び、この実施例において、プレートをホイルで覆った)。次いで、プレートを4000RPMで15分間、22℃でスピンすることによってアッセイを停止する。次いで、このプレートを、8チャンネルマニフォールドで吸引し、プレートカバーでシールする。次いで、このプレートをWallac 1450で「Prot.#37」の設定を使用して読み取る(製造者の使用説明書どおり)。
(CYCLIC AMPアッセイ)
候補化合物を(例えば、逆アゴニスト、アゴニストもしくはアンタゴニストとして)同定するための別のアッセイアプローチを、シクラーゼベースのアッセイを利用することによって達成する。直接同定に加えて、このアッセイアプローチは、独立のアプローチとして利用されて、上記の実施例6に示される[35S]GTPγSアプローチからの結果の確認を提供し得る。
(細胞内カルシウム濃度を測定するためのFluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)アッセイ)
標的レセプター(実験的)およびpCMV(ネガティブコントロール)を安定にトランスフェクトしたそれぞれのクローン株由来の細胞を、ポリ−D−リジン前処理された96ウェルプレート(Becton−Dickinson,#356640)中に5.5×104細胞/ウェルで、完全培養培地(DMEM、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウムを含む)とともに、翌日のアッセイのために播種する。Fluo4−AM(Molecular Probe,#F14202)インキュベーション緩衝液ストックを調製するため、1mgのFluo4−AMを467μlのDMSOおよび467μlのプルオロニック酸(Pluoronic acid)(Molecular Probe,#P3000)に溶解し、−20℃で1ヶ月保存し得る1mMのストック溶液を得る。Fluo4−AMは、蛍光カルシウム指標色素である。
(MAPキナーゼアッセイ)
MAPキナーゼ(マイトジェン活性化キナーゼ)をモニタリングして、レセプター活性化を評価し得る。MAPキナーゼは、いくつかのアプローチによって検出され得る。1つのアプローチは、リン酸化状態(非リン酸化(不活性)もしくはリン酸化(活性)のいずれか)の評価に基づく。リン酸化タンパク質は、SDS−PAGEにおけるよりゆっくりとした移動度を有し、したがって、ウェスタンブロッティングを使用して未刺激タンパク質と比較され得る。あるいは、リン酸化タンパク質に対する抗体特異性が利用可能である(New England Biolabs)。これは、リン酸化キナーゼの増加を検出するために使用され得る。いずれの方法においても、細胞を試験化合物で刺激し、次いでLaemmli緩衝液で抽出する。可溶性分画をSDS−PAGEゲルに付与し、タンパク質を、ニトロセルロースもしくはImmobilinに電気泳動的に移送する。標準的なウェスタンブロット技術によって免疫反応性バンドを検出する。可視的シグナルもしくは化学発光性シグナルをフィルムに記録し、デンシトメトリーによって定量化し得る。
(メラニン保有細胞技術)
メラニン保有細胞は、下等脊椎動物において見出される皮膚細胞である。これらは、メラノソームと称される色素性のオルガネラを含む。メラニン保有細胞は、Gタンパク質共役レセプター(GPCR)活性化によって微小管ネットワークに沿って、これらのメラノソームを再分布させ得る。これらの色素移動の結果は、細胞の明らかな明化もしくは暗化である。メラニン保有細胞において、Gi結合レセプターの活性化から生じる細胞内cAMPの減少したレベルは、細胞の中央にメラノソームを移動させ、色の劇的な明化をもたらす。そして、cAMPレベルが上昇する場合、Gs結合レセプターの活性化に続いて、メラノソームは、再分散され、細胞は再度暗く見える。Gq結合レセプターの活性化から生じるジアシルグリセロールの増加したレベルもまた、この再分散を誘導し得る。さらに、この技術はまた、特定のレセプターチロシンキナーゼの研究に適切である。メラニン保有細胞の反応は、レセプター活性化の数分以内に起こり、単純で、強力な色の変化を生じる。この反応は、従来の吸光マイクロプレートリーダーもしくは適度なビデオ画像化システムを使用して容易に検出され得る。他の皮膚細胞と異なり、メラニン保有細胞は神経冠に由来し、シグナル伝達タンパク質の全補体を発現するように見える。特に、細胞は、極度に広い範囲のGタンパク質を発現し、したがってほぼ全てのGPCR機能的に発現し得る。
(ヒトおよびマウスRUP43の組織分布)
ヒトおよびマウス脂肪細胞および骨格筋細胞によるRUP43の発現を、RT−PCRによって調べた。ヒト白血球サブセットによるRUP43の発現を、TaqMan RT−PCRによって調べた。
ヒト前脂肪細胞をBiowhittakerから購入し、未分化のままにさせたか、文化に供したかのいずれかとした。ヒトの分化した脂肪細胞を、Zen Bioから購入した。RNAを、これらの未分化ヒト脂肪細胞および分化したヒト脂肪細胞から調製し、cDNAに変換した。次いで、RT−PCRを行い、以下の特異的プライマーを使用してRUP43の発現を調べた:
5’−CTACCTGTACCTCGAAGTCTA−3’(センスプライマー;配列番号11)、および
5’−AGTGGCGGGCGCTGCTCAT−3’(アンチセンスプライマー;配列番号12)
使用したサイクル条件は、94℃で2分間、94℃で15秒間、55℃で30秒間、および72℃で1分間で、最後の3つの工程について35サイクルであった。分化したヒト脂肪細胞によって、そしてより低い程度でヒト前脂肪細胞によって、RUP43が内因性に発現されていたことを見出した(図2A)。
ヒト皮下脂肪(「Sub Q」)および内臓脂肪によるRUP43の発現を、上記(a.)のようにRT−PCRで調べた。19〜35の範囲のBMIを有する10人の個体から、皮下脂肪サンプルを得た。19〜45の範囲のBMIを有する8人の個体から、内臓脂肪サンプルを得た。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のRT−PCRを使用して、サンプルローディングが同等であることを示した。ヒトRUP43が、皮下脂肪および内臓脂肪の両方において内因性に発現されていることを見出した(図2B)。
マウス3T3L1細胞を、未分化のままにしたか、分化に供した。未分化3T3L1細胞、分化した3T3L1細胞、またはマウス骨格筋細胞からRNAを調製した。RNAからcDNAへの変換を、逆転写酵素の存在下(「+」)もしくは非存在下(「−」;ネガティブコントロール)のいずれかで行った。次いで、RT−PCRを行い、以下の特異的プライマーを用いてRUP43の発現を調べた:
5’−TGAGCTGTCGGCCATTCCCAT−3’(センスプライマー;配列番号13)、および
5’−GATTGTCCCTCTTGGCTCTTC−3’(アンチセンスプライマー;配列番号14)
使用したサイクル条件は、94℃で2分間、94℃で15秒間、55℃で30秒間、および72℃で1分間で、最後の3つの工程について35サイクルであった。分化したマウス3T3L1脂肪細胞によって、そしてより低い程度でマウス未分化3T3L1脂肪細胞によって、RUP43が発現されていたことを見出した。RUP43がマウス骨格筋細胞によって内因性に発現されていたことをまた見出した(図2C)。
ヒト骨格筋細胞を、Cambrexから得た。RNAを骨格筋細胞から調製し、cDNAに変換した。ポジティブコントロールとして、Biowhittakerから得たヒト脂肪細胞から上記(a.)のように調製したcDNAを使用した。(a.)に記載するように、RT−PCRを行った。RUP43が、骨格筋細胞によって、そして既に(a.)で示したように脂肪細胞によって、内因性に発現されていたことを見出した(図2D)。
(脂肪細胞分化)
(マウス3T3L1細胞の分化)
3T3L1増殖培地 1000ml
DMEM 1000ml
10% BCS 100ml
L−グルタミン、200mM 10ml
P/S 10ml
3T3L1通常培地 1000ml
DMEM 1000ml
10% FBS 100ml
L−グルタミン、200mM 10ml
P/S 10ml
3T3L1誘導培地 1000ml
DMEM 1000ml
10% FBS 100ml
L−グルタミン、200mM 10ml
P/S 10ml
インスリン(10mg/ml) 1ml
IBMax(10mg/ml) 11.1ml
デキサメタゾン(10mg/ml) 328μl
3T3L1インスリンのみの培地 1000ml
DMEM 1000ml
10% FBS 100ml
L−グルタミン、200mM 10ml
P/S 10ml
インスリン(10mg/ml) 1ml
DMEM:HYQ DEM/高グルコース,SH30081.01,500ml、SH30081.02、1000ml
BCS:仔ウシ血清、Hyclone SH30073.03
FBS:ウシ胎仔血清、Hyclone SH30071.03
L−グルタミン、200mm、100×、Hyclone SH40003−11
ペニシリン−ストレプトマイシン、100mM Hyclone SV30010
トリプシン、HYQ、0.05% 1×、SH30236.01 100ml
HYQ DPBS/改変、1×、SH30028.02 50ml
3T3L1細胞を、50%コンフルエントで播種し、その結果、培養物は翌日に完全にコンフルエントになった。2日後、細胞は100%コンフルエントに達し、誘導培地を添加した。2〜5日後、細胞をインスリンのみの培地へと交換した。誘導の2〜5日後、細胞を通常培地に2日間戻し、3T3L1の脂肪細胞への分化のプロセスを完了した。
Cambrexから購入したヒト前脂肪細胞を、24ウェルプレートに、1×106細胞/ウェルで播種した。2日後、細胞が100%コンフルエントに達した場合、Cambrexから購入した誘導培地を添加した。細胞を誘導培地中で10日間培養し、それによって、初代ヒト前脂肪細胞の脂肪細胞への分化のプロセスを完了した。
(ヒト骨格筋細胞の分化)
ヒト初代未分化骨格筋細胞を、Cambrexから購入したSKGM−2培地で培養した。骨格筋筋芽細胞培養物が50〜70%コンフルエントに達した場合、SKGM−2培地を除去し、融合培地(2%ウマ血清を補充したDMEM−F12)を添加した。
(内因性RUP43はGsに結合する)
