JP2005172987A - レーザ顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【課題】 最適な観察状態により蛍光観察とセナルモン方式の微分干渉観察の切替えを行なうことができるレーザ顕微鏡を提供する。
【解決手段】 正立型顕微鏡18の結像レンズ19と対物レンズ23との間に照明側微分干渉プリズム20を含む電動スライダ21を設け、セナルモン方式の透過微分干渉観察の際は、制御装置34により電動スライダ21を駆動して照明側微分干渉プリズム20が光路上に挿入するように制御し、一方、蛍光観察のときは、電動スライダ21を駆動して照明側微分干渉プリズム20を光路上から退避させるように制御する。
【選択図】 図1
【解決手段】 正立型顕微鏡18の結像レンズ19と対物レンズ23との間に照明側微分干渉プリズム20を含む電動スライダ21を設け、セナルモン方式の透過微分干渉観察の際は、制御装置34により電動スライダ21を駆動して照明側微分干渉プリズム20が光路上に挿入するように制御し、一方、蛍光観察のときは、電動スライダ21を駆動して照明側微分干渉プリズム20を光路上から退避させるように制御する。
【選択図】 図1
Description
本発明は、レーザ光を標本に照射したときに発せられる光や標本を通過した光を検出して標本像を観察するレーザ顕微鏡に関するものである。
例えば医学,生物学の分野では、レーザ顕微鏡が広く用いられている。このレーザ顕微鏡は、レーザ光を励起光として標本に照射し、標本から発せられる蛍光を検出して標本像を構築したり、蛍光量を測定するようにしたものである。
一方、標本は、例えば生細胞であれば、無色透明である。このため、このような標本に対しては、通常の透過観察では、標本像を得ることができない。
そこで、従来では、生細胞の標本像を得るために透過微分干渉観察方法が用いられている。この方法は、偏光を利用することで、微少に横ずれされた2つの波を標本面を透過させ、その光波を干渉させて位相物体を可視化する方法である。この観察方法を用いると、透明な位相標本にコントラストを付けて観察することができ、しかも構成が非常に簡単で偏光板と微分干渉プリズムを通常の顕微鏡に組み合わせるだけで使用できるので、各方面で様々な標本の観察に利用されている。
例えば、パッチクランプ実験に使用されるレーザ顕微鏡では、標本の細胞の位置を探すためにセナルモン方式による微分干渉観察が用いられている。このセナルモン方式の微分干渉観察は、微分干渉観察像のコントラスト調整を偏光板で行なうもので、通常の微分干渉観察のように、結像レンズと対物レンズの間に配置される微分干渉プリズムの位置を微動させてコントラストを変化させるのでなく、標本から離れた位置にある偏光板を回転させることによってコントラストを変化させることができるため、標本の回りにパッチクランプ用の電極が配置される場合も、これらに触れることなくコントラスト調整ができる。
セナルモン方式の透過微分干渉観察に用いられるレーザ顕微鏡は、レーザ光路中に複屈折素子として偏光分離プリズムである微分干渉プリズムを配置している。この微分干渉プリズムはレーザ光を2つの光線に分離し、これら光線を標本面上にシェア量を持って照射するものである。
ところで、このようなレーザ顕微鏡は、透過微分干渉観察の他に、蛍光観察にも用いられることがある。この蛍光観察は、レーザ光を標本に照射したときに標本から発せられる蛍光を検出するものである。
ところが、このような透過微分干渉観察と蛍光観察を切替えて可能としたレーザ顕微鏡は、これら透過微分干渉観察と蛍光観察のいずれの場合も、光路中に微分干渉プリズムが挿入されているため、蛍光観察においても、レーザ光は微分干渉プリズムを透過して2つの光線に分離されて標本に照射されるようになる。このため、特に、通常の光学顕微鏡に比べ解像度の高いレーザ顕微鏡については、蛍光観察により得られる標本像は、微分干渉プリズムを挿入していない状態で得られる標本像と比べて解像度が低下する。また、特に多光子吸収現象を利用した多光子励起蛍光観察を行う場合、標本面でレーザ光が2つに分離していると、多光子吸収確率が低下するので、蛍光の明るさも極端に暗くなる。
