JP2005172987A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 最適な観察状態により蛍光観察とセナルモン方式の微分干渉観察の切替えを行なうことができるレーザ顕微鏡を提供する。
【解決手段】 正立型顕微鏡１８の結像レンズ１９と対物レンズ２３との間に照明側微分干渉プリズム２０を含む電動スライダ２１を設け、セナルモン方式の透過微分干渉観察の際は、制御装置３４により電動スライダ２１を駆動して照明側微分干渉プリズム２０が光路上に挿入するように制御し、一方、蛍光観察のときは、電動スライダ２１を駆動して照明側微分干渉プリズム２０を光路上から退避させるように制御する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、レーザ光を標本に照射したときに発せられる光や標本を通過した光を検出して標本像を観察するレーザ顕微鏡に関するものである。

例えば医学，生物学の分野では、レーザ顕微鏡が広く用いられている。このレーザ顕微鏡は、レーザ光を励起光として標本に照射し、標本から発せられる蛍光を検出して標本像を構築したり、蛍光量を測定するようにしたものである。

一方、標本は、例えば生細胞であれば、無色透明である。このため、このような標本に対しては、通常の透過観察では、標本像を得ることができない。

そこで、従来では、生細胞の標本像を得るために透過微分干渉観察方法が用いられている。この方法は、偏光を利用することで、微少に横ずれされた２つの波を標本面を透過させ、その光波を干渉させて位相物体を可視化する方法である。この観察方法を用いると、透明な位相標本にコントラストを付けて観察することができ、しかも構成が非常に簡単で偏光板と微分干渉プリズムを通常の顕微鏡に組み合わせるだけで使用できるので、各方面で様々な標本の観察に利用されている。

例えば、パッチクランプ実験に使用されるレーザ顕微鏡では、標本の細胞の位置を探すためにセナルモン方式による微分干渉観察が用いられている。このセナルモン方式の微分干渉観察は、微分干渉観察像のコントラスト調整を偏光板で行なうもので、通常の微分干渉観察のように、結像レンズと対物レンズの間に配置される微分干渉プリズムの位置を微動させてコントラストを変化させるのでなく、標本から離れた位置にある偏光板を回転させることによってコントラストを変化させることができるため、標本の回りにパッチクランプ用の電極が配置される場合も、これらに触れることなくコントラスト調整ができる。

セナルモン方式の透過微分干渉観察に用いられるレーザ顕微鏡は、レーザ光路中に複屈折素子として偏光分離プリズムである微分干渉プリズムを配置している。この微分干渉プリズムはレーザ光を２つの光線に分離し、これら光線を標本面上にシェア量を持って照射するものである。

ところで、このようなレーザ顕微鏡は、透過微分干渉観察の他に、蛍光観察にも用いられることがある。この蛍光観察は、レーザ光を標本に照射したときに標本から発せられる蛍光を検出するものである。

ところが、このような透過微分干渉観察と蛍光観察を切替えて可能としたレーザ顕微鏡は、これら透過微分干渉観察と蛍光観察のいずれの場合も、光路中に微分干渉プリズムが挿入されているため、蛍光観察においても、レーザ光は微分干渉プリズムを透過して２つの光線に分離されて標本に照射されるようになる。このため、特に、通常の光学顕微鏡に比べ解像度の高いレーザ顕微鏡については、蛍光観察により得られる標本像は、微分干渉プリズムを挿入していない状態で得られる標本像と比べて解像度が低下する。また、特に多光子吸収現象を利用した多光子励起蛍光観察を行う場合、標本面でレーザ光が２つに分離していると、多光子吸収確率が低下するので、蛍光の明るさも極端に暗くなる。

