JP2007304340A - レーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】観察用レーザ光に合波される操作用レーザ光の数が増加しても、蛍光のロスを低減して明るい蛍光画像を取得する。
【解決手段】観察用レーザ光源７と、操作用レーザ光源１１と、複数の操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を合波する操作用レーザ光合波手段１５と、観察用レーザ光Ｌ_１を走査する走査手段８と、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の配置を調節するレーザ光位置調節手段１３，１４と、走査された観察用レーザ光Ｌ_１と、位置調節された操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３とを合波する合波手段４と、合波されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２，Ｌ_３を集光して標本Ｐに照射し、発生した蛍光Ｆを集光する対物レンズ５と、集光された蛍光Ｆを検出する光検出器６とを備え、操作用レーザ光合波手段１５が、合波手段４による観察用レーザ光Ｌ_１との合波前に、複数の操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を合波する位置に配置されているレーザ走査型顕微鏡１を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関し、特に、観察用レーザ光と操作用レーザ光とを合波して同一の対物レンズにより標本に照射するレーザ走査型顕微鏡に関するものである。

従来、観察用レーザ光源と操作用レーザ光源とを備え、観察用レーザ光および操作用レーザ光を別個の走査手段により標本上で２次元的に走査するレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このレーザ走査型顕微鏡においては、観察用レーザ光および操作用レーザ光が合波された後、同一の対物レンズによって標本上に集光されるようになっている。
特開２００２−８２２８７号公報

しかしながら、標本において発生した蛍光は観察用レーザ光の光路を走査手段を経由して戻った後に観察用レーザ光から分岐されるため、観察用レーザ光に操作用レーザ光を合波する合波手段を通過する際に蛍光が失われる。特に、操作用レーザ光の数が増加していくと、蛍光のロスが大きくなり、明るい蛍光画像を得ることができないという不都合が考えられる。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、観察用レーザ光に合波される操作用レーザ光の数が増加しても、蛍光のロスを低減して明るい蛍光画像を取得することができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、標本を操作するための複数の操作用レーザ光を発する操作用レーザ光源と、該操作用レーザ光源から発せられた複数の操作用レーザ光を合波する操作用レーザ光合波手段と、観察用レーザ光を２次元的に走査する走査手段と、操作用レーザ光の２次元的な配置を調節するレーザ光位置調節手段と、走査手段により走査された観察用レーザ光と、レーザ光位置調節手段により位置調節された操作用レーザ光とを合波する合波手段と、該合波手段により合波された観察用レーザ光および操作用レーザ光を集光して標本に照射する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器とを備え、前記操作用レーザ光合波手段が、前記合波手段による観察用レーザ光との合波前に、前記複数の操作用レーザ光を合波する位置に配置されているレーザ走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、観察用レーザ光源から発せられた観察用レーザ光が、走査手段により２次元的に走査され、対物レンズによって標本上に集光される。一方、操作用レーザ光源から発せられた操作用レーザ光は、レーザ光位置調節手段の作動により２次元的な配置を調節された後、合波手段の作動により観察用レーザ光と合波され、対物レンズにより標本上に集光される。

観察用レーザ光は、標本に集光されることにより、標本内の蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。発生した蛍光は、対物レンズ、合波手段、走査手段を介して戻り、光検出器により検出される。走査手段による標本上の操作位置情報および光検出器により検出された蛍光の光量情報に基づいて、蛍光画像が構築される。

一方、操作用レーザ光は、対物レンズにより標本に集光されることにより、標本に対し、光刺激、レーザトラップ等の操作を行う。本発明によれば、複数の操作用レーザ光が標本に入射されるので、標本に対し、複数箇所の光刺激やレーザトラップを行うことができる。

この場合において、操作用レーザ光源から発せられた複数の操作用レーザ光は、操作用レーザ光合波手段により合波された後に、合波手段により観察用レーザ光と合波される。したがって、蛍光が辿ることとなる観察用レーザ光の光路上に、複数の操作用レーザ光を合波するための合波手段が配置されず、操作用レーザ光の数が増加しても、蛍光のロスを低く抑えて明るい蛍光画像を取得することが可能となる。

上記発明においては、前記複数の操作用レーザ光が、相互に直交する偏光方向を備え、前記操作用レーザ光合波手段が、偏光ビームスプリッタにより構成されていることが好ましい。
このように構成することで、複数の操作用レーザ光を効率よく合波することができる。

