JP4912737B2 - レーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法 - Google Patents
レーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4912737B2 JP4912737B2 JP2006132674A JP2006132674A JP4912737B2 JP 4912737 B2 JP4912737 B2 JP 4912737B2 JP 2006132674 A JP2006132674 A JP 2006132674A JP 2006132674 A JP2006132674 A JP 2006132674A JP 4912737 B2 JP4912737 B2 JP 4912737B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- laser beam
- observation
- laser light
- laser
- specimen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/006—Optical details of the image generation focusing arrangements; selection of the plane to be imaged
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Automatic Focus Adjustment (AREA)
- Transforming Light Signals Into Electric Signals (AREA)
Description
例えば、特許文献1には、操作用レーザ光の合焦位置を変更する摺動可能な合焦手段を備え、操作用レーザ光の合焦位置を独立して変更可能としたレーザ走査型顕微鏡が開示されている。更に、この特許文献1には、操作用レーザ光を光ピンセットとして利用することが開示されている。具体的には、特許文献1には、対物レンズの焦平面に平行な面内において、種々異なる操作部位に操作用レーザ光を照射することで、該操作部位を光ピンセットで捉えることが開示されている。
本発明は、観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、標本を操作するための操作用レーザ光を発する操作用レーザ光源と、観察用レーザ光を2次元的に走査する走査手段と、操作用レーザ光の照射位置を2次元的に調節するレーザ光位置調節手段と、前記操作用レーザ光の合焦位置を光軸方向に移動させる合焦位置調節手段と、前記走査手段により走査された観察用レーザ光と、前記レーザ光位置調節手段および前記合焦位置調節手段により調節された操作用レーザ光とを合波する合波手段と、前記合波手段により合波された観察用レーザ光および操作用レーザ光を集光して標本に照射する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、前記対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、前記対物レンズまたは前記標本が載せられたステージを光軸方向に移動させるZ軸駆動手段と、前記対物レンズまたは前記ステージの移動量と前記合焦位置調節手段とを制御する制御手段と、前記Z軸駆動手段による前記対物レンズまたは前記ステージの移動にかかわらず、前記観察用レーザ光の合焦面と操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように、前記制御手段が前記合焦位置調節手段を制御する準備モードと、前記対物レンズまたは前記ステージの移動に伴う前記操作用レーザ光の合焦位置の前記標本に対するずれ量を相殺するように、前記制御手段が前記合焦位置調節手段を制御する観察モードとを切り替えるモード切替手段とを具備するレーザ走査型顕微鏡を提供する。
また、観察モードにおいては、対物レンズまたはステージの移動に伴う操作用レーザ光の合焦位置のずれ量を相殺するように、合焦位置調節手段が制御されることとなる。これにより、対物レンズまたはステージの移動に伴って観察用レーザ光の合焦位置が連続的に移動した場合でも、操作用レーザ光の合焦位置を所望の位置に固定させることができる。この結果、光刺激を標本の同じ位置に対して行いながら、或いは、光ピンセットの把持位置を常に同じ位置に固定させた状態で、観察用レーザ光の合焦位置のみを標本の深さ方向に移動させることができる。
上記レーザ走査型顕微鏡において、前記モード切替手段は、前記操作用レーザ光が標本へ照射されないときは前記準備モードに切り替え、前記操作用レーザ光を標本へ照射するときには前記観察モードに切り換えることが好ましい。
また、上記レーザ走査型顕微鏡において、複数の前記レーザ光位置調節手段を備え、該レーザ光位置調節手段が互いに独立して操作用レーザ光の2次元的照射位置を調節可能であり、前記レーザ光位置調節手段と前記合波手段との間に配置され、複数の前記レーザ光位置調節手段によって夫々2次元的に位置調節された複数の前記操作用レーザ光を一つの光路に合成する操作光合成手段を備えることが好ましい。
さらに、上記レーザ走査型顕微鏡において、前記合焦位置調節部が、複数の前記レーザ光位置調節手段の夫々に対応して個別に設けられ、複数の前記操作用レーザ光は夫々の合焦位置を個別に調節可能であることが好ましい。
また、観察モードにおいては、対物レンズまたはステージが光軸方向に移動することに伴い、操作用レーザ光の合焦位置がずれたとしても、このずれを相殺するように操作用レーザ光の合焦位置が調節されるので、標本に対する操作用レーザ光の合焦位置を固定させることが可能となる。この結果、光刺激を標本の同じ位置に対して行いながら、或いは、光ピンセットの把持位置を常に同じ位置に固定させた状態で、観察用レーザ光の合焦位置のみを標本の深さ方向に移動させることができる。
上記顕微鏡観察方法において、前記準備モードの実施中に観察用レーザ光を照射して標本観察を実行し、所望の合焦面の観察画像が得られた状態で、その観察画像に基づいて操作用レーザ光の2次元方向の照射位置を調節することにより、操作用レーザ光の標本に対する2次元照射位置及び光軸方向の合焦位置の設定を行なうことが好ましい。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1は、レーザ走査型共焦点顕微鏡である。図1中、各種レンズおよびピンホール等の光学部品は、説明の簡略化のために省略している。
