JP2005165212A

JP2005165212A - 走査型共焦点顕微鏡装置

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Publication number: JP2005165212A
Application number: JP2003407666A
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Inventors: Hiroshi Sasaki; 浩佐々木
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Abstract

【課題】簡易な構成により、試料内の所望の領域に刺激光を照射して光刺激を与えながら、試料内の任意の所望空間を蛍光観察できる走査型共焦点顕微鏡装置を提供すること。
【解決手段】試料１に光化学変化をもたらす刺激光を照射し、励起光を励起光集光点に集光させて試料１に照射し、励起光を走査させ、刺激光の影響を含めた蛍光を観察する走査型共焦点顕微鏡装置１００において、刺激光の集光位置の深さ方向に垂直な所定面を走査させるガルバノミラーユニット６２と、刺激光の走査領域を制御する刺激光走査制御部４０ｃと、励起蛍光光路９１上に設けられ励起光の集光位置を深さ方向に変化させるデフォーマブルミラー３１と、励起光の集光位置を所望の位置に可変に制御する励起光集光位置制御部４０ｂと、を備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光染色した試料に刺激光を照射して励起光を照射し、前記試料から発する蛍光を検知し、刺激光の影響も含めて空間の蛍光分布を観察する走査型共焦点顕微鏡装置に関するものである。

試料に刺激を与える刺激用レーザを備えた走査型共焦点顕微鏡装置は、Caged手法、ＦＬＩＰ（Fluorescence loss In Photobleaching）等に有効であることが知られている。Caged手法とは、試料内にケージド試薬とカルシウムイオン濃度に感受性を有する蛍光指示薬とを注入し、試料の部位に刺激用レーザ光を照射してケージド試薬のケージド基を開裂させる。ケージド基が開裂すると、内部に包含された物質が放出され、その時のカルシウムイオン濃度の経時変化を、観察用励起レーザ光を試料に照射することにより蛍光観察する手法である。また、ＦＬＩＰとは、細胞内の特定の部位を刺激用レーザ光で繰り返し照射することにより褪色させ、その部位の外側領域の蛍光強度が蛋白質の拡散により減少する過程を、観察用励起レーザ光を試料に照射することにより、試料から発する蛍光を時間経過観察する方法である。Caged手法、ＦＬＩＰ共に、試料の特定の部位に刺激用レーザ光により光刺激を与えながら、試料の経時変化を、観察用励起レーザ光を試料に照射することにより蛍光観察することが重要である（特許文献１参照）。

特開平１０−２０６７４２号公報（３頁）

ところで近年、試料の３次元の蛍光観察の要求が高まっている。前述したCaged手法、ＦＬＩＰにおいても、例えば、任意の部位に刺激用レーザ光を照射して光刺激を与えながら、観察用励起レーザ光を照射して３次元の蛍光観察を行う要望が高まっている。しかし、刺激用レーザ光の光軸と垂直な集光面は試料と対物レンズとの距離で決まり、基本的には同一面となっている。従って、試料内の３次元の蛍光観察を行うために、試料と対物レンズとの距離をステッピングモータ等の顕微鏡焦点調整機構により変化させると、刺激用レーザ光の集光面も、観察用励起レーザ光の集光面とともに変化し、試料内の３次元空間の所望の領域に光刺激を与え続けることができない。つまり、従来は試料内の任意の点を含む領域を刺激用レーザ光により、連続的、あるいは繰り返し光刺激を与えながら、試料の３次元の蛍光観察をすることはできなかった。つまり、光刺激と組合せると共焦点効果による３次元の蛍光観察が可能である走査型共焦点顕微鏡装置の利点を発揮できず所望の条件における蛍光画像が取得できないという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡易な構成により、試料内の所望の領域に刺激光を照射して光刺激を与えながら、試料内の任意の所望空間を蛍光観察できる走査型共焦点顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、請求項１にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、試料に光化学変化をもたらす刺激光を照射し、励起光を励起光集光点に集光させて前記試料に照射し、少なくとも前記励起光を深さ方向に垂直な面で走査させ、前記刺激光の影響を含めた蛍光を観察する走査型共焦点顕微鏡装置において、少なくとも前記刺激光の集光位置の深さ方向に垂直な所定面を走査させる刺激光走査手段と、前記刺激光の走査領域を所望の領域に制御する刺激光走査制御手段と、前記励起光と前記蛍光とが通る光路のうち前記刺激光がさらに通る共通光路を除いた光路である励起蛍光光路上に設けられ少なくとも前記励起光の集光位置を深さ方向に変化させる励起光集光位置変化手段と、前記励起光の集光位置を所望の位置に可変に制御する励起光制御手段と、を備えたことを特徴とする。