また、上記発明においては、前記操作用レーザ光源からの操作用レーザ光を複数に分岐する分岐手段と、分岐された複数の操作用レーザ光の偏光方向を相互に直交させるλ／２板とを備えることが好ましい。
このようにすることで、単一の操作用レーザ光源から複数の操作用レーザ光を得ることができ、また、複数の操作用レーザ光を効率よく合波できる。したがって、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
また、上記発明においては、前記複数の操作用レーザ光のそれぞれの光路に、標本における集光位置を光軸方向に変化させる操作用レーザ光集光位置調整手段が備えられていることとしてもよい。

本発明によれば、観察用レーザ光に合波される操作用レーザ光の数が増加しても、蛍光のロスを低減して明るい蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図１〜図７を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、レーザ走査型共焦点顕微鏡である。図１中、各種レンズおよびピンホール等の光学部品は、説明の簡略化のために省略している。

本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、観察用レーザ光Ｌ_１を発生する観察用レーザ光発生部２と、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を発生する操作用レーザ光発生部３と、観察用レーザ光Ｌ_１および操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を合波する第１の合波手段４と、合波された観察用レーザ光Ｌ_１および操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を集光して標本Ｐに照射する一方、観察用レーザ光Ｌ_１を標本Ｐに照射することにより、標本Ｐ内の蛍光物質が励起されて発生した蛍光Ｆを集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光された蛍光Ｆを検出する光検出器６とを備えている。

観察用レーザ光発生部２は、観察用レーザ光Ｌ_１を出射する観察用レーザ光源７と、該観察用レーザ光源７から発せられた観察用レーザ光Ｌ_１を光軸に交差する方向に２次元的に走査する第１のスキャナ（走査手段）８とを備えている。符号９はミラーである。
また、観察用レーザ光発生部２の観察用レーザ光源７と第１のスキャナ８との間には、標本Ｐにおいて発生し、対物レンズ５により集光され、合波手段４、ミラー９および第１のスキャナ８を経由して戻る蛍光Ｆを観察用レーザ光Ｌ_１から分岐して光検出器６に向かわせるダイクロイックミラー１０が備えられている。

操作用レーザ光発生部３は、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を出射する操作用レーザ光源１１と、該操作用レーザ光源１１から発せられた操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を分岐するハーフミラー（分岐手段）１２と、分岐された２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３をそれぞれ光軸に交差する方向に２次元的に位置調節する第２のスキャナ（レーザ光位置調節手段）１３，１４と、第２のスキャナ１３，１４によりそれぞれ位置調節された２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を合波する第２の合波手段（操作用レーザ光合波手段）１５とを備えている。符号１６はミラーである。

また、操作用レーザ光発生部３には、ハーフミラー１２により分岐された一方の操作用レーザ光Ｌ_３の偏光方向を９０°回転させるλ／２板１７と、標本Ｐ上における操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の合焦位置を調節する合焦位置調節手段（操作用レーザ光集光位置調整手段）１８，１９とが備えられている。該合焦位置調節手段１８，１９は、波面変換素子あるいは少なくとも一部が光軸方向に移動可能に支持された複数のレンズ群（図示略）により構成されている。

また、前記第２の合波手段１５は、偏光ビームスプリッタにより構成されている。また、ハーフミラー１２により分岐された２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の光路には、それぞれ、後述する制御装置２０により開閉制御されるシャッタ２１，２２が設けられている。
シャッタ２１，２２に代えて、ＡＯＴＦやＡＯＭのような音響光学素子を用いてもよい。
操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３は、標本Ｐに結合されたアクチンまたはミオシンの位置に合焦されることにより、標本Ｐを保持する光ピンセットとして利用されるようになっている。

また、前記対物レンズ５は、該対物レンズ５を光軸方向に沿って移動させる合焦機構２３により支持されている。
合焦機構２３および合焦位置調節手段１８，１９は、制御装置２０に接続されている。制御装置２０は、合焦機構２３による対物レンズ５の移動量と合焦位置調節手段１８，１９による２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の合焦位置の移動量との関係を記憶している。

制御装置２０は、観察用レーザ光Ｌ_１および操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３をいずれも照射している観察モードにおいては、合焦機構２３と合焦位置調節手段１８，１９を連動して作動させ、対物レンズ５の移動方向とは逆方向に同じ距離だけ２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の合焦位置を移動させるようになっている。

