【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、金属基板上にプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドが１もしくは複数種固定化されてなるアレイを用いたプロテアーゼ活性の網羅的な解析方法に関する。特に表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと示すこともある。）による分析技術を用いることにより、迅速で効率的であり、しかも簡便なプロテアーゼ活性の解析を実現することができるものである。より具体的には、ＳＰＲにより解析された物質間の相互作用の様子をモニターした表面プラズモン共鳴イメージング法（以下、ＳＰＲイメージング法と示すこともある。）を応用した新規なプロテアーゼ活性の解析方法である。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは蛋白質やペプチドにおけるペプチド結合を加水分解する酵素の総称であり、微生物、動物、植物の細胞内外に広く存在している。プロテアーゼは実に多くの種類のものが報告されており、生体内においては様々な生理的意義を有している。なかでも、カスパーゼはアポトーシスのシグナル伝達の基幹となる酵素であり、重要なプロテアーゼの一つである。
【０００３】
アポトーシスＫｅｒｒらによりは提唱された概念であり、個体の生命を維持するために遺伝子により制御された細胞死を意味するものである。これは、個体発生における形態形成や神経系ネットワークの確立だけでなく、成熟個体における細胞交替や内分泌系による恒常性の維持及び免疫系の成立などに重要な役割を果たしている。また、癌、自己免疫疾患、エイズなどのウイルス感染症、アルツハイマー病などの神経変性疾患などの発症に密接に関わっている。アポトーシスの実行過程においては、カスパーゼによる特定蛋白質（ＰＡＲＰ、ＩＣＡＤ、Ａｃｉｎｕｓ等）の限定分解が中心的な役割を果たしている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． 第３２６巻、第１〜１６頁（１９９７年））。カスパーゼには、既に多種類のものが報告されており、それらの活性化に関するメカニズムも解明されつつある。これらカスパーゼの活性を網羅的に解析する技術を確立することは、薬剤の開発や診断等の分野において重要な意味を有する。
【０００４】
プロテアーゼ活性の測定は、基質である蛋白質やペプチドの分解を紫外線吸収による定量や、蛍光物質、放射性物質等により標識された基質を用いて遊離される標識物質の量を定量するなどの方法により通常は行われている。しかしながら、こうした手法はプロテオミクス研究などの分野において近年強く求められてきているハイスループット化には到底対応できるものではない。ハイスループット化に対応の可能性あるプロテアーゼアッセイ系としては、表面プラズモン共鳴を用いた手法として、インタクトな基質の質量対切断された基質の質量を検出する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、この方法も別な反応容器内で予め酵素反応させてからＳＰＲ測定に供する方法であり、必ずしもハイスループット化に十分に対応しうるような方法とはいえるものではない。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２９６８０４８号
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、迅速でしかも特別な技術を必要としない簡易な手法により、種々のプロテアーゼに関する動態を網羅的にプロファイリングできる方法を確立しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、金属をコーティングした基板上にプロテアーゼを認識する蛋白質もしくはペプチドが固定化されてなるアレイを用いること、さらに該アレイ上における物質間の相互作用をＳＰＲにより検出することが、様々なプロテアーゼに関する動態の迅速な解析を行う上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．少なくとも１種のプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ。
項２．各々が別々のプロテアーゼの基質である、少なくとも２種の蛋白質もしくはペプチドが金属薄膜上に固定化されてなる項１に記載のアレイ。
項３．プロテアーゼがカスパーゼである項１または２に記載のアレイ。
項４．前記ペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方或いは両方にシステイン残基を有している項１〜３のいずれかに記載のアレイ。
項５．前記ペプチドがビオチンにより修飾されてなる請求項１〜４のいずれかに記載のアレイ。
項６．表面プラズモン共鳴を利用してプロテアーゼ活性の解析を行うための項１〜５のいずれかに記載のアレイ。
項７．加水分解された前記アレイ上に固定化ペプチドを表面プラズモン共鳴を利用して検出することを特徴とするプロテアーゼ活性の解析方法。
項８．加水分解された前記アレイ上に固定化ペプチドを表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする項７記載のプロテアーゼ活性の解析方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明における基板上において分解された蛋白質もしくはペプチドの検出方法としては、従来からよく知られているような放射性物質、蛍光性物質、化学発光性物質などの標識化合物を利用して行うことも可能である。しかしながら、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、楕円偏光法（以下、エリプソメトリと示す。）、和周波発生（以下、ＳＦＧと示す。）分光測定などの光学的検出方法を適用するのがより好ましい。なかでもＳＰＲは位相差を求める必要がなく、反射光強度を求めるだけで、表面のｎｍオーダーの膜厚変化を求めることができるため特に好ましい。さらにＳＰＲイメージング法は広い範囲の観察が可能であり、アレイフォーマットでの物質相互作用観察が可能であるためさらに好ましい。
【００１０】
蛋白質もしくはペプチドの加水分解は、プロテアーゼを有し得る供試試料を本発明のアレイ上に適用して行うことができる。例えば、適当なバッファー中にプロテアーゼを有し得る供試試料を加え、１０〜４０℃程度の温度で、好ましくは３０〜３７℃の温度で、１０分〜６時間程度、好ましくは３０〜２時間程度反応させることで、ペプチドを加水分解することができる。必要に応じて、加水分解反応溶液中には、塩、糖などの物質を共存させてもよい。動態のプロファイリングの対象となるプロテアーゼとしては、例えばトリプシン、エラスターゼ、ペプシン、キモトリプシン、プラスミン、レニン、ウロキナーゼ、カテプシン、カスパーゼなど種々のものが例示されるが、特に限定されるものではない。
【００１１】
本発明において、蛋白質もしくはペプチドは様々なプロテアーゼの動態を網羅的にプロファイリングすることが目的であるので、１種類の蛋白質もしくはペプチドは１種類のプロテアーゼによってのみ加水分解され、他のプロテアーゼによっては加水分解されないことが好ましい。例えば、カスパーゼ３の基質としては配列番号２のペプチドが例示される。カスパーゼ３を含むプロテアーゼの基質となるペプチド配列は公知であるか、公知の配列に基づき適宜選択することが可能である。本発明のアレイがその動態の把握を必要とする複数のプロテアーゼの種類に対応した種類のペプチドを固定化していれば、１枚のアレイで多種類の及ぶプロテアーゼのプロファイリングをすることができ好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみのプロテアーゼに対応するペプチドを固定化し、必要な数のアレイを使用してプロテアーゼのプロファイリングを行ってもよい。
【００１２】
エリプソメトリは試料に光を照射し、薄膜の表面で反射した光と、薄膜の裏面で反射してきた光の干渉によって生じる偏向状態の変化から、膜厚、屈折率を測定できる。すなわち、ｐ偏光とｓ偏光の光に対する反射率の絶対値の比及び位相変化の比を評価する手段である。なかでも波長を変えながらエリプソメトリを測定する分光エリプソメトリは非常に敏感に表面の膜厚変化が検出できるため好ましい。