RUP43によるGs結合を、内因性のヒト、マウスもしくはラットのRUP43でトランスフェクトされたHEK293細胞におけるcAMPの細胞内レベルと、偽トランスフェクトされたHEK293細胞(「pCMV」)とを比較することによって調べた。細胞内cAMPレベルの決定を、トレーサーとしての125I(NEX130)とともにPerkin Elmer Flashplate Kit(SMP004B)を使用したシクラーゼアッセイによって、実質的に製造者の使用説明書のとおりに行った。
(RUP43のアゴニストとしての化合物1の同定)
(材料)
ATCCから得たHEK293細胞を全てのアッセイにおいて使用した。培養培地は、10%ウシ胎仔血清(Gibco,BRL)を補充した90mlのDMEMから構成された。アデニリルシクラーゼ活性化Flashplate(登録商標)アッセイを使用して、直接cAMP[125I]検出システムによりサイクリックAMP測定値を決定した。
HEK293細胞(5×105細胞/ml)を15cmディッシュにプレートした。翌日、FuGENE 6試薬(Roche Applied Science)を製造者が示唆するように使用して、細胞をトランスフェクトした。簡単にいうと、OptiMEM(Gibco,BRL)およびFuGENE 6試薬から構成されるトランスフェクション混合物を、一緒に混合して、室温で5分間インキュベートさせた。2μgの内因性ヒトRUP43レセプタープラスミド(トランスフェクト)、もしくは2μgの空(empty)pCMVベクター(偽)を含む別々のチューブに、トランスフェクション試薬を滴下し、そして15分間室温でインキュベートさせた。DNA/トランスフェクション混合物を、各それぞれのプレートに滴下し、37℃、95/5%O2/CO2で維持された加湿インキュベーターにおいて一晩インキュベートした。翌日、培地を通常の増殖培地と交換し、細胞を一晩インキュベートした。
(RUP43のアゴニストとしての化合物2の同定)
メラニン保有細胞技術(実施例10、上記)を使用して、化合物2が内因性ヒトRUP43のアゴニストであることを見出した(図5)。簡単にいうと、コンフルエントなフラスコ(T−185cm2フラスコ)から、トリプシン(0.7×)を使用してメラニン保有細胞を回収し、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。内因性ヒトRUP43をコードするポリヌクレオチド(30μg)を、メラニン保有細胞のトランスフェクションのために使用した。エレクトロポレーションの後、非生存細胞および細片を除去するために、細胞をフラスコ中で約3〜4時間予めプレートした。完了後、次にフラスコをトリプシン処理し、アッセイのため、3つ組で384ポリ−D−リジンウェルコーティングしたプレートにプレートした。トランスフェクションの48時間後、アッセイプレートを分光光度計で読んだ(吸光度T0)。次いで、連続希釈した化合物#2とともに細胞を1時間インキュベートし(100μM−51.2pM、5倍希釈、0.5% DMSO最終)、再度読んだ(吸光度T60)。3つ組の吸光度データを分析し、%コントロール反応として示し、ポジティブコントロールウェル(200)およびネガティブコントロールウェル(100)と比較した。曲線の高さは、コントロールのおよそ92%であり、EC50=0.212μMであった。
(インビトログルコース取り込みアッセイ)
インビトログルコース取り込みアッセイをここに記載されるように行った。
飢餓培地:DMEM/0.5% BSAを含む高グルコース
KRPH緩衝液:
5mM NaHPO4、pH7.4(KRPH緩衝液は各回に新たに作製)
20mM Hepes、pH7.4
1mM MgSO4
1mM CaCl2
136mM NaCl
4.7mM KCl
1% BSA
2−デオキシグルコース(DOG):ストック100mM:水中16.4mg/ml(4℃で1〜2週間保存)
各ウェルに、1μCi[3H]−2−DOGを含む1μlおよび1μl冷ストック2−DOGおよび2mlのKRPHを添加
サイトカラシンB(CytoB):ストック(95%エタノール中10mM):−20℃に保つ
CytoBを10μM最終で使用し、キャリア媒介性取り込みをブロックする。最後にまたこの濃度を使用して反応を停止させる。停止緩衝液は、PBS+10μM CytoB(「PBS」)である
1% Triton−X:これは可溶化緩衝液である
細胞を24ウェルプレートにプレートする
(手順)
1.少なくとも2時間、細胞を飢餓状態にする
2.細胞をKRPH緩衝液で2回洗浄し、2mlのKRPHをウェルに添加する
3.細胞を、20分間、インスリンおよび/もしくは試験化合物で処理するか、またはビヒクルで処理する(コントロール)
4.20分後、緩衝液をウェルから吸引し、直ちに1mlのKRPH緩衝液+2−DOGを添加する。CytoB処理細胞については、CytoBを取り込みアッセイ前に5分間添加する
5.4分後、ウェルから緩衝液を吸引し、そして3mlの冷PBSを添加する。アッセイを完了した後、各ウェルにおいて細胞を冷PBSで2回洗浄する。停止PBSを完全に吸引し、次いで700μlの1% Triton Xを添加する。37℃のインキュベーターに30分おく
6.全溶解液のCPMを計数する。CPM/ウェルを計算する
CytoB値をインスリンおよび/もしくは試験化合物で処理された細胞、ならびにビヒクルで処理された細胞(コントロール)の各々について得られた価から引き算する。
(化合物2は、マウス3T3L1脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激する)
分化したマウス3T3L1脂肪細胞を、種々の時間、50μMの化合物2で処理した。その後、実施例17に従ってグルコース取り込みを決定した。図6より、化合物2が3T3L1脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激したことは明らかである。この結果は、RUP43アゴニストが、高グルコース血症におけるインスリンで制御できないグルコースレベルを調節するための魅力的な候補であることを示す。刺激されたグルコース取り込みの迅速な時間経過は、血中グルコース濃度を低下させるために、RUP43アゴニストは現在利用可能な薬物よりも、より迅速な治療効果を提供し得ることを示唆する。
(化合物2は、マウス3T3L1脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強する)
分化したマウス3T3L1脂肪細胞を、化合物2あり(「化合物2」)、またはなし(「コントロール」)で、無血清培地において3時間処理した。次いで、3T3L1細胞を新鮮なKRPH緩衝液で2回洗浄し、そして種々の濃度のインスリンで20分間処理した。インスリンによる処理後、実施例17に従ってグルコース取り込みを決定した。図7より、化合物2が3T3L1脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強したことは明らかである。この結果は、RUP43アゴニストがインスリン効力を増加し、それによって最大のグルコース取り込みを達成するのに必要とされるインスリン濃度を低下させ得ることを示す。
(化合物2は、ヒト初代ヒト脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激する)
ヒト前脂肪細胞(Cambrex)を脂肪細胞へと分化させた。この分化させた初代ヒト脂肪細胞を、50μMの化合物2ありもしくはなしで、3時間無血清培地中で処理した。次いで、ヒト脂肪細胞を新鮮なKRPH緩衝液で2回洗浄し、100nMインスリンありまたはなしで、20分間処理した。インスリンありまたはなしでの処理の後、グルコース取り込みを実施例17に従って決定した。図8より、化合物2が初代ヒト脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激したことは明らかである。図8より、化合物2が初代ヒト脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強したことがまた明らかである。顕著なことに、マウス3T3L1細胞に関して観察されたように、RUP43アゴニストは、インスリンの非存在下で初代ヒト脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激し得、そしてRUP43刺激性グルコース取り込みのレベルは、インスリン刺激性グルコース取り込みのレベルに匹敵する。
(化合物2はラットL6筋芽細胞におけるグルコース取り込みを刺激する)
ラット骨格筋L6筋芽細胞をATCCから得て、24ウェルプレートでコンフルエントまで増殖させた。
コンフルエントなL6細胞を、種々の濃度の化合物2ありまたはなしで、無血清倍地中で3時間処理した。次いで、L6細胞をKRPH緩衝液で2回洗浄した。化合物2で処理したL6細胞を、KRPH緩衝液とともに20分間インキュベートし;化合物2で処理しなかったL6細胞を、10nMもしくは100nMのインスリンとともに20分間インキュベートした。インスリンありもしくはなしでの処理の後、グルコース取り込みを実施例17に従って決定した。図9Aより、化合物2がラットL6筋芽細胞におけるグルコース取り込みを増強したことは明らかである。RUP43アゴニストは、ラットL6筋芽細胞において、インスリンより多くのグルコース取り込みを刺激した。骨格筋細胞は、インビボにおけるグルコース処理の80%に関与し、得られた結果は、RUP43アゴニストが、インビボにおいてインスリンより良好なグルコース処理を提供するための、魅力的な候補であることを示す。
コンフルエントなL6筋芽細胞を、50μMの化合物2で、種々の時間処理した。各処理期間の終わりに、グルコース取り込みを実施例17に従って決定した。結果は、RUP43アゴニストが20分(インスリンの時間枠と同様の時間枠)以内に骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを刺激し得ることを示す(図9B)。この結果は、RUP43アゴニストが、インスリンに匹敵する短い時間内でインビボにおけるグルコースレベルを調節するための、魅力的な候補であることを示す。
(化合物2は、ラットL6筋芽細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強する)
