CN110913865A - 免疫突触的变体文库及其合成 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于生成编码核酸序列预定变体的高度准确的核酸文库的方法。该核酸序列可编码CAR的参考结构域的全部或部分。变异程度可以是完全的，从而产生饱和的变体文库，或者变异程度可以是不完全的，从而产生非饱和的变体文库。本文所述的变异核酸文库可被设计用于通过转录或翻译进一步加工。本文所述的变异核酸文库可被设计用来生成变异RNA、DNA和/或蛋白质群体。本文进一步提供了用于鉴定具有增加或降低活性的变异种类的方法，其应用于调节用于治疗或减轻疾病如癌症的治疗剂的生物学功能及设计。

Description

免疫突触的变体文库及其合成

交叉引用

本申请要求2017年3月15日提交的第62/471,810号美国临时专利申请的权益，该美国临时专利申请通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，并且其通过引用整体并入本文。创建于2018年3月9日的所述ASCII副本被命名为44854-733_601_SL.txt，大小为19,476个字节。

背景技术

合成生物学的基石是设计、构建和测试过程——一个需要DNA，以使得便于快速且可行地生成并优化这些定制途径和生物体的迭代过程。在设计阶段，将构成DNA的A、C、T和G核苷酸规划成包含感兴趣的基因座或途径的多种基因序列，其中每种序列变体代表将进行测试的特定假设。这些变异基因序列代表序列空间(起源于进化生物学的一个概念)的子集，并且从属于构成基因、基因组、转录物组和蛋白质组的全部序列。

通常针对每个设计-构建-测试循环设计许多不同的变体，以实现对序列空间的充分采样并使优化设计的可能性最大化。尽管在概念上很简单，但与常规合成方法的速度、通量和质量相关的工艺瓶颈阻碍了这一循环进展的步伐，从而延长了开发时间。由于极其准确的DNA的高成本和当前合成技术的有限通量导致无法充分探索序列空间仍然是限速步骤。

从构建阶段开始，有两个过程值得注意：寡核苷酸合成和基因合成。以往，通过分子克隆实现不同基因变体的合成。这种方法虽然稳定，但无法放大。早期的化学基因合成工作集中于产生大量具有重叠序列同源性的寡核苷酸。随后将这些寡核苷酸合并，并经历多轮聚合酶链反应(PCR)，从而使重叠的寡核苷酸连接成全长双链基因。许多因素阻碍了这一方法，包括构建耗时耗力、需要大量的亚磷酰胺、原材料昂贵以及产生纳摩尔量的最终产物(显著低于下游步骤所需的量)，并且大量单独的寡核苷酸需要一个96孔板来建立一个基因的合成。

在微阵列上合成寡核苷酸使得基因合成的通量显著增加。可以在微阵列表面上合成大量的寡核苷酸，然后切下并合并在一起。针对特定基因的每种寡核苷酸含有独特的条形码序列，该条形码序列能够使特定的寡核苷酸亚群区分开(depooled)并装配成感兴趣的基因。在该过程的这个阶段，将每个子池转移至96孔板中的一个孔中，从而使通量增加到96个基因。虽然其通量比经典方法高两个数量级，但由于缺乏成本效益且周转时间缓慢，它仍然不能充分支持一次需要数千个序列的设计、构建、测试循环。因此，对变异序列文库的更有效生成存在需求。

免疫***具有寻找并摧毁有害细胞的能力。T细胞在这样的过程中起重要作用。因此，包含遗传修饰的T细胞以促使免疫***识别并消除恶性细胞的疗法是可用于治疗疾病如癌症的备选疗法。特别是，可以设计表达嵌合抗原受体(CAR)的遗传修饰的T细胞，以靶向诸如癌细胞等有害细胞。然而，由于CAR疗法能够引起不良作用，如在靶脱肿瘤(on-targetoff-tumor)毒性、自身免疫性、宿主-移植物毒性，且有时引起死亡，因此还需要进一步优化。因此，对用于利用CAR疗法的癌症治疗的改进组合物和方法存在需求。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如具体地和个别地指出每一单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

发明内容

本文提供了核酸文库，其中该核酸文库包含至少10,000个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域。本文还提供了核酸文库，其中所述嵌合抗原受体的功能域包括抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。本文还提供了核酸文库，其中该文库包含至少1,000,000个核酸。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸的长度为100个碱基至2000个碱基。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸均附接至载体序列。本文还提供了核酸文库，其中所述载体序列是病毒载体序列。

本文提供了核酸文库，其中该核酸文库包含多个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域，其中所述多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异，并且其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中所述嵌合抗原受体的功能域包括抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。本文还提供了核酸文库，其中所述多个核酸包含所述参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸的长度为100个碱基至2000个碱基。

本文提供了寡核苷酸文库，该寡核苷酸文库包含至少10,000个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的区域，其中该区域包含抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的一部分。本文还提供了寡核苷酸文库，其中该文库包含至少1,000,000个寡核苷酸。本文还提供了寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸的长度为12至500个碱基。本文还提供了寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸都附接至载体序列。

本文提供了寡核苷酸文库，其中该寡核苷酸文库包含多个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的区域，其中该区域包含抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的一部分，其中每个寡核苷酸的长度为至少12个碱基，其中所述多个寡核苷酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异，并且其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。本文还提供了寡核苷酸文库，其中所述多个寡核苷酸包含2、3、4或5个位置的所有变异。本文还提供了寡核苷酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。本文还提供了寡核苷酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。本文还提供了寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸的长度为12至500个碱基。

本文提供了包含至少400个核酸的核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸编码参考序列的变体，该参考序列编码抗原识别域，并且其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸编码参考序列的变体，该参考序列编码嵌合抗原受体(CAR)的铰链域、跨膜域或胞内域。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸的长度为至少100个碱基。本文还提供了核酸文库，其中每个核酸的长度为100至2000个碱基。本文还提供了核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸包含所述参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸包含参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。本文还提供了核酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。

本文提供了合成核酸文库的方法，其包括：(a)提供编码嵌合抗原受体基因或基因片段的至少400个序列的第一组预选寡核苷酸序列，其中每个序列包含抗原识别域中氨基酸残基的至少两个预选密码子的至少一个变异；(b)合成所述第一组预选寡核苷酸序列；以及(c)筛选由所述第一组寡核苷酸序列编码的蛋白质的第一活性，其中所述第一活性是特异性、亲合力、亲和力、稳定性或表达。本文还提供了合成核酸文库的方法，其中所述抗原是癌抗原。本文还提供了合成核酸文库的方法，其中所述癌抗原是MAGE A3、MAGE A12、MAGEA2、MAGE A6、NY-ESO-1或CEA。本文还提供了合成核酸文库的方法，其中每个序列在所述抗原识别域中氨基酸残基的预选密码子处包含至多100个变异。本文还提供了合成核酸文库的方法，其中每个序列在所述抗原识别域中氨基酸残基的预选密码子处包含至多30个变异。本文还提供了合成核酸文库的方法，其进一步包括(a)提供编码嵌合抗原受体基因或基因片段的至少一个序列的第二组预选寡核苷酸序列，其中每个序列在所述嵌合抗原受体中铰链域、跨膜域或胞内域中的氨基酸残基的预选密码子处包含至少一个变异；(b)合成所述第二组预选寡核苷酸序列；以及(c)筛选由所述第二组寡核苷酸序列编码的蛋白质的第二活性，其中所述第二活性是特异性、亲合力、亲和力、稳定性或表达，并且其中所述第二活性与所述第一活性不同。

本文提供了一种寡核苷酸文库，该文库包含至少10,000个变异寡核苷酸，其中每个变异寡核苷酸的长度为至少12个碱基，其中每个变异寡核苷酸编码参考序列的变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域，并且在没有校正错误的情况下其中至少80％的所述变异寡核苷酸与预定序列相比没有错误。本文还提供了一种寡核苷酸文库，其中该文库包含至少1,000,000个变异寡核苷酸。本文还提供了一种寡核苷酸文库，其中每个变异寡核苷酸的长度为20至500个碱基。本文还提供了一种寡核苷酸文库，其中在没有校正错误的情况下，至少90％的所述变异寡核苷酸与预定序列相比没有错误。

本文提供了一种核酸文库，该文库包含至少10,000个变异核酸，其中每个变异核酸编码嵌合抗原受体的参考序列的变体，其中该变异发生在嵌合抗原受体的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的序列中，并且其中在没有校正错误的情况下与预定序列相比，至少70％的所述变异核酸没有错误。本文还提供了一种核酸文库，其中该文库包含约10,000,000个变异核酸。本文还提供了一种核酸文库，其中每个变异核酸的长度为600至3000个碱基。本文还提供了一种核酸文库，其中每个变异核酸均附接至载体序列。本文还提供了一种核酸文库，其中所述载体序列是病毒载体序列。

本文提供了一种核酸合成方法，该方法包括：提供编码多个不同寡核苷酸的预定序列，其中每个所述不同寡核苷酸的长度为至少20个碱基，并且其中所述多个不同寡核苷酸编码至少2个密码子中的每一个与至少一个参考序列相比的至多19个变体，其中所述至少一个参考序列编码嵌合抗原受体的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的区域；提供具有表面的结构，其中该表面包含用于寡核苷酸延伸的座位簇，每个簇包含50至500个座位；合成所述多个不同寡核苷酸，其中每个所述不同寡核苷酸从单独的座位延伸；以及进行扩增反应以装配变异核酸文库，其中所述扩增反应包括将来自单个簇的所述多个不同寡核苷酸与DNA聚合酶和至少一个参考序列混合。本文还提供了一种方法，其中每个簇进一步包含另外的寡核苷酸，并且其中所述簇内的所述多个不同寡核苷酸和所述另外的寡核苷酸共同编码单个基因及其变体。本文还提供了一种方法，其中所述结构的表面包含至少6000个簇。本文还提供了一种方法，其中在没有校正错误的情况下与预定序列相比，至少80％的所述变异核酸没有错误。本文还提供了一种方法，其中与没有校正错误的预定序列相比，至少90％的所述变异核酸没有错误。本文还提供了一种方法，其中每个不同寡核苷酸的重复在至多5个座位处从所述表面延伸。本文还提供了一种方法，其中每个不同寡核苷酸的重复在至多3个座位处从表面延伸。本文还提供了一种方法，其中所述多个不同寡核苷酸编码至少3个密码子中的每一个与至少一个参考序列相比的至多19个变体。本文还提供了一种方法，其进一步包括表达变异核酸文库，其中所述变异核酸文库的表达提供了与参考序列的表达产物相比具有改善的亲和力、改善的基因表达、改善的亲合力、改善的稳定性或改善的靶标特异性的变异蛋白质。

本文提供了一种核酸合成方法，该方法包括：提供编码多个不同寡核苷酸的预定序列，其中每个所述不同寡核苷酸的长度为至少20个碱基，并且其中所述多个不同寡核苷酸编码至少2个密码子中的每一个与至少一个参考序列相比的至多19个变体，其中所述至少一个参考序列编码对于嵌合抗原受体的表位；提供具有表面的结构，其中该表面包含用于寡核苷酸延伸的座位簇，每个簇包含50至500个座位；合成所述多个不同寡核苷酸，其中每个所述不同寡核苷酸从单独的座位延伸；以及进行扩增反应以装配变异核酸文库，其中所述扩增反应包括将来自单个簇的所述多个不同寡核苷酸与DNA聚合酶和至少一个参考序列混合。本文还提供了一种方法，其中所述结构的表面包含至少6000个簇。本文还提供了一种方法，其中在没有校正错误的情况下与预定序列相比，至少约80％的所述变异核酸没有错误。本文还提供了一种方法，其中在没有校正错误的情况下与预定序列相比，至少约90％的所述变异核酸没有错误。本文还提供了一种方法，其中每个不同寡核苷酸的重复在至多5个座位处从所述表面延伸。本文还提供了一种方法，其中每个不同寡核苷酸的重复在至多3个座位处从表面延伸。本文还提供了一种方法，其中所述多个不同寡核苷酸编码至少3个密码子中的每一个与至少一个参考序列相比的至多19个变体。本文还提供了一种方法，其进一步包括表达变异核酸文库，其中所述变异核酸文库的表达提供了与参考序列的表达产物相比具有改善的亲和力、改善的基因表达、改善的亲合力、改善的稳定性或改善的靶标特异性的变异肽。本文还提供了一种方法，其中所述至少一个参考序列编码对于嵌合抗原受体的表位，并且还编码对于由非淋巴样细胞表达的表面蛋白质的表位。

本文提供了核酸文库的核酸合成以供优化试验的方法，该方法包括：提供编码第一多个不同寡核苷酸的第一组预定序列，其中每个所述不同寡核苷酸的长度为至少20个碱基，并且其中所述第一多个不同寡核苷酸编码至少3个密码子中的每一个与至少一个参考序列相比的至多19个变体，其中所述至少一个参考序列编码嵌合抗原受体的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的区域；提供编码第二多个不同寡核苷酸的第二组预定序列，其中每个第二不同寡核苷酸的长度为至少20个碱基，并且其中所述第二多个不同寡核苷酸编码至少3个密码子中的每一个与至少一个参考序列相比的至多19个变体，其中所述至少一个参考序列编码对于嵌合抗原受体的表位；提供具有表面的结构，其中该表面包含用于寡核苷酸延伸的座位簇，每个簇包含50至500个座位；合成第一多个不同寡核苷酸和第二多个不同寡核苷酸，其中每个不同寡核苷酸均从单独的座位延伸；以及进行扩增反应以装配第一核酸文库，其中该扩增反应包括将来自单个簇的所述第一多个不同寡核苷酸与DNA聚合酶和至少一个参考序列混合；进行扩增反应以装配第二变异核酸文库，其中该扩增反应包括将来自单个簇的所述第二多个不同寡核苷酸与DNA聚合酶和至少一个参考序列混合。本文还提供了一种方法，其进一步包括针对表达所述第一变异核酸文库的细胞文库筛选所述第二变异核酸文库的纯化蛋白质表达产物，其中所述细胞文库包含细胞群体，每个细胞群体表达由所述第一变异核酸文库编码的不同的蛋白质表达产物。本文还提供了一种方法，其中对于所述嵌合抗原受体的表位的所述至少一个参考序列还编码对于由非淋巴样细胞表达的表面蛋白质的表位。

附图说明

图1A-1D描绘了结合PCR诱变步骤的变异生物分子合成的处理工艺流程。

图2A-2D描绘了用于生成在单个预定密码子位点处包含与参考核酸序列不同的核酸序列的核酸的处理工艺流程。

图3A-3F描绘了从模板核酸生成一组核酸变体的备选工作流程，其中每个变体在单密码子位置处包含不同的核酸序列。每个变异核酸在其单密码子位置处编码不同的氨基酸，不同的密码子由X、Y和Z表示。

图4A-4E描绘了具有多个氨基酸(每个残基由单个圆圈表示)的参考氨基酸序列(图4A)和使用本文所述方法生成的变异氨基酸序列(图4B、4C、4D和4E)。参考氨基酸序列和变异序列由通过本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。

图5A-5B描绘了参考氨基酸序列(图5A)和变异氨基酸序列文库(图5B)，每个变体包含单残基变体(由“X”表示)。参考氨基酸序列和变异序列由通过本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。图5A披露了SEQ ID NO:42，而图5B按出现顺序分别披露了SEQ ID NO43-49。

图6A-6B描绘了参考氨基酸序列(图6A)和变异氨基酸序列文库(图6B)，每个变体包含两个位点的单位置变体。每个变体由带不同图案的圆圈表示。参考氨基酸序列和变异序列由通过本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。

图7A-7B描绘了参考氨基酸序列(图7A)和变异氨基酸序列文库(图7B)，每个变体包含一段氨基酸(由围绕圆圈的框表示)，每一段具有在序列上与参考氨基酸序列不同的三个位点的位置变体(编码组氨酸)。参考氨基酸序列和变异序列由通过本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。

图8A-8B描绘了参考氨基酸序列(图8A)和变异氨基酸序列文库(图8B)，每个变体包含两段氨基酸序列(由围绕圆圈的框表示)，每一段具有在序列上与参考氨基酸序列不同的一个位点的单位置变体(由带图案的圆圈表示)。参考氨基酸序列和变异序列由通过本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。

图9A-9B描绘了参考氨基酸序列(图9A)和氨基酸序列变体文库(图9B)，每个变体包含一段氨基酸(由带图案的圆圈表示)，每一段具有在序列上与参考氨基酸序列不同的单位点的多位置变体。在该图示中，5个位置发生改变，其中第一个位置具有50/50的K/R比；第二个位置具有50/25/25的V/L/S比，第三个位置具有50/25/25的Y/R/D比，第四个位置对于所有氨基酸具有相等的比例，而第五个位置对于G/P具有75/25的比例。参考氨基酸序列和变异序列由通过本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。

图10A-10C示出了嵌合抗原受体(CAR)的世代。CAR包含细胞外单链可变片段(scFv)、铰链域(H)、跨膜域(TM)和胞内域。第一代CAR的胞内域仅包含CD3ζ(图10A)。第二代CAR的胞内域包含共刺激域和CD3ζ(图10B)。第三代CAR的胞内域包含两个共刺激域和CD3ζ(图10C)。在图10D-10E中，示出了各种CAR结合布置。

图11描绘了通过互换两个表达盒的区段(例如启动子、开放阅读框和终止子)以生成表达盒的变体文库而产生的示例性数目的变体。

图12呈现了说明如本文所公开的基因合成的示例性处理工作流程的步骤图。

图13示出了计算机***的示例。

图14是示出计算机***的架构的框图。

图15是说明网络的示图，该网络被配置用于并入多个计算机***、多个蜂窝电话和个人数据助理，以及网络附加存储(NAS)。

图16是使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机***的框图。

图17描绘了通过凝胶电泳解析的PCR反应产物的BioAnalyzer迹线图。

图18描绘了显示96组PCR产物的电泳图，每组PCR产物在序列上与单密码子位置处的野生型模板核酸不同，其中每组中的单密码子位置位于野生型模板核酸序列中的不同位点。每组PCR产物包含19个变异核酸，每个变体在其单密码子位置处编码不同的氨基酸。

具体实施方式

除非另有说明，否则本公开采用在本领域技术范围内的常规分子生物学技术。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