そこで、このような標本像の解像度低下や多光子励起蛍光の像劣化を起こさせないために、蛍光観察時に微分干渉プリズムをレーザ光路から取り外す必要がある。しかしながら、セナルモン方式の微分干渉観察を構成しているレーザ顕微鏡では、微分干渉プリズムが固定して配置されているために、簡単にレーザ光路から取り外すことができない。また、仮に、取外し可能に構成されていても、微分干渉プリズムは、対物レンズの直前に配置されているために、レーザ光路から取り外す作業性が著しく悪い。特に、パッチクランプ実験に用いられる正立型顕微鏡では、標本を載せるステージの上方に微分干渉プリズムが配置されており、ステージ上方の特に対物レンズ周囲に、パッチクランプ用の電極が検鏡者により任意の方向から配置されているため、微分干渉プリズムをレーザ顕微鏡のレーザ光路から取り外す作業性は、さらに悪くなり、微分干渉プリズムの取外し作業によって電極に触れたり、作業時に発生する振動により電極の位置が標本からずれ、最悪の場合、標本から電極が抜けるなどして検鏡者が設定した観察条件が無駄になり、観察に大きな影響を与えることがあった。
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、最適な観察状態で蛍光観察と微分干渉観察の切替えを行なうことができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
請求項1記載の発明は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの前記レーザ光を標本に照射するためのレーザ光導入光学系と、前記レーザ光を前記標本に照射することにより当該標本から発せられる光を前記レーザ光導入光学系を介して検出する第1の光検出手段と、前記標本を透過した光路の光を検出する第2の光検出手段とを備え、前記レーザ光導入光学系は、前記レーザ光を直線偏光させるための第1の偏光素子、前記直線偏光されたレーザ光を互いに異なる偏光方向を有する2つの光線に分離する第1の複屈折素子、前記標本ヘレーザ光を照射するための対物レンズを有し、前記標本を透過した光路には、前記標本を透過した前記2つの光線を合成する第2の複屈折素子、前記第2の複屈折素子により合成された光線に位相差を生じさせるための1/4波長板、該1/4波長板により位相差を生じさせた光線に干渉を発生させて像を生じさせる第2の偏光素子を有し、前記第1の複屈折素子がレーザ光導入光学系の光路に挿入された第1の位置と光路からはずれた第2の位置とで切替え可能であり、前記第1の光検出手段で前記標本からの光を検出する時は前記第1の複屈折素子を前記第2の位置に切換え、前記第2の光検出手段で前記標本を透過する光を検出する時は前記第1の複屈折素子を前記第1の位置に切換えることを特徴としている。
請求項2記載の発明は、請求項1記載の発明において、前記第1の複屈折素子の切換えは、クリックレスに構成されることを特徴としている。
請求項3記載の発明は、請求項1または2記載の発明において、前記レーザ光源は、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザであることを特徴としている。
本発明によれば、セナルモン方式による透過微分干渉観察の際は、第1の複屈折素子(照明側微分干渉プリズム)を光路上に挿入し、蛍光観察のときは、第1の複屈折素子(照明側微分干渉プリズム)を取外すことなく光路上から退避させるようにできるので、透過微分干渉観察から蛍光観察に切り替えた場合も、検鏡者の観察に影響を与えることがなく、解像低下、画像劣化のない標本の蛍光観察像を得ることができる。
また、本発明によれば、第1の複屈折素子の切換えがクリックレスに構成されるので、標本に余計な振動を与えることもなくなり、標本の状態を常に安定して保つことができる。
さらに、本発明によれば、レーザ光源として、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザが用いられても、多光子吸収確率が低下することがなくなり、蛍光の明るさを確保することができる。
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
(第1の実施の形態)
図1(a)(b)は、本発明の第1の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の概略構成を示している。
図1(a)(b)は、本発明の第1の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の概略構成を示している。
図1(a)において、1はレーザ光源で、このレーザ光源1から出射するレーザ光2の光路には、集光レンズ3と光ファイバ4の光入射端が配置されている。集光レンズ3は、レーザ光2を集光し、光ファイバ4の光入射端に導入する。
