JP2009050171A

JP2009050171A - Method for detecting phosphorylation on substrate by surface plasmon resonance

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Publication number: JP2009050171A
Application number: JP2007217320A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Inamori; 和紀稲森; Yoshiki Katayama; 佳樹片山; Takeshi Mori; 健森; Yusuke Inoue; 雄介井上
Original assignee: Kyushu University NUC; Toyobo Co Ltd
Current assignee: Kyushu University NUC; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2009-03-12

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an evaluation system for exhaustive on-chip analysis of protein kinase activities, enabling throughput by a simple and safe method. <P>SOLUTION: The peptide array is obtained by fixing a plurality (five or more kinds) of peptides being substrates of a protein kinase and having nine to eleven specific amino acid sequences on a gold surface, and is used for detecting the phosphorylation of the peptide by the kinase by a surface plasmon resonance imaging after allowing an antibody or a metal complex compound capable of recognizing a phosphorylation site to act thereon. The method for detecting the phosphorylation uses the peptide array. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いることにより、チップ上におけるリン酸化の検出方法に関する。より詳細には、ペプチド基質が固定化されてなるチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該固定化されたペプチド基質のリン酸化を検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting phosphorylation on a chip by using surface plasmon resonance (SPR). More specifically, the present invention relates to a method for detecting phosphorylation of an immobilized peptide substrate by allowing a solution containing or thought to contain a protein kinase to act on a chip on which the peptide substrate is immobilized.

近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。なかでも、ポストゲノムの中にあっては、蛋白質の翻訳後修飾、特にリン酸化の解析は蛋白質の活性調節、機能調節を詳細に解明するうえで重要である。そして、リン酸化反応を担っているプロテインキナーゼの活性を網羅的に解析するための技術が必要となってきている。そのための手段としては、アレイ解析が操作性やコスト面で有利ではあるが、未だ十分なものが確立されていない。更に、網羅的にプロテインキナーゼ活性を解析するためには、様々なプロテインキナーゼの基質の選択が非常に重要である。 In recent years, biochips used for biomolecule interaction analysis, profiling of expressed molecules, or diagnosis have attracted attention. The operation is facilitated by immobilizing the biomolecule on the substrate, and in some cases, the interaction of a very large number of substances can be analyzed. In particular, peptide arrays in which peptides with relatively small molecular weights are immobilized on a substrate have relatively few problems of denaturation such as proteins, and have strong combinatorial chemistry aspects. It has come to be widely used for searching and the like. In particular, in the post-genome, post-translational modification of proteins, especially analysis of phosphorylation, is important for elucidating in detail the regulation of protein activity and function. A technique for comprehensively analyzing the activity of protein kinases responsible for phosphorylation is required. As a means for that, array analysis is advantageous in terms of operability and cost, but a sufficient one has not been established yet. Furthermore, in order to comprehensively analyze protein kinase activity, selection of various protein kinase substrates is very important.

既に報告されている関連技術として、例えばＳＰＯＴ技術によりセルロースメンブラン上で直接ペプチドを合成し、その後チップ上に固定化する技術が知られている。この技術を利用して、ｐ６０チロシンキナーゼの基質をチップ上に固定化し、蛍光物質もしくは放射性物質を用いてキナーゼ活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、同様の技術で作製されたペプチドアレイを用いて、プロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと示すこともある。）やＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄキナーゼ６（ＮＥＫ６）などの活性を、放射性物質を用いてアッセイしたことについての報告（例えば、非特許文献２及び３参照）もある。その他、アビジンでコートした基板上にビオチン結合したペプチドを固定化し、ＰＫＡ活性を検討した例（例えば、非特許文献４参照）もある。しかしながら、上記いずれの方法においても、検出の際のバックグラウンドがスポットを観察する上で悪影響し、その低減が大きな課題となっている。更には、放射性物質を用いる方法が主流であり、安全性の問題はもとより専用施設を設置する必要性もあり、限られた研究機関でしか実施できないという問題がある。あるいは抗体を用いる方法の場合には、そのコストや要求特性が十分でないなどの課題があり、必ずしも満足なものであるとは言い難いのが実情である。
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，３１５，２００２Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３，２６７１，２００４ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ１，２７，２００４Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２７８３９，２００２ As a related technique that has already been reported, for example, a technique in which a peptide is directly synthesized on a cellulose membrane by the SPOT technique and then immobilized on a chip is known. It has been reported that a p60 tyrosine kinase substrate was immobilized on a chip using this technique, and kinase activity was evaluated using a fluorescent substance or a radioactive substance (see, for example, Non-Patent Document 1). In addition, using a peptide array produced by the same technique, activities such as protein kinase A (hereinafter sometimes referred to as PKA) and NIMA-related kinase 6 (NEK6) were assayed using radioactive substances. There is also a report about this (for example, see Non-Patent Documents 2 and 3). In addition, there is an example in which a biotin-bonded peptide is immobilized on a substrate coated with avidin and PKA activity is examined (for example, see Non-Patent Document 4). However, in any of the above methods, the background at the time of detection has an adverse effect on observing the spot, and its reduction is a major issue. Furthermore, the method using radioactive materials is the mainstream, and there is a problem that it is necessary to install a dedicated facility as well as safety, and it can be carried out only by a limited research institution. Alternatively, in the case of a method using an antibody, there are problems such as insufficient cost and required characteristics, and it is difficult to say that the method is always satisfactory.
Curr. Opin. Biotechnol. 13,315,2002 Angew. Chem. Int. Ed. 43,2671,2004 Nature Methods 1,27,2004 J. et al. Biol. Chem. 277, 27839, 2002

本発明の課題は、簡便で安全な方法による、創薬スクリーニングのためのハイスループット対応も可能であるＯｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼ活性の網羅的な解析のための評価系を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an evaluation system for comprehensive analysis of protein kinase activity in an on-chip, which is capable of high-throughput for drug discovery screening by a simple and safe method. .

本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有する、少なくとも２種以上のペプチド基質が金表面上に固定化されていることを特徴とする基板上におけるリン酸化を表面プラズモン共鳴によりリン酸化を検出するためのペプチドアレイ。
（２）基板上におけるリン酸化を表面プラズモン共鳴イメージングにより検出するための（１）のペプチドアレイ。
（３）配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチド基質が５種以上固定化されていることを特徴とする（１）又は（２）のペプチドアレイ。
（４）配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチド基質が１０種以上固定化されていることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかのペプチドアレイ。
（５）配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチド基質が末端にシステイン残基を有していることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかのペプチドアレイ。
（６）配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチド基質が式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）に示される化合物を架橋剤として用いて金表面に固定化されていることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかのペプチドアレイ。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the above problems can be solved by the following means, and have reached the present invention. That is, the present invention has the following configuration.
(1) Phosphorylation on a substrate, characterized in that at least two or more peptide substrates containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-26 are immobilized on a gold surface Peptide array for detecting phosphorylation by resonance.
(2) The peptide array of (1) for detecting phosphorylation on a substrate by surface plasmon resonance imaging.
(3) The peptide array according to (1) or (2), wherein 5 or more types of peptide substrates containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 are immobilized.
(4) The peptide array according to any one of (1) to (3), wherein 10 or more peptide substrates containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 are immobilized.
(5) The peptide array according to any one of (1) to (4), wherein the peptide substrate containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 has a cysteine residue at the terminal .
(6) A peptide substrate containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 is immobilized on a gold surface using a compound represented by formula (I) or (II) as a cross-linking agent. The peptide array according to any one of (1) to (5).

（７）（１）〜（６）のいずれかのペプチドアレイを用いて、基板上でリン酸化反応を行った後、リン酸化部位を認識することのできる抗体を作用させることにより得られる表面プラズモン共鳴のシグナルによりリン酸化を検出する方法。
（８）（１）〜（６）のいずれかのペプチドアレイを用いて、基板上でリン酸化反応を行った後、リン酸化部位を認識することのできる金属錯体化合物を作用させることにより得られる表面プラズモン共鳴のシグナルによりリン酸化を検出する方法。
（９）金属錯体化合物がビオチンで修飾されてなり、かつ該金属錯体化合物をペプチドアレイに作用させた後、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることを特徴とする（８）のリン酸化を検出する方法。
（１０）金属錯体化合物が亜鉛キレート化合物であることを特徴とする（８）又は（９）のリン酸化を検出する方法。
（１１）金属錯体化合物が式（ＩＩＩ）で示される化合物であることを特徴とする（８）〜（１０）のいずれかのリン酸化を検出する方法。 (7) Surface plasmon obtained by allowing an antibody capable of recognizing a phosphorylated site to act after phosphorylating on a substrate using the peptide array of any one of (1) to (6) A method for detecting phosphorylation by a resonance signal.
(8) Using the peptide array of any one of (1) to (6), the phosphorylation reaction is performed on the substrate, and then a metal complex compound capable of recognizing the phosphorylation site is allowed to act. A method for detecting phosphorylation by a signal of surface plasmon resonance.
(9) The method for detecting phosphorylation according to (8), wherein the metal complex compound is modified with biotin, and the metal complex compound is allowed to act on the peptide array and then avidin or streptavidin is allowed to act. .
(10) The method for detecting phosphorylation of (8) or (9), wherein the metal complex compound is a zinc chelate compound.
(11) The method for detecting phosphorylation according to any one of (8) to (10), wherein the metal complex compound is a compound represented by the formula (III).