コンフルエントなラットL6筋芽細胞を、50μMの化合物2ありまたはなしで、3時間無血清倍地中で処理した。次いで、L6細胞を新鮮なKRPH緩衝液で2回洗浄した。次に、L6細胞を、100nMインスリンありまたはなしで、20分間処理した。インスリンありまたはなしでの処理の後、グルコース取り込みを実施例17に従って決定した。図10より、脂肪細胞について観察された結果と同様に、化合物2がラットL6筋芽細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強したことは明らかである。この結果は、RUP43アゴニストがインスリン効力を増加し、それによって最大のグルコース取り込みを達成するのに必要とされるインスリン濃度を低下させ得ることをさらに示す。したがって、RUP43は、高インスリン血症を原因とする、インスリン抵抗性に関する問題を被る個体にとっての魅力的な治療選択肢であることを示している。
(化合物2は、初代ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを刺激する)
Cambrexから得られた初代ヒト骨格筋細胞を50%コンフルエントまで増殖させ、次に誘導培地での5〜7日間の培養により分化させた。分化した初代ヒト骨格筋細胞を次に増殖倍値に7〜10日間移した。
分化したヒト骨格筋細胞を、種々の濃度の化合物2ありまたはなしで、無血清倍地中で3時間処理した。化合物2ありもしくはなしでの処理の後、細胞を新鮮なKRPH緩衝液で2回洗浄した。次いで、化合物2で処理したL6細胞を、KRPH緩衝液とともに20分間インキュベートし;化合物2で処理しなかったL6細胞を、10nMもしくは100nMのインスリンとともに20分間インキュベートした。インスリンありもしくはなしでの処理の後、グルコース取り込みを実施例17に従って決定した。図11Aより、RUP43アゴニストが、インスリンの非存在下で、かつインスリンよりも効率的に、ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを調節し得ることは明らかである。得られた結果は、RUP43アゴニストが、グルコース処理の80%が起こるヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みの刺激に有効であることを示す。この結果は、RUP43アゴニストが、インスリン作用に対して無反応性の高グルコース血症におけるグルコースレベルを制御するための、魅力的な候補であることを示す。
分化したヒト骨格筋細胞を、50μMの化合物2で、種々の時間処理した。各処理期間の終わりに、グルコース取り込みを実施例17に従って決定した。得られた結果を図11Bに提示する。RUP43 アゴニストに対して観察されたヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みの迅速な刺激は、RUP43アゴニストが、インビボにおいてグルコ−スレベルを直接的に、かつ短い時間内に調節するための、魅力的な候補であることを示す。
(経口バイオアベイラビリティ)
経口バイオアベイラビリティを直接的に評価するための物理化学分析アプローチが、当業者に周知であり、使用され得る[例えば、限定ではなく以下を参照のこと:Wong PCら,Cardiovasc Drug Rev(2002)20:137−52;およびBuchan Pら,Headache(2002)補遺2:S54−62;これらの各々の開示は、その全体が本明細書において参考として援用される]。さらなる例示のためであって限定のためではなく、上記代替的アプローチは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計[Chavez−Eng CMら,J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci(2002)767:117−29;Jetter Aら,Clin Pharmacol Ther(2002)71:21−9;Zimmerman JJら,J Clin Pharmacol(1999)39:1155−61;およびBarrish Aら,Rapid Commun Mass Spectrom(1996)10:1033−7;これらの各々の開示は、その全体が本明細書において参考として援用される]。近年、陽電子断層撮影法(PET)が、薬物の経口投与後の哺乳動物の体における薬物分布の直接測定値(経口バイオアベイラビリティを含む)を得るために、うまく使用されている[Gulyasら,Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)29:1031−8;この開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される]。
(血液脳関門モデル)
本発明の化合物の血液脳関門を横切る能力を、脳由来の細胞を使用して決定し得る。想定される1つの方法は、例示のためであって限定のためではなく、脳毛細管内皮細胞および星状細胞の共培養物を使用する。Dehouckら[J Neurochem(1990)54:1798−801;本明細書によって、その全体が参考として援用される]の血液/脳関門モデルを使用することである。
(ラットにおけるグルコースホメオスタシスに対するRUP43アゴニストのインビボ効果)
(A.ラットにおける経口ブドウ糖負荷試験(oGTT))
10週齢の雄性Zucker糖尿病脂肪性(ZDF)ラット(Charles River)を、18時間絶食させ、無作為に群に分け(n=11)、RUP43アゴニストを種々の用量で受容させるか、またはコントロールの、インスリン感受性を増加させることが公知であるロシグリタゾン(rosiglitazone)(RSG、10mg/kg)で処理する。RUP43アゴニストを腹腔内に送達する。RSGを腹腔内に送達する。好ましいRUP43アゴニストの用量は、0.1〜100mg/kgである。他の好ましい用量は、以下からなる群より選択される:0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kgおよび100mg/kg。プラシーボ群にはビヒクルを投与する。
10週齢の雄性Zucker糖尿病脂肪性(ZDF)ラット(Charles River)を、無作為に群に分け(n=6)、ビヒクル(腹腔内)、RUP43アゴニスト(腹腔内)、またはロシジタゾン(RSG、10mg/kg、腹腔内)を受容させた。RUP43アゴニストの好ましい用量は、0.1〜100mg/kgである。他の好ましい用量は、以下からなる群より選択される:0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kgおよび100mg/kg。化合物投与の後、食物を除去し、そして種々の時点で血中グルコースレベルを決定する。グルコースレベル決定の例示的時間は、0時間、1時間、2時間、3時間および4時間であり、そして毎日1週間までである。各時点での血中グルコースレベルの低下は、元のグルコースレベルのパーセンテージとして表現され、各群について6動物から平均する。これらの動物は、300〜400mg/dlの血中グルコースレベル(給餌状態)を有する。これは、非糖尿病の野生型動物よりも有意に高い。RUP43アゴニストもしくはRSGによる処理は、ビヒクルコントロールに対してグルコースレベルの有意な低下を示し得る。これらのデータは、RUP43アゴニストが糖尿病動物におけるグルコースホメオスタシスを改善するという効力を有することを実証し得る。
(本発明の化合物の合成)
(実施例27A:2−{1−[2−(2−クロロ−フェニル)−アセチル]−ピペリジン−4−イル}−チアゾール−4−カルボン酸メチル 2−メチル−4,5,6,7−テトラヒドロ−2H−インダゾール−3−イル)−アミド)
(2−ピペリジン−4−イル−チアゾール−4−カルボン酸エチルエステル二臭化水素酸塩)
30mLのEtOH中のtert−ブチル−4−(アミノカルボチオイル)テトラヒドロピリジン−1(2H)−カルボキシレート(2.0g、8.2mmol)およびエチルブロモピルベート(1.6g、8.2mmol)の溶液を、80℃で4時間攪拌した。その後、この混合物を室温に冷却し、そして48%のHBr(1.0mL、14mmol)を充填した。この反応混合物をさらに1時間攪拌し、次いで濃縮して油状の固体とした。ジエチルエーテルで粉砕して3.0g(91%)の褐色個体を得た。1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ9.02(br s,1H),8.77(br s,1H),8.46(s,1H),7.01(br s,1H),4.29(q,J=7.1Hz,2H),3.44−3.33(m,3H),3.02(q,J=11.7Hz,2H),2.19(d,J=13.2Hz,2H),1.97−1.88(m,2H),1.29(t,J=7.0Hz,3H)。C11H16N2O2S+HについてのMS:計算値241、観察値241。
30mLのCH2Cl2中の2−ピペリジン−4−イル−チアゾール−4−カルボン酸エチルエステル二臭化水素酸塩(1.0g、3.2mmol)、2−クロロフェニル酢酸(0.55g、3.2mmol)、O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.4g、3.5mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(diiospropylethylamine)(3.0mL、17mmol)の溶液を、40℃で8時間攪拌した。その後、30mLのCH2Cl2で粗混合物を希釈し、1Mクエン酸(3×50mL)で洗浄し、NaHCO3水溶液(1×30mL)で飽和させ、NaCl水溶液(1×30mL)で飽和させた。得られた有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して褐色の油状物とした。EtOAc:ヘキサン(3:1)によるシリカゲル上での精製により、0.94g(75%)の淡褐色の油状物を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(s,1H),7.39(dd,J=7.6,1.6Hz,1H),7.32(dd,J=7.2,2.0Hz,1H),7.25−7.19(m,2H),4.76(appar d,1H),4.42(q,J=7.2Hz,2H),3.99−3.95(m,1H),3.88(d,ABパターン,JAB=16.0Hz,1H),3.83(d,ABパターン,JAB=16.0Hz,1H),3.34(tt,J=11.7,3.7Hz,1H),3.21−3.14(m,1H),2.83−2.76(m,1H),2.20−2.16(m,2H),1.74(qd,J=12.3,4.1Hz,1H),1.63(qd,J=12.3,4.0Hz,1H),1.40(t,J=7.2Hz,3H)。C19H21ClN2O3S+HについてのMS:計算値393、観察値393。
