JP2003315332A - スクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニン
グ等の提供。 【解決手段】 配列番号１、配列番号：５、配列番号：
７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされる
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質またはその塩およびコレステロール代謝関連物質を
用いることを特徴とする該レセプタータンパク質または
その塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などを
提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト脾臓由来の新
規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
塩とリガンドであるコレステロール代謝関連物質とを用
いるスクリーニング方法、マウス、ラット、ウシまたは
ウサギ由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質およびそのＤＮＡ、オーファンレセプターのリガン
ド決定方法等に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質などの生
理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータ
ンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらの
レセプタータンパク質のうち多くは共役しているguanin
e nucleotide-binding protein（以下、Ｇタンパク質と
略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナ
ル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通
した構造をもっていることから、Ｇタンパク質共役型レ
セプタータンパク質あるいは７回膜貫通型レセプタータ
ンパク質（７ＴＭＲ）と総称される。Ｇタンパク質共役
型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細
胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分
子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物
質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レ
セプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細
胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制と
いった種々の反応が惹起される。各種生体の細胞や臓器
の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプ
タータンパク質、特にはＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質との関係を明らかにすることは、各種生体の
細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連し
た医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとな
る。

【０００３】例えば、生体の種々の器官では、多くのホ
ルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活
性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわ
れている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に
存在し、それぞれに対応するレセプタータンパク質を通
してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知
のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多
く、それらのレセプタータンパク質の構造に関しても、
これまで報告されていないものが多い。さらに、既知の
レセプタータンパク質においてもサブタイプが存在する
かどうかについても分かっていないものが多い。生体に
おける複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプ
タータンパク質との関係を明らかにすることは、医薬品
開発に非常に重要な手段である。また、レセプタータン
パク質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よく
スクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内
で発現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を
解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要
であった。近年、生体内で発現している遺伝子を解析す
る手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研
究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃ
ＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）
としてデータベースに登録され、公開されている。しか
し、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推
定することは困難である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来、Ｇタンパク質共
役型レセプタータンパク質と生理活性物質（すなわち、
リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活
性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を
引き起こす物質は、これらレセプターの特異的なアンタ
ゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する
医薬品として活用されてきた。従って、このように生体
内での生理発現において重要であるばかりでなく、医薬
品開発の標的ともなりうるＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質を新規に見出し、その遺伝子（例えばｃＤ
ＮＡ）をクローニングすることは、新規Ｇタンパク質共
役型レセプタータンパク質の特異的リガンドや、アゴニ
スト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段
となる。しかし、Ｇタンパク質共役型レセプターはその
全てが見出されているわけではなく、現時点でもなお、
未知のＧタンパク質共役型レセプター、また対応するリ
ガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプ
ターが多数存在しており、新たなＧタンパク質共役型レ
セプターの探索および機能解明が切望されている。Ｇタ
ンパク質共役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を
指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガン
ド）の探索、また、該レセプターに対するアゴニストま
たはアンタゴニストの探索に有用である。一方、生理的
なリガンドが見出されなくても、該レセプターの不活化
実験（ノックアウト動物）から該レセプターの生理作用
を解析することにより、該レセプターに対するアゴニス
トまたはアンタゴニストを作製することも可能である。
これら該レセプターに対するリガンド、アゴニストまた
はアンタゴニストなどは、Ｇタンパク質共役型レセプタ
ーの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療
薬や診断薬として活用することが期待できる。さらにま
た、Ｇタンパク質共役型レセプターの遺伝子変異に基づ
く、生体での該レセプターの機能の低下または昂進が、
何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合
には、該レセプターに対するアンタゴニストやアゴニス
トの投与だけでなく、該レセプター遺伝子の生体内（ま
たはある特定の臓器）への導入や、該レセプター遺伝子
に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に
応用することもできる。この場合には該レセプターの塩
基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必
要不可欠な情報であり、該レセプターの遺伝子は、該レ
セプターの機能不全に関与する疾患の予防および／また
は治療薬や診断薬に応用することもできる。一方、従来
のリガンド等の探索・決定方法では、例えば真核生物由
来の細胞を用いて、レセプターに対する結合分子をスク
リーニングする場合、従来は該レセプターを安定的に発
現する、いわゆる安定細胞株（stable cell line）を樹
立しなければならず、この細胞株の樹立には特別な細胞
を必要とした。またスクリーニングには複数の測定の組
合せが必要であり、試験化合物が複数存在すると、時間
がかかるためにその実施が困難であった。つまり、従来
のリガンド等の探索・決定方法には、（１）使用可能な
細胞系が限定される、（２）該細胞系の樹立に時間がか
かる、（３）複数の測定法を組み合わせるために、検体
数が多くなるとその実施が困難になる等の問題があっ
た。これらの問題を解決するための、各種の細胞系が使
用でき、かつ短時間で測定等を実施できる方法の開発が
望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、特別な細胞株を必要としないスクリーニ
ング方法を見出した。さらに、ヒト脾臓由来のＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質のリガンドがコレステ
ロール代謝関連物質であることを見出した。本発明者ら
は、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結
果、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、［１］（１）配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分
ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝
関連物質を用いることを特徴とする該レセプタータンパ
ク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結
合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング
方法、［２］配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含
有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または
該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を
用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、［３］配
列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータ
ンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記
［１］記載のスクリーニング方法、［４］配列番号：１
４で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役
型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質
の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載の
スクリーニング方法、［５］配列番号：１６で表される
アミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチ
ドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニン
グ方法、［６］（１）配列番号：１で表されるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該
レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩およ
び（２）コレステロール代謝関連物質を含有することを
特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレ
ステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング用キット、［７］上記
［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載
のスクリーニング用キットを用いて得られうるコレステ
ロール代謝関連物質と配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
［８］上記［７］記載の化合物またはその塩を含有して
なる医薬、［９］上記［１］記載のスクリーニング方法
または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用い
て得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩
に対するアゴニストを含有してなる炎症性疾患または移
植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［１０］上記［１］記載のスクリーニング方法または上
記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
うる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対する
アンタゴニストを含有してなる免疫不全または感染症の
予防および／または治療剤、［１１］哺乳動物に対し
て、上記［１］記載のスクリーニング方法または上記
［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られう
る、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するア
ゴニストの有効量を投与することを特徴とする炎症性疾
患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／また
は治療方法、［１２］哺乳動物に対して、上記［１］記
載のスクリーニング方法または請求項６記載のスクリー
ニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質またはその塩に対するアンタゴニストの有効量
を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予
防および／または治療方法，［１３］炎症性疾患または
移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤
を製造するための、上記［１］記載のスクリーニング方
法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用
いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
塩に対するアゴニストの使用、［１４］免疫不全または
感染症の予防および／または治療剤を製造するための、
上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］
記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実
質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役
型レセプタータンパク質またはその塩に対するアンタゴ
ニストの使用、［１５］配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質また
はその塩の発現量を増加する化合物またはその塩を含有
してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の
予防および／または治療剤、［１６］配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物また
はその塩を含有してなる免疫不全または感染症の予防お
よび／または治療剤、［１７］哺乳動物に対して、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加する
化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とす
る炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防お
よび／または治療方法、［１８］哺乳動物に対して、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実
質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役
型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を減少さ
せる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴
とする免疫不全または感染症の予防および／または治療
方法、［１９］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫
反応の予防および／または治療剤を製造するための配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加する
化合物またはその塩の使用、［２０］免疫不全または感
染症の予防および／または治療剤を製造するための配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質またはその塩の発現量を減少させ
る化合物またはその塩の使用、［２１］配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有して
なる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防
および／または治療剤、［２２］配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる炎症性
疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／ま
たは治療剤、［２３］配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有
するポリヌクレオチドを含有してなる中枢疾患、炎症性
疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾
患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満また
は移植医療後の過剰免疫反応の診断薬、［２４］配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に
対する抗体を含有してなる免疫不全または感染症の予防
および／または治療剤、［２５］配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含
有してなる中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼
吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消
化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反
応の診断薬、［２６］配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有
するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一
部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有
してなる免疫不全または感染症の予防および／または治
療剤、［２７］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部
分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポ
リヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含
有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してな
る中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾
患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾
患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診
断薬、［２８］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質、その部分ペプチドまたはその塩の有効量を投与
することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過
剰免疫反応の予防および／または治療方法、［２９］哺
乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する
ポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする
炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防およ
び／または治療方法、［３０］哺乳動物に対して、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩
に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする免疫
不全または感染症の予防および／または治療方法、［３
１］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質また
はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその
一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドの有
効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症
の予防および／または治療方法、［３２］炎症性疾患ま
たは移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治
療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、そ
の部分ペプチドまたはその塩の使用、［３３］炎症性疾
患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／また
は治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含有するポリヌクレオチドの使用、［３４］免疫不全
または感染症の予防および／または治療剤を製造するた
めの、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドま
たはその塩に対する抗体の使用、［３５］免疫不全また
は感染症の予防および／または治療剤を製造するため
の、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ
チドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなる
アンチセンスポリヌクレオチドの使用、［３６］配列番
号：５、配列番号：７、配列番号１４または配列番号：
１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列（但し、配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列を除く）を含有することを特徴とするＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質またはその塩、［３
７］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質の部分ペプチドまたはその塩、［３８］上記
［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質または上記［３７］記載の部分ペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、［３
９］ＤＮＡである上記［３８］記載のポリヌクレオチ
ド、［４０］配列番号：６、配列番号：８、配列番号：
１３または配列番号：１５で表される塩基配列を有する
上記［３８］記載のポリヌクレオチド、［４１］上記
［３８］記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベク
ター、［４２］上記［４１］記載の組換えベクターで形
質転換させた形質転換体、［４３］上記［４２］記載の
形質転換体を培養し、上記［３６］記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質を生成せしめることを特徴
とする上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質またはその塩の製造法、［４４］上記［３
６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質も
しくは上記［３７］記載の部分ペプチドまたはその塩に
対する抗体、［４５］上記［３６］記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化
する中和抗体である上記［４４］記載の抗体、［４６］
上記［４４］記載の抗体を含有してなる診断薬、［４
７］中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾
患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾
患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診
断薬である上記［４６］記載の診断薬、［４８］上記
［４４］記載の抗体を含有してなる医薬、［４９］免疫
不全または感染症の予防および／または治療剤である上
記［４８］記載の医薬、［５０］上記［３６］記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプ
チドまたはその塩を含有してなる医薬、［５１］炎症性
疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／ま
たは治療剤である上記［５０］記載の医薬、［５２］上
記［３８］記載のポリヌクレオチドを含有してなる医
薬、［５３］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反
応の予防および／または治療剤である上記［５２］記載
の医薬、［５４］上記［３８］記載のポリヌクレオチド
を含有してなる診断剤、［５５］中枢疾患、炎症性疾
患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾
患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満また
は移植医療後の過剰免疫反応の診断薬である上記［５
４］記載の診断薬、［５６］上記［３８］記載のポリヌ
クレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有し
てなるアンチセンスポリヌクレオチド、［５７］上記
［５６］記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有し
てなる医薬、［５８］免疫不全または感染症の予防およ
び／または治療剤である上記［５７］記載の医薬、［５
９］上記［５６］記載のアンチセンスポリヌクレオチド
を含有してなる診断剤、［６０］中枢疾患、炎症性疾
患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾
患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満また
は移植医療後の過剰免疫反応の診断薬である上記［５
９］記載の診断薬、［６１］リガンドが決定されていな
いレセプタータンパク質を発現し、かつ、ｃＡＭＰレス
ポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータ
ンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含
有する動物細胞に、試験化合物を添加し、レポータータ
ンパク質の活性を測定することを特徴とする該レセプタ
ータンパク質に対するリガンドの決定方法、［６２］
（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク
質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび
（２）ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの
下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結
したプラスミドを含有する動物細胞を培養し、試験化合
物を添加してレポータータンパク質の活性を測定するこ
とを特徴とする上記［６１］記載の方法、［６３］レセ
プタータンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質である上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６４］Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質が、
配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配
列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質である上記［６３］記載の方
法、［６５］プロモーターがＴＡＴＡ様配列である上記
［６１］または［６２］記載の方法、［６６］レポータ
ータンパク質がルシフェラーゼである上記［６１］また
は［６２］記載の方法、［６７］プラスミドがｃＡＭＰ
レスポンスエレメントの下流にＴＡＴＡ様プロモーター
およびレポータータンパク質をコードする遺伝子を連結
したものである上記［６１］または［６２］記載の方
法、［６８］動物細胞が、リガンドが決定されていない
２種類以上のレセプタータンパク質を発現している上記
［６１］または［６２］記載の方法、［６９］細胞が抑
制性Ｇタンパク質αサブユニットＧｉをコードする遺伝
子を含有するプラスミドを含む上記［６１］または［６
２］記載の方法、［７０］さらにフォルスコリンを添加
する上記［６１］または［６２］記載の方法、［７１］
２種類以上のレセプタータンパク質が類似の特徴を有す
ることを特徴とする上記［６８］記載の方法、［７２］
類似の特徴がレポータータンパク質の基礎発現量および
（または）フォルスコリン添加時のレポータータンパク
質の発現量である上記［６８］記載の方法、［７３］予
め２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で
発現させた時のレポータータンパク質の基礎発現量およ
び（または）フォルスコリン添加時のレポータータンパ
ク質の発現量を測定し、該レポータータンパク質の発現
量が同程度である２種類以上のレセプタータンパク質を
組み合わせて発現させることを特徴とする上記［６８］
記載の方法等に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で用いられるＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質（以下、本発明のレセプタ
ータンパク質と略記する場合がある）は、配列番号：
１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４また
は配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター
タンパク質である。本発明のレセプタータンパク質は、
例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモッ
ト、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サ
ルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、
グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細
胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細
胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細
胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラル
キラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単
球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細
胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、ま
たはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞な
ど）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあ
らゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭
核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大
脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、
尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎
臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮
膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心
臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、
睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など
に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパ
ク質であってもよい。

【０００８】配列番号：１、配列番号：５、配列番号：
７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされる
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
例えば、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、
配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミ
ノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、よ
り好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％
以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましく
は約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙
げられる。本発明の配列番号：１、配列番号：５、配列
番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１、配
列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列
番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：５、配
列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表
わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタ
ンパク質などが好ましい。実質的に同質の活性として
は、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用
などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が
性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド
結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等
（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２
０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好
ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量な
どの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性
やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方
法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載す
るリガンドの決定方法やスクリーニング方法に従って測
定することができる。

【０００９】また、本発明のレセプタータンパク質とし
ては、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、
配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０
個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好まし
くは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸
配列、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、
配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミ
ノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配
列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたア
ミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。

【００１０】本明細書におけるレセプタータンパク質
は、ペプチド表記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミ
ノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するレセ
プタータンパク質をはじめとする、本発明のレセプター
タンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯ
Ｈ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ^-)、アミド（−ＣＯ
ＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであって
もよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、
メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくは
ｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、例えば、シクロペ
ンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル
基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリ
ール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル
−Ｃ_1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどの
α−ナフチル−Ｃ_1-2アルキル基などのＣ_7-14アラルキ
ル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイ
ルオキシメチル基などが用いられる。本発明のレセプタ
ータンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカ
ルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基が
アミド化またはエステル化されているものも本発明のレ
セプタータンパク質に含まれる。この場合のエステルと
しては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いら
れる。さらに、本発明のレセプタータンパク質には、上
記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基の
アミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなど
のＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で保
護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成した
グルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内の
アミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、
アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ
基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチ
ルなどのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基な
ど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したい
わゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれ
る。本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、
例えば、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、
配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミ
ノ酸配列を含有するレセプタータンパク質などが用いら
れる。

【００１１】本発明のレセプタータンパク質の部分ペプ
チド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）とし
ては、上記した本発明のレセプタータンパク質の部分ペ
プチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、
本発明のレセプタータンパク質分子のうち、細胞膜の外
に露出している部位であって、実質的に同質のレセプタ
ー結合活性を有するものなどが用いられる。具体的に
は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列
番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸
配列を有するレセプタータンパク質の部分ペプチドとし
ては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性
（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含む
ペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を
一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々
のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数の
ドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。本発明
の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレ
セプタータンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくと
も２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは
１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好
ましい。実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミ
ノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、よ
り好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％
以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましく
は約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記
と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の
測定は上記と同様に行なうことができる。

【００１２】また、本発明の部分ペプチドは、上記アミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ
酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個
以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１
〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の
アミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ま
しくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ
酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発
明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−Ｃ
ＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ^-）である
が、上記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がア
ミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）で
あってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカ
ルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している
場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化され
ているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場
合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステ
ルなどが用いられる。さらに、本発明の部分ペプチドに
は、上記した本発明のレセプタータンパク質と同様に、
Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護され
ているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎ
がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側
鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あ
るいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペ
プチドなども含まれる。本発明のレセプタータンパク質
またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基と
の生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学
的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として
は、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いら
れる。

【００１３】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩は、上記したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組
織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって
製造することもできるし、後に記載する本発明のレセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換
体を培養することによっても製造することができる。ま
た、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて
製造することもできる。ヒトやその他の哺乳動物の組織
または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物
の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出
を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ
ーを組み合わせることにより精製単離することができ
る。

【００１４】本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成
には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることが
できる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチ
ル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン
樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジル
アルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニル
アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４
−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフ
ェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを
挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミ
ノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的と
するタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従
い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパ
ク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高
希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施
し、目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合
成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる
が、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類
としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジ
イミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロ
リル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる
活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、Ｈ
ＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加する
か、または、対応する酸無水物またはＨＯＢｔエステル
あるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミ
ノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができ
る。

【００１５】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化す
ることができる。

【００１６】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、ア
ラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−
ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステ
ル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジ
ル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕ
ｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。

【００１７】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタン
ジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカ
チオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンの
イミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロ
フェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリ
プトファンのインドール保護基として用いられるホルミ
ル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタ
ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外
に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによる
アルカリ処理によっても除去される。

【００１８】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護、保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化など
は公知の手段から、また保護基は公知の基から、それぞ
れ適宜選択され、適用される。タンパク質のアミド体を
得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端
アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した
後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖
長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ
基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキ
シル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、
この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合さ
せる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮
合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方
法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質
を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精
製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥すること
で所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。タ
ンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ
末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール
類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のア
ミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を
得ることができる。

【００１９】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００２０】本発明のレセプタータンパク質をコードす
るポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のレセプ
タータンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいか
なるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとして
は、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一
本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、
二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでも
よい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード
鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード
鎖）であってもよい。本発明のレセプタータンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載
の方法またはそれに準じた方法により、本発明のレセプ
タータンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。

【００２１】本発明のレセプタータンパク質をコードす
るＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブ
ラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記
した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮ
Ａのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクター
は、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファ
ージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細
胞または組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製し
たものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase
Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）
によって増幅することもできる。具体的には、本発明の
レセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例
えば、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配
列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配
列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：
６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１
５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のレセ
プタータンパク質と実質的に同質の活性（例、リガンド
結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのもの
でもよい。配列番号：２、配列番号：６、配列番号：
８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる
塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列
番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列
と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好まし
くは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同
性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。

【００２２】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の
方法などに従って行なうことができる。また、市販のラ
イブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の
方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハ
イストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナト
リウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２
０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜
６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍ
Ｍで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的
には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有す
るレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、
配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡな
どが用いられる。また配列番号：５で表わされるアミノ
酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤ
ＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を含
有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：７で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコ
ードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：
１４で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータ
ンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１３
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有す
るレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、
配列番号：１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
などが用いられる。

【００２３】本発明のレセプタータンパク質をコードす
るＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な
塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、
下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含
するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられ
る。本発明に従えば、Ｇタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのでき
るアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クロー
ン化した、あるいは決定されたＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に
基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド
（核酸）は、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質
遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該Ｒ
ＮＡの合成または機能を阻害することができるか、ある
いはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮ
Ａとの相互作用を介してＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができ
る。Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮ
Ａの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およ
びＧタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡ
と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレ
オチドは、生体内および生体外でＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに
有用であり、また病気などの治療または診断に有用であ
る。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチ
ド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有する
あるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、
塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で
「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列または
その相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパ
ク質）のアミノ酸を通常指している。Ｇタンパク質共役
型レセプタータンパク質遺伝子の５’端ヘアピンルー
プ、５’端６ベースペア・リピート、５’端非翻訳領
域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領
域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’'
端パリンドローム領域、および３’'端ヘアピンループ
は好ましい対象領域として選択しうるが、Ｇタンパク質
共役型レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域も
対象として選択しうる。

【００２４】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なポリヌクレオチドとの関係、即ち対象物とハイ
ブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係
は、「アンチセンス」であるということができる。アン
チセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リ
ボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−
リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまた
はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイ
プのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を
有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、
核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊
な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマー
はＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリン
グや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含
有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、
一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤ
ＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非
修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチ
ド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当
該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたも
の、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチ
ドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾の
されたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホ
ネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カ
ルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または
硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロ
ジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌ
クレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、
抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖
（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有し
ているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリ
ジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例
えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金
属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するも
の、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型
の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシ
ド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンお
よびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾された
その他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良
い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピ
リミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あ
るいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾さ
れたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた
糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸
基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、
あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されてい
てよい。