【００１３】
ＳＦＧは２次の非線形光学効果の一種であり、周波数の異なる２種類の入射光（周波数ω１ と周波数ω２）が媒質中で混合され、ω１＋ω２、あるいはω１−ω２の光が発生する現象である。特にω１として可視光を用い、ω２として波長可変の赤外光を用いると赤外分光に類似した振動分光を行うことができる。この手法は表面選択性が良いため単分子膜レベルの分子の振動分光が可能であり、非常に敏感な表面解析方法として有用である。
【００１４】
上述したように、特に好ましい１つの実施形態において、本発明はＳＰＲを用いて種々のプロテアーゼ活性を網羅的に解析することが特に好ましい。ＳＰＲは金属に照射する偏光光束によってエバネッセント波が生じて表面ににじみだし、表面波である表面プラズモンを励起し、光のエネルギーを消費して反射光強度を低下させる。反射光強度が著しく低下する共鳴角は金属の表面に形成される層の厚みによって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。したがって、ＳＰＲはラベルが不要であり、しかもリアルタイム評価が可能な定量法として有用である。
【００１５】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１にその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００１６】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００１７】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００１８】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００１９】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。
【００２０】
光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２１】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。なかでもガラスが特に好ましい。
【００２２】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく、１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎＤは１．５以上であることが好ましい。
【００２３】
金属薄膜を構成する金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、これらを単独であるいは組み合わせて用いてもよいが、なかでも金を用いるのが特に好ましい。金属薄膜の形成方法は特に限定されるものではないが、公知の手法として例えば蒸着法、スパッタ法、イオンコーティング法などが挙げられる。なかでも蒸着による方法が好ましい。また、金属薄膜の厚みは１０〜３０００Å程度が好ましく、１００〜６００Å程度がより好ましい。
【００２４】
本発明の１つの特に好ましい具体例は、金属を蒸着した基板上にプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドが少なくとも１種、好ましくは複数種の蛋白質もしくはペプチドが固定化されてなるアレイを用い、且つ該アレイに細胞破砕液等のプロテアーゼを含有する溶液を作用させてそれらの相互作用の様子を特にＳＰＲないしはＳＰＲイメージング法により検出することを特徴とする。本発明においてプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドとは、該プロテアーゼにより加水分解反応を受ける性質を有する蛋白質もしくはペプチドをいうものである。
【００２５】
上記蛋白質もしくはペプチドの分子量は特に限定されないが、一般的には１００アミノ酸残基以下のペプチドが用いられる。好ましくは５〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２５アミノ酸残基程度からなるものが用いられる。ペプチドは公知の手法に基づく化学的な合成により得られたペプチドであってもよいし、あるいは遺伝子工学的な手法により生産された蛋白質もしくはペプチドを用いてもよい。また基質の基板への脱着を容易にするために、上記ペプチドの片末端において、ビオチンや、チオール基を有するシステイン残基を付加させたものや、あるいはオリゴヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような一般的によく用いられるタグを付加させた蛋白質やペプチドを用いるのも有用である。
【００２６】
上記蛋白質もしくはペプチドの金属薄膜への固定化の方法は、特に限定されるものではないが、金属薄膜表面に固定化しやすいような官能基を予め導入しておいて基質ペプチドを固定化処理するのがより好ましい。該官能基としては、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、アルデヒド基などが挙げられる。これらの官能基を金属薄膜表面に導入するには、一般的に用いられているアルカンチオールの誘導体を用いるのが好ましい。その際に、Ｊ．Ｍ．ＢｒｏｃｋｍａｎらによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． 第１２１巻、第８０４４〜８０５１頁（１９９９年）において報告されているような方法に基づいて、アルカンチオール層を介して固定化し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりバックグラウンドを修飾する方法を用いてもよい。また、非特異的な影響をより抑えるために、ＰＥＧの末端に上述のような官能基が導入された誘導体をアルカンチオールに結合させた後に、基質を固定化することも、スペーサー効果を奏する点で有用である。
【００２７】
具体的には、例えば金属薄膜にカルボキシメチルデキストランあるいはカルボキシル基で末端が修飾されたＰＥＧのような水溶性高分子を結合させて表面にカルボキシル基を導入して、ＥＤＣ（１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）のような水溶性カルボジイミドを用いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステルとして、活性化されたカルボキシル基にペプチドもしくは蛋白質のアミノ基を反応させる方法が挙げられる。あるいは表面をマレイミドにより修飾した後、システインのようなチオール基を含むアミノ酸残基を介して固定化してもよい。この場合のシステイン残基はペプチドの一方の末端に付加されてなるのが好ましい。非特異的な影響を低減させるには、後者のチオール基を介した固定化方法がより好ましいが、特に限定されるものではない。また、基質末端をビオチンにより修飾させた蛋白質もしくはペプチドを用いることも可能である。この場合、基質にアビジンもしくはストレプトアビジンを作用させて、チップ上の基質の分子量を増大させることにより、加水分解される様子をより明瞭にモニターすることができる。
【００２８】
上述したＨｉｓ−ｔａｇやＧＳＴのようなタグを付加した蛋白質もしくはペプチドを固定化する方法も非常に簡便で有用である。この場合には、上述のように金属表面にアルカンチオールを介してアミノ基やカルボキシル基を導入した後に、それぞれＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、グルタチオンを金属薄膜上に導入させておくのがよい。Ｈｉｓ−ｔａｇの場合は、ＮＴＡを導入したアレイを塩化ニッケルにより処理した後で基質を固定化する。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１：ＳＰＲアレイの作製（１）
