JP2007107946A - Peptide array for detecting phosphorization - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、物質相互作用の解析系に用いられるペプチドチップにおいて、非特異的な影響を受けることなく、標的とする物質間の結合シグナルを増大させることの可能なペプチドアレイに関する。 The present invention relates to a peptide array capable of increasing a binding signal between target substances without being influenced non-specifically in a peptide chip used in a substance interaction analysis system.
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。 In recent years, biochips used for biomolecule interaction analysis, profiling of expressed molecules, or diagnosis have attracted attention. The operation is facilitated by immobilizing the biomolecule on the substrate, and in some cases, the interaction of a very large number of substances can be analyzed. In particular, peptide arrays in which peptides with relatively small molecular weights are immobilized on a substrate have relatively few problems of denaturation such as proteins, and have strong combinatorial chemistry aspects. It has come to be widely used for searching and the like.
これら生体分子同士の相互作用を観察する際に問題になるのが非特異的吸着による影響である。非特異的吸着とは、本来であれば相互作用しない分子へ対象物質が非特異的に吸着する場合のことを言う。その結果、擬陽性の判定を与えるため好ましくない。非特異的な吸着を抑制するために、生体高分子が固定化された基板を、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧということもある）などの親水性高分子で表面をコートしたバイオチップが開発されている。例えば、カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している（非特許文献１）。これらの親水性高分子には生体分子の非特異的吸着を抑制する効果があることが知られている。しかしながら、親水性高分子のコーティングによって、生体分子が親水性高分子中に埋没してしまい、生体高分子同士の相互作用が阻害されるという問題を生じる場合がある。 A problem in observing the interaction between these biomolecules is the effect of non-specific adsorption. Non-specific adsorption refers to a case where the target substance adsorbs non-specifically to molecules that do not interact with each other. As a result, a false positive determination is given, which is not preferable. In order to suppress non-specific adsorption, biochips have been developed in which a substrate on which a biopolymer is immobilized is coated with a hydrophilic polymer such as dextran or polyethylene glycol (sometimes called PEG). Yes. For example, the carboxyl group of carboxymethyldextran is activated with water-soluble carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), and the formed succinimide group and the biomolecule are successfully immobilized (Non-patent Document 1). . These hydrophilic polymers are known to have an effect of suppressing nonspecific adsorption of biomolecules. However, the coating of the hydrophilic polymer may cause a problem that the biomolecule is buried in the hydrophilic polymer and the interaction between the biopolymers is hindered.
この生体高分子同士の相互作用の阻害は、測定シグナル低下の原因となる。この相互作用の阻害は、親水性高分子のコーティングに起因するだけでなく、生体高分子を基板に直接的に結合することによって生じることも少なくない。これは、生体高分子を基板に直接的に結合すると、生体高分子の自由度が抑制されるためである。バイオチップの測定シグナル向上のためには、生体高分子同士の相互作用を容易せしめる必要がある。 This inhibition of the interaction between biopolymers causes a decrease in the measurement signal. This inhibition of interaction is not only due to the coating of the hydrophilic polymer, but is often caused by binding the biopolymer directly to the substrate. This is because when the biopolymer is directly bonded to the substrate, the degree of freedom of the biopolymer is suppressed. In order to improve the measurement signal of the biochip, it is necessary to facilitate the interaction between biopolymers.
生体分子同士の相互作用をより容易に行わせるために、基板にスペーサーを介して生体分子を固定化する検討がなされている。しかしながら、特に高分子量のスペーサーを介して生体分子を固定化すると、固定化反応効率の低下や測定系への阻害などの悪影響が生じる可能性が高くなることもあり、必ずしも好ましくない。 In order to facilitate interaction between biomolecules, studies have been made to immobilize biomolecules on a substrate via a spacer. However, in particular, immobilization of a biomolecule via a high molecular weight spacer is not always preferred because it may increase the possibility of adverse effects such as a decrease in immobilization reaction efficiency and inhibition on the measurement system.
特にペプチドを基板上に固定化するに際しては、高分子量のリンカーを介した固定化反応では、その収率が非常に低下し、測定シグナルの低下や非特異的なシグナルの増大を起こすことが頻繁に見られる。しかしながら、リンカーを介さない、もしくは低分子量のリンカーを介する固定化では、スペーサー効果が十分に機能しにくいため、固定化ペプチドの自由度が小さくなり、優れた測定結果が得られなくなる確率が高まるという問題がある。
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制しながらも、なおかつ標的物質における結合シグナルを増大することのできるペプチドアレイに関する技術を提供することにある。 The subject of this invention is providing the technique regarding the peptide array which can increase the binding signal in a target substance, while suppressing the nonspecific adsorption | suction of a biomolecule.
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the above problems can be solved by the following means, and have reached the present invention.
１． 基板上に固定化されたペプチドのリン酸化を検出するためのアレイであって、該ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸は１残基以下であることを特徴とするリン酸化検出用ペプチドアレイ。
1. An array for detecting phosphorylation of a peptide immobilized on a substrate, wherein the basic amino acid in the amino acid sequence of the
２． 塩基性アミノ酸がリジンであることを特徴とする項１に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
2.
３． ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中に２残基以上の中性アミノ酸が含有されることを特徴とする項１又は２に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
3.
４． 中性アミノ酸がアラニンであることを特徴とする項１〜３のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
4).
５． 基板表面が金であることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
5.
６． 基板がガラスであることを特徴とする項１〜５のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
6).
７． ペプチドの固定化される側の末端がシステイン残基であることを特徴とする項１〜６のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
7).
８． アレイが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に用いられることを特徴とする項１〜７のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
8).
９． アレイがオートラジオグラフィに用いられることを特徴とする項１〜８のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
9.
１０． リン酸化されるアミノ酸残基が、固定化されていない側の末端から４残基以上離れていることを特徴とする項１〜９のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
10.
１１． リン酸化されるアミノ酸がチロシンである項１〜１０のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
11.
１２． リン酸化されるアミノ酸の基板側に少なくとも１個のスペーサーアミノ酸を連結してなる項１〜１１のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
12
１３． 前記スペーサーアミノ酸がGly-Glyである項１２に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
13. Item 13. The peptide array for detecting phosphorylation according to
１４． 項１〜１３のいずれかに記載のペプチドアレイにＡＴＰ及びキナーゼを作用させ、リン酸化されたペプチドを検出することを特徴とする、ペプチドのリン酸化検出方法。
14 Item 14. A method for detecting the phosphorylation of a peptide, comprising detecting a phosphorylated peptide by allowing ATP and a kinase to act on the peptide array according to any one of
本発明におけるリン酸化検出用ペプチドアレイは、固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸は１残基以下であるペプチドを用いることで、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化効率が増し測定シグナルを向上させ、更に非特異的吸着が抑制された精度のよいペプチドチップを用いた測定系を得ることができる。
The peptide array for detection of phosphorylation in the present invention uses a peptide in which the basic amino acid in the amino acid sequence of the
キナーゼによるリン酸化を測定するために、基質ペプチドのC末端にLys（K）を３個連結することで遊離ペプチド基質では、高効率でキナーゼによるリン酸化が生じることが知られているが、on-chipではキナーゼの効率が低下し、この固定化されていない末端のLys（K）ような塩基性アミノ酸の数を１個以下にするとｏｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化の効率が飛躍的に向上することが本発明により明らかになった。 In order to measure phosphorylation by kinase, it is known that phosphorylation by kinase occurs with high efficiency in free peptide substrate by linking three Lys (K) to C-terminus of substrate peptide. -chip reduces the efficiency of the kinase, and if the number of basic amino acids such as Lys (K) at the end of the immobilization is reduced to 1 or less, the efficiency of on-chip phosphorylation is dramatically improved. This has been clarified by the present invention.
本発明におけるペプチドの基板上への固定化方法は特に限定されるものではないが、例えばチオール基を介してペプチドを固定化する方法が挙げられる。固定化されるペプチドに関しては、１種類のみであってもよいし、２種類以上であってもよい。ここで用いられるペプチドは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が４個以上ペプチド結合により連結されたものであって、酵素の基質として機能しうる性質を有するものをいう。その基質配列部位のアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、１０〜２５残基程度がより好ましい。分析する目的に応じて、アミノ酸残基のうち１乃至数残基において化学的な修飾を加えられたアミノ酸が含まれていてもよい。また特に限定されるものではないが、特定の酵素に対して基質としての機能を有しているペプチドを少なくとも１種は含むことが好ましい。 The method for immobilizing a peptide on a substrate in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method for immobilizing a peptide via a thiol group. Regarding the peptide to be immobilized, there may be only one type, or two or more types. The peptide used herein refers to a commonly used meaning, and is a peptide in which four or more amino acids are linked by peptide bonds and has a property of functioning as an enzyme substrate. The number of amino acid residues in the substrate sequence site is not particularly limited, but is usually about 5 to 60 residues, and more preferably about 10 to 25 residues. Depending on the purpose of analysis, amino acids in which one or several residues among the amino acid residues are chemically modified may be included. Further, although not particularly limited, it is preferable that at least one peptide having a function as a substrate for a specific enzyme is included.
ここで、基板に固定化される部位とは、具体的には例えば固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在する状態のものをいう。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。また、別な態様として、固定化されるペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものも挙げられる。この場合に該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。システインは、側鎖のチオール基を介して基板に直接又は適当なスペーサーを介して結合する。 Here, the site immobilized on the substrate specifically means, for example, a state where at least one cysteine residue is present in the amino acid sequence of the peptide to be immobilized. The cysteine residue is an amino acid necessary for the peptide to be immobilized to have its original function, even if it exists as an essential residue as an amino acid sequence necessary for the peptide to function. It may be a case where it is further added to the sequence. The position of the cysteine residue in the peptide to be immobilized is not particularly limited, but it is preferably added to at least one end, more preferably only to one end. As another embodiment, a compound in which a compound having a thiol group is chemically bonded to one or more amino acid residues with respect to the peptide to be immobilized. In this case, the bonding position of the compound is not particularly limited, but is preferably bonded to any terminal amino acid residue. Cysteine is bound directly to the substrate via a side chain thiol group or via a suitable spacer.