また、観察用レーザ光発生部2の観察用レーザ光源7と第1のスキャナ8との間には、標本Pにおいて発生し、対物レンズ5により集光され、ダイクロイックミラー4、ミラー9および第1のスキャナ8を経由して戻る蛍光Fを観察用レーザ光L1から分岐して光検出器6に向かわせるダイクロイックミラー10が備えられている。
操作用レーザ光L2,L3は、標本Pに結合されたアクチンまたはミオシンの位置に合焦されることにより、標本Pを保持する光ピンセットとして利用されるようになっている。
合焦機構23および合焦位置調節装置18,19は、制御装置20に接続されている。制御装置20は、合焦機構23による対物レンズ5の移動量と合焦位置調節装置18,19による2つの操作用レーザ光L2,L3の合焦位置の移動量との関係を記憶している。
これにより、準備モードにおいては、合焦機構23を作動させて対物レンズ5を光軸方向に移動させると、観察用レーザ光L1のみならず停止されている操作用レーザ光L2,L3の合焦位置が対物レンズ5とともに光軸方向に移動させられるようになっている。
Access Memory)等から構成されている。上述の各種機能を実現するための一連の処理の過程は、プログラムの形式でROM等に記録されており、このプログラムをCPUがRAM等に読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、各種機能が実現される。
制御装置20は、第1のスキャナ8による観察用レーザ光L1の標本P上における走査位置情報と、光検出器6により検出された蛍光Fの光強度情報とに基づいて、2次元的な蛍光画像を構築し、モニタ24に表示するようになっている。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1を用いて、標本P、例えば、シャーレ26内に貯留された培地27内に浮遊する細胞を観察する場合には、図2に示されるように、標本Pの端点A,Bにアクチンまたはミオシンを結合しておき(図8のステップS1)、制御装置20を準備モードに切り替える(図8のステップS2:モード切替手段)。
同時に、制御装置20は、シャッタ21を開放した当該一方の操作用レーザ光L2については準備モードを解除し、観察モードに切り替える(図8のステップS6:モード切替手段)。
同時に、制御装置20は、シャッタ22を開放した当該他方の操作用レーザ光L3についても準備モードを解除し、観察モードに切り替える(図8のステップS10:モード切替手段)。これにより、図7に示されるように、合焦機構23を作動させて対物レンズ5を光軸方向に移動させても、他方の操作用レーザ光L3も、標本Pの端点Bを保持した合焦位置を移動させることなく静止した状態に維持される。
つまり、観察モードにおいては、合焦機構23と合焦位置調節装置18,19とを連動させることにより、単一の対物レンズ5を介して標本Pに照射されている観察用レーザ光L1の焦点面FPのみを対物レンズ5の移動に従って移動させ、操作用レーザ光L2,L3の合焦位置を固定させておくことができる。この結果、標本Pを静止させたままの状態で、観察用レーザ光L1の焦点面FPを対物レンズ5の光軸方向に移動させることができ、標本Pの状態を変化させることなく、また、標本Pに外力を付与することなく、3次元的な蛍光分布を観察することができる。
また、合焦機構23として、対物レンズ5を光軸方向に移動させるものを例示したが、これに代えて、対物レンズ5は固定したままで、標本Pを支持するステージ28を光軸方向に移動させることにしてもよい。
L1 観察用レーザ光
L2,L3 操作用レーザ光
P 標本
1 レーザ走査型顕微鏡
4 ダイクロイックミラー(合波手段)
5 対物レンズ
6 光検出器
7 観察用レーザ光源
8 第1のスキャナ(走査手段)
11 操作用レーザ光源
12 ハーフミラー
13,14 第2のスキャナ(レーザ光位置調節手段)
15 偏光ビームスプリッタ
17 λ/2板
18,19 合焦位置調節装置(合焦位置調節手段)
23 合焦機構(Z軸駆動手段)
Claims (7)
- 観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、
標本を操作するための操作用レーザ光を発する操作用レーザ光源と、
観察用レーザ光を2次元的に走査する走査手段と、
操作用レーザ光の照射位置を2次元的に調節するレーザ光位置調節手段と、
前記操作用レーザ光の合焦位置を光軸方向に移動させる合焦位置調節手段と、
前記走査手段により走査された観察用レーザ光と、前記レーザ光位置調節手段および前記合焦位置調節手段により調節された操作用レーザ光とを合波する合波手段と、
前記合波手段により合波された観察用レーザ光および操作用レーザ光を集光して標本に照射する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
前記対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、
前記対物レンズまたは前記標本が載せられたステージを光軸方向に移動させるZ軸駆動手段と、
前記対物レンズまたは前記ステージの移動量と前記合焦位置調節手段とを制御する制御手段と、
前記Z軸駆動手段による前記対物レンズまたは前記ステージの移動にかかわらず、前記観察用レーザ光の合焦面と操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように、前記制御手段が前記合焦位置調節手段を制御する準備モードと、前記対物レンズまたは前記ステージの移動に伴う前記操作用レーザ光の合焦位置の前記標本に対するずれ量を相殺するように、前記制御手段が前記合焦位置調節手段を制御する観察モードとを切り替えるモード切替手段と
を具備するレーザ走査型顕微鏡。 - 前記モード切替手段は、前記操作用レーザ光が標本へ照射されないときは前記準備モードに切り替え、前記操作用レーザ光を標本へ照射するときには前記観察モードに切り換える請求項1に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 複数の前記レーザ光位置調節手段を備え、該レーザ光位置調節手段が互いに独立して操作用レーザ光の2次元的照射位置を調節可能であり、
前記レーザ光位置調節手段と前記合波手段との間に配置され、複数の前記レーザ光位置調節手段によって夫々2次元的に位置調節された複数の前記操作用レーザ光を一つの光路に合成する操作光合成手段を備える請求項1又は請求項2に記載のレーザ走査型顕微鏡。 - 前記合焦位置調節部が、複数の前記レーザ光位置調節手段の夫々に対応して個別に設けられ、複数の前記操作用レーザ光は夫々の合焦位置を個別に調節可能である請求項3に記載のレーザ走査型顕微鏡。
- 標本を観察するための観察用レーザ光と標本を操作するための操作用レーザ光とを合波し、合波後の光を対物レンズを介してステージ上に載せられた前記標本に照射し、前記標本内から発せられる蛍光を検出する顕微鏡観察方法であって、