まず、金を蒸着させたガラス板（大阪真空工業株式会社製ＬＡＫ−１０；サイズ：１８ｍｍ×１８ｍｍ×１ｍｍ、コート内容：１層目 クロム２０Å、２層目金４５０Å；屈折率１．７２）を、１ｍＭ ＭＯＡＭ（８−ａｍｉｎｏ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；同仁化学製）のエタノール溶液２０ｍｌ中に１．５時間浸漬して、金表面上にアミノ基を導入した。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄し、乾燥後、４ｍＭ ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（分子量２０００；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ製）溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む）に溶解した。）５００μｌを載せて室温で１．５時間静置させた。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄し、乾燥後、上記ガラス板の上にフォトマスクを載せて固定し、紫外線照射（ウシオ電機製Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｏｄｕｌｅｘ ＳＸ−ＵＩ５００Ｈを使用；５００ワット）を２時間行った。フォトマスクは一辺５００μｍの正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されているものを用いた。紫外線照射終了後エタノールによりガラス板を洗浄して、さらに１ｍＭ ＭＨＡ（７−ｃａｒｂｏｘｙ−１−ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ；同仁化学製）のエタノール溶液２０ｍｌ中に１．５時間浸漬して、アレイ表面にカルボキシル基を導入した。
【００３１】
上記の処理を施されたガラス板上に、０．２Ｍ ＥＤＣ／０．０５Ｍ ＮＨＳ溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む）に溶解した。）２００μｌを載せて室温で２時間静置させて、表面を活性化させた後、エタノール、水の順で洗浄して乾燥を行い、上記ガラス板上に形成されたフォトパターン上に１０ｎｌずつ基質溶液をスポットした。スポットに用いた基質は、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む）に溶解した。スポッティングに際してはニチリョー製ＤＮＡ−ＧＲを用いた。基質としては、抗ＫＯＤ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）、ヤギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；１００μｇ／ｍｌ）、配列表・配列番号１（ＰＫＡの基質となる。）及び配列番号２（カスパーゼ３の基質となる。）に示されるアミノ酸配列からなる合成ペプチド（いずれも１００μｇ／ｍｌ）を用いた。おのおのの基質の固定化パターンは図２に示した通りで行った。このように基質溶液がスポットされたガラス板をウェットな環境下において室温で１６時間静置して反応させた。こうしてプロテアーゼ基質が固定化されたアレイを調製した。
【００３２】
実施例２：ＳＰＲ解析（１）
実施例１において調製したペプチドアレイを水、エタノールで洗浄して乾燥後、ＳＰＲ装置（ＧＷＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．製ＳＰＲｉｍａｇｅｒ）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、ＰＢＳ（−）を用いた。ランニングバッファーの送液は、プランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いた。温度は３０℃に設定して行った。基質の加水分解反応においては、市販のトリプシン（ナカライテスク製）を用いた。上記ランニングバッファーにより２．５μｇ／ｍｌに調製した溶液を循環させながら反応を行った。この際におけるＳＰＲシグナルの経時変化の様子を図３に示した。抗ＫＯＤ抗体及びヤギＩｇＧに関しては、トリプシンの作用による分解反応が進行することによりチップ上における質量が徐々に減少するため、ＳＰＲシグナルも経時的に減少していく様子が確認されている。
【００３３】
図４に、上記結果に関してＳＰＲイメージングを行った結果を示した。実施例２におけるＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、トリプシン反応後４０００秒における時点で取り込まれた画像から、反応開始時点での画像を、画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。抗ＫＯＤ抗体及びヤギＩｇＧのスポットにおいて抗体が分解された様子が確認される。
【００３４】
実施例３：ＳＰＲアレイの作製（２）
まず、金を蒸着させたガラス板（大阪真空工業株式会社製ＬＡＫ−１０；サイズ：１８ｍｍ×１８ｍｍ×１ｍｍ、コート内容：１層目 クロム２０Å、２層目金４５０Å；屈折率１．７２）を、１ｍＭ濃度のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ（日本油脂製）のエタノール溶液２０ｍｌ中に２時間浸漬させた。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄し、乾燥後、上記ガラス板の上にフォトマスクを載せて固定し、実施例１の場合と同様に紫外線照射を２時間行った。フォトマスクは一辺５００μｍの正方形の穴が１６個有し（４個×４個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。紫外線照射終了後エタノールによりガラス板を洗浄して、さらに１ｍＭ ＭＯＡＭのエタノール溶液２０ｍｌ中に１．５時間浸漬して、アレイ表面にアミノ基を導入した。
【００３５】
上記の処理を施されたガラス板上に、１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量３４００；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ製）溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む）に溶解した。）２００μｌを載せて室温で２時間静置させることによりマレイミド表面を形成させた。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄して乾燥を行い、上記ガラス板上に形成されたフォトパターン上に０．１μｌずつ基質溶液をマニュアルでスポットした。スポットに用いた基質は、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む）に溶解した。基質としては、配列表・配列番号１（ＰＫＡの基質となる。）及び配列番号２（カスパーゼ３の基質となる。）に示されるアミノ酸配列からなる合成ペプチド（いずれも１００μｇ／ｍｌ）であり、いずれもこの配列の末端にビオチンで修飾されたものを用いた。図５に示すようなパターンで各々の基質をスポットした。基質溶液がスポットされたガラス板をウェットな環境下において室温で１６時間静置して反応させた。こうしてプロテアーゼ基質が固定化されたアレイを調製した。
【００３６】
実施例４：ＳＰＲ解析（２）
実施例３において調製したペプチドアレイを水、エタノールで洗浄して乾燥後、ＳＰＲ装置（ＧＷＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．製ＳＰＲｉｍａｇｅｒ）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を用いた。ランニングバッファーの送液は、実施例２の場合と同様のプランンジャーポンプを用いた。温度は３７℃に設定して行った。まず、ストレプトアビジン溶液（０．１μｇ／ｍｌ；上記ランニングバッファーにより調製）を送液することにより、基質に結合しているビオチンに作用させた。その後、カスパーゼ３として市販のＡｃｔｉｖｅ Ｃａｓｐａｓｅ３／ＣＰＰ３２（ＭＢＬ製）を用いて、上記ランニングバッファーにより１００倍に希釈したＣＰＰ３２溶液（約２０Ｕ／ｍｌ）を循環させながら加水分解反応を行った。この際におけるＳＰＲシグナルの経時変化の様子を図６に示した。カスパーゼ３基質においてのみ、ＣＰＰ３２の作用によるＳＰＲシグナルの低下が確認されている。