光ファイバ4には、スキャナユニット5が接続されている。スキャナユニット5は、光ファイバ4の光出射端から出射するレーザ光の光路に、レーザ光導入光学系の一部を構成するコリメートレンズ6、偏光素子8、波長選択素子であるダイクロイックミラー9が配置されている。コリメートレンズ6は、光ファイバ4からのレーザ光を平行光に変換する。偏光素子8は、レーザ光を直線偏光するためのものである。ダイクロイックミラー9は、レーザ光源1からのレーザ光の波長を反射し、後述する標本Sからの蛍光の波長を透過するような特性を有している。
ダイクロイックミラー9の反射偏向された光路上には、ガルバノミラー10が配置されている。ガルバノミラー10は、直交する2方向に光を偏向するための2枚のガルバノミラーを有し、これらのガルバノミラーによりダイクロイックミラー9により反射偏向されたレーザ光を2次元に走査するようになっている。ガルバノミラー10により2次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ15、反射ミラー16を介して、正立型顕微鏡18のレーザ光導入光学系へと導入される。反射ミラー16は、スキャナユニット5からのレーザ光を正立型顕微鏡18へ反射偏向させるものである。
ダイクロイックミラー9の透過光路上には、第1の光検出手段を構成する反射ミラー11、共焦点レンズ12と、共焦点絞り13および第1の光電変換素子14が配置されている。共焦点絞り13は、共焦点レンズ12の焦点位置に配置されている。第1の光電変換素子14は、共焦点絞り13を通過してきた光を光検出し電気信号へ変換出力するもので、ここでは、例えばフォトマルチプライアが用いられる。
正立型顕微鏡18は、反射ミラー16の反射光路上に結像レンズ19、第1の複屈折素子としての照明側微分干渉プリズム20、対物レンズ23が配置されている。照明側微分干渉プリズム20は、反射ミラー16で反射されるレーザ光を互いに異なる偏光方向を有する2つの光線に分離するもので、この分離された2つの光線を対物レンズ23を通過してステージ25上に載置された標本Sに照射するようにしている。また、照明側微分干渉プリズム20は、切替え手段としての電動スライダ21に設けられ、駆動手段の駆動用ステッピングモータ22により駆動され、光路上に挿脱可能になっている。この場合、電動スライダ21の移動方向は、図示矢印35の方向、つまり顕微鏡の鏡基に対し検鏡者側から見て前後方向に直線移動する。また、照明側微分干渉プリズム20を有する電動スライダ21には、フラグ32が設けられている。フラグ32に対応してセンサ33が配置されている。このセンサ33は、正立型顕微鏡18側に設けられ、フラグ32を検知するもので、光路に対して挿脱される電動スライダ21(照明側微分干渉プリズム20)の位置を検知するようになっている。
対物レンズ23は、倍率の異なるものが複数個用意され、それぞれがレボルバ24に設けられ、レボルバ24の操作により選択的に光路上に位置されるようになっている。
一方、標本を透過した光路には、コンデンサレンズ26、第2の複屈折素子としての観察側微分干渉プリズム27、1/4波長板28、偏光素子29、反射ミラー30が配置されている。
標本Sの透過してきたレーザ光は、コンデンサレンズ26を介して、観察側微分干渉プリズム27に入射される。観察側微分干渉プリズム27は、照明側微分干渉プリズム20で2つに分離された光線を合成するものである。1/4波長板28は、観察側微分干渉プリズム27により合成された光線に楕円偏光となるような位相を持たせるようにしている。偏光素子29は、楕円偏光となった2つの光線に干渉を生じさせ、明暗の像を生成するためのものである。反射ミラー30は、偏光素子29を透過した光を反射する。
反射ミラー30の反射光路上には、第2の光検出手段を構成する第2の光電変換素子31が配置されている。第2の光電変換素子31は、反射ミラー30で反射された光を光検出し電気信号へ変換出力するもので、ここでは、例えばフォトマルチプライアが用いられる。
ガルバノミラー10、電動スライダ21の駆動用ステッピングモータ22、フラグ32を検知するセンサ33および第1の光電変換素子14、第2の光電変換素子31には、制御手段としての制御装置34が接続されている。この制御装置34は、ガルバノミラー10の駆動制御を始め、センサ33からの出力信号の処理,駆動用ステッピングモータ22の駆動制御および第1の光電変換素子14および第2の光電変換素子31からそれぞれ出力される電気信号を処理するようになっている。
ここで、照明側微分干渉プリズム20を含む電動スライダ21の構成および動作について簡単に説明する。