また、制御装置２０は、観察用レーザ光Ｌ_１のみを照射し、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を停止している準備モードにおいては、観察用レーザ光Ｌ_１の合焦位置と、停止されている操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の合焦位置（操作用レーザ光が出射されたならば達成される合焦位置）とを一致させた状態で、合焦機構２３と合焦位置調節手段１８，１９との連動を停止するようになっている。
これにより、準備モードにおいては、合焦機構２３を作動させて対物レンズ５を光軸方向に移動させると、観察用レーザ光Ｌ_１のみならず停止されている操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の合焦位置が対物レンズ５とともに光軸方向に移動させられるようになっている。

また、制御装置２０には、前記光検出器６、第１、第２のスキャナ８，１３、モニタ２４およびマウス２５が接続されている。
制御装置２０は、第１のスキャナ８による観察用レーザ光Ｌ_１の標本Ｐ上における走査位置情報と、光検出器６により検出された蛍光Ｆの光強度情報とに基づいて、２次元的な蛍光画像を構築し、モニタ２４に表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の作用について、図２〜図８を参照しながら以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１を用いて、標本Ｐ、例えば、シャーレ２６内に貯留された培地２７内に浮遊する細胞を観察する場合には、図２に示されるように、標本Ｐの端点Ａ，Ｂにアクチンまたはミオシンを結合しておき（図８のステップＳ１）、制御装置２０を準備モードに切り替える（図８のステップＳ２）。

これにより、図２に示されるように、観察用レーザ光発生部２からの観察用レーザ光Ｌ_１のみが標本Ｐに照射され、２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３は停止される。操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の停止は、操作用レーザ光源１１のオフまたはシャッタ２１，２２の閉鎖あるいは音響光学素子のオフにより行う。ここでは、シャッタ２１，２２の閉鎖により行うこととして説明する。

操作者は、合焦機構２３を作動させて、例えば、標本Ｐの最上位近傍に観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰが配置されるように対物レンズ５を移動し、第１のスキャナ８を作動させる。これにより、観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰにおける標本Ｐの蛍光画像が取得される（図８のステップＳ３）。図２に示す例では、標本Ｐの端点Ａが最上位位置であるため、端点Ａを含む最上位位置の断面の蛍光画像が取得される。

操作者は、取得された蛍光画像をモニタ２４上で確認しながら、このモニタ２４条の蛍光画像に対して端点Ａをマウス２５等の入力手段により指示する（図８のステップＳ４）。これにより、一方の操作用レーザ光Ｌ_２による光ピンセットの把持位置が指定されるので、制御装置２０は、第２のスキャナ１３を作動させて、一方の操作用レーザ光Ｌ_２の照射位置を指定された端点Ａに一致するように２次元的に位置調整した後（図８のステップＳ５）、当該一方の操作用レーザ光Ｌ_２の光路上のシャッタ２１を開放し、操作用レーザ光Ｌ_２を標本Ｐに照射する。

準備モードにおいては、停止されていた操作用レーザ光Ｌ_２の合焦位置が観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰと一致した状態に維持されているので、シャッタ２１の開放により照射された操作用レーザ光Ｌ_２は、図３に示されるように、端点Ａに合焦され、標本Ｐを端点Ａにおいて保持することができる。
同時に、制御装置２０は、シャッタ２１を開放した当該一方の操作用レーザ光Ｌ_２については準備モードを解除し、観察モードに切り替える（図８のステップＳ６）。

次いで、操作者は、合焦機構２３を作動させて、図４に示されるように、観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰを下降させていく。このとき、シャッタ２２が閉鎖されている操作用レーザ光Ｌ_３については準備モードに維持されているため、その合焦位置は、観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰに一致した状態で合焦機構２３の動作に従って下降させられる。

一方、準備モードが解除されて観察モードに切り替えられた操作用レーザ光Ｌ_２については、制御装置２０の作動により、合焦機構２３と合焦位置調節手段１８とが連動させられる。これにより、操作用レーザ光Ｌ_２は、合焦機構２３により観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰとともに移動させられる一方で、その移動量と同一の移動量で逆方向に操作用レーザ光Ｌ_２の合焦位置が移動するように合焦位置調節手段１８が作動させられる。その結果、操作用レーザ光Ｌ_２は、図４に示されるように、標本Ｐの端点Ａを保持した合焦位置を移動させることなく静止した状態に維持される。