この請求項１の発明によれば、刺激光により所望面又はポイントに刺激を与えながら、刺激光の照射面とは独立に励起光の集光位置を深さ方向に変化させつつ励起光を走査させることにより、所望空間の蛍光分布が取得できる。

また、請求項２にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記刺激光走査制御手段は、前記試料の所望の点又は所望の領域に刺激を与えるように前記刺激光を制御するとともに、前記励起光制御手段は、前記励起光の集光位置の深さ方向の変化を加えて所定空間を走査させるように前記励起光を制御し、所定空間の蛍光分布を取得することを特徴とする。

また、請求項３にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記刺激光が通る刺激光光路のうち前記共通光路を除いた前記刺激光光路上に設けられ少なくとも前記刺激光の集光位置を深さ方向に変化させる刺激光集光位置変化手段と、前記刺激光の集光位置を所望の位置に可変に制御する刺激光制御手段と、を備えたことを特徴とする。

この請求項３の発明によれば、励起光の集光位置とは独立に刺激光の集光位置を深さ方向に変化させつつ刺激光を走査させることにより、刺激光により所望空間に刺激を与えることができる。

また、請求項４にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記刺激光制御手段は、前記刺激光の集光位置の深さ方向の変化を加えて所定空間を走査させるように前記刺激光を制御し、所定空間に刺激を与えるとともに、前記励起光制御手段は、前記励起光の集光位置の深さ方向の変化を加えて所定空間を走査させるように前記励起光を制御し、所定空間の蛍光分布を取得することを特徴とする。

この請求項４の発明によれば、刺激光により所望空間に刺激を与えつつ、所望空間の蛍光分布を取得することができる。

また、請求項５にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、所望空間の蛍光分布を所定時間間隔毎に順次取得することを特徴とする。

また、請求項６にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記刺激光制御手段は前記刺激光集光位置変化手段を制御し、前記刺激光走査制御手段は前記刺激光走査手段を制御し、複数の空間又はポイントを順次切換えて前記刺激光により照射しながら、前記励起光制御手段は前記励起光の集光位置の深さ方向の変化を加えて所定面を走査させるように前記励起光を制御し、前記試料から発する反応光を検出することにより、前記試料の所望の空間の画像を取得することを特徴とする。

また、請求項７にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記励起光集光位置変化手段および前記刺激光集光位置変化手段の少なくともいずれかは、収差の補償を含めて入出力波面の変換を行う波面変換素子であることを特徴とする。

また、請求項８にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記波面変換素子は、デフォーマブルミラーまたは液晶光学素子であることを特徴とする。

また、請求項９にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、上記の発明において、前記刺激光は、多光子励起に用いられる赤外パルスレーザ光であることを特徴とする。

上記目的を達成するため、請求項１０にかかる走査型共焦点顕微鏡装置は、試料に励起光を照射し、該励起光を励起光集光点に集光させ、少なくとも該励起光を深さ方向に垂直な面で走査させるとともに、前記試料に光化学変化をもたらす刺激光を照射し、該刺激光を刺激光集光点に集光させ、少なくとも該刺激光を深さ方向に垂直な面で走査させ、前記励起光集光点から発する前記刺激光の影響を含めた蛍光を観察する走査型共焦点顕微鏡装置において、前記刺激光が通る光路のうち前記励起光および前記蛍光とがさらに通る共通光路を除いた光路である刺激光光路上に設けられ、収差の補償を含めて入出力波面の変換を行って少なくとも前記刺激光の集光位置を深さ方向に変化させる波面変換素子と、前記刺激光の集光位置を所望の位置に可変に制御する刺激光制御手段と、を備えたことを特徴とする。

この請求項１０の発明によれば、励起光の集光位置とは独立に刺激光の集光位置を深さ方向に変化させつつ刺激光を走査させることにより、所望空間に刺激を与えることができる。