この場合、センサ33によるフラグ32の検知により制御装置34から電動スライダ21の駆動用ステッピングモータ22に制御信号のパルス信号を出力し、電動スライダ21を駆動する。このときの電動スライダ21の移動に必要なパルス信号は、予め制御装置34に記憶されており、常にセンサ33がフラグ32を検知した状態を基準として一定量だけ電動スライダ21を移動させることができるようになっている。これにより、電動スライダ21は、機械的な位置決めのための機構を必要とせずにクリックレスに光路に挿脱可能となる。また、検鏡者が微分干渉観察または蛍光観察を選択したときに、センサ33によりフラグ32の状態を検知すると、以下の制御が実行される。
(1)微分干渉観察が選択された場合
(a)センサ33がフラグ32を検知した場合、つまり照明側微分干渉プリズム20が光路上にある場合は、電動スライダ21は移動しない。
(a)センサ33がフラグ32を検知した場合、つまり照明側微分干渉プリズム20が光路上にある場合は、電動スライダ21は移動しない。
(b)センサ33がフラグ32を検知しない場合、つまり照明側微分干渉プリズム20が光路上にない場合は、制御装置34より電動スライダ21の駆動用ステッピングモータ22にパルス信号を出力し、電動スライダ21を駆動して、照明側微分干渉プリズム20を光路上に移動する。
(2)蛍光観察が選択された場合
(c)センサ33がフラグ32を検知した場合、つまり照明側微分干渉プリズム20が光路上にある場合には、制御装置34より電動スライダ21の駆動用ステッピングモータ22にパルス信号を出力し、電動スライダ21を駆動して、照明側微分干渉プリズム20を光路上から外すように移動する。
(c)センサ33がフラグ32を検知した場合、つまり照明側微分干渉プリズム20が光路上にある場合には、制御装置34より電動スライダ21の駆動用ステッピングモータ22にパルス信号を出力し、電動スライダ21を駆動して、照明側微分干渉プリズム20を光路上から外すように移動する。
(d)センサ33がフラグ32を検知しない場合、つまり、照明側微分干渉プリズム20が光路上にない場合は、既に蛍光観察光路になっているため、電動スライダ21は移動しない。
次に、上記のように構成された第1の実施の形態の動作について説明する。
まず、標本Sの微分干渉観察について説明する。
検鏡者により微分干渉観察か選択されると、上述したように制御装置34により電動スライダ21の位置制御が行われ、微分干渉観察光路になるように光路切換えが行われ、照明側微分干渉プリズム20が光路上に挿入される(図1(a)参照)。
この状態から、レーザ光源1からレーザ光2が出射されると、レーザ光2は、集光レンズ3により集光され、光ファイバ4の光入射端へ導入される。
光ファイバ4を通してスキャナユニット5にレーザ光が導入されると、このレーザ光は、コリメートレンズ6により平行光となり、偏光素子8により直線偏光され、ダイクロイックミラー9に入射される。そして、ダイクロイックミラー9により反射偏向され、ガルバノミラー10に入射する。
ガルバノミラー10は、ダイクロイックミラー9により反射偏向されたレーザ光を2次元に走査する。この2次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ15を通って反射ミラー16で反射して正立型顕微鏡18に導入され、結像レンズ19を通って照明側微分干渉プリズム20に入射する。
この場合、図2に示すように結像レンズ19より照明側微分干渉プリズム20に入射するレーザ光を符号17で示すと、このレーザ光17は、互いに異なる偏光方向を有する2つの光線17a,17bに分離される。なお、図2では、光線17aを図面に対して垂直な偏光方向、光線17bを図面に対して平行な偏光方向とし、光線17bについては、矢印で表している。
このように横ずれした2つの光線17a,17bは、対物レンズ23を透過して、標本S上に照射される。このときレーザ光線7はガルバノミラー10によって、2次元に走査されているので、2つの光線17a,17bは、標本S上の2次元平面上で走査される。
これらの光線17a,17bは、標本Sを透過する。このとき、2つの光線17a,17bの間に、標本Sによって位相差が生じる。これら位相差の生じた2つの光線17a,17bは、コンデンサレンズ26を介して観察側微分干渉プリズム27に入射される。観察側微分干渉プリズム27は、標本Sを透過した2つの光線17a,17bを合成する。観察側微分干渉プリズム27により合成された光線は、1/4波長板28により、2つの光線17a,17bの偏光方向に分解可能な楕円偏光となる。1/4波長板28からの楕円偏光は、偏光素子29に入射される。偏光素子29は、観察側微分干渉プリズム27により合成された互いに位相差のある2つの光線17a,17bによって干渉を生じさせ、明暗の像を取得する。この干渉像は、反射ミラー30で反射し、第2の光電変換素子31に入射する。