【００２５】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。本発明のアン
チセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、
塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロス
フェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療
により適用されたり、付加された形態で与えられること
ができうる。こうして付加形態で用いられるものとして
は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ
ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高め
たり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例え
ば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水
性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質として
は、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリ
ルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こ
うしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させる
ことができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介し
て付着させることができうる。その他の基としては、核
酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ
用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌク
レアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられ
る。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレング
リコール、テトラエチレングリコールなどのグリコール
をはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙
げられるが、それに限定されるものではない。アンチセ
ンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の
生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳系
を用いて調べることができる。該核酸はまた公知の各種
の方法で細胞に適用できる。

【００２６】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−Ｐ
ＣＲ法によって増幅することもできる。

【００２７】具体的には、本発明の部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配
列番号：１５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部
分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：
２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３また
は配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有
し、本発明のレセプタータンパク質ペプチドと実質的に
同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達
作用など）を有するレセプタータンパク質をコードする
ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列
番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列
ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３
または配列番号：１５で表わされる塩基配列と約７０％
以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０
％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する
塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００２８】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチド（以下、本発明のレセプタータンパク質と
略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクロ
ーニングの手段としては、本発明のレセプタータンパク
質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用い
てＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクター
に組み込んだＤＮＡを本発明のレセプタータンパク質の
一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合
成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシ
ョンによって選別することができる。ハイブリダイゼー
ションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold
Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など
に従って行なうことができる。また、市販のライブラリ
ーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従
って行なうことができる。

【００２９】ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^TM−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造）、Ｍｕｔａｎ^TM−Ｋ（宝酒
造）などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐ
ｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの公知の方
法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことがで
きる。クローン化されたレセプタータンパク質をコード
するＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制
限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用す
ることができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始
コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳
終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有し
ていてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加するこ
ともできる。本発明のレセプタータンパク質の発現ベク
ターは、例えば、（イ）本発明のレセプタータンパク質
をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば、ｃＤＮ
Ａ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該Ｄ
ＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流
に連結することにより製造することができる。ベクター
としては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌
由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ
１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳ
Ｈ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レト
ロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスな
どの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、
ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅ
ｏなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーター
としては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、
動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモータ
ー、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭ
Ｖプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げ
られる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプ
ロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリ
ヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Lプロモータ
ー、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌で
ある場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモー
ター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場
合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｇ
ＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好まし
い。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモ
ーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

【００３０】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明のレセプタータンパク質のＮ端末側に
付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｐｈ
ｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、
宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シ
グナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主
が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２
・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、
インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・
シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ
利用できる。このようにして構築された本発明のレセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクター
を用いて、形質転換体を製造することができる。

【００３１】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１
９６８)〕、ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リ
サーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y），１２０巻，５１７(１９７８)〕、ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１
巻，４５９(１９６９)〕、Ｃ６００〔ジェネティックス
（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用い
られる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズ
ブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、ＡＨ２２
Ｒ^-、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。

【００３２】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spod
optera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia n
iの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来の
Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ^TM細胞、Mamestra brassicae由来の
細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられ
る。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細
胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。
該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL17
11）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴ
ィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられ
る。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いら
れる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９
２(１９８５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞
ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞Ｃ
ＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄ
ｈｆｒ^-）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ
−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦ
Ｌ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。

【００３３】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０
(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８
２)などに記載の方法に従って行なうことができる。バ
チルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular
＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)
などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を
形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８
２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法
に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形
質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/
Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従
って行なうことができる。動物細胞を形質転換するに
は、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコー
ル．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィ
ロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記
載の方法に従って行なうことができる。このようにし
て、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコード
するＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形
質転換体が得られる。宿主がエシェリヒア属菌、バチル
ス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用され
る培地としては液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコ
ース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源
としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コー
ンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、
大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、
無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水
素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。ま
た、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

【００３４】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５
(１９８０)」や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地
〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），
８１巻，５３３０（１９８４）」が挙げられる。培地の
ｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約
２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。

【００３５】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜ま
たは細胞外に本発明のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質を生成せしめることができる。

【００３６】上記培養物から本発明のレセプタータンパ
ク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行
なうことができる。本発明のレセプタータンパク質を培
養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、
公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩
衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結
融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を
得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩
酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−
１００^TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養
液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、培
養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分
離し、上清を集める。このようにして得られた培養上
清、あるいは抽出液中に含まれるレセプタータンパク質
の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。

【００３７】このようにして得られるレセプタータンパ
ク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいは
それに準じる方法によって塩に変換することができ、逆
に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じ
る方法により、遊離体または他の塩に変換することがで
きる。なお、組換え体が産生するレセプタータンパク質
を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を
作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペ
プチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修
飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシ
ン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナー
ゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。このようにして
生成する本発明のレセプタータンパク質またはその塩の
活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体
を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定する
ことができる。

【００３８】以下に、本発明のスクリーニング方法につ
いて詳述する。本発明のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質とコレステロール代謝関連物質との結合性を
変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）
のスクリーニング方法特定のアミノ酸配列を含有する本
発明のタンパク質（例えば、本発明のレセプタータンパ
ク質、その部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明の
レセプタータンパク質等と略記する場合がある））を用
いるか、または組換え型タンパク質等の発現系を構築
し、該発現系を用いた結合アッセイ系を用いることによ
って、試験化合物（例えば、リガンドであるコレステロ
ール代謝関連物質（例、胆汁酸（例、タウロリトコール
酸、グリコリトコール酸、タウロデオキシコール酸、グ
リコデオキシコール酸、ノルデオキシコール酸、７−ケ
トリトコール酸、５β−プレグナン−３，２０−オン、
コール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、タウロコ
ール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸、ウル
ソデオキシコール酸、タウロケノデキシコール酸、グリ
コケノデオキシコール酸）、エピアンドロステロン、
（＋）−４−アンドロステン−３，１７−ジオン、シス
−アンドロステロン、１１β−ヒドロキシプロゲステロ
ン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキ
シコルチコステロン、１１−デオキシコルチゾール、デ
ヒドロイソアンドロステロン、３α−ヒドロキシ−５α
−プレグナン−２０−オン、４−プレグネン−２０α−
オール−３−オン、５α−デヒドロテストステロン、テ
ストステロン、プロゲステロン、またはこれらの塩
等））と本発明のタンパク質等との結合性を変化させる
化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性
化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を
効率よくスクリーニングすることができる。このような
試験化合物には、（イ）あるタンパク質（例えば、Ｇタ
ンパク質共役型レセプター）を介して細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低
下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター
遺伝子の発現誘導活性など）を有する化合物（いわゆ
る、本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニス
ト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆ
る、本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニ
スト）、（ハ）生理活性物質（例えば、コレステロール
代謝関連物質）と本発明のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質との結合力を増強する化合物、あるいは
（ニ）生理活性物質（例えば、コレステロール代謝関連
物質）と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質との結合力を減少させる化合物などが含まれる（な
お、上記（イ）の化合物は、後述のリガンド決定方法に
よってスクリーニングすることが好ましい）。

【００３９】本発明では、（１）試験化合物１単独で結
合活性を測定し、（２）さらに、試験化合物２について
結合活性を測定し、（３）そして、（１）と（２）の結
果を比較する。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のレ
セプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ
の塩と、コレステロール代謝関連物質とを接触させた場
合と（ｉｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩と、コレステロール代謝関
連物質および試験化合物とを接触させた場合との比較を
行なうことを特徴とするコレステロール代謝関連物質と
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリ
ーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合にお
ける、例えば、該レセプタータンパク質等に対するコレ
ステロール代謝関連物質の結合量、細胞刺激活性などを
測定して、比較することを特徴とする。

【００４０】より具体的には、本発明は、 標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のレ
セプタータンパク質等に接触させた場合と、標識したコ
レステロール代謝関連物質および試験化合物を本発明の
レセプタータンパク質等に接触させた場合における、標
識したコレステロール代謝関連物質の該レセプタータン
パク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴
とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタ
ータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、 標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のレ
セプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合と、標識したコレステロール代謝
関連物質および試験化合物を本発明のレセプタータンパ
ク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させ
た場合における、標識したコレステロール代謝関連物質
の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較
することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本
発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法、 標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞
膜上に発現したレセプタータンパク質等に接触させた場
合と、標識したコレステロール代謝関連物質および試験
化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養す
ることによって細胞膜上に発現した本発明のレセプター
タンパク質等に接触させた場合における、標識したコレ
ステロール代謝関連物質の該レセプタータンパク質等に
対する結合量を測定し、比較することを特徴とするコレ
ステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク
質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク
リーニング方法、

【００４１】本発明のレセプタータンパク質等を活性
化する化合物（例えば、本発明のレセプタータンパク質
等に対するコレステロール代謝関連物質など）を本発明
のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた
場合と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する
化合物および試験化合物を本発明のレセプタータンパク
質等を含有する細胞に接触させた場合における、レセプ
ターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性ま
たは抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性な
ど）を測定し、比較することを特徴とするコレステロー
ル代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、および 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物
（例えば、本発明のレセプタータンパク質等に対するコ
レステロール代謝関連物質など）を本発明のＤＮＡを含
有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発
現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場
合と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化
合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発
明のレセプタータンパク質等に接触させた場合におけ
る、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進す
る活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘
導活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガ
ンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変
化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提
供する。まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本
発明のレセプタータンパク質等としては、上記した本発
明のレセプタータンパク質等を含有するものであれば何
れのものであってもよいが、本発明のレセプタータンパ
ク質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適で
ある。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難
なことから、スクリーニングに用いられるものとして
は、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプ
タータンパク質等などが適している。

【００４２】本発明のレセプタータンパク質等を製造す
るには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを
哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが
好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮ
Ａ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに
制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成Ｄ
ＮＡを用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質を
コードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それら
を効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を
宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイル
ス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘド
リンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レト
ロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロ
ウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流
に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質
の検査は公知の方法で行うことができる。例えば、文献
〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19
559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができ
る。したがって、本発明のスクリーニング方法におい
て、本発明のレセプタータンパク質等を含有するものと
しては、公知の方法に従って精製したレセプタータンパ
ク質等であってもよいし、該レセプタータンパク質等を
含有する細胞を用いてもよく、また該レセプタータンパ
ク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。

【００４３】本発明のスクリーニング方法において、本
発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行
なうことができる。本発明のレセプタータンパク質等を
含有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発
現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸
菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好まし
い。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方
法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。
細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナ
イザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーや
ポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波によ
る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細い
ノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ
る。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心
分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３００
０ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、
上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐ
ｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパ
ク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成
分が多く含まれる。該レセプタータンパク質等を含有す
る細胞や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細
胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵
〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多
いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高
くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になる
ばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるよ
うになる。

【００４４】コレステロール代謝関連物質と本発明のレ
セプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物を
スクリーニングする上記の〜を実施するためには、
例えば、適当なレセプタータンパク質画分と、標識した
コレステロール代謝関連物質が必要である。レセプター
タンパク質画分としては、天然型のレセプタータンパク
質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型レ
セプタータンパク質画分などが望ましい。ここで、同等
の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝
達作用などを示す。標識したコレステロール代謝関連物
質としては、標識したコレステロール代謝関連物質、標
識したコレステロール代謝関連物質アナログ化合物など
が用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、
〔³⁵Ｓ〕などで標識されたコレステロール代謝関連物質
などが用いられる。具体的には、コレステロール代謝関
連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を
変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まず
本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または
細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに
懸濁することによりレセプタータンパク質標品を調製す
る。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６
〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーな
どのリガンドとレセプタータンパク質との結合を阻害し
ないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異
的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−
８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコ
レートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもで
きる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガン
ドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−
６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテ
アーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜
１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐ
ｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したコレステロール代
謝関連物質を添加し、同時に１０^-4Ｍ〜１０^-10Ｍの試
験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知
るために大過剰の未標識のコレステロール代謝関連物質
を加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５
０℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２
４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、
ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄
した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シン
チレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測す
る。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ₀）から非
特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳ
Ｂ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）
が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能
力のある候補物質として選択することができる。

【００４５】コレステロール代謝関連物質と本発明のレ
セプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物ス
クリーニングする上記の〜の方法を実施するために
は、例えば、レセプタータンパク質を介する細胞刺激活
性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭ
Ｐ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細
胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨ
の低下などを促進する活性または抑制する活性、レポー
ター遺伝子の発現誘導活性など）を公知の方法または市
販の測定用キットを用いて測定することができる。具体
的には、まず、本発明のレセプタータンパク質等を含有
する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリ
ーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地ある
いは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、
試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした
後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産
物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の
指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成
が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合
は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行
なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性につ
いては、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増
大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す
ることができる。細胞刺激活性を測定してスクリーニン
グを行なうには、適当なレセプタータンパク質を発現し
た細胞が必要である。本発明のレセプタータンパク質等
を発現した細胞としては、天然型の本発明のレセプター
タンパク質等を有する細胞株、上記の組換え型レセプタ
ータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。試験
化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペ
プチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。

【００４６】コレステロール代謝関連物質と本発明のレ
セプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物ま
たはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のレセ
プタータンパク質等、本発明のレセプタータンパク質等
を含有する細胞、または本発明のレセプタータンパク質
等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のも
のが挙げられる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇタンパク質共役型レセプター標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたＣＨＯ細胞
を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７
℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識コレステロール代謝関連物質 市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識したコレステロール代謝関連物質 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 コレステロール代謝関連物質標準液 コレステロール代謝関連物質を０.１％ウシ血清アルブ
ミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように
溶解し、−２０℃で保存する。

【００４７】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセ
プタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍ
ｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴
に加える。 １０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識コレステロール代謝関連物質を５μｌ加え、室
温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るために
は試験化合物の代わりに１０^-3Ｍのコレステロール代謝
関連物質を５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式で求める。 ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１０
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００４８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドであるコレステロール代謝関連物質と本発
明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる作
用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｇタンパ
ク質共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺
遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノ
シトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを
促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の
発現誘導活性など）を有する化合物（いわゆる、本発明
のレセプタータンパク質に対するアゴニスト）、（ロ）
該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明の
レセプタータンパク質に対するアンタゴニスト）、
（ハ）コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する
化合物、あるいは（ニ）コレステロール代謝関連物質と
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との
結合力を減少させる化合物である。該化合物としては、
ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な
化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよ
い。

【００４９】本発明のレセプタータンパク質等に対する
アゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対す
るコレステロール代謝関連物質が有する生理活性と同様
の作用を有しているので、該コレステロール代謝関連物
質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプタータンパク質等に対するアンタゴニス
トは、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレス
テロール代謝関連物質が有する生理活性を抑制すること
ができるので、該コレステロール代謝関連物質活性を抑
制する安全で低毒性な医薬として有用である。コレステ
ロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質との結合力を増強する化合物は、本発
明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代
謝関連物質が有する生理活性を増強するための安全で低
毒性な医薬として有用である。コレステロール代謝関連
物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質との結合力を減少させる化合物は、本発明のレセプタ
ータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が
有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬
として有用である。例えば、中枢疾患（例えば、アルツ
ハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例え
ば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマ
トーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥
大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺
癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部
癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、
気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患
（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾
患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例え
ば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、
消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染
症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防
および／または治療剤として有用である。これらの疾患
のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進する
ことに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後
の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータ
ンパク質等を介した生理活性を増強させる化合物（例、
アゴニスト）が有効である。一方、免疫機能、マクロフ
ァージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例え
ば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプ
タータンパク質等を介した生理活性を減少させる化合物
（例、アンタゴニスト）が有効である。

【００５０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上記の医薬（組成物）として使用する場合、常套手段
に従って実施することができる。例えば、該化合物また
はその塩を、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその
塩を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形
剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一
般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混
和することによって製造することができる。これら製剤
における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得
られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに
混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチ
ン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのよう
な結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンス
ターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ス
テアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖
またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカ
モノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられ
る。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイ
プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有すること
ができる。注射のための無菌組成物は注射用水のような
ベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天
然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の
製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性
液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の
補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−
マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、
適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノー
ル）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポ
リエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、
ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用して
もよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油など
が用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベン
ジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物
またはその塩は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩
衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩
化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤
（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコー
ルなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェ
ノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製
された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。こ
のようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、
例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マ
ウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル
など）に対して投与することができる。該化合物または
その塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方
法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に
例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、
一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０
〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇであ
る。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与
対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なる
が、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１
〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、
より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。

【００５１】さらに、本発明のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質に対するリガンドの定量法を以下に説
明する。本発明のレセプタータンパク質等は、コレステ
ロール代謝関連物質（例、胆汁酸（例、タウロリトコー
ル酸、グリコリトコール酸、タウロデオキシコール酸、
グリコデオキシコール酸、ノルデオキシコール酸、７−
ケトリトコール酸、５β−プレグナン−３，２０−オ
ン、コール酸、コール酸、リトコール酸、デオキシコー
ル酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシ
コール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロケノデキシ
コール酸、グリコケノデオキシコール酸、エピアンドロ
ステロン）、（＋）−４−アンドロステン−３，１７−
ジオン、シス−アンドロステロン、１１β−ヒドロキシ
プロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、
１１−デオキシコルチコステロン、１１−デオキシコル
チゾール、デヒドロイソアンドロステロン、３α−ヒド
ロキシ−５α−プレグナン−２０−オン、４−プレグネ
ン−２０α−オール−３−オン、５α−デヒドロテスト
ステロン、テストステロン、プロゲステロン、またはこ
れらの塩等）に対して結合性を有しているので、生体内
におけるコレステロール代謝関連物質濃度を感度良く定
量することができる。本発明の定量法は、例えば、競合
法と組み合わせることによって用いることができる。す
なわち、被検体を本発明のレセプタータンパク質等と接
触させることによって被検体中のコレステロール代謝関
連物質濃度を測定することができる。具体的には、例え
ば、以下のまたはなどに記載の方法あるいはそれに
準じる方法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）

【００５２】本発明の、リガンドが未知のレセプタータ
ンパク質に対するリガンドの決定方法について詳述す
る。本発明のリガンドの決定方法は、（１）リガンドが
決定されていないレセプタータンパク質を発現し、かつ
エンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパ
ク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有す
る細胞に、試験化合物を添加し、発現誘導されるレポー
タータンパク質の活性を測定する方法、（２）（ｉ）リ
ガンドが決定されていないレセプタータンパク質をコー
ドするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（ｉｉ）エン
ハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質
をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細
胞を培養し、試験化合物を添加し、発現誘導されるレポ
ータータンパク質の活性を測定する方法などである。該
レセプタータンパク質としては、例えばＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質などが用いられる。具体例と
しては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質や、ＷＯ９６／０５
３０２、ＥＰ−Ａ−７１１８３１、ＥＰ−Ａ−７８９０
７６、ＥＰ−Ａ−１１０３５６３、ＥＰ−Ａ−１１０３
５６２、特開平８−１５４６８２号公報、特開平８−２
８３２９５号公報、特開平８−１９６２７８号公報、特
開平８−２４５６９７号公報、特開平８−２６６２８０
号公報、特開平９−５１７９５号公報、特開平９−１２
１８６５号公報、特開平９−２３８８６８６号公報、特
開平１０−１４６１９２号公報に記載のＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質などが挙げられる。レセプタ
ー発現プラスミドとしては真核生物由来の細胞で該レセ
プタータンパク質を発現させるためのプロモーター、原
核生物で増殖させる場合の選択マーカーとして用いる薬
剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）など
を含有するプラスミドがあげられる。エンハンサー／プ
ロモーターの下流にレポータータンパク質をコードする
ＤＮＡを含む（真核生物由来）細胞に、導入可能なプラ
スミドとしては、市販のプラスミドなどのいかなるプラ
スミドでもよい。公知の方法にて酵素活性を検出できる
ような酵素遺伝子を含むようなプラスミドが好ましく用
いられる。エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０、
パピローマウイルス等のウイルス由来のエンハンサー、
レトロウイルスのＬＴＲ、ｃＡＭＰレスポンスエレメン
ト（ｃＡＭＰ応答配列）（ＣＲＥ）等が用いられ、好ま
しくはｃＡＭＰレスポンスエレメントである。プロモー
ターとしては、例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ
プロモーター、ＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子のＴＡ
ＴＡ様プロモーター等が用いられ、好ましくはＴＡＴＡ
様プロモーターである。レポータータンパク質遺伝子と
しては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、アルカリフォスファタ
ーゼ遺伝子等が用いられる。かかるプラスミドの具体例
としては、ｃＡＭＰレスポンスエレメントの下流にＴＡ
ＴＡ様プロモーターおよびレポータータンパク質（例、
ルシフェラーゼ遺伝子）をコードする遺伝子を連結した
プラスミド、例えばｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ社）などが用いられる。上記で用いられる細胞として
は、真核生物由来の細胞が挙げられ、好ましくは、動物
細胞（例、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細
胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞、マウスＬ細胞、マウス
ＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、
ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞など）などが用い
られる。該細胞は、２種以上（好ましくは２〜３種）の
レセプタータンパク質を発現していてもよい。２種類以
上のレセプタータンパク質を発現させる場合は、類似の
特徴を有する２種類以上のレセプタータンパク質を選択
するのが良い。類似の特徴としては、例えば、２種類以
上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた
時のレポータータンパク質の発現量などが挙げられる。
具体的には、２種類以上のレセプタータンパク質をそれ
ぞれ単独で発現させた場合におけるレポータータンパ
ク質の基礎発現量および（または）フォルスコリン添
加時のレポータータンパク質の発現量を指標として、各
レセプタータンパク質の特徴を区別することができる。
すなわち、リガンドが決定されていない２種類以上のレ
セプタータンパク質を発現させてリガンドを決定する場
合、あらかじめレポータータンパク質の基礎発現量が低
いもの、中程度のもの、明らかに高いものなどに区分け
をしたり、あるいはフォルスコリン添加によってレポー
タータンパク質の発現量が上昇しにくいレセプタータン
パク質を明らかにしておくことが望ましい。なぜなら
ば、例えばレポータータンパク質の基礎発現量が高いレ
セプタータンパク質とレポータータンパク質の基礎発現
量が低いレセプターの２種類のレセプタータンパク質を
発現させた場合、後者にリガンドがヒットした場合にレ
ポータータンパク質発現量の上昇が見えにくくなるから
である。したがって、得られた情報をもとに、（１）レ
ポータータンパク質の基礎発現量が高いレセプタータン
パク質と低いレセプタータンパク質の混合は避けるのが
好ましい、（２）フォルスコリン添加によるレポーター
タンパク質の発現量の上昇が顕著なレセプタータンパク
質とそうでないレセプタータンパク質は混合しないほう
が好ましい、（３）レポータータンパク質の基礎発現量
が同程度であるレセプタータンパク質同士を組み合わせ
て発現させるのが好ましい。このように類似の特徴を有
するレセプタータンパク質の組み合わせとしては、例え
ば、ＡＰＪ（アペリンレセプター；ジーン（Gene）、第
１３６巻、第３５５頁（1993年））とＴＧＲ−１（特開
２００２−０７８４９２号）との組み合わせが挙げられ
る。