（１２）細胞ライゼートによる基板上でのリン酸化反応を検出することを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかのリン酸化を検出する方法。
（１３）薬剤による刺激を与えた細胞のライゼートによる基板上でのリン酸化反応を検出することを特徴とする（１２）のリン酸化を検出する方法。 (12) The method for detecting phosphorylation according to any one of (1) to (11), wherein a phosphorylation reaction on a substrate by cell lysate is detected.
(13) The method for detecting phosphorylation according to (12), wherein a phosphorylation reaction on a substrate by a lysate of a cell stimulated with a drug is detected.

本発明におけるアレイを用いた特にＳＰＲによる相互作用解析により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの活性検出のための測定系を得ることができる。アレイでの解析を行うことにより、ハイスループット化への対応も可能である点も有用である。また、細胞ライゼートを用いたＳＰＲ測定においても、非常に有用なものである。特に、癌などの疾患の診断やリン酸化阻害剤などの新規な創薬スクリーニングのための評価系として非常に有用なものとして期待される。 A measurement system for detecting protein kinase activity on-chip can be obtained by the interaction analysis using the array of the present invention, particularly by SPR. It is also useful to be able to cope with high throughput by performing analysis with an array. It is also very useful for SPR measurement using cell lysate. In particular, it is expected to be very useful as an evaluation system for diagnosis of diseases such as cancer and new drug discovery screening such as phosphorylation inhibitors.

本発明は、ＳＰＲによる相互作用解析により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼによるリン酸化の網羅的な検出を行うことを特徴とする。ＳＰＲを用いることにより、ラベルフリーに解析できる長所があり、一般的なチップ、アレイにおいては、放射線同位体等によるラベル手段による検出が必要なことに比べて、簡便性のみならず安全性の点でも優位である。この場合、最終的に物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着してなければ、正確に測定できているものと判断することができる。 The present invention is characterized by comprehensive detection of phosphorylation by protein kinase in an on-chip by interaction analysis by SPR. The use of SPR has the advantage of being able to perform label-free analysis. Compared to the need for detection by means of labeling with a radioisotope, etc., in general chips and arrays, it is not only simple but also safe. But it is an advantage. In this case, it is possible to detect only whether or not the substance is finally bound, and even if a substance not related to the interaction is adsorbed non-specifically, it is not erroneously detected. Therefore, if the interacting target substance is not non-specifically adsorbed to the negative control, it can be determined that the measurement is accurate.

本発明において用いられる基板の素材は、特に限定されるものではないが、金、銀などの金属が好適に用いられる。なかでも、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲ測定に極めて適しているからである。 The material of the substrate used in the present invention is not particularly limited, but metals such as gold and silver are preferably used. Of these, gold which is very stable against acids, alkalis, organic solvents and the like is preferable. In fact, gold is a material frequently used in the above optical detection method. Further, the material supporting gold is preferably transparent, and more preferably transparent glass. This is because transparent glass is not only easily available, but also very suitable for SPR measurement.

金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。 As a method of forming the metal substrate, a method of coating a thin metal layer is preferable. A method for coating the metal is not particularly limited, but generally, a vapor deposition method, a sputtering method, an ion coating method, or the like is selected. In order to provide an optical detection method, it is necessary to control the thickness of the thin metal layer at the nano level. The thickness of the thin metal layer is not particularly limited, but is generally selected in the range of 30 nm to 80 nm. In order to suppress peeling of the thin metal layer, a chromium layer or a titanium layer of 0.5 nm to 10 nm may be coated on the substrate in advance.

このＳＰＲをアレイ解析技術に応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。 The SPR imaging method, which applies this SPR to array analysis technology, monitors the state of interaction between substances by irradiating a polarized light beam over a wide range and analyzing the reflected image by making full use of image processing technology, etc. It is possible to screen a chip on which a plurality of substances are immobilized, and to observe the morphology of an object adsorbed on the surface with high sensitivity. In the SPR imaging method, a means for irradiating the chip with a polarized light beam in a wide range and analyzing the reflected image and sufficiently securing the illuminance of the light beam is necessary. An example is shown in FIG. The brighter the illuminance of the polarized light flux, the more preferable is the sensitivity of the sensor.

光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。 The type of the light source is not particularly limited, but it is preferable to use light including near infrared light that makes the change in the SPR resonance angle particularly sensitive. Specifically, a white light source capable of irradiating light over a wide range such as a metal halide lamp, a mercury lamp, a xenon lamp, a halogen lamp, a fluorescent lamp, and an incandescent lamp can be used. A halogen lamp that is sufficiently high, has a simple light power supply and is inexpensive is particularly preferable.

通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。 A normal white light source has a defect that light and dark unevenness occurs in the filament portion. If the light from the light source is irradiated as it is, light and dark unevenness occurs in the image obtained by reflection, and it becomes difficult to evaluate screening and morphological changes. Therefore, as a means for uniformly irradiating the chip with light, a method of making the light into parallel light after passing through the pinhole is preferable. The means for passing a pinhole is preferable as a means for obtaining a light beam having a uniform brightness, but there is a drawback that the illuminance decreases when light is passed through the pinhole as it is. Therefore, as a means for ensuring sufficient illuminance, it is preferable to use a method in which a convex lens is installed between the pinhole and the light source, and condensed to pass through the pinhole.

白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ^２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。 Since the white light source is radiated light, it needs to be converted into parallel light using a convex lens before condensing. Parallel light can be obtained by installing a light source near the focal length of the convex lens. By installing another convex lens and installing a pinhole in the vicinity of the focal length of the lens, it is possible to pass the condensed light through the pinhole. The light that intersects and passes through the pinhole is converted into parallel light by the CCTV lens for the camera. The cross-sectional area of the parallel light beam obtained at this time is preferably adjusted to 10 to 1000 mm ² . This method enables a wide range of screening and morphological observation.

相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラにより撮影される。 When the interaction is monitored, the polarized light beam is applied to the opposite surface of the metal thin film on which the substance or the substance aggregate is fixed. The polarized light beam is applied to the opposite surface of the metal thin film on which the substance or substance aggregate is fixed, and the reflected light beam is obtained. The reflected light beam from the metal thin film passes through a near-infrared wavelength optical interference filter and transmits only light in the vicinity of a certain wavelength before being photographed by a CCD camera.

光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。 The center wavelength of the optical interference filter is preferably 600 to 1000 nm with high SPR sensitivity. The wavelength width of the wavelength at which the transmittance of the optical interference filter is half that at the maximum is called a half-value width, but the smaller the half-value width, the sharper the wavelength distribution is, and more specifically, the half-value width is preferably 100 nm or less. An image photographed by the CCD camera through the optical interference filter is taken into a computer, and a change in the brightness of a certain part can be evaluated in real time, and the whole image can be evaluated by image processing. Thus, it is possible to screen a chip on which a plurality of substances are immobilized, and to observe the morphology of an object adsorbed on the surface with high sensitivity.

本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。 The chip for SPR used in the present invention preferably comprises a metal substrate in which a metal thin film is formed on a transparent substrate, and directly or indirectly, chemically or physically on the metal thin film, a substance or a substance. A slide on which the assembly is fixed is used. The material of the substrate is not particularly limited, but it is preferable to use a transparent material. Specific examples include glass or plastics such as polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, and acrylic. Of these, glass is particularly preferable.

基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎ_Ｄは１．５以上であることが好ましく、１．６以上が更に好ましい。 The thickness of the substrate is preferably about 0.1 to 20 mm, and more preferably about 1 to 2 mm. In order to achieve the object of evaluating the reflection image from the metal thin film, the SPR resonance angle is as small as possible, and there is no fear that the image to be photographed will be fuzzy, and the analysis is easy. Therefore, the refractive index n _D of the transparent substrate or the transparent substrate and the prism in contact with the transparent substrate is preferably 1.5 or more, and more preferably 1.6 or more.