第2の光電変換素子31は、受光量に応じた電流レベルの電気信号に変換出力する。制御装置34は、第2の光電変換素子31から出力された電気信号を入力し、この電気信号を処理して標本Sの透過干渉像を画像化する。
次に、標本Sの蛍光観察について説明する。
この場合、検鏡者により、蛍光観察が選択されると、上述したように制御装置34により電動スライダ21の位置制御が行われ、蛍光観察光路になるように光路切換えが行われ、照明側微分干渉プリズム20が光路上から退避されている(図1(b)参照)。また、標本Sは、蛍光試薬により染色されているものとする。
この状態から、レーザ光源1からレーザ光2が出射されると、このレーザ光2は、上述したと同様にして、集光レンズ3、光ファイバ4を通してスキャナユニット5に導入され、コリメートレンズ6、偏光素子8を通って、ダイクロイックミラー9に入射される。そして、ダイクロイックミラー9により反射偏向され、ガルバノミラー10で2次元に走査され、瞳投影レンズ15を通って反射ミラー16で反射して正立型顕微鏡18に導入される。
この場合、照明側微分干渉プリズム20が光路上に存在しないので、結像レンズ19を通ったレーザ光は、対物レンズ23を透過して、標本S上に照射される。
これにより、標本S上の蛍光試薬がレーザ光により励起され、標本Sより蛍光が発生する。この蛍光は、上述したレーザ光の照射光路とは逆の光路、すなわち対物レンズ23、結像レンズ19を通って、反射ミラー16で反射し、瞳投影レンズ15を通って、ガルバノミラー10に入射し、さらにガルバノミラー10を通って、ダイクロイックミラー9に入射する。この場合、ダイクロイックミラー9は、蛍光の波長を透過する特性を有するので、ダイクロイックミラー9に入射する蛍光は、ダイクロイックミラー9を透過し、反射ミラー11に入射する。そして、反射ミラー11で反射した蛍光は、共焦点レンズ12により共焦点絞り13に集光される。この場合、共焦点絞り13は、共焦点レンズ12の焦点位置で、対物レンズ23の焦点位置、つまり、標本Sの照射位置と共役位置な位置に配置されるので、標本Sの照射位置からの蛍光のみが共焦点絞り13を通過し、第1の光電変換素子14へ入射する。
第1の光電変換素子14は、受光量に応じた電流レベルの電気信号に変換出力する。制御装置34は、第1の光電変換素子14から出力された電気信号を入力し、この電気信号を処理して標本Sの蛍光観察像を画像化する。
従って、このようにすれば、正立型顕微鏡18の結像レンズ19と対物レンズ23との間に照明側微分干渉プリズム20を含む電動スライダ21を設け、セナルモン方式の透過微分干渉観察の際は、制御装置34により電動スライダ21を駆動して照明側微分干渉プリズム20が光路上に挿入するように制御し、一方、蛍光観察のときは、電動スライダ21を駆動して照明側微分干渉プリズム20を光路上から退避させるように制御するようにしたので、透過微分干渉観察から蛍光観察に切り替えた場合も、検鏡者の観察に影響を与えることがなく、解像低下、画像劣化のない標本Sの蛍光観察像を得ることができる。
また、検鏡者は、透過微分干渉観察から蛍光観察の観察方法の切替えを意識せずに、解像低下、画像劣化のない蛍光観察への観察方法の切り替えができるので、検鏡者の誤操作を招くことがなく、常に最適な状態でそれぞれの観察を行なうことができる。
さらに、電動スライダにより透過微分干渉観察と蛍光観察の切替えを自動的に行なうことができるので、検鏡者が誤ってステージ周辺のパッチクランプの電極等の実験用機器などに触るようなことなく観察方法の切り替えを行なうことができる。
さらにまた、電動スライダ21は、駆動用ステッピングモータを用いたパルス信号による位置決め制御が行われるので、、つまり、照明側微分干渉プリズム20の切り替えをクリックレスで行なうことができるので、機械的な位置決め機構などを不要にでき、構成を簡単にできるとともに、標本Sに余計な振動を与えることもなくなり、標本Sの状態を常に安定して保つことができる。
(第2の実施の形態)
図3(a)(b)は、本発明の第2の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の概略構成を示す図で、図1と同一部分には、同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
図3(a)(b)は、本発明の第2の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の概略構成を示す図で、図1と同一部分には、同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
この場合、正立型顕微鏡18は、結像レンズ19とレボルバ24との間に、照明側微分干渉プリズム20を含むスライダ36が設けられている。