定义

贯穿本公开内容，数值特征以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述只是为了方便和简明，而不应被解释为对任何实施方案的范围的硬性限制。因此，除非上下文另有明确规定，否则对范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围以及该范围内精确到下限单位十分之一的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应被认为已经明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的各个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都是适用的。这些中间范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也被涵盖于本公开之中，但受制于所声称范围中的任何被明确排除的限值。除非上下文另有明确规定，否则当所声称的范围包括限值之一或全部两者时，排除了这些包括的限值之一或全部两者的范围也被包括在本公开中。

本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制任何实施方案。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。进一步应当理解，术语“包括”和/或“包含”在本说明书中使用时指定所述特征、整体、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元件、组分和/或其群体。如本文所用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何及所有组合。

除非特别说明或从上下文中可以明显看出，否则如本文所用的，关于数字或数字范围的术语“约”应被理解为表示所述数字及其+/-10％的数字，或者对于范围列出的值，表示低于所列下限的10％至高于所列上限的10％。

术语“核酸”涵盖双链或三链核酸，以及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不必共同延伸(即，双链核酸不必沿两条链的全长均是双链的)。除非另有说明，否则提供的核酸序列以5’至3’方向列出。本文所述的方法提供了分离的核酸的生成。本文所述的方法另外提供了分离并纯化的核酸的生成。

如本文所用的，术语“预选序列”、“预限定序列”或“预定序列”可互换使用。这些术语意指在聚合物的合成或装配之前，聚合物的序列是已知的和选定的。具体地，本发明的多个方面主要就核酸分子的制备在本文中进行了描述，寡核苷酸或多核苷酸的序列在核酸分子合成或装配之前是已知的和选定的。

本文提供了用于产生合成的(即从头合成的或化学合成的)多核苷酸的方法和组合物。贯穿全文，术语寡核苷酸(oligonucleotide)、寡核苷酸(oligo)、寡核酸和多核苷酸被定义为同义词。本文所述的合成多核苷酸的文库可包含共同编码一种或多种基因或基因片段的多个多核苷酸。在一些情况下，多核苷酸文库包含编码序列或非编码序列。在一些情况下，多核苷酸文库编码多个cDNA序列。cDNA序列所基于的参考基因序列可含有内含子，而cDNA序列不含内含子。本文所述的多核苷酸可编码来自生物体的基因或基因片段。示例性生物体包括但不限于原核生物(例如，细菌)和真核生物(例如，小鼠、兔、人和非人灵长类动物)。在一些情况下，多核苷酸文库包含一个或多个多核苷酸，所述一个或多个多核苷酸中的每一个编码多个外显子的序列。本文所述的文库内的每个多核苷酸可以编码不同的序列，即，不相同的序列。在一些情况下，本文所述的文库内的每个多核苷酸包含至少一个与该文库内另一个多核苷酸的序列互补的部分。除非另有说明，否则本文所述的多核苷酸序列可包括DNA或RNA。

本文提供了用于产生合成的(即从头合成的)基因的方法和组合物。包含合成基因的文库可以通过本文其它部分进一步详述的多种方法来构建，如PCA、非PCA基因装配方法或分层基因装配，从而将两个或更多个双链寡核苷酸组合(“缝合”)以产生更大的DNA单元(即，底架)。大构建体的文库可包含长度为至少1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500kb或更长的寡核苷酸。大构建体可被独立选择的约5000、10000、20000或50000个碱基对的上限所约束。任意数目的编码多肽区段的核苷酸序列的合成，该序列包括编码非核糖体肽(NRP)的序列，编码以下物质的序列：非核糖肽合成酶(NRPS)模块和合成变体、其它模块化蛋白质如抗体的多肽区段、来自其它蛋白质家族的多肽区段，包括非编码DNA或RNA，如调节序列，例如启动子、转录因子、增强子、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、衍生自微小RNA的核仁小RNA，或任何感兴趣的功能性或结构性DNA或RNA单元。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、基因间DNA、由连锁分析限定的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核仁小RNA、核酶、互补DNA(cDNA)(其为mRNA的DNA呈现形式，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增来获得)；经合成或通过扩增产生的DNA分子、基因组DNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。编码本文提及的基因或基因片段的cDNA可包含至少一个编码外显子序列的区域，而没有在相应基因组序列中发现的居间内含子序列。或者，cDNA的相应基因组序列可能最初缺少内含子序列。

嵌合抗原受体

嵌合抗原受体(CAR)通常是工程化的受体，其识别特定的抗原，如其表位对癌细胞是独特的抗原。参见图10A-10C，CAR包含源自单链抗体的抗原识别域(scFv)、铰链域(H)或间隔区、将CAR锚定于质膜上的跨膜域(TM)和介导T细胞活化的胞内域。第一代CAR的胞内域包含CD3ζ(图10A)。第二代CAR的胞内域包含共刺激域和CD3ζ(图10B)。第三代CAR的胞内域包含两个共刺激域和CD3ζ(图10C)。示例性的CAR结合示意图在图10D-10E中示出。CAR可以在淋巴样细胞例如T细胞中表达，并且对于CAR的表位可以在非淋巴样细胞或体外基质如珠子、凝胶或柱中表达。参见例如图10D。在一些布置中，CAR能够与“连接体”蛋白质或肽的表位结合，后者还能够充当对于另一表面例如细胞、珠子、凝胶或柱的表面蛋白质的表位。参见例如图10E。

嵌合抗原受体中的工程化变异

本文提供了用于合成变异核酸文库的方法，其中每个变异核酸编码与CAR内的参考结构域相比发生改变的序列。例如，发生改变的序列是编码抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的核酸序列。在一些情况下，胞内域包含信号传导域。在一些情况下，胞内域还包含共刺激域。在一些情况下，变异核酸文库包含编码CAR的所有结构域的变异序列。所得到的核酸文库可以是寡核苷酸文库、基因片段文库或基因文库。在一些情况下，该核酸文库在细胞中表达以生成变异蛋白质文库。

通过本文公开的方法生成的变异核酸文库可以编码抗原识别域。抗原识别域可包含单链可变片段(scFv)。在一些情况下，抗原识别域包含F(ab’)₂、Fab’、Fab或Fv。可以针对特定的肿瘤抗原设计并合成编码抗原识别域的变异核酸文库。示例性肿瘤抗原包括但不限于α-叶酸受体、BCMA、CAIX、CD123、CD138、CD171、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v7/8、CEA、cMET、DNAM-1、EDB-F、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、EpCAM、FAP、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3、h5T4、HER2、HER3、IL-13、IL-13R-a2、κ轻链、KDR、LewisY、LMP-1、MAGE-A1、间皮素、MUC-1、MUC-16、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGFR和VEGFR2。在一些情况下，选择抗原识别域的约25、50、100、250、500、1000个或超过1000个共同编码基因序列用于变异。变异可以包括针对所选的每个共同编码基因序列设计至少25、50、100、250、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、100000个或超过100000个变体。

铰链域和跨膜域可以将抗原识别域连接至胞内域，并将CAR锚定在T细胞膜中。在一些情况下，生成编码铰链域的变异核酸文库。示例性的铰链域是免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE)、免疫球蛋白的CH2CH3区和可选的CD3的部分和CD8α。在一些情况下，生成编码跨膜域的变异核酸文库。

通过本文公开的方法生成的变异核酸文库可以包含胞内域发生改变的序列。在一些情况下，胞内域包含共刺激域。在一些情况下，变异核酸文库包含CAR的参考共刺激域发生改变的序列。示例性的共刺激域包括但不限于CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、OX40(CD134)或其片段或组合。在一些情况下，选择共刺激域的约100、250、500、1000个或超过1000个共同编码基因序列用于变异。变异包括针对所选的每个共同编码基因序列设计至少约500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、100000个或超过100000个变体。表1示出了示例性的共刺激域序列。

表1.共刺激域

如本文所述的变异核酸文库可以包含胞内域的变体。在一些情况下，胞内域包含信号传导域。在一些情况下，通过本文公开的方法生成的变异核酸文库包含与信号传导域相比发生改变的序列。在一些情况下，信号传导域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一些情况下，信号传导域包含来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的结构域。在一些情况下，用于T细胞活化的信号传导域包含来源于CD3ζ的结构域。在一些情况下，选择用于T细胞活化的信号传导域的约100、250、500、1000个或超过1000个共同编码基因序列用于变异。变异包括针对所选的每个共同编码基因序列设计至少约500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、100000个或超过100000个变体。表2示出了示例性的信号传导域序列。

表2.信号传导域序列

本文提供的用于合成与CAR内的参考结构域相比发生改变的变异核酸文库的方法可包括：从头合成引物寡核苷酸的变体文库，然后进行PCR诱变，或者从头合成变异形式的多个片段以供退火和装配，包括聚合酶链装配。

本文所述的核酸文库可以包含与参考CAR内的参考结构域相比发生改变的多个核酸，并且通过从头合成引物寡核苷酸的变体文库然后进行PCR诱变来生成变异。在一些情况下，寡核苷酸在表面上合成，其中每个寡核苷酸编码预定序列。在一些情况下，预定序列是编码CAR的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的参考核酸序列的预定变体。在一些情况下，从头合成寡核苷酸引物以用于一系列PCR反应中，以生成编码CAR的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的参考核酸序列的寡核苷酸变体文库。在一些情况下，寡核苷酸引物用于从参考核酸序列扩增，以产生编码CAR的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的变异核酸文库。

在一些情况下，通过从头合成共同序列的变异形式的多个片段以供退火和装配，包括聚合酶链装配，来产生与CAR内的参考结构域相比发生改变的变异核酸文库。在一些情况下，表面用于从头合成核酸序列的多个片段，其中至少一个片段以多种形式合成。核酸序列可以是编码CAR的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的参考核酸序列的变体。在一些情况下，使片段杂交以生成CAR变体文库。在一些情况下，将合成的片段扩增并进行连接或杂交以生成CAR变体文库。

在一些情况下，CAR变体文库包含编码CAR的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域(包括刺激域或信号传导域)的核酸序列。在一些情况下，CAR变体文库包含编码CAR的单个结构域的核酸序列。在一些情况下，CAR变体文库包含编码CAR的多个结构域的核酸序列。例如，CAR变体文库包含编码CAR的所有结构域的核酸序列。

包含编码如本文所述的变异TCR的核酸的文库在翻译时包含不同长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或大约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150个或超过150个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度在约15至150、20至145、25至140、30至135、35至130、40至125、45至120、50至115、55至110、60至110、65至105、70至100或75至95个氨基酸的范围内。在一些情况下，氨基酸的长度在约22个至约75个氨基酸的范围内。

使用如本文所述的方法从头合成用于变异的TCR链的至少一个区域的许多变异序列。在一些情况下，针对CAR的抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域从头合成许多变异序列。在一些情况下，针对CAR的刺激域或信号传导域从头合成许多变异序列。变异序列的数目可以是至少或大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或超过500个序列。在一些情况下，变异序列的数目是至少或大约500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、一百万个或超过一百万个序列。在一些情况下，变异序列的数目在约10至500、25至475、50至450、75至425、100至400、125至375、150至350、175至325、200至300、225至375、250至350或275至325个序列的范围内。

本文提供了编码变异CAR的变异核酸，其中该变异CAR是抗原特异性的。在一些情况下，该抗原参与疾病、病症或病况或与疾病、病症或病况相关。例如，该抗原与增生性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫性病症、自身免疫性疾病、传染性疾病、病毒性疾病、***反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病相关。在一些情况下，该抗原是在肿瘤细胞上表达的抗原。在一些情况下，抗原与病原体如病毒或细菌相关。

在一些情况下，所述变异CAR识别组织限制性的抗原。例如，所述变异CAR受限于非重要的细胞谱系或组织。在一些情况下，所述变异CAR识别来自突变基因产物的抗原。

本文提供了变异CAR文库，其中变异CAR编码抗原结合界面中的变体。在一些情况下，用于变异的残基是预先选择的或预测的与抗原接触的残基。在一些情况下，抗原结合界面是抗原识别域。在一些情况下，用于变异的残基是预先选择的或预测的位于结合口袋中的残基。

如本文所述的变异CAR文库包含文库中的一个或多个突变。在一些情况下，该CAR变体文库是单变体文库，其包含跨文库的单个位点处的变体。在一些情况下，该CAR变体文库是包含多个位点处的变体的多变体文库。在一些情况下，位点的数目是2、3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个位点。

本文提供了其中CAR基因或基因片段中的一个或多个预选密码子编码变异氨基酸残基以在所得变异CAR蛋白质文库中生成变异的文库。在一些情况下，至多10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基得到改变。在一些情况下，至多30个氨基酸残基得到改变。在一些情况下，至多5个氨基酸残基得到改变。在一些情况下，至多100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或超过1000个氨基酸残基得到改变。在一些情况下，至少或大约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基得到改变。在一些情况下，至少或大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或超过1000个氨基酸残基得到改变。在一些情况下，预选区域中的所有氨基酸残基都得到改变。在一些情况下，变异CAR文库是高度多样性的。在一些情况下，所述文库包含至少或大约10⁶、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或10¹³个变体。在一些情况下，所述文库包含至少或大约10⁹个变体。

在合成编码CAR内的参考结构域的变异核酸文库之后，可以将变异核酸文库***载体序列中。在一些情况下，载体序列在细胞中表达(例如，通过电穿孔、转染或转导)，并测定功能性后果。可以改变的CAR结构域是抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。在一些情况下，胞内域包含信号传导域或共刺激域。在一些情况下，变异核酸文库包含编码CAR的所有结构域的变异序列。可以测量的功能性后果包括结合亲和力和结合强度。在一些情况下，通过本文公开的方法生成的变异核酸文库导致抗原识别域与特定目的癌症相关的肿瘤抗原的结合强度增加。该癌症可以是实体癌或造血***癌症。在一些情况下，该癌症是膀胱癌、肺癌、脑癌、黑素瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、***、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、食道癌、***癌、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肝癌或子宫癌。用于结合试验的示例性抗原包括但不限于表3中提供的抗原。

表3.抗原

可以筛查使用本文所述方法生成的变异核酸文库，以选择修饰的CAR结构域序列，从而提供对肿瘤抗原具有改善的亲和力(表位与抗体的抗原结合位点之间的相互作用强度的量度)的蛋白质复合物。还可以评估其它功能考虑因素，如变异基因表达、亲合力、稳定性和靶细胞(即癌细胞)特异性。在一些情况下，与参考非变异CAR相比，CAR的增加的特异性提供了对非癌相关抗原的降低的交叉反应性。在一些情况下，针对在细胞内的定位筛查变异CAR文库。在一些情况下，筛查变异CAR文库以鉴定适当定位的变异CAR。

变异CAR对肿瘤抗原的特异性增加可导致毒性降低。在一些情况下，产生的毒性包括细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、在靶脱肿瘤毒性、自身免疫、宿主-移植物毒性、神经毒性和肿瘤溶解综合征。可以将编码抗原识别域的变异核酸文库***载体序列中，在细胞中表达，并针对功能性后果如毒性降低进行筛选。例如，针对细胞因子(例如，白介素-6(IL-6)、干扰素-γ、肿瘤坏死因子、IL-2、IL-2-受体-α、IL-8和IL-10)从细胞的释放增加或细胞因子表达的增加作为CRS的量度来筛查变异核酸文库。

在一些情况下，筛查使用本文所述的方法生成的变异核酸文库，以选择提供改善的T细胞功能或改善的T细胞活化的修饰的CAR结构域序列。在一些情况下，变异CAR用来筛选影响细胞生长、存活、细胞分化、细胞死亡或细胞内信号传导调节的T细胞途径。例如，已经证明丝氨酸/苏氨酸激酶Akt改善了T细胞功能和存活，导致对肿瘤抑制机制的抗性。在一些情况下，变异CAR用来筛选改善对肿瘤抑制机制的抗性的T细胞途径。在一些情况下，使用本文所述的方法生成的变异CAR导致对靶细胞如癌细胞的免疫应答增强。例如，变异CAR可以增加细胞毒性细胞(例如，自然杀伤细胞或细胞毒性T淋巴细胞)对靶细胞如癌细胞的细胞毒性活性。在一些情况下，使用本文所述的方法生成的变异CAR导致对靶细胞如癌细胞的免疫应答增强，从而导致癌细胞死亡的增加。

在一些情况下，在细胞中表达的变异CAR文库用来鉴定具有改善的变异基因表达、亲合力、稳定性、亲和力或特异性的变异CAR。例如，生成第一变异CAR文库，其包含对肿瘤抗原的改善的特异性。在一些情况下，在鉴定具有改善的基因表达、亲合力、稳定性、亲和力或特异性的变异CAR后，进一步改变那些变异CAR，以产生具有第二改善的第二变异CAR文库。例如，进一步改变具有改善的特异性的变异CAR，以鉴定进一步包含改善的稳定性的变体。在一些情况下，第二文库在与第一文库相同的区域中包含变体。在一些情况下，第二文库在与第一文库不同的区域中包含变体。例如，第一文库可包含CAR的抗原识别域中的变体，而第二文库可包含CAR的铰链域、跨膜域或胞内域中的变体。在一些情况下，生成许多变异CAR文库。在一些情况下，变异CAR文库的数目是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或超过12个变体文库。在一些情况下，变体文库包含至少或大约10¹、10²、10³、10⁴、10⁵或10⁶个变体。在一些情况下，每个变体文库独立地在基因表达、亲合力、稳定性、亲和力或特异性方面具有改善。

可将变异CAR文库工程化到细胞中并引入受试者中。在一些情况下，所述细胞是自体的，意味着来源于受试者自身的细胞。或者，表达变异CAR的细胞是同种异体的，意味着来源于具有相似组织类型的另一个受试者。在一些情况下，细胞是针对受试者定制的。在一些情况下，细胞与局部组织相容。

在一些情况下，本文所述的变异核酸文库包含约50-100000、100-75000、250-50000、500-25000、1000-15000、2000-10000或4000-8000个序列。在一些情况下，变异核酸文库包含500个序列。在一些情况下，变异核酸文库包含5000个序列。在一些情况下，变异核酸文库包含15000个序列。在一些情况下，变异核酸文库包含至少50、100、150、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、400000、800000、1000000个或超过1000000个序列。变异核酸文库可包含至多50、100、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、400000、800000或1000000个序列。总变体文库可以产生10⁶、10⁸、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³个或更多个不同的核酸。