そして、操作者は、合焦機構２３を作動させて、例えば、図５に示されるように、標本Ｐの最下位近傍に観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰが配置されるように対物レンズ５を移動し、第１のスキャナ８を作動させる。図５に示す例では、標本Ｐの端点Ｂが最下位位置であるため、端点Ｂを含む最下位位置の断面の蛍光画像が取得される（図８のステップＳ７）。

操作者は、取得された蛍光画像をモニタ２４上で確認しながら、端点Ｂをマウス２５等の入力手段により指示する（図８のステップＳ８）。これにより、他方の操作用レーザ光Ｌ_３による光ピンセットの把持位置が指定されるので、制御装置２０は、第２のスキャナ１４を作動させて、他方の操作用レーザ光Ｌ_３の照射位置を指定された端点Ｂに一致するように２次元的に位置調整した後（図８のステップＳ９）、当該他方の操作用レーザ光Ｌ_３の光路上のシャッタ２２を開放し、図６に示されるように、操作用レーザ光Ｌ_３を標本Ｐに照射する。

シャッタ２２の開放により照射された当該他方の操作用レーザ光Ｌ_３が端点Ｂに合焦され、標本Ｐを端点Ｂにおいて保持することができる。
同時に、制御装置２０は、シャッタ２２を開放した当該他方の操作用レーザ光Ｌ_３についても準備モードを解除し、観察モードに切り替える（図８のステップＳ１０）。これにより、図７に示されるように、合焦機構２３を作動させて対物レンズ５を光軸方向に移動させても、他方の操作用レーザ光Ｌ_３も、標本Ｐの端点Ｂを保持した合焦位置を移動させることなく静止した状態に維持される。

その後の観察モードにおいては、合焦機構２３を作動させることにより対物レンズ５を移動させ、観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰを移動させても、端点Ａ，Ｂを保持している２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３の合焦位置が静止状態に維持される。したがって、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を用いた光ピンセットにより標本Ｐを端点Ａ，Ｂの２カ所で静止した状態に維持しつつ、観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰを順次移動させて、蛍光画像の取得位置を対物レンズ５の光軸方向に変位させることができる。そして、対物レンズ５の光軸方向にずれた複数の蛍光画像を取得することにより、これらの蛍光画像を用いて、標本Ｐの３次元的な蛍光分布を取得することが可能となる（図８のステップＳ１１）。

この場合において、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、２つに分岐された操作用レーザ光の合焦位置Ｌ_２，Ｌ_３が、それぞれ、合焦位置調節手段１８，１９により対物レンズ５の光軸方向に調節され、第２のスキャナ１３，１４により対物レンズ５の光軸に交差する２次元方向に調節される。そして、合焦位置を調節された２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３が、第２の合波手段１５によって合波された後に、第１の合波手段４により観察用レーザ光Ｌ_１に合波されるので、対物レンズ５により集光された蛍光Ｆが第２の合波手段１５を通過せずに済む。その結果、２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を照射する場合においても、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３と観察用レーザ光Ｌ_１との合波位置における蛍光Ｆのロスが増大することがなく、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。

また、λ／２板１７と偏光ビームスプリッタからなる第２の合波手段１５とにより、２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を合波することとしているので、操作用レーザ光源１１が１つで済み、装置の小型化を図ることができる。また、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３のロスを低減することにより無駄をなくし、消費電力を低減することができる。

また、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、観察モードにおいて、合焦機構２３と合焦位置調節手段１８，１９とを連動させることにより、単一の対物レンズ５を介して標本Ｐに照射されている観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰのみを対物レンズ５の移動に従って移動させ、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を静止させておくことができる。その結果、標本Ｐを静止させたままの状態で、観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰを対物レンズ５の光軸方向に移動させることができ、標本Ｐの状態を変化させることなく、また、標本Ｐに外力を付与することなく、３次元的な蛍光分布を観察することができる。

なお、本実施形態においては、単一の操作用レーザ光源１１から発せられた操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３をハーフミラー１２によって分岐することとしたが、これに代えて、各操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３毎に、操作用レーザ光源１１を配置してもよい。この場合には、操作用レーザ光源１１の設置角度を９０°異ならせることにより、偏光方向が相互に直交する２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を利用することができる。

また、２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を用いる場合について説明したが、これに代えて、３以上の操作用レーザ光を用いることにしてもよい。この場合には、２つの操作用レーザ光を上記と同様にして合波した後に合波された操作用レーザ光をさらに他の操作用レーザ光と合波させることとすればよい。