【００５３】リガンドの決定方法の具体例を以下に記載
する。細胞を９６ウェルプレートに播種し、例えば１０
％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで一晩培養する。ここ
で、例えば市販のトランスフェクションキットを用い
て、レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポー
タープラスミドを同時に細胞に導入し、細胞をさらに一
晩培養することにより、細胞内でレセプタータンパク質
を一過性に発現させる。細胞を洗浄し、さらに培地を無
血清化した後、試験化合物を添加する。エンハンサーが
ＣＲＥである場合、試験化合物と同時にフォルスコリン
を添加してもよい。一定時間インキュベーションを行っ
た後、細胞を溶解し、レポータータンパク質の活性を測
定する。前記の決定方法において、ベースラインが高
く、シグナルの検出が困難な場合には、該ベースライン
を低下させる手段を講じるとよい。例えばレセプタータ
ンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
（ＧＰＣＲ）の場合、Ｇタンパク質のサブユニットであ
るＧαタンパク質のうち、ｃＡＭＰ抑制効果を示すＧｉ
タンパク質を添加することにより、シグナル検出が容易
となる。Ｇｉタンパク質はまたＧｉタンパク質をコード
するＤＮＡを発現するプラスミドとして、レセプタータ
ンパク質プラスミドおよびレポータープラスミドと共に
細胞に導入することができる。この場合、３種のプラス
ミド（レセプタープラスミド：レポータープラスミド：
Ｇｉプラスミド）の混合比は、５〜１５：１：１〜６程
度が好ましく、さらには７：１：３程度であるのが好ま
しい。

【００５４】本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明の
レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたは
その塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略
記する場合がある）に対する抗体は、本発明のレセプタ
ータンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗
血清の製造法に従って製造することができる。

【００５５】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のレセプタータンパク質等は、哺乳動物に対して
投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。
用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、
イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙
げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられ
る。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗
原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の
認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓ま
たはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞
を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血
清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタ
ータンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６巻、
４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができ
る。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられる
が、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞として
は、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙
げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられ
る抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ま
しい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ま
しくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８
０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましく
は約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートする
ことにより効率よく細胞融合を実施できる。

【００５６】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体
とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素
などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用い
られる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗
体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロ
ブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで
標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合し
たモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられ
る。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに
準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡ
Ｔ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添
加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含
むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリド
ーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００５７】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。

【００５８】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
（レセプタータンパク質等の抗原）とキャリアータンパ
ク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の
製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物か
ら本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物
を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造で
きる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原と
キャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータ
ンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して
抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率
で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、
ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２
０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用
いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルア
ルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、
チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル
試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対し
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２
〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。

【００５９】本発明の配列番号：５、配列番号：７、配
列番号１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列（但
し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を除く）を含
有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その塩、その部分ペプチドまたはその塩、および該レセ
プタータンパク質またはその部分ペプチドをコードする
ＤＮＡは新規物質であり、（１）本発明のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患
の予防および／または治療剤、（２）遺伝子診断剤、
（３）本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病
の予防および／または治療剤、（４）本発明のＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドの定
量法、（５）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（ア
ゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防
および／または治療剤、（６）本発明のレセプタータン
パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量、
（７）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質ま
たはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有す
る各種疾病の予防および／または治療剤、（８）本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩に対する抗体による中和、（９）本発明のＧタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａを有する非ヒト動物の作出などに用いることができ
る。本発明のレセプタータンパク質もしくは部分ペプチ
ドまたはその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質
等と略記する場合がある）、本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以
下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）および本発
明のレセプタータンパク質等に対する抗体（以下、本発
明の抗体と略記する場合がある）の用途について、以下
に具体的に説明する。

【００６０】（１）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および
／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドが有す
る作用に応じて、本発明のレセプタータンパク質また
は該レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを、本
発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患
の予防および／または治療剤などの医薬として使用する
ことができる。例えば、生体内において本発明のレセプ
タータンパク質が減少しているためにリガンドの生理作
用が期待できない（該レセプタータンパク質の欠乏症）
患者がいる場合に、本発明のレセプタータンパク質を
該患者に投与し該レセプタータンパク質の量を補充した
り、（イ）本発明のレセプタータンパク質をコードす
るＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あ
るいは（ロ）対象となる細胞に本発明のレセプタータン
パク質をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該
細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内
におけるレセプタータンパク質の量を増加させ、リガン
ドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、
本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡは、
安全で低毒性な本発明のレセプタータンパク質の機能不
全に関連する疾患の予防および／または治療剤として有
用である。本発明のレセプタータンパク質は、例えば、
中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害
など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマ
チ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾
患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症
等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、
胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌
等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺
繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン
病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血
病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝
不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、
潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後
の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤
として有用である。これらの疾患のうち、免疫機能、マ
クロファージ機能などが亢進することに起因する疾患
（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応な
ど）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介し
た生理活性を増強させる化合物（例、アゴニスト）が有
効である。一方、免疫機能、マクロファージ機能などが
抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感
染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等
を介した生理活性を減少させる化合物（例、アンタゴニ
スト）が有効である。本発明のレセプタータンパク質を
上記予防および／または治療剤として使用する場合は、
常套手段に従って製剤化することができる。一方、本発
明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ（以下、
本発明のＤＮＡと略記する場合がある）を上記予防およ
び／または治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮ
Ａを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイル
スベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手
段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、
そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤ととも
に、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテー
テルによって投与できる。例えば、本発明のレセプタ
ータンパク質または該レセプタータンパク質をコード
するＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセ
ル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経
口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し
得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の
形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のレセプ
タータンパク質または該レセプタータンパク質をコー
ドするＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
容量が得られるようにするものである。

【００６１】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。

【００６２】また、上記予防および／または治療剤は、
例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリ
ウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通
常、適当なアンプルに充填される。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやそ
の他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投
与することができる。本発明のレセプタータンパク質の
投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
より差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、
高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につ
き約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５
０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非
経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、
対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例
えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０
ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０
ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好
ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与
するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当
たりに換算した量を投与することができる。

【００６３】本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対
象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口
投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇ
として）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００
ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは
約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合
は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では
通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは
約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１
０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。

【００６４】（２）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することによ
り、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マ
ウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル
など）における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異
常（遺伝子異常）を検出することができるので、例え
ば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは
発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発
現過多などの遺伝子診断剤として有用である。より具体
的には、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、
摂食障害など）、炎症性疾患(例えば、アレルギー、喘
息、リュウマチなど)、循環器疾患(例えば、高血圧症、
心肥大、狭心症、動脈硬化症等)、癌（例えば、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、糖尿病、免疫系疾患（例
えば、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆
のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞
症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収
不良等）、肥満などの疾患の遺伝子診断診断剤として有
用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断
は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションや
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５
巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of theNa
tional Academy of Sciences of the United States of
America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８
９年））などにより実施することができる。

【００６５】（３）本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有
する各種疾病の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例え
ば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たし
ていると考えられる。したがって、本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ
る化合物は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全
に関連する疾患、例えば、中枢疾患（例えば、アルツハ
イマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例え
ば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマ
トーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥
大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺
癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部
癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、
気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患
（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾
患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例え
ば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、
消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染
症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防
および／または治療剤として有用である。これらの疾患
のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進する
ことに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後
の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータ
ンパク質等の発現を促進する化合物が有効である。一
方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されるこ
とに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）に
は、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現を阻害
する化合物が有効である。該化合物を本発明のレセプタ
ータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／
または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って
製剤化することができる。例えば、該化合物は、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知
の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、
結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求さ
れる単位用量形態で混和することによって製造すること
ができる。これら製剤における有効成分量は指示された
範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

【００６６】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。

【００６７】また、上記予防および／または治療剤は、
例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリ
ウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通
常、適当なアンプルに充填される。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやそ
の他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投
与することができる。該化合物またはその塩の投与量
は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差
異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧
症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に
投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、
注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇと
して）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【００６８】（４）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプタータンパク質等は、リガンドに対して
結合性を有しているので、生体内におけるリガンド濃度
を感度良く定量することができる。本発明の定量法は、
例えば、競合法と組み合わせることによって用いること
ができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータン
パク質等と接触させることによって被検体中のリガンド
濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以
下のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる
方法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）

【００６９】（５）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病
の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば
中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしてい
ると考えられる。従って、本発明のレセプタータンパク
質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニス
ト、アンタゴニスト）は、本発明のレセプタータンパク
質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療
剤として用いることができる。該化合物を本発明のレセ
プタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防およ
び／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従
って製剤化することができる。例えば、該化合物は、必
要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公
知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定
剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要
求される単位用量形態で混和することによって製造する
ことができる。これら製剤における有効成分量は指示さ
れた範囲の適当な容量が得られるようにするものであ
る。

【００７０】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。

【００７１】また、上記予防および／または治療剤は、
例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリ
ウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通
常、適当なアンプルに充填される。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやそ
の他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投
与することができる。該化合物またはその塩の投与量
は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差
異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧
症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に
投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、
注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇと
して）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【００７２】（６）本発明のレセプタータンパク質もし
くはその部分ペプチドまたはその塩の定量 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を特
異的に認識することができるので、被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫
測定法による定量などに使用することができる。すなわ
ち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明の抗体と、被検液
および標識化レセプタータンパク質等とを競合的に反応
させ、該抗体に結合した標識化レセプタータンパク質等
の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量法、（ii）被検液と担体
上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明
の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被
検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法を提
供する。上記（ii）においては、一方の抗体が本発明の
レセプタータンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他
方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のＣ端部に
反応する抗体であることが好ましい。

【００７３】本発明のレセプタータンパク質等に対する
モノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗
体と称する場合がある）を用いて本発明のレセプタータ
ンパク質等の測定を行なえるほか、組織染色等による検
出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子
そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａ
ｂ')₂、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体を用いる
測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液
中の抗原量（例えば、レセプタータンパク質量）に対応
した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的
または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を
含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定
法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、
ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサ
ンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点
で、後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好ま
しい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤とし
ては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光
物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例え
ば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが
用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きな
ものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−
グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキ
シダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光
物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッ
センイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質と
しては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体
あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系
を用いることもできる。

【００７４】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法に
おいては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検
液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明の
モノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不
溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液
中の本発明のレセプタータンパク質量を定量することが
できる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、
また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なって
もよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに
準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫
測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用い
られる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感
度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を
用いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるレセプタ
ータンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反
応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプタ
ータンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好まし
く用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用
いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体
が、レセプタータンパク質のＣ端部を認識する場合、１
次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例
えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。

【００７５】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ)と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／
Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中
の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性
抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上
記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、
第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１
抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を
用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック法で
は、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗
体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、
あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反
応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固
相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、い
ずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量す
る。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中
で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測
定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物
しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレー
ザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００７６】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のレセプタータンパク質またはその塩の測定系を構築
すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細について
は、総説、成書などを参照することができる〔例えば、
入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」
（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫
測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年
発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）
（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エ
ンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Im
munochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Im
munochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Im
munochemical Techniques(PartC))、 同書 Vol. 84(Imm
unochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me
thods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques
(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibo
dies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本
発明のレセプタータンパク質またはその塩を感度良く定
量することができる。さらに、本発明の抗体を用いて、
生体内での本発明のレセプタータンパク質またその塩を
定量することによって、本発明のレセプタータンパク質
の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができ
る。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中
に存在する本発明のレセプタータンパク質等を特異的に
検出するために使用することができる。また、本発明の
レセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体
カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のレセプター
タンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のレセ
プタータンパク質の挙動の分析などのために使用するこ
とができる。

【００７７】（７）細胞膜における本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化
合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例え
ば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たし
ていると考えられる。したがって、細胞膜における本発
明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量
を変化させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質
の機能不全に関連する疾患、例えば、中枢疾患（例え
ば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性
疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節
症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高
血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例え
ば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、
乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患
（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖
尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮
膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆
のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞
症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収
不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応な
どの疾患の予防および／または治療剤として有用であ
る。これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機
能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性
疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発
明のレセプタータンパク質等の発現量を促進する化合物
が有効である。一方、免疫機能、マクロファージ機能な
どが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不
全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパ
ク質等の発現を阻害する化合物が有効である。該化合物
を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する
疾患の予防および／または治療剤として使用する場合
は、常套手段に従って製剤化することができる。例え
ば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプ
セル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして
経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容
し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤
の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理
学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒク
ル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認めら
れた製剤実施に要求される単位用量形態で混和すること
によって製造することができる。これら製剤における有
効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよう
にするものである。

【００７８】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。

【００７９】また、上記予防および／または治療剤は、
例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリ
ウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通
常、適当なアンプルに充填される。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやそ
の他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投
与することができる。該化合物またはその塩の投与量
は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差
異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧
症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に
投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、
注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇと
して）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【００８０】（８）本発明のレセプタータンパク質、そ
の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体による中
和 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドまたはその塩に対する抗体の、それらレセプタータン
パク質などに対する中和活性とは、すなわち、該レセプ
タータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化
する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有す
る場合は、該レセプタータンパク質の関与するシグナル
伝達、例えば、該レセプタータンパク質を介する細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性
など）を不活性化することができる。したがって、該レ
セプタータンパク質の過剰発現などに起因する疾患の予
防および／または治療に用いることができる。

【００８１】（９）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡを有する動物の作出 本発明のＤＮＡを用いて、本発明のレセプタータンパク
質等を発現するトランスジェニック動物を作出すること
ができる。動物としては、非ヒト哺乳動物（例えば、ラ
ット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）など（以下、動物と略記する場合があ
る）が挙げれるが、特に、マウス、ウサギなどが好適で
ある。本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたって
は、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの
下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが
一般に有利である。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮ
Ａを導入する場合、これと相同性が高い動物由来の本発
明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモーター
の下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウ
サギ受精卵へマイクロインジェクションすることによっ
て本発明のレセプタータンパク質等を高産生するＤＮＡ
導入動物を作出できる。このプロモーターとしては、例
えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等
のユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好ま
しくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロモーター
やエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。

【００８２】受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの
導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽
細胞において本発明のレセプタータンパク質等が存在す
ることは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体
細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有する
ことを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子
孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプ
タータンパク質等を有する。本発明のＤＮＡ導入動物
は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認し
て、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代
を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌
雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色
体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄
の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを
有するように繁殖継代することができる。本発明のＤＮ
Ａが導入された動物は、本発明のレセプタータンパク質
等が高発現させられているので、本発明のレセプタータ
ンパク質等に対するアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング用の動物などとして有用である。本発明
のＤＮＡ導入動物を、組織培養のための細胞源として使
用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ導入マウ
スの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、
あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタータ
ンパク質が存在する組織を分析することにより、本発明
のレセプタータンパク質等について分析することができ
る。本発明のレセプタータンパク質等を有する組織の細
胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用し
て、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難
な組織からの細胞の機能を研究することができる。ま
た、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の
機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高
発現細胞株があれば、そこから、本発明のレセプタータ
ンパク質等を単離精製することも可能である。

【００８３】（１０）ノックアウト動物 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不
活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、（３）ネオマ
イシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、（４）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹
細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載
の胚幹細胞、（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）該ＤＮＡがレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制
御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記
載の非ヒト哺乳動物、（９）ゲッ歯動物がマウスである
上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および（１０）上記
（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター
遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮ
Ａに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合
物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。

【００８４】本発明の「ＤＮＡが不活性化された非ヒト
哺乳動物胚幹細胞」とは、該非ヒト哺乳動物が有する本
発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮ
Ａの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードし
ている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させ
ることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチド
の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮ
Ａと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以
下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物とし
ては、前記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡ
に人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子
工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、
他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうこ
とができる。これらの変異により、例えば、コドンの読
み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソン
の機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮ
Ａを作製すればよい。

【００８５】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細
胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の
具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が
有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を
代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレ
ポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能
を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に
遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ
付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲ
ＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子
を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖
（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例
えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得ら
れたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近
傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ
ーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤ
ＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本
発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマー
としたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥ
Ｓ細胞を選別することにより得ることができる。また、
相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元
のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立さ
れたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの
方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マ
ウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥ
Ｓ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりし
ていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背
景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、
Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少な
さをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ₁マウス
（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ₁）を用いて樹立
したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ₁マウスは、採
卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加え
て、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用
いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したと
き、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでそ
の遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可
能である点で有利に用い得る。

【００８６】また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には
受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８
細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより
効率よく多数の初期胚を取得することができる。また、
雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ
細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。
また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ
早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌
雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色
体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、そ
の１例としてあげることができる。この方法を使用すれ
ば、従来、核型分析をするのに約１０⁶個の細胞数を要
していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約
５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一
次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ
り、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初
期の手間は大幅に削減できる。

【００８７】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス
培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気また
は５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で
培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、ト
リプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリ
プシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１
％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化
し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法な
どがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行
なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細
胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが
望まれる。

【００８８】ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に
至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するま
で浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋など
の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり
〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Natur
e）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら、
ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクス
ペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985
年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明の
ＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポ
リペプチドの細胞生物学的検討において有用である。

【００８９】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して
間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と
区別することが可能である。該非ヒト哺乳動物として
は、前記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡ発
現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作
製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞また
はマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティング
ベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列
が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウ
ス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同
組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックア
ウトさせることができる。本発明のＤＮＡがノックアウ
トされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤ
ＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーショ
ン解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列
と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の
本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライ
マーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができ
る。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相
同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞
株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、
８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作
製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮
に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座
をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ
細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメ
ラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座を
もつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配する
ことにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に
変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された
個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別する
ことにより得られる。このようにして得られた個体は、
通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であ
り、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を
交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドのホモ
発現不全個体を得ることができる。

【００９０】卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞
核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入
することによりターゲッティングベクターを染色体内に
導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ること
ができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に
比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変
異のあるものを選択することにより得られる。このよう
にして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体
は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックア
ウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継
代を行なうことができる。

【００９１】さらに、生殖系列の取得および保持につい
ても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保
有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮ
Ａを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得
しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対
して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状
態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘ
テロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不
活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴ
ート動物を繁殖継代する。本発明のＤＮＡが不活性化さ
れた非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不
全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発
明のポリペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を
欠失するため、本発明のポリペプチドの生物活性の不活
性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これら
の疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。

【００９２】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission
on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場
合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００９３】Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸

【００９４】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ₂Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００９５】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 配列番号：１ 本発明で用いられるヒト由来の新規Ｇタンパク質共役型
レセプタータンパク質ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。 配列番号：２ 本発明で用いられるヒト由来の新規Ｇタンパク質共役型
レセプタータンパク質ＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの
塩基配列を示す。 配列番号：３ 以下の参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー１の塩基配列を示す。 配列番号：４ 以下の参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー２の塩基配列を示す。 配列番号：５ 本発明のマウス心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質ｍＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。 配列番号：６ 本発明のマウス心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質ｍＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩
基配列を示す。 配列番号：７ 本発明のラット心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質ｒＴＧＲ５アミノ酸配列を示す。 配列番号：８ 本発明のラット心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質ｒＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩
基配列を示す。 配列番号：９ 以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー１の塩基配列を示す。 配列番号：１０ 以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー２の塩基配列を示す。 配列番号：１１ 以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー３の塩基配列を示す。 配列番号：１２ 以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー４の塩基配列を示す。 配列番号：１３ ウシ型ＴＧＲ５のＤＮＡ配列を示す。 配列番号：１４ ウシ型ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。 配列番号：１５ ウサギ型ＴＧＲ５のＤＮＡ配列を示す。 配列番号：１６ ウサギ型ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。 配列番号：１７ 以下の実施例６におけるＰＣＲ反応で使用したｂＦプラ
イマーの塩基配列を示す。 配列番号：１８ 以下の実施例６におけるＰＣＲ反応で使用したｂＲプラ
イマーの塩基配列を示す。 配列番号：１９ 以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したｒａｂｂ
ｉｔＦプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：２０ 以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したｒａｂｂ
ｉｔＲプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：２１ 以下の実施例１１におけるＩＬ−１α ｍＲＮＡ発現量
の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：２２ 以下の実施例１１におけるＩＬ−１αｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：２３ 以下の実施例１１におけるＩＬ−１αｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプローブの塩基配列を示す。 配列番号：２４ 以下の実施例１１におけるＩＬ−１β ｍＲＮＡ発現量
の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：２５ 以下の実施例１１におけるＩＬ−１βｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：２６ 以下の実施例１１におけるＩＬ−１βｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプローブの塩基配列を示す。 配列番号：２７ 以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：２８ 以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：２９ 以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプローブの塩基配列を示す。 配列番号：３０ 以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：３１ 以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：３２ 以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプローブの塩基配列を示す。 配列番号：３３ 以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：３４ 以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：３５ 以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の
定量に使用したプローブの塩基配列を示す。 配列番号：３６ ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示
す。 配列番号：３７ ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの
塩基配列を示す。 配列番号：３８ ＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。 配列番号：３９ ＧＰＲ７をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 配列番号：４０ 参考例４でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈをコードす
るｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示
す。 配列番号：４１ 参考例４でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈをコードす
るｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示
す。 配列番号：４２ 参考例２で用いたプライマーの塩基配列を示す。 配列番号：４３ 参考例２で用いたプライマーの塩基配列を示す。

【００９６】以下の参考例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＣ
Ｒ４−ｈＴＧＲ５は、平成１２（２０００）年４月３日
から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便
番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７１１４として、平成１２（２０００）
年３月２３日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１
７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・
発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６４１０と
して寄託されている。以下の実施例５で得られた形質転
換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α
／ｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ−ｒＴＧＲ５は、平成１４（２
００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地
１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政
法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７７として、平成１４（２０
０２）年１月１０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２
丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団
法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７
４５として寄託されている。以下の実施例５で得られた
形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｄ
Ｈ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ５は、平成１４（２０
０２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番
号ＦＥＲＭＢＰ−７８７８として、平成１４（２００
２）年１月１０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁
目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法
人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４
６として寄託されている。以下の実施例６で得られた形
質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ
１０９／ｐＴＡｂＴＧＲ５−１は、平成１４（２００
２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７９として、平成１４（２００
２）年１月１７日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁
目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法
人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４
７として寄託されている。以下の実施例７で得られた形
質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ
１０９／ｐＴＡｒａｂｂｉｔＴＧＲ５−１は、平成１４
（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１
番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立
行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに
寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８８０として、平成１４
（２００２）年１月１７日から大阪府大阪市淀川区十三
本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）
の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６７４８として寄託されている。後述の参考例４で得
られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７Ｌ−１
として２００１年６月２７日から茨城県つくば市東１丁
目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ
ーに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４０として、２００
１年６月１９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目
１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人
・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６６４４
として寄託されている。

【００９７】

【実施例】以下に参考例および実施例を示して、本発明
をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定
するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作
は、モレキュラー・クローニング（Molecular clonin
g）に記載されている方法に従った。

【００９８】参考例１ ヒト脾臓のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニ
ングと塩基配列の決定 ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clontech）を鋳型とし、２個のプラ
イマー、プライマー１（配列番号：３）およびプライマ
ー２（配列番号：４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該
反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡを１／１０量
鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ２ Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Clontech）１／５０量、プ
ライマー１（配列番号：３）およびプライマー２（配列
番号：４）を各０.５μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、お
よび酵素に添付のバッファーを１／５量、ＧＣ Ｍｅｌ
ｔを１／５量加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応
は、９４℃・５分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０
秒、６８℃・２分のサイクルを３０回繰り返し、最後に
６８℃・５分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物を
ＴＡクローニングキット（Invitrogen）の処方に従いプ
ラスミドベクターｐＣＲ４（Invitrogen）へサブクロー
ニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、ｃＤＮ
Ａを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中
で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新
規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードす
るｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を得た。このｃＤＮＡ
により導き出されるアミノ酸配列（配列番号：１）を有
する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をＴ
ＧＲ５と命名した。また配列番号：２で表わされるＤＮ
Ａを含有する形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）
ＪＭ１０９／ｐＣＲ４−ｈＴＧＲ５と命名した。

【００９９】実施例１ ＴＧＲ５を一過性に発現させた
ＨＥＫ２９３細胞における、コレステロール代謝関連物
質による活性の検出 コレステロール代謝関連物質によるＴＧＲ５特異的な刺
激活性の検出は、ＣＲＥプロモーターの発現誘導によっ
て産生されるレポーター遺伝子産物（ルシフェラーゼ）
の発現量を指標に行った。ＨＥＫ２９３細胞を増殖培地
（ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（Gi
bcoBRL）に１０％ウシ胎児血清（GibcoBRL）を添加した
もの）に懸濁し、１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃
度にてコラーゲンでコートされたＢｌａｃｋ ｗｅｌｌ
９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社）にま
いた。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した後、レ
ポーター遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＲＥ−Ｌｕ
ｃ（Clontech）と同時に、公知の方法により動物細胞で
の発現用ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Biochem. Bio
phys. Acta, Hinuma, S. etal., 1219, 251-259, 1994
記載のｐＡＫＫＯ−１．１１１Ｈと同一のプラスミドベ
クター）にＴＧＲ５遺伝子を挿入して作製した発現ベク
タープラスミド、または、ＴＧＲ５遺伝子を含まないも
とのｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを用いて細胞のトランスフェ
クションを以下のとおりに行った。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−
Ｉ（GibcoBRL）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０
００ Ｒｅａｇｅｎｔ（GibcoBRL）を２４：１にて混合
することにより、リポフェクトアミン希釈液を調製し
た。また、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ、ＴＧＲ５発現ベクタ
ープラスミドまたはもとのベクタープラスミド（２４０
ｎｇ／μｌ）およびｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（２４０ｎｇ／μ
ｌ）を２４：０．９：０．１にて混合することによりＤ
ＮＡ希釈液を調製した。リポフェクトアミン希釈液とＤ
ＮＡ希釈液を等量混合し、２０分間室温で静置すること
によりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させ
た後、上記のＨＥＫ２９３細胞を培養したプレートに２
５μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩
培養した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をア
ッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミン
を添加したもの）にて洗浄した後、アッセイ用培地にて
希釈したリトコール酸（和光純薬）およびプロゲステロ
ン（和光純薬）を２×１０ ^-5Ｍとなるよう添加し、３７
℃、５％ＣＯ₂条件下で４時間培養した。培養上清を捨
てて、ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピッカジ
ーンＬＴ２．０（東洋インキ製造株式会社）を５０μｌ
添加し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベ
ルカウンター、Wallac社）を用いてルシフェラーゼの発
光量を測定した。その結果、配列番号：２で表される塩
基配列を有するＴＧＲ５遺伝子を導入したＨＥＫ２９３
細胞特異的に、リトコール酸、プロゲステロンによるル
シフェラーゼ活性の上昇が認められた（図６）。

【０１００】実施例２ Ｇタンパク質共役型レセプター
タンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミド
の宿主細胞への導入 公知の方法によって作製した各種Ｇタンパク質共役型レ
セプタータンパク質ｃＤＮＡ、すなわち甲状腺ホルモン
刺激因子レセプター（ＴＲＨＲ）、ニューロメジンＵレ
セプター（ＦＭ−３およびＴＧＲ−１）、プロラクチン
放出因子レセプター（ｈＧＲ３）、アペリンレセプター
（ＡＰＪ）などを挿入した動物細胞用発現プラスミドを
用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたコロ
ニーを単離・培養後、QIAGEN Plasmid Maxi Kit（キア
ゲン）を用いてプラスミドの調製を行なった。また、ｃ
ＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポー
ターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたｐＣＲＥ
−Ｌｕｃ（Clontech）のレポータープラスミドを同様に
して調製した。Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク
質発現プラスミドおよびレポータープラスミドを導入す
る宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞をコラーゲンタ
イプＩでコートした96-well黒色プレート（ベクトンデ
ィッキンソン社）に100,000 cells/well、培養液量１０
０μｌで播種し、一晩培養した。同じくＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞をpAKKO-111Hで形質転換したＣＨＯ−ｍｏｃ
ｋ細胞をコスター社の９６−ｗｅｌｌ黒色プレートに4
0,000 cells/well、培養液量１００μｌで播種し、一
晩培養した。いずれの細胞についても、プレートで培養
するための培地はＤＭＥＭ（GibcoBRL社）に１０％のウ
シ胎児血清のみを添加したものを用いた。各プラスミド
を２４０ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、Ｇタンパク質共役
型レセプタータンパク質の発現プラスミド９μｌとレポ
ータープラスミド１μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM
-I（GibcoBRL社）に添加した。これを、同じく２４０μ
ｌのOpti-MEM-Iに１０μｌのリポフェクトアミン2000
（GibcoBRL社）を添加したものと等量混合して、リポフ
ェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従っ
てリポソームとプラスミドの複合体を形成させた。ま
た、効率的なスクリーニングの実施のためには、２４０
ｎｇ／μｌの濃度で３種類のレセプター発現プラスミド
を５μｌずつ添加し、他の試薬の比率は前出と同じもの
を調製した。これらを２５μｌ／ｗｅｌｌずつＨＥＫ２
９３あるいはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞の培養液に添加し、
３７℃で一晩培養してプラスミドの導入を行った。ＣＨ
Ｏ−ｍｏｃｋ細胞については、プラスミド添加後４時間
以降に培養液をアッセイバッファー（０．１％のウシ血
清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）に交換し、無血清化
をおこなった。

【０１０１】実施例３ レポーターアッセイによるリガ
ンド活性の検出 ＨＥＫ２９３細胞についてはアッセイの１時間前に培養
液を実施例２に記載のアッセイバッファーに交換し、プ
レインキュベーションを行なった。アッセイバッファー
にリガンドあるいはリガンド候補化合物を溶解したもの
を用意し、実施例２で準備したＨＥＫ２９３細胞または
ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞に添加した。また、アッセイバッ
ファーに終濃度２μＭのフォルスコリンを添加した条件
でのアッセイも同様にして実施した。サンプルを添加後
に４時間のインキュベーションを行ない、レセプターを
介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細
胞内シグナル伝達に由来するレポーター遺伝子の転写・
翻訳の促進あるいは抑制を誘導した。インキュベーショ
ン終了後に各ウェルのアッセイバッファーを除去し、ピ
ッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）発光基質を５０
μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した
後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現誘導量に由来す
る発光量を実施例１記載のプレートリーダーにて測定し
た。実施例２および３に記載の方法に従って各種のＧタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質ｃＤＮＡを挿入し
た発現プラスミドを用い、ＨＥＫ２９３細胞においてリ
ガンド刺激によるレポーター遺伝子の発現誘導を測定し
た。レセプターを介して細胞内へシグナルを伝達するＧ
タンパク質αサブユニットの種類としてＧｓに共役する
ＣＲＦＲについては、フォルスコリン非添加、添加のい
ずれの条件においてもリガンド添加によるレポーター遺
伝子の活性化が検出された。また、抑制性であるＧαｉ
に共役するＡＰＪについては、フォルスコリン添加条件
において、リガンド添加によるレポーター遺伝子発現の
抑制が検出された。また、Ｇｑに共役するレセプターＴ
ＲＨＲ、ＦＭ−３、ＴＧＲ−１については、フォルスコ
リン添加条件においてレポーター遺伝子の発現の促進が
検出された。ＧｑおよびＧｉの両方に共役するレセプタ
ーｈＧＲ３についても、同様にフォルスコリン添加条件
においてレポーター遺伝子の発現の促進が検出された
（図７）。

【０１０２】実施例４ 抑制性Ｇタンパク質αサブユニ
ットＧｉ発現プラスミドを用いたレポーターアッセイ 実施例２に示したＧタンパク質レセプター発現プラスミ
ドと同様の方法によって抑制性Ｇタンパク質αサブユニ
ット(Ｇｉ)プラスミドを作製、調製した（ここで、Ｇｉ
ついては、動物種を問わない）。これを３μｌ、レセプ
ター発現プラスミドを７μｌ、レポータープラスミドを
１μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-Iに添加し、その
他の条件は実施例２と同様の方法でＨＥＫ２９３あるい
はＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞にＤＮＡを導入した。これら３
種のプラスミドの混合比は全体の量を１１μｌとした場
合、Ｇｉが１から６、好ましくは１から３が適当であ
る。これらを実施例３の方法に従ってアッセイを行いリ
ガンド活性を検出した。すなわち、Ｇｉを用いたＴＧＲ
５のリトコール酸に対する反応を検出した結果、ＣＨＯ
−ｍｏｃｋ細胞を用いたＧタンパク質レセプターＴＧＲ
５のアッセイにおいて、ＧｉをＴＧＲ５と同時に発現さ
せることにより、リガンド非添加時（リガンド（−））
のルシフェラーゼ活性を大幅に低下させることができ、
その結果リガンド（リトコール酸、２×１０^-5Ｍ、リガ
ンド（＋））による活性の上昇を検出することが可能と
なった（図８）。

【０１０３】実施例５ マウスおよびラット型ＴＧＲ５
タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基
配列の決定 配列番号：９で表されるオリゴＤＮＡをセンス鎖プライ
マー１として、配列番号：１０で表されるオリゴＤＮＡ
をアンチセンス鎖プライマー２として、各々０．４μ
Ｍ、GC2 DNA Polymerase（CLONTECH社製）０．３μｌ、
5x Buffer 6μｌ、GC-Melt 6μｌ、dNTP (TaKaRa社製)
0.2 mM、鋳型ＤＮＡとしてMarathon-ReadyMouse cDNA l
ibrary (CLONTECH社製)の心臓ｃＤＮＡ溶液３μｌ、滅
菌水９．９μｌからなる混合液３０μｌを調製し、サー
マルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (App
lied Biosystems社製)）を用いて、最初に９４℃で２０
秒間置いた後、９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８
℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃
で３０秒、６２℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクル
として５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３
０秒、６８℃で２分を１サイクルとして３５サイクル、
最後に６８℃で７分伸長反応させるタッチダウンＰＣＲ
のプログラムでＰＣＲ反応を行った。次に、反応終了液
の一部をエチジウムブロマイドを含む１．５％アガロー
スゲルを用いて電気泳動後、ＵＶ照射のもと分子量マー
カー換算で１ｋｂ付近の位置にＰＣＲ反応で増幅された
ＤＮＡに対応するバンドを確認した。次に塩基配列を決
定する為にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）
を用いてＴＡクローニングし、該プラスミドを大腸菌Ｄ
Ｈ５α株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン
含有ＬＢ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転
換株のコロニーの中から外来ＤＮＡ断片が挿入されてい
たプラスミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲ
により選択し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するために
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Re
ady Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いた
シーケンス反応を製品添付資料の条件にしたがって、サ
ーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (A
pplied Biosystems社製)）で行った後、該反応試料をＤ
ＮＡシーケンサーABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Ap
plied Biosystems社製)で分析した。その結果、ＰＣＲ
産物から配列番号：６で表される９９０塩基の塩基配列
からなり、配列番号：５で表される新規の３２９個のア
ミノ酸、すなわちＴＧＲ５に相同性のある構造遺伝子配
列を決定できた。配列番号：５を含有する新規Ｇタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質をｍＴＧＲ５と命名し
た。さらに、この形質転換体をエシェリヒア・コリ（Es
cherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ５
と命名した。配列番号：１１で表されるオリゴＤＮＡを
センス鎖プライマー３として、配列番号：１２で表され
るオリゴＤＮＡをアンチセンス鎖プライマー４として、
各々0.4 μＭ、Advantage2 DNA Polymerase (CLONTECH
社製)0.3μｌ、10x Buffer 3μｌ、dNTP (TaKaRa社製)
0.2 ｍＭ、鋳型ＤＮＡとしてMarathon-Ready Rat cDNAl
ibrary (CLONTECH社製)の心臓ｃＤＮＡ溶液3μｌ、滅菌
水18.9μｌからなる混合液30μｌを調製し、サーマルサ
イクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied B
iosystems社製)）を用いて、最初に９４℃で２０秒間置
いた後、９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８℃で２
分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０
秒、６２℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして
５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、
６８℃で２分を１サイクルとして３５サイクル、最後に
６８℃で７分伸長反応させるタッチダウンＰＣＲのプロ
グラムでＰＣＲ反応を行った。次に、反応終了液の一部
をエチジウムブロマイドを含む１．５％アガロースゲル
を用いて電気泳動後、ＵＶ照射のもと分子量マーカー換
算で１ｋｂ付近の位置にＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ
に対応するバンドを確認した。次に塩基配列を決定する
為にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）を用い
てＴＡクローニングし、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α
株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有Ｌ
Ｂ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株の
コロニーの中から外来ＤＮＡ断片が挿入されていたプラ
スミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲにより
選択し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するためにABI PR
ISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Re
action Kit（Applied Biosystems社製）を用いたシーケ
ンス反応を製品添付資料の条件にしたがって、サーマル
サイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied
Biosystems社製)）で行った後、該反応試料をＤＮＡシ
ーケンサーABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied
Biosystems社製)で分析した。その結果、ＰＣＲ産物か
ら配列番号：８で表される９９０塩基の塩基配列からな
り、配列番号：７で表される新規の３２９個のアミノ
酸、すなわちＴＧＲ５に相同性のある構造遺伝子配列を
決定できた。配列番号：７を含有する新規Ｇタンパク質
共役型レセプタータンパク質をrＴＧＲ５と命名した。
次に、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに挿入したＤＮＡ断片
を、プライマー３、プライマー４に付加された制限酵素
ＳａｌＩ、ＳｐｅＩサイトで酵素消化し、切り出された
ｒＴＧＲ５の配列を持つＤＮＡ断片を、発現プラスミド
ｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ（Hinuma, S., Hosoya, M., Og
i., Tanaka, H., Nagai, Y., and Onda, H.（1994）Bio
chim. Biophys. Acta 1129, 251-259）のＳａｌＩ、Ｓ
ｐｅＩサイトに挿入し、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α
株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有Ｌ
Ｂ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株の
コロニーの中からｒＴＧＲ５断片が挿入されていたプラ
スミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲにより
選択した。さらに、この形質転換体をエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ１．１１
Ｈ−ｒＴＧＲ５と命名した。

【０１０４】実施例６ ウシ脾臓ｃＤＮＡからのＰＣＲ
法によるＴＧＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡのク
ローニングと塩基配列の決定の取得 ウシ脾臓ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号：１７で表さ
れるプライマーｂＦおよび配列番号：１８で表されるプ
ライマーｂＲを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。Ｐ
ＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ ｂＦ
（１０μＭ）、０．５μｌ ｂＲ（１０μＭ）、２．５
μｌ添付の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０
ｍＭ）、０．５μｌ Advantage2 DNA polymerase（クロ
ーンテック社）、１７．５μｌ蒸留水を加えて合計２５
μｌにした。反応液を、Thermal Cycler9600（ＡＢＩ
社）を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５
℃２分の変性の後、９８℃１０秒、６３℃２０秒、７２
℃６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の
一部を用いて電気泳動で約１０００ｂｐのＰＣＲ産物の
増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をQiagen PCR purificat
ion Kit（キアゲン社）を用いて精製し、直接配列決定
を行ったところ配列番号：１３の配列が得られた。配列
番号：１３のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を
配列番号：１４に示す。次に、ゲルから回収したＰＣＲ
産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用い
て大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌JM10
9/pTAbTGR5-1を取得した。サブクローニングで得られた
大腸菌からプラスミドpTAbTGR5-1をプラスミド抽出機
（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を
決定し、その配列がウシ型ＴＧＲ５遺伝子であることを
確認した。