そこで、このような標本像の解像度低下や多光子励起蛍光の像劣化を起こさせないために、蛍光観察時に微分干渉プリズムをレーザ光路から取り外す必要がある。しかしながら、セナルモン方式の微分干渉観察を構成しているレーザ顕微鏡では、微分干渉プリズムが固定して配置されているために、簡単にレーザ光路から取り外すことができない。また、仮に、取外し可能に構成されていても、微分干渉プリズムは、対物レンズの直前に配置されているために、レーザ光路から取り外す作業性が著しく悪い。特に、パッチクランプ実験に用いられる正立型顕微鏡では、標本を載せるステージの上方に微分干渉プリズムが配置されており、ステージ上方の特に対物レンズ周囲に、パッチクランプ用の電極が検鏡者により任意の方向から配置されているため、微分干渉プリズムをレーザ顕微鏡のレーザ光路から取り外す作業性は、さらに悪くなり、微分干渉プリズムの取外し作業によって電極に触れたり、作業時に発生する振動により電極の位置が標本からずれ、最悪の場合、標本から電極が抜けるなどして検鏡者が設定した観察条件が無駄になり、観察に大きな影響を与えることがあった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、最適な観察状態で蛍光観察と微分干渉観察の切替えを行なうことができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの前記レーザ光を標本に照射するためのレーザ光導入光学系と、前記レーザ光を前記標本に照射することにより当該標本から発せられる光を前記レーザ光導入光学系を介して検出する第１の光検出手段と、前記標本を透過した光路の光を検出する第２の光検出手段とを備え、前記レーザ光導入光学系は、前記レーザ光を直線偏光させるための第１の偏光素子、前記直線偏光されたレーザ光を互いに異なる偏光方向を有する２つの光線に分離する第１の複屈折素子、前記標本ヘレーザ光を照射するための対物レンズを有し、前記標本を透過した光路には、前記標本を透過した前記２つの光線を合成する第２の複屈折素子、前記第２の複屈折素子により合成された光線に位相差を生じさせるための１／４波長板、該１／４波長板により位相差を生じさせた光線に干渉を発生させて像を生じさせる第２の偏光素子を有し、前記第１の複屈折素子がレーザ光導入光学系の光路に挿入された第１の位置と光路からはずれた第２の位置とで切替え可能であり、前記第１の光検出手段で前記標本からの光を検出する時は前記第１の複屈折素子を前記第２の位置に切換え、前記第２の光検出手段で前記標本を透過する光を検出する時は前記第１の複屈折素子を前記第１の位置に切換えることを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記第１の複屈折素子の切換えは、クリックレスに構成されることを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記レーザ光源は、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザであることを特徴としている。

本発明によれば、セナルモン方式による透過微分干渉観察の際は、第１の複屈折素子（照明側微分干渉プリズム）を光路上に挿入し、蛍光観察のときは、第１の複屈折素子（照明側微分干渉プリズム）を取外すことなく光路上から退避させるようにできるので、透過微分干渉観察から蛍光観察に切り替えた場合も、検鏡者の観察に影響を与えることがなく、解像低下、画像劣化のない標本の蛍光観察像を得ることができる。

また、本発明によれば、第１の複屈折素子の切換えがクリックレスに構成されるので、標本に余計な振動を与えることもなくなり、標本の状態を常に安定して保つことができる。

さらに、本発明によれば、レーザ光源として、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザが用いられても、多光子吸収確率が低下することがなくなり、蛍光の明るさを確保することができる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１（ａ）（ｂ）は、本発明の第１の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の概略構成を示している。

図１（ａ）において、１はレーザ光源で、このレーザ光源１から出射するレーザ光２の光路には、集光レンズ３と光ファイバ４の光入射端が配置されている。集光レンズ３は、レーザ光２を集光し、光ファイバ４の光入射端に導入する。

光ファイバ４には、スキャナユニット５が接続されている。スキャナユニット５は、光ファイバ４の光出射端から出射するレーザ光の光路に、レーザ光導入光学系の一部を構成するコリメートレンズ６、偏光素子８、波長選択素子であるダイクロイックミラー９が配置されている。コリメートレンズ６は、光ファイバ４からのレーザ光を平行光に変換する。偏光素子８は、レーザ光を直線偏光するためのものである。ダイクロイックミラー９は、レーザ光源１からのレーザ光の波長を反射し、後述する標本Ｓからの蛍光の波長を透過するような特性を有している。

ダイクロイックミラー９の反射偏向された光路上には、ガルバノミラー１０が配置されている。ガルバノミラー１０は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のガルバノミラーを有し、これらのガルバノミラーによりダイクロイックミラー９により反射偏向されたレーザ光を２次元に走査するようになっている。ガルバノミラー１０により２次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１５、反射ミラー１６を介して、正立型顕微鏡１８のレーザ光導入光学系へと導入される。反射ミラー１６は、スキャナユニット５からのレーザ光を正立型顕微鏡１８へ反射偏向させるものである。