20mLのMeOH中の2−{1−[2−(2−クロロ−フェニル)−アセチル]−ピペリジン−4−イル}−チアゾール−4−カルボン酸エチルエステル(0.94g,2.4mmolを、1M NaOH(20mL、20mmol)で希釈し、60℃で4時間攪拌した。その後、粗混合物を濃縮し、MeOH溶媒を除去した。次いで、この水性の塩基性溶液をCH2Cl2(2×25mL)で洗浄し、5MのHClでpH=1に酸性化した。得られた酸性の水溶液を、CH2Cl2(3×25mL)で抽出した。有機層を合わせ、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して、0.51g(58%)の白色の泡沫状の固体を得た。1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ12.96(br s,1H),8.36(s,1H),7.45−7.40(m,1H),7.33−7.25(m,3H),4.43(d,J=13.2Hz,1H),4.06(d,J=13.6Hz,1H),3.87(d,ABパターン,JAB=16.0Hz,1H),3.82(d,ABパターン,JAB=16.0Hz,1H),3.38−3.31(m,1H),3.25(appar t,J=11.8Hz,1H),2.79(appar t,J=11.6Hz,1H),2.08(t,J=10.6Hz,2H),1.67(qd,J=12.1,3.7Hz,1H),1.53(qd,J=12.2,4.0Hz,1H)。C17H17ClN2O3S+HについてのMS:計算値365、観察値365。
10mLのCH2Cl2中のN,1−ジメチル−4,5,6,7−テトラヒドロ−1H−インダゾール−3−アミン(23mg,0.14mmol),O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(75mg,0.20mmol)および2−{1−[2−(2−クロロ−フェニル)−アセチル]−ピペリジン−4−イル}−チアゾール−4−カルボン酸(50mg,0.14mmol)の溶液を、40℃pで8時間攪拌した。その後、粗混合物を20mLのCH2Cl2で希釈し、1Mのクエン酸(3×30mL)で洗浄し、NaHCO3水溶液(1×30mL)で飽和させ、NaCl溶液(1×30mL)で飽和させた。得られた有機層をMgSO4で乾燥させ、濃縮して、黄色の油状物を得た。勾配HPLC(アセトニトリル−水、0.1%TFAによる)により精製し、二塩酸塩に変換して56 mg(70%)の白色固体を得た。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.28(d,J=8.8Hz,1H),7.43−7.41(m,1H),7.30−7.26(m,3H),4.50(t,J=11.8Hz,1H),4.09−4.03(m,1H),3.98−3.91(m,2H),3.83(d,J=12.8Hz,3H),3.37(s,3H),3.24−3.20(m,1H),2.89−2.82(m,1H),2.83−2.66(m,2H),2.47−2.41(m 1H),2.03−1.88(m,4H),1.72−1.60(m,3H),1.46−1.26(m,3H)。C26H30ClN5O2S+HについてのMS:計算値512、観察値512。
実施例29Aと同様の一般的手順によって、1,2,3,4−テトラヒドロキノリンから2−(2−クロロ−フェニル)−1−{4−[4−(3,4−ジヒドロ−2H−キノリン−1−カルボニル)−チアゾール−2−イル]−ピペリジン−1−イル}−エタノンを黄色の油状物として得た。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.78(s,1H),7.42−7.40(m,1H),7.30−7.24(m,3H),7.18(d,J=7.6Hz,1H),7.03(t,J=7.4Hz,1H),6.91(t,J=7.6Hz,1H),6.72(br s,1H),4.28(d,J=12.8Hz,1H),3.94−3.81(m,5H),3.30−3.20(m,2H),2.98−2.91(m,1H),2.83(t,J=6.4Hz,2H),2.04(四重項,J=6.6Hz,2H),1.99−1.93(br m,2H),1.60−1.51(m,2H)。C26H26ClN3O2S+HについてのMS:計算値480、観察値480。
実施例29Aと同様の一般的手順によって、2−{1−[2−(2−フルオロ−フェニル)−アセチル]−ピペリジン−4−イル}−チアゾール−4−カルボン酸から2−{1−[2−(2−フルオロ−フェニル)−アセチル]−ピペリジン−4−イル}−チアゾール−4−カルボン酸メチル−(2−メチル−4,5,6,7−テトラヒドロ−2H−インダゾール−3−イル)−アミドを白色固体として得た。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(d,J=10.4Hz,1H),7.30(t,J=7.6Hz,1H),7.26−7.22(m,1H),7.11(t,J=7.4Hz,1H),7.05(t,J=9.0Hz,1H),4.47(appar t,J=13.6Hz,1H),3.90−3.79(m,1H),3.74(s,2H),3.63(d,J=4.4Hz,3H),3.32(s,3H),3.17−3.11(m,1H),3.04−2.95(m,1H),2.91−2.79(m,1H),2.61−2.43(m,2H),2.27(dt,J=15.3,5.7Hz,1H),1.99−1.88(m,3H),1.79−1.72(m,1H),1.64−1.38(m,5H)。C26H30FN5O2S+HについてのMS:計算値496、観察値496。
Claims (140)
- 1以上の候補化合物をRUP43 GPCRのモジュレーターと同定する方法であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該レセプターは、Gタンパク質と共役し;該方法は、工程:
(a)候補化合物を該レセプターと接触させる工程;および
(b)該レセプターの機能性が調節されるか否かを決定する工程;
を包含し、ここで、レセプターの機能性における変化は、該候補化合物がRUP43 GPCRのモジュレーターであることを示す、方法。 - 前記GPR131アミノ酸配列が:
(a)配列番号2のアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸2−330;
(c)前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;
(d)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、該核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号3のプライマーおよび配列番号4のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(e)配列番号6のアミノ酸配列;
(f)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、該核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(g)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸配列;
(h)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸2−330;
(i)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;および
(j)ストリンジェントな条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Gタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記RUP43 GPCRが組換え体である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記RUP43 GPCRを発現する宿主細胞または前記RUP43 GPCRを発現する宿主細胞の膜と接触させることを含み、該宿主細胞は、該RUP43 GPCRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記RUP43 GPCRの公知のアゴニストの存在下で実施される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、化合物1、化合物2、または化合物3の存在下で実施される、請求項5に記載の方法。
- 1以上の候補化合物を哺乳動物における血中グルコース濃度のモジュレーターと同定する方法であって、工程:
(a)候補化合物を、GPR131アミノ酸配列を含むGPCRと接触させる工程であって、ここで該レセプターがGタンパク質と共役する、工程;および
(b)該レセプターの機能性が調節されるか否かを決定する工程;
を包含し、ここで、レセプターの機能性における変化は、該候補化合物が、哺乳動物における血中グルコース濃度のモジュレーターであることを示す、方法。 - 前記GPR131アミノ酸配列が:
(a)配列番号2のアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸2−330;
(c)前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;
(d)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、該核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号3のプライマーおよび配列番号4のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(e)配列番号6のアミノ酸配列;
(f)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、該核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(g)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸配列;