在一些情况下，每个寡核苷酸片段的长度或合成的寡核苷酸的平均长度可以是至少或大约至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、300、400、500、2000个或更多个核苷酸。每个寡核苷酸片段的长度或合成的寡核苷酸的平均长度可以是至多或大约至多2000、500、400、300、200、150、100、50、45、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸。每个寡核苷酸片段的长度或合成的寡核苷酸的平均长度可以是10-2000、10-500、9-400、11-300、12-200、13-150、14-100、15-50、16-45、17-40、18-35、19-25。

变体文库合成

本文所述的方法提供了合成各自编码至少一个预定参考核酸序列的预定变体的寡核苷酸文库。在一些情况下，分离、纯化或者分离并纯化本文合成的寡核苷酸。在一些情况下，预定参考序列是编码蛋白质的核酸序列，并且变体文库包含编码至少单个密码子的变异的序列，使得由合成核酸编码的后续蛋白质中单个残基的多个不同变体通过标准翻译过程生成。核酸序列中合成的特定变化可通过将核苷酸变化并入重叠或平端寡核苷酸引物中来引入。或者，寡核苷酸群体可共同编码长核酸(例如，基因)及其变体。在这种布置中，寡核苷酸群体可进行杂交并且经历标准分子生物技术以形成长核酸(例如，基因)及其变体。当长核酸(例如，基因)及其变体在细胞中表达时，生成变异蛋白质文库。类似地，本文提供了合成编码RNA序列(例如，miRNA、shRNA和mRNA)或DNA序列(例如，增强子、启动子、UTR和终止子区)的变体文库的方法。在一些情况下，所述序列是外显子序列或编码序列。在一些情况下，所述序列不包含内含子序列。本文还提供了使用本文所述的方法合成的文库中所选择出的变体的下游应用。下游应用包括鉴定具有增强的生物学相关功能(例如，生物化学亲和力、酶活性、细胞活性变化)和用于治疗或预防疾病状态的变异核酸或蛋白质序列。

合成后进行PCR诱变

合成寡核苷酸变体文库的第一个过程是用于PCR诱变(饱和或非饱和)方法。在该工作流程中，合成多个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考核酸序列的预定变体的预定序列。参见附图，图1A-1D中描绘了示例性工作流程，其中寡核苷酸在表面上生成。图1A描绘了具有121个座位的表面的单簇的放大视图。图1B中描绘的每个寡核苷酸均为可用于从参考核酸序列扩增以产生变异长核酸文库(图1C)的引物。然后，变异长核酸文库任选地经历转录和/或翻译以生成变异RNA或蛋白质文库，图1D。在该示例性说明中，描绘了具有基本上为平面的表面的装置，其用于从头合成寡核苷酸，图1A。在一些情况下，该装置包含一簇座位，其中每个座位为寡核苷酸延伸的位点。在一些情况下，单簇包含生成所期望的变异序列文库所需的所有寡核苷酸变体。在备选的布置中，板包含未分隔成簇的一片座位。

在一些情况下，通过PCR扩增簇内合成的寡核苷酸(例如，如图1A中所见)。与在没有成簇布置的情况下在整个板上扩增不相同的寡核苷酸相比，这样的布置可以提供改进的寡核苷酸呈现。在一些情况下，由于反复合成具有高GC含量的寡核苷酸的大寡核苷酸群体，在簇内座位表面上合成的寡核苷酸的扩增克服了对呈现的负面影响。在一些情况下，本文描述的簇包含约50-1000、75-900、100-800、125-700、150-600、200-500、50-500或300-400个离散的座位。在一些情况下，座位是斑点、孔、微孔、通道或柱杆(post)。在一些情况下，每个簇具有至少1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X或更高丰余度的支持延伸具有相同序列的寡核苷酸的单独特征。在一些情况下，1X丰余度意味着没有具有相同序列的寡核苷酸。

本文所述的从头合成的寡核苷酸文库可包含多个寡核苷酸，每个寡核苷酸在第一位置(位置“x”)处有至少一个变异序列，并且每个变异寡核苷酸在第一轮PCR中用作引物以生成第一延伸产物。在该实例中，第一寡核苷酸220中的位置“x”编码变异密码子序列，即来自参考序列的19个可能的变体之一。参见图2A。包含与第一寡核苷酸的序列重叠的序列的第二寡核苷酸225也在另一轮的PCR中用作引物以生成第二延伸产物。另外，外部引物215、230可用于扩增来自长核酸序列的片段。所得到的扩增产物是长核酸序列的片段235、240。参见图2B。然后使长核酸序列的片段235、240杂交，并经历延伸反应以形成长核酸的变体245。参见图2C。第一和第二延伸产物的重叠末端可充当第二轮PCR的引物，从而生成含有该变体的第三延伸产物(图2D)。为了提高产率，长核酸的变体在包括DNA聚合酶、扩增试剂和外部引物215、230的反应中进行扩增。在一些情况下，第二寡核苷酸包含邻近但不包括变异位点的序列。在备选的布置中，生成具有与第二寡核苷酸相重叠的区域的第一寡核苷酸。在这种情境下，针对至多19个变体合成在单个密码子处具有变异的第一寡核苷酸。第二寡核苷酸不包含变异序列。任选地，第一群体包含第一寡核苷酸变体和编码不同密码子位点处的变体的其它寡核苷酸。或者，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可被设计用于平端连接。

图3A-3F描绘了备选的诱变PCR方法。在这样的过程中，包含第一和第二链305、310的模板核酸分子300在含有第一引物315和第二引物320的PCR反应中扩增(图3A)。扩增反应包括作为核苷酸试剂的尿嘧啶。生成尿嘧啶标记的延伸产物325(图3B)，任选地进行纯化，并且充当使用第一寡核苷酸335和多个第二寡核苷酸330生成第一延伸产物340和345的后续PCR反应的模板(图3C-3D)。在该过程中，多个第二寡核苷酸330包含编码变异序列的寡核苷酸(在图3C中表示为X、Y和Z)。尿嘧啶标记的模板核酸用尿嘧啶特异性切除试剂，例如从New England Biolabs商购获得的USER digest进行消化。添加变体335和具有变体X、Y和Z的不同密码子330，并且进行有限的PCR步骤以生成图3D。在将含尿嘧啶的模板消化后，延伸产物的重叠末端用来引发PCR反应，其中第一延伸产物340和345与第一外部引物350和第二外部引物355组合起到引物的作用，从而生成在变异位点处含有多个变体X、Y和Z的核酸分子360的文库，图3F。

具有长核酸的变体和非变体部分的群体的从头合成

在用于合成变体文库的第二个过程中，表面用于从头合成长核酸的多个片段，其中至少一个片段以多种形式合成，每种形式具有不同的变异序列。在这种布置中，从头合成装配变异长程核酸文库所需的全部片段。合成的片段可具有重叠的序列，使得在合成之后，片段文库经历杂交。杂交后，可进行延伸反应以补平任何互补缺口。

或者，合成的片段可以用引物来扩增，随后经历平端连接或重叠杂交。在一些情况下，该装置包含一簇座位，其中每个座位是寡核苷酸延伸的位点。在一些情况下，单簇包含预定长核酸的所有寡核苷酸变体和其它片段序列，以生成所期望的变异核酸序列文库。该簇可包含约50至500个座位。在一些布置中，簇包含超过500个座位。

第一寡核苷酸群体中的每个单独的寡核苷酸可在簇的单独的、可单独寻址的座位上生成。一个寡核苷酸变体可以由多个可单独寻址的座位呈现。第一寡核苷酸群体中的每个变体可以呈现1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些情况下，第一寡核苷酸群体中的每个变体在3个或更少的座位处呈现。在一些情况下，第一寡核苷酸群体中的每个变体在两个座位处呈现。在一些情况下，第一寡核苷酸群体中的每个变体仅在单个座位处呈现。

本文提供了生成丰余度降低的核酸文库的方法。在一些情况下，可以在不需要超过1次合成变异寡核苷酸的情况下生成变异寡核苷酸，以获得所需变异寡核苷酸。在一些情况下，本公开提供了在不需要超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次合成变异寡核苷酸的情况下生成变异寡核苷酸以生成所需变异寡核苷酸的方法。

可以在不需要在超过1个离散位点处合成变异寡核苷酸的情况下生成变异寡核苷酸，以获得所需变异寡核苷酸。本公开提供了在不需要在超过1个位点、2个位点、3个位点、4个位点、5个位点、6个位点、7个位点、8个位点、9个位点或10个位点处合成变异寡核苷酸的情况下生成变异寡核苷酸的方法。在一些情况下，在至多6、5、4、3、2或1个离散位点处合成寡核苷酸。相同的寡核苷酸可以在表面上的1、2或3个离散座位中合成。

在一些情况下，呈现单变异寡核苷酸的座位的量是下游加工(例如，扩增反应或细胞试验)所需的核酸材料的量的函数。在一些情况下，呈现单变异寡核苷酸的座位的量是单簇中可用座位的函数。

本文提供了用于生成寡核苷酸文库的方法，该寡核苷酸文库包含在参考核酸的多个位点处不同的变异寡核苷酸。在这类情况下，每个变体文库均在一簇座位内的可单独寻址的座位上生成。应当理解，由寡核苷酸文库呈现的变异位点的数目将取决于该簇中可单独寻址的座位的数目和每个位点处所需变体的数目。在一些情况下，每个簇包含约50至500个座位。在一些情况下，每个簇包含100至150个座位。

在示例性布置中，19个变体在变异位点处呈现，其对应于编码19个可能的变异氨基酸中的每一个的密码子。在另一个示例性情况下，61个变体在变异位点处呈现，其对应于编码19个可能的变异氨基酸中的每一个的三联体。在非限制性实例中，簇包含121个可单独寻址的座位。在该实例中，寡核苷酸群体包含每个单位点变体的6次重复(6次重复×1个变异位点×19个变体＝114个座位)、每个双位点变体的3次重复(3次重复×2个变异位点×19个变体＝114个座位)或每个三位点变体的2次重复(2次重复×3个变异位点×19个变体＝114个座位)。在一些情况下，寡核苷酸群体在四个、五个、六个或超过六个变异位点处包含变体。

本文提供了用于产生合成的(即从头合成或化学合成的)寡核苷酸的方法和组合物。本文所述的合成寡核苷酸的文库可包含多个共同编码一个或多个基因或基因片段的寡核苷酸。在一些情况下，寡核苷酸文库包含编码序列或非编码序列。在一些情况下，寡核苷酸文库编码多个cDNA序列。在一些情况下，寡核苷酸文库包含一个或多个寡核苷酸，所述一个或多个寡核苷酸中的每一个寡核苷酸编码多个外显子的序列。本文所述文库内的每个寡核苷酸可编码不同的序列，即，不相同的序列。在一些情况下，本文所述文库内的每个寡核苷酸包含与该文库内的另一个寡核苷酸的序列互补的至少一部分。除非另有说明，否则本文所述的寡核苷酸序列可包含DNA或RNA。

本文提供了用于产生合成的(即从头合成的)基因的方法和组合物。包含合成基因的文库可以通过本文其它部分进一步详述的多种方法来构建，如PCA、非PCA基因装配方法或分层基因装配，从而将两个或更多个双链寡核苷酸组合(“缝合”)以产生更大的DNA单元(即，底架)。大构建体的文库可包含长度为至少1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500kb或更长的寡核苷酸。大构建体可被独立选择的约5000、10000、20000或50000个碱基对的上限所约束。任意数目的编码多肽区段的核苷酸序列的合成可包括编码非核糖体肽(NRP)的序列，编码以下物质的序列：非核糖肽合成酶(NRPS)模块和合成变体、其它模块化蛋白质如抗体的多肽区段、来自其它蛋白质家族的多肽区段，包括非编码DNA或RNA，如调节序列，例如启动子、转录因子、增强子、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、衍生自微小RNA的核仁小RNA，或任何感兴趣的功能性或结构性DNA或RNA单元。以下是寡核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、基因间DNA、由连锁分析限定的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核仁小RNA、核酶、cDNA(其为mRNA的DNA呈现形式，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增来获得)；经合成或通过扩增产生的DNA分子、基因组DNA、重组寡核苷酸、支链寡核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。在cDNA的语境中，术语基因或基因片段是指包含至少一个编码外显子序列的区域而没有间插内含子序列的DNA核酸序列。

在各个实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及基因文库。基因文库可包含多个亚区段。在一个或多个亚区段中，文库的基因可以共价连接在一起。在一个或多个亚区段中，文库的基因可编码具有一个或多个代谢终产物的第一代谢途径的组成部分。在一个或多个亚区段中，可以基于一种或多种靶向代谢终产物的制备过程来选择文库的基因。所述一种或多种代谢终产物可以包含生物燃料。在一个或多个亚区段中，文库的基因可以编码具有一种或多种代谢终产物的第二代谢途径的组成部分。第一和第二代谢途径的一种或多种终产物可以包含一种或多种共同的终产物。在一些情况下，第一代谢途径包含在第二代谢途径中操纵的终产物。

密码子变异

本文所述的变异寡核苷酸文库可包含多个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码与参考核酸序列相比的变异密码子序列。在一些情况下，第一寡核苷酸群体中的每个寡核苷酸在单变异位点处含有变体。在一些情况下，第一寡核苷酸群体在单变异位点处含有多个变体，使得第一寡核苷酸群体在相同变异位点处含有超过一个变体。第一寡核苷酸群体可包含在相同变异位点处共同编码多个密码子变体的寡核苷酸。第一寡核苷酸群体可包含在相同位置处共同编码多达19个或更多个密码子的寡核苷酸。第一寡核苷酸群体可包含在相同位置处共同编码多达60个变异三联体的寡核苷酸，或者第一寡核苷酸群体可包含在相同位置处共同编码多达61个不同密码子三联体的寡核苷酸。每个变体可编码在翻译过程中产生不同氨基酸的密码子。表4提供了对于变异位点可能的每个密码子(和代表性氨基酸)的列表。

表4.密码子和氨基酸列表

本文提供了可以包含多个核酸的核酸文库，其中每个核酸编码与参考核酸序列相比的变异密码子序列。在一些情况下，第一核酸群体的每个核酸在单变异位点处含有变体。在一些情况下，第一核酸群体在单变异位点处含有多个变体，使得第一核酸群体在相同变异位点处含有超过一个变体。第一核酸群体可包含在相同变异位点处共同编码多个密码子变体的核酸。第一寡核苷酸群体可包含在相同位置处共同编码多达19个或更多个密码子的核酸。第一核酸群体可包含在相同位置处共同编码多达60个变体三联体的核酸，或者第一核酸群体可包含在相同位置处共同编码多达61个不同密码子三联体的寡核苷酸。每个变体可编码在翻译过程中产生不同氨基酸的密码子。

寡核苷酸群体可包含在多个位置处共同编码至多20个密码子变异的改变的寡核苷酸。在这类情况下，该群体中的每个寡核苷酸包含在相同寡核苷酸中超过一个位置处的密码子变异。在一些情况下，该群体中的每个寡核苷酸包含在单个寡核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，每个变异长核酸包含在单个长核酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，该变异寡核苷酸群体包含在单个寡核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，该变异寡核苷酸群体包含在单个长核酸中的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个密码子处的密码子变异。

本文提供了其中在含有多个可单独寻址的座位的第二簇上生成第二寡核苷酸群体的过程。第二寡核苷酸群体可包含对于每个密码子位置而言恒定(即，在每个位置处编码相同的氨基酸)的多个第二寡核苷酸。第二寡核苷酸可与第一寡核苷酸的至少一部分重叠。在一些情况下，第二寡核苷酸不包含在第一寡核苷酸上所呈现的变异位点。或者，第二寡核苷酸群体可包含多个第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸含有至少一个针对一个或多个密码子位置的变异。

本文提供了用于合成寡核苷酸文库的方法，其中生成在多个密码子位置处包含变体的单个寡核苷酸群体。第一寡核苷酸群体可在含有多个可单独寻址的座位的第一簇上生成。在这类情况下，第一寡核苷酸群体在不同密码子位置处包含变体。在一些情况下，所述不同位点是连续的(即，编码连续的氨基酸)。例如，第一寡核苷酸群体在两个连续密码子位置处包含变体，在一个位置处编码多达19个变体。在一些情况下，第一寡核苷酸群体在两个连续的密码子位置处包含变体，在一个位置处编码约1至约19个变体。在一些情况下，合成约38个寡核苷酸。在一些情况下，在两个连续密码子位置处包含变体的寡核苷酸的长度范围为约36至约66个碱基。第一寡核苷酸群体可包含在相同或另外的变异位点处共同编码至多19个密码子变体的改变的寡核苷酸。第一寡核苷酸群体可包括多个第一寡核苷酸，其在位置x处含有至多19个变体、在位置y处含有至多19个变体且在位置z处含有至多19个变体。在这样的布置中，每个变体编码不同的氨基酸，使得在每个不同的变异位点处编码至多19个氨基酸变体。在另外的情况下，第二寡核苷酸群体在含有多个可单独寻址的座位的第二簇上生成。第二寡核苷酸群体可包含对于每个密码子位置而言恒定(即，在每个位置处编码相同的氨基酸)的多个第二寡核苷酸。第二寡核苷酸可与第一寡核苷酸的至少一部分重叠。第二寡核苷酸可不包含在第一寡核苷酸上所呈现的变异位点。

通过本文所述的过程生成的变异核酸文库提供了变异蛋白质文库的生成。在第一个示例性布置中，模板寡核苷酸编码序列，该序列在转录并翻译时产生具有多个密码子位置的参考氨基酸序列(图4A)，这些位置由单个圆圈表示。模板的寡核苷酸变体可使用本文所述的方法生成。在一些情况下，寡核苷酸中存在单个变体，导致单变异氨基酸序列(图4B)。在一些情况下，寡核苷酸中存在多于一个变体，其中这些变体被一个或多个密码子隔开，导致在变异残基之间具有间隔的蛋白质(图4C)。在一些情况下，寡核苷酸中存在多于一个变体，其中这些变体是顺序的并且彼此相邻或连续，导致间隔的变异残基段(图4D)。在一些情况下，寡核苷酸中存在两段变体，其中每段变体包含顺序的且相邻或连续的变体(图4E)。