【０１０５】実施例７ ウサギ脾臓ｃＤＮＡからのＰＣ
Ｒ法によるＴＧＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡの
クローニングと塩基配列の決定の取得 ウサギ脾臓ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号：１９で表
されるプライマーｒａｂｂｉｔＦおよび配列番号：２０
で表されるプライマーｒａｂｂｉｔＲを用いて、ＰＣＲ
による増幅を行った。ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１
μｌ、０．５μｌ ｒａｂｂｉｔＦ（１０μＭ）、０．
５μｌ ｒａｂｂｉｔＲ（１０μＭ）、２．５μｌ添付
の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、
０．５μｌ Advantage2 DNA polymerase（クローンテッ
ク社）、１７．５μｌ蒸留水を加えて合計２５μｌにし
た。反応液を、ThermalCycler9600（ＡＢＩ社）を用い
てＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃２分の変
性の後、９８℃１０秒、６３℃２０秒、７２℃６０秒の
サイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用い
て電気泳動で約１０００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認
した後、ＰＣＲ産物をQiagen PCR purificationKit（キ
アゲン社）を用いて精製し、直接配列決定を行ったとこ
ろ配列番号：１５で表される塩基配列がえられた。配列
番号：１５で表されるＤＮＡ配列から予測されるアミノ
酸配列を配列番号：１６で示す。次に、ゲルから回収し
たＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen
社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、
大腸菌JM109/pTArabbitTGR5-1を取得した。サブクロー
ニングで得られた大腸菌からプラスミドpTArabbitTGR5-
1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、
挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウサギ型ＴＧ
Ｒ５遺伝子であることを確認した。

【０１０６】実施例８ ヒト、ウサギ、ウシ、マウスお
よびラット型ＴＧＲ５の胆汁酸刺激によるレポーター遺
伝子の発現量上昇の検出 実施例１に示したのと同様の方法により、動物細胞での
発現用ベクターpAKKO-111Hに、実施例５に示したマウス
およびラット型ＴＧＲ５遺伝子、実施例６に示したウシ
型ＴＧＲ５遺伝子、および実施例７に示したウサギ型Ｔ
ＧＲ５遺伝子を挿入してそれぞれの遺伝子の発現ベクタ
ーを作製した。これらとインサートが挿入されていない
元の発現ベクターおよび実施例１に示したヒト型ＴＧＲ
５発現ベクターを実施例４に示した方法に従い、抑制性
Ｇタンパク質αサブユニット（Ｇｉ）、レポータープラ
スミドとともにＣＨＯ−Ｍｏｃｋ細胞に一過性に発現さ
せた。これを実施例３の方法に従い胆汁酸の刺激による
レポータ遺伝子の発現量を検出した。胆汁酸としてはタ
ウロリトコール酸（ＴＣＬＡ）、リトコール酸（ＬＣ
Ａ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコー
ル酸（ＣＤＣＡ）、をそれぞれ１０μＭで使用した。ま
たレポーター遺伝子発現のポジティブコントロールとし
てはフォルスコリン（ＦＳＫ、２μＭ）を用いた。その
結果いずれの動物種由来のＴＧＲ５を発現させても、胆
汁酸添加区で胆汁酸を添加しない区（Ｂａｓｅ）より高
いルシフェラーゼ活性が検出された（図９）。このこと
からヒト型ＴＧＲ５と同様にウサギ、ウシ、マウスおよ
びラット型ＴＧＲ５も胆汁酸のレセプターとして作用す
ることが示された。

【０１０７】実施例９ ウサギ肺胞マクロファージの貪
食活性に対するタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）の抑制
作用 ウサギ（ＮＺＷ、メス、体重２．５−３．０ｋｇ前後）
から麻酔下にて血清および肺を採取した。ＰＢＳ（phos
phate-buffered saline）を気管より注入して洗浄する
ことにより、肺内の肺胞マクロファージ細胞を含む懸濁
液を回収した。得られた細胞をさらにＰＢＳで洗浄後、
培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ
酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した
もの。いずれもGibcoBRL社）に懸濁し、単核細胞分離液
であるＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（アマシャ
ムファルマシア社）上に重層・遠心処理し、赤血球を除
いた。単核細胞を培地にて洗浄後、０．２５×１０⁶／
ｗｅｌｌの濃度で２４ウェルプレートに播種し３７℃、
５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。培地を除き、ＴＬＣ
Ａ１００μＭを加えた培地、あるいはコントロールの培
地を０．５ｍｌ添加して、さらに１６時間培養した。同
じウサギより採取した血清５０μｌ、加熱により殺菌処
理した酵母懸濁液０．８×１０⁸／ｍｌを３０μｌ添加
し３７℃、５％ＣＯ₂条件下で４０分間培養した。０．
１％フクシン液（和光純薬社）を６０μｌ添加した後、
細胞をはがして遠心し、懸濁液を顕微鏡にて観察した。
フクシンにより酵母は染色されるが肺胞マクロファージ
により貪食された酵母は染色されないことを利用して、
貪食活性を示したマクロファージの算定を行った。その
結果、図１０に示すとおり、ＴＬＣＡを添加した場合に
おいて、マクロファージの免疫機能のひとつである貪食
活性の著明な低下が認められた。

【０１０８】実施例１０ ウサギ肺胞マクロファージに
おける、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）αの分泌に対するＴＬＣＡの抑制効果 実施例９の方法で採取したウサギ肺胞マクロファージを
０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈し２４ウェル
プレートで一晩培養後、ＬＰＳ刺激で誘導されるＴＮＦ
α分泌に対する影響を検討した。ＴＬＣＡ５０μＭを含
む培地あるいはコントロール培地０．５ｍｌに交換して
１時間培養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地あるいはコン
トロール培地にＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４
和光純薬）を加えたもの（添加時の濃度１ｎｇ／ｍｌ）
０．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下でさら
に１２時間培養した。培養後、上清を回収し、ＴＮＦ感
受性細胞株Ｌ９２９（理化学研究所）に対する増殖抑制
作用を指標にＴＮＦα量を測定した。Ｌ９２９細胞を
１．２×１０⁴／ｗｅｌｌにて９６ウェルプレートに播
種し３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養後、肺胞マク
ロファージ培養上清を適当に希釈し、２μｇ／ｍｌアク
チノマイシンＤ（和光純薬社）存在下で一晩培養した。
標準サンプルとしてはヒト組み換え型ＴＮＦα（Ｇｅｎ
ｚｙｍｅ社）を使用した。Ｌ９２９細胞の増殖はＣｅｌ
ｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（和光純薬社）によっ
て測定した。その結果、図１１に示すように、ＴＬＣＡ
を添加することにより、顕著なＴＮＦα分泌量の低下が
認められた。

【０１０９】実施例１１ ウサギ肺胞マクロファージの
各種サイトカインｍＲＮＡ発現量に対するタウロリトコ
ール酸（ＴＬＣＡ）の抑制作用 実施例９の方法で採取したウサギ肺胞マクロファージを
０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈し６ウェルプ
レートで一晩培養後、ＴＬＣＡ１００μＭを含む培地あ
るいはコントロール培地１．５ｍｌに交換して１時間培
養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地あるいはコントロール
培地にＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４、和光純
薬社）を加えたもの（添加時の濃度１ｎｇ／ｍｌ）１．
５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下でさらに２
時間培養した。培地を除去後、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポン
ジーン社）３ｍｌを加え、マニュアルにしたがい全ＲＮ
Ａを調製した。１μｇの全ＲＮＡを、SuperScriptII逆
転写酵素（Gibco BRL社）を用いてマニュアルに従いｃ
ＤＮＡを合成し、２５ｎｇ 全ＲＮＡ／μｌに相当する
ｃＤＮＡ溶液を調製した。各種サイトカインのｍＲＮＡ
発現量定量はABI prism 7700 Sequence Detector（ABI
社）を用いて行った。各反応には配列番号：２１から３
５で表されるそれぞれのサイトカインに特異的なプライ
マー、プローブを設計し使用した。ＰＣＲ反応液はUniv
ersal PCR master mix（ABI社）１２．５μｌ、それぞ
れのプライマーを各々１００μＭのものを０．２２５μ
ｌずつ、５μＭのプローブを１．２５μｌ、上記で調製
したｃＤＮＡ溶液１μｌを加え、全量を蒸留水で２５μ
ｌとした。それぞれのサンプルは５０℃で２分間、９５
℃で１０分間置いた後、９５℃で１５秒、６０℃で１分
のサイクルを４０回繰り返し定量のための反応を行っ
た。その結果、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−８のいずれのサイトカインにおいてもＴ
ＬＣＡの添加により明らかに発現量が低下し、ウサギ肺
胞マクロファージに対するＴＬＣＡによる各種のサイト
カインのｍＲＮＡ発現抑制作用が見出された（図１
２）。

【０１１０】実施例１２ ＴＧＲ５遺伝子導入ＴＨＰ−
１細胞の作製 ヒトマクロファージ細胞株ＴＨＰ−１にＴＧＲ５遺伝子
を導入することによりＴＧＲ５高発現細胞を樹立した。
まず、定法に従いヒトＴＧＲ５のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ
３．１（Invitrogen社）に組み込んだｐｃＤＮＡ−ＴＧ
Ｒ５を作製した。ＴＨＰ−１を培地（ＲＰＭＩ１６４０
１０％ＦＢＳ）にて培養し、定法に従い、リポフェク
トアミン（GibcoBRL社）を用いてｐｃＤＮＡ−ＴＧＲ５
を導入した。その後、Ｇ４１８（GibcoBRL社）を培地に
添加して耐性株を選択し、安定的にＴＧＲ５を高発現す
る細胞株、ＴＨＰ−ＴＧＲ５を樹立した。

【０１１１】実施例１３ ＴＨＰ−ＴＧＲ５における、
リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）αの分泌およびｍＲＮＡ発現量に対するＴＬＣＡの
抑制効果 実施例１２で得たＴＨＰ−ＴＧＲ５あるいはもとのＴＨ
Ｐ−１細胞を０．５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈し
て１０^-8Ｍのホルボールエステル（和光純薬）存在下で
２４ウェルプレートで一晩培養後、ＬＰＳ刺激で誘導さ
れるＴＮＦα分泌に対する影響を検討した。ＴＬＣＡ１
００μＭを加えた培地あるいはコントロール培地０．５
ｍｌにて１時間培養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地ある
いはコントロール培地にＬＰＳを加えたもの（添加時の
濃度５０ｎｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加し、３７℃、５
％ＣＯ₂条件下で２４時間培養した。培養後、上清を回
収し、実施例１０と同じようにＴＮＦα含量をＬ９２９
の増殖抑制活性により定量した。またＴＨＰ−１とＴＨ
Ｐ−ＴＧＲ５の全ＲＮＡはＬＰＳ添加の２時間後に細胞
から実施例１１と同様の方法で調製した。ヒト型ＴＮＦ
α ｍＲＮＡの発現量はTaqMan Cytokine Gene Expressi
on plate I（ＡＢＩ社）を使用して求めた。定量値はＴ
ＨＰ−１細胞のＬＰＳ、ＴＬＣＡをともに添加しなかっ
た区値を１とした時の相対値で示した。その結果、図１
３に示すように、ＴＨＰ−ＴＧＲ５ではＴＬＣＡ添加に
より顕著なＴＮＦα分泌量の低下が認められた、一方、
もとのＴＨＰ−１では顕著なＴＮＦα分泌抑制作用は見
られなかった。またｍＲＮＡも同様にＴＬＣＡ添加によ
る顕著な発現量の低下が認められた。これらのことか
ら、ウサギ肺胞マクロファージで認められたＴＮＦα分
泌抑制効果は明らかにＴＧＲ５を介したものであること
が確認され、生体内においてＴＧＲ５がこうした免疫機
能の制御に関わることが示された。

【０１１２】実施例１４ ＣＨＯ細胞に発現させたＴＧ
Ｒ５−ＧＦＰ融合タンパク質のタウロリトコール酸添加
による細胞内移行 ＴＧＲ５のＣ末端に翻訳のフレーム合わせてオワンクラ
ゲより単離されたGreen Fluorescent Protein（ＧＦ
Ｐ）ｃＤＮＡをつないだ融合タンパク質を発現させるた
めの発現プラスミドを構築した。その際ＧＦＰ ｃＤＮ
ＡにはＧＦＰの発現ベクターｐＱＢＩ２５（宝酒造）か
ら切り出した断片を用いた。ＴＧＲ５はＰＣＲ法により
その終止コドンを制限酵素ＮｈｅＩの認識配列に修正
し、ここにＧＦＰ断片を連結して、実施例１に記載の発
現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入した。このよう
にして得たＴＧＲ５とＧＦＰの融合タンパク質（以下、
ＴＧＲ５-ＧＦＰ）発現ベクターのプラスミド を以下の
方法でＣＨＯ-ｍｏｃｋ細胞にトランスフェクションし
た。ＣＨＯ-ｍｏｃｋ細胞は増殖培地［ＤＭＥＭ（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄ
ｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）に１０％ウシ胎児血清
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を添加したもの］に懸濁し、
０．６×１０⁵ｃｅｌｌｓ／チャンバーの濃度にてチェ
ンバー数４つのＬａｂ−ＴｅｋIIカバーグラスチェンバ
ー（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ社）にまき、３７℃、５％
ＣＯ₂条件下で一晩培養した後にトランスフェクション
した。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍ
ｉｎｅ^TM ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（GIBCO BRL社）を
用いた。まずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０００
Ｒｅａｇｅｎｔ ２μｌとＯＰＴＩ−ＭＥＭ−I（GIBCO
BRL社）５０μｌを混合し、２０分間室温で静置するこ
とによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成さ
せた後、上記のＣＨＯ細胞を培養したチェンバーに１０
０μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩
培養した。培地を共焦点顕微鏡観察用培地［Ｈａｎｋ
ｓ' Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ社）に０．１％ウシ アルブミン（Ｅｓ
ｓｅｎｔｉａｌｌｙ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｆｒｅｅ、
ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を懸濁したもの］に置き換え、
共焦点顕微鏡（ライカ社）でＧＦＰの蛍光像を観察し
た。その際、ＧＦＰの励起は４８８ｎｍで行った。その
結果ＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質は細胞膜に観察さ
れた（図１４）。この細胞にタウロリトコール酸を１０
^-5Ｍとなるように培地に添加３０分後には、ＧＦＰの蛍
光が細胞膜ではなく、細胞質に移動していることが見出
された（図１５）。このことはＴＧＲ５が細胞膜に発現
するＧタンパク質共役型のレセプターであるとともに、
ＴＧＲ５がタウロリトコール酸に反応して細胞質へ移
行、すなわちインタナリゼーションしたことを示してい
た。

【０１１３】実施例１５ タウロリトコール酸添加によ
るＴＧＲ５発現ＣＨＯ細胞でのＭＡＰキナーゼ活性化 実施例１で作製したＴＧＲ５発現ベクターを用いて公知
の方法で作製した安定的なＴＧＲ５発現ＣＨＯ（ＣＨＯ
−ＴＧＲ５）またはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞を３×１０⁵
／ｗｅｌｌの濃度で６ウェルプレートに撒いて、血清低
濃度培地（核酸不含ＭＥＭα培地に０．５％の透析ウシ
胎児血清を添加したもの）にて一晩培養し、さらに無血
清培地（核酸不含ＭＥＭα培地に０．１％ウシ血清アル
ブミンを添加したもの）に交換して一晩培養した。新し
い無血清培地に交換して３時間培養後、２μＭのタウロ
リトコール酸（ＴＬＣＡ）を添加した。０−２０分イン
キュベーションしたのち、サンプルバッファー（TEFCO
社）で細胞を溶解・抽出しＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
離を行った。その後PhosphoPlus p44/42 MAP kinase（T
hr202/Tyr204）Antibody Kit（Cell Signaling Technol
ogy, Inc）を用いたウエスタンブロッテイングを行っ
た。その結果、図１６に示す通り、ＴＧＲ５発現ＣＨＯ
細胞でのみ、ＴＬＣＡ添加後５分をピークにＭＡＰキナ
ーゼのリン酸化によって示される当該タンパク質の活性
化が起こることが分かった。

【０１１４】実施例１６ ＴＧＲ５発現ＣＨＯ細胞にお
ける各種胆汁酸のｃＡＭＰ産生上昇活性 ＣＨＯ−ＴＧＲ５を２×１０⁴／ｗｅｌｌの濃度で９６
ウェルプレートに撒いて一晩培養後、ｃＡＭＰ産生量の
測定に用いた。アッセイ用バッファー（ＤＭＥＭに０．
１％ウシ血清アルブミン、0.2mM 3-Isobutyl-1-methylx
anthine, IBMXを添加したもの）で細胞を２回洗浄し、
３０分プレインキュベーションした。細胞を２回洗浄し
た後、アッセイ用バッファーに希釈したサンプルを細胞
に添加して２０分間インキュベーションした。培養上清
を捨てて、cAMP Screen System（ＡＢＩ）によってｃＡ
ＭＰ産生量を測定した。ポジティブコントロールとし
て、リトコール酸（ＬＣＡ）１０μＭを用いた。ｃＡＭ
Ｐ産生量はポジティブコントロールを１００％とした場
合の％値で表した。その結果、図１７に示す通りタウロ
リトコール酸（ＴＬＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、
デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸
（ＣＤＣＡ）、コール酸（ＣＡ）の順で濃度依存的なｃ
ＡＭＰ産生の上昇が観察された。また、２μＭの濃度で
その他の胆汁酸やコレステロール代謝化合物などによる
ＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるｃＡＭＰ産生上昇活性を比較
し、その結果を図１８に示した。ＬＣＡ、ＤＣＡ、ＣＤ
ＣＡ、ＣＡのそれぞれにおいて、タウリン抱合体
（Ｔ）、グリシン抱合体（Ｇ）、非抱合体（Ｆ）のいず
れもｃＡＭＰ産生上昇活性を有することが分かった。

【０１１５】実施例１７ ヒトＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現
分布解析 ｍＲＮＡの発現量の定量にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７０
０ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバ
イオシステムズ社）を用いた。発現量の定量に用いるプ
ライマーとプローブは、ヒト型ＴＧＲ５の塩基配列（配
列番号：２）をもとにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ専用のソフトウエアＰ
ｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステム
ズ社）を利用してデザインした。鋳型となるｃＤＮＡ
は、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテ
ック社）１μｇからランダムプライマーを用いて４２℃
で合成した。逆転写反応にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩ
Ｉ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）を用い、添付のマ
ニュアルに従って反応を行い、反応終了後エタノール沈
殿して１００μｌに溶解した。また分画したヒト血球由
来のｃＤＮＡとしてはＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ
ｃＤＮＡ（ＭＹＴＣ^TM）ｐａｎｅｌｓ Ｈｕｍａｎ Ｂｌ
ｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ (クロンテック社)を使用し
た。ＡＢＩＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅ
ｔｅｃｔｏｒの反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオ
システムズ社）のマニュアルにしたがい、マスターミッ
クスを１２．５μｌ、プライマーを０．９μＭ、プロー
ブを０．２５μＭ、各サンプルのｃＤＮＡ溶液を１μｌ
で混ぜ合わせ、蒸留水で２５μlとして調製した。ＡＢ
Ｉ ＰＲＩＳＭ ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔ
ｏｒでの反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分の後、
９５℃ １５秒、６０℃ １分のサイクルを４０回繰り返
して行った。ヒト各種組織でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発
現分布を図１９に示す。胎盤、脾臓、肺など免疫に関与
する組織での高発現が見出された。またヒト血球でのＴ
ＧＲ５ ｍＲＮＡの発現量を図２０に示す。ＣＤ１４を
発現している血球、すなわち単球・マクロファージでの
高発現が見出された。

【０１１６】実施例１８ ウサギＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発
現分布解析 実施例１７と同様の方法でウサギ型ＴＧＲ５ ｍＲＮＡ
の発現量を求めた。用いたプライマーとプローブはウサ
ギＴＧＲ５（配列番号：１５）をもとにデザインした。
ウサギの各種組織由来の全ＲＮＡは、北山ラベス社より
購入したＮＺＷ雌性 体重２．５−３．０ｋｇ前後の個
体より各組織を取得し、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン
社）を用い、付属のマニュアルにしたがって調製した。
ｃＤＮＡは調製した全ＲＮＡ １μｇから実施例１７と
同様の方法で合成した。ただし逆転写反応後は４０μｌ
に溶解した。ウサギ型ＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現は図２
１に示したように、免疫に関与する脾臓、肺胞マクロフ
ァージや胸腺で高発現していた。

【０１１７】実施例１９ ＴＬＣＡによるウサギ肺胞マ
クロファージのｃＡＭＰ産生上昇 実施例９の方法で調製したウサギ肺胞マクロファージを
培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ
酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した
もの）に懸濁し２×１０⁵／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェ
ルプレートに撒き一晩培養した。細胞をＤＭＥＭに０．
１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＩＢＭＸを加えた培地で２回洗浄
した後、同じ培地に希釈したＴＬＣＡ ２００μＭある
いは培地を添加して４分間インキュベーションした。cA
MP Screen System（ＡＢＩ）によってｃＡＭＰ産生量を
測定した結果、図２２に示す通りＴＬＣＡ添加によりｃ
ＡＭＰ産生量の上昇が認められた。