(h)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸2−330;
(i)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;および
(j)ストリンジェントな条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Gタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。 - 前記RUP43 GPCRが組換え体である、請求項7または請求項8に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記RUP43 GPCRを発現する宿主細胞または前記RUP43 GPCRを発現する宿主細胞の膜と接触させることを含み、該宿主細胞は、該RUP43 GPCRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項7〜請求項9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記RUP43 GPCRの公知のアゴニストの存在下で実施される、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、化合物1、化合物2、および化合物3の存在下で実施される、請求項11に記載の方法。
- レセプター機能性の上昇は、前記候補化合物が、哺乳動物における血中グルコース濃度を低下させる化合物であることを示す、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記決定する工程が、サイクリックAMP(cAMP)、サイクリックGMP(cGMP)、イソシトール(isositol)三リン酸(IP3)、ジアシルグリセロール(DAG)およびCa2+からなる群より選択されるセカンドメッセンジャーのレベルの測定を通してである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- cAMPの細胞内レベルが上昇している、請求項14に記載の方法。
- 前記決定する工程が、メラニン保有細胞アッセイの使用を通して、または前記RUP43 GPCRを含む膜へのGTPγS結合の測定を通してである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- RUP43 GPCRのモジュレーターを作製するためのプロセスであって、工程:
(a)請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って該モジュレーターを同定する工程;および
(b)(a)において同定されたモジュレーターを合成する工程
を包含する、プロセス。 - 請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によって同定された、モジュレーター。
- 前記モジュレーターが、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される、請求項18に記載のモジュレーターまたは請求項17に記載のプロセス。
- 前記モジュレーターがアゴニストである、請求項18に記載のモジュレーターまたは請求項17に記載のプロセス。
- 前記アゴニストが部分アゴニストである、請求項20に記載のアゴニスト。
- 前記モジュレーターが、前記RUP43 GPCRの機能性を上昇させる、請求項18に記載のモジュレーターまたは請求項17に記載のプロセス。
- 前記モジュレーターが、cAMPの細胞内レベルを上昇させる、請求項18に記載のモジュレーターまたは請求項17に記載のプロセス。
- 薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を調製する方法であって、
キャリアとRUP43 GPCRのモジュレーターを混合する工程を包含し、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含む、方法。 - RUP43 GPCRを調節する方法であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該方法は、該レセプターと該レセプターのモジュレーターとを接触させる工程を包含する、方法。
- RUP43 GPCRを調節する方法であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物における血中グルコース濃度を低下させるためであり、該方法は、該レセプターを該レセプターの治療有効量のモジュレーターと接触させる工程を包含する、方法。
- RUP43 GPCRを調節する方法であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物における代謝障害を予防または処置するためであり、該方法は、該レセプターを、治療有効量の該レセプターのモジュレーターと接触させる工程を包含し、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - RUP43 GPCRを調節する方法であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする哺乳動物における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためであり、該方法は、該レセプターを、治療有効量の該レセプターのモジュレーターと接触させる工程を包含し、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物における血中グルコース濃度の低下方法であって、該方法は、治療有効量のRUP43 GPCRのモジュレーターを該レセプターと接触させる工程を包含し、該レセプターが、GPR131アミノ酸配列を含む、方法。
- 代謝障害を予防または処置する必要のある哺乳動物における代謝障害を予防または処置する方法であって、該方法は、治療有効量のRUP43 GPCRのモジュレーターを該レセプターと接触させる工程を包含し、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要する哺乳動物における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、該方法は、治療有効量のRUP43 GPCRのモジュレーターを該レセプターと接触させる工程を包含し、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 哺乳動物における血中グルコースを低下させる方法であって、該方法は、該低下を必要とする哺乳動物にRUP43 GPCRのモジュレーターを提供または投与する工程を包含し、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含む、方法。
- 代謝障害を予防または処置する方法であって、該方法は、該予防または処置を必要とする哺乳動物にRUP43 GPCRのモジュレーターを提供または投与する工程を包含し、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、該方法は、該予防または処置を必要とする哺乳動物にRUP43 GPCRのモジュレーターを提供または投与する工程を包含し、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項27〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、請求項18〜23のいずれか1項による、請求項27〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RUP43 GPCRのモジュレーターが、該RUP43 GPCRのアゴニストである、請求項27〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、請求項24に記載の化合物である、請求項27〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項27〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項27〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項27〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物における血中グルコースを低下させる方法であって、該方法は、該低下を必要とする哺乳動物にGPR131 GPCRのアゴニストを提供または投与する工程を包含する、方法。
- 代謝障害を予防または処置する方法であって、該方法は、該予防または処置を必要とする哺乳動物にGPR131 GPCRのアゴニストを提供または投与する工程を包含し、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - 前記代謝障害が糖尿病である、請求項34に記載の方法。
- 前記代謝障害がグルコース寛容減損である、請求項34に記載の方法。
- 前記代謝障害がインスリン抵抗性である、請求項34に記載の方法。
- 前記代謝障害が高インスリン血症である、請求項34に記載の方法。
- 上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、該方法は、該予防または処置を必要とする哺乳動物にGPR131 GPCRのアゴニストを提供または投与する工程を包含し、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項27〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物であって、該組成物は、RUP43 GPCRのモジュレーターを含むか、RUP43 GPCRのモジュレーターから本質的になるか、またはRUP43 GPCRのモジュレーターからなり、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含む、組成物。
- RUP43 GPCRのモジュレーターを含む薬学的組成物であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