本文提供了生成寡核苷酸变体文库的方法，其中每个变体包含单位置密码子变体。在一个实例中，模板寡核苷酸具有多个密码子位置，其中示例性氨基酸残基由带有它们各自的单字母代码蛋白质密码子的圆圈表示，图5A。图5B描绘了由变异核酸文库编码的氨基酸变体文库，其中每个变体包含位于不同单个位点处的单位置变体(由“X”表示)。第一位置变体用任意密码子来代替丙氨酸，第二个变体用由变异核酸文库编码的任意密码子来代替色氨酸，第三个变体用任意密码子来代替异亮氨酸，第四个变体用任意密码子来代替赖氨酸，第五个变体用任意密码子来代替精氨酸，第六个变体用任意密码子来代替谷氨酸，而第七个变体用任意密码子来代替谷氨酰胺。当全部或少于全部密码子变体由变异核酸文库编码时，在蛋白质表达(即，DNA转录的标准细胞事件之后进行翻译和加工事件)之后生成相应的氨基酸序列变体群体。

在一些布置中，生成具有多位点的单位置变体的文库。如图6A所示，提供了野生型模板。图6B描绘了具有两个位点的单位置密码子变体的所得氨基酸序列，其中编码不同氨基酸的每个密码子变体由带不同图案的圆圈表示。

本文提供了生成具有一段多位点、单位置变体的文库的方法。每段寡核苷酸或核酸可具有1、2、3、4、5个或更多个变体。每段寡核苷酸或核酸可具有至少1个变体。每段寡核苷酸或核酸可具有至少2个变体。每段寡核苷酸或核酸可具有至少3个变体。例如，一段5个寡核苷酸或核酸可具有1个变体。一段5个寡核苷酸或核酸可具有2个变体。一段5个寡核苷酸或核酸可具有3个变体。一段5个寡核苷酸或核酸可具有4个变体。例如，一段4个寡核苷酸或核酸可具有1个变体。一段4个寡核苷酸或核酸可具有2个变体。一段4个寡核苷酸或核酸可具有3个变体。一段4个寡核苷酸或核酸可具有4个变体。

在一些情况下，单位置变体可全部编码相同的氨基酸，例如组氨酸。如图7A所示，提供了参考氨基酸序列。在这种布置中，一段寡核苷酸编码多位点的单位置变体，并且在表达时产生具有编码组氨酸的所有单位置变体的氨基酸序列，图7B。在一些实施方案中，通过本文所述的方法合成的变体文库在所得到的氨基酸序列中未编码多于4个组氨酸残基。

在一些情况下，通过本文所述的方法生成的核酸变体文库提供具有单独的变异段的氨基酸序列的表达。图8A中描绘了模板氨基酸序列。一段寡核苷酸可以在两个区段中仅具有1个变异密码子，并且当表达时产生图8B中所描绘的氨基酸序列。在图8B中由带不同图案的圆圈描绘变体，以表明氨基酸的变异处于单一区段中不同的位置。

本文提供了合成具有1、2、3个或更多个密码子变体的寡核苷酸或核酸文库的方法和装置，其中选择性地控制每个位点的变体。单位点变体的两种氨基酸之比可以是约1:100、1:50、1:10、1:5、1:3、1:2、1:1。单位点变体的三种氨基酸之比可以是约1:1:100、1:1:50、1:1:20、1:1:10、1:1:5、1:1:3、1:1:2、1:1:1、1:10:10、1:5:5、1:3:3或1:2:2。图9A描绘了由野生型核酸序列编码的野生型参考氨基酸序列。图9B描绘了氨基酸变体文库，其中每个变体包含一段序列(由带图案的圆圈表示)，其中每个位置可以在所得到的变异蛋白质文库中具有一定比例的氨基酸。所得到的变异蛋白质文库由通过本文所述方法生成的变异核酸文库编码。在该图示中，5个位置发生改变：第一个位置900具有50/50的K/R比；第二个位置910具有50/25/25的V/L/S比，第三个位置920具有50/25/25的Y/R/D比，第四个位置930对于所有20种氨基酸具有相等的比例，而第五个位置940对于G/P具有75/25的比例。本文所述的比例仅是示例性的。

表达盒中的变异

在一些情况下，生成合成的变体文库，其编码表达构建体的一部分。表达构建体的示例性部分包括启动子、开放阅读框和终止区。在一些情况下，表达构建体编码一个、两个、三个或更多个表达盒。如图11所示，可生成寡核苷酸文库，其编码在构成表达构建体盒之部分的单独区域的单个位点或多个位点处的密码子变异。为了生成表达两个构建体的盒，合成编码第一启动子1110、第一开放阅读框1120、第一终止子1130、第二启动子1140、第二开放阅读框1150或第二终止子序列1160的变异序列的至少一部分的变异寡核苷酸。如前述实例中所述，在数轮扩增后，生成具有1,024个表达构建体的文库。图11提供了一个示例性布置。在一些情况下，另外的调节序列如非翻译调节区(UTR)或增强子区也包括在本文提到的表达盒中。表达盒可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个组分，其变异序列通过本文所述的方法生成。在一些情况下，该表达构建体在多顺反子载体中包含多于一个基因。在一个实例中，将合成的DNA核酸***到病毒载体(例如，慢病毒)中，随后包装以供转导至细胞中，或者***到非病毒载体中以供转移至细胞中，随后进行筛选和分析。

本文公开的用于***核酸的表达载体包含哺乳动物细胞，例如人、非人灵长类动物、猪、兔和小鼠。示例性表达载体包括但不限于哺乳动物表达载体：pSF-CMV-NEO-NH2-PPT-3XFLAG、pSF-CMV-NEO-COOH-3XFLAG、pSF-CMV-PURO-NH2-GST-TEV、pSF-OXB20-COOH-TEV-FLAG(R)-6His(“6His”被披露为SEQ ID NO:41)、pCEP4pDEST27、pSF-CMV-Ub-KrYFP、pSF-CMV-FMDV-daGFP、pEF1a-mCherry-N1载体、pEF1a-tdTomato载体、pSF-CMV-FMDV-Hygro、pSF-CMV-PGK-Puro、pMCP-tag(m)和pSF-CMV-PURO-NH2-CMYC。通过本文所述的方法合成的核酸可以通过本领域已知的各种方法(包括但不限于转染、转导和电穿孔)转移至细胞中。所测试的示例性细胞功能包括但不限于细胞增殖、死亡、迁移/粘附、代谢和细胞信号传导活性的改变。

高度平行的核酸合成

本文提供了一种平台方法，其利用从寡核苷酸合成到硅上纳米孔内基因装配的端到端过程的小型化、平行化及垂直整合来创建革命性的合成平台。本文所述的装置采用与96孔板相同的占地面积(footprint)提供了这样一种硅合成平台，与传统合成方法相比，该硅合成平台能够将通量提高高达1,000倍或更多，其中在单次高度平行化运行中产生高达约1,000,000个或更多个寡核苷酸或10,000个或更多个基因。

随着新一代测序的出现，高分辨率基因组数据已成为深入研究各种基因在正常生物学和疾病发病机理中的生物学作用的研究的重要因素。本研究的核心是分子生物学的中心法则和“连续信息的逐残基转移”的概念。将DNA中编码的基因组信息转录成信息，随后将其翻译成蛋白质，该蛋白质是给定生物学途径内的活性产物。

另一个令人兴奋的研究领域是关于着眼于高度特异性细胞靶标的治疗性分子的发现、研发和制备。高度多样性的DNA序列文库是靶向治疗剂的开发流程的核心。在设计、构建和测试蛋白质工程循环中使用基因突变体表达蛋白质，在理想情况下该循环得到针对对其治疗靶标具有高亲和力的蛋白质的高度表达而优化的基因。作为实例，考虑受体的结合口袋。同时测试结合口袋内所有残基的所有序列排列的能力将允许进行彻底的探索，从而增加成功的可能性。饱和诱变(其中研究人员试图在受体内的特定位点处生成所有可能的突变)代表了针对这种开发挑战的一种方法。虽然其成本高、耗时且耗力，但它能够将每个变体引入到每个位置。相反，组合诱变(其中几个选定的位置或短DNA段可得到广泛修饰)生成具有偏向呈现的变体的不完全组库。

为了加速药物开发流程，具有在可用于测试的正确位置处以预期频率可获得的所需变体的文库(换言之，精确文库)使得能够降低成本以及筛选的周转时间。本文提供了用于合成核酸合成变体文库的方法，其能够以所需的频率精确引入每种期望的变体。对于最终用户来说，这意味着不仅能够彻底对序列空间进行采样，而且能够以有效的方式查询这些假设，从而降低成本和筛选时间。全基因组编辑可以阐明重要的途径，可以检测每个变体和序列排列以获得最佳功能性的文库，并且可以使用数以千计的基因重建整个途径和基因组，以重新改造生物***以供药物发现。

在第一个实例中，药物本身可以使用本文所述的方法进行优化。例如，为了改善抗体的指定功能，设计并合成编码抗体一部分的变异寡核苷酸文库。然后可以通过本文所述的过程(例如，PCR诱变之后***载体中)生成抗体的变异寡核苷酸文库。然后在生产细胞系中表达该抗体，并针对增强的活性进行筛选。示例筛选包括检查对抗原的结合亲和力、稳定性或效应物功能(例如，ADCC、补体或凋亡)的调节。用来优化抗体的示例性区域包括但不限于Fc区、Fab区、Fab区的可变区、Fab区的恒定区、重链或轻链的可变域(V_H或V_L)以及V_H或V_L的特定互补决定区(CDR)。

通过本文所述的方法合成的核酸文库可以在与疾病状态相关的各种细胞中表达。与疾病状态相关的细胞包括细胞系、组织样品、来自受试者的原代细胞、从受试者扩充的培养细胞或模型***中的细胞。示例性细胞包括但不限于原核细胞和真核细胞。示例性真核细胞包括但不限于动物、植物和真菌细胞。示例性动物细胞包括但不限于昆虫、鱼和哺乳动物细胞。示例性哺乳动物细胞包括小鼠、人和灵长类动物细胞。示例性的模型***包括但不限于疾病状态的植物和动物模型。示例性的动物包括但不限于小鼠、兔子、灵长类动物、鱼和昆虫。示例性的植物包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。示例性的植物还包括但不限于微藻类，海带，蓝藻细菌和绿色、棕色和红色藻类，小麦，烟草和玉米，水稻，棉花，蔬菜，和水果。

为了鉴定与疾病状态的预防、减轻或治疗相关的变异分子，本文所述的变异核酸文库在与疾病状态相关的细胞中表达，或者在可以诱发疾病状态的细胞中表达。在一些情况下，使用药剂在细胞中诱发疾病状态。用于疾病状态诱发的示例性工具包括但不限于Cre/Lox重组***、LPS炎症诱发和用来诱发低血糖的链脲佐菌素。与疾病状态相关的细胞可以是来自模型***的细胞或培养的细胞，以及来自具有特定疾病状况的受试者的细胞。示例性疾病状况包括细菌、真菌、病毒、自身免疫性或增生性病症(例如，癌症)。在一些情况下，所述变异核酸文库在模型***、细胞系或来源于受试者的原代细胞中表达，并针对至少一种细胞活性的改变进行筛选。示例性的细胞活性包括但不限于增殖、周期进展、细胞死亡、粘附、迁移、繁殖、细胞信号传导、能量产生、氧利用、代谢活性和老化、对自由基损伤的响应或其任意组合。

基底

本文提供了包含多个簇的基底，其中每个簇包含多个支持寡核苷酸附着和合成的座位。如本文所用的术语“座位”是指结构上的离散区域，其提供了对编码单个预定序列的寡核苷酸从该表面延伸的支持。在一些情况下，座位在二维表面(例如，基本上为平面的表面)上。在一些情况下，座位是指表面上离散的凸起或凹陷的位点，例如孔、微孔、通道或柱杆。在一些情况下，座位的表面包含这样的材料，该材料被活化官能化，以附着至少一个核苷酸以供寡核苷酸合成，或者优选地，附着相同核苷酸的群体以供寡核苷酸群体合成。在一些情况下，寡核苷酸是指编码相同核酸序列的寡核苷酸群体。在一些情况下，装置的表面包括基底的一个或多个表面。

使用所提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸的平均错误率常常可以小于1/1000、小于1/1250、小于1/1500、小于1/2000、小于1/3000或更低。在一些情况下，使用所提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸的平均错误率小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1250、1/1300、1/1400、1/1500、1/1600、1/1700、1/1800、1/1900、1/2000、1/3000或更低。在一些情况下，使用所提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸的平均错误率小于1/1000。

在一些情况下，与预定序列相比，使用所提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸的总错误率小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1250、1/1300、1/1400、1/1500、1/1600、1/1700、1/1800、1/1900、1/2000、1/3000或更低。在一些情况下，与预定序列相比，使用本文提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸的总错误率小于1/500或更低。在一些情况下，使用所提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸的总错误率小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900或1/1000。在一些情况下，使用所提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸的总错误率小于1/1000。

在一些情况下，错误校正酶可用于使用本文提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸。在一些情况下，与预定序列相比，经错误校正的寡核苷酸的总错误率可小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400、1/1500、1/1600、1/1700、1/1800、1/1900、1/2000、1/3000或更低。在一些情况下，使用所提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸经错误校正后的总错误率可小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900或1/1000。在一些情况下，使用所提供的***和方法在文库内合成的寡核苷酸经错误校正后的总错误率可小于1/1000。

错误率可限制基因合成在产生基因变体文库方面的价值。错误率为1/300时，在1500个碱基对的基因中约0.7％的克隆将是正确的。由于大多数来自寡核苷酸合成的错误导致移码突变，所以在这样的文库中超过99％的克隆将不会产生全长蛋白质。将错误率降低75％将使正确克隆的比例提高40倍。本公开的方法和组合物允许快速从头合成大寡核苷酸和基因文库，其错误率低于基因合成方法通常观察到的错误率，这是由于合成质量的改善以及能够以大规模平行且具时效性的方式进行的错误校正方法的适用性。因此，可以合成文库，其中在整个文库中或超过80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的文库中具有低于1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1250、1/1500、1/2000、1/2500、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10000、1/12000、1/15000、1/20000、1/25000、1/30000、1/40000、1/50000、1/60000、1/70000、1/80000、1/90000、1/100000、1/125000、1/150000、1/200000、1/300000、1/400000、1/500000、1/600000、1/700000、1/800000、1/900000、1/1000000或更低的碱基***、缺失、置换或总错误率。本公开的方法和组合物还涉及具有低错误率的大合成寡核苷酸和基因文库，该错误率与该文库的至少一个子集中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的寡核苷酸或基因相关，从而涉及与预定/预选序列相比的无错误序列。在一些情况下，文库内的隔离体积中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的寡核苷酸或基因具有相同的序列。在一些情况下，与超过95％、96％、97％.98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高的相似性或同一性有关的任意寡核苷酸或基因中的至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多具有相同的序列。在一些情况下，优化与寡核苷酸或基因上的指定基因座有关的错误率。因此，作为大文库的部分的一个或多个寡核苷酸或基因的给定基因座或多个选定基因座可各自具有低于1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1250、1/1500、1/2000、1/2500、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10000、1/12000、1/15000、1/20000、1/25000、1/30000、1/40000、1/50000、1/60000、1/70000、1/80000、1/90000、1/100000、1/125000、1/150000、1/200000、1/300000、1/400000、1/500000、1/600000、1/700000、1/800000、1/900000、1/1000000或更低的错误率。在各种情况下，这类错误优化的基因座可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、30000、50000、75000、100000、500000、1000000、2000000、3000000个或更多个基因座。错误优化的基因座可分布到至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、30000、75000、100000、500000、1000000、2000000、3000000个或更多个寡核苷酸或基因。

可在使用或不使用错误校正的情形下达到所述错误率。可在整个文库中，或在文库的超过80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多中达到所述错误率。

本文提供了可包含表面的结构，该表面支持在共同支持物上的可寻址位置处合成具有不同预定序列的多个寡核苷酸。在一些情况下，装置为合成超过2,000、5,000、10,000、20,000、30,000、50,000、75,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、10,000,000个或更多个不同的寡核苷酸提供支持。在一些情况下，该装置为合成超过2,000、5,000、10,000、20,000、30,000、50,000、75,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、10,000,000个或更多个编码不同序列的寡核苷酸提供支持。在一些情况下，至少一部分寡核苷酸具有相同的序列或被配置为用相同的序列合成。

本文提供了用于制备和增长长度约为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个碱基的寡核苷酸的方法和装置。在一些情况下，所形成的寡核苷酸的长度约为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或225个碱基。寡核苷酸的长度可以是至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个碱基。寡核苷酸的长度可以是10至225个碱基、12至100个碱基、20至150个碱基、20至130个碱基或30至100个碱基，或30至70个碱基长。

在一些情况下，寡核苷酸在基底的不同座位上合成，其中每个座位支持合成寡核苷酸群体。在一些情况下，每个座位支持合成与在另一座位上增长的寡核苷酸群体具有不同序列的寡核苷酸群体。在一些情况下，装置的座位位于多个簇内。在一些情况下，装置包含至少10、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、30000、40000、50000个或更多个簇。在一些情况下，装置包含超过2,000、5,000、10,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,100,000、1,200,000、1,300,000、1,400,000、1,500,000、1,600,000、1,700,000、1,800,000、1,900,000、2,000,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000或10,000,000个或更多个不同的座位。在一些情况下，装置包含约10,000个不同的座位。单簇内的座位的量在不同情况下是不同的。在一些情况下，每个簇包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、130、150、200、300、400、500个或更多个座位。在一些情况下，每个簇包含约50-500个座位。在一些情况下，每个簇包含约100-200个座位。在一些情况下，每个簇包含约100-150个座位。在一些情况下，每个簇包含约109、121、130或137个座位。在一些情况下，每个簇包含约19、20、61、64个或更多个座位。

在装置上合成的不同寡核苷酸的数目可取决于基底中可用的不同座位的数目。在一些情况下，装置的簇内的座位密度为至少或大约1个座位/mm²、10个座位/mm²、25个座位/mm²、50个座位/mm²、65个座位/mm²、75个座位/mm²、100个座位/mm²、130个座位/mm²、150个座位/mm²、175个座位/mm²、200个座位/mm²、300个座位/mm²、400个座位/mm²、500个座位/mm²、1,000个座位/mm²或更大。在一些情况下，装置包含约10个座位/mm²至约500个座位/mm²、约25个座位/mm²至约400个座位/mm²、约50个座位/mm²至约500个座位/mm²、约100个座位/mm²至约500个座位/mm²、约150个座位/mm²至约500个座位/mm²、约10个座位/mm²至约250个座位/mm²、约50个座位/mm²至约250个座位/mm²、约10个座位/mm²至约200个座位/mm²或约50个座位/mm²至约200个座位/mm²。在一些情况下，簇内两个相邻座位中心的距离为约10um至约500um、约10um至约200um或约10um至约100um。在一些情况下，相邻座位的两个中心的距离为大于约10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um或100um。在一些情况下，两个相邻座位的中心的距离为小于约200um、150um、100um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um或10um。在一些情况下，每个座位具有约0.5um、1um、2um、3um、4um、5um、6um、7um、8um、9um、10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um或100um的宽度。在一些情况下，每个座位具有约0.5um至100um、约0.5um至50um、约10um至75um或约0.5um至50um的宽度。