本発明のペプチドアレイにおいて用いられるペプチドは、ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸は１残基以下であることを特徴とする。ここで、塩基性アミノ酸とは、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどが挙げられる。蛋白質構成アミノ酸でないものとしては、ヒドロキシリジン、オルニチンなども例示される。特にはリジンが挙げられる。
The peptide used in the peptide array of the present invention is characterized in that the basic amino acid in the amino acid sequence of the
より好ましくは、ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中に２残基以上の中性アミノ酸が含有されている。ここで、中性アミノ酸とは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、プロリンなどが挙げられる。特にはアラニンであることが好ましい。 More preferably, two or more neutral amino acids are contained in the amino acid sequence of the terminal three residues on the non-immobilized side of the peptide. Here, neutral amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, asparagine, glutamine, methionine, proline and the like. Particularly preferred is alanine.
固定化されていない側の末端アミノ酸は、LysまたはAlaが特に好ましい。 The terminal amino acid on the non-immobilized side is particularly preferably Lys or Ala.
固定化されていない側の末端にリジンのような塩基性アミノ酸がリッチな配列の基質ペプチドを用いると、その極性荷電の影響から、プロテインキナーゼを作用させた場合に、プロテインキナーゼが反発されやすくなり基質ペプチドに接近しにくくなるものと考えられる。特にアレイのように固定化されたペプチドにおいては、基質の自由度が低くなることから、その傾向がより顕著になり、その結果リン酸化を受けにくくなってしまうものと推定される。したがって、リン酸化検出用アレイに用いる基質を設計するに際して、溶液中のように遊離状態でリン酸化されやすいことが既知であるアミノ酸配列を用いる場合に、一方の末端付近に塩基性アミノ酸がリッチな場合、特に３残基以上存在する場合には、該塩基性アミノ酸を２残基以上削除して１残基以下にするか、もしくはアラニンのような中性アミノ酸に置換するという技術的手法を用いて最適化することが可能である。 If a substrate peptide with a sequence rich in basic amino acids such as lysine is used at the non-immobilized end, the protein kinase is likely to be repelled when the protein kinase is activated due to the influence of its polar charge. It is thought that it becomes difficult to access the substrate peptide. In particular, in the case of peptides immobilized like an array, since the degree of freedom of the substrate is low, this tendency becomes more prominent, and as a result, it is presumed that the peptide is less susceptible to phosphorylation. Therefore, when designing a substrate to be used for an array for phosphorylation detection, when using an amino acid sequence that is known to be easily phosphorylated in a free state as in a solution, a basic amino acid is rich near one end. In particular, in the case where there are 3 or more residues, the technical method of deleting 2 or more basic amino acids to 1 residue or substituting with a neutral amino acid such as alanine is used. Can be optimized.
プロテインキナーゼとしては、cSrc、MAPK、PKA、PKC、EGFR、Insulin Receptor, Akt、CaMK等が挙げられるが、特に限定されるものではなく、あらゆる蛋白質のリン酸化に関与するプロテインキナーゼが対象となり得る。
ｃＳｒｃキナーゼの基質となるペプチドの配列がＩＹＧＥＦである場合、基板に必要に応じて適当なスペーサーを介して連結される本発明の特に好ましいペプチドとしては、Ｃ−（スペーサーペプチド）−ＩＹＧＥＦ−（Ａ又はＫ）が挙げられる。
Examples of protein kinases include cSrc, MAPK, PKA, PKC, EGFR, Insulin Receptor, Akt, CaMK, and the like.
When the sequence of the peptide serving as a substrate for cSrc kinase is IYGEF, as a particularly preferred peptide of the present invention linked to the substrate via an appropriate spacer as necessary, C- (spacer peptide) -IYGEF- (A Or K).
他のプロテインキナーゼの基質ペプチドの場合にも、同様の規則により、基板に結合するのに特に好ましいペプチド配列は、当業者により容易に決定される。 For other protein kinase substrate peptides, particularly preferred peptide sequences for binding to the substrate can be readily determined by those skilled in the art by similar rules.