本発明にかかる走査型共焦点顕微鏡装置によれば、励起光の集光位置を深さ方向に変化させる励起光集光位置変化手段を、刺激光と励起蛍光とが共用する共通光路外の励起蛍光光路に設けることにより、刺激光集光位置とは独立に励起光集光位置を深さ方向に変化させることが可能となり、例えば、刺激光の集光点を固定して励起光集光位置を深さ方向に変化させつつ所定面を走査することにより、刺激光の所定空間への影響を知ることができるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかる走査型共焦点顕微鏡装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１である走査型共焦点顕微鏡装置１００の概要構成を示すブロック図である。走査型共焦点顕微鏡装置１００は、励起光と蛍光とを制御する励起照射ユニット９０Ａと、刺激光を制御する刺激光照射ユニット９２と、励起照射ユニット９０Ａと刺激光照射ユニット９２とを制御する制御部４０Ａとを有し、励起光と蛍光とが通る励起蛍光光路９１と、刺激光が通る刺激光光路９３とが共用する共通光路９４に配置される合成ダイクロイックミラー６６と、対物レンズ７１と、対物レンズ７１を支持するガイド駆動機構７２と、ガイド駆動機構７２を駆動させるモータ７０と、観察対象である試料１と、試料１を載置する試料ステージ３とを有している。

制御部４０Ａは、励起光走査制御部４０ａと、励起光集光位置制御部４０ｂと、刺激光走査制御部４０ｃとを有している。励起光走査制御部４０ａは、励起光走査ユニット３０Ａ内のガルバノミラーユニット３９を制御することによって励起光の走査面を走査制御している。励起光集光位置制御部４０ｂは、励起光走査ユニット３０Ａ内の波面変換素子であるデフォーマブルミラー３１を制御することによって励起光の集光点の深さ方向の位置を制御している。刺激光走査制御部４０ｃは、刺激光走査ユニット６０Ａ内のガルバノミラーユニット６２を制御することによって刺激光の走査面を走査制御している。また、制御部４０Ａは、光検知器３３Ａと、電動シャッタ５１と、モータ７０とをそれぞれ制御している。

励起光照射ユニット９０Ａは、励起光源レーザユニット１０と、励起光走査ユニット３０Ａとを有している。励起光源ユニット１０は、アルゴンレーザ発振器１０ａと、音響光学素子１０ｂとを有し、アルゴンレーザ発振器１０ａから出射した波長４８８ｎｍのレーザ光は音響光学素子１０ｂにより出力強度が変調され、励起光源レーザユニット１０から励起光として出射する。出射した励起光はシングルモードファイバ２０を介して励起光走査ユニット３０Ａに入射する。入射した励起光は、可視レーザ光導入ポート４１とコリメートレンズ３２と励起ダイクロイックミラー３６とを順次介して波面変換素子であるデフォーマブルミラー３１に入射する。デフォーマブルミラー３１は、後述するように光の反射面を凹凸状に高速に変化させることができ、入射光を平行光以外の収束光、あるいは発散光に可変させて反射させることができる。結果的にデフォーマブルミラー３１が反射面を可変させることによって、励起光の深さ方向の集光位置を可変することができる。デフォーマブルミラー３１の反射面は励起光集光点位置制御部４０ｂにより制御されているため、デフォーマブルミラー３１で反射した励起光の光束は制御されて反射し、ガルバノミラーユニット３９に向かう。ガルバノミラーユニット３９に入射した励起光は、励起光走査制御部４０ａによって励起光の走査面が走査制御され、１対のガルバノミラー３９ａ，３９ｂを介して瞳投影レンズ４０に入射する。

瞳投影レンズ４０に入射した励起光は、励起蛍光光路９１を通り結像レンズ６５を介して励起光照射ユニット９０Ａから出射し、合成ダイクロイックミラー６６に入射する。合成ダイクロイックミラー６６に入射した励起光は、共通光路９４を通り対物レンズ７１を介して試料１内の励起光の集光点に集光する。