在一些情况下，装置内的簇密度为至少或大约1个簇/100mm²、1个簇/10mm²、1个簇/5mm²、1个簇/4mm²、1个簇/3mm²、1个簇/2mm²、1个簇/1mm²、2个簇/1mm²、3个簇/1mm²、4个簇/1mm²、5个簇/1mm²、10个簇/1mm²、50个簇/1mm²或更大。在一些情况下，装置包含约1个簇/10mm²至约10个簇/1mm²。在一些情况下，两个相邻簇的中心的距离小于约50um、100um、200um、500um、1000um或2000um或5000um。在一些情况下，两个相邻簇的中心的距离为约50um至约100um、约50um至约200um、约50um至约300um、约50um至约500um和约100um至约2000um。在一些情况下，两个相邻簇的中心的距离为约0.05mm至约50mm、约0.05mm至约10mm、约0.05mm至约5mm、约0.05mm至约4mm、约0.05mm至约3mm、约0.05mm至约2mm、约0.1mm至10mm、约0.2mm至10mm、约0.3mm至约10mm、约0.4mm至约10mm、约0.5mm至10mm、约0.5mm至约5mm或约0.5mm至约2mm。在一些情况下，每个簇沿一个维度具有约0.5至2mm、约0.5至1mm或约1至2mm的直径或宽度。在一些情况下，每个簇沿一个维度具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mm的直径或宽度。在一些情况下，每个簇沿一个维度具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.15、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mm的内径或宽度。

与本文所述的装置、组合物、***和方法一起使用的用于寡核苷酸合成的结构包括多种大小。装置可以是大约标准96孔板的尺寸，例如约100至200mm乘以约50至150mm。在一些情况下，装置具有小于或等于约1000mm、500mm、450mm、400mm、300mm、250nm、200mm、150mm、100mm或50mm的直径。在一些情况下，装置的直径为约25mm至1000mm、约25mm至约800mm、约25mm至约600mm、约25mm至约500mm、约25mm至约400mm、约25mm至约300mm或约25mm至约200mm。装置尺寸的非限制性实例包括约300mm、200mm、150mm、130mm、100mm、76mm、51mm和25mm。在一些情况下，装置具有至少约100mm²、200mm²、500mm²、1,000mm²、2,000mm²、5,000mm²、10,000mm²、12,000mm²、15,000mm²、20,000mm²、30,000mm²、40,000mm²、50,000mm²或更大的平面表面积。在一些情况下，装置的厚度为约50mm至约2000mm、约50mm至约1000mm、约100mm至约1000mm、约200mm至约1000mm或约250mm至约1000mm。装置厚度的非限制性实例包括275mm、375mm、525mm、625mm、675mm、725mm、775mm和925mm。在一些情况下，装置的厚度随直径而变化，并取决于基底的组成。例如，包含硅之外的材料的装置具有与相同直径的硅装置不同的厚度。装置厚度可以取决于所用材料的机械强度，并且该装置必须厚到足以在操作期间支撑其自身重量而不会破裂。在一些情况下，结构包含多个本文所述的装置。

表面材料

本文提供了包含表面的装置，其中该表面被修饰用于支持在预定位置处的寡核苷酸合成，并且具有低错误率、低遗漏率、高产率和高寡核苷酸呈现。在一些实施方案中，本文提供的用于寡核苷酸合成的装置的表面由能够被修饰以支持从头寡核苷酸合成反应的多种材料制成。在一些情况下，该装置具有足够的导电性，例如，能够跨整个装置或其一部分形成均匀的电场。本文所述的装置可包含柔性材料。示例性柔性材料包括但不限于改性尼龙、未改性的尼龙、硝酸纤维素和聚丙烯。本文所述的装置可包含刚性材料。示例性刚性材料包括但不限于玻璃、熔融石英、硅、二氧化硅、氮化硅、塑料(例如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯，及其掺合物)和金属(例如，金、铂)。本文公开的装置可由包含硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃或其任意组合的材料制成。在一些情况下，本文公开的装置使用此处所列材料或本领域已知的其它任何合适材料的组合制成。

在一些情况下，本文公开的装置包含二氧化硅基质和氧化硅表面层。或者，该装置可以具有氧化硅基质。本文提供的装置的表面可以是纹理化的，导致用于寡核苷酸合成的总表面积增加。本文公开的装置可包含至少5％、10％、25％、50％、80％、90％、95％或99％的硅。本文公开的装置可以由绝缘体上硅(SOI)晶片制成。

本文提供的基底、装置和反应器由适用于本文所述的方法和组合物的各种材料制成。在某些情况下，装置材料被制造成展现出低水平的核苷酸结合。在一些情况下，修饰装置材料以生成展现出高水平核苷酸结合的不同表面。在一些情况下，装置材料对可见光和/或紫外线是透明的。在一些情况下，装置材料具有足够的导电性，例如能够跨整个基底或其一部分形成均匀的电场。在一些情况下，将导电材料连接到电接地。在一些情况下，该装置是导热的或隔热的。在一些情况下，该材料是耐化学品且耐热的，以支持化学或生化反应，例如寡核苷酸合成反应过程。在一些情况下，装置包含柔性材料。柔性材料包括但不限于改性尼龙、未改性的尼龙、硝酸纤维素、聚丙烯等。在一些情况下，装置包含刚性材料。刚性材料包括但不限于玻璃、熔融石英、硅、二氧化硅、氮化硅、塑料(例如，聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯，及其掺合物，等等)和金属(例如，金、铂等)。在一些情况下，装置由包含硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃或其任意组合的材料制成。在一些情况下，装置使用本文所列材料或本领域已知的其它任何合适材料的组合制成。

表面结构

本文提供了包含凸起和/或凹陷特征的装置。具有这类特征的一个益处是用来支持寡核苷酸合成的表面积增加。在一些情况下，具有凸起和/或凹陷特征的装置被称为三维基底。在一些情况下，三维装置包含一个或多个通道。在一些情况下，一个或多个座位包含通道。在一些情况下，通道可通过沉积装置如寡核苷酸合成仪进行试剂沉积。在一些情况下，试剂和/或流体收集在与一个或多个通道流体连通的较大的孔中。例如，装置包含对应于多个具有簇的座位的多个通道，并且所述多个通道与该簇的一个孔流体连通。在一些方法中，寡核苷酸文库在簇的多个座位中合成。

在一些情况下，所述结构被配置为允许用于表面上寡核苷酸合成的受控制的流动和质量传递路径。在一些情况下，装置的构造允许在寡核苷酸合成过程中质量传递路径、化学暴露次数和/或洗涤功效的受控且均匀的分布。在一些情况下，装置的构造允许增加扫描效率，例如通过提供足以用于增长寡核苷酸的体积，使得由增长的寡核苷酸所排除的体积占可用于或适合于增长寡核苷酸的初始可用体积的不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。在一些情况下，三维结构允许流体的受管控的流动，从而允许化学暴露的快速交换。

本文提供了合成1fM、5fM、10fM、25fM、50fM、75fM、100fM、200fM、300fM、400fM、500fM、600fM、700fM、800fM、900fM、1pM、5pM、10pM、25pM、50pM、75pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM、900pM或更多的量的DNA的方法。在一些情况下，寡核苷酸文库可跨越基因的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的长度。基因可以变化最多约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。

不同的寡核苷酸可以共同编码基因的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的序列。在一些情况下，寡核苷酸可以编码基因的50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的序列。在一些情况下，寡核苷酸可以编码基因的80％、85％、90％、95％或更多的序列。

在一些情况下，通过物理结构实现隔离。在一些情况下，通过表面的差异官能化以生成用于寡核苷酸合成的活化和钝化区域来实现隔离。差异官能化还可通过在整个装置表面上交替呈现疏水性，从而造成可引起沉积的试剂结珠或润湿的水接触角效应来实现。采用较大的结构可减少飞溅和邻近斑点的试剂对不同的寡核苷酸合成位置的交叉污染。在一些情况下，使用装置如寡核苷酸合成仪将试剂沉积到不同的寡核苷酸合成位置。具有三维特征的基底以允许以低错误率(例如，小于约1:500、1:1000、1:1500、1:2,000；1:3,000；1:5,000；或1:10,000)合成大量寡核苷酸(例如，超过约10,000个)的方式配置。在一些情况下，装置包含密度为大约或大于约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400或500个特征/mm²的特征。

装置的孔可具有与基底的另一个孔相同或不同的宽度、高度和/或容积。装置的通道可具有与基底的另一个通道相同或不同的宽度、高度和/或容积。在一些情况下，簇的宽度为约0.05mm至约50mm、约0.05mm至约10mm、约0.05mm至约5mm、约0.05mm至约4mm、约0.05mm至约3mm、约0.05mm至约2mm、约0.05mm至约1mm、约0.05mm至约0.5mm、约0.05mm至约0.1mm、约0.1mm至10mm、约0.2mm至约10mm、约0.3mm至约10mm、约0.4mm至约10mm、约0.5mm至约10mm、约0.5mm至约5mm或约0.5mm至约2mm。在一些情况下，包含簇的孔的宽度为约0.05mm至约50mm、约0.05mm至约10mm、约0.05mm至约5mm、约0.05mm至约4mm、约0.05mm至约3mm、约0.05mm至约2mm、约0.05mm至约1mm、约0.05mm至约0.5mm、约0.05mm至约0.1mm、约0.1mm至约10mm、约0.2mm至约10mm、约0.3mm至约10mm、约0.4mm至约10mm、约0.5mm至约10mm、约0.5mm至约5mm或约0.5mm至约2mm。在一些情况下，簇的宽度为小于或约5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm或0.05mm。在一些情况下，簇的宽度约为1.0至约1.3mm。在一些情况下，簇的宽度约为1.150mm。在一些情况下，孔的宽度为小于或约5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm或0.05mm。在一些情况下，孔的宽度约为1.0至约1.3mm。在一些情况下，孔的宽度约为1.150mm。在一些情况下，簇的宽度约为0.08mm。在一些情况下，孔的宽度约为0.08mm。簇的宽度可以指二维或三维基底内的簇。

在一些情况下，孔的高度为约20um至约1000um、约50um至约1000um、约100um至约1000um、约200um至约1000um、约300um至约1000um、约400um至约1000um或约500um至约1000um。在一些情况下，孔的高度小于约1000um、小于约900um、小于约800um、小于约700um或小于约600um。

在一些情况下，装置包含对应于簇内多个座位的多个通道，其中通道的高度或深度为约5um至约500um、约5um至约400um、约5um至约300um、约5um至约200um、约5um至约100um、约5um至约50um或约10um至约50um。在一些情况下，通道的高度小于100um、小于80um、小于60um、小于40um或小于20um。

在一些情况下，通道、座位(例如，在基本上为平面的基底中)或通道和座位两者(例如，在其中座位对应于通道的三维装置中)的直径为约1um至约1000um、约1um至约500um、约1um至约200um、约1um至约100um、约5um至约100um或约10um至约100um，例如约90um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um或10um。在一些情况下，通道、座位或通道和座位两者的直径小于约100um、90um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um或10um。在一些情况下，两个相邻通道、座位或通道和座位两者的中心的距离为约1um至约500um、约1um至约200um、约1um至约100um、约5um至约200um、约5um至约100um、约5um至约50um或约5um至约30um，例如约20um。

表面修饰

在各种情况下，采用表面修饰通过加成工艺或减成工艺对表面进行化学和/或物理改变，以改变装置表面或装置表面的选定位点或区域的一种或多种化学和/或物理性质。例如，表面修饰包括但不限于：(1)改变表面的润湿性质；(2)对表面进行官能化，即，提供、修改或取代表面官能团；(3)对表面进行去官能化，即，移除表面官能团；(4)以其它方式例如通过刻蚀来改变表面的化学组成；(5)增大或减小表面粗糙度；(6)在表面上提供涂层，例如，展现出与表面的润湿性质不同的润湿性质的涂层；和/或(7)在表面上沉积微粒。

在一些情况下，在表面顶部添加化学层(被称为粘附促进剂)有利于基底表面上的座位的结构化图案化。用于施加粘附促进剂的示例性表面包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅和氮化硅。在一些情况下，该粘附促进剂是具有高表面能的化学品。在一些情况下，在基底的表面上沉积第二化学层。在一些情况下，第二化学层具有低表面能。在一些情况下，涂覆在表面上的化学层的表面能支持小液滴在表面上的定位。根据所选择的图案化布置，座位的接近度和/或在座位处的流体接触面积是可改变的。

在一些情况下，(例如为了寡核苷酸合成)核酸或其它部分所沉积到的装置表面或解析座位是光滑的或基本上为平面的(例如，二维的)，或者具有不规则性，诸如凸起或凹陷特征(例如，三维特征)。在一些情况下，用一个或多个不同的化合物层来修饰装置表面。感兴趣的此类修饰层包括但不限于无机层和有机层，如金属、金属氧化物，聚合物、有机小分子等。非限制性聚合物层包括肽、蛋白质、核酸或其模拟物(例如，肽核酸等)、多糖、磷脂、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯胺、聚芳硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯，以及本文所述的或本领域已知的其它任何合适的化合物。在一些情况下，聚合物为杂聚物。在一些情况下，聚合物为均聚物。在一些情况下，聚合物包含官能部分或是缀合的。

在一些情况下，使用增大和/或减小表面能的一个或多个部分对装置的解析座位进行官能化。在一些情况下，部分是化学惰性的。在一些情况下，部分被配置为支持所需的化学反应，例如在寡核苷酸合成反应中的一个或多个过程。表面的表面能或疏水性是决定核苷酸附着到该表面上的亲和力的因素。在一些情况下，装置官能化方法可包括：(a)提供具有包含二氧化硅的表面的装置；和(b)使用本文所述的或本领域已知的合适的硅烷化剂(例如，有机官能烷氧基硅烷分子)对所述表面进行硅烷化。

在一些情况下，所述有机官能烷氧基硅烷分子包括二甲基氯-十八烷基-硅烷、甲基二氯-十八烷基-硅烷、三氯-十八烷基-硅烷、三甲基-十八烷基-硅烷、三乙基-十八烷基-硅烷或其任意组合。在一些情况下，装置表面用聚乙烯/聚丙烯来官能化(通过γ辐射或铬酸氧化并还原成羟烷基表面来官能化)、包含高度交联的聚苯乙烯-二乙烯基苯(通过氯甲基化来衍生化，并胺化成苄胺官能表面)、尼龙(末端氨基己基基团是直接反应性的)或以还原的聚四氟乙烯来刻蚀。在通过引用整体并入本文的美国专利5474796中描述了其它方法和官能化剂。

在一些情况下，装置表面通常经由存在于装置表面上的反应性亲水部分，在有效地将硅烷偶联至装置表面的反应条件下，使装置表面与含有硅烷混合物的衍生化组合物相接触来进行官能化。硅烷化一般通过使用有机官能烷氧基硅烷分子自装配来覆盖表面。

还可使用本领域当前已知的多种硅氧烷官能化试剂，例如用于降低或增大表面能。有机官能烷氧基硅烷可根据其有机官能来分类。

本文提供了可包含能够与核苷偶联的试剂的图案化的装置。在一些情况下，装置可以涂覆有活性剂。在一些情况下，装置可以涂覆有钝化剂。包含在本文所述的涂层材料中的示例性活性剂包括但不限于N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPS)、3-碘-丙基三甲氧基硅烷、丁基-醛-三甲氧基硅烷、二聚仲氨基烷基硅氧烷、(3-氨丙基)-二乙氧基-甲基硅烷、(3-氨丙基)二甲基-乙氧基硅烷和(3-氨丙基)-三甲氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)-二甲基-乙氧基硅烷、缩水甘油基氧基-三甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷，3-4环氧环己基-乙基三甲氧基硅烷以及(3-巯基丙基)-甲基-二甲氧基硅烷、烯丙基三氯氯硅烷、7-辛-1-烯基三氯氯硅烷或双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)胺。

包含在本文所述的涂层材料中的示例性钝化剂包括但不限于全氟辛基三氯硅烷；十三氟-1,1,2,2-四氢辛基三氯硅烷；1H,1H,2H,2H-氟辛基三乙氧基硅烷(FOS)；三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷；叔丁基-[5-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吲哚-1-基]-二甲基-硅烷；CYTOP^TM；Fluorinert^TM；全氟辛基三氯硅烷(PFOTCS)；全氟辛基二甲基氯硅烷(PFODCS)；全氟癸基三乙氧基硅烷(PFDTES)；五氟苯基-二甲基丙基氯-硅烷(PFPTES)；全氟辛基三乙氧基硅烷；全氟辛基三甲氧基硅烷；辛基氯硅烷；二甲基氯-十八烷基-硅烷；甲基二氯-十八烷基-硅烷；三氯-十八烷基-硅烷；三甲基-十八烷基-硅烷；三乙基-十八烷基-硅烷；或十八烷基三氯硅烷。

在一些情况下，官能化剂包括烃硅烷，如十八烷基三氯硅烷。在一些情况下，官能化剂包括11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、缩水甘油基氧基丙基/三甲氧基硅烷和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺。

寡核苷酸合成

用于寡核苷酸合成的本公开的方法可包括涉及亚磷酰胺化学法的过程。在一些情况下，寡核苷酸合成包括将碱基与亚磷酰胺偶联。寡核苷酸合成可包括通过在偶联条件下沉积亚磷酰胺来偶联碱基，其中相同的碱基任选地与亚磷酰胺沉积超过一次，即双偶联。寡核苷酸合成可包括未反应位点的加帽。在一些情况下，加帽是可选的。寡核苷酸合成还可包括氧化或氧化步骤或多个氧化步骤。寡核苷酸合成可包括解封闭、脱三苯甲基化和硫化。在一些情况下，寡核苷酸合成包括氧化或硫化。在一些情况下，在寡核苷酸合成反应期间的一个步骤或每个步骤之间，例如使用四唑或乙腈来洗涤所述装置。亚磷酰胺合成方法中任一步骤的时间范围可小于约2min、1min、50sec、40sec、30sec、20sec和10sec。