本発明においては、上記基板に固定化される部位と基質配列部位との間にスペーサーとして親水性化合物もしくは数残基からなるアミノ酸配列が挿入されていることがより好ましい。親水性化合物の場合に、その分子量は特に限定されないが、１００〜１０００が好ましく、４００〜１０００がより好ましい。また、上記親水性化合物とともに、アミノ酸残基数が１〜１０個、より好ましくは２〜６個からなるスペーサー配列を更に付加させてもよい。スペーサー配列を構成するアミノ酸残基の種類は特に限定されるものではないが、高次構造の形成を起こしにくいアミノ酸を含むことが好ましい。具体的には、少なくとも１つはグリシン残基を含むことが好ましい。より好ましくは、１残基のグリシン（Ｇ）、２残基のグリシン（ＧＧ）、グリシンとアラニン（ＧＡもしくはＡＧ）、あるいはグリシンとセリン（ＧＳもしくはＳＧ）残基の繰り返しを１回以上、更に好ましくは２回以上含んでなる。 In the present invention, it is more preferable that a hydrophilic compound or an amino acid sequence consisting of several residues is inserted as a spacer between the site immobilized on the substrate and the substrate sequence site. In the case of a hydrophilic compound, the molecular weight is not particularly limited, but is preferably 100 to 1000, and more preferably 400 to 1000. In addition to the above hydrophilic compound, a spacer sequence having 1 to 10, more preferably 2 to 6 amino acid residues may be further added. The type of amino acid residue constituting the spacer sequence is not particularly limited, but it is preferable to include an amino acid that is less likely to form a higher order structure. Specifically, at least one preferably contains a glycine residue. More preferably, one residue of glycine (G), two residues of glycine (GG), glycine and alanine (GA or AG), or glycine and serine (GS or SG) residues are repeated one or more times. Preferably it comprises two or more times.
ここで、親水性化合物とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことを言い、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ＰＥＧ、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。なかでも、ＰＥＧが特に好ましい。こうしたスペーサーを付加させることにより、固定化された基質ペプチドの自由度を向上させることができ、それにより酵素により受ける作用の効率を高めることが可能となる。 Here, the hydrophilic compound means a compound having a repeating unit, which has a property of being soluble in water or swelled in water, and may be a synthetic product or a natural product. Specifically, as the hydrophilic polymer, for example, PEG, polyvinyl alcohol, poly (meth) acrylic acid, poly (meth) acrylate, poly (meth) acrylamide, polyethyleneimine, polyvinylpyrrolidone, carboxylic acid or Examples thereof include polyesters, polyurethanes, carboxymethylcellulose, and polysaccharides such as chitosan, carrageenan, and glucomannan, which are copolymerized with a salt thereof, a sulfonic acid or a monomer containing the salt, or a hydrophilic moiety such as polyethylene glycol. Of these, PEG is particularly preferable. By adding such a spacer, the degree of freedom of the immobilized substrate peptide can be improved, thereby increasing the efficiency of the action received by the enzyme.
上記親水性化合物をペプチドに挿入する方法は特に限定されるものではなく、種々の化学合成に基づく手法が適用されうるものであるが、合成効率面から考えると、ペプチド合成に際した一連の流れの中に親水性化合物の結合反応を組み込むのが好ましい。ペプチド合成においては、一般的にＦｍｏｃ基やｔＢｏｃ基のような保護基の結合されたアミノ酸が用いられるが、こうした保護基により修飾された親水性化合物をアミノ酸と同様に用いるのが好ましい。具体的には、式（Ｉ）に示されるようなＦｍｏｃ基で修飾されたＰＥＧ、式（ＩＩ）に示されるようなＮ−ＣＢＺで修飾されたＰＥＧ、式（ＩＩＩ）に示されるようなｔＢｏｃ基で修飾されたＰＥＧなどが例示される。式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）においてｎの値は２〜２５程度が好ましく、４〜１５程度がより好ましい。 The method for inserting the hydrophilic compound into the peptide is not particularly limited, and various methods based on chemical synthesis can be applied. However, from the viewpoint of synthesis efficiency, a series of flow during peptide synthesis is considered. It is preferred to incorporate a hydrophilic compound binding reaction therein. In peptide synthesis, an amino acid to which a protective group such as Fmoc group or tBoc group is bonded is generally used, and it is preferable to use a hydrophilic compound modified with such a protective group in the same manner as the amino acid. Specifically, PEG modified with an Fmoc group as shown in formula (I), PEG modified with N-CBZ as shown in formula (II), tBoc as shown in formula (III) Examples thereof include PEG modified with a group. In formulas (I), (II), and (III), the value of n is preferably about 2 to 25, and more preferably about 4 to 15.
上述したようなチオール基を介してペプチドを固定化するに際しては、予め基板表面にアミノ基を導入させて、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いてマレイミド表面を形成させて反応させる方法が推奨される。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。こうしたヘテロ二官能型架橋剤としては、種々市販されているものもあり、特に限定されるものではないが、例えばＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくはＳｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）などを挙げることができる。またこれらの化合物と完全に同一構造のものでなくても、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物も適用することが可能である。ＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。また、その他にも、ＰＥＧのような高分子の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するものも用いることができる。 When immobilizing a peptide via a thiol group as described above, an amino group is introduced into the substrate surface in advance, and a heterobifunctional crosslinking agent having a succinimide (NHS) group and a maleimide (MAL) group is used. A method of reacting by forming a maleimide surface is recommended. The means for introducing an amino group on the chip is not particularly limited. Examples thereof include a self-assembled surface method for aligning molecules on the substrate surface, a method of introducing using a reaction reagent, and a means for coating a substance having a functional group on a chip. Also included are means for introducing an amino group using a cross-linking agent starting from the functional group introduced on the surface. Such heterobifunctional crosslinking agents include various commercially available ones, and are not particularly limited. For example, succinimidyl 4- [N-maleimidemethyl] cyclohexane-1-carboxylate (hereinafter referred to as SMCC). Alternatively, sulfosuccinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (hereinafter referred to as SSMCC) can be used. In addition, even if these compounds are not completely the same in structure, analogized compounds can be applied as long as their functions are not impaired. Either SMCC or SSMCC can be applied, but from the viewpoint of solubility in water, it is more preferable to use SSMCC when the reaction is carried out in an aqueous system such as a buffer solution. In addition, those having a succinimide (NHS) group and a maleimide (MAL) group at the end of a polymer such as PEG can also be used.