試料１内の励起光の集光点は励起され基底状態に遷移する過程で波長５０５〜６００ｎｍの蛍光を発する。励起光の集光点から発した蛍光は、共通光路９４と励起蛍光光路９１とを逆行し、励起ダイクロイックミラー３６まで到達する。蛍光は励起ダイクロイックミラー３６を透過し、共焦点レンズ３７と反射ミラー３８とを順次介し、さらに共焦点ピンホール３５の位置を調整することによって励起光の集光点から発した蛍光のみが共焦点ピンホール３５を通過し、バリアフィルタ３４を通過して光検知器３３Ａに入射する。光検知器３３Ａに入射した蛍光は電気信号に変換され、制御部４０Ａに出力される。制御部４０Ａに入力した電気信号は、画像処理部８０に蛍光信号として出力され、画像処理部８０は、入力した蛍光信号により、蛍光画像を作成する。

一方、刺激光照射ユニット９２は、刺激光源ユニット５０と、刺激光の出射を制御する電動シャッタ５１と、１対のビームエクスパンダ５２，５３と、刺激光走査ユニット６０Ａと、結像レンズ６４とを有し、刺激光源ユニット５０からは波長７２０ｎｍの赤外パルスレーザ光が発振し、電動シャッタ５１が開くことにより刺激光として出射する。出射した刺激光は、１対のビームエクスパンダ５２，５３を介して刺激光走査ユニット６０Ａに入射する。刺激光走査ユニット６０Ａは、ミラー６７と、ガルバノミラーユニット６２と瞳投影レンズ６３とを有し、刺激光走査ユニット６０Ａに入射した刺激光は、ミラー６７を介してガルバノミラーユニット６２に入射する。ガルバノミラーユニット６２に入射した刺激光は、刺激光走査制御部４０ｃによって刺激光の走査面が偏向制御されて１対のガルバノミラー６２ａ，６２ｂを介して瞳投影レンズ６３に出射する。

瞳投影レンズ６３に入射した刺激光は刺激光光路９３を通り結像レンズ６４を介して励刺激光照射ユニット９２から出射し、合成ダイクロイックミラー６６に入射する。合成ダイクロイックミラー６６で反射した刺激光は、共通光路９４を通り対物レンズ７１を介して試料１内の刺激光の集光点に集光する。

刺激光の集光点に存在する物質がケージド試薬とカルシウムイオン濃度に感受性を有する蛍光指示薬で染色されていると、刺激光の集光点では２光子励起が起き、ケージド試薬のケージド基が開裂する。刺激光の集光点においては波長７２０ｎｍの２個の光子が同時に吸収されることにより、波長７２０ｎｍの２倍のエネルギーが刺激光の集光点に生じ２光子励起がおこる。１光子では刺激用レーザ光が通過する試料１内の円錐領域全体に光刺激が与えられることになるが、２光子励起の場合、２個の光子が同時に吸収されないと２光子励起が発生しないので、試料１に刺激光が集光した位置にのみ２光子励起が生じ、光刺激が与えられる。このことは、試料１の３次元空間の１箇所に刺激を与えるような場合には特に有効である。２光子励起によりケージド基が開裂すると内部に包含された物質が放出され、放出された物質によってカルシウムイオン濃度が変化する。カルシウムイオン濃度が変化すると波長４８８ｎｍの励起光に対して発する蛍光強度が変化する。

したがって、ケージド解除などの刺激用レーザ光の照射位置を試料１の刺激を与えたい１点に固定した状態で、観察用励起レーザ光による３次元的な蛍光観察が可能となる。また、刺激用レーザ光として２光子励起を起こさせる赤外パルスレーザ光を用いているので、刺激を与える点を３次元空間中の刺激光の集光位置に限定できるので、不要な部位を同時に光刺激することがなく、正確な点に刺激を与えたことによる正確な観察が可能となる。

また、ＦＬＩＰにおいては、刺激用レーザ光として２光子励起でフォトブリーチングを行う波長８００ｎｍの赤外パルスレーザを用いる。試料にはＧＦＰなど蛍光蛋白が標識されており、蛍光観察用として波長４８８ｎｍで励起すると５００ｎｍ〜６００ｎｍの波長の蛍光を発する。なお、刺激用レーザ光の光路と蛍光観察用励起レーザ光の光路とを合成する合成ダイクロイックミラー６６の特性は、刺激用レーザ光の波長８００ｎｍは反射し、蛍光観察用励起レーザ光の波長４８８ｎｍ、および蛍光波長５００ｎｍ〜６００ｎｍを透過するようになっている。