本発明においては、ペプチド基質が上述したような基板上に固定化されたアレイを用いる。ペプチド基質は、種々のプロテインキナーゼの基質として機能しうるようなアミノ酸配列を含有するものとして、配列番号１〜２６のアミノ酸配列を含有するペプチドを少なくとも２種以上、好ましくは５種以上、より好ましくは１０種以上、更に好ましくは２０種以上を用いる。これらのペプチドは、種々のプロテインキナーゼによる応答性が確認されているものであり、これら２６種の中からいくつかを適宜選択して、組み合わせてアレイ解析に用いることにより、網羅的なプロテインキナーゼ活性の解析を行うことができるものである。アレイ解析における検出手段として、非標識に測定できる点に加えて、定量的な再現性の観点から、例えば蛍光アレイ解析などの方法と比べて、ＳＰＲによる検出法は特に有利である。 In the present invention, an array in which a peptide substrate is immobilized on a substrate as described above is used. The peptide substrate contains at least 2 peptides, preferably 5 or more, more preferably peptides containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 26 as those containing amino acid sequences that can function as substrates for various protein kinases. Uses 10 or more, more preferably 20 or more. These peptides have been confirmed to be responsive to various protein kinases. By selecting some of these 26 types as appropriate and using them in combination for array analysis, comprehensive protein kinase activity can be obtained. Can be analyzed. As a detection means in array analysis, the detection method by SPR is particularly advantageous from the viewpoint of quantitative reproducibility, in addition to a method capable of measurement without labeling, for example, compared to a method such as fluorescence array analysis.

２６種のペプチドと対応するキナーゼを以下の表１に示す。 The 26 peptides and corresponding kinases are shown in Table 1 below.

上記の表１に示されるように、２６種のペプチドは、特定のキナーゼにより認識される基質であるので、これらを組み合わせることにより、1種または2種以上のキナーゼ活性が容易にかつ同時に検出できる。 As shown in Table 1 above, since 26 peptides are substrates recognized by specific kinases, by combining them, one or more kinase activities can be easily and simultaneously detected. .

更には、測定に関する信頼性を確認するために、予めリン酸化されたアミノ酸残基を含むもの（ポジティブコントロール）、あるいはネガティブコントロールも同じ基板上に固定化されているのが好ましい。ネガティブコントロールを用いる場合は、リン酸化部位がセリン残基、スレオニン残基の場合はアラニン残基に、リン酸化部位がチロシン残基の場合はフェニルアラニン残基に置換されたものが好ましい。合成のしやすさ、取り扱いやすさ、保存安定性などの点では、比較的低分子量のペプチドを用いる方が好ましい。ここでペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、７〜３０残基程度が好ましく、１０〜２５残基程度がより好ましい。 Furthermore, in order to confirm the reliability regarding the measurement, it is preferable that a pre-phosphorylated amino acid residue (positive control) or a negative control is also immobilized on the same substrate. When a negative control is used, it is preferable that the phosphorylation site is a serine residue, a threonine residue is substituted with an alanine residue, and a phosphorylation site is substituted with a phenylalanine residue when the phosphorylation site is a tyrosine residue. In terms of ease of synthesis, ease of handling, storage stability, etc., it is preferable to use a peptide having a relatively low molecular weight. Here, the peptide refers to a commonly used meaning, in which two or more amino acids are linked by peptide bonds. The number of amino acid residues is not particularly limited, but is usually about 5 to 60 residues, preferably about 7 to 30 residues, and more preferably about 10 to 25 residues.

本発明のペプチドアレイにおけるペプチド基質の固定化方法は特に限定されるものではなく、ペプチド配列におけるアミノ基やチオール基のような官能基を介した方法、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグなどのアフィニティ結合を利用する方法などが挙げられる。この中では、特にチオール基を介してペプチド基質を固定化する方法が、特異性、感度の両面から特に好ましい。 The method for immobilizing a peptide substrate in the peptide array of the present invention is not particularly limited, and is a method via a functional group such as an amino group or a thiol group in a peptide sequence, such as an affinity such as a His tag, GST tag, or MBP tag. For example, a method using a bond. Among these, a method of immobilizing a peptide substrate via a thiol group is particularly preferable from the viewpoints of both specificity and sensitivity.

チオール基を介して固定化される場合、ペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在することが好ましい。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチド基質におけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくはペプチド部分（両末端にアミノ酸を有しで囲まれ、スペーサーをアミノ酸の間に有していてもよい）の少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。 When immobilized via a thiol group, it is preferable that at least one cysteine residue is present in the amino acid sequence of the peptide. The cysteine residue is an amino acid necessary for the peptide to be immobilized to have its original function, even if it exists as an essential residue as an amino acid sequence necessary for the peptide to function. It may be a case where it is further added to the sequence. The position of the cysteine residue in the peptide substrate to be immobilized is not particularly limited, but preferably at least in the peptide portion (which is surrounded by amino acids at both ends and may have a spacer between the amino acids). It is better to add one end, more preferably only one end. When a cysteine residue is added to one end, only a cysteine residue may be added, but a spacer is used in order to increase the efficiency of interaction with a substance that acts by increasing the degree of freedom of the immobilized peptide. As an amino acid sequence of 1 to several residues may be further added. The amino acid sequence of the spacer portion is not particularly limited, but it is particularly preferable to add a sequence having 1 to several glycine residues and / or alanine residues or serine residues.

本発明においては、上記基板に固定化される部位と基質配列部位との間にスペーサーとして親水性化合物が挿入されていることを特徴とする。親水性化合物の分子量は特に限定されないが、１００〜１，０００が好ましく、４００〜１，０００がより好ましい。また、上記親水性化合物とともに、アミノ酸残基数が２〜１０個、より好ましくは２〜６個からなるスペーサー配列を更に付加させてもよい。スペーサー配列を構成するアミノ酸残基の種類は特に限定されるものではないが、高次構造の形成を起こしにくいアミノ酸を含むことが好ましい。具体的には、少なくとも１つはグリシン残基を含むことが好ましい。より好ましくは、１残基のグリシン（Ｇ）、２残基のグリシン（ＧＧ）、グリシンとアラニン（ＧＡもしくはＡＧ）、あるいはグリシンとセリン（ＧＳもしくはＳＧ）残基の繰り返しを１回以上、更に好ましくは２回以上含んでなる。 The present invention is characterized in that a hydrophilic compound is inserted as a spacer between the site immobilized on the substrate and the substrate sequence site. Although the molecular weight of a hydrophilic compound is not specifically limited, 100-1,000 are preferable and 400-1,000 are more preferable. In addition to the hydrophilic compound, a spacer sequence having 2 to 10 amino acid residues, more preferably 2 to 6 amino acid residues may be further added. The type of amino acid residue constituting the spacer sequence is not particularly limited, but it is preferable to include an amino acid that is unlikely to form a higher order structure. Specifically, at least one preferably contains a glycine residue. More preferably, one residue of glycine (G), two residues of glycine (GG), glycine and alanine (GA or AG), or glycine and serine (GS or SG) residues are repeated one or more times. Preferably it comprises two or more times.

ここで、親水性化合物とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことをいうものであり、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。なかでも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が特に好ましい。こうしたスペーサーを付加させることにより、固定化されたペプチド基質の自由度を向上させることができ、その結果としてプロテインキナーゼの固定化ペプチド基質へのアクセスが容易になることより、受けるリン酸化作用の効率をより高めることが可能となる。 Here, the hydrophilic compound means a compound having a repeating unit having a property soluble in water or swelled in water, and may be a synthetic product or a natural product. Specifically, as the hydrophilic polymer, for example, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, poly (meth) acrylic acid, poly (meth) acrylate, poly (meth) acrylamide, polyethyleneimine, polyvinylpyrrolidone, carboxylic acid Or the salt, the sulfonic acid, the monomer containing the salt, or polyester, polyurethane, carboxymethylcellulose which copolymerized hydrophilic parts, such as polyethyleneglycol, and polysaccharides, such as chitosan, carrageenan, and glucomannan, are mentioned. Of these, polyethylene glycol (PEG) is particularly preferable. By adding such a spacer, the degree of freedom of the immobilized peptide substrate can be improved, and as a result, the protein kinase can be easily accessed to the immobilized peptide substrate, resulting in the efficiency of the phosphorylation effect received. Can be further increased.

また、固定化されるペプチド基質に対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものを用いてもよい。該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。また、親水性化合物の挿入される位置に関しても、固定化部位とリン酸化を受ける部位との間であれば、特には制限されるものではないが、固定化部位に近接している方がより好ましい。親水性化合物の挿入されたペプチドの合成方法も特に限定されるものではなく、例えば市販されているペプチド合成用の保護基で修飾されている化合物を用いることにより容易に得ることが可能である。保護基の種類も特に限定されるものではなく、Ｆｍｏｃ基、ｔＢｏｃ基などの一般的なものが用いられる。 Alternatively, a compound in which a compound having a thiol group is chemically bonded at any one or more amino acid residues to the peptide substrate to be immobilized may be used. The bonding position of the compound is not particularly limited, but is preferably bonded to any terminal amino acid residue. Further, the position at which the hydrophilic compound is inserted is not particularly limited as long as it is between the immobilization site and the site subjected to phosphorylation, but it is more close to the immobilization site. preferable. The method for synthesizing the peptide into which the hydrophilic compound is inserted is not particularly limited, and can be easily obtained by using, for example, a commercially available compound modified with a protecting group for peptide synthesis. The kind of the protecting group is not particularly limited, and general groups such as an Fmoc group and a tBoc group are used.