ダイクロイックミラー９の透過光路上には、第１の光検出手段を構成する反射ミラー１１、共焦点レンズ１２と、共焦点絞り１３および第１の光電変換素子１４が配置されている。共焦点絞り１３は、共焦点レンズ１２の焦点位置に配置されている。第１の光電変換素子１４は、共焦点絞り１３を通過してきた光を光検出し電気信号へ変換出力するもので、ここでは、例えばフォトマルチプライアが用いられる。

正立型顕微鏡１８は、反射ミラー１６の反射光路上に結像レンズ１９、第１の複屈折素子としての照明側微分干渉プリズム２０、対物レンズ２３が配置されている。照明側微分干渉プリズム２０は、反射ミラー１６で反射されるレーザ光を互いに異なる偏光方向を有する２つの光線に分離するもので、この分離された２つの光線を対物レンズ２３を通過してステージ２５上に載置された標本Ｓに照射するようにしている。また、照明側微分干渉プリズム２０は、切替え手段としての電動スライダ２１に設けられ、駆動手段の駆動用ステッピングモータ２２により駆動され、光路上に挿脱可能になっている。この場合、電動スライダ２１の移動方向は、図示矢印３５の方向、つまり顕微鏡の鏡基に対し検鏡者側から見て前後方向に直線移動する。また、照明側微分干渉プリズム２０を有する電動スライダ２１には、フラグ３２が設けられている。フラグ３２に対応してセンサ３３が配置されている。このセンサ３３は、正立型顕微鏡１８側に設けられ、フラグ３２を検知するもので、光路に対して挿脱される電動スライダ２１（照明側微分干渉プリズム２０）の位置を検知するようになっている。

対物レンズ２３は、倍率の異なるものが複数個用意され、それぞれがレボルバ２４に設けられ、レボルバ２４の操作により選択的に光路上に位置されるようになっている。

一方、標本を透過した光路には、コンデンサレンズ２６、第２の複屈折素子としての観察側微分干渉プリズム２７、１／４波長板２８、偏光素子２９、反射ミラー３０が配置されている。

標本Ｓの透過してきたレーザ光は、コンデンサレンズ２６を介して、観察側微分干渉プリズム２７に入射される。観察側微分干渉プリズム２７は、照明側微分干渉プリズム２０で２つに分離された光線を合成するものである。１／４波長板２８は、観察側微分干渉プリズム２７により合成された光線に楕円偏光となるような位相を持たせるようにしている。偏光素子２９は、楕円偏光となった２つの光線に干渉を生じさせ、明暗の像を生成するためのものである。反射ミラー３０は、偏光素子２９を透過した光を反射する。

反射ミラー３０の反射光路上には、第２の光検出手段を構成する第２の光電変換素子３１が配置されている。第２の光電変換素子３１は、反射ミラー３０で反射された光を光検出し電気信号へ変換出力するもので、ここでは、例えばフォトマルチプライアが用いられる。

ガルバノミラー１０、電動スライダ２１の駆動用ステッピングモータ２２、フラグ３２を検知するセンサ３３および第１の光電変換素子１４、第２の光電変換素子３１には、制御手段としての制御装置３４が接続されている。この制御装置３４は、ガルバノミラー１０の駆動制御を始め、センサ３３からの出力信号の処理，駆動用ステッピングモータ２２の駆動制御および第１の光電変換素子１４および第２の光電変換素子３１からそれぞれ出力される電気信号を処理するようになっている。

ここで、照明側微分干渉プリズム２０を含む電動スライダ２１の構成および動作について簡単に説明する。

この場合、センサ３３によるフラグ３２の検知により制御装置３４から電動スライダ２１の駆動用ステッピングモータ２２に制御信号のパルス信号を出力し、電動スライダ２１を駆動する。このときの電動スライダ２１の移動に必要なパルス信号は、予め制御装置３４に記憶されており、常にセンサ３３がフラグ３２を検知した状態を基準として一定量だけ電動スライダ２１を移動させることができるようになっている。これにより、電動スライダ２１は、機械的な位置決めのための機構を必要とせずにクリックレスに光路に挿脱可能となる。また、検鏡者が微分干渉観察または蛍光観察を選択したときに、センサ３３によりフラグ３２の状態を検知すると、以下の制御が実行される。

（１）微分干渉観察が選択された場合
（ａ）センサ３３がフラグ３２を検知した場合、つまり照明側微分干渉プリズム２０が光路上にある場合は、電動スライダ２１は移動しない。