本発明におけるペプチドチップの固定化方法はさまざまな用途に応用可能である。一般にアレイにおける検出手段としてよく用いられている蛍光性物質、化学発光性物質、放射性物質等による検出系においても有効であるが、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や和周波発生（ＳＦＧ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、エリプソメトリなどの光学的検出方法に絶大な効果を発揮する。なかでも、ＳＰＲによる解析系において特に有用である。一般的なチップ、アレイにおいては、相互作用の検出方法として蛍光物質や放射線同位体によるラベル手段による検出が用いられる。この場合、最終的にラベル物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着してなければ、正確に測定できているものと判断することができる。 The peptide chip immobilization method in the present invention can be applied to various uses. In general, it is also effective in detection systems using fluorescent materials, chemiluminescent materials, radioactive materials, etc., which are often used as detection means in arrays, but in particular surface plasmon resonance (SPR), sum frequency generation (SFG), localization It is extremely effective for optical detection methods such as plasmon resonance (LPR) and ellipsometry. Among these, it is particularly useful in an analysis system using SPR. In a general chip or array, detection by a labeling means using a fluorescent substance or a radioisotope is used as a method for detecting an interaction. In this case, it is possible to detect only whether or not the label substance is finally bound, and even if a substance not related to the interaction is adsorbed non-specifically, it is not erroneously detected. Therefore, if the interacting target substance is not non-specifically adsorbed to the negative control, it can be determined that the measurement is accurate.
しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、本発明の固定化方法は非常に効果的である。 However, in the label-free optical detection method, any substance adsorbed on the chip is detected as a signal. That is, it is difficult to distinguish nonspecific adsorption of a substance that is not a measurement target from specific adsorption. Therefore, since a means for suppressing non-specific adsorption more severely is required, the immobilization method of the present invention is very effective.
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧの誘導体が好適に用いられる。 In an ELISA method or an interaction analysis method using a label substance, physical adsorption by bovine serum albumin or casein is generally selected as a blocking method. Although the physical adsorption method is easy, it is not stable and may be detached from the chip surface over time. In the above optical detection method, it is preferable to perform blocking by covalent bond in order to detect even the elimination of the blocking agent. In particular, when blocking the unreacted maleimide group surface, a compound having a thiol group is preferably used, and a PEG derivative is particularly preferably used.
ＳＰＲ、ＳＦＧ、ＬＰＲ、エリプソメトリにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲやＬＰＲの測定に極めて適しているからである。 In SPR, SFG, LPR, and ellipsometry, a metal substrate is used. In the present invention, the material of the substrate is preferably gold which is very stable in acid, alkali, organic solvent and the like. In fact, gold is a material frequently used in the above optical detection method. Further, the material supporting gold is preferably transparent, and more preferably transparent glass. This is because transparent glass is not only easily available, but also very suitable for measuring SPR and LPR.
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。 As a method of forming the metal substrate, a method of coating a thin metal layer is preferable. A method for coating the metal is not particularly limited, but generally, a vapor deposition method, a sputtering method, an ion coating method, or the like is selected. In order to provide an optical detection method, it is necessary to control the thickness of the thin metal layer at the nano level. The thickness of the thin metal layer is not particularly limited, but is generally selected in the range of 30 nm to 80 nm. In order to suppress peeling of the thin metal layer, a chromium layer or a titanium layer of 0.5 nm to 10 nm may be coated on the substrate in advance.
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。 The SPR imaging method using this SPR is a method of monitoring the state of interaction between substances by irradiating a polarized light beam over a wide range and analyzing the reflected image by making full use of image processing technology or the like. Yes, it is possible to screen a chip on which a plurality of substances are immobilized, and to observe the morphology of an object adsorbed on the surface with high sensitivity.
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。 In the SPR imaging method, in order to analyze the reflected image, a means for irradiating the chip with a polarized light beam in a wide range and sufficiently securing the illuminance of the light beam is required. An example is shown in FIG. The brighter the illuminance of the polarized light flux, the more preferable is the sensitivity of the sensor.
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。 The type of the light source is not particularly limited, but it is preferable to use light including near infrared light that makes the change in the SPR resonance angle particularly sensitive. Specifically, a white light source capable of irradiating light over a wide range such as a metal halide lamp, a mercury lamp, a xenon lamp, a halogen lamp, a fluorescent lamp, and an incandescent lamp can be used. A halogen lamp that is sufficiently high, has a simple light power supply and is inexpensive is particularly preferable.