本発明において、チオール基を介してペプチド基質を固定化する場合、予めアミノ基を表面に導入した後、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いることが特に好ましい。このようなヘテロ二官能型架橋剤としては、ＰＥＧのような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いることも可能であるが、ペプチド基質の固定化収率を向上させるためには、より低分子量のものを用いてもよい。具体的には、式（Ｉ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）が挙げられる。なお、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含する。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。ペプチドの溶解性に応じて、両方を使い分けることが可能である。 In the present invention, when a peptide substrate is immobilized via a thiol group, a heterobifunctional cross-linking agent having a succinimide (NHS) group or a succinimide sulfate group and a maleimide (MAL) group after previously introducing an amino group onto the surface It is particularly preferable to use As such a heterobifunctional cross-linking agent, it is possible to use a hydrophilic polymer such as PEG in which both ends are modified with NHS groups and MAL groups. In order to improve, a lower molecular weight may be used. Specifically, the compound Succinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (hereinafter referred to as SMCC) or the compound Sulfosuccinimidyl 4- [N-maleimidocylimide] represented by the formula (II) -1-carboxylate (hereinafter referred to as SSMCC). It should be noted that not only compounds having the same structure as the compound represented by formula (I) or formula (II) but also compounds analogized within a range not impairing the function thereof are included. In the present invention, both SMCC and SSMCC can be applied. However, from the viewpoint of solubility in water, it is more preferable to use SSMCC when the reaction is carried out in an aqueous system such as a buffer solution. Both can be used properly depending on the solubility of the peptide.

上述したような低分子量化合物を適用することにより、特に高分子量の物質を架橋剤として用いる場合と比べて、ペプチド基質のチップへの固定化効率が格段に高くなるため標的物質との結合効率も向上して、結合によるシグナルがより鮮明になるという効果を奏するものである。また、非特異的な影響に関してもほとんど問題とならず、いわゆるＳ／Ｎ比を大きくすることができる点で有利である。しかしながら、本発明において架橋剤の種類は、特にこれらに限定されるものではない。 By applying a low molecular weight compound as described above, the efficiency of immobilizing the peptide substrate on the chip is significantly higher than when a high molecular weight substance is used as a cross-linking agent. The effect is that the signal due to the binding becomes clearer. Further, there is almost no problem with non-specific influences, which is advantageous in that the so-called S / N ratio can be increased. However, the type of the crosslinking agent in the present invention is not particularly limited to these.

上記ＳＭＣＣもしくはＳＳＭＣＣをチップ上に導入させてマレイミド表面を形成させるためには、ＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有するスクシンイミド基あるいはＳＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有する硫酸スクシンイミド基と反応性を有する官能基、具体的にはアミノ基を予めチップ上に導入させておく必要がある。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。 In order to introduce the SMCC or SSMCC onto the chip to form a maleimide surface, a succinimide group at the other end of the SMCC or a functional group reactive with the succinimide sulfate group at the other end of the SSMCC, Specifically, it is necessary to introduce an amino group on the chip in advance. The means for introducing an amino group on the chip is not particularly limited. Examples thereof include a self-assembled surface method for aligning molecules on the substrate surface, a method of introducing using a reaction reagent, and a means for coating a substance having a functional group on a chip. Also included are means for introducing an amino group using a cross-linking agent starting from the functional group introduced on the surface.

本発明において用いられるペプチドアレイは、ペプチド基質の固定化されていない部分（バックグラウンド部）が、式（ＩＶ）に示すような化合物によりコーティングされていることが好ましい。式（ＩＶ）においてｍは１〜２０の整数、ｎは１〜１０の整数を示す。ｍの値は、２〜１０の範囲がより好ましく、４〜８の範囲が更に好ましい。ｎの値は、２〜８の範囲がより好ましく、３〜６の範囲が更に好ましい。この化合物によりバックグラウンド部をコーティングすることにより、バックグラウンド部における非特異的吸着を非常に効果的に抑制することが実現される。また、本発明のペプチドアレイは、基板の製造ロットや処理条件などの様々な変動要因に依存されるデータの再現性も向上し、非常に安定な測定データを得ることが可能である。 In the peptide array used in the present invention, the non-immobilized portion (background portion) of the peptide substrate is preferably coated with a compound as shown in the formula (IV). In formula (IV), m represents an integer of 1 to 20, and n represents an integer of 1 to 10. The value of m is more preferably in the range of 2 to 10, and still more preferably in the range of 4 to 8. As for the value of n, the range of 2-8 is more preferable, and the range of 3-6 is still more preferable. By coating the background portion with this compound, non-specific adsorption in the background portion can be very effectively suppressed. In addition, the peptide array of the present invention improves the reproducibility of data depending on various fluctuation factors such as the substrate production lot and processing conditions, and can obtain very stable measurement data.

しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、上記の固定化方法は非常に効果的である。 However, in the label-free optical detection method, any substance adsorbed on the chip is detected as a signal. That is, it is difficult to distinguish nonspecific adsorption of a substance that is not a measurement target from specific adsorption. Therefore, since a means for suppressing the nonspecific adsorption more severely is required, the above immobilization method is very effective.

ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の誘導体が好適に用いられる。 In an ELISA method or an interaction analysis method using a label substance, physical adsorption by bovine serum albumin or casein is generally selected as a blocking method. Although the physical adsorption method is easy, it is not stable and may be detached from the chip surface over time. In the above optical detection method, it is preferable to perform blocking by covalent bond in order to detect even the elimination of the blocking agent. In particular, when blocking the surface of the unreacted maleimide group, a compound having a thiol group is preferably used, and a PEG (polyethylene glycol) derivative is particularly preferably used.

本発明は、アレイ上でのリン酸化の検出を目的とする。したがって、上述のようにして得られたアレイ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させるに際しては、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることになる。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の破砕液中に既に含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。例えば、バッファーもしくは細胞破砕液（細胞ライゼート）または両者混合液中にプロテインキナーゼ試薬もしくは細胞破砕液中にすでに含まれるプロテインキナーゼとヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ）を加えたものを直接アレイに作用させることにより固定化基質のリン酸化を行うことができる。 The present invention is directed to the detection of phosphorylation on the array. Therefore, when a solution containing or considered to contain protein kinase is allowed to act on the array obtained as described above, a compound that inhibits or is thought to inhibit the protein kinase activity is coexisted in the solution. I will let you. The protein kinase to be subjected to profiling may be a commercially available reagent, but it is also possible to use a protein kinase already contained in or estimated to be contained in a cell-derived disruption solution. For example, the protein kinase reagent or nucleoside triphosphate (ATP) added to the protein kinase reagent or cell disruption solution in the buffer or cell disruption solution (cell lysate) or a mixture of both is directly applied to the array. By this, phosphorylation of the immobilized substrate can be performed.

特に、種々の薬剤による刺激を与えた細胞ライゼートを、本発明に適用することにより、薬剤による各種プロテインキナーゼ活性についての応答パターンの変化を捉えることが可能である。また、阻害剤を共存させる系でのリン酸化の阻害評価を行うことも可能である。したがって、例えば、各種プロテインキナーゼの阻害剤のような新規なドラッグのスクリーニング、プロテインキナーゼをマーカーとして癌などの疾患診断などに展開することも可能である。 In particular, by applying a cell lysate that has been stimulated with various drugs to the present invention, it is possible to capture changes in response patterns of various protein kinase activities by the drugs. It is also possible to evaluate phosphorylation inhibition in a system in which an inhibitor coexists. Therefore, for example, screening for novel drugs such as inhibitors of various protein kinases, diagnosis of diseases such as cancer, etc. using protein kinase as a marker is also possible.

リン酸化の条件はプロテインキナーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、固定化されたペプチドをリン酸化することができる。また、必要に応じて反応液中には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させてもよい。 The phosphorylation conditions vary depending on the type of protein kinase, but it is usually about 10 to 40 ° C., preferably about 20 to 40 ° C. for about 5 minutes to 8 hours, preferably about 10 minutes to 5 hours. Thus, the immobilized peptide can be phosphorylated. Moreover, you may coexist the substance which assists and accelerates | stimulates phosphorylation, such as cAMP, cGMP, Mg ^<2+> , Ca ^< ²⁺ >, in a reaction liquid as needed.

また、本発明は、アレイ上でのリン酸化阻害活性の検出を目的とすることも可能である。この場合は、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させるに際しては、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることになる。共存される阻害剤は特に限定されるものではないが、ペプチドもしくは蛋白質であってもよいし、その他の低分子化合物であってもよい。低分子化合物としては、分子量２，０００以下のものが挙げられるが特に制約されない。 The present invention can also be aimed at detecting phosphorylation inhibitory activity on the array. In this case, when a solution containing or thought to contain a protein kinase is allowed to act, a compound that inhibits or is thought to inhibit the protein kinase activity coexists in the solution. The coexisting inhibitor is not particularly limited, but may be a peptide or protein, or other low molecular weight compound. Low molecular compounds include those having a molecular weight of 2,000 or less, but are not particularly limited.