通常のフォトブリーチング手法は、褪色させる刺激用レーザ光の波長と蛍光を観察する観察用励起レーザ光の波長が同じなので、２つの光路を合成する合成ダイクロイックミラー６６の特性で、どちらかの波長にロスが生じることになるが、本発明においては、刺激用レーザ光に赤外パルスレーザ光を用いることによりブリーチさせるレーザ光の波長と蛍光を観察する観察用レーザ光の波長とを分離することができるので、合成ダイクロイックミラー６６の特性を両方のレーザ光ともロスしない特性にできる。特に高出力が必要なフォトブリーチングを行う赤外パルスレーザ光の光量ロスが少ないことは有効である。

ところで前述したように、デフォーマブルミラー３１は、光の反射面の形状を変化させることによって、励起光の集光点の深さ方向の位置を変化させるとともに入射光と反射光との収差を補償する機能をもっている。図２は、デフォーマブルミラー３１が共焦点位置制御部４０ｂからの制御によって反射面断面を凹凸型に変化させ、反射した励起光の光束が変化するところを示している。反射面断面が凸型に変形すると、励起光は拡散光となり、凹型に変形すると、励起光は収束光となる。図３は、デフォーマブルミラー３１により、反射した励起光が拡散光となると対物レンズ７１を介し励起光集光点５が深い励起光集光点５Ｂに変化し、励起光が収束光となると励起光集光点５が浅い励起光集光点５Ｂに変化することを示している。つまり、デフォーマブルミラー３１の反射面を可変することにより、励起光集光点５が深さ方向に可変できることになる。また、励起光集光点５の位置が変化することにともなって励起光走査面２の深さも変化することを示している。

したがって、励起光集光点５の深さ方向の位置を変化させながら所定の励起光走査面２を走査すると、試料１内の所定空間の蛍光分布が取得でき、蛍光強度を画像信号に変換することにより、所定空間の蛍光分布を立体画像として観察することができる。また、このような励起光による、所定空間の走査を所定時間間隔で繰り返すと、蛍光分布の立体画像の経時変化も観察することができる。つまり、ある点に与えた刺激光の影響により放出した物質により変化するカルシウムイオン濃度の経時変化を立体的に観察することができる。

図４は、デフォーマブルミラー３１を制御して励起光走査面２を深さ方向に変化させ、結果的に刺激光集光点４とは独立に試料１中の所望の空間の蛍光分布が取得できることを示している。また、図５は、デフォーマブルミラー３１とガルバノミラーユニット３９とを同時に制御し、励起光の走査を行いつつ励起光の深さ方向を変化させ、結果的に刺激光集光走査面４Ａとは独立に斜面形状の所望の空間の蛍光分布を取得することができることを示している。このように、励起光の走査と励起光の深さ方向の変化とを組み合わせる制御を行うと、試料１中の任意形状の平面を含む曲面と、任意形状の空間の蛍光観察が可能になる。例えば、励起光の深さ方向のみで構成される平面の蛍光観察も可能である。

図６に示すように光の深さ方向をＺ軸とし、光の深さ方向に垂直な面をＸ−Ｙ軸として表すと、試料１の特定点１０６に刺激用レーザ光を照射し、２光子励起によりブリーチしながら蛍光観察用励起レーザ光により試料１内の所望空間１０５を走査して蛍光共焦点画像を観察できるので、試料１内の特定点１０６を連続的または繰り返し刺激用レーザ光を照射してブリーチしながら、特定点１０６の外側領域の所望空間１０５の蛍光強度が蛍光蛋白の拡散により減少する経時的な変化を共焦点により３次元的に蛍光観察できる。

図７は、試料１内の刺激光集光走査面４Ａに刺激光を与えるとともに、所望空間１０１の蛍光分布を所定時間間隔で繰り返し取得することにより、刺激光の所望空間１０１への影響の経時変化が観察できることを示している。なお、所望空間１０１は図７に示すように所望の形状にすることができる。