スライダ36は、図示矢印37の方向、つまり顕微鏡の鏡基に対し検鏡者側から見て前後方向に観察光路選択ための移動が可能になっている。また、このスライダ36には、検鏡者側の側面にツマミ38が設けられている。このツマミ38は、検鏡者が指先で摘まんでスライダ36の移動を操作するものである。
スライダ36には、位置決めピン39a,39bが設けられている。これら位置決めピン39a,39bは、スライダ36の移動範囲を規制するもので、検鏡者がツマミ38を顕微鏡側に押し込むことで、位置決めピン39aがレボルバ24の側面に突き当たり(図3(a)参照)、この状態で、照明側微分干渉プリズム20を光路上に挿入して微分干渉観察を可能とし、逆に、検鏡者がツマミ38を手前に引き出すことで、位置決めピン39bがレボルバ24の側面に突き当たり(図3(b)参照)、この状態で、照明側微分干渉プリズム20を光路上から退避させ、蛍光観察を可能とするようになっている。また、スライダ36の移動操作により位置決めピン39a,39bがレボルバ24側面に突き当たるように構成されているので、微分干渉観察にするときには、照明側微分干渉プリズム20を確実に光路上に位置させることができるとともに、蛍光観察にするときは、照明側微分干渉プリズム20を光路上から退避させることができる。また、スライダ36の移動量を一定にすることもできる。
また、スライダ36には、図示しないクリック力量が調整可能なメカクリック機構が備えられている。このメカクリック機構は、クリックによるスライダ36の位置決めを可能とするものである。勿論、メカクリック機構を調整することで、クリックレスにスライダ36を構成することが可能である。
その他は、図1と同様である。
次に、上記のように構成された第2の実施の形態の動作について説明する。
まず、標本Sの微分干渉観察について説明する。
この場合、検鏡者がツマミ38を指先で摘まんで、スライダ36を顕微鏡側に押し込むように操作する。これにより、スライダ36の位置決めピン39aがレボルバ24の側面に突き当たり、照明側微分干渉プリズム20が光路上に挿入される(図3(a)参照)。
この状態から、レーザ光源1からレーザ光2が出射されると、レーザ光2は、集光レンズ3、光ファイバ4を通してスキャナユニット5に導入され、コリメートレンズ6、偏光素子8を通って、ダイクロイックミラー9に入射される。そして、ダイクロイックミラー9により反射偏向され、ガルバノミラー10で2次元に走査され、瞳投影レンズ15を通って反射ミラー16で反射して正立型顕微鏡18に導入される。
この場合、光路上に照明側微分干渉プリズム20が挿入されているので、図2の説明で述べたと同様に、結像レンズ19より照明側微分干渉プリズム20に入射するレーザ光17は、互いに異なる偏光方向を有する2つの光線17a,17bに分離され、対物レンズ23を透過して標本S上に照射され、ガルバノミラー10によって、標本S上の2次元平面上で走査される。そして、標本Sを透過する際に、2つの光線17a,17bの間に位相差が生じ、この位相差の生じた2つの光線17a,17bが、コンデンサレンズ26を介して観察側微分干渉プリズム27に入射し合成され、さらに、1/4波長板28により偏光方向に分解可能な楕円偏光となって偏光素子29に入射し、干渉を生じ、明暗の像として取得される。この干渉像は、反射ミラー30で反射し、第2の光電変換素子31に入射する。第2の光電変換素子31は、受光量に応じた電流レベルの電気信号に変換出力する。制御装置34は、第2の光電変換素子31から出力された電気信号を入力し、この電気信号を処理して標本Sの透過干渉像を画像化する。
次に、標本Sの蛍光観察について説明する。
この場合、検鏡者がツマミ38を指先で摘まんで、スライダ36を手前に引き出すように操作する。これにより、スライダ36の位置決めピン39bがレボルバ24の側面に突き当たり、照明側微分干渉プリズム20が光路上から退避される(図3(b)参照)。また、標本Sは、蛍光試薬により染色されているものとする。
この状態から、レーザ光源1からレーザ光2が出射されると、このレーザ光2は、上述したと同様にして、集光レンズ3、光ファイバ4を通してスキャナユニット5に導入され、コリメートレンズ6、偏光素子8を通って、ダイクロイックミラー9に入射される。そして、ダイクロイックミラー9により反射偏向され、ガルバノミラー10で2次元に走査され、瞳投影レンズ15を通って反射ミラー16で反射して正立型顕微鏡18に導入される。この場合、照明側微分干渉プリズム20が光路上に存在しないので、結像レンズ19を通ったレーザ光は、対物レンズ23を透過して、標本S上に照射される。