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。 A normal white light source has a defect that light and dark unevenness occurs in the filament portion. If the light from the light source is irradiated as it is, light and dark unevenness occurs in the image obtained by reflection, and it becomes difficult to evaluate screening and morphological changes. Therefore, as a means for uniformly irradiating the chip with light, a method of making the light into parallel light after passing through the pinhole is preferable. The means for passing a pinhole is preferable as a means for obtaining a light beam having a uniform brightness, but there is a drawback that the illuminance decreases when light is passed through the pinhole as it is. Therefore, as a means for ensuring sufficient illuminance, it is preferable to use a method in which a convex lens is installed between the pinhole and the light source, and condensed to pass through the pinhole.
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。 Since the white light source is radiated light, it needs to be converted into parallel light using a convex lens before condensing. Parallel light can be obtained by installing a light source near the focal length of the convex lens. By installing another convex lens and installing a pinhole in the vicinity of the focal length of the lens, it is possible to pass the condensed light through the pinhole. The light that intersects and passes through the pinhole is converted into parallel light by the CCTV lens for the camera. The cross-sectional area of the parallel light beam obtained at this time is preferably adjusted to 10 to 1000 mm 2 . This method enables a wide range of screening and morphological observation.
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。 When the interaction is monitored, the polarized light beam is applied to the opposite surface of the metal thin film on which the substance or the substance aggregate is fixed. The polarized light beam is applied to the opposite surface of the metal thin film on which the substance or substance aggregate is fixed, and the reflected light beam is obtained. The reflected light beam from the metal thin film passes through a near-infrared wavelength optical interference filter and transmits only light in the vicinity of a certain wavelength before being photographed by a CCD camera.
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。 The center wavelength of the optical interference filter is preferably 600 to 1000 nm with high SPR sensitivity. The wavelength width of the wavelength at which the transmittance of the optical interference filter is half that at the maximum is called a half-value width, but the smaller the half-value width, the sharper the wavelength distribution is, and more specifically, the half-value width is preferably 100 nm or less. An image photographed by the CCD camera through the optical interference filter is taken into a computer, and a change in brightness of a certain part can be evaluated in real time, and an entire image can be evaluated by image processing. Thus, it is possible to screen a chip on which a plurality of substances are immobilized, and to observe the morphology of an object adsorbed on the surface with high sensitivity.
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。 The chip for SPR used in the present invention preferably comprises a metal substrate in which a metal thin film is formed on a transparent substrate, and directly or indirectly, chemically or physically on the metal thin film, a substance or a substance. A slide on which the assembly is fixed is used. The material of the substrate is not particularly limited, but it is preferable to use a transparent material. Specific examples include glass or plastics such as polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, and acrylic. Of these, glass is particularly preferable.
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎＤは１．５以上であることが好ましい。 The thickness of the substrate is preferably about 0.1 to 20 mm, and more preferably about 1 to 2 mm. In order to achieve the purpose of evaluating the reflection image from the metal thin film, the SPR resonance angle is as small as possible, and the captured image is not likely to be distorted and is easy to analyze. Therefore, the refractive index n D of the transparent substrate or the transparent substrate and the prism in contact with the transparent substrate is preferably 1.5 or more.
また、本発明のリン酸化検出用アレイは、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いたオートラジオグラフィにも非常に有用である。この方法は、直接的にＲＩの取り込みをモニターすることにより、基質ペプチドのリン酸化を高感度にモニターできるという優位性がある。ＲＩとしては、例えばγ３２Ｐ−ＡＴＰもしくはγ３３Ｐ−ＡＴＰが好適に用いられる。 The phosphorylation detection array of the present invention is also very useful for autoradiography using a radioisotope (RI). This method has an advantage that the phosphorylation of the substrate peptide can be monitored with high sensitivity by directly monitoring the RI uptake. As RI, for example, γ 32 P-ATP or γ 33 P-ATP is preferably used.
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
図２に示したようなスキームに基づき、ペプチドアレイの調製を行った。
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基であるＰＥＧ３−ＯＨアルカンチオール（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製；以下、ＰＥＧチオールという。）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。末端のチオール基は、特に金に対する金属結合性を示す。１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not particularly limited to the examples.
[Example 1]
A peptide array was prepared based on the scheme as shown in FIG.
(Peptide immobilization)
PEG3-OH alkanethiol (manufactured by SensoPath; hereinafter referred to as PEG thiol) whose terminal functional group is a thiol group was dissolved in a mixed solution of 7 ml of ethanol: water = 6: 1 at a concentration of 1 mM. The terminal thiol group exhibits a metal binding property particularly to gold. A gold-deposited slide in which 3 nm of chromium was vapor-deposited on an SF15 glass slide of 18 mm square and 2 mm thick and 45 nm of gold was vapor-deposited was immersed in the PEG thiol solution for 3 hours to bond PEG thiol to the entire gold substrate.