【００３７】
【発明の効果】
上述したように、本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテアーゼ動態の解析を行うことが可能となった。本発明を利用することにより、多種類のプロテアーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテアーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【００３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いられる表面プラズモン共鳴イメージング装置の一例を示す図である。
【図２】実施例１において、アレイ上に複数種の基質を固定化したパターンを示す図である。
【図３】実施例２において、ＳＰＲ解析を行った結果である。
【図４】実施例２において、ＳＰＲイメージングを行った結果である。
【図５】実施例３において、アレイ上に複数種の基質を固定化したパターンを示す図である。
【図６】実施例４において、ＳＰＲ解析を行った結果である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a comprehensive method for analyzing protease activity using an array in which one or more proteins or peptides serving as protease substrates are immobilized on a metal substrate. Particularly, by using an analysis technique based on surface plasmon resonance (hereinafter sometimes referred to as SPR), it is possible to realize a quick, efficient and simple analysis of protease activity. More specifically, a novel protease activity analysis method using a surface plasmon resonance imaging method (hereinafter, sometimes referred to as an SPR imaging method) that monitors the state of interaction between substances analyzed by SPR. is there.
[0002]
[Prior art]
Protease is a general term for enzymes that hydrolyze peptide bonds in proteins and peptides, and is widely present inside and outside cells of microorganisms, animals and plants. Numerous types of proteases have been reported, and have various physiological significance in vivo. Among them, caspase is an important enzyme in apoptosis signal transduction and one of important proteases.
[0003]
Apoptosis A concept proposed by Kerr et al., Which refers to cell death controlled by a gene to maintain the life of an individual. This plays an important role not only in morphogenesis and the establishment of a nervous system network in ontogeny, but also in cell turnover and maintenance of homeostasis by the endocrine system and establishment of the immune system in mature individuals. It is also closely related to the onset of cancer, autoimmune diseases, viral infections such as AIDS, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease. In the process of executing apoptosis, limited degradation of specific proteins (PARP, ICAD, Acinus, etc.) by caspase plays a central role (Biochem. J. 326: 1-16 (1997)). Many types of caspases have already been reported, and the mechanism for their activation is being elucidated. Establishing a technique for comprehensively analyzing the activity of these caspases is important in the fields of drug development and diagnosis.
[0004]
Protease activity is usually measured by a method such as quantifying the degradation of protein or peptide as a substrate by ultraviolet absorption, or quantifying the amount of a labeled substance released using a substrate labeled with a fluorescent substance or a radioactive substance. Has been done. However, such a method cannot at all respond to the high throughput demanded in recent years in fields such as proteomics research. As a protease assay system that can respond to high throughput, a method using surface plasmon resonance to detect the mass of an intact substrate versus the mass of a cleaved substrate has been disclosed (for example, Patent Documents). 1). However, this method is also a method in which an enzymatic reaction is performed in another reaction vessel in advance and then subjected to SPR measurement, and is not necessarily a method that can sufficiently cope with high throughput.