これにより、標本S上の蛍光試薬がレーザ光により励起され、標本Sより蛍光が発生する。この蛍光は、上述したレーザ光の照射光路とは逆の光路を通って、ダイクロイックミラー9に入射し、さらに、ダイクロイックミラー9を透過し、反射ミラー11で反射し、共焦点レンズ12により共焦点絞り13に集光され、標本Sの照射位置からの蛍光のみが共焦点絞り13を通過し、第1の光電変換素子14へ入射する。
第1の光電変換素子14は、受光量に応じた電流レベルの電気信号に変換出力する。制御装置34は、第1の光電変換素子14から出力された電気信号を入力し、この電気信号を処理して標本Sの蛍光観察像を画像化する。
従って、このようにすれば、検鏡者によるスライダ36の移動による簡単な光路位置の切り替え操作により、セナルモン方式の透過微分干渉観察時の照明側微分干渉プリズム20の光路上への挿入または蛍光観察時の照明側微分干渉プリズム20の光路上からの退避の状態を選択的に得られるので、透過微分干渉観察から蛍光観察に切り替えた場合も、検鏡者の観察に影響を与えることがなく、解像低下、画像劣化のない標本Sの蛍光観察像を得ることができる。
また、スライダ36の移動操作方向は、顕微鏡の前後方向であるので、検鏡者が誤ってステージ周辺のパッチクランプの電極等の実験用機器などに触るようなことも防止でき、観察作業への悪影響を回避できる。
さらに、スライダ36には、位置決めピン39a,39bが設けられ、最小限のスライダ移動のみで観察方法の切り替えができるので、観察方法の切り替え操作を簡単にできる。
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した第1の実施の形態では、駆動用ステッピングモータ22により電動スライダ21を直線方向に移動する例を述べたが、電動式の回転ターレット方式も適用できる。この場合、制御装置34からパルス信号を出力し、照明側微分干渉プリズム20を保持した回転ターレットを所定角度回転させて照明側微分干渉プリズム20の光路上への挿脱を制御するようになる。勿論、第2の実施の形態で述べたスライダ36に代えて手動式の回転ターレット方式を適用することもできる。この場合は、検鏡者の操作により回転ターレットを所定角度回転させて照明側微分干渉プリズム20の光路上への挿脱を制御するようになる。
また、上述した第1の実施の形態では、好ましい例として、電動スライダ21(照明側微分干渉プリズム20)の光路への挿脱状態をフラグ32とセンサ33による検出手段により検出するようにしたが、これら検出手段は必須ではない。例えば、ステッピングモータ22のような回転量(角度)を管理可能なモータの場合、このモータに対する制御手段からの移動制御指令によって制御手段自身が照明側微分干渉プリズム20の光路への挿脱状態を認識できるので、観察方法の選択に連動させて照明側微分干渉プリズム20の光路への挿脱状態を切り替えようにもできる。
また、上述した第1の実施の形態では、電動スライダ21の駆動用にステッピングモータ22を使用したが、これに限らずDCモータを使用した構成でも同様な効果を得ることができる。
さらに、本発明のレーザ光源1は、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザを発生するものであってもよい。このように、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザを用いて蛍光観察を行なう場合に、照明側微分干渉プリズム20を光路から退避させるようにすれば、多光子吸収確率が低下することがなくなり、蛍光の明るさを確保することができる。
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
本発明の実施の形態には、以下の発明も含まれる。
(1)請求項1記載のレーザ顕微鏡において、前記第1の複屈折素子を第1の位置と第2の位置とで切替える切替え手段は、観察方法の選択に応じて前記第1の複屈折素子の前記レーザ光導入光学系の光路への挿脱を切替えることを特徴としている。
(2)(1)記載のレーザ顕微鏡において、前記切替え手段は、前記レーザ光導入光学系の光路に挿脱される前記第1の複屈折素子の挿脱位置を検出する位置検出手段を有し、観察方法の選択により前記位置検出手段の検出結果に応じて前記第1の複屈折素子の前記レーザ光導入光学系の光路への挿脱を切替えることを特徴としている。
(3)(2)記載のレーザ顕微鏡において、前記切替え手段は、直線方向に移動可能なスライダ、観察方法の選択により前記位置検出手段の検出結果に応じて制御信号を出力する制御手段、該制御手段からの制御信号により前記スライダを駆動する駆動手段を有することを特徴としている。