次に、励起光光源をレーザから水銀ランプに代え、ガルバノミラーユニット３９を複数のピンホールが形成されたニポウディスク８２に代え、光検知器３３ＡをＣＣＤカメラ３３Ｂに代えることによっても、デフォーマブルミラー３１を用いれば、励起光により、所望空間の蛍光分布が取得できることを説明する。図８は、この発明の実施の形態１の変形例である走査型共焦点顕微鏡装置１１０の概要構成を示すブロック図である。図８では、励起走査ユニット３０Ａを励起走査ユニット３０Ｂに代えている。なお、図１と同一の構成については同一の符号を付す。励起走査ユニット３０Ｂに取り付けられた水銀ランプ８３は、波長７２０ｎｍの光を励起光として出射する。励起光は、コリメートレンズ３７ｄを介して励起ダイクロイックミラー３６に入射する。励起ダイクロイックミラー３６に入射した励起光は反射され、レンズ３７ｂと、ニポウディスク８２と、レンズ３７ａとを順次介してデフォーマブルミラー３１に入射する。デフォーマブルミラー３１は、入射した励起光を反射し、レンズ４０を介して励起光走査ユニット３０Ｂから励起光を出射させる。

ニポウディスク８２には、複数のピンホールが空けられていて、その複数のピンホールの共焦点効果により同時に複数の励起光を通過させるとともに、励起蛍光光路を逆行した複数の蛍光を同時に通過させることができる。したがって、励起光走査制御部４０ｅがモータ８１の回転を制御してニポウディスク８２を回転させ、レンズ３７ｃを介したＣＣＤカメラ３３Ｂが蛍光を検知することにより、試料１内の所定面の蛍光分布を取得することができる。また、励起光集光位置制御部４０ｂは、デフォーマブルミラー３１を制御することによって、励起光の深さ方向の集光位置を制御している。このように励起光源として水銀ランプ８３と、ニポウディスク８２と、ＣＣＤカメラ３３Ｂとを用いても、刺激を与えたい点に与えた刺激光の影響により放出した物質により変化するカルシウムイオン濃度の経時変化を立体的に観察することができる。

ニポウディスク８２を用いると、同時に複数の蛍光を通過させることができるため、短時間に所望空間の蛍光分布が取得でき、早い変化に対応できる。なお、ニポウディスク８２に代えて円板にスリットが形成されたスリットディスクを用いても同様の効果が得られる。励起光源として水銀ランプ８３以外にもキセノンランプ、またはＬＥＤなどが使用でき、装置を安価にすることができる。

上述の実施の形態においては、反射型のデフォーマブルミラー３１を用いたが、透過型の液晶光学素子または液晶レンズ等を用いるようにしてもよい。

（実施の形態２）
つぎに、この発明の実施の形態２について説明する。上述した実施の形態１では、デフォーマブルミラー３１を用いて励起光の集光点の深さ方向の位置を変化させていたが、この実施の形態２では、デフォーマブルミラー３１Ｂを共通光路９４外の刺激光光路９３にも設け、所望空間に刺激光により刺激を与えながら所望空間の蛍光分布が取得できるようにしている。

図９は、この発明の実施の形態２である走査型共焦点顕微鏡装置１２０の概要構成を示すブロック図である。刺激光照射ユニット６０Ｂは、ミラー６７，６８と、デフォーマブルミラー３１Ｂと、ガルバノミラーユニット６２と、瞳投影レンズ６３とを有している。また、制御部４０Ｃは、励起光走査制御部４０ａと、励起光集光位置制御部４０ｂと、刺激光走査制御部４０ｃと、刺激光集光位置制御部４０ｄとを有している。なお、図１と同一の構成については同一の符号を付す。

励起光走査制御部４０ａは、ガルバノミラーユニット３９を制御することによって、励起光走査面２を走査制御し、励起光集光位置制御部４０ｂは、デフォーマブルミラー３１を制御することによって、励起光の集光点の深さ方向の位置を制御している。刺激光走査制御部４０ｃは、ガルバノミラーユニット６２を制御することによって、刺激光の走査面を走査制御して、刺激光集光位置制御部４０ｄは、デフォーマブルミラー３１Ｂを制御することによって、刺激光の集光点の深さ方向の位置を制御している。