前記標本に対する前記操作用レーザ光の照射を停止した状態で、前記対物レンズまたは前記ステージの光軸方向の移動にかかわらず、前記観察用レーザ光の合焦面と前記操作用レーザ光の合焦位置とが一致するように前記操作用レーザ光の合焦位置を調節する準備モードを実施し、前記操作用レーザ光の合焦位置が所望の位置に達した場合に、前記標本に対する前記操作用レーザ光の照射を開始するとともに、前記対物レンズまたは前記ステージの光軸方向の移動に伴う前記操作用レーザ光の合焦位置の前記標本に対するずれ量を相殺するように、前記操作用レーザ光の合焦位置を調節する観察モードに切り替える顕微鏡観察方法。 - 前記操作用レーザ光の合焦位置の調節を前記標本の蛍光検出に同期して行う請求項5に記載の顕微鏡観察方法。
- 前記準備モードの実施中に観察用レーザ光を照射して標本観察を実行し、所望の合焦面の観察画像が得られた状態で、その観察画像に基づいて操作用レーザ光の2次元方向の照射位置を調節することにより、操作用レーザ光の標本に対する2次元照射位置及び光軸方向の合焦位置の設定を行なう請求項5又は請求項6に記載の顕微鏡観察方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006132674A JP4912737B2 (ja) | 2006-05-11 | 2006-05-11 | レーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法 |
US11/799,196 US7483131B2 (en) | 2006-05-11 | 2007-05-01 | Laser-scanning microscope and microscope observation method |
EP07009074A EP1855141A1 (en) | 2006-05-11 | 2007-05-04 | Laser-scanning microscope and microscope observation method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006132674A JP4912737B2 (ja) | 2006-05-11 | 2006-05-11 | レーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007304339A JP2007304339A (ja) | 2007-11-22 |
JP4912737B2 true JP4912737B2 (ja) | 2012-04-11 |
Family
ID=38291034
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006132674A Expired - Fee Related JP4912737B2 (ja) | 2006-05-11 | 2006-05-11 | レーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7483131B2 (ja) |
EP (1) | EP1855141A1 (ja) |
JP (1) | JP4912737B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011056658A1 (en) * | 2009-10-27 | 2011-05-12 | Duke University | Multi-photon microscopy via air interface objective lens |
JP5554965B2 (ja) * | 2009-11-06 | 2014-07-23 | オリンパス株式会社 | 位相変調型空間光変調器を用いたレーザ顕微鏡 |
JP5452180B2 (ja) * | 2009-11-13 | 2014-03-26 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡装置 |
JP5221614B2 (ja) | 2010-09-17 | 2013-06-26 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 3次元共焦点観察用装置及び観察焦点面変位・補正ユニット |
JP5409588B2 (ja) * | 2010-12-17 | 2014-02-05 | キヤノン株式会社 | 焦点調節方法、焦点調節プログラムおよび撮像装置 |
DE102011100507B4 (de) * | 2011-04-29 | 2020-05-14 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Tragbares optisches Analysegerät |
JP5926966B2 (ja) * | 2012-01-30 | 2016-05-25 | オリンパス株式会社 | 蛍光観察装置 |
JP5914242B2 (ja) * | 2012-08-08 | 2016-05-11 | 浜松ホトニクス株式会社 | 観察装置 |
WO2015127940A1 (en) * | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Københavns Universitet | A detection system for an optical manipulation system for manipulating micro-particles or nano-particles of a sample by means of at least two optical traps |
EP2930496B8 (en) * | 2014-04-10 | 2021-12-15 | Horiba France SAS | Raman micro-spectrometry system and method for analyzing microscopic objects in a fluidic sample |
NL2014262B1 (en) * | 2015-02-09 | 2016-10-13 | Stichting Vu | Apparatus and method for controlling a plurality of optical traps. |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3917731B2 (ja) * | 1996-11-21 | 2007-05-23 | オリンパス株式会社 | レーザ走査顕微鏡 |