(4)(1)記載のレーザ顕微鏡において、前記切替え手段は、手動により移動可能なスライダを有することを特徴としている。
(5)(1)乃至(4)のいずれかに記載のレーザ顕微鏡において、前記切替え手段は、前記スライダによる前記第1の複屈折素子の切替え方向を鏡基に対して前後方向としたことを特徴としている。
このような発明によれば、スライダは、ステッピングモータなどの駆動手段を用いて位置決め制御が行われるので、構成を簡単にできるとともに、標本に余計な振動を与えることもなくなり、標本の状態を常に安定して保つことができる。また、第1の複屈折素子(照明側微分干渉プリズム)の位置の切り替え方向が顕微鏡の鏡基に対して前後方向なので、ステージ周辺のパッチクランプの電極等の実験用機器などに触ることなく観察方法の切り替えを行なうことができる。
S…標本、1…レーザ光源、2…レーザ光
3…集光レンズ、4…光ファイバ、5…スキャナユニット
6…コリメートレンズ、7…レーザ光線、8…偏光素子
9…ダイクロイックミラー、10…ガルバノミラー
11…反射ミラー、12…共焦点レンズ、13…共焦点絞り
14…第1の光電変換素子、15…瞳投影レンズ
16…反射ミラー、17…レーザ光、17a.17b…光線
18…正立型顕微鏡、19…結像レンズ、20…照明側微分干渉プリズム
21…電動スライダ、22…駆動用ステッピングモータ
23…対物レンズ、24…レボルバ、25…ステージ
26…コンデンサレンズ、27…観察側微分干渉プリズム
28…1/4波長板、29…偏光素子
30…反射ミラー、31…第2の光電変換素子
32…フラグ、33…センサ、34…制御装置
35、37…矢印、36…スライダ、38…ツマミ
39a.39b…ピン
3…集光レンズ、4…光ファイバ、5…スキャナユニット
6…コリメートレンズ、7…レーザ光線、8…偏光素子
9…ダイクロイックミラー、10…ガルバノミラー
11…反射ミラー、12…共焦点レンズ、13…共焦点絞り
14…第1の光電変換素子、15…瞳投影レンズ
16…反射ミラー、17…レーザ光、17a.17b…光線
18…正立型顕微鏡、19…結像レンズ、20…照明側微分干渉プリズム
21…電動スライダ、22…駆動用ステッピングモータ
23…対物レンズ、24…レボルバ、25…ステージ
26…コンデンサレンズ、27…観察側微分干渉プリズム
28…1/4波長板、29…偏光素子
30…反射ミラー、31…第2の光電変換素子
32…フラグ、33…センサ、34…制御装置
35、37…矢印、36…スライダ、38…ツマミ
39a.39b…ピン
Claims (3)
- レーザ光源と、
前記レーザ光源からのレーザ光を標本に照射するためのレーザ光導入光学系と、
前記レーザ光を前記標本に照射することにより当該標本から発せられる光を前記レーザ光導入光学系を介して検出する第1の光検出手段と、
前記標本を透過した光路の光を検出する第2の光検出手段とを備え、
前記レーザ光導入光学系は、前記レーザ光を直線偏光させるための第1の偏光素子、前記直線偏光されたレーザ光を互いに異なる偏光方向を有する2つの光線に分離する第1の複屈折素子、前記標本ヘレーザ光を照射するための対物レンズを有し、
前記標本を透過した光路には、前記標本を透過した前記2つの光線を合成する第2の複屈折素子、前記第2の複屈折素子により合成された光線に位相差を生じさせるための1/4波長板、該1/4波長板により位相差を生じさせた光線に干渉を発生させて像を生じさせる第2の偏光素子を有し、
前記第1の複屈折素子がレーザ光導入光学系の光路に挿入された第1の位置と光路からはずれた第2の位置とで切替え可能であり、前記第1の光検出手段で前記標本からの光を検出する時は前記第1の複屈折素子を前記第2の位置に切換え、前記第2の光検出手段で前記標本を透過する光を検出する時は前記第1の複屈折素子を前記第1の位置に切換えることを特徴とするレーザ顕微鏡。 - 前記第1の複屈折素子の切換えは、クリックレスに構成されることを特徴とする請求項1記載のレーザ顕微鏡。
- 前記レーザ光源は、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザであることを特徴とする請求項1または2記載のレーザ顕微鏡。
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- 2003-12-09 JP JP2003410076A patent/JP2005172987A/ja not_active Withdrawn
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