デフォーマブルミラー３１Ｂは、実施の形態１に説明したデフォーマブルミラー３１と同様に光の反射面を変化させるとともに入射光と反射光との収差を補償する機能を持ち、共通光路９４外に配置されている。したがって、デフォーマブルミラー３１Ｂの反射面を制御することにより、刺激光の集光点の深さ方向の位置を励起光とは独立に可変させることができる。したがって、刺激光を走査させつつ深さ方向を変化させることが可能となり、刺激光においても、試料１中の任意形状の空間に刺激を与えることができることになる。

図１０は、刺激光を走査させつつ刺激光の深さ方向の位置を変化させることにより、試料１中の任意の空間に刺激を与えるとともに、励起光を走査させつつ励起光の深さ方向の位置を変化させ、試料１中の任意の空間の蛍光観察が行えることを示している。さらに、図１１は、励起光を複数の離散空間にスキップすることにより、試料１内の所望空間１０２に刺激を与えつつ、所望空間１０３，１０４の蛍光分布を取得できることを示している。また、刺激光を励起光と同様に複数の離散空間にスキップすることにより複数の所望空間に刺激を与えることも可能となる。このようにすれば、試料１中の任意の３次元領域に光刺激を与えながら、刺激を与える領域とは異なる任意の３次元領域の経時変化を観察用励起レーザ光により観察することができる。例えば、刺激を与える領域からの距離により蛍光拡散が起こる時間差を観察するような場合は、刺激を与える領域を１箇所とし、観察する領域を２箇所とすればよい。また、逆に刺激を与える領域を２箇所にし、交互に刺激を与えながら観察する領域を１箇所としてもよい。また、所望空間１０２，１０３，１０４を、任意形状にすることもできる。

この発明の実施の形態１である走査型共焦点顕微鏡装置の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態１のデフォーマブルミラーの機能を示す説明図である。この発明の実施の形態１のデフォーマブルミラーによって、励起光集光点の深さ方向の位置が変化することを示す説明図である。この発明の実施の形態１の刺激光集光点とは独立に所望空間の蛍光分布が取得できることを示す説明図である。この発明の実施の形態１の所望面に刺激を与えつつ斜面形状の所望空間の蛍光分布が取得できることを示す説明図である。この発明の実施の形態１の所望点に連続的または繰り返し刺激を与えて所望空間の蛍光分布が取得できることを示す説明図である。この発明の実施の形態１の所望面に刺激を与えつつ所望空間の蛍光分布を所定時間間隔により取得することができることを示す説明図である。この発明の実施の形態１の変形例である走査型共焦点顕微鏡装置の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態２である走査型共焦点顕微鏡装置の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態２の所望空間に刺激を与えつつ所望空間の蛍光分布を取得することができることを説明する説明図である。この発明の実施の形態２の所望空間に刺激を与えつつ複数の離散的な所望空間の蛍光分布を取得することができることを示す説明図である。

符号の説明

１試料
２，２ａ，２ｂ励起光走査面
３試料ステージ
４，４ａ，４ｂ刺激光集光点
４Ａ刺激光走査面
５，５ａ，５ｂ励起光集光点
１０励起光源レーザユニット
１０ａアルゴンレーザ発振器
１０ｂ音響光学素子
２０シングルモードファイバ
３０Ａ励起光走査ユニット
３０Ｂ励起蛍光ユニット
３１，３１Ｂデフォーマブルミラー
３２コリメートレンズ
３３Ａ光検知器
３３ＢＣＣＤカメラ
３４バリアフィルタ
３５共焦点ピンホール
３６励起ダイクロイックミラー
３７共焦点レンズ
３８，３８Ｂ，６８反射ミラー
３９，６２ガルバノミラーユニット
３９ａ，３９ｂ，６２ａ，６２ｂガルバノミラー
４０レンズ
４０Ａ，４０Ｂ，４０Ｃ，４０Ｄ制御部
４０ａ，４０ｅ励起光走査制御部
４０ｂ，４０ｆ励起光集光位置制御部
４０ｃ刺激光走査制御部
４０ｄ刺激光集光位置制御部
４１可視光レーザ導入ポート
５０刺激光源ユニット
５１電動シャッタ
５２，５３ビームエクスパンダ
６０Ａ，６０Ｂ刺激光走査ユニット
６３瞳投影レンズ
６４，６５結像レンズ
６６合成ダイクロイックミラー
６７ミラー
７０，８１モータ
７１対物レンズ
７２ガイド駆動機構
８０画像処理部
８２ニポウディスク
９０，９０Ａ，９０Ｃ励起光照射ユニット
９１励起蛍光光路
９２刺激光照射ユニット
９３刺激光光路
９４共通光路
１００，１１０，１２０，１３０走査型共焦点顕微鏡装置
１０１，１０２，１０３，１０４，１０５所望空間
１０６特定点