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分はＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。 A photomask was placed on the slide and irradiated with a 500 W ultra-high pressure mercury lamp (manufactured by USHIO) for 2 hours to remove 4 armPEG thiol in the UV irradiation part. The photomask has 96 square holes of 500 μm square (consisting of 8 × 12 patterns), and the pitch between the hole centers is designed to be 1 mm. The portion of the photomask with a hole is transparent to UV light and is irradiated onto the slide for patterning. PEG remains in the unirradiated portion, and functions as a reference portion as a background portion of the chip.
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに室温で１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応して、ＭＡＬ基は未反応のまま残り表面に導入することができた。 It was immersed in a 1 mM ethanol solution of 8-Amino-1-Octanethiol, Hydrochloride (8-AOT, manufactured by Dojindo Laboratories) for 1 hour to form a self-organized surface of 8-AOT on the UV irradiation part. SSMCC (manufactured by Pierce) was dissolved in phosphate buffer (20 mM phosphate, 150 mM NaCl; pH 7.2) at 0.4 mg / ml, and reacted with 8-AOT on the gold surface at room temperature for 15 minutes. The amino group of 8-AOT and the NHS group of SSMCC reacted, and the MAL group remained unreacted and could be introduced onto the surface.
上記のようにして得られた表面に、配列表に示したようなアミノ酸配列からなる１２種のペプチドを固定化した。各ペプチドの固定化パターンは図３に示した通りである。いずれのペプチドにおいても、そのＣ末端にシステイン残基を付加している。システイン残基と基質配列の間には、スペーサーとしてはグリシン１又は２残基を挿入している。いずれのペプチドにおいてもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒスポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができるものである。
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、上記ＴＥＧ−ＳＨを１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。また比較例として、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で３０分間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
［実施例２］
（オートラジオグラフィによるｃＳｒｃリン酸化の検出）
実施例１においてブロッキング処理までを行ったアレイを用いて、ｃＳｒｃキナーゼによるリン酸化を行った。ｃＳｒｃキナーゼ溶液３００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃で１５分もしくは５時間の反応を行った。ｃＳｒｃ溶液の組成は、ｃＳｒｃキナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ製；５Ｕ／μｌ）６μｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２７８μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液１５μｌ、１０ｍＭ γ３２Ｐ−ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス製）１μｌとした。その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、オートラジオグラフィによる各固定化基質におけるＲＩの取り込みの読み取りを、ＢＡＳ−１８００II（富士写真フイルム製）を用いて行った。露光は装置専用のシート（富士写真フイルム製ＳＧイメージングプレート）を用いて３０分間行った。結果を図４に示した。
Twelve kinds of peptides having amino acid sequences as shown in the sequence listing were immobilized on the surface obtained as described above. The immobilization pattern of each peptide is as shown in FIG. In any peptide, a cysteine residue is added to the C-terminus. A
(Blocking of unreacted maleimide groups)
After washing the substrate peptide-immobilized surface with phosphate buffer, phosphate buffer (20 mM phosphate, 150 mM NaCl) is used so that the TEG-SH has a concentration of 1 mM in order to block unreacted maleimide groups. Dissolved in pH 7.2), 250 μl was poured onto the chip and allowed to react at room temperature for 1 hour. In addition, as a comparative example, a phosphate buffer (20 mM phosphate) is used so that PEG thiol (SUNBRIGHT MESH-50H manufactured by NOF Corporation) has a thiol group at one end and a methoxy group at the other end to a concentration of 1 mM. , 150 mM NaCl; pH 7.2), 250 μl was poured onto the chip and allowed to react at room temperature for 30 minutes. The molecular weight of PEG thiol used here is 5,000.
[Example 2]
(Detection of cSrc phosphorylation by autoradiography)
Phosphorylation by cSrc kinase was performed using the array that had been subjected to the blocking treatment in Example 1. 300 μl of cSrc kinase solution was dropped on the array and reacted at 30 ° C. for 15 minutes or 5 hours. The composition of the cSrc solution was 6 μl of cSrc kinase (manufactured by Upstate; 5 U / μl), 278 μl of 50 mM MES buffer (pH 6.8), 15 μl of 1M magnesium chloride solution, 1 μl of 10 mM γ 32 P-ATP (manufactured by Amersham Biosciences). . Thereafter, the array was washed three times with PBS and water, and the surface of the array was dried. Then, reading of RI uptake in each immobilized substrate by autoradiography was performed using BAS-1800II (Fuji Photo Film). went. The exposure was performed for 30 minutes using a sheet dedicated to the apparatus (SG imaging plate manufactured by Fuji Photo Film). The results are shown in FIG.