[0005]
[Patent Document 1]
Patent No. 2968848 [0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention seeks to establish a method capable of comprehensively profiling the kinetics of various proteases by a simple method that is quick and does not require any special technique.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in view of the above circumstances, and as a result, using an array in which a protein or peptide that recognizes a protease is immobilized on a metal-coated substrate, The present inventors have found that detecting an interaction by SPR is extremely useful for performing a rapid analysis of the kinetics of various proteases, and arrived at the present invention.
[0008]
That is, the present invention has the following configuration.
Item 1. An array in which a protein or peptide serving as a substrate of at least one protease is immobilized on a metal thin film on a substrate.
Item 2. Item 2. The array according to Item 1, wherein at least two types of proteins or peptides, each of which is a separate protease substrate, are immobilized on a metal thin film.
Item 3. Item 3. The array according to Item 1 or 2, wherein the protease is caspase.
Item 4. Item 4. The array according to any one of Items 1 to 3, wherein the peptide has a cysteine residue at one or both of the N-terminus and the C-terminus of the peptide.
Item 5. The array according to any one of claims 1 to 4, wherein the peptide is modified with biotin.
Item 6. Item 6. An array according to any one of Items 1 to 5, for analyzing protease activity using surface plasmon resonance.
Item 7. A method for analyzing protease activity, comprising detecting an immobilized peptide on the hydrolyzed array using surface plasmon resonance.
Item 8. Item 8. The method for analyzing protease activity according to Item 7, wherein the immobilized peptide is detected on the hydrolyzed array by surface plasmon resonance imaging.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically.
The method for detecting a protein or peptide degraded on the substrate in the present invention can be performed by using a labeling compound such as a radioactive substance, a fluorescent substance, and a chemiluminescent substance which are well known in the art. It is. However, it is more preferable to apply an optical detection method such as surface plasmon resonance (SPR), ellipsometry (hereinafter, referred to as ellipsometry), and sum frequency generation (hereinafter, referred to as SFG) spectrometry. Above all, SPR is particularly preferable because it is not necessary to obtain a phase difference, and it is possible to obtain a change in film thickness on the order of nm on the surface only by obtaining reflected light intensity. Further, the SPR imaging method is more preferable because observation over a wide range is possible and substance interaction observation in an array format is possible.
[0010]
The protein or peptide can be hydrolyzed by applying a test sample which may have a protease to the array of the present invention. For example, a test sample which may have a protease in a suitable buffer is added, and at a temperature of about 10 to 40 ° C, preferably at a temperature of 30 to 37 ° C, for about 10 minutes to 6 hours, preferably 30 to 2 hours. By reacting to a certain degree, the peptide can be hydrolyzed. If necessary, substances such as salts and sugars may coexist in the hydrolysis reaction solution. Various proteases such as trypsin, elastase, pepsin, chymotrypsin, plasmin, renin, urokinase, cathepsin, and caspase are exemplified as the target of kinetic profiling, but are not particularly limited.
[0011]
In the present invention, since the purpose of the protein or peptide is to comprehensively profile the kinetics of various proteases, one kind of protein or peptide is hydrolyzed only by one kind of protease and hydrolyzed by another kind of protease. Preferably not. For example, the caspase 3 substrate is exemplified by the peptide of SEQ ID NO: 2. The peptide sequence serving as a substrate for the protease containing caspase 3 is known or can be appropriately selected based on the known sequence. If the array of the present invention immobilizes peptides of a type corresponding to a plurality of types of proteases whose kinetics need to be grasped, it is preferable because a single array can perform profiling of various types of proteases. Of course, a peptide corresponding to only one protease may be immobilized on one array, and protease profiling may be performed using a required number of arrays.
[0012]
Ellipsometry irradiates a sample with light, and can measure a film thickness and a refractive index from a change in a deflection state caused by interference between light reflected on the front surface of the thin film and light reflected on the back surface of the thin film. That is, it is a means for evaluating the ratio of the absolute value of the reflectance and the ratio of the phase change to the p-polarized light and the s-polarized light. Above all, spectroscopic ellipsometry, in which ellipsometry is measured while changing the wavelength, is preferable because a change in film thickness on the surface can be detected very sensitively.
[0013]
SFG is a kind of second-order nonlinear optical effect, and is a phenomenon in which two types of incident light (frequency ω1 and frequency ω2) having different frequencies are mixed in a medium to generate light of ω1 + ω2 or ω1-ω2. In particular, when visible light is used as ω1 and variable wavelength infrared light is used as ω2, vibrational spectroscopy similar to infrared spectroscopy can be performed. Since this method has good surface selectivity, vibration spectroscopy of molecules at the monomolecular film level is possible, and is useful as a very sensitive surface analysis method.
[0014]
As described above, in one particularly preferred embodiment, it is particularly preferred that the present invention comprehensively analyze various protease activities using SPR. In the SPR, an evanescent wave is generated by a polarized light beam irradiated on a metal, and oozes on the surface, excites surface plasmons, which are surface waves, and consumes light energy to reduce the intensity of reflected light. The resonance angle at which the intensity of the reflected light is significantly reduced depends on the thickness of the layer formed on the surface of the metal. Therefore, the substance or substance aggregate to be examined is immobilized on the metal surface, and the interaction with the substance or substance aggregate in the sample is detected by the change in the resonance angle or the change in the reflected light intensity at a certain angle. It is possible. Therefore, SPR does not require a label and is useful as a quantitative method capable of real-time evaluation.