- 前記モジュレーターが、請求項18〜23のいずれか1項による、請求項52に記載の薬学的組成物。
- 前記RUP43 GPCRのモジュレーターが、該RUP43 GPCRのアゴニストである、請求項52に記載の薬学的組成物。
- 前記モジュレーターが、請求項24に記載の化合物である、請求項52に記載の薬学的組成物。
- 前記モジュレーターが、化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項52に記載の薬学的組成物。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項52〜56のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項52〜56のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 哺乳動物における血中グルコースを低下させる方法であって、該方法は、該低下を必要とする哺乳動物に請求項52〜58のいずれか1項に記載の薬学的組成物を提供または投与する工程を包含する、方法。
- 代謝障害を予防または処置する方法であって、該方法は、該予防または処置を必要とする哺乳動物に請求項52〜58のいずれか1項に記載の薬学的組成物を提供または投与する工程を包含し、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、該方法は、該予防または処置を必要とする哺乳動物に請求項52〜58のいずれか1項に記載の薬学的組成物を提供または投与する工程を包含し、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項59〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 治療によるヒトまたは動物体の処置方法において使用するための、RUP43 GPCRのモジュレーターであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含む、モジュレーター。
- 治療によってヒトまたは動物体の血中グルコース濃度を低下させる方法において使用するための、RUP43 GPCRのモジュレーターであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含む、モジュレーター。
- 治療によってヒトまたは動物体における代謝障害を予防または処置する方法において使用するための、RUP43 GPCRのモジュレーターであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、モジュレーター。 - 治療によってヒトまたは動物体における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法において使用するための、RUP43 GPCRのモジュレーターであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、モジュレーター。 - 前記動物が哺乳動物である、請求項63〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、請求項18〜23のいずれか1項による、請求項63〜67のいずれか1項に記載のモジュレーター。
- 前記RUP43 GPCRのモジュレーターが、該RUP43 GPCRのアゴニストである、請求項63〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、請求項24に記載の化合物である、請求項63〜67のいずれか1項に記載のモジュレーター。
- 前記モジュレーターが、化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項63〜67のいずれか1項に記載のモジュレーター。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項63〜71のいずれか1項に記載のモジュレーター。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項63〜71のいずれか1項に記載のモジュレーター。
- 血中グルコース濃度を低下させるための医薬の調製のためにRUP43 GPCRのモジュレーターを使用する方法であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含む、方法。
- 代謝障害を予防または処置するための医薬の調製のためにRUP43 GPCRのモジュレーターを使用する方法であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置のための医薬の調製のためにRUP43 GPCRのモジュレーターを使用する方法であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 前記モジュレーターが、請求項18〜23のいずれか1項による、請求項74〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RUP43 GPCRのモジュレーターが、該RUP43 GPCRのアゴニストである、請求項74〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、請求項24に記載の化合物である、請求項74〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項74〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項74〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項74〜80のいずれか1項に記載の方法。
- RUP43 GPCRの活性を調節するためのプロセスであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該プロセスは、工程:
(a)該レセプターのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程;および
(b)該レセプターを、(a)において同定されたモジュレーターと接触させる工程
を包含する、プロセス。 - 薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、工程:
(a)RUP43 GPCRのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程であって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含む、工程;および
(b)キャリアと(a)で同定されたモジュレーターとを混合する工程
を包含する、プロセス。 - RUP43 GPCRの活性を調節するためのプロセスであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物における血中グルコース濃度を低下させるためであり、該プロセスは、工程:
(a)該レセプターのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程;および
(b)該レセプターを、(a)において同定された治療有効量のモジュレーターと接触させる工程
を包含する、プロセス。 - RUP43 GPCRの活性を調節するためのプロセスであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物において代謝障害を予防または処置するためであり、該プロセスは、工程:
(a)該レセプターのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程;および
(b)該レセプターを、(a)において同定された治療有効量のモジュレーターと接触させる工程
を包含し;ここで、該代謝障害は、以下:
(i)糖尿病;
(ii)グルコース寛容減損;
(iii)インスリン抵抗性;および
(iv)高インスリン血症
からなる群より選択される、プロセス。 - RUP43 GPCRの活性を調節するためのプロセスであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする哺乳動物において上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためであり、該プロセスは、工程:
(a)該レセプターのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程;および
(b)該レセプターを、(a)において同定された治療有効量のモジュレーターと接触させる工程
を包含し;ここで、該合併症は、以下:
(i)症候群X;
(ii)アテローム性動脈硬化症;
(iii)アテローム性疾患;
(iv)心臓病;
(v)高血圧症;
(vi)発作;
(vii)ニューロパシー;
(viii)網膜症;
(ix)腎症;および
(x)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、プロセス。 - 血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物において血中グルコース濃度を低下させるためのプロセスであって、該プロセスは、工程:
(a)RUP43 GPCRのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含む、工程;および
(b)(a)において同定された治療有効量のモジュレーターを、該レセプターと接触させる工程
を包含する、プロセス。 - 代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物において代謝障害を予防または処置するためのプロセスであって、該プロセスは、工程:
(a)RUP43 GPCRのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含む、工程;および
(b)(a)において同定された治療有効量のモジュレーターを該レセプターと接触させる工程
を包含し;ここで、該代謝障害は、以下:
(i)糖尿病;
(ii)グルコース寛容減損;
(iii)インスリン抵抗性;および
(iv)高インスリン血症