【０１１８】実施例２０ ウサギ肺胞マクロファージの
貪食活性におよぼす各種胆汁酸の抑制効果 実施例９の方法に従い、ウサギ肺胞マクロファージを調
製し、各種胆汁酸による貪食能抑制効果を検討した。そ
の結果、図２３に示すとおり、ＴＬＣＡの他、ＧＬＣ
Ａ、ＬＣＡを１００μＭにて添加した場合において、マ
クロファージの免疫機能のひとつである貪食活性の著明
な低下が認められた。

【０１１９】実施例２１ ウサギ肺胞マクロファージか
らのＴＮＦα分泌に対する胆汁酸の抑制効果 実施例９の方法で調製したウサギ肺胞マクロファージを
培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ
酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した
もの）に懸濁し０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度で２
４ウェルプレートに撒き一晩培養した。同じ培地を用い
て胆汁酸を希釈してグラフに表示した濃度にて肺胞マク
ロファージに添加して１時間培養した。さらに、同じ濃
度の胆汁酸サンプルにリポ多糖（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｏ１１１：Ｂ４ 和光純薬）を添加したものを追加し
て加え、１２時間培養した。ＬＰＳの濃度は１ｎｇ／ｍ
ｌにて加えた。培養後、培養上清を回収し、実施例１０
と同様に上清中のＴＮＦαを定量した。その結果、図２
４に示す通り、ＴＧＲ５にアゴニスト活性を示す胆汁酸
の添加により濃度依存的にＴＮＦα分泌量の抑制活性が
認められた。

【０１２０】実施例２２ ＴＧＲ５遺伝子を導入したＴ
ＨＰ−１細胞におけるｃＡＭＰ産生上昇 ＴＨＰ−１あるいは実施例１２で得たＴＧＲ５高発現細
胞株ＴＨＰ−ＴＧＲ５をアッセイ用培地（ＤＭＥＭに
０．１％ ＢＳＡと１ｍＭ ＩＢＭＸを添加したもの）で
洗浄後、１×１０⁵／ｗｅｌｌにて９６ウェルプレート
に撒いた。上記アッセイ用培地にて希釈した胆汁酸を添
加して２０分間インキュベーションした。その後cAMP S
creen System（ＡＢＩ）によってｃＡＭＰ産生量を測定
した結果、図２５に示す通りＴＨＰ−ＴＧＲ５において
ＴＬＣＡ、ＬＣＡ、ＤＣＡ添加によるｃＡＭＰ産生量の
上昇が認められた。一方ＴＨＰ−１ではＴＬＣＡによる
ｃＡＭＰ産生上昇は認められないことから、これらの胆
汁酸によるｃＡＭＰ上昇はＴＧＲ５を介した反応である
ことが確かめられた。

【０１２１】実施例２３ ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−
ＴＧＲ５からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する
各種胆汁酸の抑制効果 実施例１３と同様にＴＨＰ−ＴＧＲ５あるいはＴＨＰ−
１細胞を処理し、ＬＰＳで刺激されたＴＮＦα分泌に対
する各種胆汁酸の抑制効果を検討した。ＬＰＳ刺激は１
２時間とし、培養上清を回収後、実施例１３と同じく、
バイオアッセイによるＴＮＦα含有量の測定を行った。
その結果、図２６に示す通り、ＴＨＰ−ＴＧＲ５では胆
汁酸の濃度依存性にＴＮＦα分泌量の低下が認められ
た。一方、ＴＨＰ−１では顕著なＴＮＦα分泌抑制作用
は見られなかった（図２７）。これらのことから、ウサ
ギ肺胞マクロファージで認められたＴＮＦα分泌抑制効
果は明らかにＴＧＲ５を介したものであることが確認さ
れ、生体内においてＴＧＲ５がこうした免疫機能の制御
に関わることが示された。

【０１２２】参考例１ ヒト染色体ＤＮＡを用いたＰＣ
Ｒ法によるヒトＧＰＲ７ ＤＮＡの増幅 ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、２種の合成プライマー
（配列番号：４２および配列番号：４３）を用いたＰＣ
Ｒ法によるＤＮＡ増幅を行なった。合成プライマーはレ
セプタータンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増幅さ
れるように構築したが、その際に遺伝子の５’側に制限
酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、３’側に
制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されるよう
に、５’側および３’側にそれぞれの制限酵素の認識配
列を付加した。反応液の組成は、ヒト染色体ＤＮＡ（タ
カラ）0.5μg、合成DNAプライマー各1μM、0.8 mM dNTP
s、1 mM MgCl₂、KODポリメラーゼ（トーヨーボー）1μl
および酵素に付属のバッファーで、総反応量は50μlと
した。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（タ
カラ）を用い、94℃・60秒の加熱の後、98℃・15秒、65
℃・2秒、74℃・30秒のサイクルを35回繰り返した。増
幅産物の確認は、0.8%アガロースゲル電気泳動の後、エ
チジウムブロマイド染色によって行なった。

【０１２３】参考例２ ＰＣＲ産物のプラスミドベクタ
ーへのサブクローニングおよび挿入ＤＮＡ部分の塩基配
列の解読による増幅ＤＮＡ配列の確認 参考例１で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をか
みそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行
なってＤＮＡを回収した。pCR-Script^TM Amp SK(+)クロ
ーニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収
したＤＮＡをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)
へサブクローニングした。これをエシェリヒア・コリ(E
scherichia coli) DH5αcompetent cell（トーヨーボ
ー）に導入して形質転換した後、ＤＮＡ挿入断片を持つ
クローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを
含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみ
を滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体E. col
i DH5α/GPR7を得た。個々のクローンをアンピシリンを
含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit
（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調
製したＤＮＡの一部に対して制限酵素ＣｌａＩおよびＳ
ｐｅＩによる切断を行ない、挿入されているレセプター
ＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のため
の反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit (App
lied Biosystems社)を用いて行ない、蛍光式自動シーケ
ンサーを用いて解読した（配列番号：３９）。配列番
号：３９で表わされる塩基配列を有するDNAを保持するp
CR-Script Amp SK(+)プラスミドを、pCR-ScriptヒトGPR
7と命名した。配列番号：３９で表わされる塩基配列を
有するＤＮＡがコードするヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列
を配列番号：３８に示した。ここで配列を決定したヒト
ＧＰＲ７のＤＮＡ配列はＯ’Ｄｏｗｄらの報告（O'Dow
d, B. F. et al.、Genomics、28巻、84-91頁、1995年）
にあるＤＮＡ配列とは２塩基が異なっていた。これらは
配列番号：３９の８９３番目および８９４番目に当た
り、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告ではそれぞれＣおよびＧであ
るが、本参考例ではＧおよびＣであった。これにより、
翻訳されるアミノ酸配列において配列番号：３８の２９
６番目のアミノ酸が、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告のＴｈｒが
本実施例ではＳｅｒとなる。

【０１２４】参考例３ ヒト全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ
法によるＧＰＲ７リガンド前駆体遺伝子の取得と発現プ
ラスミドの構築 クローンテック社より購入したヒト全脳ｃＤＮＡを鋳型
として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲに
よる増幅を行った。 GSF1: 5'-GTCGACATGGCCCGGTCCGCGACACTGGCGGCC-3'（配
列番号：４０） GSR2: 5'-GCTAGCAGCGGTGCCAGGAGAGGTCCGGGCTCA-3'（配
列番号：４１） ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ GSF
1（10 μM）、０．５μｌ GSR2（１０μＭ）、２．５μ
ｌ添付の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍ
Ｍ）、０．５μｌ KlenTaq（クローンテック）、１７．
５μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液
を、ThermalCycler9600を用いてＰＣＲ反応にかけた。
ＰＣＲの条件は９５℃２分の変性の後、９８℃１０秒、
６０℃２０、７２℃２０秒のサイクルを３５回繰り返し
た。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００ｂｐ
のＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をQIAGEN
PCR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定
を行ったところ図２８（配列番号：３７）で示す配列が
えられた。図２８のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸
配列は図２９（配列番号：３６）に示すものであった。
次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニング
キット（Invitrogen社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサ
ブクローニングし、大腸菌JM109/pTAhGPR7-1を取得し
た。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミド
pTAhGPR7-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて
抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図２
８と同じヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡであることを
確認した。次にそのプラスミドから制限酵素ＳａｌＩお
よびＮｈｅＩによって消化後約０．４ｋｂのヒト型ＧＰ
Ｒ７リガンドｃＤＮＡ断片を得た。さらに、動物細胞用
の発現ベクターであるpAKKO-111Hはマルチクローニング
サイト部分の制限酵素サイトＳａｌＩおよびＮｈｅＩに
よって消化後、電気泳動を行い、ベクター部分を回収し
た。以上の操作によって調製したヒト型ＧＰＲ７リガン
ドｃＤＮＡ断片および発現ベクターをライゲーションに
よって連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換してE.coli
JM109/pAK-S64を得た。形質転換体E.coli JM109/pAK-S
64を培養し、プラスミドpAK-S64のDNAを大量に調製し
た。

【０１２５】参考例４ ＧＰＲ７発現プラスミドおよび
レポータープラスミドのチャイニーズハムスターオバリ
ー（ＣＨＯ）細胞での一過的な発現 参考例３で得たヒト型ＧＰＲ７ ＤＮＡを、公知の方法
により動物細胞用発現プラスミドｐＡＫＫＯ-111Ｈに挿
入したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換
した。得られたコロニーを単離・培養後、QIAGEN Plasm
id Maxi Kit（キアゲン社）を用いてＧＰＲ7発現プラス
ミドＤＮＡの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポン
スエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポーターとしてルシ
フェラーゼ遺伝子が連結されたpCRE-Luc（クロンテック
社）のプラスミドＤＮＡを同様の方法で調製した。ＧＰ
Ｒ７発現プラスミドおよびpCRE-Lucはレセプター遺伝子
を挿入していない発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞に
一過性に発現させた。ＣＨＯ細胞は９６−ウェルプレー
ト（コーニングコースター社）に40,000 細胞/ウェ
ル、培養液量１００μｌで播種し、３７℃で一晩培養し
た。プレート上での培養にはＤＭＥＭ（Dulbecco's mod
ified Eagle's medium, GibcoBRL社）に１０％のウシ胎
児血清のみを添加した培地を用いた。各プラスミドは24
0ng/μlの濃度に希釈し、ＧＰＲ７の発現プラスミド９
μｌとpCRE-Luc １μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-
I（GibcoBRL社）に添加した。これを、同じく２４０μ
ｌのOpti-MEM-Iに１０μｌのリポフェクトアミン2000
（GibcoBRL社）を添加したものと等量混合して、リポフ
ェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従っ
てリポソームとプラスミドＤＮＡの複合体を形成させ
た。これを25μl/wellずつＣＨＯ細胞の培養液に添加
し、その４時間後に培養液をアッセイバッファー（０．
１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）に交換
して無血清化し、３７℃で一晩培養した。

【０１２６】参考例５ リガンド遺伝子のＣＨＯ細胞で
の発現 参考例４で作製したヒト型リガンドｃＤＮＡを挿入した
動物細胞用発現プラスミドpAK-S64を参考例５と同様の
方法でCHO細胞に一過性に発現させた。ただし細胞は6-
ウェルプレート（ファルコン社）に600,000細胞/ウェル
で播種し、一晩培養の後、リガンド遺伝子プラスミドを
導入した。240ng/μlの濃度に希釈したプラスミドを10
μlと240 μlのOpti-MEM-Iに添加し、これを、同じく24
0 μlのOpti-MEM-Iに10 μlのリポフェクトアミン2000
を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン20
00に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームと
プラスミドDNAの複合体を形成させた。これを500μl/ウ
ェルずつＣＨＯ細胞の培養液に添加し、その４時間後に
培養液をアッセイバッファーに交換し、無血清化をおこ
なった。培地交換の１８時間後に各ウェルの培地を回収
しリガンドペプチドを含むＣＨＯ細胞培養上清を得た。

【０１２７】実施例２４ レポーターアッセイによるリ
ガンド活性の検出 参考例４の方法に従いＧＰＲ７を一過性に発現させたＣ
ＨＯ細胞の培養液に、参考例５で調製したpAK-S64発現
培養上清および終濃度2 μMとなるようにホルスコリン
を添加した。またリガンド遺伝子を挿入していない空の
発現ベクター（ｐAKKO-111H）を参考例５の方法で一過
性に発現させたＣＨＯ細胞の培養上清も同様に添加し
た。その際発現上清はアッセイバッファーにて２倍、４
倍、８倍、１６倍に希釈した。上清を添加してから４時
間、３７℃でインキュベーションを行ない、レセプター
を介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される
細胞内シグナル伝達に由来するレポーター（ルシフェラ
ーゼ）遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘導し
た。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセイバ
ッファーを除去し、PicaGene LT2.0 （東洋インキ社）
発光基質を５０μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と
充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現
誘導量に由来する発光量をプレートリーダー（ARVOsxマ
ルチラベルカウンター、PerkinElmer社）を用いて測定
した。その結果、ｐAK-S64の培養上清を添加した際にの
みレポーター遺伝子の発現抑制がルシフェラーゼ活性の
低下として検出された(図３０)。さらに、この抑制の程
度はｐAK-S64の培養上清の濃度依存的であった。このこ
とはpAK-S64に挿入されたプラスミドによって発現した
産物が、ＧＰＲ７を介した細胞内のシグナルを伝達し
た、すなわちＧＰＲ７のリガンドとして作用したことを
示している。

【０１２８】

【発明の効果】本発明のスクリーニング方法／キットを
用いることにより、新規Ｇタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とリ
ガンドであるコレステロール代謝関連物質との結合性を
変化させる化合物またはその塩が得られ、該化合物また
はその塩は、中枢疾患(例えば、アルツハイマー病、痴
呆、摂食障害など)、炎症性疾患(例えば、アレルギー、
喘息、リュウマチなど)、循環器疾患(例えば、高血圧
症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等)、癌（例えば、非
小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、
子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、糖尿病、免疫系疾患
（例えば、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓
・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁う
っ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、
吸収不良等）、肥満などの予防および／または治療等の
医薬等として用いることができる。本発明の、リガンド
が決定されていないレセプタータンパク質のリガンドの
決定方法では、各種の細胞系が使用できるため簡便であ
り、かつ短時間で測定等を実施することができる。