ところで、ペプチドのリン酸化に際しては、分子量としては８０の増大しか伴わないため、ＳＰＲによる検出を試みる場合には、直接的な検出シグナルを得ることは困難である。そこで、間接的にリン酸基もしくはリン酸化されたアミノ酸に特異的に結合しうる物質もしくは化合物を検出プローブとして用いる必要がある。 By the way, when a peptide is phosphorylated, the molecular weight is only increased by 80, so that when a detection by SPR is attempted, it is difficult to obtain a direct detection signal. Therefore, it is necessary to use a substance or compound that can specifically bind to a phosphate group or a phosphorylated amino acid as a detection probe.

特にアレイ上における基質のリン酸化を特異的に感度よくモニターするための検出プローブの種類として、リン酸化蛋白質を認識する抗体を用いることが可能である。具体的には、リン酸化セリン、リン酸化スレオニン、もしくはリン酸化チロシン抗体が用いられる。抗体は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体のいずれも適用が可能ではあるが、特異性の点で、一般的にはモノクロナール抗体の方が好ましい。 In particular, an antibody that recognizes a phosphorylated protein can be used as a type of detection probe for specifically monitoring the phosphorylation of a substrate on the array with high sensitivity. Specifically, phosphorylated serine, phosphorylated threonine, or phosphorylated tyrosine antibody is used. As the antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be applied, but a monoclonal antibody is generally preferable in terms of specificity.

また、検出プローブとしては、キレート化合物を用いる方法も適用することができる。キレート化合物とは一般に多座配位子ないしキレート試薬が金属イオンに配位して生じた錯体をいうものを指すが、特にリン酸に選択的かつ可逆的に結合する性質を有する化合物が好ましく、ポリアミン亜鉛錯体を用いることがより好ましい。ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることが更に好ましい。更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。 A method using a chelate compound can also be applied as the detection probe. The chelate compound generally refers to a complex formed by coordination of a polydentate ligand or a chelating reagent to a metal ion, and particularly a compound having a property of selectively and reversibly binding to phosphoric acid, More preferably, a polyamine zinc complex is used. More preferably, a dinuclear zinc complex having a polyamine compound as a ligand is used. Furthermore, it is more preferable to use a hexaamine dinuclear zinc (II) complex having a dinuclear zinc (II) complex in the basic structure.

このような化合物の典型としては、式（Ｖ）に示されるような、１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし、プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛２価イオンの架橋配位子になっている）が挙げられるが、本発明は特にこの化合物に限定されるものではない（ＤａｌｔｏｎＴｒａｎｓＶｏｌ．８，ｐｐ．１１８９−１１９３（２００４）参照） A typical example of such a compound is 1,3-bis [bis (2-pyridylmethyl) amino] -2-hydroxypropanolate (IUPAC name: 1,3-bis) as shown in the formula (V). A binuclear zinc complex having a polyamine compound having [bis (2-pyridinemethyl) amino] -2-propanolatodiincinc (II) complex) as a ligand (provided that the hydroxyl group of the propanol skeleton is divalent to two zinc atoms as an alcoholate) The present invention is not particularly limited to this compound (see Dalton Trans Vol. 8, pp. 1189-1193 (2004)).

本発明で用いられる錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、上記式（Ｖ）で示される化合物（Ｚｎ_２Ｌ）は、市販の１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンのエタノール溶液に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加え、次いで酢酸亜鉛二水和物を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水を加えて溶解後、１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し、加熱乾燥することにより式（Ｖ）の構造式で表される酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ_２Ｌ−ＣＨ_３ＣＯＯ⁻・２ＣｌＯ_４ ⁻・Ｈ_２Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。 The complex used in the present invention can be synthesized using a general chemical synthesis technique, but can also be synthesized using a commercially available compound as a raw material. For example, the compound (Zn ₂ L) represented by the above formula (V) can be obtained by the following method using commercially available 1,3-bis [bis (2-pyridylmethyl) amino] -2-hydroxypropane and zinc acetate as raw materials. Can be synthesized. To a solution of 1,3-bis [bis (2-pyridylmethyl) amino] -2-hydroxypropane in ethanol is added 10M aqueous sodium hydroxide, followed by zinc acetate dihydrate. A brown oil can be obtained by distilling off the solvent under reduced pressure. After adding water to this residue and dissolving, 1M sodium perchlorate aqueous solution was added dropwise while heating to 70 ° C., and the precipitated colorless crystals were collected by filtration and dried by heating to form the structure of formula (V). two perchlorate _{_{^{(Zn 2 L-CH 3 COO}}} - · 2ClO 4 - · H 2 O) of the acetate ion adduct of the formula can be obtained in high yield. This crystal contains one molecule of crystal water.

更には、例えばＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．７７，ｐｐ．３９７９−３９８５（２００５）において報告されているように、亜鉛キレート化合物でビオチン修飾されたもの（式（III）を参照）を用いて、アビジンもしくはストレプトアビジン、更には抗ストレプトアビジン抗体を作用させることにより、特異的にリン酸化に起因するＳＰＲシグナルを増幅させる方法も好ましい。この場合に、作用されるビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の溶液濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されないが、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体溶液をアレイ表面全体に広がるのに必要な液量をドロップしてもよいし、溶液中にアレイを浸漬させてもよい。あるいはポンプを用いて溶液を送液しながら、アレイ表面上に溶液を接触させることにより作用させてもよい。作用温度は室温でもよいし、２０〜４０℃程度の一定温度でインキュベートさせてもよい。作用時間は１０分から２時間程度が好ましく、３０分から１時間程度がより好ましい。 Furthermore, for example, Anal. Chem. Vol. 77, pp. As reported in 3979-3985 (2005), a biotin-modified zinc chelate compound (see formula (III)) is used to act avidin or streptavidin, and even anti-streptavidin antibodies A method of specifically amplifying an SPR signal resulting from phosphorylation is also preferred. In this case, the solution concentration of the biotin-modified polyamine zinc complex to be actuated is not particularly limited, but is usually in the range of 1 μM to 10 M, preferably 10 μM to 1 M, more preferably 10 μM to 10 mM. The mode of action on the array is not particularly limited, but the amount of liquid necessary for spreading the biotin-modified polyamine zinc complex solution over the entire array surface may be dropped, or the array may be immersed in the solution. Or you may make it act by making a solution contact on an array surface, sending a solution using a pump. The action temperature may be room temperature or may be incubated at a constant temperature of about 20 to 40 ° C. The action time is preferably about 10 minutes to 2 hours, more preferably about 30 minutes to 1 hour.

上述のように、ビオチン修飾された亜鉛キレート化合物を作用させた後、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させ、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることにより、検出感度を更に高めることが可能になる。この場合の、アビジンもしくはストレプトアビジン、あるいは抗体を作用させる際の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１からμｇ／ｍｌ程度である。抗体としてはモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体のいずれも適用できるが、特異性の点でモノクロナール抗体の方が好ましい。 As described above, after the biotin-modified zinc chelate compound is allowed to act, avidin or streptavidin is allowed to act, and further, an antibody that recognizes avidin or streptavidin is allowed to act, thereby further enhancing detection sensitivity. Become. In this case, the concentration when avidin or streptavidin or an antibody is allowed to act is not particularly limited, but is preferably about 0.01 to 10 μg / ml, more preferably about 0.1 to μg / ml. As the antibody, either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be applied, but the monoclonal antibody is more preferable in terms of specificity.

また、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンを順次作用させてもよいが、予めビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンの複合体を形成させたものを直接作用させてもよい。この場合も上述のように、さらにアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させてもよい。複合体の形成に際しては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンとのモル比にして１：１乃至４：１にして反応させるのがよい。反応物は精製して未反応物を除去する方が好ましいが、反応物をそのまま適用することも可能である。 Further, a biotin-modified polyamine zinc complex, avidin or streptavidin may be allowed to act sequentially, but a biotin-modified polyamine zinc complex and a complex of avidin or streptavidin previously formed may be allowed to act directly. In this case, as described above, an antibody that recognizes avidin or streptavidin may be allowed to further act. In forming the complex, it is preferable that the biotin-modified polyamine zinc complex and avidin or streptavidin are reacted in a molar ratio of 1: 1 to 4: 1. The reaction product is preferably purified to remove unreacted product, but the reaction product can be applied as it is.

こうしたキレート性化合物の適用は、上述したような方法により非常に安価に合成することができる点で有利である。また常温により保存ができる点でも安定で使いやすく、流通面においても有利である。またリン酸化されるアミノ酸残基の種類に関係なく作用をすることや、リン酸化されたアミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列に対して反応が依存しない点において、特に抗体を用いて検出する方法と比較して非常に大きな優位性を有している。 The application of such a chelating compound is advantageous in that it can be synthesized at a very low cost by the method described above. In addition, it is stable and easy to use in that it can be stored at room temperature, which is advantageous in terms of distribution. Compared with the detection method using antibodies in particular, it acts regardless of the type of amino acid residue to be phosphorylated and is independent of the reaction with the amino acid sequence in the vicinity of the phosphorylated amino acid. And has a huge advantage.