からなる群より選択される、プロセス。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする哺乳動物において上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためのプロセスであって、該プロセスは、工程:
(a)RUP43 GPCRのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含む、工程;および
(b)(a)において同定された治療有効量のモジュレーターを該レセプターと接触させる工程
を包含し;ここで、該合併症は、以下:
(i)症候群X;
(ii)アテローム性動脈硬化症;
(iii)アテローム性疾患;
(iv)心臓病;
(v)高血圧症;
(vi)発作;
(vii)ニューロパシー;
(viii)網膜症;
(ix)腎症;および
(x)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、プロセス。 - 哺乳動物において血中グルコースを低下させるためのプロセスであって、該プロセスは、工程:
(a)RUP43 GPCRのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含む、工程;および
(b)(a)において同定されたモジュレーターを、該低下を必要とする哺乳動物に提供または投与する工程
を包含する、プロセス。 - 代謝障害を予防または処置するためのプロセスであって、該プロセスは、工程:
(a)RUP43 GPCRのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含む、工程;および
(b)(a)において同定されたモジュレーターを、該予防または処置を必要とする哺乳動物に提供または投与する工程
を包含し;ここで、該代謝障害は、以下:
(i)糖尿病;
(ii)グルコース寛容減損;
(iii)インスリン抵抗性;および
(iv)高インスリン血症
からなる群より選択される、プロセス。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためのプロセスであって、該プロセスは、工程:
(a)RUP43 GPCRのモジュレーターを、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に従って同定する工程であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含む、工程;および
(b)(a)において同定されたモジュレーターを、該予防または処置を必要とする哺乳動物に提供または投与する工程
を包含し;該合併症は、以下:
(i)症候群X;
(ii)アテローム性動脈硬化症;
(iii)アテローム性疾患;
(iv)心臓病;
(v)高血圧症;
(vi)発作;
(vii)ニューロパシー;
(viii)網膜症;
(ix)腎症;および
(x)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、プロセス。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項85〜93のいずれか1項に記載のプロセス。
- 血中グルコース濃度を低下させるための医薬の調製のためにRUP43 GPCRのモジュレーターを使用するプロセスであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該プロセスは、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法を実施することにより該モジュレーターを同定する工程を包含する、プロセス。
- 代謝障害を予防または処置するための医薬の調製のためにRUP43 GPCRのモジュレーターを使用するプロセスであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該プロセスは、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法を実施することにより該モジュレーターを同定する工程を包含し;該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、プロセス。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するための医薬の調製のためにRUP43 GPCRのモジュレーターを使用するプロセスであって、該レセプターは、GPR131アミノ酸配列を含み、該プロセスは、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法を実施することにより該モジュレーターを同定する工程を包含し;該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、プロセス。 - 前記モジュレーターが、請求項18〜23のいずれか1項による、請求項85〜97のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記RUP43 GPCRのモジュレーターが該RUP43 GPCRのアゴニストである、請求項85〜97のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記モジュレーターが請求項24に記載の化合物である、請求項85〜97のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記モジュレーターが化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項85〜97のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項85〜101のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項85〜101のいずれか1項に記載のプロセス。
- 薬学的組成物を調製する方法であって、請求項24に記載の化合物と薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程を包含する、方法。
- 前記化合物が化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項104に記載の方法。
- 薬学的組成物であって、請求項24に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- 前記化合物が化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項106に記載の薬学的組成物。
- RUP43 GPCRを調節する方法であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含み、該方法は、該レセプターを請求項24に記載の化合物または請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物と接触させる工程を包含する、方法。
- RUP43 GPCRの活性を調節する方法であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物における血中グルコース濃度を低下させるためであり、該方法は、該レセプターを、治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物と接触させる工程を包含する、方法。
- RUP43 GPCRの活性を調節する方法であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物における代謝障害を予防または処置するためであり、該方法は、該レセプターを、治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物と接触させる工程を包含し、該代謝性障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - RUP43 GPCRを調節する方法であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含み、該調節は、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする哺乳動物における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためであり、該方法は、該レセプターを治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物と接触させる工程を包含し、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物において血中グルコース濃度を低下させる方法であって、該方法は、治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物をRUP43 GPCRと接触させる工程を包含し、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含む、方法。
- 代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物において代謝障害を予防または処置する方法であって、該方法は、治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物をRUP43 GPCRと接触させる工程を包含し、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含み、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする哺乳動物において上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、該方法は、治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物をRUP43 GPCRと接触させる工程を包含し、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含み、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 血中グルコース濃度を低下させる方法であって、該方法は、該低下を必要とする哺乳動物に、治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物を提供または投与する工程を包含する、方法。