また、操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を光ピンセットとして使用する場合について説明したが、光刺激用に使用することとしてもよい。このようにすることで、２カ所以上の定まった位置に光刺激を付与しながら標本Ｐの３次元的な蛍光分布を取得することができる。
また、合焦機構２３として、対物レンズ５を光軸方向に移動させるものを例示したが、これに代えて、対物レンズ５は固定したままで、標本Ｐを支持するステージ２８を光軸方向に移動させることにしてもよい。

また、本実施形態においては、２つの操作用レーザ光Ｌ_２，Ｌ_３を光ピンセットとして使用し、標本Ｐの異なる端点Ａ，Ｂを静止した状態に保持したままで、合焦機構２３の作動により対物レンズ５を光軸方向に移動させて、観察用レーザ光Ｌ_１の焦点面ＦＰを光軸方向に移動させたが、これに代えて、光ピンセットにより端点Ａ，Ｂを把持した後は、合焦位置調節手段１８，１９の作動により標本Ｐを対物レンズ５の光軸方向に移動させることとしてもよい。

このようにすることで、合焦機構２３により対物レンズ５やステージ２８を移動させることなく、標本Ｐの３次元的な蛍光分布を取得することができる。その結果、対物レンズ５やステージ２８を移動させるような大きな駆動力を発生するモータが不要となり、装置の小型化を図ることができる。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。 図１のレーザ走査型顕微鏡から観察用レーザ光のみを標本に照射した準備モードを示す説明図である。 図１のレーザ走査型顕微鏡からの観察用レーザ光の焦点面が、標本の最上位位置に一致した原点位置において、一方の操作用レーザ光を標本に照射した状態を示す説明図である。 図３の原点位置から観察用レーザ光の焦点面を下降させた状態を示す説明図である。 図１のレーザ走査型顕微鏡からの観察用レーザ光の焦点面が、標本の最下位位置に一致した状態を示す説明図である。 図５の状態で他方の観察用レーザ光を標本に照射した状態を示す説明図である。 図５の状態において２つの操作用レーザ光を固定し、観察用レーザ光のみを移動させる観察モードを説明する説明図である。 図１のレーザ走査型顕微鏡を用いた標本の観察手順を示すフローチャートである。

符号の説明

Ｆ 蛍光
Ｌ_１ 観察用レーザ光
Ｌ_２，Ｌ_３ 操作用レーザ光
Ｐ 標本
１ レーザ走査型顕微鏡
４ 第１の合波手段（合波手段）
５ 対物レンズ
６ 光検出器
７ 観察用レーザ光源
８ 第１のスキャナ（走査手段）
１１ 操作用レーザ光源
１２ ハーフミラー（分岐手段）
１３，１４ 第２のスキャナ（レーザ光位置調節手段）
１５ 第２の合波手段（操作用レーザ光合波手段）
１７ λ／２板
１８，１９ 合焦位置調節手段（操作用レーザ光集光位置調整手段）

Claims (4)

1. 観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、
   標本を操作するための複数の操作用レーザ光を発する操作用レーザ光源と、
   該操作用レーザ光源から発せられた複数の操作用レーザ光を合波する操作用レーザ光合波手段と、
   観察用レーザ光を２次元的に走査する走査手段と、
   操作用レーザ光の照射位置を２次元的に調節するレーザ光位置調節手段と、
   走査手段により走査された観察用レーザ光と、レーザ光位置調節手段により位置調節された操作用レーザ光とを合波する合波手段と、
   該合波手段により合波された観察用レーザ光および操作用レーザ光を集光して標本に照射する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器とを備え、
   前記操作用レーザ光合波手段が、前記合波手段による観察用レーザ光との合波前に、前記複数の操作用レーザ光を合波する位置に配置されているレーザ走査型顕微鏡。
2. 前記複数の操作用レーザ光が、相互に直交する偏光方向を備え、
   前記操作用レーザ光合波手段が、偏光ビームスプリッタにより構成されている請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
3. 前記操作用レーザ光源からの操作用レーザ光を複数に分岐する分岐手段と、
   分岐された複数の操作用レーザ光の偏光方向を相互に直交させるλ／２板とを備える請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
4. 前記複数の操作用レーザ光のそれぞれの光路に、標本における集光位置を光軸方向に変化させる操作用レーザ光集光位置調整手段が備えられている請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。

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