上記プロテインキナーゼとしては、種々のチロシンキナーゼあるいはセリン／スレオニンキナーゼが挙げられる。これらプロテインキナーゼの種類については特に限定されるものではなく、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに対して適用することが可能である。 Examples of the protein kinase include various tyrosine kinases and serine / threonine kinases. The types of these protein kinases are not particularly limited, and can basically be applied to all types of protein kinases.

上述したような本発明の方法により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでリン酸化反応を行うことにより、プロテインキナーゼ活性のプロファイリングによる網羅的な解析を実現することができる。特に、創薬のスクリーニングや癌などの診断の分野において、有用な技術となりうることが期待される。 By conducting the phosphorylation reaction on-chip by the method of the present invention as described above, comprehensive analysis by profiling of protein kinase activity can be realized. In particular, it is expected to be a useful technique in the fields of drug discovery screening and cancer diagnosis.

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
（ＳＰＲアレイの作製）
式（ＶＩ）に示すような、末端官能基がチオール基である直鎖型チオールＰＥＧ試薬（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製ＳＰＳＰＴ−００１１）を１ｍＭの濃度でエタノール７ｍｌに溶解させた。直鎖型チオールＰＥＧの分子量は３３６．５４である。特に、金に対する金属結合性を示す。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not particularly limited to the examples.
[Example 1]
(Preparation of SPR array)
As shown in the formula (VI), a linear thiol PEG reagent (SPSPT-0011 manufactured by SensoPath) whose terminal functional group is a thiol group was dissolved in 7 ml of ethanol at a concentration of 1 mM. The molecular weight of the linear thiol PEG is 336.54. In particular, it shows metal bondability to gold.

１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記直鎖型ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。 A gold-deposited slide in which 3 nm of chromium was vapor-deposited on an SF15 glass slide of 18 mm square and 2 mm thickness and gold was vapor-deposited at 45 nm was immersed in the linear PEG thiol solution for 3 hours to bond PEG thiol to the entire gold substrate.

このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分はＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。 A photomask was placed on the slide and irradiated with a 500 W ultra-high pressure mercury lamp (manufactured by USHIO) for 2 hours to remove PEG thiol in the UV irradiation part. The photomask has 96 square holes of 500 μm square (consisting of 8 × 12 patterns), and the pitch between the hole centers is designed to be 1 mm. The portion of the photomask with a hole is transparent to UV light and is irradiated onto the slide for patterning. PEG remains in the unirradiated portion, and functions as a reference portion as a background portion of the chip.

８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）を２０ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基とが反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。 It was immersed in a 1 mM ethanol solution of 8-Amino-1-Octanethiol, Hydrochloride (8-AOT, manufactured by Dojindo Laboratories) for 1 hour to form a self-organized surface of 8-AOT on the UV irradiation part. SSMCC (Pierce) was dissolved in 20 mM phosphate buffer (150 mM NaCl; pH 7.2) at 0.4 mg / ml and reacted with 8-AOT on the gold surface for 15 minutes. Since the amino group of 8-AOT and the NHS group of SSMCC reacted and the MAL group remained unreacted, a maleimide group could be introduced to the surface via PEG.

上記のようにして得られた表面に、配列番号１〜２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、図１に示すようなパターンで、３箇所ずつ、いずれもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．５ｍＭ濃度で溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）自動スポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。ペプチドは全て、システイン（Ｃｙｓ）−グリシン（Ｇｌｙ）−グリシン（Ｇｌｙ）の配列を末端に付加されたものを用いた。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。 On the surface obtained as described above, the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 26 was formed in a phosphate buffer solution (20 mM phosphate, 150 mM NaCl; pH 7.2) was dissolved at a concentration of 0.5 mM and spotted by 10 nl using a MultiSPRinter (registered trademark) automatic spotter (manufactured by Toyobo). All peptides used were those with a cysteine (Cys) -glycine (Gly) -glycine (Gly) sequence added to the end. Then, the immobilization reaction was carried out by allowing to stand at room temperature for 16 hours in a wet environment. The maleimide group formed on the surface of the chip reacts with the thiol group possessed by the cysteine residue at the terminal of the substrate peptide, so that the substrate peptide can be covalently immobilized on the surface.

（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。 (Blocking of unreacted maleimide groups)
After washing the substrate peptide-immobilized surface with a phosphate buffer, in order to block unreacted maleimide groups, PEG thiol (wherein one functional group is a thiol group and the other functional group is a methoxy group) SUNBRIGHT (registered trademark) MESH-50H manufactured by NOF Corporation is dissolved in a phosphate buffer (20 mM phosphate, 150 mM NaCl; pH 7.2) to a concentration of 1 mM, and 250 μl is poured onto the chip at room temperature. The reaction was carried out for 1 hour. The molecular weight of PEG thiol used here is 5,000.

［実施例２］
（ＳＰＲ解析によるＳｒｃキナーゼによるリン酸化の検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイを用いて、チップ上でのＳｒｃによるリン酸化を行った。Ｓｒｃキナーゼ溶液３００μｌをアレイ上にドロップして、３７℃で２時間の反応を行った。Ｓｒｃ溶液の組成は、Ｓｒｃキナーゼ（カルナバイオサイエンス製；２０ｐｇ／μｌ）６μｌ、１５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）２５２μｌ、１０ｍＭＡＴＰ３μｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０３０μｌ、１００ｍＭＤＴＴ６μｌ、５００ｍＭ塩化マグネシウム３μｌとした。 [Example 2]
(Detection of phosphorylation by Src kinase by SPR analysis)
Phosphorylation with Src was performed on the chip using the array subjected to blocking as described above. 300 μl of Src kinase solution was dropped on the array, and the reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. The composition of the Src solution was 6 μl of Src kinase (carna bioscience; 20 pg / μl), 252 μl, 15 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 10 μm ATP 3 μl, 0.1% Tween 20 30 μl, 100 mM DTT 6 μl, 500 mM chloride. Magnesium was 3 μl.

上記リン酸化反応を施されたアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、リン酸化チロシン抗体ＰＴ−６６（シグマ製）の１．３μｇ／ｍｌ濃度溶液をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察して、シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。 The array subjected to the phosphorylation reaction was washed with PBS and water, and after the surface of the array was dried, it was set in an SPR imaging device (MultiSPRinter (registered trademark): manufactured by Toyobo) and 50 mM Tris as a running buffer. -Hydrochloric acid buffer (pH 7.4) was flowed into the flow cell at a rate of 100 μl / min. After confirming that the signal from SPR was stabilized, a 1.3 μg / ml concentration solution of phosphorylated tyrosine antibody PT-66 (manufactured by Sigma) was injected into the cell in the SPR device to act. The change of the SPR signal at that time was observed, and when the signal rise reached a plateau state, the running buffer was again fed and washed. In addition to the spot site of each substrate, the signal change was also observed in the background.

（観察の結果と考察）
ＳＰＲイメージングを行った結果を図２（Ａ）に示した。ＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、抗体反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ（ＳｃｉｏｎＣｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。 (Observation results and discussion)
The result of SPR imaging is shown in FIG. In the SPR analysis, the image is captured every 5 seconds by the CCD camera, and the image at the time before the reaction is obtained from the image captured at the time after the antibody reaction by the image calculation processing software Scion Image (manufactured by Scion Corp.). It is the result of having performed the subtraction process using.

また、各プローブにおいて得られたＳＰＲセンサグラムにおけるシグナル値をグラフ化した結果を図３に示した。シグナル値は、３点における値を平均化し、ブランクにおけるシグナル値を差し引いた結果である。Ｎｏ.２３，９，２０，２２，１３，５，１９において、特に強いシグナルが得られている。これらのほとんどは、別途検討した蛍光アレイ解析やマススペクトル解析においても、Ｓｒｃの基質としての有用性が確認されているものである。 Moreover, the result of having graphed the signal value in the SPR sensorgram obtained in each probe was shown in FIG. The signal value is the result of averaging the values at 3 points and subtracting the signal value at the blank. In No. 23, 9, 20, 22, 13, 5, and 19, particularly strong signals are obtained. Most of these have confirmed the usefulness of Src as a substrate in fluorescent array analysis and mass spectrum analysis separately examined.