- 代謝障害を予防または治療する方法であって、該方法は、該予防または処置を必要とする哺乳動物に治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物を提供または投与する工程を包含し、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するための方法であって、該方法は、該予防または処置を必要とする哺乳動物に治療有効量の請求項24に記載の化合物または治療有効量の請求項106もしくは請求項107に記載の薬学的組成物を投与または提供する工程を包含し、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項109〜117のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物が、化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項108〜118のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項108〜119のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である、請求項108〜119のいずれか1項に記載の方法。
- 治療によるヒトまたは動物体の処置方法において使用するための、請求項24に記載の化合物。
- 治療によってヒトまたは動物体における血中グルコース濃度を低下させる方法において使用するための、請求項24に記載の化合物。
- 治療によってヒトまたは動物体における代謝障害を予防または処置する方法において使用するための、請求項24に記載の化合物であって、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、化合物。 - 治療によってヒトまたは動物体における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法において使用するための、請求項24に記載の化合物であって、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、化合物。 - 前記化合物が、化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項122〜125のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記動物が哺乳動物である、請求項122〜126のいずれか1項に記載の化合物。
- 血中グルコース濃度を低下させるための医薬の調製のために請求項24に記載の化合物を使用する方法。
- 代謝障害の予防または処置のための医薬の調製のために請求項24に記載の化合物を使用する方法であって、該代謝障害は、以下:
(a)糖尿病;
(b)グルコース寛容減損;
(c)インスリン抵抗性;および
(d)高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。 - 上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置のための医薬の調製のために請求項24に記載の化合物を使用する方法であって、該合併症は、以下:
(a)症候群X;
(b)アテローム性動脈硬化症;
(c)アテローム性疾患;
(d)心臓病;
(e)高血圧症;
(f)発作;
(g)ニューロパシー;
(h)網膜症;
(i)腎症;および
(j)末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。 - 前記化合物が、化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項128〜130のいずれか1項に記載の方法。
- 1以上の候補化合物を、RUP43 GPCRに結合する化合物と同定する方法であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含み、該方法は、工程:
(a)該レセプターを、該候補化合物の存在下または非存在下で、該レセプターの検出可能に標識された既知のリガンドと接触させる工程;および
(b)該標識された既知のリガンドの該レセプターに対する結合が、該候補化合物の存在下で阻害されるか否かを決定する工程
を包含し;該阻害は、該候補化合物が、該RUP43 GPCRに結合する化合物であることを示す、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記GPR131アミノ酸配列は、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸2−330;
(c)前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;
(d)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、該核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号3のプライマーおよび配列番号4のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(e)配列番号6のアミノ酸配列;
(f)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、該核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(g)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸配列;
(h)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸2−330;
(i)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;および
(j)ストリンジェントな条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Gタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択される、方法。 - 前記接触させる工程が、前記GPCRを発現する宿主細胞または前記GPCRを発現する宿主細胞の膜と接触させることを含む、請求項132または請求項133に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、該レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項134に記載の方法。
- 前記既知のリガンドが、化合物1、化合物2、または化合物3である、請求項132〜135のいずれか1項に記載の方法。
- RUP43 GPCRに結合するリガンドを検出するための方法であって、該レセプターはGPR131アミノ酸配列を含み、該方法は、工程:
(a)試験リガンドを、該レセプターと該試験リガンドとの間の相互作用を許容する条件下で、該レセプターを発現する宿主細胞または該レセプターを発現する宿主細胞の膜と接触させる工程;および
(b)該レセプターに結合したリガンドを検出する工程
を包含する、方法。 - 請求項137に記載の方法であって、前記GPR131アミノ酸配列は、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸2−330;
(c)前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;
(d)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、該核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号3のプライマーおよび配列番号4のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(e)配列番号6のアミノ酸配列;
(f)核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるGタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列であって、該核酸配列は、ヒトDNAサンプルについて、配列番号7のプライマーおよび配列番号8のプライマーを用いてPCRを行うことを含むプロセスによって入手可能である、アミノ酸配列;
(g)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸配列;
(h)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号2のアミノ酸2−330;
(i)配列番号2のアミノ酸223位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、前記RUP43 Gタンパク質共役レセプターが配列番号2のアミノ酸1位のメチオニン残基を含まない、配列番号2のアミノ酸2−330;および
(j)ストリンジェントな条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Gタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択される、方法。 - 前記接触させる工程が、前記GPCRを発現する宿主細胞または前記GPCRを発現する宿主細胞の膜と接触させることを含む、請求項137または請求項138に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、該レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含み、該宿主細胞が、該レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項139に記載の方法。
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