図４より明らかなように、Ｎｏ．３，９，１０，１１，１２に関して非常に強いＲＩの取り込みが認められた。図５にはＲＩ取り込み量を定量化した結果を示した。図中、横軸は基質の固定化されていない側の末端部分のアミノ酸配列を示している。末端部分のリジン残基の数によりリン酸化の受けやすさが大きく変化している。末端にリジン残基が２つ以上存在する場合と比較して、１つもしくはゼロの場合にはｄｒａｓｔｉｃに強くリン酸化を受けている。リジン残基が２つ以上アラニン残基に置換されている場合も強いリン酸化が確認されている。
［実施例３］
（ＳＰＲイメージングによるｃＳｒｃリン酸化の検出）
実施例１においてブロッキング処理までを行ったアレイを用いて、ｃＳｒｃキナーゼによるリン酸化を行った。ｃＳｒｃ溶液の組成は、ｃＳｒｃキナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ製；５Ｕ／μｌ）６μｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２７６μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液１５μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ３μｌとした。その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、リン酸化チロシン抗体ＰＴ−６６（シグマ製）をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。抗体は上記のランニングバッファーで２０００倍希釈した溶液を用いて作用させた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
As is clear from FIG. Very strong RI uptake was observed for 3,9,10,11,12. FIG. 5 shows the results of quantifying the amount of RI uptake. In the figure, the horizontal axis represents the amino acid sequence of the terminal portion of the substrate that is not immobilized. The susceptibility to phosphorylation varies greatly depending on the number of lysine residues in the terminal portion. Compared to the case where two or more lysine residues are present at the terminal, when it is one or zero, it is strongly phosphorylated by drastic. Strong phosphorylation has also been confirmed when two or more lysine residues are substituted with alanine residues.
[Example 3]
(Detection of cSrc phosphorylation by SPR imaging)
Phosphorylation by cSrc kinase was performed using the array that had been subjected to the blocking treatment in Example 1. The composition of the cSrc solution was 6 μl of cSrc kinase (manufactured by Upstate; 5 U / μl), 276 μl of 50 mM MES buffer (pH 6.8), 15 μl of 1M magnesium chloride solution, and 3 μl of 10 mM ATP. Thereafter, the array was washed three times with PBS and water, and the surface of the array was dried. Then, the array was set in an SPR imaging device (MultiSPRinter: manufactured by Toyobo), and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) was used as a running buffer. Was flowed into the flow cell at a rate of 100 μl / min. After confirming that the signal from the SPR was stable, a phosphorylated tyrosine antibody PT-66 (manufactured by Sigma) was injected into the cell in the SPR device to act. The antibody was allowed to act using a solution diluted 2000 times with the above running buffer. When the signal rise reached a plateau state, the running buffer was fed again for washing. The change of the SPR signal at that time was observed. In addition to the spot site of each substrate, the signal change was also observed in the background.
上記測定終了後、ＳＰＲイメージングによる解析も検討した。上記ＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによりアレイ表面を撮像した画像の取り込みを２秒ごとに行い、抗体反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行うことにより、アレイ全体においての抗体が結合している様子を示すことができる。結果を図６に示した。 After the above measurement, analysis by SPR imaging was also examined. At the time of the SPR analysis, an image obtained by imaging the surface of the array with a CCD camera is taken every 2 seconds, and from the image taken at the time after the antibody reaction, the image at the time before the reaction is obtained from the image calculation processing software Scion Image By performing a subtraction process using (made by Scion Corp.), it is possible to show how the antibodies in the entire array are bound. The results are shown in FIG.
この場合もオートラジオグラフィと同様に、Ｎｏ．３，９，１０，１１，１２に関して比較的強いリン酸化が確認された。図７には、定量的な対比のため、ＳＰＲシグナル上昇の比較を行った結果を示した。傾向としては、オートラジオグラフィとＳＰＲイメージングとでよく一致していたが、その効果はオートラジオグラフィの場合と比較すると、あまりｄｒａｓｔｉｃなものではない。しかしながら、ＳＰＲイメージングにおいても、末端のリジン残基の改変により一定の作用効果を確認することができた。固定化される部位から離れた箇所、特に末端にリジンのような塩基性アミノ酸がリッチであると、その極性荷電の影響によりキナーゼの接近が反発されやすくなり、その結果リン酸化を受けにくくなるものと推測される。 In this case, as in autoradiography, No. Relatively strong phosphorylation was confirmed for 3,9,10,11,12. FIG. 7 shows the result of comparison of SPR signal rise for quantitative comparison. As a tendency, autoradiography and SPR imaging agreed well, but the effect was not so drastic as compared with autoradiography. However, even in SPR imaging, it was possible to confirm certain effects by modifying the terminal lysine residue. When the basic amino acid such as lysine is rich at the position away from the site to be immobilized, especially at the end, the proximity of the kinase is likely to be repelled due to the influence of the polar charge, and as a result, it is less susceptible to phosphorylation It is guessed.
本発明の方法により、ペプチドチップにおける結合シグナルを著しく増幅させることができつつ、非特異的吸着に関しても抑制することができ、より正確で高感度な測定が可能となる。非常に容易な改良系であり、今後産業界に大きく寄与することが期待される。 By the method of the present invention, the binding signal in the peptide chip can be remarkably amplified, and nonspecific adsorption can be suppressed, and more accurate and highly sensitive measurement is possible. It is a very easy improvement system and is expected to greatly contribute to the industry in the future.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2008289374A (en) * | 2007-05-22 | 2008-12-04 | Kyushu Univ | New substrate polypeptide for protein kinase |
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