［実施例３］
（ＳＰＲ解析によるＰＫＡによるリン酸化の検出）
実施例１と同様にして得た、ブロッキングを行ったアレイを用いて、チップ上でのＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３７℃で２時間の反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ（プロメガ製；８０Ｕ／μｌ、２．５ｍｇ蛋白質／ｍｌ）１μｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）３８３μｌ、１０ｍＭＡＴＰ８μｌ、５００ｍＭ塩化マグネシウム８μｌとした。 [Example 3]
(Detection of phosphorylation by PKA by SPR analysis)
Using the blocking array obtained in the same manner as in Example 1, phosphorylation with PKA on the chip was performed. 400 μl of PKA solution was dropped on the array and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The composition of the PKA solution was PKA (manufactured by Promega; 80 U / μl, 2.5 mg protein / ml) 1 μl, 20 mM HEPES buffer (pH 7.5) 383 μl, 10 mM ATP 8 μl, 500 mM magnesium chloride 8 μl.

上記リン酸化反応を施されたアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた。ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体としては、以下の式（III）に示されるＰｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）ＢＴＬ−１０４（株式会社ナード研究所）を用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）ＢＴＬ−１０４は１０μｇ／ｍｌ濃度とし、溶解液には０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。インキュベーションは室温で３０分間行った。 The array subjected to the phosphorylation reaction was washed with PBS and water to allow the biotin-modified polyamine zinc complex to act. As the biotin-modified polyamine zinc complex, Phos-tag (registered trademark) BTL-104 (Nard Laboratories, Inc.) represented by the following formula (III) was used. Phos-tag (registered trademark) BTL-104 has a concentration of 10 μg / ml, and the lysis solution contains 10 mM HEPES- containing 0.005% Tween 20, 10% (v / v) ethanol, 0.2 M sodium nitrate, 1 mM zinc nitrate. NaOH buffer (pH 7.4) was used. Incubation was for 30 minutes at room temperature.

その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、４μｇ／ｍｌ濃度のストレプトアビジン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ製）溶液をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察して、シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行い、更に抗ストレプトアビジン抗体を４μｇ／ｍｌ濃度で同様に作用させた。この場合も、ＳＰＲシグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。 Thereafter, the array was washed three times with PBS and water, and the surface of the array was dried. Then, the array was set in an SPR imaging device (MultiSPRinter (registered trademark): manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and 50 mM Tris-HCl buffer (as a running buffer) pH 7.4) was flowed into the flow cell at a rate of 100 μl / min. After confirming that the signal from the SPR was stabilized, a streptavidin (Molecular Probes) solution having a concentration of 4 μg / ml was injected into the cell in the SPR device to act. The change in the SPR signal at that time was observed, and when the signal rise reached a plateau state, the running buffer was again fed and washed, and the anti-streptavidin antibody was similarly acted at a concentration of 4 μg / ml. . Also in this case, when the SPR signal rise reached a plateau state, the running buffer was fed again for washing. In addition to the spot site of each substrate, the signal change was also observed in the background.

ＳＰＲイメージングを行った結果を図２（Ｂ）に示した。Ｓｒｃ反応により得られた図２（Ａ）とはイメージングのパターンに大きな相違が認められている。画像演算処理については、実施例２と同じ方法により行った。また、各プローブにおいて得られたＳＰＲセンサグラムにおけるシグナル値を、実施例２と同様にしてグラフ化した結果を図４に示した。Ｎｏ．９，４，１６、５，１，６，１９において、特に強いシグナルが得られている。これらのほとんどは、別途検討した蛍光アレイ解析やマススペクトル解析においても、ＰＫＡの基質としての有用性が確認されているものである。 The result of SPR imaging is shown in FIG. A large difference in the imaging pattern is recognized from FIG. 2A obtained by the Src reaction. The image calculation process was performed in the same manner as in Example 2. In addition, FIG. 4 shows the results of graphing the signal values in the SPR sensorgram obtained for each probe in the same manner as in Example 2. No. In 9, 4, 16, 5, 1, 6 and 19, particularly strong signals are obtained. Most of these have been confirmed to be useful as substrates for PKA in fluorescent array analysis and mass spectrum analysis separately examined.

［実施例４］
実施例１と同様にして得た、ブロッキングを行ったアレイを用いて、薬剤刺激を与えた細胞ライゼートを用いた、プロテインキナーゼ活性のＳＰＲによる検出を検討した。
（細胞ライゼートの調製）
無血清ＭＥＭ中で培養したヒト乳がん由来ＭＣＦ−７細胞(株)（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を１０ｃｍシャーレに１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した後、２０時間培養した。神経成長因子（ＮＧＦ）を無血清培地に添加し、終濃度が５０ｎｇ／ｍｌになるように、細胞に添加して、ＣＯ_２インキュベーター内で１０分間インキュベートを行った。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）５ｍｌで洗浄した後、Ｄ−ＰＢＳ１ｍｌを加えて、細胞をセルスクレーパーではがし、細胞懸濁液を回収した。３００ｇで５分間遠心分離した後、ペレットにｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭリン酸化カリウム、ｐＨ７．２５，１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭｓｏｄｉｕｍｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、８０ｍＭ β−グリセロリン酸、３μｇ／ｍｌｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、５μｇ／ｍｌａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１ｍＭｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）を加えて、１５秒間の超音波処理を３回行い、細胞を破砕した。１００，０００ｇで６０分の超遠心を４回行い、上清（ｃｙｔｏｓｏｌ）を回収した。沈殿に２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りのｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加えて、１５秒間の超音波処理を３回行い、細胞を破砕した。１００，０００ｇで４０分の超遠心を４回行い、上清（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を回収して用いた。なお、対照としてＮＧＦを加えない細胞に関しても、同様の処理を行いライゼートを調製した。ライゼート中に含まれる蛋白質の定量は、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド製）を用いて定量を行った。 [Example 4]
Using the blocked array obtained in the same manner as in Example 1, detection of protein kinase activity by SPR using a cell lysate to which drug stimulation was applied was examined.
(Preparation of cell lysate)
Human breast cancer-derived MCF-7 cells (human science research resource bank) cultured in serum-free MEM were seeded in a 10 cm petri dish at 1 × 10 ⁶ cells / well and then cultured for 20 hours. Nerve growth factor (NGF) was added to the serum-free medium, added to the cells to a final concentration of 50 ng / ml, and incubated for 10 minutes in a CO ₂ incubator. After washing with 5 ml of Dulbecco's PBS (D-PBS), 1 ml of D-PBS was added, the cells were peeled off with a cell scraper, and the cell suspension was recovered. After centrifuging at 300 g for 5 minutes, the pellet was mixed with lysis buffer (50 mM potassium phosphate, pH 7.25, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM magnesium chloride, 1 mM DTT, 1 mM sodium orthovanadate, 80 mM β-glycerophosphate, 3 μg / ml pepstatin. A, 5 μg / ml aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride) was added, and sonication was performed 3 times for 15 seconds to disrupt the cells. The ultracentrifugation was performed 4 times at 100,000 g for 60 minutes, and the supernatant was recovered. Lysis buffer containing 2% Triton X-100 was added to the precipitate, and sonication was performed 3 times for 15 seconds to disrupt the cells. Ultracentrifugation was carried out 4 times at 100,000 g for 40 minutes, and the supernatant was collected and used. As a control, a lysate was prepared by carrying out the same treatment for cells not added with NGF. The protein contained in the lysate was quantified using a DC protein assay kit (manufactured by Bio-Rad).

（細胞ライゼートを用いたＳＰＲ解析）
上記で得られた細胞ライゼートを蛋白質濃度が１００μｇ／ｍｌになるように、反応バッファーで希釈した。終濃度条件として、１５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＡＴＰとなるように調整した。該組成からなるライゼート溶液３００μｌを実施例１で作製したブロッキングを行ったアレイ上にドロップして、３７℃で２時間の反応を行った。その後、アレイを１％ＳＤＳ−ＰＢＳ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ，ミリＱ水の順に超音波処理しながら、各１０分ずつ洗浄を行った。 (SPR analysis using cell lysate)
The cell lysate obtained above was diluted with a reaction buffer so that the protein concentration was 100 μg / ml. As final concentration conditions, 15 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM magnesium chloride, 0.01% (v / v) Tween 20, 2 mM DTT, and 0.1 mM ATP were adjusted. 300 μl of the lysate solution having the composition was dropped on the blocked array prepared in Example 1 and reacted at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the array was washed for 10 minutes each while sonicating in the order of 1% SDS-PBS, 0.05% Tween 20-PBS, and milli-Q water.