使用亚磷酰胺方法的寡核苷酸合成可包括随后将亚磷酰胺构件(例如，核苷亚磷酰胺)添加至增长的寡核苷酸链以形成亚磷酸三酯键。亚磷酰胺寡核苷酸合成沿3’至5’方向进行。亚磷酰胺寡核苷酸合成允许在每个合成循环中将一个核苷酸受控添加至增长的核酸链。在一些情况下，每个合成循环包括偶联步骤。亚磷酰胺偶联包括在活化的核苷亚磷酰胺与结合至基底的核苷之间(例如通过连接体)形成亚磷酸三酯键。在一些情况下，将核苷亚磷酰胺提供给活化的装置。在一些情况下，将核苷亚磷酰胺提供给具有活化剂的装置。在一些情况下，核苷亚磷酰胺以相对于与基底结合的核苷1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100倍或更多倍的过量来提供给装置。在一些情况下，核苷亚磷酰胺的添加在无水环境中(例如，在无水乙腈中)进行。添加核苷亚磷酰胺后，任选地洗涤该装置。在一些情况下，偶联步骤重复一次或额外多次，任选地在向基底添加核苷亚磷酰胺之间进行洗涤步骤。在一些情况下，本文使用的寡核苷酸合成方法包括1、2、3个或更多个连续的偶联步骤。在许多情况下，在偶联之前，与装置结合的核苷通过去除保护基团来脱保护，其中该保护基团起到防止聚合的作用。常见的保护基团为4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。

偶联后，亚磷酰胺寡核苷酸合成方法任选地包括加帽步骤。在加帽步骤中，用加帽剂处理增长的寡核苷酸。加帽步骤可用来在偶联后封闭未反应的与基底结合的5’-OH基团以防止进一步链延伸，从而防止形成具有内部碱基缺失的寡核苷酸。此外，用1H-四唑活化的亚磷酰胺可以在很小的程度上与鸟苷的O6位置反应。不受理论的束缚，在用I₂/水氧化后，该副产物(可能经由O6-N7迁移)可经历脱嘌呤。无嘌呤位点可终止在寡核苷酸的最终脱保护过程中被切割，从而降低全长产物的产率。O6修饰可通过在用I₂/水氧化之前用加帽试剂处理而去除。在一些情况下，与没有加帽的合成相比，在寡核苷酸合成过程中包括加帽步骤会降低错误率。作为实例，加帽步骤包括用乙酸酐和1-甲基咪唑的混合物处理与基底结合的寡核苷酸。在加帽步骤之后，任选地洗涤所述装置。

在一些情况下，在添加核苷亚磷酰胺之后，并且任选地在加帽和一个或多个洗涤步骤之后，对与装置结合的增长的寡核苷酸进行氧化。氧化步骤包括将亚磷酸三酯氧化成四配位的磷酸三酯——天然存在的磷酸二酯核苷间连接的受保护的前体。在一些情况下，增长的寡核苷酸的氧化通过任选地在弱碱(例如，吡啶、二甲基吡啶、三甲吡啶)的存在下用碘和水处理来实现。氧化可在无水条件下采用例如叔丁基过氧化氢或(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)-氧杂吖丙啶(CSO)进行。在一些方法中，在氧化之后进行加帽步骤。第二个加帽步骤允许装置干燥，因为可能持续存在的来自氧化的残余水可以抑制随后的偶联。氧化后，任选地洗涤装置和增长的寡核苷酸。在一些情况下，氧化步骤用硫化步骤来代替，以获得寡核苷酸硫代磷酸，其中任何加帽步骤均可在硫化之后进行。许多试剂能够进行有效的硫转移，包括但不限于3-(二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮、DDTT、3H-1,2-苯并二噻戊环-3-酮1,1-二氧化物(也被称为Beaucage试剂)和N,N,N'N'-四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)。

为了使后续核苷掺入循环通过偶联而发生，除去与装置结合的增长的寡核苷酸的受保护的5’末端，使得伯羟基与下一个核苷亚磷酰胺反应。在一些情况下，保护基团为DMT，并且用在二氯甲烷中的三氯乙酸进行解封闭。进行延长时间的脱三苯甲基化或者使用比推荐的酸溶液更强的酸溶液进行脱三苯甲基化可导致与固体支持物结合的寡核苷酸的脱嘌呤增加，并因此降低了所需全长产物的产率。本文所述的本公开的方法和组合物提供了受控的解封闭条件，从而限制不希望的脱嘌呤反应。在一些情况下，与装置结合的寡核苷酸在解封闭后洗涤。在一些情况下，解封闭后的有效洗涤有助于以低错误率合成寡核苷酸。

寡核苷酸合成方法一般包括一系列迭代的以下步骤：将受保护的单体施加至活化官能化的表面(例如，座位)以与活化的表面、连接体或与预先脱保护的单体连接；使所施加的单体脱保护，使其可与随后施加的受保护的单体反应；以及施加另一种受保护的单体以供连接。一个或多个中间步骤包括氧化或硫化。在一些情况下，在一个或全部步骤之前或之后有一个或多个洗涤步骤。

基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成方法包括一系列化学步骤。在一些情况下，合成方法的一个或多个步骤涉及试剂循环，其中该方法的一个或多个步骤包括向该装置施加对该步骤有用的试剂。例如，试剂通过一系列液相沉积和真空干燥步骤进行循环。对于包含诸如孔、微孔、通道等三维特征的基底，试剂任选地经由孔和/或通道穿过该装置的一个或多个区域。

本文所述的方法和***涉及用于合成寡核苷酸的寡核苷酸合成装置。该合成可以是平行的。例如，可以平行合成至少或大约至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、10000、50000、75000、100000个或更多个寡核苷酸。可以平行合成的寡核苷酸的总数可以是2-100000、3-50000、4-10000、5-1000、6-900、7-850、8-800、9-750、10-700、11-650、12-600、13-550、14-500、15-450、16-400、17-350、18-300、19-250、20-200、21-150、22-100、23-50、24-45、25-40、30-35个。本领域技术人员知晓，平行合成的寡核苷酸的总数可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-100。平行合成的寡核苷酸的总数可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。在装置内合成的寡核苷酸的总摩尔质量或每种寡核苷酸的摩尔质量可以是至少或至少约10、20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、25000、50000、75000、100000皮摩尔或更大。每种寡核苷酸的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可以是至少或大约至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、300、400、500个或更多个核苷酸。每种寡核苷酸的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可以是至多或大约至多500、400、300、200、150、100、50、45、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸。每种寡核苷酸的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可以处于10-500、9-400、11-300、12-200、13-150、14-100、15-50、16-45、17-40、18-35、19-25之间。本领域技术人员知晓，每种寡核苷酸的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如100-300。每种寡核苷酸的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。

本文提供的在表面上合成寡核苷酸的方法允许以较快的速度合成。作为实例，每小时合成至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、125、150、175、200个或更多个核苷酸。核苷酸包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿苷构件，或其类似物/修饰形式。在一些情况下，寡核苷酸文库在基底上平行合成。例如，包含大约或至少约100、1,000、10,000、30,000、75,000、100,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000或5,000,000个解析座位的装置能够支持合成至少相同数目的不同的寡核苷酸，其中编码不同序列的每个寡核苷酸在解析座位上合成。在一些情况下，在少于约三个月、两个月、一个月、三周、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、24小时或更短的时间内，以本文所述的低错误率在装置上合成寡核苷酸文库。在一些情况下，使用本文所述的基底和方法从以低错误率合成的寡核苷酸文库装配的较大核酸在少于约三个月、两个月、一个月、三周、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、24小时或更短的时间内制备。

在一些情况下，本文所述的方法提供了生成包含在多个密码子位点处不同的变异寡核苷酸的寡核苷酸文库。在一些情况下，寡核苷酸可具有1个位点、2个位点、3个位点、4个位点、5个位点、6个位点、7个位点、8个位点、9个位点、10个位点、11个位点、12个位点、13个位点、14个位点、15个位点、16个位点、17个位点、18个位点、19个位点、20个位点、30个位点、40个位点、50个位点或更多个变异密码子位点。

在一些情况下，变异密码子位点的一个或多个位点可以是相邻的。在一些情况下，变异密码子位点的一个或多个位点可以是不相邻的，并且由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个密码子隔开。

在一些情况下，寡核苷酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中所有变异密码子位点彼此相邻，形成一段变异密码子位点。在一些情况下，寡核苷酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中所述变异密码子位点彼此均不相邻。在一些情况下，寡核苷酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中一些变异密码子位点彼此相邻，形成一段变异密码子位点，而一些变异密码子位点彼此不相邻。

参见附图，图12示出了用于从较短寡核苷酸合成核酸(例如，基因)的示例性处理工作流程。该工作流程大致分为以下阶段：(1)从头合成单链寡核苷酸文库，(2)连接寡核苷酸以形成更大的片段，(3)错误校正，(4)质量控制，以及(5)运输。在从头合成之前，预先选择预期的核酸序列或一组核酸序列。例如，预先选择一组基因用于生成。

一旦选择用于生成的大寡核苷酸，则针对从头合成来设计预定的寡核苷酸文库。用于生成高密度寡核苷酸阵列的各种合适的方法是已知的。在该工作流程示例中，提供了装置表面层1201。在该示例中，改变表面的化学性质，以改进寡核苷酸合成过程。生成低表面能区域以排斥液体，同时生成高表面能区域以吸引液体。表面本身可以是平面表面的形式或者包含形状的变化，例如增加表面积的突起或微孔。在该工作流程示例中，如在通过引用整体并入本文的国际专利申请公开WO/2015/021080中所公开的，所选择的高表面能分子发挥支持DNA化学过程的双重功能。

寡核苷酸阵列的原位制备在固体支持物上进行，并利用单核苷酸延伸过程平行延伸多个寡聚物。材料沉积装置如寡核苷酸合成仪被设计为以逐步方式释放试剂，使得多个寡核苷酸平行地一次延伸一个残基，以生成具有预定核酸序列的寡聚物1202。在一些情况下，寡核苷酸在该阶段从表面上切下。切割包括例如采用氨或甲胺的气体切割。

将生成的寡核苷酸文库放置于反应室中。在该示例性工作流程中，反应室(也被称为“纳米反应器”)为硅涂覆的孔，其含有PCR试剂并下降到寡核苷酸文库1203上。在寡核苷酸密封1204之前或之后，添加试剂以从基底释放寡核苷酸。在该示例性工作流程中，寡核苷酸在纳米反应器密封1205之后释放。一旦释放，单链寡核苷酸的片段即发生杂交，以跨越整个长程DNA序列。部分杂交1205是可能的，因为每个合成的寡核苷酸被设计为具有与池中的至少一个其它寡核苷酸重叠的一小部分。

杂交后，开始PCA反应。在聚合酶循环过程中，寡核苷酸与互补片段退火，并且用聚合酶补平缺口。根据哪些寡核苷酸彼此发现，每个循环随机增加各个片段的长度。片段之间的互补性允许形成完整的大跨度的双链DNA 1206。

在PCA完成之后，将纳米反应器与装置分开1207，并定位成与具有PCR引物的装置相互作用1208。密封后，纳米反应器经历PCR1209并扩增较大的核酸。在PCR之后1210，打开纳米室1211，添加错误校正试剂1212，将腔室密封1213并进行错误校正反应，以从双链PCR扩增产物中去除具有较差互补性的错配碱基对和/或链1214。打开并分离纳米反应器1215。错误校正产物接下来经历另外的处理步骤，如PCR和分子条形码化，随后包装1222以供运输1223。

在一些情况下，采取质量控制措施。在错误校正之后，质量控制步骤包括例如与具有用于扩增错误校正产物的测序引物的晶片进行相互作用1216，将晶片密封到含有错误校正扩增产物的腔室中1217，并进行另一轮扩增1218。打开纳米反应器1219，合并产物1220并进行测序1221。在得到可接受的质量控制结果之后，包装的产物1222准许运输1223。

在一些情况下，通过诸如图12中的工作流程生成的核酸使用本文公开的重叠引物进行诱变。在一些情况下，通过在固体支持物上原位制备来生成引物文库，并利用单核苷酸延伸过程平行延伸多个寡聚物。沉积装置如寡核苷酸合成仪被设计为以逐步方式释放试剂，使得多个寡核苷酸平行地一次延伸一个残基，以生成具有预定核酸序列的寡聚物1202。

计算机***

本文所述的任何***均可以可操作地连接至计算机，并且可以本地或远程地通过计算机进行自动化。在各种情况下，本公开的方法和***可进一步包括计算机***上的软件程序及其使用。因此，对于分配/抽真空/再填充功能的同步(如编排和同步材料沉积装置运动、分配动作和真空致动)的计算机化控制处于本公开内容的范围内。计算机***可被编程为在用户指定的碱基序列与材料沉积装置的位置之间接合，以将正确的试剂递送至基底的指定区域。

图13中示出的计算机***1300可被理解为能够从介质1311和/或网络端口1305读取指令的逻辑设备，其可任选地连接至具有固定介质1312的服务器1309。诸如图13示出的***可包括CPU 1301、磁盘驱动器1303、可选的输入设备如键盘1315和/或鼠标1316以及可选的监视器1307。可通过示出的通信媒介实现与本地或远程位置处的服务器的数据通信。通信媒介可包括传输和/或接收数据的任何手段。例如，通信媒介可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接可提供经由万维网的通信。可以预期有关本公开的数据可经过这样的网络或连接而传输，以便由图13所示的用户方1322接收和/或审阅。

图14是示出可与本公开的示例实例结合使用的计算机***1400的第一示例架构的框图。如图14所示，该示例计算机***可包括用于处理指令的处理器1402。处理器的非限制性实例包括：Intel Xeon^TM处理器、AMD Opteron^TM处理器、Samsung 32-位RISC ARM1176JZ(F)-S v1.0^TM处理器、ARM Cortex-A8 Samsung S5PC100^TM处理器、ARM Cortex-A8Apple A4^TM处理器、Marvell PXA 930^TM处理器或功能上等效的处理器。多个执行线程可用于并行处理。在一些情况下，也可以使用多个处理器或具有多个核的处理器，无论是在单一计算机***中，在群集中，还是通过包含多个计算机、蜂窝电话和/或个人数据助理设备的网络跨***分布。

如图14所示，高速缓冲存储器1404可连接至或并入处理器1402，以提供由处理器1402新近或频繁使用的指令或数据的高速存储器。处理器1402通过处理器总线1408连接至北桥1406。北桥1406通过存储器总线1412连接至随机存取存储器(RAM)1410，并管理处理器1402对RAM 1410的访问。北桥1406还通过芯片集总线1416连接至南桥1414。南桥1414又连接至***总线1418。***总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其它***总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片集，并管理在处理器、RAM与***总线1418上的***组件之间的数据传送。在一些备选的架构中，北桥的功能性可以并入处理器中，而不是使用单独的北桥芯片。在一些情况下，***1400可包括附接至***总线1418的加速器卡1422。加速器可包括现场可编程门阵列(FPGA)或用于加速某个处理的其它硬件。例如，加速器可用于适应性数据重建或用来评价在扩展集处理中使用的代数表达式。

软件和数据存储在外部存储器1424中，并可加载至RAM 1410和/或高速缓冲存储器1404中，以供处理器使用。***1400包括用于管理***资源的操作***；操作***的非限制性实例包括：Linux、Windows^TM、MACOS^TM、BlackBerry OS^TM、iOS^TM和其它功能上等效的操作***，以及在操作***顶部运行的、用于根据本公开的示例实例管理数据存储和优化的应用软件。在该实例中，***1400还包括与***总线连接的网络接口卡(NIC)1420和1421，以提供与外部存储如网络附加存储(NAS)和可用于分布式并行处理的其它计算机***的网络接口。

图15是显示了具有多个计算机***1502a和1502b、多个蜂窝电话和个人数据助理1502c以及网络附加存储(NAS)1504a和1504b的网络1500的示图。在示例实例中，***1502a、1502b和1502c可管理数据存储并优化对存储在网络附加存储(NAS)1504a和1504b中的数据的数据访问。数学模型可用于该数据，并使用跨计算机***1502a和1502b和蜂窝电话以及个人数据助理***1502c的分布式并行处理进行评价。计算机***1502a和1502b和蜂窝电话以及个人数据助理***1502c也可提供对存储在网络附加存储(NAS)1504a和1504b中的数据的适应性数据重建的并行处理。图15仅示出了一个实例，而多种多样的其它计算机架构和***可与本公开的多个实例一起使用。例如，刀片式服务器可用来提供并行处理。处理器刀片可通过背板连接，以提供并行处理。存储还可通过单独的网络接口连接至背板或作为网络附加存储(NAS)。在一些示例实例中，处理器可维持单独的存储空间，并通过网络接口、背板或其它连接器传输数据以便由其它处理器并行处理。在其它情况下，部分或全部处理器可使用共享的虚拟地址存储空间。

图16是根据示例实例使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机***1600的框图。该***包括可访问共享的存储器子***1604的多个处理器1602a-f。该***中并入存储器子***1604中的多个可编程硬件存储算法处理器(MAP)1606a-f。MAP 1606a-f中的每一个可包括存储器1608a-f和一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)1610a-f。MAP提供可配置的功能单元，并且可向FPGA 1610a-f提供特定算法或算法的部分，以便与各自的处理器密切协调处理。例如，在示例实例中，MAP可用来评价与数据模型相关的代数表达式以及用来进行适应性数据重建。在该示例中，每个MAP可被用于这些目的的所有处理器全局访问。在一种配置中，每个MAP可使用直接存储器访问(DMA)来访问相关联的存储器1608a-f，使其独立于且异步于各自的微处理器1602a-f而执行任务。在这一配置中，MAP可将结果直接馈送至另一MAP以用于流水处理和并行执行算法。

以上计算机架构和***仅为实例，并且多种多样的其它计算机、蜂窝电话和个人数据助理架构和***可与示例实例结合使用，包括使用通用处理器、协处理器、FPGA和其它可编程逻辑设备、芯片上***(SOC)、专用集成电路(ASIC)和其它处理和逻辑元件的任何组合的***。在一些情况下，全部或部分计算机***可用软件或硬件来实现。任何种类的数据存储介质可与示例实例结合使用，包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、网络附加存储(NAS)和其它的本地或分布式数据存储设备和***。