【０１２９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Screening method <130> P02-0051 <150> JP 2001-114203 <151> 2001-04-12 <150> JP 2001-180562 <151> 2001-06-14 <150> JP 2001-214922 <151> 2001-07-16 <150> JP 2001-397767 <151> 2001-12-27 <150> JP 2002-45728 <151> 2002-02-22 <160> 43 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Thr Pro Asn Ser Thr Gly Glu Val Pro Ser Pro Ile Pro Lys Gly 5 10 15 Ala Leu Gly Leu Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Ile Thr Ala Asn 20 25 30 Leu Leu Leu Ala Leu Gly Ile Ala Trp Asp Arg Arg Leu Arg Ser Pro 35 40 45 Pro Ala Gly Cys Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr 50 55 60 Gly Leu Ala Leu Pro Thr Leu Pro Gly Leu Trp Asn Gln Ser Arg Arg 65 70 75 80 Gly Tyr Trp Ser Cys Leu Leu Val Tyr Leu Ala Pro Asn Phe Ser Phe 85 90 95 Leu Ser Leu Leu Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Met 100 105 110 Ala Val Leu Arg Pro Leu Gln Pro Pro Gly Ser Ile Arg Leu Ala Leu 115 120 125 Leu Leu Thr Trp Ala Gly Pro Leu Leu Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu 130 135 140 Gly Trp Asn His Trp Thr Pro Gly Ala Asn Cys Ser Ser Gln Ala Ile 145 150 155 160 Phe Pro Ala Pro Tyr Leu Tyr Leu Glu Val Tyr Gly Leu Leu Leu Pro 165 170 175 Ala Val Gly Ala Ala Ala Phe Leu Ser Val Arg Val Leu Ala Thr Ala 180 185 190 His Arg Gln Leu Gln Asp Ile Cys Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg 195 200 205 Asp Glu Pro Ser Ala Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg 210 215 220 Ala Gln Ala Gly Ala Met Leu Leu Phe Gly Leu Cys Trp Gly Pro Tyr 225 230 235 240 Val Ala Thr Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Tyr Glu Gln Arg Pro Pro 245 250 255 Leu Gly Pro Gly Thr Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Ala Ser 260 265 270 Ala Ala Ala Val Pro Val Ala Met Gly Leu Gly Asp Gln Arg Tyr Thr 275 280 285 Ala Pro Tyr Arg Ala Ala Ala Gln Arg Cys Leu Gln Gly Leu Trp Gly 290 295 300 Arg Ala Ser Arg Asp Ser Pro Gly Pro Ser Ile Ala Tyr His Pro Ser 305 310 315 320 Ser Gln Ser Ser Val Asp Leu Asp Leu Asn 325 330 <210> 2 <211> 990 <212> DNA <213> Human <400> 2 atgacgccca acagcactgg cgaggtgccc agccccattc ccaagggggc tttggggctc 60 tccctggccc tggcaagcct catcatcacc gcgaacctgc tcctagccct gggcatcgcc 120 tgggaccgcc gcctgcgcag cccacctgct ggctgcttct tcctgagcct actgctggct 180 gggctgctca cgggtctggc attgcccaca ttgccagggc tgtggaacca gagtcgccgg 240 ggttactggt cctgcctcct cgtctacttg gctcccaact tctccttcct ctccctgctt 300 gccaacctct tgctggtgca cggggagcgc tacatggcag tcctgaggcc actccagccc 360 cctgggagca ttcggctggc cctgctcctc acctgggctg gtcccctgct ctttgccagt 420 ctgcccgctc tggggtggaa ccactggacc cctggtgcca actgcagctc ccaggctatc 480 ttcccagccc cctacctgta cctcgaagtc tatgggctcc tgctgcccgc cgtgggtgct 540 gctgccttcc tctctgtccg cgtgctggcc actgcccacc gccagctgca ggacatctgc 600 cggctggagc gggcagtgtg ccgcgatgag ccctccgccc tggcccgggc ccttacctgg 660 aggcaggcaa gggcacaggc tggagccatg ctgctcttcg ggctgtgctg ggggccctac 720 gtggccacac tgctcctctc agtcctggcc tatgagcagc gcccgccact ggggcctggg 780 acactgttgt ccctcctctc cctaggaagt gccagtgcag cggcagtgcc cgtagccatg 840 gggctgggcg atcagcgcta cacagccccc tggagggcag ccgcccaaag gtgcctgcag 900 gggctgtggg gaagagcctc ccgggacagt cccggcccca gcattgccta ccacccaagc 960 agccaaagca gtgtcgacct ggacttgaac 990 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding TGR5 <400> 3 gatgacgccc aacagcactg gcgaggtgcc 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding TGR5 <400> 4 ttagttcaag tccaggtcga cactgctttg g 31 <210> 5 <211> 329 <212> PRT <213> Mouse <400> 5 Met Met Thr Pro Asn Ser Thr Glu Leu Ser Ala Ile Pro Met Gly Val 5 10 15 Leu Gly Leu Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Val Ile Ala Asn Leu 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Gly Ile Ala Leu Asp Arg His Leu Arg Ser Pro Pro 35 40 45 Ala Gly Cys Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly 50 55 60 Leu Ala Leu Pro Met Leu Pro Gly Leu Trp Ser Arg Asn His Gln Gly 65 70 75 80 Tyr Trp Ser Cys Leu Leu Leu His Leu Thr Pro Asn Phe Cys Phe Leu 85 90 95 Ser Leu Leu Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Met Ala 100 105 110 Val Leu Gln Pro Leu Arg Pro His Gly Ser Val Arg Leu Ala Leu Phe 115 120 125 Leu Thr Trp Val Ser Ser Leu Phe Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu Gly 130 135 140 Trp Asn His Trp Ser Pro Asp Ala Asn Cys Ser Ser Gln Ala Val Phe 145 150 155 160 Pro Ala Pro Tyr Leu Tyr Leu Glu Val Tyr Gly Leu Leu Leu Pro Ala 165 170 175 Val Gly Ala Thr Ala Leu Leu Ser Val Arg Val Leu Ala Thr Ala His 180 185 190 Arg Gln Leu Cys Glu Ile Arg Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg Asp 195 200 205 Val Pro Ser Thr Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg Ala 210 215 220 Gln Ala Gly Ala Thr Leu Leu Phe Leu Leu Cys Trp Gly Pro Tyr Val 225 230 235 240 Ala Thr Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Tyr Glu Arg Arg Pro Pro Leu 245 250 255 Gly Pro Gly Thr Leu Leu Ser Leu Ile Ser Leu Gly Ser Thr Ser Ala 260 265 270 Ala Ala Val Pro Val Ala Met Gly Leu Gly Asp Gln Arg Tyr Thr Ala 275 280 285 Pro Trp Arg Thr Ala Ala Gln Arg Cys Leu Arg Val Leu Arg Gly Arg 290 295 300 Ala Lys Arg Asp Asn Pro Gly Pro Ser Thr Ala Tyr His Thr Ser Ser 305 310 315 320 Gln Cys Ser Ile Asp Leu Asp Leu Asn 325 <210> 6 <211> 990 <212> DNA <213> Mouse <400> 6 atgatgacac ccaacagcac tgagctgtcg gccattccca tgggggttct ggggctttcc 60 ttggccctgg caagcctcat cgtcatcgcc aacctgctcc tggccctagg catcgccctg 120 gaccgccact tgcgcagccc acctgctggc tgcttcttcc taagcctact actagccggg 180 ctgctcacag ggctggcact gcccatgctg cctgggctat ggagccggaa ccatcagggc 240 tactggtcct gcctccttct ccacttgacc cccaactttt gtttcctttc cctgcttgcc 300 aatctgctgc tggtgcatgg ggaacgctac atggcagtgt tgcagccact ccggccccat 360 ggaagtgtgc ggctagccct gttcctcacc tgggtcagct ccctgttctt tgccagcctg 420 cctgctctgg gctggaacca ttggagccct gatgccaact gcagctccca agctgtcttc 480 ccagccccct acctctacct ggaagtttat ggcctcctgt tgcctgccgt gggggccact 540 gcccttctct ctgtccgcgt gttggccact gcccaccgcc agctgtgtga gatccgccga 600 ctggagcggg cagtgtgccg cgatgtaccc tcaaccctgg ctagggctct cacctggagg 660 caggctaggg cacaggcagg agccacactg ctcttcttgc tgtgttgggg gccctatgtg 720 gccacattgc tcctgtcagt cttggcctat gagcgtcgcc caccactagg gcctggaact 780 ctgttatcgc tcatctcatt gggcagcacc agtgctgccg ctgtgcctgt ggccatgggg 840 ctgggtgatc agcgctacac agccccctgg aggacagctg cccaaaggtg tctacgagtg 900 cttcgaggaa gagccaagag ggacaatcca ggccccagca ctgcctacca caccagtagc 960 caatgcagca ttgacctgga cttgaattag 990 <210> 7 <211> 329 <212> PRT <213> Rat <400> 7 Met Met Ser His Asn Thr Thr Glu Leu Ser Ala Ile Pro Arg Gly Val 5 10 15 Gln Glu Leu Ser Leu Val Leu Ala Ser Leu Ile Val Ile Ala Asn Leu 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Gly Ile Val Leu Asp Arg His Leu Arg Ser Pro Pro 35 40 45 Ala Gly Cys Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly 50 55 60 Leu Ala Leu Pro Thr Leu Pro Gly Leu Trp Asn Arg Ser His Gln Gly 65 70 75 80 Tyr Trp Ser Cys Leu Leu Leu His Leu Ala Pro Asn Phe Cys Phe Leu 85 90 95 Ser Leu Leu Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Met Ala 100 105 110 Val Leu Gln Pro Leu Arg Pro His Gly Ser Val Arg Leu Ala Leu Phe 115 120 125 Leu Thr Trp Ile Ser Ser Leu Leu Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu Gly 130 135 140 Trp Asn His Trp Ser Pro Gly Ala Asn Cys Ser Ser Gln Ala Ile Phe 145 150 155 160 Pro Ala Pro Tyr Leu Tyr Leu Glu Val Tyr Gly Leu Leu Leu Pro Ala 165 170 175 Val Gly Ala Thr Ala Leu Leu Ser Val Arg Val Leu Ala Thr Ala His 180 185 190 His Gln Leu Arg Glu Ile Arg Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg Asp 195 200 205 Ala Pro Ser Thr Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg Ala 210 215 220 Gln Ala Gly Ala Thr Leu Leu Phe Leu Leu Cys Trp Gly Pro Tyr Val 225 230 235 240 Ala Thr Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Tyr Glu Arg Arg Pro Pro Leu 245 250 255 Gly Pro Val Thr Leu Leu Ser Leu Ile Ser Leu Gly Ser Ala Ser Ala 260 265 270 Ala Val Val Pro Val Ala Met Gly Leu Gly Asp Gln Arg Tyr Thr Ala 275 280 285 Pro Trp Arg Thr Ala Ala Gln Arg Trp Leu Gln Val Leu Arg Gly Arg 290 295 300 Pro Lys Arg Ala Asn Pro Gly Pro Ser Thr Ala Tyr His Ser Ser Ser 305 310 315 320 Gln Cys Ser Thr Asp Leu Asp Leu Asn 325 <210> 8 <211> 990 <212> DNA <213> Rat <400> 8 atgatgtcac acaacaccac tgagctgtca gccattccca gaggggttca ggagctttcc 60 ctggtcctgg caagcctcat cgtcatcgcc aacctgctcc tggccctagg cattgtcctg 120 gaccgccact tacgcagccc acctgctggc tgcttctttc taagcctact actagctggg 180 ctactcacag ggttggcact gcccacgctg cctgggctat ggaataggag ccatcagggg 240 tactggtcct gcctccttct ccacttggcc cccaactttt gtttcctctc cctgcttgcc 300 aatctgctgc tggtgcatgg ggaacgctac atggcagtgt tgcagccact ccggccccat 360 gggagtgtgc ggctagccct gttcctcacc tggatcagct ccctgctctt tgccagcctg 420 cctgctctgg gctggaacca ctggagtcct ggtgccaact gcagctccca ggctatcttc 480 ccagccccct acctttacct cgaagtctat gggctcctgc tgcccgctgt gggggccact 540 gcccttctct ctgtccgagt gttggccact gcccaccacc agctgcggga gatccgcaga 600 ctggagcggg cggtgtgccg tgatgcaccc tcaaccctag cgagggctct cacctggagg 660 caggctaggg cacaggcagg agccacactg ctctttttgc tgtgttgggg gccctatgtg 720 gccacattgc tcctgtcagt cttggcctat gagcggcggc caccactagg gcctgtaact 780 ctgttatctc tcatctcatt gggcagtgcc agtgctgcag ttgtgcctgt ggccatgggt 840 ctgggtgatc agcgctacac ggccccctgg aggacagctg cccaaaggtg gctacaagtg 900 cttcgaggaa gacccaagag ggccaatcca ggccccagca ctgcctacca ctccagtagc 960 caatgcagca ctgacttgga cttgaattag 990 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 used in Example 5 <400> 9 aaagtcgacc catgatgaca cccaacagca c 31 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 used in Exaple 5 <400> 10 aaaactagtc ctaattcaag tccaggtcaa t 31 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 used in Example 5 <400> 11 aaagtcgacc atgatgtcac aca 23 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 used in Example 5 <400> 12 aaaactagtc ctaattcaag tccaagtcag tgc 33 <210> 13 <211> 990 <212> DNA <213> Bovine <400> 13 atgacatcca acagcaccag ggaggtgccc agccccgttc ctgcaggggc cctggggctc 60 tccctggccc tggcaagcct catcgtcgct gccaacctgc tcctggccgt gggtatcgcc 120 ggggaccgcc gcctgcgcag cccgcccgct ggctgcttct tcctgagtct tctgctggca 180 gggctgctca cggggctggc gctgcccgcg ctgcccgtcc tatggagcca gagccgccgg 240 ggctactggt cctgcctctt cctctacttg gctcccaact tctgcttcct ctccctgctc 300 gccaacctcc tactggtgca cggggagcgc tacatggccg tgctgcggcc cctgcggccc 360 cgtgggagca tgcggctggc cctgctcctc acctgggctg cccccttgct ctttgccagc 420 ctgcctgccc tgggctggaa ccactgggcc cctggtggca actgcagctc ccaggccgtc 480 ttcccagccc cctacctcta cctcgaaatc tatgggctcc tgctgccggc tgtgggcgcg 540 gccgccctcc tctcggtccg cgtgctggtc actgcgcacc gccagctgca ggacatccgc 600 cggctggagc gggccgtgtg ccgcggggcg ccctcggccc tggcccgagc cctcacctgg 660 cggcaggcca gggcgcaggc tggggccacg ttgctctttg ggctgtgctg ggggccctac 720 gtggccaccc tgctgctctc tgtcctggcc tttgagcagc gcccgccact agggcccgga 780 actctgctgt ccctcatctc actgggcagc gccagtgcgg cggccgtgcc cgtggccatg 840 gggctgggtg atcagcgcta tacaggcccc tggagggtgg ccgcccagaa gtggctccgg 900 atgctgcggg gcagaccgca gagcagtcct ggtcccagca ccgcctacca taccagcagc 960 caaagcagcg tggaccttga cttgaactag 990 <210> 14 <211> 329 <212> PRT <213> Bovine <400> 14 Met Thr Ser Asn Ser Thr Arg Glu Val Pro Ser Pro Val Pro Ala Gly 5 10 15 Ala Leu Gly Leu Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Val Ala Ala Asn 20 25 30 Leu Leu Leu Ala Val Gly Ile Ala Gly Asp Arg Arg Leu Arg Ser Pro 35 40 45 Pro Ala Gly Cys Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr 50 55 60 Gly Leu Ala Leu Pro Ala Leu Pro Val Leu Trp Ser Gln Ser Arg Arg 65 70 75 80 Gly Tyr Trp Ser Cys Leu Phe Leu Tyr Leu Ala Pro Asn Phe Cys Phe 85 90 95 Leu Ser Leu Leu Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Met 100 105 110 Ala Val Leu Arg Pro Leu Arg Pro Arg Gly Ser Met Arg Leu Ala Leu 115 120 125 Leu Leu Thr Trp Ala Ala Pro Leu Leu Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu 130 135 140 Gly Trp Asn His Trp Ala Pro Gly Gly Asn Cys Ser Ser Gln Ala Val 145 150 155 160 Phe Pro Ala Pro Tyr Leu Tyr Leu Glu Ile Tyr Gly Leu Leu Leu Pro 165 170 175 Ala Val Gly Ala Ala Ala Leu Leu Ser Val Arg Val Leu Val Thr Ala 180 185 190 His Arg Gln Leu Gln Asp Ile Arg Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg 195 200 205 Gly Ala Pro Ser Ala Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg 210 215 220 Ala Gln Ala Gly Ala Thr Leu Leu Phe Gly Leu Cys Trp Gly Pro Tyr 225 230 235 240 Val Ala Thr Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Phe Glu Gln Arg Pro Pro 245 250 255 Leu Gly Pro Gly Thr Leu Leu Ser Leu Ile Ser Leu Gly Ser Ala Ser 260 265 270 Ala Ala Ala Val Pro Val Ala Met Gly Leu Gly Asp Gln Arg Tyr Thr 275 280 285 Gly Pro Trp Arg Val Ala Ala Gln Lys Trp Leu Arg Met Leu Arg Gly 290 295 300 Arg Pro Gln Ser Ser Pro Gly Pro Ser Thr Ala Tyr His Thr Ser Ser 305 310 315 320 Gln Ser Ser Val Asp Leu Asp Leu Asn 325 <210> 15 <211> 993 <212> DNA <213> Rabbit <400> 15 atgacaccca acagcaccgg ggaggtgcct ggccccatcc ccaggggcgc cctggagctg 60 tcactggccc tggcaagcct catcatcgca gccaacctgc tcctggcgct gggcatcgcc 120 tgcgaccgcc gccttcgcag cccaccggcc ggctgcttct tcctgagcct gttgctggcc 180 gggctgctta cggggctggc actgcccact ctgccagggc tctggagaca gagccaccgg 240 ggctattggt cctgcctgct cgtctacttg gctcccaact tctccttcct ctccctgctc 300 gccaacctcc tgctggtgca cggggagcgc tatgtggcgg tgctgcggcc actccagcct 360 ccggggagca tccggctggc cctgctcctc acctggaccg gccccctgct ctttgccagc 420 ctgccggccc tgggctggaa ccactggggc cctgaggcca actgcagctc ccagaccatc 480 ttcccagcgc cctacctcta cctcgaagtc tacgggctcc tgctgccggc cgtgggggcc 540 gcggcccttc tctcggctca cgtgctgctg gccgcccacc gccagctgca ggacatccgc 600 cggctggagc gggccgtgtg ccgcgacgcg ccctccgccc tggcccgggc ccttacctgg 660 aggcaggcgc gggcgcaggc tggagccacg ctgctctttg ggctgtgctg ggggccctat 720 gtggccacgc tgttcctgtc ggtcctggcc tatgagcagc gcccacctct agggcccgga 780 actctgctgt ctctcctctc cctgggcagt gccagcgcgg cggccgtgcc cgtggccatg 840 gggctgggtg atcaccgcta cacagcgccc tggagggcgg ccgcccggag gtggctgcgg 900 gggctgcggg ggagaggctc ccaggctagc cctggcccca gcactgccta ccacaccagc 960 agccaaagca gcgtggacgt ggacttgaac tga 993 <210> 16 <211> 330 <212> PRT <213> Rabbit <400> 16 Met Thr Pro Asn Ser Thr Gly Glu Val Pro Gly Pro Ile Pro Arg Gly 5 10 15 Ala Leu Glu Leu Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Ile Ala Ala Asn 20 25 30 Leu Leu Leu Ala Leu Gly Ile Ala Cys Asp Arg Arg Leu Arg Ser Pro 35 40 45 Pro Ala Gly Cys Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr 50 55 60 Gly Leu Ala Leu Pro Thr Leu Pro Gly Leu Trp Arg Gln Ser His Arg 65 70 75 80 Gly Tyr Trp Ser Cys Leu Leu Val Tyr Leu Ala Pro Asn Phe Ser Phe 85 90 95 Leu Ser Leu Leu Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Val 100 105 110 Ala Val Leu Arg Pro Leu Gln Pro Pro Gly Ser Ile Arg Leu Ala Leu 115 120 125 Leu Leu Thr Trp Thr Gly Pro Leu Leu Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu 130 135 140 Gly Trp Asn His Trp Gly Pro Glu Ala Asn Cys Ser Ser Gln Thr Ile 145 150 155 160 Phe Pro Ala Pro Tyr Leu Tyr Leu Glu Val Tyr Gly Leu Leu Leu Pro 165 170 175 Ala Val Gly Ala Ala Ala Leu Leu Ser Ala His Val Leu Leu Ala Ala 180 185 190 His Arg Gln Leu Gln Asp Ile Arg Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg 195 200 205 Asp Ala Pro Ser Ala Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg 210 215 220 Ala Gln Ala Gly Ala Thr Leu Leu Phe Gly Leu Cys Trp Gly Pro Tyr 225 230 235 240 Val Ala Thr Leu Phe Leu Ser Val Leu Ala Tyr Glu Gln Arg Pro Pro 245 250 255 Leu Gly Pro Gly Thr Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Ala Ser 260 265 270 Ala Ala Ala Val Pro Val Ala Met Gly Leu Gly Asp His Arg Tyr Thr 275 280 285 Ala Pro Trp Arg Ala Ala Ala Arg Arg Trp Leu Arg Gly Leu Arg Gly 290 295 300 Arg Gly Ser Gln Ala Ser Pro Gly Pro Ser Thr Ala Tyr His Thr Ser 305 310 315 320 Ser Gln Ser Ser Val Asp Val Asp Leu Asn 325 330 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bF Primer <400> 17 gtcgacatga catccaacag caccagggag gtg 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bR Primer <400> 18 gctagcctag ttcaagtcaa ggtccacgct gct 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rabbitF Primer <400> 19 gtcgacatga cacccaacag caccggggag gtg 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rabbitR Primer <400> 20 actagttcag ttcaagtcca cgtccacgct gct 33 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for IL-1 alfa mRNA quantification <400> 21 gaagatgaac ctgtgctgct a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for IL-1 alfa mRNA quantification <400> 22 tcactctcgc tgtctgtgat g 21 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_binding <223> Probe designed for IL-1 alfa mRNA quantification, labeled 5'-termi nal with FAM and 3'-terminal with TAMRA <400> 23 aggaaatgcc tgagacaccc agga 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for IL-1 beta mRNA quantification <400> 24 gcacgtatga gctgaaagct 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for IL-1 beta mRNA quantification <400> 25 actcatggag aacaccactt gt 22 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_binding <223> Probe designed for IL-1 beta mRNA quantification, labeled 5'-termi nal with FAM and 3'-terminal with TAMRA <400> 26 tccacctcaa tgcagagaat ctga 24 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for IL-6 mRNA quantification <400> 27 agcatcctgg agaccatcaa g 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for IL-6 mRNA quantification <400> 28 cctttctgtt catgcagttg ac 22 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_binding <223> Probe designed for IL-6 mRNA quantification, labeled 5'-terminal w ith FAM and 3'-terminal with TAMRA <400> 29 agctgaggaa agagatgtgt gaccatga 28 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for IL-8 mRNA quantification <400> 30 ctctttgtga agctgcagtt ct 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for IL-8 mRNA quantification <400> 31 ggtgtggagt gtgtctttat gc 22 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_binding <223> Probe designed for IL-8 mRNA quantification, labeled 5'-terminal w ith FAM and 3'-terminal with TAMRA <400> 32 cacggattgg tacagagctt cgatgc 26 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for TNF alfa mRNA quantification <400> 33 tcaccctcag atcagcttct c 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for TNF alfa mRNA quantification <400> 34 tggttgtccg tgagcttca 19 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_binding <223> Probe designed for TNF alfa mRNA quantification, labeled 5'-termin al with FAM and 3'-terminal with TAMRA <400> 35 cgtagtagca aacccgcaag tgga 24 <210> 36 <211> 125 <212> PRT <213> Human <400> 36 Met Ala Arg Ser Ala Thr Leu Ala Ala Ala Ala Leu Ala Leu Cys Leu 5 10 15 Leu Leu Ala Pro Pro Gly Leu Ala Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly His 20 25 30 Ser Ser Tyr Ser Val Gly Arg Ala Ala Gly Leu Leu Ser Gly Leu Arg 35 40 45 Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Arg Ser Gln Pro Tyr Arg Gly Ala Glu Pro 50 55 60 Pro Gly Gly Ala Gly Ala Ser Pro Glu Leu Gln Leu His Pro Arg Leu 65 70 75 80 Arg Ser Leu Ala Val Cys Val Gln Asp Val Ala Pro Asn Leu Gln Arg 85 90 95 Cys Glu Arg Leu Pro Asp Gly Arg Gly Thr Tyr Gln Cys Lys Ala Asn 100 105 110 Val Phe Leu Ser Leu Arg Ala Ala Asp Cys Leu Ala Ala 115 120 125 <210> 37 <211> 375 <212> DNA <213> Human <400> 37 atggcccggt ccgcgacact ggcggccgcc gccctggcgc tgtgcctgct gctggcgccg 60 cctggcctcg cgtggtacaa gccagcggcg gggcacagct cctactcggt gggccgcgcc 120 gcggggctgc tgtccggcct ccgcaggtcc ccgtacgcgc ggcgctccca gccctacaga 180 ggggcggaac ccccgggcgg ggccggcgcc tccccggagc tgcaactgca ccccaggctg 240 cggagcctcg ctgtgtgcgt ccaggacgtc gccccaaacc tgcagaggtg cgagcggctc 300 cccgacggcc gcgggaccta ccagtgcaag gcgaacgtct tcctgtccct gcgcgcagcc 360 gactgcctcg ccgcc 375 <210> 38 <211> 328 <212> PRT <213> Human <400> 38 Met Asp Asn Ala Ser Phe Ser Glu Pro Trp Pro Ala Asn Ala Ser Gly 1 5 10 15 Pro Asp Pro Ala Leu Ser Cys Ser Asn Ala Ser Thr Leu Ala Pro Leu 20 25 30 Pro Ala Pro Leu Ala Val Ala Val Pro Val Val Tyr Ala Val Ile Cys 35 40 45 Ala Val Gly Leu Ala Gly Asn Ser Ala Val Leu Tyr Val Leu Leu Arg 50 55 60 Ala Pro Arg Met Lys Thr Val Thr Asn Leu Phe Ile Leu Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ile Ala Asp Glu Leu Phe Thr Leu Val Leu Pro Ile Asn Ile Ala Asp 85 90 95 Phe Leu Leu Arg Gln Trp Pro Phe Gly Glu Leu Met Cys Lys Leu Ile 100 105 110 Val Ala Ile Asp Gln Tyr Asn Thr Phe Ser Ser Leu Tyr Phe Leu Thr 115 120 125 Val Met Ser Ala Asp Arg Tyr Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Glu Ser 130 135 140 Arg Arg Val Ala Gly Arg Thr Tyr Ser Ala Ala Arg Ala Val Ser Leu 145 150 155 160 Ala Val Trp Gly Ile Val Thr Leu Val Val Leu Pro Phe Ala Val Phe 165 170 175 Ala Arg Leu Asp Asp Glu Gln Gly Arg Arg Gln Cys Val Leu Val Phe 180 185 190 Pro Gln Pro Glu Ala Phe Trp Trp Arg Ala Ser Arg Leu Tyr Thr Leu 195 200 205 Val Leu Gly Phe Ala Ile Pro Val Ser Thr Ile Cys Val Leu Tyr Thr 210 215 220 Thr Leu Leu Cys Arg Leu His Ala Met Arg Leu Asp Ser His Ala Lys 225 230 235 240 Ala Leu Glu Arg Ala Lys Lys Arg Val Thr Phe Leu Val Val Ala Ile 245 250 255 Leu Ala Val Cys Leu Leu Cys Trp Thr Pro Tyr His Leu Ser Thr Val 260 265 270 Val Ala Leu Thr Thr Asp Leu Pro Gln Thr Pro Leu Val Ile Ala Ile 275 280 285 Ser Tyr Phe Ile Thr Ser Leu Ser Tyr Ala Asn Ser Cys Leu Asn Pro 290 295 300 Phe Leu Tyr Ala Phe Leu Asp Ala Ser Phe Arg Arg Asn Leu Arg Gln 305 310 315 320 Leu Ile Thr Cys Arg Ala Ala Ala 325 <210> 39 <211> 1000 <212> DNA <213> Human <400> 39 atcgatatgg acaacgcctc gttctcggag ccctggcccg ccaacgcatc gggcccggac 60 ccggcgctga gctgctccaa cgcgtcgact ctggcgccgc tgccggcgcc gctggcggtg 120 gctgtaccag ttgtctacgc ggtgatctgc gccgtgggtc tggcgggcaa ctccgccgtg 180 ctgtacgtgt tgctgcgggc gccccgcatg aagaccgtca ccaacctgtt catcctcaac 240 ctggccatcg ccgacgagct cttcacgctg gtgctgccca tcaacatcgc cgacttcctg 300 ctgcggcagt ggcccttcgg ggagctcatg tgcaagctca tcgtggctat cgaccagtac 360 aacaccttct ccagcctcta cttcctcacc gtcatgagcg ccgaccgcta cctggtggtg 420 ttggccactg cggagtcgcg ccgggtggcc ggccgcacct acagcgccgc gcgcgcggtg 480 agcctggccg tgtgggggat cgtcacactc gtcgtgctgc ccttcgcagt cttcgcccgg 540 ctagacgacg agcagggccg gcgccagtgc gtgctagtct ttccgcagcc cgaggccttc 600 tggtggcgcg cgagccgcct ctacacgctc gtgctgggct tcgccatccc cgtgtccacc 660 atctgtgtcc tctataccac cctgctgtgc cggctgcatg ccatgcggct ggacagccac 720 gccaaggccc tggagcgcgc caagaagcgg gtgaccttcc tggtggtggc aatcctggcg 780 gtgtgcctcc tctgctggac gccctaccac ctgagcaccg tggtggcgct caccaccgac 840 ctcccgcaga cgccgctggt catcgctatc tcctacttca tcaccagcct gagctacgcc 900 aacagctgcc tcaacccctt cctctacgcc ttcctggacg ccagcttccg caggaacctc 960 cgccagctga taacttgccg cgcggcagcc tgacactagt 1000 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 gtcgacatgg cccggtccgc gacactggcg gcc 33 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 gctagcagcg gtgccaggag aggtccgggc tca 33 <210> 42 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 atcgatatgg acaacgcctc gttctcggag cc 32 <210> 43 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 actagtgtca ggctgccgcg cggcaagtta tc 32