[0015]
The SPR imaging method using this SPR is a method of irradiating a polarized light beam over a wide area and analyzing the reflected image to monitor the state of interaction between substances by making full use of image processing technology and the like. In addition, it is possible to screen a chip on which a plurality of substances are immobilized, and to observe the morphology of an object adsorbed on the surface with high sensitivity. In the SPR imaging method, a means for irradiating a chip with a polarized light beam over a wide area in order to analyze a reflected image and ensuring sufficient illuminance of the light beam is required. FIG. 1 shows an example. It is more preferable that the illuminance of the polarized light beam is higher because the sensitivity of the sensor increases.
[0016]
Although the type of the light source is not particularly limited, it is preferable to use light including near-infrared light whose change in the SPR resonance angle is particularly sensitive. Specifically, a white light source that can irradiate light over a wide range, such as a metal halide lamp, a mercury lamp, a xenon lamp, a halogen lamp, a fluorescent lamp, and an incandescent lamp, can be used. A halogen lamp which is sufficiently high, has a simple light power supply device and is inexpensive is particularly preferable.
[0017]
An ordinary white light source has a drawback in that light and darkness unevenness occurs in a filament portion. When the light from the light source is irradiated as it is, unevenness in brightness and darkness occurs in an image obtained by reflection, making it difficult to evaluate screening and morphological changes. Therefore, as a means for uniformly irradiating the chip with light, a method of passing light through a pinhole and then converting the light into parallel light is preferable. The means for passing through the pinhole is preferable as a means for obtaining a light beam having a uniform brightness, but there is a disadvantage that the illuminance is reduced if the light passes through the pinhole as it is. Therefore, as a means for securing sufficient illuminance, it is preferable to use a method in which a convex lens is provided between the pinhole and the light source, and light is collected and passed through the pinhole.
[0018]
Since the white light source is emitted light, it is necessary to use a convex lens to convert the white light into parallel light before focusing. By installing a light source near the focal length of the convex lens, parallel light can be obtained. By installing another convex lens and installing a pinhole near the focal length of the lens, it is possible to pass the condensed light through the pinhole. The light crossing and passing through the pinhole is converted into parallel light by a CCTV lens for a camera, and the cross-sectional area of the parallel light flux obtained at that time is preferably adjusted to 10 to 1000 mm 2 . This method enables a wide range of screening and morphology observation.
[0019]
When monitoring the interaction, the polarized light beam is irradiated on the opposite surface of the metal thin film on which the substance or the aggregate of the substance is immobilized. The polarized light beam is applied to the opposite surface of the metal thin film on which the substance or the aggregate of the substance is immobilized, and the reflected light beam is obtained. The light beam reflected from the metal thin film passes through a near-infrared wavelength light interference filter, passes only light near a certain wavelength, and is photographed by a CCD camera. The center wavelength of the optical interference filter is preferably from 600 to 1000 nm, at which the sensitivity of SPR is high. The wavelength width of the wavelength at which the transmittance of the optical interference filter is half of the maximum value is called the half-value width. The smaller the half-value width is, the sharper the wavelength distribution becomes, and more specifically, the more preferable is the half-value width of 100 nm or less.
[0020]
An image captured by a CCD camera through an optical interference filter is captured by a computer, and a change in brightness of a certain portion can be evaluated in real time, and an entire image can be evaluated by image processing. In this way, it is possible to screen a chip on which a plurality of substances are immobilized, and to observe the morphology of an object adsorbed on the surface with high sensitivity.
[0021]
The SPR chip used in the present invention is preferably formed of a metal substrate having a metal thin film formed on a transparent substrate, and directly or indirectly, chemically or physically, forming a substance or substance on the metal thin film. A slide on which the aggregate is fixed is used. The material of the substrate is not particularly limited, but it is preferable to use a transparent material. Specific examples include glass and plastics such as polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, and acrylic. Of these, glass is particularly preferred.
[0022]
The thickness of the substrate is preferably about 0.1 to 20 mm, more preferably about 1 to 2 mm. In order to achieve the purpose of evaluating the reflection image from the metal thin film, the SPR resonance angle should be as small as possible, so that the captured image does not have a risk of shaking and the analysis is easy. Accordingly, the refractive index n D of the prism in contact therewith and the transparent substrate or the transparent substrate is preferably 1.5 or more.
[0023]
Examples of the metal constituting the metal thin film include gold, silver, copper, aluminum, and platinum. These may be used alone or in combination, but among them gold is particularly preferable. The method for forming the metal thin film is not particularly limited, but known methods include, for example, an evaporation method, a sputtering method, and an ion coating method. Above all, a method by vapor deposition is preferable. Further, the thickness of the metal thin film is preferably about 10 to 3000 °, more preferably about 100 to 600 °.
[0024]
One particularly preferred embodiment of the present invention uses an array in which at least one, preferably a plurality of proteins or peptides serving as protease substrates are immobilized on a metal-deposited substrate, and A solution containing a protease such as a cell lysate is allowed to act on the array, and the state of the interaction is detected by SPR or SPR imaging. In the present invention, the protein or peptide serving as a substrate for a protease refers to a protein or peptide having a property of undergoing a hydrolysis reaction by the protease.