在示例实例中，计算机***可使用在任何上述或其它计算机架构和***上执行的软件模块来实现。在其它实例中，该***的功能可部分或完全地在固件、可编程逻辑设备如图16提到的现场可编程门阵列(FPGA)、芯片上***(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其它处理和逻辑元件中实现。例如，集处理器(Set Processor)和优化器可通过使用硬件加速器卡如图14所示的加速器卡1422用硬件加速方式实现。

阐述以下实施例是为了向本领域技术人员更清楚地说明本文所公开的实施方案的原理和实践，而不应解释为限制任何请求保护的实施方案的范围。除非另有说明，否则所有份数和百分比均以重量计。

实施例

给出以下实施例是为了说明本公开的各个实施方案的目的，而不意味着以任何方式限制本公开内容。这些实施例以及目前代表优选实施方案的本文所述方法是示例性的，而非旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将会想到其变化以及包含在由权利要求的范围所限定的本公开的精神之内的其它用途。

实施例1：装置表面的官能化

将装置进行官能化以支持寡核苷酸文库的附着和合成。首先使用包含90％H₂SO₄和10％H₂O₂的水虎鱼溶液(piranha solution)将装置表面润湿清洗20分钟。将该装置在含有去离子水的数个烧杯中冲洗，在去离子水鹅颈旋塞下保持5min，并用N₂干燥。随后将该装置在NH₄OH(1:100；3mL:300mL)中浸泡5min，使用手持式喷枪(handgun)用去离子水冲洗，在连续三个含有去离子水的烧杯中各浸泡1min，然后再使用手持式喷枪用去离子水冲洗。然后通过将装置表面暴露于O₂来等离子体清洗该装置。使用SAMCO PC-300仪器在下游模式下以250瓦进行O₂等离子体蚀刻1min。

使用具有以下参数的YES-1224P气相沉积烘箱***，用包含N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺的溶液对清洁的装置表面进行活化官能化：0.5至1托，60min，70℃，135℃汽化器。使用Brewer Science 200X旋涂仪对装置表面进行抗蚀剂涂覆。将SPR^TM 3612光致抗蚀剂以2500rpm旋涂在装置上40sec。该装置在Brewer热板上以90℃预烘30min。使用Karl Suss MA6掩模对准仪对装置进行光刻。将该装置暴露2.2sec并在MSF 26A中显影1min。剩余的显影剂用手持式喷枪冲洗，并将装置在水中浸泡5min。该装置在烘箱中以100℃烘烤30min，随后使用Nikon L200目视检查光刻缺陷。采用残余去除工艺利用SAMCO PC-300仪器以250瓦进行O₂等离子体蚀刻1min来去除残余抗蚀剂。

用与10μL轻质矿物油混合的100μL全氟辛基三氯硅烷溶液对装置表面进行钝化官能化。将该装置放置于腔室中，泵送10min，随后关闭通往泵的阀门并静置10min。使该腔室排气。该装置通过在70℃下在500mL NMP中进行两次5min浸泡并同时以最大功率(在Crest***上的9)进行超声波处理来剥离抗蚀剂。然后将该装置在室温下在500mL异丙醇中浸泡5min，同时以最大功率进行超声波处理。将该装置浸入300mL的200标准酒精度(proof)的乙醇中并用N₂吹干。活化该官能化表面以充当寡核苷酸合成的支持物。

实施例2：在寡核苷酸合成装置上合成50-聚体序列

将二维寡核苷酸合成装置组装至流动池中，其与流动池(Applied Biosystems(ABI394 DNA合成仪")连接。该二维寡核苷酸合成装置用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(Gelest)均匀地官能化，并用来使用本文所述的寡核苷酸合成方法合成50bp的示例性寡核苷酸("50-聚体寡核苷酸”)。

所述50-聚体的序列如SEQ ID NO.:20所述。5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3'(SEQ ID NO.:20)，其中#表示胸苷-琥珀酰基己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)，它是允许在脱保护过程中从表面上释放寡核苷酸的可切割的连接体。

根据表5中的方案和ABI合成仪，使用标准DNA合成化学法(偶联、加帽、氧化和解封闭)完成合成。

表5：合成方案

亚磷酰胺/活化剂组合以类似于本体试剂通过流动池递送的方式进行递送。当在全部时间内保持环境被试剂“润湿”时，不进行干燥步骤。

从ABI 394合成仪中去除限流器，以使得能够更快速流动。在没有限流器的情况下，酰胺类(amidites)(在ACN中0.1M)、活化剂(在ACN中的0.25M苯甲酰基硫基四唑(“BTT”；来自GlenResearch的30-3070-xx))和Ox(在20％吡啶、10％水和70％THF中的0.02M I2)的流速大致为约100uL/sec，乙腈(“ACN”)和加帽试剂(帽A和帽B的1:1混合物，其中帽A是在THF/吡啶中的乙酸酐，帽B是在THF中的16％1-甲基咪唑(1-methylimidizole))的流速大致为约200uL/sec，而解封闭剂(在甲苯中的3％二氯乙酸)的流速大致为约300uL/sec(相比之下，在有限流器的情况下，所有试剂的流速均为约50uL/sec)。观测完全排出氧化剂的时间，相应地调节化学品流动时间的时间选择，并在不同的化学品之间引入额外的ACN洗涤。在寡核苷酸合成后，将芯片在75psi下在气态氨中脱保护过夜。将五滴水施加到表面上以回收寡核苷酸。然后在BioAnalyzer小RNA芯片上分析所回收的寡核苷酸(数据未示出)。

实施例3：在寡核苷酸合成装置上合成100-聚体序列

使用实施例2中描述的用于合成50-聚体序列的相同过程，在两个不同的硅芯片上合成100-聚体寡核苷酸(“100-聚体寡核苷酸”；5'CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3'，其中#表示胸苷-琥珀酰基己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)；SEQ ID NO.:21)，第一个用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺均匀地官能化，而第二个用11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷和正癸基三乙氧基硅烷的5/95混合物官能化，并在BioAnalyzer仪器上分析从表面提取的寡核苷酸(数据未示出)。

使用下列热循环程序，在50uL PCR混合物(25uL NEB Q5主混合物，2.5uL 10uM正向引物，2.5uL 10uM反向引物，1uL从表面提取的寡核苷酸，用水加至50uL)中使用正向引物(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'；SEQ ID NO.:22)和反向引物(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'；SEQ ID NO.:23)进一步PCR扩增来自两个芯片的全部十个样品：

98℃，30sec

98℃，10sec；63℃，10sec；72℃，10sec；重复12个循环

72℃，2min

PCR产物还在BioAnalyzer上运行(数据未示出)，在100-聚***置处显示出尖锐峰。然后，对PCR扩增的样品进行克隆，并进行Sanger测序。表6总结了从来自芯片1的斑点1-5采集的样品和从来自芯片2的斑点6-10采集的样品的Sanger测序结果。

表6：测序结果

斑点	错误率	循环效率
			1	1/763bp	99.87％
2	1/824bp	99.88％
			3	1/780bp	99.87％
4	1/429bp	99.77％
			5	1/1525bp	99.93％
6	1/1615bp	99.94％
			7	1/531bp	99.81％
8	1/1769bp	99.94％
			9	1/854bp	99.88％
10	1/1451bp	99.93％

因此，合成的寡核苷酸的高质量和均匀性在具有不同表面化学的两个芯片上重现。总体上，89％，相当于被测序的262个100-聚体中的233个，是没有错误的完美序列。

最后，表7总结了从来自斑点1-10的寡核苷酸样品中获得的序列的错误特征。

表7：错误特征

实施例4：通过单位点、单位置诱变生成核酸文库

从头合成寡核苷酸引物，以用于用来生成模板核酸的寡核苷酸变体文库的一系列PCR反应，参见图2A-2D。图2A中生成了四种类型的引物：外部5’引物215、外部3’引物230、内部5’引物225和内部3’引物220。内部5’引物/第一寡核苷酸220和内部3’引物/第二寡核苷酸225使用如表6中大体上概括的寡核苷酸合成方法生成。内部5’引物/第一寡核苷酸220代表一组至多19个具有预定序列的引物，其中该组中的每个引物在序列的单个位点上与另一个引物在单个密码子处不同。

在具有至少两个簇的装置上进行寡核苷酸合成，每个簇具有121个可单独寻址的座位。

内部5’引物225和内部3’引物220在单独的簇中合成。内部5’引物225复制121次，在单簇内的121个座位上延伸。对于内部3’引物220，变异序列的19个引物中的每一个在6个不同的座位上各自延伸，导致在114个不同座位上延伸114个寡核苷酸。

将合成的寡核苷酸从装置表面上切下并转移到塑料小瓶中。如图2B所示，使用长核酸序列235、240的片段进行第一PCR反应以扩增模板核酸。如图2C-2D所示，使用引物组合和第一PCR反应的产物作为模板进行第二PCR反应。第二PCR产物的分析在BioAnalyzer上进行，如图17的迹线所示。

实施例5：包含96个不同组的单位置变体的核酸文库的生成

大体上如图2A所示和实施例2中所提到的，使用从头寡核苷酸合成来生成四组引物。对于内部5’引物220，生成96个不同组的引物，每组引物靶向位于模板核酸的单个位点内的不同单个密码子。对于每组引物，生成19个不同的变体，每个变体在所述单个位点处包含编码不同氨基酸的密码子。大体上如图2A-2D所示和实施例2中所述，使用所生成的引物进行两轮PCR。96组扩增产物在电泳图(图18)中可视化，其用来计算100％扩增成功率。

实施例6：包含500个不同组的单位置变体的核酸文库的生成

大体上如图2A所示和实施例2中所提到的，使用从头寡核苷酸合成来生成四组引物。对于内部5’引物220，生成500个不同组的引物，每组引物靶向位于模板核酸的单个位点内的不同单个密码子。对于每组引物，生成19个不同的变体，每个变体在所述单个位点处包含编码不同氨基酸的密码子。大体上如图2A所示和实施例2中所述，使用所生成的引物进行两轮PCR。电泳图显示了500组PCR产物中的每一组具有在不同单个位点处具有19个变体的核酸群体(数据未示出)。对该文库的全面测序分析显示出在预选密码子突变中大于99％的成功率(序列追踪和分析数据未示出)。

实施例7：针对1个位置的单位点诱变引物

表8中提供了针对黄色荧光蛋白的密码子变异设计的实例。在这种情况下，来自50-聚体序列的单个密码子改变19次。变异核酸序列用粗体字母表示。野生型引物序列为：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCAT(SEQ ID NO.:1)。在这种情况下，野生型密码子编码缬氨酸，在SEQ ID NO.:1中用下划线表示。因此，以下19个变体不包括编码缬氨酸的密码子。在备选实例中，如果要考虑所有三联体，那么将生成全部60个变体，包括野生型密码子的备选序列。

表8.变异序列

实施例8：单位点、双位置核酸变体

在与实施例2中所述的条件类似的条件下进行从头寡核苷酸合成。生成装置上的单簇，其在单个位点处含有针对2个连续密码子位置的核酸的合成预定变体，每个位置存在编码氨基酸的密码子。在这种布置中，对于每个核酸有3次重复的2个位置，生成19个变体/每个位置，导致合成114个核酸。

实施例9：多位点、双位置核酸变体

在与实施例2中所述的条件类似的条件下进行从头寡核苷酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对2个非连续密码子位置的核酸的合成预定变体，每个位置存在编码氨基酸的密码子。在这种布置中，对于2个位置生成19个变体/每个位置。

实施例10：单段、三位置核酸变体

在与实施例2中所述的条件类似的条件下进行从头寡核苷酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对3个连续密码子位置的参考核酸的合成预定变体。在3个连续密码子位置的布置中，对于每个核酸有2次重复的3个位置，生成19个变体/每个位置，并导致合成114个核酸。

实施例11：多位点、三位置核酸变体

在与实施例2中所述的条件类似的条件下进行从头寡核苷酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对至少3个非连续密码子位置的参考核酸的合成预定变体。在预定的区域内，编码3个组氨酸残基的密码子的位置发生改变。

实施例12：多位点、多位置核酸变体

在与实施例2中所述的条件类似的条件下进行从头寡核苷酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对1个或多个区段中的1个或多个密码子位置的参考核酸的合成预定变体。该文库中的五个位置发生改变。第一个位置编码在表达的蛋白质中得到50/50的K/R比的密码子；第二个位置编码在表达的蛋白质中得到50/25/25的V/L/S比的密码子，第三个位置编码在表达的蛋白质中得到50/25/25的Y/R/D比的密码子，第四个位置编码在表达的蛋白质中对于所有氨基酸得到相等比例的密码子，而第五个位置编码在表达的蛋白质中得到75/25的G/P比的密码子。

实施例13：用于表达多样化肽的模块化质粒组件

如实施例4-6和8-12所述生成核酸文库，其编码在构成表达构建体盒的部分的每个单独区域的单个位点或多个位点处的密码子变异，如图11中所示。为了生成表达两个构建体的盒，合成编码第一启动子1110、第一开放阅读框1120、第一终止子1130、第二启动子1140、第二开放阅读框1150或第二终止子序列1160的变异序列的至少一部分的变异寡核苷酸。如前述实施例中所述，在数轮扩增后，生成了具有1,024个表达构建体的文库。

实施例14：多位点、单位置变体

如实施例4-6和8-12所述生成核酸文库，其编码在编码核酸至少一部分的区域中的单个位点或多个位点处的密码子变异。生成寡核苷酸变体文库，其中该文库由多位点、单位置变体组成。参见例如图6B。

实施例15：变体文库合成

在与实施例2中所述的条件类似的条件下进行从头寡核苷酸合成。从头合成至少30,000个不同的寡核苷酸，其中每个不同的寡核苷酸均编码氨基酸序列的不同密码子变体。所合成的至少30,000个不同寡核苷酸与所述至少30,000个不同寡核苷酸中的每一个的预定序列相比具有小于1/1000个碱基的总错误率。该文库用于长核酸的PCR诱变，并且形成至少30,000个不同的变异核酸。

实施例16：基于簇的变体文库合成

在与实施例2中所述的条件类似的条件下进行从头寡核苷酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对2个密码子位置的参考寡核苷酸的合成预定变体。在2个连续密码子位置的布置中，对于每个寡核苷酸有2次重复的2个位置，生成19个变体/每个位置，并导致合成38个寡核苷酸。每个变异序列的长度为40个碱基。在相同的簇中，生成另外的非变异寡核苷酸序列，其中所述另外的非变异寡核苷酸和变异寡核苷酸共同编码基因的编码序列的38个变体。每个寡核苷酸均具有至少一个与另一个寡核苷酸反向互补的区域。通过气态氨切割来释放该簇中的寡核苷酸。包含水的大头针(pin)与该簇接触，挑取寡核苷酸，并将寡核苷酸移动到小瓶中。该小瓶还含有用于聚合酶循环装配(PCA)反应的DNA聚合酶试剂。使寡核苷酸退火，通过延伸反应补平缺口，并形成所得到的双链DNA分子，从而形成变异核酸文库。任选地对变异核酸文库进行限制酶切割，然后将其连接到表达载体中。

实施例17：变异核酸文库的生成

如实施例8-16中所述，生成与参考序列相比在抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域中具有变异的CAR变体文库。备选地，还生成在CAR的所有结构域中均具有变异的CAR变体文库。针对已知的肿瘤抗原筛查CAR变体文库。鉴定导致T细胞活化和/或T细胞结合增加的变异序列。该肿瘤抗原可以在原代培养细胞、非原代培养细胞上或在非细胞设置下如在板、珠子、浆液或柱上表达。

实施例18：变异CAR文库的表达和筛查

将实施例17描述的变异CAR基因文库转移到哺乳动物细胞中以生成细胞群体文库，每个细胞群表达不同的CAR变异蛋白质。针对对肿瘤抗原如HER2或NY-ESO-1具有改善的亲和力(表位与抗体的抗原结合位点之间的相互作用强度的量度)的CAR复合物筛查蛋白质文库。还评估了其它功能考虑因素，如变异基因表达、亲合力(抗体-抗原复合物的总强度的量度)、稳定性和靶标特异性。

实施例19：工程化T细胞的制备和递送

从被诊断为患有癌症的受试者中收获T细胞，并用实施例18中进行分析后选择的CAR进行遗传工程化。在短期体外扩充并通过产物特定的合格标准后，将工程化T细胞施用于同一受试者。

实施例20：变异肽文库

如实施例4-6和8-12所述生成核酸文库，其编码针对常见肿瘤抗原的单位点或多位点处的密码子变异。如前述实施例中所述，在数轮扩增后，生成了对于每个抗原变体具有1,024个表达构建体的文库。将文库转移到哺乳动物细胞中以生成细胞群体文库，并针对结合亲和力和靶标特异性进行筛查。

实施例21：变异肽文库和CAR的变体文库

如实施例4-6和8-12所述生成核酸，其编码针对CAR的抗原识别域的单位点或多位点处的密码子变异。如实施例20所述生成核酸文库，其编码针对常见肿瘤抗原的单位点或多位点处的密码子变异。如前述实施例中所述，在数轮扩增后，生成了对于每个CAR变体和抗原变体具有1,024个表达构建体的文库。将文库转移到哺乳动物细胞中以生成细胞群体文库，并针对结合亲和力和靶标特异性进行筛查。

实施例22：变异CAR

如实施例4-6和8-12所述生成核酸文库，以生成编码变异CAR的核酸。在三个位点处生成变体，以生成包含约10³个变异CAR的文库。

根据变异CAR对肿瘤抗原的特异性，在体外针对肿瘤抗原筛选变异CAR。然后对肿瘤抗原高度特异性变异CAR进一步进行多样化(variegated)，以生成第二文库。第二文库包含位于CAR的铰链域、跨膜域或胞内域中的残基的变异。第二文库在细胞中表达，并在体外针对第二改善，例如亲合力、稳定性、亲和力或表达进行筛查。

选择在从第一和/或第二变体文库中筛选产物后具有所需特征的CAR基因或基因片段变体，以用于开发潜在治疗剂。

虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅通过示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下将会想到许多变化、改变和替代。应当理解，可在实施本公开时采用本文所述公开内容的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