洗浄を終えたアレイを、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）：東洋紡績製）にセットし、実施例２と同じ方法、条件にてＳＰＲ解析を実施した。各プローブにおいて得られたＳＰＲセンサグラムにおけるシグナル値を、グラフ化した結果を図５に示した。（Ａ）はＮＧＦによる刺激のない細胞ライゼート、（Ｂ）はＮＧＦにより刺激を与えた細胞ライゼートを用いて測定を行った結果である。ＮＧＦ刺激により、Ｎｏ．１９の基質ペプチドにおいて、シグナルの増大が最も顕著であった。その他にも、Ｎｏ．２２，２３，１８などにおいてもシグナルが増大している。これらは、実施例２で行ったＳｒｃ反応において、応答を示した基質であることから、ＮＧＦ刺激によりＳｒｃ活性が増幅されている可能性が示唆される結果である。最もシグナル増幅されたＮｏ．１９に関しては、Ｓｒｃでの応答は見られているが、他の基質と比べて特に強い応答ではなかった。したがって、Ｓｒｃ以外のチロシンキナーゼの活性化も促進されているものと推察される。 The washed array was set in an SPR imaging device (MultiSPRinter (registered trademark): manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and SPR analysis was performed under the same method and conditions as in Example 2. FIG. 5 shows the result of graphing the signal value in the SPR sensorgram obtained for each probe. (A) is the result of measurement using cell lysate without stimulation by NGF, and (B) is the result of measurement using cell lysate stimulated by NGF. By NGF stimulation, no. In 19 substrate peptides, the increase in signal was most noticeable. In addition, no. Signals are also increasing in 22, 23, 18 and the like. Since these are substrates that showed a response in the Src reaction performed in Example 2, the results suggest the possibility that the Src activity was amplified by NGF stimulation. The most amplified signal No. Regarding 19, the response with Src was observed, but it was not particularly strong compared with other substrates. Therefore, it is speculated that activation of tyrosine kinases other than Src is also promoted.

［実施例５］
実施例４で調製したＮＧＦで刺激された細胞のライゼートを用いて、Ｓｒｃ阻害剤であるＳＵ６６５６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）を共存させた場合の、各プローブにおける応答変化を検討した。実施例４と同じ方法、条件にて、ＳＵ６６５６を１０^−７，１０^−６，１０^−５，１０^−４Ｍの濃度で共存させて、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化反応を行った。ＳＰＲ解析も実施例４と同様にして行った。各プローブにおいて得られたＳＰＲセンサグラムにおけるシグナル値を、グラフ化した結果を図６に示した。シグナルが確認されているペプチドに関しては、阻害剤が高濃度になるほど、シグナルが低下していく様子が確認されている。このことからも、実施例４で確認されていたＳＰＲシグナルは主にＳｒｃ反応によるリン酸化に起因するものであったことが裏づけられたと考えられる。 [Example 5]
Using the lysate of NGF-stimulated cells prepared in Example 4, the response change in each probe was examined in the presence of SU6656 (Calbiochem), which is an Src inhibitor. Under the same method and conditions as in Example 4, SU-6656 was allowed to coexist at concentrations of 10 ⁻⁷ , 10 ⁻⁶ , 10 ⁻⁵ , and 10 ⁻⁴ M, and an on-chip phosphorylation reaction was performed. SPR analysis was performed in the same manner as in Example 4. The result of graphing the signal value in the SPR sensorgram obtained for each probe is shown in FIG. Regarding the peptide for which the signal is confirmed, it has been confirmed that the signal decreases as the concentration of the inhibitor increases. This also suggests that the SPR signal confirmed in Example 4 was mainly due to phosphorylation by the Src reaction.

本発明を利用することにより、多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。 By utilizing the present invention, it is possible to comprehensively analyze many types of protein kinase signals, and to effectively profile protein kinase dynamics in cells accompanying the introduction of genes with unknown functions or drug administration. it can. This is expected to expand into genomic drug discovery, such as functional analysis from new genes and approaches to drug discovery.

実施例１において作製したアレイにおける、固定化ペプチドのパターンを示す図である。数字は、配列番号を示す。FIG. 3 is a diagram showing a pattern of immobilized peptides in the array prepared in Example 1. Numbers indicate SEQ ID NOs. 実施例２及び実施例３により得られたＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。（Ａ）Ｓｒｃ反応、（Ｂ）ＰＫＡ反応It is a figure which shows the result of having performed SPR imaging obtained by Example 2 and Example 3. FIG. (A) Src reaction, (B) PKA reaction 実施例２において、Ｓｒｃ反応により得られた各基質ペプチドにおけるＳＰＲシグナルを示す図である。In Example 2, it is a figure which shows the SPR signal in each substrate peptide obtained by Src reaction. 実施例３において、ＰＫＡ反応により得られた各基質ペプチドにおけるＳＰＲシグナルを示す図である。In Example 3, it is a figure which shows the SPR signal in each substrate peptide obtained by PKA reaction. 実施例４において、細胞ライゼートによるリン酸化反応により得られた各基質ペプチドにおけるＳＰＲシグナルを示す図である。（Ａ）ＮＧＦ刺激なし、（Ｂ）ＮＧＦ刺激ありIn Example 4, it is a figure which shows the SPR signal in each substrate peptide obtained by the phosphorylation reaction by a cell lysate. (A) No NGF stimulation, (B) NGF stimulation 実施例５において、ＮＧＦ刺激を与えた細胞ライゼートに関して、Ｓｒｃ阻害剤ＳＵ６６５６を共存させた場合の、各基質ペプチドにおけるリン酸化シグナルの変動を検討した結果示す図である。In Example 5, it is a figure which shows the result of having examined the fluctuation | variation of the phosphorylation signal in each substrate peptide at the time of coexisting Src inhibitor SU6656 regarding the cell lysate which gave NGF stimulation.

Claims

配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有する、少なくとも２種以上のペプチド基質が金表面上に固定化されていることを特徴とする基板上におけるリン酸化を表面プラズモン共鳴によりリン酸化を検出するためのペプチドアレイ。 Phosphorylation on a substrate characterized by phosphorylation by surface plasmon resonance, wherein at least two or more peptide substrates containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 are immobilized on a gold surface Peptide array for detecting oxidation.

基板上におけるリン酸化を表面プラズモン共鳴イメージングにより検出するための請求項１に記載のペプチドアレイ。 The peptide array according to claim 1 for detecting phosphorylation on a substrate by surface plasmon resonance imaging.

配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチド基質が５種以上固定化されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチドアレイ。 The peptide array according to claim 1 or 2, wherein five or more types of peptide substrates containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 are immobilized.

配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチド基質が１０種以上固定化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドアレイ。 The peptide array according to any one of claims 1 to 3, wherein 10 or more types of peptide substrates containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 are immobilized.

配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチド基質が末端にシステイン残基を有していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドアレイ。 The peptide array according to any one of claims 1 to 4, wherein the peptide substrate containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 has a cysteine residue at the terminal.

配列番号１〜２６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチド基質が式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）に示される化合物を架橋剤として用いて金表面に固定化されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドアレイ。

A peptide substrate containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 26 is immobilized on a gold surface using a compound represented by formula (I) or (II) as a crosslinking agent The peptide array in any one of Claims 1-5.

請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドアレイを用いて、基板上でリン酸化反応を行った後、リン酸化部位を認識することのできる抗体を作用させることにより得られる表面プラズモン共鳴のシグナルによりリン酸化を検出する方法。 A signal of surface plasmon resonance obtained by allowing an antibody capable of recognizing a phosphorylated site to act after phosphorylating on the substrate using the peptide array according to any one of claims 1 to 6. To detect phosphorylation.

請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドアレイを用いて、基板上でリン酸化反応を行った後、リン酸化部位を認識することのできる金属錯体化合物を作用させることにより得られる表面プラズモン共鳴のシグナルによりリン酸化を検出する方法。 Surface plasmon resonance obtained by allowing a metal complex compound capable of recognizing a phosphorylated site to act after phosphorylating on a substrate using the peptide array according to any one of claims 1 to 6. Of detecting phosphorylation by the signal of.

金属錯体化合物がビオチンで修飾されてなり、かつ該金属錯体化合物をペプチドアレイに作用させた後、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることを特徴とする請求項８に記載のリン酸化を検出する方法。 9. The method for detecting phosphorylation according to claim 8, wherein the metal complex compound is modified with biotin, and after the metal complex compound is allowed to act on the peptide array, avidin or streptavidin is allowed to act.

金属錯体化合物が亜鉛キレート化合物であることを特徴とする請求項８又は９に記載のリン酸化を検出する方法。 The method for detecting phosphorylation according to claim 8 or 9, wherein the metal complex compound is a zinc chelate compound.

金属錯体化合物が式（ＩＩＩ）で示される化合物であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載のリン酸化を検出する方法。

The method for detecting phosphorylation according to any one of claims 8 to 10, wherein the metal complex compound is a compound represented by the formula (III).

細胞ライゼートによる基板上でのリン酸化反応を検出することを特徴とする請求項7〜１１のいずれかに記載のリン酸化を検出する方法。 The method for detecting phosphorylation according to any one of claims 7 to 11, wherein a phosphorylation reaction on a substrate by cell lysate is detected.

薬剤による刺激を与えた細胞のライゼートによる基板上でのリン酸化反応を検出することを特徴とする請求項１２に記載のリン酸化を検出する方法。 The method for detecting phosphorylation according to claim 12, wherein a phosphorylation reaction on a substrate by a lysate of a cell stimulated with a drug is detected.