（ｂ）センサ３３がフラグ３２を検知しない場合、つまり照明側微分干渉プリズム２０が光路上にない場合は、制御装置３４より電動スライダ２１の駆動用ステッピングモータ２２にパルス信号を出力し、電動スライダ２１を駆動して、照明側微分干渉プリズム２０を光路上に移動する。

（２）蛍光観察が選択された場合
（ｃ）センサ３３がフラグ３２を検知した場合、つまり照明側微分干渉プリズム２０が光路上にある場合には、制御装置３４より電動スライダ２１の駆動用ステッピングモータ２２にパルス信号を出力し、電動スライダ２１を駆動して、照明側微分干渉プリズム２０を光路上から外すように移動する。

（ｄ）センサ３３がフラグ３２を検知しない場合、つまり、照明側微分干渉プリズム２０が光路上にない場合は、既に蛍光観察光路になっているため、電動スライダ２１は移動しない。

次に、上記のように構成された第１の実施の形態の動作について説明する。

まず、標本Ｓの微分干渉観察について説明する。

検鏡者により微分干渉観察か選択されると、上述したように制御装置３４により電動スライダ２１の位置制御が行われ、微分干渉観察光路になるように光路切換えが行われ、照明側微分干渉プリズム２０が光路上に挿入される（図１（ａ）参照）。

この状態から、レーザ光源１からレーザ光２が出射されると、レーザ光２は、集光レンズ３により集光され、光ファイバ４の光入射端へ導入される。

光ファイバ４を通してスキャナユニット５にレーザ光が導入されると、このレーザ光は、コリメートレンズ６により平行光となり、偏光素子８により直線偏光され、ダイクロイックミラー９に入射される。そして、ダイクロイックミラー９により反射偏向され、ガルバノミラー１０に入射する。

ガルバノミラー１０は、ダイクロイックミラー９により反射偏向されたレーザ光を２次元に走査する。この２次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１５を通って反射ミラー１６で反射して正立型顕微鏡１８に導入され、結像レンズ１９を通って照明側微分干渉プリズム２０に入射する。

この場合、図２に示すように結像レンズ１９より照明側微分干渉プリズム２０に入射するレーザ光を符号１７で示すと、このレーザ光１７は、互いに異なる偏光方向を有する２つの光線１７ａ，１７ｂに分離される。なお、図２では、光線１７ａを図面に対して垂直な偏光方向、光線１７ｂを図面に対して平行な偏光方向とし、光線１７ｂについては、矢印で表している。

このように横ずれした２つの光線１７ａ，１７ｂは、対物レンズ２３を透過して、標本Ｓ上に照射される。このときレーザ光線７はガルバノミラー１０によって、２次元に走査されているので、２つの光線１７ａ，１７ｂは、標本Ｓ上の２次元平面上で走査される。

これらの光線１７ａ，１７ｂは、標本Ｓを透過する。このとき、２つの光線１７ａ，１７ｂの間に、標本Ｓによって位相差が生じる。これら位相差の生じた２つの光線１７ａ，１７ｂは、コンデンサレンズ２６を介して観察側微分干渉プリズム２７に入射される。観察側微分干渉プリズム２７は、標本Ｓを透過した２つの光線１７ａ，１７ｂを合成する。観察側微分干渉プリズム２７により合成された光線は、１／４波長板２８により、２つの光線１７ａ，１７ｂの偏光方向に分解可能な楕円偏光となる。１／４波長板２８からの楕円偏光は、偏光素子２９に入射される。偏光素子２９は、観察側微分干渉プリズム２７により合成された互いに位相差のある２つの光線１７ａ，１７ｂによって干渉を生じさせ、明暗の像を取得する。この干渉像は、反射ミラー３０で反射し、第２の光電変換素子３１に入射する。

第２の光電変換素子３１は、受光量に応じた電流レベルの電気信号に変換出力する。制御装置３４は、第２の光電変換素子３１から出力された電気信号を入力し、この電気信号を処理して標本Ｓの透過干渉像を画像化する。

次に、標本Ｓの蛍光観察について説明する。

この場合、検鏡者により、蛍光観察が選択されると、上述したように制御装置３４により電動スライダ２１の位置制御が行われ、蛍光観察光路になるように光路切換えが行われ、照明側微分干渉プリズム２０が光路上から退避されている（図１（ｂ）参照）。また、標本Ｓは、蛍光試薬により染色されているものとする。