序列表

<110> 特韦斯特生物科学公司

<120> 免疫突触的变体文库及其合成

<130> 44854-733.601

<140>

<141>

<150> 62/471,810

<151> 2017-03-15

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 2

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<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 3

atgttaagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 4

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<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 8

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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

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atggatagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 15

atggaaagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44

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<211> 44

<212> DNA

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 16

atgtgtagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44

<210> 17

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 17

atgtggagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 18

atgcgtagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 19

atgggtagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44

<210> 20

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 20

agacaatcaa ccatttgggg tggacagcct tgacctctag acttcggcat tttttttttt 60

tt 62

<210> 21

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 21

cgggatcctt atcgtcatcg tcgtacagat cccgacccat ttgctgtcca ccagtcatgc 60

tagccatacc atgatgatga tgatgatgag aaccccgcat tttttttttt tt 112

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 22

atgcggggtt ctcatcatc 19

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 23

cgggatcctt atcgtcatcg 20

<210> 24

<211> 600

<212> DNA

<213> 智人

<400> 24

atgaagtcag gcctctggta tttctttctc ttctgcttgc gcattaaagt tttaacagga 60

gaaatcaatg gttctgccaa ttatgagatg tttatatttc acaacggagg tgtacaaatt 120

ttatgcaaat atcctgacat tgtccagcaa tttaaaatgc agttgctgaa aggggggcaa 180

atactctgcg atctcactaa gacaaaagga agtggaaaca cagtgtccat taagagtctg 240

aaattctgcc attctcagtt atccaacaac agtgtctctt tttttctata caacttggac 300

cattctcatg ccaactatta cttctgcaac ctatcaattt ttgatcctcc tccttttaaa 360

gtaactctta caggaggata tttgcatatt tatgaatcac aactttgttg ccagctgaag 420

ttctggttac ccataggatg tgcagccttt gttgtagtct gcattttggg atgcatactt 480

atttgttggc ttacaaaaaa gaagtattca tccagtgtgc acgaccctaa cggtgaatac 540

atgttcatga gagcagtgaa cacagccaaa aaatctagac tcacagatgt gaccctataa 600

<210> 25

<211> 402

<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

atggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa agtatcaaag tacaatttac cgaatataag 60

aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac 120

aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc 180

caggaagtca acattagcct tcattaccag aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag 240

aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg gcctctctga cttacaaaga caaagtctac 300

ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg 360

attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc tgtgtccttt ga 402

<210> 26

<211> 768

<212> DNA

<213> 智人

<400> 26

atgggaaaca gctgttacaa catagtagcc actctgttgc tggtcctcaa ctttgagagg 60

acaagatcat tgcaggatcc ttgtagtaac tgcccagctg gtacattctg tgataataac 120

aggaatcaga tttgcagtcc ctgtcctcca aatagtttct ccagcgcagg tggacaaagg 180

acctgtgaca tatgcaggca gtgtaaaggt gttttcagga ccaggaagga gtgttcctcc 240

accagcaatg cagagtgtga ctgcactcca gggtttcact gcctgggggc aggatgcagc 300

atgtgtgaac aggattgtaa acaaggtcaa gaactgacaa aaaaaggttg taaagactgt 360

tgctttggga catttaacga tcagaaacgt ggcatctgtc gaccctggac aaactgttct 420

ttggatggaa agtctgtgct tgtgaatggg acgaaggaga gggacgtggt ctgtggacca 480

tctccagccg acctctctcc gggagcatcc tctgtgaccc cgcctgcccc tgcgagagag 540

ccaggacact ctccgcagat catctccttc tttcttgcgc tgacgtcgac tgcgttgctc 600

ttcctgctgt tcttcctcac gctccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaaactc 660

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 720

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgtga 768

<210> 27

<211> 783

<212> DNA

<213> 智人

<400> 27

atggcacggc cacatccctg gtggctgtgc gttctgggga ccctggtggg gctctcagct 60

actccagccc ccaagagctg cccagagagg cactactggg ctcagggaaa gctgtgctgc 120

cagatgtgtg agccaggaac attcctcgtg aaggactgtg accagcatag aaaggctgct 180

cagtgtgatc cttgcatacc gggggtctcc ttctctcctg accaccacac ccggccccac 240

tgtgagagct gtcggcactg taactctggt cttctcgttc gcaactgcac catcactgcc 300

aatgctgagt gtgcctgtcg caatggctgg cagtgcaggg acaaggagtg caccgagtgt 360

gatcctcttc caaacccttc gctgaccgct cggtcgtctc aggccctgag cccacaccct 420

cagcccaccc acttacctta tgtcagtgag atgctggagg ccaggacagc tgggcacatg 480

cagactctgg ctgacttcag gcagctgcct gcccggactc tctctaccca ctggccaccc 540

caaagatccc tgtgcagctc cgattttatt cgcatccttg tgatcttctc tggaatgttc 600

cttgttttca ccctggccgg ggccctgttc ctccatcaac gaaggaaata tagatcaaac 660

aaaggagaaa gtcctgtgga gcctgcagag ccttgtcgtt acagctgccc cagggaggag 720

gagggcagca ccatccccat ccaggaggat taccgaaaac cggagcctgc ctgctccccc 780

tga 783

<210> 28

<211> 708

<212> DNA

<213> 智人

<400> 28

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgagccagt tccgggtgtc gccgctggat cggacctgga acctgggcga gacagtggag 120

ctgaagtgcc aggtgctgct gtccaacccg acgtcgggct gctcgtggct cttccagccg 180

cgcggcgccg ccgccagtcc caccttcctc ctatacctct cccaaaacaa gcccaaggcg 240

gccgaggggc tggacaccca gcggttctcg ggcaagaggt tgggggacac cttcgtcctc 300

accctgagcg acttccgccg agagaacgag ggctactatt tctgctcggc cctgagcaac 360

tccatcatgt acttcagcca cttcgtgccg gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg 420

ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 480

ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 540

tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 600

gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac cgaagacgtg tttgcaaatg tccccggcct 660

gtggtcaaat cgggagacaa gcccagcctt tcggcgagat acgtctaa 708

<210> 29

<211> 282

<212> DNA

<213> 智人

<400> 29

atgatccatc tgggtcacat cctcttcctg cttttgctcc cagtggctgc agctcagacg 60

actccaggag agagatcatc actccctgcc ttttaccctg gcacttcagg ctcttgttcc 120

ggatgtgggt ccctctctct gccgctcctg gcaggcctcg tggctgctga tgcggtggca 180

tcgctgctca tcgtgggggc ggtgttcctg tgcgcacgcc cacgccgcag ccccgcccaa 240

gaagatggca aagtctacat caacatgcca ggcaggggct ga 282

<210> 30

<211> 549

<212> DNA

<213> 智人

<400> 30

atggaacagg ggaagggcct ggctgtcctc atcctggcta tcattcttct tcaaggtact 60

ttggcccagt caatcaaagg aaaccacttg gttaaggtgt atgactatca agaagatggt 120

tcggtacttc tgacttgtga tgcagaagcc aaaaatatca catggtttaa agatgggaag 180

atgatcggct tcctaactga agataaaaaa aaatggaatc tgggaagtaa tgccaaggac 240

cctcgaggga tgtatcagtg taaaggatca cagaacaagt caaaaccact ccaagtgtat 300

tacagaatgt gtcagaactg cattgaacta aatgcagcca ccatatctgg ctttctcttt 360

gctgaaatcg tcagcatttt cgtccttgct gttggggtct acttcattgc tggacaggat 420

ggagttcgcc agtcgagagc ttcagacaag cagactctgt tgcccaatga ccagctctac 480

cagcccctca aggatcgaga agatgaccag tacagccacc ttcaaggaaa ccagttgagg 540

aggaattga 549

<210> 31

<211> 624

<212> DNA

<213> 智人

<400> 31

atgcagtcgg gcactcactg gagagttctg ggcctctgcc tcttatcagt tggcgtttgg 60

gggcaagatg gtaatgaaga aatgggtggt attacacaga caccatataa agtctccatc 120

tctggaacca cagtaatatt gacatgccct cagtatcctg gatctgaaat actatggcaa 180

cacaatgata aaaacatagg cggtgatgag gatgataaaa acataggcag tgatgaggat 240

cacctgtcac tgaaggaatt ttcagaattg gagcaaagtg gttattatgt ctgctacccc 300

agaggaagca aaccagaaga tgcgaacttt tatctctacc tgagggcaag agtgtgtgag 360

aactgcatgg agatggatgt gatgtcggtg gccacaattg tcatagtgga catctgcatc 420

actgggggct tgctgctgct ggtttactac tggagcaaga atagaaaggc caaggccaag 480

cctgtgacac gaggagcggg tgctggcggc aggcaaaggg gacaaaacaa ggagaggcca 540

ccacctgttc ccaacccaga ctatgagccc atccggaaag gccagcggga cctgtattct 600

ggcctgaatc agagacgcat ctga 624

<210> 32

<211> 681

<212> DNA

<213> 智人

<400> 32

atgcctgggg gtccaggagt cctccaagct ctgcctgcca ccatcttcct cctcttcctg 60

ctgtctgctg tctacctggg ccctgggtgc caggccctgt ggatgcacaa ggtcccagca 120

tcattgatgg tgagcctggg ggaagacgcc cacttccaat gcccgcacaa tagcagcaac 180

aacgccaacg tcacctggtg gcgcgtcctc catggcaact acacgtggcc ccctgagttc 240

ttgggcccgg gcgaggaccc caatggtacg ctgatcatcc agaatgtgaa caagagccat 300

gggggcatat acgtgtgccg ggtccaggag ggcaacgagt cataccagca gtcctgcggc 360

acctacctcc gcgtgcgcca gccgcccccc aggcccttcc tggacatggg ggagggcacc 420

aagaaccgaa tcatcacagc cgaggggatc atcctcctgt tctgcgcggt ggtgcctggg 480

acgctgctgc tgttcaggaa acgatggcag aacgagaagc tcgggttgga tgccggggat 540

gaatatgaag atgaaaacct ttatgaaggc ctgaacctgg acgactgctc catgtatgag 600

gacatctccc ggggcctcca gggcacctac caggatgtgg gcagcctcaa cataggagat 660

gtccagctgg agaagccgtg a 681

<210> 33

<211> 1280

<212> DNA

<213> 智人

<400> 33

aggggacagg ctgcagccgg tgcagttaca cgttttcctc caaggagcct cggacgttgt 60

cacgggtttg gggtcgggga cagagcggtg accatggcca ggctggcgtt gtctcctgtg 120

cccagccact ggatggtggc gttgctgctg ctgctctcag ctgagccagt accagcagcc 180

agatcggagg accggtaccg gaatcccaaa ggtagtgctt gttcgcggat ctggcagagc 240

ccacgtttca tagccaggaa acggggcttc acggtgaaaa tgcactgcta catgaacagc 300

gcctccggca atgtgagctg gctctggaag caggagatgg acgagaatcc ccagcagctg 360

aagctggaaa agggccgcat ggaagagtcc cagaacgaat ctctcgccac cctcaccatc 420

caaggcatcc ggtttgagga caatggcatc tacttctgtc agcagaagtg caacaacacc 480

tcggaggtct accagggctg cggcacagag ctgcgagtca tgggattcag caccttggca 540

cagctgaagc agaggaacac gctgaaggat ggtatcatca tgatccagac gctgctgatc 600

atcctcttca tcatcgtgcc tatcttcctg ctgctggaca aggatgacag caaggctggc 660

atggaggaag atcacaccta cgagggcctg gacattgacc agacagccac ctatgaggac 720

atagtgacgc tgcggacagg ggaagtgaag tggtctgtag gtgagcaccc aggccaggag 780

tgagagccag gtcgccccat gacctgggtg caggctccct ggcctcagtg actgcttcgg 840

agctgcctgg ctcatggccc aacccctttc ctggaccccc cagctggcct ctgaagctgg 900

cccaccagag ctgccatttg tctccagccc ctggtcccca gctcttgcca aagggcctgg 960

agtagaagga caacagggca gcaacttgga gggagttctc tggggatgga cgggacccag 1020

ccttctgggg gtgctatgag gtgatccgtc cccacacatg ggatggggga ggcagagact 1080

ggtccagagc ccgcaaatgg actcggagcc gagggcctcc cagcagagct tgggaagggc 1140

catggaccca actgggcccc agaagagcca caggaacatc attcctctcc cgcaaccact 1200

cccaccccag ggaggccctg gcctccagtg ccttcccccg tggaataaac ggtgtgtcct 1260

gagaaaccac acaaaaaaaa 1280

<210> 34

<211> 495

<212> DNA

<213> 智人

<400> 34

atgaagtgga aggcgctttt caccgcggcc atcctgcagg cacagttgcc gattacagag 60

gcacagagct ttggcctgct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 120

atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 180

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 240

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 300

cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 360

gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 420

ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 480

ctgccccctc gctaa 495

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

Arg Pro Lys Ser Asn Ile Val Leu Leu

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val

1 5

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 39

Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 40

Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Ser Ile

1 5

<210> 41

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成6xHis标签

<400> 41

His His His His His His

1 5

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 42

Ala Trp Ile Lys Arg Glu Gln

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 任意氨基酸

<400> 43

Xaa Trp Ile Lys Arg Glu Gln

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> 任意氨基酸

<400> 44

Ala Xaa Ile Lys Arg Glu Gln

1 5

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> 任意氨基酸

<400> 45

Ala Trp Xaa Lys Arg Glu Gln

1 5

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> 任意氨基酸

<400> 46

Ala Trp Ile Xaa Arg Glu Gln

1 5

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任意氨基酸

<400> 47

Ala Trp Ile Lys Xaa Glu Gln

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> 任意氨基酸

<400> 48

Ala Trp Ile Lys Arg Xaa Gln

1 5

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任意氨基酸

<400> 49

Ala Trp Ile Lys Arg Glu Xaa

1 5

Claims (37)

1.一种核酸文库，所述核酸文库包含至少10,000个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域。

2.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述嵌合抗原受体的功能域包括抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。

3.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述文库包含至少1,000,000个核酸。

4.根据权利要求1所述的核酸文库，其中每个核酸的长度为100个碱基至2000个碱基。

5.根据权利要求1所述的核酸文库，其中每个核酸均附接至载体序列。

6.根据权利要求5所述的核酸文库，其中所述载体序列是病毒载体序列。

7.一种核酸文库，所述核酸文库包含多个核酸，其中每个核酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体或其功能域，其中所述多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异，并且其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。

8.根据权利要求7所述的核酸文库，其中所述嵌合抗原受体的功能域包括抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域。

9.根据权利要求7所述的核酸文库，其中所述多个核酸包含所述参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。

10.根据权利要求7所述的核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。

11.根据权利要求7所述的核酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。

12.根据权利要求7所述的核酸文库，其中每个核酸的长度为100个碱基至2000个碱基。

13.一种寡核苷酸文库，所述寡核苷酸文库包含至少10,000个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的区域，其中所述区域包含抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的一部分。

14.根据权利要求13所述的寡核苷酸文库，其中所述文库包含至少1,000,000个寡核苷酸。

15.根据权利要求13所述的寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸的长度为12至500个碱基。

16.根据权利要求13所述的寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸均附接至载体序列。

17.一种寡核苷酸文库，所述寡核苷酸文库包含多个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸编码参考序列的预选变体，该参考序列编码嵌合抗原受体的区域，其中所述区域包含抗原识别域、铰链域、跨膜域或胞内域的一部分，其中每个寡核苷酸的长度为至少12个碱基，其中所述多个寡核苷酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异，并且其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。

18.根据权利要求17所述的寡核苷酸文库，其中所述多个寡核苷酸包含2、3、4或5个位置的所有变异。

19.根据权利要求17所述的寡核苷酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。

20.根据权利要求17所述的寡核苷酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。

21.根据权利要求17所述的寡核苷酸文库，其中每个寡核苷酸的长度为12至500个碱基。

22.一种包含至少400个核酸的核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸编码参考序列的变体，该参考序列编码抗原识别域，并且其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸编码参考序列的变体，该参考序列编码嵌合抗原受体(CAR)的铰链域、跨膜域或胞内域。

23.根据权利要求22所述的核酸文库，其中每个核酸的长度为至少100个碱基。

24.根据权利要求22所述的核酸文库，其中每个核酸的长度为100至2000个碱基。

25.根据权利要求22所述的核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异。

26.根据权利要求22所述的核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第一多个核酸包含所述参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。

27.根据权利要求22所述的核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸包含所述参考序列中的至少两个位置的所有变异。

28.根据权利要求22所述的核酸文库，其中所述至少400个核酸中的第二多个核酸包含所述参考序列中的2、3、4或5个位置的所有变异。

29.根据权利要求25所述的核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自5至20个不同密码子的序列。

30.根据权利要求25所述的核酸文库，其中所述至少两个位置编码来自10至20个不同密码子的序列。

31.根据权利要求25所述的核酸文库，其中所述至少两个位置编码约10个不同密码子的序列。

32.一种合成核酸文库的方法，其包括：

a.提供编码嵌合抗原受体基因或基因片段的至少400个序列的第一组预选寡核苷酸序列，其中每个序列包含抗原识别域中氨基酸残基的至少两个预选密码子的至少一个变异；

b.合成所述第一组预选寡核苷酸序列；以及

c.筛选由所述第一组寡核苷酸序列编码的蛋白质的第一活性，其中所述第一活性是特异性、亲合力、亲和力、稳定性或表达。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗原是癌抗原。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌抗原是MAGE A3、MAGE A12、MAGE A2、MAGEA6、NY-ESO-1或CEA。

35.根据权利要求32所述的方法，其中每个序列在所述抗原识别域中氨基酸残基的预选密码子处包含至多100个变异。

36.根据权利要求32所述的方法，其中每个序列在所述抗原识别域中氨基酸残基的预选密码子处包含至多30个变异。

37.根据权利要求32所述的方法，其进一步包括：

a.提供编码嵌合抗原受体基因或基因片段的至少一个序列的第二组预选寡核苷酸序列，其中每个序列在所述嵌合抗原受体中铰链域、跨膜域或胞内域中的氨基酸残基的预选密码子处包含至少一个变异；

b.合成所述第二组预选寡核苷酸序列；以及

c.筛选由所述第二组寡核苷酸序列编码的蛋白质的第二活性，其中所述第二活性是特异性、亲合力、亲和力、稳定性或表达，并且其中所述第二活性与所述第一活性不同。

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