[0025]
The molecular weight of the protein or peptide is not particularly limited, but a peptide having 100 amino acid residues or less is generally used. Preferably, those having about 5 to 60 amino acid residues, more preferably about 10 to 25 amino acid residues are used. The peptide may be a peptide obtained by chemical synthesis based on a known technique, or a protein or peptide produced by a genetic engineering technique may be used. In order to facilitate the desorption of the substrate from the substrate, biotin or a cysteine residue having a thiol group is added to one end of the peptide, or oligohistidine (His-tag), glutathione-S It is also useful to use a protein or peptide to which a commonly used tag such as transferase (GST) is added.
[0026]
The method of immobilizing the protein or peptide on the metal thin film is not particularly limited, but a functional group that can be easily immobilized on the surface of the metal thin film is introduced in advance and the substrate peptide is immobilized. Is more preferred. Examples of the functional group include an amino group, a mercapto group, a carboxyl group, and an aldehyde group. In order to introduce these functional groups into the surface of the metal thin film, it is preferable to use a generally used alkanethiol derivative. At that time, J.I. M. Brockman et al. Am. Chem. Soc. Vol. 121, pp. 8044-8051 (1999), a method of immobilizing via an alkanethiol layer and modifying the background with PEG (polyethylene glycol) can also be used. Good. In order to further suppress non-specific effects, immobilizing the substrate after binding a derivative having the above-described functional group introduced to the end of PEG to alkanethiol also exerts a spacer effect. Useful in
[0027]
Specifically, for example, a metal thin film is bonded to a water-soluble polymer such as carboxymethyl dextran or PEG whose terminal is modified with a carboxyl group to introduce a carboxyl group to the surface, and EDC (1-ethyl-3, As a ester of NHS (N-hydroxysuccinimide) using a water-soluble carbodiimide such as 4-dimethylaminopropylcarbodiimide), a method of reacting an activated carboxyl group with an amino group of a peptide or protein can be mentioned. Alternatively, after the surface is modified with maleimide, it may be immobilized via an amino acid residue containing a thiol group such as cysteine. In this case, the cysteine residue is preferably added to one end of the peptide. In order to reduce non-specific effects, the latter method of immobilization via a thiol group is more preferable, but is not particularly limited. It is also possible to use proteins or peptides whose substrate ends have been modified with biotin. In this case, the state of hydrolysis can be more clearly monitored by allowing avidin or streptavidin to act on the substrate to increase the molecular weight of the substrate on the chip.
[0028]
A method for immobilizing a protein or peptide to which a tag such as His-tag or GST described above is added is also very simple and useful. In this case, after introducing an amino group or a carboxyl group into the metal surface via the alkanethiol as described above, it is preferable to introduce NTA (nitrilotriacetic acid) and glutathione onto the metal thin film, respectively. In the case of His-tag, the array in which NTA is introduced is treated with nickel chloride, and then the substrate is immobilized.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not particularly limited to the examples.
[0030]
Example 1: Fabrication of SPR array (1)
First, a glass plate on which gold was deposited (LAK-10 manufactured by Osaka Vacuum Industry Co., Ltd .; size: 18 mm × 18 mm × 1 mm, coat content: first layer of chromium 20Å, second layer of gold 450Å; refractive index 1.72) The substrate was immersed in a 20 ml ethanol solution of 1 mM MOAM (8-amino-1-octanethiol, hydrochloride; Dojindo Chemical) for 1.5 hours to introduce an amino group on the gold surface. This glass plate was washed with ethanol and water in this order, dried, and then dissolved in 4 mM mPEG-SPA (molecular weight: 2,000; manufactured by Shearwater) solution (pH 7.4, 10 mM phosphate buffer (containing 100 mM NaCl)) (500 μl). And allowed to stand at room temperature for 1.5 hours. This glass plate was washed with ethanol and water in that order, dried, and then fixed with a photomask placed on the glass plate, and irradiated with ultraviolet light (using an Optical Module SX-UI500H manufactured by Ushio Inc .; 500 watts) for 2 hours. went. The photomask used was a photomask having 96 square holes of 500 μm on a side (consisting of 8 × 12 patterns) and a pitch between centers of holes of 1 mm. After the irradiation with ultraviolet rays, the glass plate was washed with ethanol, and further immersed in 20 ml of an ethanol solution of 1 mM MHA (7-carboxy-1-heptanethiol; Dojin Chemical) for 1.5 hours to introduce carboxyl groups on the array surface. did.
[0031]
200 μl of a 0.2 M EDC / 0.05 M NHS solution (dissolved in a 10 mM phosphate buffer (containing 100 mM NaCl) at pH 7.4) was placed on the glass plate subjected to the above treatment, and placed at room temperature for 2 hours. After leaving it to stand for a while to activate the surface, it was washed and dried in the order of ethanol and water, and a 10 nl substrate solution was spotted on the photopattern formed on the glass plate. The substrate used for the spot was dissolved in 10 mM phosphate buffer (containing 100 mM NaCl) at pH 7.4. For spotting, DNA-GR manufactured by Nichiryo was used. Substrates include anti-KOD antibody (1 mg / ml), goat IgG (1 mg / ml), bovine serum albumin (BSA; 100 μg / ml), Sequence Listing and SEQ ID NO: 1 (which is a PKA substrate) and SEQ ID NO: 2. (A substrate for caspase 3 was used.) A synthetic peptide having the amino acid sequence shown in Table 1 (in each case, 100 µg / ml) was used. The immobilization pattern of each substrate was as shown in FIG. The glass plate on which the substrate solution had been spotted was allowed to react at room temperature for 16 hours in a wet environment. Thus, an array having the protease substrate immobilized thereon was prepared.