この状態から、レーザ光源１からレーザ光２が出射されると、このレーザ光２は、上述したと同様にして、集光レンズ３、光ファイバ４を通してスキャナユニット５に導入され、コリメートレンズ６、偏光素子８を通って、ダイクロイックミラー９に入射される。そして、ダイクロイックミラー９により反射偏向され、ガルバノミラー１０で２次元に走査され、瞳投影レンズ１５を通って反射ミラー１６で反射して正立型顕微鏡１８に導入される。

この場合、照明側微分干渉プリズム２０が光路上に存在しないので、結像レンズ１９を通ったレーザ光は、対物レンズ２３を透過して、標本Ｓ上に照射される。

これにより、標本Ｓ上の蛍光試薬がレーザ光により励起され、標本Ｓより蛍光が発生する。この蛍光は、上述したレーザ光の照射光路とは逆の光路、すなわち対物レンズ２３、結像レンズ１９を通って、反射ミラー１６で反射し、瞳投影レンズ１５を通って、ガルバノミラー１０に入射し、さらにガルバノミラー１０を通って、ダイクロイックミラー９に入射する。この場合、ダイクロイックミラー９は、蛍光の波長を透過する特性を有するので、ダイクロイックミラー９に入射する蛍光は、ダイクロイックミラー９を透過し、反射ミラー１１に入射する。そして、反射ミラー１１で反射した蛍光は、共焦点レンズ１２により共焦点絞り１３に集光される。この場合、共焦点絞り１３は、共焦点レンズ１２の焦点位置で、対物レンズ２３の焦点位置、つまり、標本Ｓの照射位置と共役位置な位置に配置されるので、標本Ｓの照射位置からの蛍光のみが共焦点絞り１３を通過し、第１の光電変換素子１４へ入射する。

第１の光電変換素子１４は、受光量に応じた電流レベルの電気信号に変換出力する。制御装置３４は、第１の光電変換素子１４から出力された電気信号を入力し、この電気信号を処理して標本Ｓの蛍光観察像を画像化する。

従って、このようにすれば、正立型顕微鏡１８の結像レンズ１９と対物レンズ２３との間に照明側微分干渉プリズム２０を含む電動スライダ２１を設け、セナルモン方式の透過微分干渉観察の際は、制御装置３４により電動スライダ２１を駆動して照明側微分干渉プリズム２０が光路上に挿入するように制御し、一方、蛍光観察のときは、電動スライダ２１を駆動して照明側微分干渉プリズム２０を光路上から退避させるように制御するようにしたので、透過微分干渉観察から蛍光観察に切り替えた場合も、検鏡者の観察に影響を与えることがなく、解像低下、画像劣化のない標本Ｓの蛍光観察像を得ることができる。

また、検鏡者は、透過微分干渉観察から蛍光観察の観察方法の切替えを意識せずに、解像低下、画像劣化のない蛍光観察への観察方法の切り替えができるので、検鏡者の誤操作を招くことがなく、常に最適な状態でそれぞれの観察を行なうことができる。

さらに、電動スライダにより透過微分干渉観察と蛍光観察の切替えを自動的に行なうことができるので、検鏡者が誤ってステージ周辺のパッチクランプの電極等の実験用機器などに触るようなことなく観察方法の切り替えを行なうことができる。

さらにまた、電動スライダ２１は、駆動用ステッピングモータを用いたパルス信号による位置決め制御が行われるので、、つまり、照明側微分干渉プリズム２０の切り替えをクリックレスで行なうことができるので、機械的な位置決め機構などを不要にでき、構成を簡単にできるとともに、標本Ｓに余計な振動を与えることもなくなり、標本Ｓの状態を常に安定して保つことができる。

（第２の実施の形態）
図３（ａ）（ｂ）は、本発明の第２の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の概略構成を示す図で、図１と同一部分には、同一符号を付してその詳しい説明は省略する。

この場合、正立型顕微鏡１８は、結像レンズ１９とレボルバ２４との間に、照明側微分干渉プリズム２０を含むスライダ３６が設けられている。

スライダ３６は、図示矢印３７の方向、つまり顕微鏡の鏡基に対し検鏡者側から見て前後方向に観察光路選択ための移動が可能になっている。また、このスライダ３６には、検鏡者側の側面にツマミ３８が設けられている。このツマミ３８は、検鏡者が指先で摘まんでスライダ３６の移動を操作するものである。

スライダ３６には、位置決めピン３９ａ，３９ｂが設けられている。これら位置決めピン３９ａ，３９ｂは、スライダ３６の移動範囲を規制するもので、検鏡者がツマミ３８を顕微鏡側に押し込むことで、位置決めピン３９ａがレボルバ２４の側面に突き当たり（図３（ａ）参照）、この状態で、照明側微分干渉プリズム２０を光路上に挿入して微分干渉観察を可能とし、逆に、検鏡者がツマミ３８を手前に引き出すことで、位置決めピン３９ｂがレボルバ２４の側面に突き当たり（図３（ｂ）参照）、この状態で、照明側微分干渉プリズム２０を光路上から退避させ、蛍光観察を可能とするようになっている。また、スライダ３６の移動操作により位置決めピン３９ａ，３９ｂがレボルバ２４側面に突き当たるように構成されているので、微分干渉観察にするときには、照明側微分干渉プリズム２０を確実に光路上に位置させることができるとともに、蛍光観察にするときは、照明側微分干渉プリズム２０を光路上から退避させることができる。また、スライダ３６の移動量を一定にすることもできる。

また、スライダ３６には、図示しないクリック力量が調整可能なメカクリック機構が備えられている。このメカクリック機構は、クリックによるスライダ３６の位置決めを可能とするものである。勿論、メカクリック機構を調整することで、クリックレスにスライダ３６を構成することが可能である。

その他は、図１と同様である。

次に、上記のように構成された第２の実施の形態の動作について説明する。

まず、標本Ｓの微分干渉観察について説明する。

この場合、検鏡者がツマミ３８を指先で摘まんで、スライダ３６を顕微鏡側に押し込むように操作する。これにより、スライダ３６の位置決めピン３９ａがレボルバ２４の側面に突き当たり、照明側微分干渉プリズム２０が光路上に挿入される（図３（ａ）参照）。

この状態から、レーザ光源１からレーザ光２が出射されると、レーザ光２は、集光レンズ３、光ファイバ４を通してスキャナユニット５に導入され、コリメートレンズ６、偏光素子８を通って、ダイクロイックミラー９に入射される。そして、ダイクロイックミラー９により反射偏向され、ガルバノミラー１０で２次元に走査され、瞳投影レンズ１５を通って反射ミラー１６で反射して正立型顕微鏡１８に導入される。

この場合、光路上に照明側微分干渉プリズム２０が挿入されているので、図２の説明で述べたと同様に、結像レンズ１９より照明側微分干渉プリズム２０に入射するレーザ光１７は、互いに異なる偏光方向を有する２つの光線１７ａ，１７ｂに分離され、対物レンズ２３を透過して標本Ｓ上に照射され、ガルバノミラー１０によって、標本Ｓ上の２次元平面上で走査される。そして、標本Ｓを透過する際に、２つの光線１７ａ，１７ｂの間に位相差が生じ、この位相差の生じた２つの光線１７ａ，１７ｂが、コンデンサレンズ２６を介して観察側微分干渉プリズム２７に入射し合成され、さらに、１／４波長板２８により偏光方向に分解可能な楕円偏光となって偏光素子２９に入射し、干渉を生じ、明暗の像として取得される。この干渉像は、反射ミラー３０で反射し、第２の光電変換素子３１に入射する。第２の光電変換素子３１は、受光量に応じた電流レベルの電気信号に変換出力する。制御装置３４は、第２の光電変換素子３１から出力された電気信号を入力し、この電気信号を処理して標本Ｓの透過干渉像を画像化する。

次に、標本Ｓの蛍光観察について説明する。

この場合、検鏡者がツマミ３８を指先で摘まんで、スライダ３６を手前に引き出すように操作する。これにより、スライダ３６の位置決めピン３９ｂがレボルバ２４の側面に突き当たり、照明側微分干渉プリズム２０が光路上から退避される（図３（ｂ）参照）。また、標本Ｓは、蛍光試薬により染色されているものとする。

この状態から、レーザ光源１からレーザ光２が出射されると、このレーザ光２は、上述したと同様にして、集光レンズ３、光ファイバ４を通してスキャナユニット５に導入され、コリメートレンズ６、偏光素子８を通って、ダイクロイックミラー９に入射される。そして、ダイクロイックミラー９により反射偏向され、ガルバノミラー１０で２次元に走査され、瞳投影レンズ１５を通って反射ミラー１６で反射して正立型顕微鏡１８に導入される。この場合、照明側微分干渉プリズム２０が光路上に存在しないので、結像レンズ１９を通ったレーザ光は、対物レンズ２３を透過して、標本Ｓ上に照射される。

これにより、標本Ｓ上の蛍光試薬がレーザ光により励起され、標本Ｓより蛍光が発生する。この蛍光は、上述したレーザ光の照射光路とは逆の光路を通って、ダイクロイックミラー９に入射し、さらに、ダイクロイックミラー９を透過し、反射ミラー１１で反射し、共焦点レンズ１２により共焦点絞り１３に集光され、標本Ｓの照射位置からの蛍光のみが共焦点絞り１３を通過し、第１の光電変換素子１４へ入射する。

第１の光電変換素子１４は、受光量に応じた電流レベルの電気信号に変換出力する。制御装置３４は、第１の光電変換素子１４から出力された電気信号を入力し、この電気信号を処理して標本Ｓの蛍光観察像を画像化する。

従って、このようにすれば、検鏡者によるスライダ３６の移動による簡単な光路位置の切り替え操作により、セナルモン方式の透過微分干渉観察時の照明側微分干渉プリズム２０の光路上への挿入または蛍光観察時の照明側微分干渉プリズム２０の光路上からの退避の状態を選択的に得られるので、透過微分干渉観察から蛍光観察に切り替えた場合も、検鏡者の観察に影響を与えることがなく、解像低下、画像劣化のない標本Ｓの蛍光観察像を得ることができる。

また、スライダ３６の移動操作方向は、顕微鏡の前後方向であるので、検鏡者が誤ってステージ周辺のパッチクランプの電極等の実験用機器などに触るようなことも防止でき、観察作業への悪影響を回避できる。

さらに、スライダ３６には、位置決めピン３９ａ，３９ｂが設けられ、最小限のスライダ移動のみで観察方法の切り替えができるので、観察方法の切り替え操作を簡単にできる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した第１の実施の形態では、駆動用ステッピングモータ２２により電動スライダ２１を直線方向に移動する例を述べたが、電動式の回転ターレット方式も適用できる。この場合、制御装置３４からパルス信号を出力し、照明側微分干渉プリズム２０を保持した回転ターレットを所定角度回転させて照明側微分干渉プリズム２０の光路上への挿脱を制御するようになる。勿論、第２の実施の形態で述べたスライダ３６に代えて手動式の回転ターレット方式を適用することもできる。この場合は、検鏡者の操作により回転ターレットを所定角度回転させて照明側微分干渉プリズム２０の光路上への挿脱を制御するようになる。

また、上述した第１の実施の形態では、好ましい例として、電動スライダ２１（照明側微分干渉プリズム２０）の光路への挿脱状態をフラグ３２とセンサ３３による検出手段により検出するようにしたが、これら検出手段は必須ではない。例えば、ステッピングモータ２２のような回転量（角度）を管理可能なモータの場合、このモータに対する制御手段からの移動制御指令によって制御手段自身が照明側微分干渉プリズム２０の光路への挿脱状態を認識できるので、観察方法の選択に連動させて照明側微分干渉プリズム２０の光路への挿脱状態を切り替えようにもできる。

また、上述した第１の実施の形態では、電動スライダ２１の駆動用にステッピングモータ２２を使用したが、これに限らずＤＣモータを使用した構成でも同様な効果を得ることができる。

さらに、本発明のレーザ光源１は、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザを発生するものであってもよい。このように、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザを用いて蛍光観察を行なう場合に、照明側微分干渉プリズム２０を光路から退避させるようにすれば、多光子吸収確率が低下することがなくなり、蛍光の明るさを確保することができる。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の実施の形態には、以下の発明も含まれる。

（１）請求項１記載のレーザ顕微鏡において、前記第１の複屈折素子を第１の位置と第２の位置とで切替える切替え手段は、観察方法の選択に応じて前記第１の複屈折素子の前記レーザ光導入光学系の光路への挿脱を切替えることを特徴としている。

（２）（１）記載のレーザ顕微鏡において、前記切替え手段は、前記レーザ光導入光学系の光路に挿脱される前記第１の複屈折素子の挿脱位置を検出する位置検出手段を有し、観察方法の選択により前記位置検出手段の検出結果に応じて前記第１の複屈折素子の前記レーザ光導入光学系の光路への挿脱を切替えることを特徴としている。

（３）（２）記載のレーザ顕微鏡において、前記切替え手段は、直線方向に移動可能なスライダ、観察方法の選択により前記位置検出手段の検出結果に応じて制御信号を出力する制御手段、該制御手段からの制御信号により前記スライダを駆動する駆動手段を有することを特徴としている。

（４）（１）記載のレーザ顕微鏡において、前記切替え手段は、手動により移動可能なスライダを有することを特徴としている。

（５）（１）乃至（４）のいずれかに記載のレーザ顕微鏡において、前記切替え手段は、前記スライダによる前記第１の複屈折素子の切替え方向を鏡基に対して前後方向としたことを特徴としている。

このような発明によれば、スライダは、ステッピングモータなどの駆動手段を用いて位置決め制御が行われるので、構成を簡単にできるとともに、標本に余計な振動を与えることもなくなり、標本の状態を常に安定して保つことができる。また、第１の複屈折素子（照明側微分干渉プリズム）の位置の切り替え方向が顕微鏡の鏡基に対して前後方向なので、ステージ周辺のパッチクランプの電極等の実験用機器などに触ることなく観察方法の切り替えを行なうことができる。

本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の微分干渉の作用を説明するための図。 本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。

符号の説明

Ｓ…標本、１…レーザ光源、２…レーザ光
３…集光レンズ、４…光ファイバ、５…スキャナユニット
６…コリメートレンズ、７…レーザ光線、８…偏光素子
９…ダイクロイックミラー、１０…ガルバノミラー
１１…反射ミラー、１２…共焦点レンズ、１３…共焦点絞り
１４…第１の光電変換素子、１５…瞳投影レンズ
１６…反射ミラー、１７…レーザ光、１７ａ．１７ｂ…光線
１８…正立型顕微鏡、１９…結像レンズ、２０…照明側微分干渉プリズム
２１…電動スライダ、２２…駆動用ステッピングモータ
２３…対物レンズ、２４…レボルバ、２５…ステージ
２６…コンデンサレンズ、２７…観察側微分干渉プリズム
２８…１／４波長板、２９…偏光素子
３０…反射ミラー、３１…第２の光電変換素子
３２…フラグ、３３…センサ、３４…制御装置
３５、３７…矢印、３６…スライダ、３８…ツマミ
３９ａ．３９ｂ…ピン

Claims (3)

1. レーザ光源と、
   前記レーザ光源からのレーザ光を標本に照射するためのレーザ光導入光学系と、
   前記レーザ光を前記標本に照射することにより当該標本から発せられる光を前記レーザ光導入光学系を介して検出する第１の光検出手段と、
   前記標本を透過した光路の光を検出する第２の光検出手段とを備え、
   前記レーザ光導入光学系は、前記レーザ光を直線偏光させるための第１の偏光素子、前記直線偏光されたレーザ光を互いに異なる偏光方向を有する２つの光線に分離する第１の複屈折素子、前記標本ヘレーザ光を照射するための対物レンズを有し、
   前記標本を透過した光路には、前記標本を透過した前記２つの光線を合成する第２の複屈折素子、前記第２の複屈折素子により合成された光線に位相差を生じさせるための１／４波長板、該１／４波長板により位相差を生じさせた光線に干渉を発生させて像を生じさせる第２の偏光素子を有し、
   前記第１の複屈折素子がレーザ光導入光学系の光路に挿入された第１の位置と光路からはずれた第２の位置とで切替え可能であり、前記第１の光検出手段で前記標本からの光を検出する時は前記第１の複屈折素子を前記第２の位置に切換え、前記第２の光検出手段で前記標本を透過する光を検出する時は前記第１の複屈折素子を前記第１の位置に切換えることを特徴とするレーザ顕微鏡。
2. 前記第１の複屈折素子の切換えは、クリックレスに構成されることを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡。
3. 前記レーザ光源は、多光子励起を標本に生じさせる超短パルスレーザであることを特徴とする請求項１または２記載のレーザ顕微鏡。

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