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列
（一文字表記）を示す。

【図２】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列
（一文字表記）を示す（図１に続く）。

【図３】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列
（一文字表記）を示す（図２に続く）。

【図４】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列
（一文字表記）を示す（図３に続く）。

【図５】ＴＧＲ５の疎水性プロット図である。

【図６】ＴＧＲ５発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３
細胞（Ａ）およびもとのベクターのみを導入したＨＥＫ
２９３細胞（Ｂ）における、コレステロール代謝関連物
質による活性の検出（ｎ＝２）の結果を示す。

【図７】ＨＥＫ２９３細胞におけるリガンド刺激に対す
るレポーター遺伝子の発現誘導の結果を示す。

【図８】Ｇｉを用いたＴＧＲ５のリトコール酸に対する
反応の結果を示す。

【図９】ヒト（Ｂ）、ウサギ（Ｃ）、ウシ（Ｄ）、マウ
ス（Ｅ）およびラット（Ｆ）型ＴＧＲ５の胆汁酸刺激に
よるレポーター遺伝子の発現量上昇。胆汁酸はすべて１
０μＭとなるように培地に添加した。Ａはコントロール
（プラスミドのみ）を示す。

【図１０】ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性に対す
るＴＬＣＡ（１００μＭ）の抑制効果。ｎ＝３の平均
値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。

【図１１】ウサギ肺胞マクロファージにおける、リポ多
糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの
分泌に対するＴＬＣＡ（５０μＭ）の抑制効果。ｎ＝３
の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。

【図１２】ウサギ肺胞マクロファージに対するＴＬＣＡ
による各種のサイトカインのｍＲＮＡ発現抑制作用を示
す。Ａ：ＴＮＦα；Ｂ：ＩＬ−１α；Ｃ：ＩＬ−１β；
Ｄ：ＩＬ−６；Ｅ：ＩＬ−８のサイトカインの場合を表
す。

【図１３】ＴＨＰ−ＴＧＲ５における、リポ多糖（ＬＰ
Ｓ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌およ
びｍＲＮＡ発現量に対するＴＬＣＡ（１００μＭ）の抑
制効果。分泌量：ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１
で有意。ｍＲＮＡ発現量：ｎ＝２の平均値。

【図１４】ＣＨＯ細胞に発現させたＴＧＲ５−ＧＦＰ融
合タンパク質の局在を示す。図中の白線は４μｍを示
す。

【図１５】ＴＧＲ５−ＧＦＰを発現させたＣＨＯ細胞に
ＴＬＣＡを添加して３０分後の融合タンパク質の局在を
示す。図中の白線は４μｍを示す。

【図１６】ＴＬＣＡによるＣＨＯ−ＴＧＲ５でのＭＡＰ
キナーゼ活性化の検出を表す。

【図１７】ＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるＴＬＣＡ、ＬＣ
Ａ、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡのｃＡＭＰ産生上昇活性を
表す。ｎ＝３の平均値。グラフ中の構造式は胆汁酸を示
す。

【図１８】各種胆汁酸関連化合物（２μＭ）によるＣＨ
Ｏ−ＴＧＲ５におけるｃＡＭＰ産生上昇活性の比較を示
す。ｎ＝３の平均値。ＴＴＮＰＢは（Ｅ）−［（テトラ
ヒドロテトラメチルナフタレニル）プロピル］ベンゾイ
ックアシッドの略称を表す。

【図１９】ヒト各組織でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布
を示す。

【図２０】ヒト血球でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布を
示す。

【図２１】ウサギＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現分布を示
す。

【図２２】ＴＬＣＡによるウサギ肺胞マクロファージの
ｃＡＭＰ産生上昇を示す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜
０．０１で有意。

【図２３】ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性におよ
ぼす各種胆汁酸の抑制効果を表す。ｎ＝３の平均値。＊
＊，ｐ＜０．０１で有意。

【図２４】ウサギ肺胞マクロファージからのＴＮＦα分
泌に対する胆汁酸の抑制効果を表す。ｎ＝３の平均値。
＊＊，ｐ＜０．０１で有意。

【図２５】胆汁酸添加によるＴＨＰ−ＴＧＲ５細胞での
ｃＡＭＰ産生上昇を示す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜
０．０１で有意。

【図２６】ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−ＴＧＲ５からの
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する各種胆汁酸の抑
制効果を表す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で
有意。

【図２７】ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１からの腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する各種胆汁酸の影響を表
す。ｎ＝３の平均値。

【図２８】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配
列を示す。

【図２９】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸
配列を示す。

【図３０】リガンド発現ベクターpAK-S64および空の発
現ベクター(pAKKO-111H)を発現させたＣＨＯ細胞の培養
上清を、ＧＰＲ７ ｃＤＮＡを挿入した発現プラスミド
を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培地にホルスコリン
（ＦＳＫ）とともに添加し、リガンド刺激によるルシフ
ェラーゼ活性の抑制を検出した結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/06 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 3/06 29/00 ４Ｃ０８６ 29/00 31/00 ４Ｈ０４５ 31/00 37/02 37/02 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 特願2001−397767(P2001−397767) (32)優先日 平成13年12月27日(2001．12．27) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願2002−45728(P2002−45728) (32)優先日 平成14年２月22日(2002．2．22) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 川俣 裕二 茨城県つくば市松代４丁目22番地 松代４ 丁目団地２号棟203号 (72)発明者 三輪 真敬 茨城県つくば市松代３丁目12番地１ 武田 松代レジデンス513号 (72)発明者 細谷 昌樹 茨城県土浦市板谷１丁目711番地の83 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA44 BA63 CA04 CA07 CA11 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 FA06 GA01 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ05 QQ13 QR33 QR48 QR60 QR74 QR80 QS05 QS15 QS36 QX02 4B064 AG20 AG27 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA90X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA16 CA18 CA32 NA14 ZB07 ZB08 ZB11 ZB31 ZC33 4C085 AA13 AA14 CC21 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 NA14 ZB07 ZB08 ZB11 ZB31 ZC33 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (73)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）配列番号：１で表されるアミノ酸
   配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
   するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該
   レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩およ
   び（２）コレステロール代謝関連物質を用いることを特
   徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレス
   テロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物ま
   たはその塩のスクリーニング方法。
2. 【請求項２】 配列番号：５で表されるアミノ酸配列を
   含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質また
   は該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩
   を用いる請求項１記載のスクリーニング方法。
3. 【請求項３】 配列番号：７で表されるアミノ酸配列を
   含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質また
   は該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩
   を用いる請求項１記載のスクリーニング方法。
4. 【請求項４】 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列
   を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ま
   たは該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその
   塩を用いる請求項１記載のスクリーニング方法。
5. 【請求項５】 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列
   を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ま
   たは該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその
   塩を用いる請求項１記載のスクリーニング方法。
6. 【請求項６】 （１）配列番号：１で表されるアミノ酸
   配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
   するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該
   レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩およ
   び（２）コレステロール代謝関連物質を含有することを
   特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレ
   ステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物
   またはその塩のスクリーニング用キット。
7. 【請求項７】 請求項１記載のスクリーニング方法また
   は請求項６記載のスクリーニング用キットを用いて得ら
   れうるコレステロール代謝関連物質と配列番号：１で表
   わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
   ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
   ンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま
   たはその塩。
8. 【請求項８】 請求項７記載の化合物またはその塩を含
   有してなる医薬。
9. 【請求項９】 請求項１記載のスクリーニング方法また
   は請求項６記載のスクリーニング用キットを用いて得ら
   れうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一
   もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタン
   パク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対す
   るアゴニストを含有してなる炎症性疾患または移植医療
   後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項６記載のスクリーニング用キットを用いて得
    られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同
    一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタ
    ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対
    するアンタゴニストを含有してなる免疫不全または感染
    症の予防および／または治療剤。
11. 【請求項１１】 哺乳動物に対して、請求項１記載のス
    クリーニング方法または請求項６記載のスクリーニング
    用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされ
    るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
    配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク
    質またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与する
    ことを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免
    疫反応の予防および／または治療方法。
12. 【請求項１２】 哺乳動物に対して、請求項１記載のス
    クリーニング方法または請求項６記載のスクリーニング
    用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされ
    るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
    配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク
    質またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与
    することを特徴とする免疫不全または感染症の予防およ
    び／または治療方法。
13. 【請求項１３】 炎症性疾患または移植医療後の過剰免
    疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、
    請求項１記載のスクリーニング方法または請求項６記載
    のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番
    号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
    に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質またはその塩に対するアゴニストの
    使用。
14. 【請求項１４】 免疫不全または感染症の予防および／
    または治療剤を製造するための、請求項１記載のスクリ
    ーニング方法または請求項６記載のスクリーニング用キ
    ットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるア
    ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
    を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ま
    たはその塩に対するアンタゴニストの使用。
15. 【請求項１５】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
    塩の発現量を増加する化合物またはその塩を含有してな
    る炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防お
    よび／または治療剤。
16. 【請求項１６】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
    塩の発現量を減少させる化合物またはその塩を含有して
    なる免疫不全または感染症の予防および／または治療
    剤。
17. 【請求項１７】 哺乳動物に対して、配列番号：１で表
    わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
    ンパク質またはその塩の発現量を増加する化合物または
    その塩の有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患
    または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または
    治療方法。
18. 【請求項１８】 哺乳動物に対して、配列番号：１で表
    わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
    ンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物また
    はその塩の有効量を投与することを特徴とする免疫不全
    または感染症の予防および／または治療方法。
19. 【請求項１９】 炎症性疾患または移植医療後の過剰免
    疫反応の予防および／または治療剤を製造するための配
    列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実
    質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役
    型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加す
    る化合物またはその塩の使用。
20. 【請求項２０】 免疫不全または感染症の予防および／
    または治療剤を製造するための配列番号：１で表わされ
    るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
    配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク
    質またはその塩の発現量を減少させる化合物またはその
    塩の使用。
21. 【請求項２１】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分
    ペプチドまたはその塩を含有してなる炎症性疾患または
    移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療
    剤。
22. 【請求項２２】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
    部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する
    ポリヌクレオチドを含有してなる炎症性疾患または移植
    医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤。
23. 【請求項２３】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
    部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する
    ポリヌクレオチドを含有してなる中枢疾患、炎症性疾
    患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾
    患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満また
    は移植医療後の過剰免疫反応の診断薬。
24. 【請求項２４】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分
    ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる免疫
    不全または感染症の予防および／または治療剤。
25. 【請求項２５】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分
    ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる中枢
    疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿
    病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染
    症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬。
26. 【請求項２６】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
    部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する
    ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を
    含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有して
    なる免疫不全または感染症の予防および／または治療
    剤。
27. 【請求項２７】 配列番号：１で表わされるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
    部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する
    ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を
    含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有して
    なる中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾
    患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾
    患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診
    断薬。
28. 【請求項２８】 哺乳動物に対して、配列番号：１で表
    わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
    ンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の有効量を投
    与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の
    過剰免疫反応の予防および／または治療方法。
29. 【請求項２９】 哺乳動物に対して、配列番号：１で表
    わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
    ンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌク
    レオチドを含有するポリヌクレオチドの有効量を投与す
    ることを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰
    免疫反応の予防および／または治療方法。
30. 【請求項３０】 哺乳動物に対して、配列番号：１で表
    わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
    ンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
    の有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感
    染症の予防および／または治療方法。
31. 【請求項３１】 哺乳動物に対して、配列番号：１で表
    わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータ
    ンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌク
    レオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配
    列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌク
    レオチドの有効量を投与することを特徴とする免疫不全
    または感染症の予防および／または治療方法。
32. 【請求項３２】 炎症性疾患または移植医療後の過剰免
    疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、
    配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは
    実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共
    役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはそ
    の塩の使用。
33. 【請求項３３】 炎症性疾患または移植医療後の過剰免
    疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、
    配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは
    実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共
    役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
    の使用。
34. 【請求項３４】 免疫不全または感染症の予防および／
    または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わさ
    れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
    酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパ
    ク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使
    用。
35. 【請求項３５】 免疫不全または感染症の予防および／
    または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わさ
    れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
    酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパ
    ク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオ
    チドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列ま
    たはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオ
    チドの使用。
36. 【請求項３６】 配列番号：５、配列番号：７、配列番
    号１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列（但し、配
    列番号：１で表されるアミノ酸配列を除く）を含有する
    ことを特徴とするＧタンパク質共役型レセプタータンパ
    ク質またはその塩。
37. 【請求項３７】 請求項３６記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
38. 【請求項３８】 請求項３６記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質または請求項３７記載の部分ペプ
    チドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク
    レオチド。
39. 【請求項３９】 ＤＮＡである請求項３８記載のポリヌ
    クレオチド。
40. 【請求項４０】 配列番号：６、配列番号：８、配列番
    号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を有
    する請求項３８記載のポリヌクレオチド。
41. 【請求項４１】 請求項３８記載のポリヌクレオチドを
    含有する組換えベクター。
42. 【請求項４２】 請求項４１記載の組換えベクターで形
    質転換させた形質転換体。
43. 【請求項４３】 請求項４２記載の形質転換体を培養
    し、請求項３６記載のＧタンパク質共役型レセプタータ
    ンパク質を生成せしめることを特徴とする請求項３６記
    載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
    の塩の製造法。
44. 【請求項４４】 請求項３６記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質もしくは請求項３７記載の部分ペ
    プチドまたはその塩に対する抗体。
45. 【請求項４５】 請求項３６記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化する中
    和抗体である請求項４４記載の抗体。
46. 【請求項４６】 請求項４４記載の抗体を含有してなる
    診断薬。
47. 【請求項４７】 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、
    癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾
    患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰
    免疫反応の診断薬である請求項４６記載の診断薬。
48. 【請求項４８】 請求項４４記載の抗体を含有してなる
    医薬。
49. 【請求項４９】 免疫不全または感染症の予防および／
    または治療剤である請求項４８記載の医薬。
50. 【請求項５０】 請求項３６記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩
    を含有してなる医薬。
51. 【請求項５１】 炎症性疾患または移植医療後の過剰免
    疫反応の予防および／または治療剤である請求項５０記
    載の医薬。
52. 【請求項５２】 請求項３８記載のポリヌクレオチドを
    含有してなる医薬。
53. 【請求項５３】 炎症性疾患または移植医療後の過剰免
    疫反応の予防および／または治療剤である請求項５２記
    載の医薬。
54. 【請求項５４】請求項３８記載のポリヌクレオチドを含
    有してなる診断剤。
55. 【請求項５５】 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、
    癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾
    患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰
    免疫反応の診断薬である請求項５４記載の診断薬。
56. 【請求項５６】 請求項３８記載のポリヌクレオチドと
    相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチ
    センスポリヌクレオチド。
57. 【請求項５７】 請求項５６記載のアンチセンスポリヌ
    クレオチドを含有してなる医薬。
58. 【請求項５８】 免疫不全または感染症の予防および／
    または治療剤である請求項５７記載の医薬。
59. 【請求項５９】 請求項５６記載のアンチセンスポリヌ
    クレオチドを含有してなる診断剤。
60. 【請求項６０】 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、
    癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾
    患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰
    免疫反応の診断薬である請求項５９記載の診断薬。
61. 【請求項６１】 リガンドが決定されていないレセプタ
    ータンパク質を発現し、かつ、ｃＡＭＰレスポンスエレ
    メント／プロモーターの下流にレポータータンパク質を
    コードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する動物
    細胞に、試験化合物を添加し、レポータータンパク質の
    活性を測定することを特徴とする該レセプタータンパク
    質に対するリガンドの決定方法。
62. 【請求項６２】 （１）リガンドが決定されていないレ
    セプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラ
    スミドおよび（２）ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プ
    ロモーターの下流にレポータータンパク質をコードする
    ＤＮＡを連結したプラスミドを含有する動物細胞を培養
    し、試験化合物を添加してレポータータンパク質の活性
    を測定することを特徴とする請求項６１記載の方法。
63. 【請求項６３】 レセプタータンパク質がＧタンパク質
    共役型レセプタータンパク質である請求項６１または請
    求項６２記載の方法。
64. 【請求項６４】 Ｇタンパク質共役型レセプタータンパ
    ク質が、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４
    または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一
    もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタン
    パク質共役型レセプタータンパク質である請求項６３記
    載の方法。
65. 【請求項６５】 プロモーターがＴＡＴＡ様配列である
    請求項６１または請求項６２記載の方法。
66. 【請求項６６】 レポータータンパク質がルシフェラー
    ゼである請求項６１または請求項６２記載の方法。
67. 【請求項６７】 プラスミドがｃＡＭＰレスポンスエレ
    メントの下流にＴＡＴＡ様プロモーターおよびレポータ
    ータンパク質をコードする遺伝子を連結したものである
    請求項６１または請求項６２記載の方法。
68. 【請求項６８】 動物細胞が、リガンドが決定されてい
    ない２種類以上のレセプタータンパク質を発現している
    請求項６１または請求項６２記載の方法。
69. 【請求項６９】 細胞が抑制性Ｇタンパク質αサブユニ
    ットＧｉをコードする遺伝子を含有するプラスミドを含
    む請求項６１または請求項６２記載の方法。
70. 【請求項７０】 さらにフォルスコリンを添加する請求
    項６１または請求項６２記載の方法。
71. 【請求項７１】 ２種類以上のレセプタータンパク質が
    類似の特徴を有することを特徴とする請求項６８記載の
    方法。
72. 【請求項７２】 類似の特徴がレポータータンパク質の
    基礎発現量および（または）フォルスコリン添加時のレ
    ポータータンパク質の発現量である請求項７１記載の方
    法。
73. 【請求項７３】 予め２種類以上のレセプタータンパク
    質をそれぞれ単独で発現させた時のレポータータンパク
    質の基礎発現量および（または）フォルスコリン添加時
    のレポータータンパク質の発現量を測定し、該レポータ
    ータンパク質の発現量が同程度である２種類以上のレセ
    プタータンパク質を組み合わせて発現させることを特徴
    とする請求項６８記載の方法。