[0032]
Example 2: SPR analysis (1)
The peptide array prepared in Example 1 was washed with water and ethanol, dried and then set on an SPR device (SPRIimager manufactured by GWC Instruments Inc.) for analysis. PBS (-) was used as the running buffer. A running buffer was supplied using a plunger pump (Model-021 manufactured by From). The temperature was set at 30 ° C. In the hydrolysis reaction of the substrate, commercially available trypsin (manufactured by Nacalai Tesque) was used. The reaction was carried out while circulating a solution adjusted to 2.5 μg / ml with the running buffer. FIG. 3 shows how the SPR signal changes with time at this time. As for the anti-KOD antibody and goat IgG, it has been confirmed that the mass on the chip gradually decreases due to the progress of the decomposition reaction by the action of trypsin, and thus the SPR signal also decreases over time.
[0033]
FIG. 4 shows the result of performing SPR imaging on the above result. At the time of SPR analysis in Example 2, an image was captured by a CCD camera every 5 seconds, and an image at a reaction start time was converted from an image captured at 4000 seconds after the trypsin reaction by Scion Image processing software. This is a result of performing a subtraction process using (Scion Corp.). The appearance of the degradation of the antibody in the spots of the anti-KOD antibody and the goat IgG is confirmed.
[0034]
Example 3: Production of SPR array (2)
First, a gold-deposited glass plate (LAK-10 manufactured by Osaka Vacuum Industry Co., Ltd .; size: 18 mm × 18 mm × 1 mm, coating content: first layer of chromium 20Å, second layer of gold 450Å; refractive index 1.72) The sample was immersed in a 20 mM ethanol solution of SUNBRIGHT MASH-50H (manufactured by NOF Corporation) at a concentration of 1 mM for 2 hours. This glass plate was washed with ethanol and water in this order, dried, and then fixed by placing a photomask on the glass plate, and irradiated with ultraviolet light for 2 hours as in Example 1. The photomask has 16 square holes of 500 μm on a side (consisting of 4 × 4 patterns), and the pitch between the centers of the holes is designed to be 1 mm. After completion of the ultraviolet irradiation, the glass plate was washed with ethanol, and further immersed in 20 ml of a 1 mM MOAM ethanol solution for 1.5 hours to introduce amino groups on the array surface.
[0035]
The solution was dissolved in a 10 mg / ml NHS-PEG-MAL (molecular weight: 3400; manufactured by Shearwater) solution (pH 7.4, 10 mM phosphate buffer (containing 100 mM NaCl)) on the glass plate treated as described above. ) 200 μl was placed and allowed to stand at room temperature for 2 hours to form a maleimide surface. This glass plate was washed and dried in the order of ethanol and water, and the substrate solution was manually spotted on the photo pattern formed on the glass plate in 0.1 μl portions. The substrate used for the spot was dissolved in 10 mM phosphate buffer (containing 100 mM NaCl) at pH 7.4. The substrate is a synthetic peptide (100 μg / ml) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (which is a substrate for PKA) and SEQ ID NO: 2 (which is a substrate for caspase 3). In each case, the sequence modified with biotin at the end was used. Each substrate was spotted in a pattern as shown in FIG. The glass plate on which the substrate solution had been spotted was allowed to stand and react at room temperature for 16 hours in a wet environment. Thus, an array having the protease substrate immobilized thereon was prepared.
[0036]
Example 4: SPR analysis (2)
The peptide array prepared in Example 3 was washed with water and ethanol, dried, and then set on an SPR device (SPRIimager manufactured by GWC Instruments Inc.) for analysis. As a running buffer, a 50 mM HEPES buffer (pH 7.4; containing 150 mM NaCl) was used. For feeding the running buffer, the same plunger pump as in Example 2 was used. The temperature was set at 37 ° C. First, a streptavidin solution (0.1 μg / ml; prepared with the above running buffer) was fed to act on biotin bound to the substrate. Thereafter, a hydrolysis reaction was performed using a commercially available Active Caspase 3 / CPP32 (manufactured by MBL) as caspase 3, while circulating a CPP32 solution (about 20 U / ml) diluted 100-fold with the running buffer. FIG. 6 shows how the SPR signal changes with time at this time. Only in the caspase 3 substrate, a decrease in the SPR signal due to the action of CPP32 has been confirmed.
[0037]
【The invention's effect】
As described above, according to the method of the present invention, no special technique is required, and particularly when SPR is used, there is no need to use a label such as a fluorescent substance or a radioactive substance, which is very simple and rapid. It became possible to analyze various protease kinetics. By utilizing the present invention, a wide variety of protease signals can be analyzed comprehensively, and the kinetics of intracellular protease kinetics associated with introduction of a gene whose function is unknown or drug administration can be effectively performed. . This is expected to be applied to genomic drug discovery, such as functional analysis from new genes and approaches to drug discovery.
[0038]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an example of a surface plasmon resonance imaging apparatus used in the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a pattern in which a plurality of types of substrates are immobilized on an array in Example 1.
FIG. 3 shows the result of performing SPR analysis in Example 2.
FIG. 4 shows the result of performing SPR imaging in Example 2.
FIG. 5 is a diagram showing a pattern in which a plurality of types of substrates are immobilized on an array in Example 3.
FIG. 6 shows the result of performing SPR analysis in Example 4.