Claims

試料に光化学変化をもたらす刺激光を照射し、励起光を励起光集光点に集光させて前記試料に照射し、少なくとも前記励起光を深さ方向に垂直な面で走査させ、前記刺激光の影響を含めた蛍光を観察する走査型共焦点顕微鏡装置において、
少なくとも前記刺激光の集光位置の深さ方向に垂直な所定面を走査させる刺激光走査手段と、
前記刺激光の走査領域を所望の領域に制御する刺激光走査制御手段と、
前記励起光と前記蛍光とが通る光路のうち前記刺激光がさらに通る共通光路を除いた光路である励起蛍光光路上に設けられ少なくとも前記励起光の集光位置を深さ方向に変化させる励起光集光位置変化手段と、
前記励起光の集光位置を所望の位置に可変に制御する励起光制御手段と、
を備えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡装置。
前記刺激光走査制御手段は、前記試料の所望の点又は所望の領域に刺激を与えるように前記刺激光を制御するとともに、
前記励起光制御手段は、前記励起光の集光位置の深さ方向の変化を加えて所定空間を走査させるように前記励起光を制御し、所定空間の蛍光分布を取得することを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
前記刺激光が通る刺激光光路のうち前記共通光路を除いた前記刺激光光路上に設けられ少なくとも前記刺激光の集光位置を深さ方向に変化させる刺激光集光位置変化手段と、
前記刺激光の集光位置を所望の位置に可変に制御する刺激光制御手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１または２に記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
前記刺激光制御手段は、前記刺激光の集光位置の深さ方向の変化を加えて所定空間を走査させるように前記刺激光を制御し、所定空間に刺激を与えるとともに、前記励起光制御手段は、前記励起光の集光位置の深さ方向の変化を加えて所定空間を走査させるように前記励起光を制御し、所定空間の蛍光分布を取得することを特徴とする請求項３に記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
所望空間の蛍光分布を所定時間間隔毎に順次取得することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
前記刺激光制御手段は前記刺激光集光位置変化手段を制御し、前記刺激光走査制御手段は前記刺激光走査手段を制御し、複数の空間又はポイントを順次切換えて前記刺激光により照射しながら、前記励起光制御手段は前記励起光の集光位置の深さ方向の変化を加えて所定面を走査させるように前記励起光を制御し、前記試料から発する反応光を検出することにより、前記試料の所望の空間の画像を取得することを特徴とする請求項３〜５のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
前記励起光集光位置変化手段および前記刺激光集光位置変化手段の少なくともいずれかは、収差の補償を含めて入出力波面の変換を行う波面変換素子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
前記波面変換素子は、デフォーマブルミラーまたは液晶光学素子であることを特徴とする請求項７に記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
前記刺激光は、多光子励起に用いられる赤外パルスレーザ光であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一つに記載の走査型共焦点顕微鏡装置。
試料に励起光を照射し、該励起光を励起光集光点に集光させ、少なくとも該励起光を深さ方向に垂直な面で走査させるとともに、前記試料に光化学変化をもたらす刺激光を照射し、該刺激光を刺激光集光点に集光させ、少なくとも該刺激光を深さ方向に垂直な面で走査させ、前記励起光集光点から発する前記刺激光の影響を含めた蛍光を観察する走査型共焦点顕微鏡装置において、
前記刺激光が通る光路のうち前記励起光および前記蛍光とがさらに通る共通光路を除いた光路である刺激光光路上に設けられ、収差の補償を含めて入出力波面の変換を行って少なくとも前記刺激光の集光位置を深さ方向に変化させる波面変換素子と、
前記刺激光の集光位置を所望の位置に可変に制御する刺激光制御手段と、
を備えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡装置。