DE10039520A1 (de) * | 2000-08-08 | 2002-02-21 | Leica Microsystems | Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten |
DE10115578A1 (de) * | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Leica Microsystems | Verfahren und Anordnung zum Ausgleichen von Abbildungsfehlern |
JP4468684B2 (ja) * | 2003-12-05 | 2010-05-26 | オリンパス株式会社 | 走査型共焦点顕微鏡装置 |
DE102004016253B4 (de) | 2004-04-02 | 2006-02-23 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Rastermikroskop und Verfahren zur rastermikroskopischen Untersuchung einer Probe |
DE102004032952A1 (de) * | 2004-07-07 | 2006-01-26 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Rastermikroskop und Verfahren zur Untersuchung von biologischen Proben mit einem Rastermikroskop |
DE102004034998A1 (de) | 2004-07-16 | 2006-02-02 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Lichtrastermikroskop mit bewegter Lochscheibe und Verwendung |
-
2006
- 2006-05-11 JP JP2006132674A patent/JP4912737B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-05-01 US US11/799,196 patent/US7483131B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-05-04 EP EP07009074A patent/EP1855141A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1855141A1 (en) | 2007-11-14 |
JP2007304339A (ja) | 2007-11-22 |
US20070263282A1 (en) | 2007-11-15 |
US7483131B2 (en) | 2009-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4912737B2 (ja) | レーザ走査型顕微鏡および顕微鏡観察方法 | |
JP5006694B2 (ja) | 照明装置 | |
EP2317363B1 (en) | Microscope connecting unit and microscope system | |
US20160124203A1 (en) | Microscope and microscope image acquisition method | |
JP5208650B2 (ja) | 顕微鏡システム | |
JP5555061B2 (ja) | 観察装置および観察方法 | |
US7838818B2 (en) | Light-stimulus illumination apparatus which scans light-stimulus laser light in a direction intersecting an optical axis | |
JP5095935B2 (ja) | 顕微鏡装置 | |
JP2005121796A (ja) | レーザー顕微鏡 | |
US6924490B2 (en) | Microscope system | |
JP2010286566A (ja) | レーザ走査型蛍光顕微鏡および蛍光観察方法 | |
JP4270884B2 (ja) | 顕微鏡システム | |
JP5179099B2 (ja) | 光刺激用照明装置および顕微鏡装置 | |
JP4867354B2 (ja) | 共焦点顕微鏡 | |
JP4722464B2 (ja) | 全反射蛍光照明装置 | |
JP4912738B2 (ja) | レーザ走査型顕微鏡 | |
JP2007304421A (ja) | レーザ走査型顕微鏡 | |
JP3736213B2 (ja) | 共焦点光スキャナ | |
JP4939855B2 (ja) | 照明装置およびレーザ走査型顕微鏡 | |
JP4874012B2 (ja) | レーザ走査型顕微鏡およびレーザ走査型顕微鏡の画像取得方法 | |
JP4700334B2 (ja) | 全反射蛍光顕微鏡 | |
JP4694760B2 (ja) | 顕微鏡 | |
JP2006003747A (ja) | 光走査型観察装置 | |
JP6278707B2 (ja) | 光学装置 | |
JP2006106346A (ja) | 顕微鏡システム |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090420 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110726 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110922 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120110 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120118 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 4912737 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150127 Year of fee payment: 3 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |