JP2006521821A - バイオマーカーとしての表面受容体複合体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞表面膜受容体の二量体を含む、患者試料中の新しい種類のバイオマーカーを対象とする。一態様では、本発明は、患者試料、特に固定組織試料において直接測定した1種またはそれ以上の細胞表面膜受容体二量体の量と、疾患状態または健康状態を相関させることによって、そのような状態の状況を判定する方法を含む。他の態様では、本発明は、検体の細胞における1種またはそれ以上の細胞表面膜受容体二量体の量の測定値を、前癌状態の有無、癌性状態の有無、癌の予後、または治療に対する応答性を含めた癌の状態と相関させることによって、個人由来の検体において癌の状態を判定する方法を含む。好ましくは、1種またはそれ以上の種類の受容体二量体の複数の成分に特異的である遊離可能な分子タグを有する結合性化合物のセットを使用することによって、本発明の方法を実施する。結合後、分子タグを遊離させ、アッセイ混合物からそれを分離して分析する。
Description
本発明は、全体としてはバイオマーカーに関し、より詳細には、バイオマーカーとしての、細胞表面受容体複合体(二量体やオリゴマーなど)の使用に関する。
バイオマーカーは、通常の生物学的プロセス、発病プロセス、または治療的介入に対する薬理学的反応の指標として、客観的に測定され評価される特性である、Atkinsonら、Clin. Pharmacol. Ther.、69:89−95(2001)。バイオマーカーは、性質、測定の容易性、および対象とする生理学的状態との相関性の点で大いに異なる。例えば、Frankら、Nature Reviews Drug Discovery、2:566−580(2003)。有効な新規バイオマーカーの開発は、健康管理および薬剤開発のコストを著しく減少させ、多様な疾患および病的状態の治療も著しく改善させることになると広く考えられている。そこで、新しい技術を用いて新しい種類のバイオマーカーを発見することに多大な努力が向けられてきた。例えば、Petricoinら、Nature Reviews Drug Discovery、1:683−695(2002);Sidransky、Nature Reviews Cancer、2:210−219(2002)。
細胞表面膜成分の相互作用は、正常な生理条件および疾患条件下で細胞外シグナルを細胞に伝達する際に重要な役割を果たす。具体的には、細胞外事象またはシグナルを、例えばリガンドと受容体の結合を、増殖、遺伝子発現の増加または減少などの細胞応答へと変換することと関連して、多くの種類の細胞表面受容体が二量体化、オリゴマー化、またはクラスター化する。例えば、Georgeら、Nature Reviews Drug Discovery、1:808−820(2002);Melladoら、Ann. Rev. Immunol.、19:397−421(2001);Schlessinger、Cell、103:211−225(2000);Yarden、Eur. J. Cancer、37:S3−S8(2001)。癌などの疾患におけるこのようなシグナル伝達事象の役割は活発な研究の対象であり、それによっていくつかの新しい薬剤および薬剤候補が開発されてきている。例えば、HerbstおよびShin、Cancer、94:1593−1611(2002);YardenおよびSliwkowski、Nature Reviews Molecular Cell Biology、2:127−137(2001);McCormick、Trends in Cell Biology、9:53−56(1999);Blume−JensenおよびHunter、Nature、411:355−365(2001)。
個々の細胞表面受容体の発現レベルは、バイオマーカーとして成功裏に使用されてきた。例えばSlamonら、米国特許第4,968,603号(Her2発現)。しかし、個々の受容体発現レベル単独は、常に疾患状態または病態の信頼性のある指標というわけではない。例えば、Chowら、Clin. Cancer Res.、7:1957−1962(2001)(EGFRまたはHer1発現)。受容体の二量体形成が、細胞のおよび疾患のプロセスに重要な役割を果たすにも関わらず、受容体二量体の発現はバイオマーカーとして使用されてこなかった。これは部分的には、現在の測定技術では不便であり感度不足であること、およびそのような技術を用いて、ホルマリン固定されている可能性がある、かつ/または分析用には量が少なすぎる可能性がある患者試料について測定を実施することが不可能であるかまたは実用的でないことに起因する。例えば、Priceら、Methods in Molecular Biology、218:255−267(2003);Stagljar、Science STKE 2003、pe56(2003);Kollら、国際特許公開WO2004/008099;Golemis編、Protein-Protein Interactions(Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、2002);Sorkinら、Curr. Biol.、10:1395−1398(2000);McVeyら、J. Biol. Chem.、17:14092−14099(2001);Salimら、J. Biol. Chem.、277:15482−15485(2002);Angersら、Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.、42:409−435(2002);Szollosiら、Reviews in Molecular Biotechnology、82:251−266(2002);Matkoら、Meth. in Enzymol.、278:444−462(1997);Reed−Gitomer、米国特許第5,192,660号。
上記の観点から、シグナル伝達などの重要な細胞内プロセスと関係する細胞表面受容体二量体または複合体の有無、および/またはプロファイルもしくは比率に基づく、患者試料における新しい種類のバイオマーカーが使用できれば、診断、予後診断、患者の層別、および薬剤開発のための新しいツールが提供されることによって、医学の分野が進歩するはずである。
発明の要旨
本発明は、凍結や固定などの従来の手順によって保存された試料を始めとする、患者の細胞または組織試料の細胞表面膜中の受容体複合体を含む新しい種類のバイオマーカーを対象とする。一態様では、本発明は、個体由来の細胞または組織試料中の細胞表面膜中の1種またはそれ以上の受容体複合体の量と、疾患状態または健康状態を相関させることによってそのような状態の状況を判定する方法を含む。他の態様では、本発明は、検体中の1種またはそれ以上の表面受容体複合体の量の測定値を、癌の状態と相関させることによって個体由来の検体において癌の状態を判定する方法を含む。本発明はさらに、例えば癌治療において、薬剤応答性二量体の数および種類を、効力と、または患者が応答する可能性と関連付けることにより、二量体作用性薬剤の有効性を予測する方法を提供する。
本発明は、凍結や固定などの従来の手順によって保存された試料を始めとする、患者の細胞または組織試料の細胞表面膜中の受容体複合体を含む新しい種類のバイオマーカーを対象とする。一態様では、本発明は、個体由来の細胞または組織試料中の細胞表面膜中の1種またはそれ以上の受容体複合体の量と、疾患状態または健康状態を相関させることによってそのような状態の状況を判定する方法を含む。他の態様では、本発明は、検体中の1種またはそれ以上の表面受容体複合体の量の測定値を、癌の状態と相関させることによって個体由来の検体において癌の状態を判定する方法を含む。本発明はさらに、例えば癌治療において、薬剤応答性二量体の数および種類を、効力と、または患者が応答する可能性と関連付けることにより、二量体作用性薬剤の有効性を予測する方法を提供する。
一態様では、本発明は、以下のステップにより、1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体の異常な発現を特徴とする疾患に罹患した患者の疾患状態を判定することを可能にする:(i)患者試料中の1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体のそれぞれの量を測定するステップ;(ii)そのような量のそれぞれを参照試料中のその対応する量と比較するステップ;および(iii)患者試料からの量と参照試料からのそれぞれの対応する量との差を、患者の疾患状態と相関させるステップ。患者試料は、固定されていてもよく、凍結されていてもよい。しかし患者試料は従来のプロトコルを用いて固定されていることが好ましい。
他の特定の態様では、本発明は、患者試料、特に固定試料に関する測定値から、異常な線維化状態を治療するための二量体作用性薬剤の有効性、または該薬剤に対する患者の応答性を予測する方法を提供し、ここで、その二量体作用性薬剤は、以下に限らないが、1種またはそれ以上のPDGFRαホモ二量体、PDGFRβホモ二量体、PDGFRα−PDGFRβヘテロ二量体、PDGFR−SHC、PDGFR−PI3K、Her1−PDGFR受容体二量体、Her2−PDGFR受容体二量体、Her3−PDGFR受容体二量体、およびPDGFR−IGF−1R受容体二量体を始めとする、PDGF受容体複合体に作用する。他の実施形態では、そのようなPDGF受容体複合体は、PDGFRαホモ二量体、PDGFRβホモ二量体、およびPDGFRα−PDGFRβヘテロ二量体からなる群から選択される。
他の特定の態様では、本発明は、患者試料、特に固定試料に関する測定値から、特に固形腫瘍における異常な血管新生を治療するための二量体作用性薬剤の有効性、または該薬剤に対する患者の応答性を予測する方法を提供し、ここで、その二量体作用性薬剤は、以下に限らないが、1種またはそれ以上のVEGFR1ホモ二量体、VEGFR2ホモ二量体、VEGFR1−VEGFR2ヘテロ二量体、VEGFR2−VEGFR3ヘテロ二量体、VEGFR2−SHC複合体、およびVEGFR3−SHC複合体を始めとするVEGF受容体複合体に作用する。
他の態様では、本発明は、癌患者の細胞または組織試料において、1種またはそれ以上の細胞表面膜受容体二量体の量、あるいは複数の細胞表面膜受容体二量体の相対量を測定することにより、患者における癌の状態を判定する方法を提供する。一実施形態では、本明細書において試薬対と呼ばれる、各二量体の異なる構成要素に対して特異的な少なくとも2種の試薬を用いてそのような二量体を測定する。その一方の試薬は、本明細書において切断性プローブと呼ばれ、そのすぐ近接した範囲内にある感受性結合を切断するように誘導されうる切断誘導部分を有し、他方の試薬は、本明細書において結合性化合物と呼ばれ、切断誘導部分により切断可能な結合によって結合された1種またはそれ以上の分子タグを有する。その実施形態では、そのような異なる構成要素が二量体を形成すればいつでも、切断可能な結合が、切断誘導部分が有効に切断する近接範囲内に入り、分子タグが遊離する。次いで、その遊離した分子タグを反応混合物から分離し、それを定量することにより、二量体化を測定することになる。
本発明の他の態様では、患者試料中の受容体二量体をレシオメトリーで測定する。すなわち、二量体の量を、それが二量体の形で存在しようと単量体の形で存在しようと、二量体中に存在する一方の構成成分の総量の測定値に対する、二量体の他方の構成成分の測定値の比として得る。一実施形態では、通常の測定値には、特定の分子タグと相関する電気泳動図中のピークのピーク高またはピークのピーク面積が含まれる。
この態様の特定の実施形態では、本発明は、患者の固定組織試料において、複数のHer受容体二量体の量を同時に測定することにより、患者における癌の状態を判定する方法を提供する。各二量体の異なる構成要素に対して特異的な少なくとも2種の試薬を用いてそのような二量体を測定することができる。その一方の試薬は、本明細書において切断性プローブと呼ばれ、そのすぐ近接した範囲内にある感受性結合を切断するように誘導されうる切断誘導部分を有し、他方の試薬は、本明細書において結合性化合物と呼ばれ、切断誘導部分により切断可能な結合によって結合された1種またはそれ以上の分子タグを有する。その実施形態では、Her受容体が二量体を形成すればいつでも、結合性化合物の切断可能な結合が、切断誘導部分が有効に切断する近接範囲内に入り、分子タグが遊離する。次いで、その分子タグを反応混合物から分離し、それを定量することにより、Her受容体二量体集団を測定することになる。この態様の他の実施形態では、複数のHer受容体二量体の相対量を測定し、それを患者における癌の状態と関連付ける。癌の例としては、以下には限らないが、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌がある。
本発明は、患者試料中の受容体複合体の量の測定値を含む新しい種類のバイオマーカーを提供する。具体的には、受容体複合体集団のプロファイルは、患者の疾患状態と相関し、またある実施形態では、予後、二量体作用性薬剤の効力、および治療に対する患者の応答可能性と相関しうる。本発明によれば、コストおよび労力、ならびに最終的なアッセイ読取り値へのノイズ源および潜在的なアーチファクトの導入を増加させる、細胞または組織試料の培養、あるいは異種移植などの他の方法でのその処理を必要とせずに、患者試料において受容体複合体の直接の測定を可能にすることにより、当技術分野の欠点が克服される。本発明はまた、細胞内受容体リン酸化の代替測定、または試料調製の手順の中で除去することが容易である他の修飾をも提供する。そのような代替測定は、その形成について上記の修飾に依存し、試料調製の手順による影響が少ない、PI3KやSHC受容体複合体などの複合体の測定に基づくものである。
定義
「抗体」とは、他の分子の特定の空間的な極性構造と特異的に結合し、それによってそれと相補的であると定義されるイムノグロブリンを意味する。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、宿主の免疫化および血清(ポリクローナル抗体)の収集などの当技術分野で周知の技術により調製することができ、あるいは連続したハイブリッド細胞系統を調製しその分泌タンパク質(モノクローナル抗体)を収集することにより、または天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはその突然変異誘発型をクローン化し発現させることにより、調製することができる。抗体は、完全なイムノグロブリンまたはその断片を含みうるが、そのイムノグロブリンには、IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgMなど様々な種類およびアイソタイプが含まれる。その断片としては、Fab、Fv、F(ab’)2、Fab’などが挙げられうる。さらに、特定のポリペプチドに対する結合親和性が維持されている限り、適当であればイムノグロブリンまたはその断片の凝集物、ポリマー、および結合物を使用することができる。(下記に記載の)遊離可能な分子タグを使用するイムノアッセイをはじめとするイムノアッセイに使用する抗体の作製および選択における手引きは、容易に入手可能な教科書およびマニュアル書、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1988);HowardおよびBethell、Basic Methods in Antibody Production and Characterization(CRC Press、2001);Wild編、The Immunoassay Handbook(Stockton Press、New York、1994)などに見出すことができる。
「抗体」とは、他の分子の特定の空間的な極性構造と特異的に結合し、それによってそれと相補的であると定義されるイムノグロブリンを意味する。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、宿主の免疫化および血清(ポリクローナル抗体)の収集などの当技術分野で周知の技術により調製することができ、あるいは連続したハイブリッド細胞系統を調製しその分泌タンパク質(モノクローナル抗体)を収集することにより、または天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはその突然変異誘発型をクローン化し発現させることにより、調製することができる。抗体は、完全なイムノグロブリンまたはその断片を含みうるが、そのイムノグロブリンには、IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgMなど様々な種類およびアイソタイプが含まれる。その断片としては、Fab、Fv、F(ab’)2、Fab’などが挙げられうる。さらに、特定のポリペプチドに対する結合親和性が維持されている限り、適当であればイムノグロブリンまたはその断片の凝集物、ポリマー、および結合物を使用することができる。(下記に記載の)遊離可能な分子タグを使用するイムノアッセイをはじめとするイムノアッセイに使用する抗体の作製および選択における手引きは、容易に入手可能な教科書およびマニュアル書、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1988);HowardおよびBethell、Basic Methods in Antibody Production and Characterization(CRC Press、2001);Wild編、The Immunoassay Handbook(Stockton Press、New York、1994)などに見出すことができる。
「抗体結合性組成物」とは、1種またはそれ以上の抗体あるいはその断片を含み、その結合特異性がそのような抗体または抗体断片に由来する分子または分子の複合体を意味する。抗体結合性組成物としては、以下には限らないが、(i)第1の抗体が標的分子と特異的に結合し、第2の抗体が第1の抗体の定常領域と特異的に結合するような抗体の対;分子タグや光増感剤などの成分で誘導体化されるストレプトアビジンタンパク質および標的分子に、ビオチン成分を介して特異的に結合するビオチン化抗体;(ii)標的分子に特異的であり、デキストランなどのポリマーと結合した抗体であって、次に分子タグや光増感剤などの成分により共有結合で直接的にまたはストレプトアビジン−ビオチン結合を介して間接的に、誘導体化される抗体;(iii)標的分子に特異的であり、ビーズ、またはマイクロビーズ、または他の固相支持体と結合した抗体であって、次に分子タグや光増感剤などの成分または後者を含むポリマーで直接的にまたは間接的に誘導体化される抗体が挙げられる。
「抗原決定基」または「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する分子(通常はタンパク質)の表面上の部位を意味する。一般にタンパク質はいくつかのまたは多数の異なる抗原決定基を有し、多数の異なる特異性を有する抗体と反応する。好ましい抗原決定基は、タンパク質のリン酸化部位である。
「結合性部分」とは、分子タグが直接的にまたは間接的に結合することができる任意の分子を意味し、それは分析物と特異的に結合することができる。結合性部分としては、以下には限らないが、抗体、抗体結合性組成物、ペプチド、タンパク質、核酸、ならびに分子量が最大1000ダルトンであり、水素、炭素、酸素、窒素、硫黄、およびリンからなる群から選択される原子からなる有機分子が挙げられる。好ましくは、結合性部分は抗体または抗体結合性組成物である。
「癌」および「癌性」とは、無秩序な細胞増殖を典型的な特徴とする哺乳動物における生理的状態を指しまたは言及するものである。癌の例としては、以下には限らないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病がある。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、および様々なタイプの頭頸部癌がある。
本明細書において「複合体」とは、互いに直接的にまたは間接的に接触している分子の集合物または凝集物を意味する。一態様では、分子の複合体に関して、あるいは特異性または特異的結合に関して、「接触」、またはより具体的には「直接的接触」とは、2つ以上の分子が、ファンデルワールス力、水素結合、イオン性および疎水性相互作用などのような引力性の非共有結合性相互作用がその分子の相互作用の中心となるほど十分近くにあることを意味する。このような態様では、分子の複合体は、アッセイ条件下ではその成分分子の非凝集または非複合体化状態よりも複合体が熱力学的に好ましいという点で安定である。本明細書において、「複合体」とは、通常、2つ以上のタンパク質の安定な凝集物を指し、同等に「タンパク質−タンパク質複合体」とも呼ばれる。最も典型的には、「複合体」とは2つのタンパク質の安定な凝集物を指す。
細胞表面膜受容体に関して「二量体」とは、同じものでもよく異なるものでもよい2つ以上の膜結合受容体タンパク質の複合体を意味する。同一の受容体の二量体を「ホモ二量体」と呼び、異なる受容体の二量体を「ヘテロ二量体」と呼ぶ。二量体は通常、互いに接触した2つの受容体からなる。二量体は、細胞表面膜において、「複合体」の定義において上記に記載したファンデルワールス相互作用などの受動的プロセスにより生成されることもあり、あるいは、リガンド誘導性二量体化、共有結合、細胞内成分との相互作用などの能動的なプロセスにより生成されることもある。例えば、Schlessinger、Cell、103:211−225(2000)。本明細書において、「二量体」という用語は、その内容から異なるように理解されない限りは、「細胞表面膜受容体二量体」を指すと理解される。
「疾患状態」としては、以下には限らないが、次の特徴が挙げられる:罹患可能性、疾患の有無、疾患の重症度についての予後、および受容体複合体を介して作用する特定の治療薬による治療に患者が応答する可能性。癌に関して、「疾患状態」はさらに、前癌性または癌性の細胞もしくは組織の検出、1種またはそれ以上の受容体二量体などの1種またはそれ以上の受容体複合体を介して作用する治療薬による治療に応答すると思われる患者の選択、およびそのような治療薬を用いた治療の改善効果を含む。一態様では、Her受容体複合体に関連して疾患状態とは、癌患者が、Her二量体作用性薬剤による治療に応答する可能性を意味する。好ましくは、そのような癌患者は、乳癌または卵巣癌患者であり、そのようなHer二量体作用性薬剤には、Omnitarg(商標)(2C4)、ハーセプチン(Herceptin)、ZD−1839(イレッサ(Iressa))、およびOSI−774(タルセバ(Tarceva))が含まれる。別の態様では、PDGFR受容体複合体に関連する疾患状態とは、不適切な線維化を特徴とする疾患に罹患した患者がPDGFR二量体作用性薬剤による治療に応答する可能性を意味する。好ましくは、そのような疾患としては癌、および腎臓の繊維化が挙げられる。別の態様では、VEGF受容体複合体に関連する疾患状態とは、固形腫瘍などの不適切な血管新生を特徴とする疾患に罹患した患者がVEGF二量体作用性薬剤による治療に応答する可能性を意味する。
「ErbB受容体」または「Her受容体」とは、ErbB受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、これには、EGFR(「Her1」)、ErbB2(「Her2」)、ErbB3(「Her3」)、およびErbB4(「Her4」)受容体が含まれる。一般に、ErbB受容体は、ErbBリガンドと結合することができる細胞外ドメイン;親油性膜貫通ドメイン;保存されている細胞内チロシンキナーゼドメイン;およびリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。ErbB受容体は、天然配列のErbB受容体でもよく、あるいはそのアミノ酸配列変異体でもよい。好ましくは、ErbB受容体は、天然配列のヒトErbB受容体である。一態様では、ErbB受容体は、以下には限らないが、Chuら、Biochem. J.、324:855−861(1997);Xiaら、Oncogene、23:646−653(2004)などに開示されているEGFRvIIIおよびp95Her2を含む、末端切断型Her受容体を含む。
「ErbB1」、「上皮成長因子受容体」、「EGFR」および「Her1」という用語は、本明細書において同義的に使用され、例えば、Carpenterら、Ann. Rev. Biochem.56:881−914(1987)に開示されているような天然配列のEGFR(その変異体(例えば、Humphreyら、PNAS(USA)87:4207−4211(1990)にある欠失変異体EGFR)を含む)を指す。erbB1は、EGFRタンパク質産物をコードする遺伝子を指す。EGFRと結合する抗体の例には、MAb579(ATCC CRL RB 8506)、MAb455(ATCC CRL HB8507)、MAb225(ATCC CRL 8508)、MAb528(ATCC CRL 8509)(Mendelsohnら、米国特許第4,943,533号を参照)、および、キメラ化225(C225)や再形成ヒト225(H225)(Imclone Systems Inc.のWO96/40210を参照)などのそれらの変異体が含まれる。
「Her2」、「ErbB2」、「c−Erb−B2」は、同義的に使用される。特に示さない限り、本明細書において使用されるとき、「ErbB2」、「c−Erb−B2」および「Her2」という用語は、ヒトタンパク質を指す。ヒトErbB2遺伝子およびErbB2タンパク質は、例えば、Sembaら、PNAS(USA)82:6497−650(1985)およびYamamotoら、Nature、319:230−234(1986)(Genebank受託番号X03363)に記載されている。Her2と特異的に結合する抗体の例は、米国特許第5,677,171号;第5,772,997号;Fendlyら、Cancer Res. 50:1550−1558(1990)などに開示されている。
「ErbB3」および「Her3」は、例えば、米国特許第5,183,884号および第5,480,968号、ならびにKrausら、PNAS(USA)86:9193−9197(1989)に開示されている受容体ポリペプチド(それらの変異体を含む)を指す。Her3と結合する抗体の例は、米国特許第5,968,511号に記載されており、例えば、8B8抗体(ATCC HB 12070)がある。
本明細書において「ErbB4」および「Her4」という用語は、例えば、EP特許出願第599,274号;Plowmanら、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA、90:1746−1750(1993);およびPlowmanら、Nature、366:473−475(1993)に開示されている受容体ポリペプチド(WO99/19488に開示されているHer4アイソフォームなどのそれらの変異体を含む)を指す。
「インスリン様成長因子−1受容体」または「IGF−1R」とは、Ullrichら、EMBO J.、5:2503−2512(1986)またはSteele−Perkinsら、J. Biol. Chem.、263:11486−11492(1988)に開示されているものと実質的に同一のヒト受容体チロシンキナーゼを意味する。
ポリペプチドまたはタンパク質に関して「単離された」とは、その自然環境の成分から実質的に分離されたことを意味する。好ましくは、単離ポリペプチドまたはタンパク質は、その自然環境の成分と比べて、重量ベースで少なくとも80%の、配列によって同定されたポリペプチドまたはタンパク質からなる組成物であり;より好ましくは、そのような組成物は、その自然環境の成分と比べて、重量ベースで少なくとも95%の、配列によって同定されたポリペプチドまたはタンパク質からなり;さらにより好ましくは、そのような組成物は、その自然環境の成分と比べて、重量ベースで少なくとも99%の、配列によって同定されたポリペプチドまたはタンパク質からなる。最も好ましくは、単離ポリペプチドまたはタンパク質は、分子量および等電点に基づく二次元ゲル電気泳動による従来の分離法を行った後、単一スポットとして分離されうる均一な組成物である。従来の二次元ゲル電気泳動によるこのような分析のプロトコルは、当業者に周知である。例えば、HamesおよびRickwood編、Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach(IRL Press、Oxford、1981);Scopes、Protein Purification(Springer−Verlag、New York、1982);Rabilloud編、Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods(Springer−Verlag、Berlin、2000)。
「キット」とは、本発明の方法を実施するための物質または試薬を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイとの関係では、このような送達システムには、ある場所から他の場所への、反応試薬(例えば、適当な容器中のプローブ、酵素など)および/または補助物(例えば、バッファー、アッセイを行うための説明書など)の貯蔵、輸送または送達を可能にするシステムが含まれる。例えば、キットには、関連する反応試薬および/または補助物を含む1種またはそれ以上の筐体(例えば、箱)が含まれる。そのような内容物を意図した受容者に一緒に送達することもでき、あるいは別々に送達することもできる。例えば、第1の容器が、アッセイに使用する酵素を含み、第2の容器がプローブを含んでもよい。
参照配列と他の配列(すなわち、「候補」配列)の比較に関して使用する、「%同一」またはそれと類似の用語は、2つの配列間の最適なアラインメントにおいて、記載した百分率に対応する数のサブユニットの位置で候補配列が参照配列と同一であること(そのサブユニットは、ポリヌクレオチドの比較ではヌクレオチドであり、ポリペプチドの比較ではアミノ酸である)を意味する。本明細書において、比較する配列の「最適なアラインメント」とは、サブユニット間の一致が最大となり、アラインメントを構築する際に使用するギャップの数が最少となるものである。同一性%は、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、48:443−453(1970)に記載されている市販のアルゴリズムの実行により決定することができる(ウィスコンシン配列解析パッケージ(Wisconsin Sequence Analysis Package)の「GAP」プログラム、Genetics Computer Group、Madison、WI)。アラインメントを構築し、同一性%または類似性の他の指標を算出するための、当技術分野における他のソフトウェアパッケージは、SmithおよびWaterman、Advances in Applied Mathematics、2:482−489(1981)のアルゴリズムに基づく「BestFit」プログラム(ウィスコンシン配列解析パッケージ、Genetics Computer Group、Madison、WI)を含む。言い換えれば、例えば、参照アミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列中の最大5%のアミノ酸残基を欠失させまたは他のアミノ酸で置換することもでき、あるいは、参照配列における総アミノ酸残基の最大5%の数のアミノ酸を参照配列中に挿入することもできる。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端の位置で、あるいはそれらの末端位置の間の任意の場所で生じてもよく、参照配列内の残基の間に個々に、あるいは参照配列内に1種またはそれ以上の連続した群として散在してもよい。本発明の参照配列との比較を行う際に、候補配列は、より大きなポリペプチドまたはポリヌクレオチドの成分またはセグメントでもよく、同一性%を算出する目的でのそのような比較は、関連する成分またはセグメントについて実施すべきであることが理解される。
「ホスファチジルイノシトール3キナーゼタンパク質」、または同じものとして「PI3Kタンパク質」とは、NCBI受託番号NP 852664、NP 852556、およびNP 852665で示されるヒトタンパク質セットのヒト細胞内タンパク質、ならびにそれと実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
「血小板由来成長因子受容体」または「PDGFR」とは、Heldinら、Physiological Reviews、79:1283−1316(1999)に記載のPDGFRαまたはPDGFRβ、あるいはそれらの変異体と実質的に同一のヒト受容体チロシンキナーゼタンパク質を意味する。一態様では、本発明は、以下の群:PDGFRαホモ二量体、PDGFRβホモ二量体、およびPDGFRα−PDGFRβヘテロ二量体、のうちの1種またはそれ以上の二量体を測定することにより、癌の状態、前癌状態、線維化または硬化状態を判定することを含む。具体的には、線維化状態には、肺または腎の線維症が含まれ、硬化状態には、アテローム性動脈硬化症が含まれる。癌には、以下には限らないが、乳癌、結腸直腸癌、膠芽腫、卵巣癌が含まれる。「PDGFR」単独の指すものは、「PDGFRα」または「PDGFRβ」を意味すると理解される。
「ポリペプチド」は、一方のアミノ酸のカルボキシル基と他方のアミノ酸のアミノ基との間の水が脱離したアミド結合によって互いに化学的に結合したアミノ酸残基からなる化合物種を指す。ポリペプチドはアミノ酸残基のポリマーであり、そのような残基を多数含みうる。ペプチドは、一般により少数のアミノ酸からなること以外はポリペプチドと同様である。ペプチドは、ときにオリゴペプチドと呼ばれる。ポリペプチドとペプチドの間に明確な区別は存在しない。便宜上、本開示および請求項では、「ポリペプチド」という用語は、ペプチドおよびポリペプチドを一般的に指すように使用される。アミノ酸残基は、天然のものでもよく、合成のものでもよい。
「タンパク質」とは、生体細胞によって通常合成され、折り畳まれて所定の三次元構造をとるポリペプチドを指す。タンパク質は、一般に分子量約5,000〜約5,000,000以上であり、より一般には分子量約5,000〜約1,000,000であり、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋形成、環化、ジスルフィド結合形成、ファルネシル化、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミネートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、糖鎖付加、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化やユビキチン化などの翻訳後修飾を含むことがある。例えば、Post-translational Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、Academic Press、New York、1983中のWold,F、Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects、pgs.1−12。例示の目的であって限定するものではないが、タンパク質としては、サイトカインまたはインターロイキン、例えばキナーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼなどの酵素、プロタミン、ヒストン、アルブミン、イムノグロブリン、硬タンパク質、リンタンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、T細胞受容体、プロテオグリカンなどが挙げられる。
「参照試料」とは、正常または非疾患状態を示す1種またはそれ以上の細胞、異種移植片、または組織試料を意味し、ここで、患者試料の測定値をそれと比較して、受容体複合体がその患者試料中に過剰に存在するのか、または減少した量で存在するのかを決定する。参照試料の性質は、特定のアッセイの設計上選択すべき問題であり、患者自身の正常組織または健常者集団の組織から導き出してもよく、それから決定してもよい。参照試料における受容体複合体の量に関連する値は、試験する患者試料に対応する値として、本質的に同一の実験条件下で得ることが好ましい。参照試料は、患者試料と同じ種類の組織由来でもよく異なる組織タイプ由来でもよく、参照試料を得る集団は、年齢、性、人種などの患者の特徴と一致する特徴について選択することができる。通常、本発明のアッセイでは、患者試料での受容体複合体の量を、予め集計した参照試料の対応する値と比較し、そして平均範囲、平均値および標準偏差、または同様の指標として提供する。
「受容体複合体」とは、少なくとも1つの細胞表面膜受容体を含む複合体を意味する。受容体複合体には、細胞表面膜受容体の二量体、あるいは様々なシグナル伝達経路で連結を形成するアダプタータンパク質などの1種またはそれ以上の細胞内タンパク質が含まれうる。受容体複合体の一部であってもよい細胞内タンパク質の例としては、以下には限らないが、PI3Kタンパク質、Grb2タンパク質、Grb7タンパク質、Shcタンパク質、およびSosタンパク質、Srcタンパク質、Cblタンパク質、PLCγタンパク質、Shp2タンパク質、GAPタンパク質、Nckタンパク質、Vavタンパク質、およびCrkタンパク質が挙げられる。一態様では、受容体複合体はPI3KまたはShcタンパク質を含む。
「受容体チロシンキナーゼ」または「RTK」とは、細胞内キナーゼ活性を有し、Schlessinger、Cell、103:211−225(2000)ならびにBlume−JensenおよびHunter(上記で引用)に記載のRTKファミリーのタンパク質から選択されるヒト受容体タンパク質を意味する。「受容体チロシンキナーゼ二量体」とは、2つの受容体チロシンキナーゼタンパク質を含む、細胞表面膜中の複合体を意味する。いくつかの態様では、受容体チロシンキナーゼ二量体は、2つの共有結合した受容体チロシンキナーゼタンパク質を含んでもよい。例示的なRTK二量体を表Iに示す。特定の対象となるRTK二量体は、Her受容体二量体およびVEGFR二量体である。
「試料」または「組織試料」または「患者試料」または「患者の細胞または組織試料」または「検体」とは、被験体または患者の組織から得られた類似の細胞の収集物をそれぞれ意味する。組織試料の供給源は、新鮮な、凍結されたおよび/または保存された臓器あるいは組織試料あるいは生検試料または吸引試料由来の固形組織;血液または任意の血液成分;脳脊髄液、羊水、腹水や間質液などの体液;妊娠または被験体の発生における任意の時期の細胞でもよい。組織試料は、保存剤、抗凝固剤、バッファー、固定液、栄養素、抗生剤などの、天然には組織と本来混ざることのない化合物を含んでもよい。本発明の一態様では、組織試料または患者試料を固定し、具体的には、従来法で試料をホルマリン固定しパラフィン包埋する。そのような試料は通常、受容体複合体のアッセイで、顕微鏡用スライドまたは同等の表面上に載せた、固定組織からの例えば厚さ3〜10μmのスライス片の形で使用される。またそのような試料には、通常、従来の再水和処置を施し、そして場合によっては、アッセイ測定の一部または準備段階として抗原回復法を施す。
分子タグの分離に関して、「分離プロファイル」とは、保持時間、質量などの、分子タグに関連したパラメーターに対するシグナル強度データの表、グラフ、曲線、棒グラフ、または他の表示を意味し、それは、アッセイ中に生成するそれぞれの型の分子タグの数の読取値すなわち測定値を与える。分離プロファイルは、使用する分離技術に応じて、電気泳動図、クロマトグラム、電気クロマトグラム、質量スペクトログラム、または同様のデータグラフ表示でありうる。分離プロファイルに関して「ピーク」または「バンド」または「ゾーン」とは、分離した化合物が濃縮された領域を意味する。例えば、異なる分子タグが別々の発光スペクトルを有する異なる蛍光標識を有し、複数の波長でデータを収集し記録する場合、単一のアッセイで複数の分離プロファイルが存在しうる。一態様では、遊離した分子タグは、電気泳動での移動度の違いによって分離されて電気泳動図を形成し、その図では異なる分子タグが電気泳動図上の別々のピークに対応する。電気泳動図で隣り合ったピークが別々のものであること、すなわち重複していないことの指標は、「電気泳動分解能」であり、これは、隣り合ったピークの最高値の間の距離を、それらピークの2つの標準偏差のうちの大きい方の4倍で割った値として表すことができる。好ましくは、隣り合ったピークが示す分解能は、少なくとも1.0であり、より好ましくは少なくとも1.5であり、最も好ましくは少なくとも2.0である。所与の分離および検出系では、そのメンバー同士が少なくともピークが分離される量(peak−resolving amount)だけ異なる電気泳動移動度を有する複数の分子タグを、選択することにより、所望の分解能を得ることができる。そのような量は、シグナル検出系、蛍光成分の性質、タグの拡散係数、ふるいマトリックス(sieving matrix)の有無、電気泳動装置の性質、例えばチャネルの有無、分離チャネルの長さなどを含む、当業者に周知である複数の要因に依存する。電気泳動図を分析して、データ中の特徴を、Williamsら、米国特許出願公開公報2003/0170734A1に開示されているような分析プログラムを用いて、分子タグの有無または量と関連付けることができる。
「SHC」(「Src相同性2/α−コラーゲン関連」を意味する)とは、Pelicciら、Cell、70:93−104(1992)に記載のものと実質的に同一の、RTKシグナル伝達経路におけるアダプタータンパク質のファミリー(66、52、および46キロダルトン)のうちの任意のものを意味する。一態様では、SHCはヒトのそのようなアダプタータンパク質を意味する。
「シグナリング経路」または「シグナル伝達経路」とは、通常、細胞表面受容体と細胞外リガンドとの相互作用から始まるか、または一連の分子の相互作用を引き起こす細胞表面受容体のリン酸化部位への細胞内分子の結合から始まる一連の分子事象を意味し、それにおいては、その一連の分子相互作用により、結果として細胞の核での遺伝子発現が調節される。「Ras−MAPK経路」とは、Ras−GTP複合体の形成に続いてMAPKタンパク質がリン酸化されることを含むシグナル伝達経路を意味する。「PI3K−Akt経路」とは、PI3Kタンパク質によってAktタンパク質のリン酸化を含むシグナル伝達経路を意味する。
結合性化合物やプローブなどの一方の分子と他方の分子の結合に関して、標的の分析物または複合体に対する「特異的」または「特異性」とは、プローブが標的を認識し、それと接触し、それとの間で安定した複合体を形成するとともに、プローブが実質的に他の分子を認識せず、それと接触せずそれと複合体を形成しないことを意味する。一態様では、第1の分子と第2の分子の結合に関して「特異的」とは、反応物または試料中で第1の分子が他の分子を認識しそれと複合体を形成することができる範囲で、第1の分子が第2の分子と最大数の複合体を形成することを意味する。一態様では、この最大数とは、第1の分子によって形成されるそのような複合体すべての少なくとも50%である。一般に、特異的な結合事象に関与する分子は、その表面上にまたは空洞中に、互いに結合する分子間の特異的認識を生じさせる領域を有する。特異的結合の例には、抗体と抗原の相互作用、酵素と基質の相互作用、ポリヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド間の二重鎖または三重鎖形成、受容体とリガンドの相互作用などがある。
複数の蛍光標識に関して「スペクトル分離可能」とは、そのそれぞれの標識が結合した分子タグを、標準的な光検出システム、例えば、米国特許第4,230,558号;4,811,218号などまたはFlow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis(Academic Press、New York、1985)中のWheelessら、21−76ページに記載のシステムによって例示される帯域フィルターおよび光電子倍増管のシステムなどを使用することにより、それぞれの標識によって発生した蛍光シグナルに基づいて識別することができる程度に、それらの標識の蛍光発光バンドが十分に区別され、すなわち十分に非重複であることを意味する。
比較する関連タンパク質のファミリー内のタンパク質またはそのタンパク質のアミノ酸配列に関して「実質的に同一」とは、一のタンパク質が他のタンパク質に対して少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を有するか、一のタンパク質が他のタンパク質と同じ遺伝子のアイソフォームまたはスプライス変異体であることを意味する。一態様では、実質的に同一とは、一のタンパク質またはそのアミノ酸配列が、他のタンパク質またはそのアミノ酸配列と少なくとも80%同一であることを意味する。
本明細書で用いる「VEGF受容体」または「VEGFR」とは、血管上皮成長因子(VEGF)に対する細胞性受容体、通常は血管上皮細胞上に認められる細胞表面受容体、ならびにヒトVEGFへの結合能を保持するそれらの変異体を言う。VEGF受容体としては、VEGFR1(Flt1としても知られる)、VEGFR2(Flk1またはKDRとしても知られる)、およびVEGFR3(Flt4としても知られる)が挙げられる。これらの受容体については、DeVriesら、Science、255:989(1992);Shibuyaら、Oncogene、5:519(1990);Matthewsら、Proc. Nat. Acad. Sci.、88:9026(1991);Termanら,Oncogene、6:1677(1991);Termanら,Biochefra. Biophys. Res. Conzinuiz.、187:1579(1992)に記載されている。VEGF受容体の二量体については、Shibuya、Cell Structure and Function,、26:25−35(2001)、およびFerraraら、Nature Medicine,、9:669−676(2003)に記載されている。一態様では、本発明は異常な血管新生、または異常な血管新生を特徴とする疾患を、以下の群:VEGFR1ホモ二量体、VEGFR2ホモ二量体、VEGFR1−VEGFR2ヘテロ二量体、およびVEGFR2−VEGFR3ヘテロ二量体、のうちの1種またはそれ以上の二量体を測定することによって評価することを含む。
発明の詳細な説明
本発明は、生物、特にヒトにおける疾患の状態または他の生理的状態のバイオマーカーとして、細胞表面受容体複合体を使用する方法を提供する。一態様では、受容体複合体を患者試料から直接測定する。すなわち、余分な労力および費用を必要とし、測定プロセス中にアーチファクトおよびノイズを導入する可能性がある培養、異種移植形成、または同様の技術を行わずに、測定を行う。本発明の特定の態様では、1種またはそれ以上の受容体複合体の測定を、凍結患者試料の組織溶解液、または固定患者試料の切片について直接行う。好ましい実施形態では、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料の切片において1種またはそれ以上の受容体複合体を測定する。
本発明は、生物、特にヒトにおける疾患の状態または他の生理的状態のバイオマーカーとして、細胞表面受容体複合体を使用する方法を提供する。一態様では、受容体複合体を患者試料から直接測定する。すなわち、余分な労力および費用を必要とし、測定プロセス中にアーチファクトおよびノイズを導入する可能性がある培養、異種移植形成、または同様の技術を行わずに、測定を行う。本発明の特定の態様では、1種またはそれ以上の受容体複合体の測定を、凍結患者試料の組織溶解液、または固定患者試料の切片について直接行う。好ましい実施形態では、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料の切片において1種またはそれ以上の受容体複合体を測定する。
他の態様では、本発明は、受容体リン酸化の間接的な測定法であって、複合体形成に対するそのような翻訳後修飾に依存した複合体の測定による方法、を提供する。
一態様では、受容体二量体などの複数の受容体複合体を、同じアッセイ反応混合物中で同時に測定する。好ましくは、遊離可能なように結合した1種またはそれ以上の分子タグを有する結合性化合物を用いて、複合体中のタンパクとの結合後に、その分子タグが遊離し、また反応混合物またはアッセイ混合物から分離するようにして検出および/または定量することにより、そのような複合体を測定する。
一態様では、本発明は、患者の疾患状態を判定する方法を提供し、その方法は以下のステップを含む:患者試料中の1種またはそれ以上の受容体二量体のそれぞれの量を測定するステップ;そのような量のそれぞれを、参照試料に由来するその対応する量と比較するステップ;および患者試料からの量と参照試料からのそれぞれの対応する量との差を、患者の疾患状態の存在または重症度と相関させるステップ。好ましい実施形態では、測定するステップは、(i)各結合性化合物が、切断可能な結合によってそれぞれ結合された1種またはそれ以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物と結合した1種またはそれ以上の分子タグが、分離した際に異なる結合性化合物由来の分子タグが分離プロファイルにおいて別々のピークを形成するような異なる分離特性を有するように、1種またはそれ以上の受容体二量体のそれぞれのタンパク質に特異的な1種またはそれ以上の結合性化合物を用意するステップ;(ii)結合性化合物がそのそれぞれの受容体二量体と特異的に結合して検出可能な複合体を形成するように、結合性化合物と1種またはそれ以上の複合体を混合するステップ;(iii)検出可能な複合体を形成している各結合性化合物の切断可能な結合を切断するステップ;および(iv)遊離した分子タグを分離し同定して、1種またはそれ以上の受容体二量体の有無または量を決定するステップを含む。
他の態様では、1種またはそれ以上の種類の受容体二量体の量を測定するステップは、以下のステップを含む:(i)1種またはそれ以上の受容体二量体のそれぞれについて、有効な近接範囲をもつ切断誘導部分を有する、1種またはそれ以上の受容体二量体のそれぞれにおける第1の受容体に特異的な切断性プローブを用意するステップ;(ii)各結合性化合物が、切断可能な結合によってそれぞれ結合された1種またはそれ以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物と結合した1種またはそれ以上の分子タグが、分離した際に異なる結合性化合物由来の分子タグが分離プロファイルにおいて別々のピークを形成するような異なる分離特性を有するように、1種またはそれ以上の受容体二量体のそれぞれの第2の受容体に特異的な1種またはそれ以上の結合性化合物を用意するステップ;(iii)切断性プローブ、結合性化合物、および1種またはそれ以上の受容体二量体を混合して、それにより切断性プローブが、受容体二量体の第1の受容体と特異的に結合し、結合性化合物が受容体二量体の第2の受容体と特異的に結合し、結合性化合物の切断可能な結合が、切断性プローブの切断誘導部分の有効な近接範囲内に入り、その結果として分子タグが遊離されるようにするステップ;および(iv)遊離した分子タグを分離および同定して、1種またはそれ以上の受容体二量体の有無または量を決定するステップ。好ましくは、受容体二量体ならびに第1のおよび第2の受容体は、表Iに示した受容体二量体から選択される。
本発明の他の態様では、対象とする微量の細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含む生物検体を患者から得る。次いで、他の試料成分を実質的に除去することができるように、血液細胞と異なるかまたは血液細胞上で認められない、微量の細胞上の抗原(本明細書において「捕獲抗原」と呼ぶ)と特異的に反応する生体特異的リガンドと結合した磁性粒子と生物検体とを混合することによって、試料を調製する。対象とする微量の細胞(検体中に存在する場合)を含む磁性粒子で標識した細胞を分離するのに有効である磁場を、試料にかける。次いで、バイオマーカーに特異的な結合性部分と結合した分子タグを用いて、そのように単離した細胞集団を分析し、微量の細胞の存在および/または数を決定する。好ましい実施形態では、この方法で使用する磁性粒子は、コロイド磁性ナノ粒子である。好ましくは、このような微量の細胞集団は循環系上皮細胞であり、これは、例えば、Hayesら、International J. of Oncology、21:1111−1117(2002);Soriaら、Clinical Cancer Research、5:971−975(1999);Adyら、British J. Cancer、90:443−448(2004)(これらを参照により組み込む)に開示されているような上皮特異的捕獲抗原を用いて、患者血液から単離することができる。具体的には、モノクローナル抗体BerEP4(Dynal A.S.、Oslo、Norway)を使用して、磁性粒子でヒト上皮細胞を捕獲することができる。
他の態様では、本発明は、患者の癌の状態を判定する方法を提供し、その方法は以下のステップを含む:(i)患者血液の試料を、それぞれが捕獲抗原に特異的であり、かつ磁性粒子と結合している1種またはそれ以上の抗体組成物と接触させることにより、循環系上皮細胞を含む患者試料を免疫磁気的に単離するステップ;(ii)患者試料中の1種またはそれ以上の受容体複合体のそれぞれの量を測定し;そのような量のそれぞれを、参照試料に由来するその対応する量と比較し;患者試料からの量と参照試料からのそれぞれの対応する量との差を、患者の癌の状態の存在または重症度と相関させるステップ。好ましい実施形態では、測定するステップは、(i)各結合性化合物が、切断可能な結合によってそれぞれ結合された1種またはそれ以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物と結合した1種またはそれ以上の分子タグが、分離した際に異なる結合性化合物由来の分子タグが分離プロファイルにおいて別々のピークを形成するような異なる分離特性を有するように、1種またはそれ以上の受容体複合体のそれぞれのタンパク質に特異的な1種またはそれ以上の結合性化合物を用意するステップ;(ii)結合性化合物と1種またはそれ以上の受容体複合体を混合して、結合性化合物が1種またはそれ以上の受容体複合体のそれぞれのタンパク質と特異的に結合して検出可能な複合体を形成するようにするステップ;(iii)検出可能な複合体を形成している各結合性化合物の切断可能な結合を切断するステップ;および(iv)遊離した分子タグを分離および同定して、1種またはそれ以上の受容体複合体の有無または量を決定するステップを含む。
他の態様では、1種またはそれ以上の受容体複合体の量を測定するステップは、以下のステップを含む:(i)1種またはそれ以上の受容体複合体のそれぞれについて、有効な近接範囲をもつ切断誘導部分をそれぞれ有する、1種またはそれ以上の受容体複合体のそれぞれにおける第1のタンパク質に特異的な切断性プローブを用意するステップ;(ii)各結合性化合物が、切断可能な結合によってそれぞれ結合された1種またはそれ以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物と結合した1種またはそれ以上の分子タグが、分離した際に異なる結合性化合物由来の分子タグが分離プロファイルにおいて別々のピークを形成するような異なる分離特性を有するように、1種またはそれ以上の受容体複合体のそれぞれの第2のタンパク質に対して特異的な1種またはそれ以上の結合性化合物を用意するステップ;(iii)切断性プローブ、結合性化合物、および1種またはそれ以上の複合体を混合して、それにより切断性プローブが受容体複合体の第1のタンパク質と特異的に結合し、結合性化合物が受容体複合体の第2のタンパク質と特異的に結合し、結合性化合物の切断可能な結合が、切断性プローブの切断誘導部分の有効な近接範囲内に入り、その結果として分子タグが遊離するようにするステップ;および(iv)遊離した分子タグを分離および同定して、1種またはそれ以上の受容体複合体の有無または量を決定するステップ。
使用されている、または開発中である多数の薬剤の作用機序は、成分受容体の二量体構造への会合、または例えばキナーゼ活性や自己リン酸化などの酵素活性のような二量体化に依存する機能などの、受容体二量体の1種またはそれ以上の機能の抑制を必要とする。そのような薬剤は、本明細書において「二量体作用性」薬剤と呼ばれる。治療を受けているかまたは治療が検討されている患者の細胞における受容体二量体の数、種類、構成、および/または解離は、特定の二量体作用性薬剤の使用の有効性または適合性に影響を及ぼす。以下の受容体二量体は、記載した薬剤に関係するバイオマーカーである。一態様では、本発明は、疾患状態に対する二量体作用性薬剤の効果をモニターするためのバイオマーカーを提供する。
以下の参照文献は、表IIに示す二量体作用性薬剤について記載しているものである:Traxler、Expert Opin. Ther. Targets、7:215−234(2002);Baselga編、Oncology Biotherapeutics、2:1−36(2002);Namら、Current Drug Targets、4:159−179(2003);Seymour、Current Drug Targets、2:117−133(2001)など。
試料の調製
分子複合体を含む試料は、受容体複合体集団を疾患状態または健康状態と関連付けるために本発明で使用する多様な供給源(細胞培養物、動物または植物の組織、患者生検試料などを含む)に由来するものでありうる。好ましくは、試料はヒト患者試料である。従来技術を用いて本発明のアッセイ用に試料を調製するが、その技術は、試料を得た供給源に依存して決まるであろう。
分子複合体を含む試料は、受容体複合体集団を疾患状態または健康状態と関連付けるために本発明で使用する多様な供給源(細胞培養物、動物または植物の組織、患者生検試料などを含む)に由来するものでありうる。好ましくは、試料はヒト患者試料である。従来技術を用いて本発明のアッセイ用に試料を調製するが、その技術は、試料を得た供給源に依存して決まるであろう。
A.固形組織試料 生検試料および医学検体については、以下の参照文献:Bancroft JD & Stevens A.編、Theory and Practice of Histological Techniques(Churchill Livingstone、Edinburgh、1977);Pearse、Histochemistry. Theory and applied.、第4版(Churchill Livingstone、Edinburgh、1980)において手引きが与えられている。
癌性疾患状態の領域で、使用することができる患者組織試料の例には、以下には限らないが、***、前立腺、卵巣、大腸、肺、子宮内膜、胃、唾液腺または膵臓がある。外科的切除、吸引または生検を含むがそれらに限られない様々な手段によって、組織試料を得ることができる。組織は、新鮮なものでもよく、凍結したものでもよい。一実施形態では、固定されパラフィンなどに包埋された組織試料について本発明のアッセイを実施する。したがって、このような実施形態では、脱パラフィン処理のステップを実施する。従来の方法[例えば、「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」、第3版、(1960)Lee G.Luna、HT(ASCP)編、The Blakston Division McGraw−Hill Book Company、New York;The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Mikel編、Armed Forces Institute of Pathology、American Registry of Pathology、Washington,D.Cを参照]によって、組織試料を固定する(すなわち保存する)ことができる。固定液の選択は、どの組織を組織学的に染色するかまたはそれ以外で分析するかという目的によって決まることは、当業者なら理解するであろう。固定の長さは、組織試料のサイズおよび使用する固定液に依存することも、当業者なら理解するであろう。一例として、中性緩衝化ホルマリン、ブアン液またはパラホルムアルデヒドを使用して組織試料を固定することができる。
一般に、組織試料をまず固定し、次いで漸増アルコール系列を通して脱水し、組織試料を切片化できるように、それにパラフィンまたは他の切片化媒体を浸透させ、包埋する。あるいは、組織を切片化し、得られた切片を固定してもよい。一例として、従来の方法(例えば、上記の「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」を参照)によって、組織試料をパラフィン中に包埋し処理することができる。使用することができるパラフィンの例には、以下には限らないが、Paraplast、BroloidおよびTissuemayがある。一旦、組織試料を包埋すれば、その試料を、ミクロトームなどによって切片化することができる(例えば、上記の「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」を参照)。この手順の例として、切片は、厚さ約3ミクロン〜約20ミクロンの範囲であってよく、好ましくは、厚さ約5ミクロン〜約10ミクロンの範囲である。一態様では、切片は、面積が約10mm2〜約1cm2であってよい。切断した後、いくつかの標準的な方法によって、切片をスライドに付着させることができる。スライド接着剤の例には、以下には限らないが、シラン、ゼラチン、ポリ−L−リシンなどがある。例として、正に帯電したスライドおよび/またはポリ−L−リシンで被覆したスライドに、パラフィンに包埋した切片を付着させることができる。
パラフィンを包埋用物質として用いた場合、一般に、組織切片は脱パラフィン処理され、水へと再水和される。いくつかの従来の標準的な方法によって、組織切片を脱パラフィン処理することができる。例えば、キシレンおよび徐々に漸減するアルコール系列を使用することができる(例えば、上記の「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」を参照)。あるいは、Hemo−De(登録商標)(CMS、Houston、Tex.)などの市販されている脱パラフィン処理用非有機薬剤を使用することもできる。
哺乳動物組織培養細胞、新鮮な組織、または同様の供給源について、従来の細胞溶解技術(例えば、0.14MのNaCl、1.5mMのMgCl2、10mMのTris−Cl(pH8.6)、0.5%のNonidet P−40、ならびに必要に応じてプロテアーゼおよび/またはホスファターゼ抑制剤)によって試料を調製することができる。新鮮な哺乳動物組織については、試料調製は、組織分解ステップ、例えば、破砕、みじん切り、粉砕、超音波処理などをも含むことがある。
B.細胞の磁気単離 患者の血液から微量の転移性細胞上の二量体を測定するなどのいくつかの適用では、表面受容体二量体集団のアッセイを行う前に、濃縮ステップを実施してもよい。参照により組み込まれる下記の代表的な参照文献中で開示されている、当技術分野で公知の様々な技術および物質を用いて、免疫磁気的単離または濃縮を実施することができる:Terstappenら、米国特許第6,365,362号;Terstappenら、米国特許第5,646,001号;Rohrら、米国特許第5,998,224号;Kauschら、米国特許第5,665,582号;Kresseら、米国特許第6,048,515号;Kauschら、米国特許第5,508,164号;Miltenyiら、米国特許第5,691,208号;Molday、米国特許第4,452,773号;Kronick、米国特許第4,375,407号;Radbruchら、Methods in Cell Biology、Vol.42の第23章(Academic Press、New York、1994);Uhlenら、Advances in Biomagnetic Separation(Eaton Publishing、Natick、1994);Safarikら、J. Chromatography B、722:33−53(1999);Miltenyiら、Cytometry、11:231−238(1990);Nakamuraら、Biotechnol. Prog.、17:1145−1155(2001);Morenoら、Urology、58:386−392(2001);Racilaら、Proc. Natl. Acad. Sci.、95:4589−4594(1998);Zigeunerら、J. Urology、169:701−705(2003);Ghosseinら、Seminars in Surgical Oncology、20:304−311(2001)。
本発明を実施する際に使用するのに好ましい磁性粒子は、コロイドとして振舞う粒子である。そのような粒子は、その粒子サイズが1ミクロン未満であり、一般に約200ナノメートル(nm)(0.20ミクロン)未満であること、および溶液からの重力による分離に対して、長期間にわたり安定であることを特徴とする。他の多くの利点に加えて、このサイズ範囲により、それは、細胞分析に通常適用される分析技術では原則的に見えなくなる。90〜150nmの範囲内であり、かつ70〜90%の磁性物を有する粒子が、本発明での使用に意図される。好適な磁性粒子は、超常磁性物質の結晶性のコアと、それを取り囲む磁性コアに結合した分子、例えば、そのコアに物理的に吸着したかまたは共有結合した分子とから構成されており、そのことによって、安定化させるコロイド特性がもたらされる。被覆物質は、好ましくは、試料中に認められる生体高分子と磁性コアとの非特異的な相互作用を防ぐのに有効な量で適用されるべきである。そのような生体高分子としては、非標的細胞の表面上のシアル酸残基、レクチン、糖タンパク質および他の膜構成成分が挙げられうる。さらに、その物質は、可能な限り多くの磁性物/ナノ粒子を含有するべきである。コアを含む磁性結晶のサイズは十分に小さいので、それは完全な磁性ドメインを含まない。ナノ粒子のサイズは十分に小さいので、そのブラウン運動エネルギーは、その磁性モーメントを超える。その結果、N極とS極の整列、およびそれに続くこれらのコロイド磁性粒子の相互の引力/反発力は、中程度の強さの磁界でも生じないと思われ、そのことがその溶液の安定性をもたらす。最後に、磁性粒子は、高磁性勾配の外部磁界分離器で分離可能であるべきである。その特徴により、試料の取り扱いが容易となり、強磁性ビーズまたはスチール・ウールを充填したより複雑な内部勾配カラムを超える経済的な利点がもたらされる。米国特許第4,795,698号、第5,597,531号および第5,698,271号(これら特許は参照により組み込まれる)に記載の原料物質を改変することにより、上記に記載の特性を有する磁性粒子を調製することができる。
遊離可能な分子タグを使用するアッセイ
遊離可能な分子タグを用いて二量体集団を測定することによって、多くの利点がもたらされる。そのような利点には、(1)アッセイ混合物から遊離した分子タグを分離することにより、バックグラウンドが大幅に低下し、感度が著しく増すこと、および(2)分離および検出が容易となるように特別に設計した分子タグを使用することにより、複数の受容体複合体成分を同じアッセイ中で同時に容易に測定できるような好都合な多重処理能を得られることが含まれる。そのようなタグを使用するアッセイは、様々な形態をとることができ、以下の参照文献中で開示されている:Singhら、米国特許第6,627,400号;米国特許公開、Singhら、第2002/0013126号;第2003/0170915号、Williamsら、第2002/0146726号;およびChan−Huiら、国際特許公開WO2004/011900(これらすべては、参照により本明細書に組み込まれる)。例えば、以下には限らないが、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、電荷/質量比、極性などを含む、分離させる分子間の1種またはそれ以上の物理的、化学的または光学的差異に基づいて、分子を区別できる多様な分離技術を使用することができる。一態様では、複数のまたは組み合わせた分子タグは、電気泳動移動度および光学的検出特性が異なり、電気泳動によって分離される。他の態様では、複数のまたは組み合わせた分子タグは、分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、極性が異なっていてもよく、順相または逆相HPLC、イオン交換HPLC、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィー、または同様の技術によって分離される。
遊離可能な分子タグを用いて二量体集団を測定することによって、多くの利点がもたらされる。そのような利点には、(1)アッセイ混合物から遊離した分子タグを分離することにより、バックグラウンドが大幅に低下し、感度が著しく増すこと、および(2)分離および検出が容易となるように特別に設計した分子タグを使用することにより、複数の受容体複合体成分を同じアッセイ中で同時に容易に測定できるような好都合な多重処理能を得られることが含まれる。そのようなタグを使用するアッセイは、様々な形態をとることができ、以下の参照文献中で開示されている:Singhら、米国特許第6,627,400号;米国特許公開、Singhら、第2002/0013126号;第2003/0170915号、Williamsら、第2002/0146726号;およびChan−Huiら、国際特許公開WO2004/011900(これらすべては、参照により本明細書に組み込まれる)。例えば、以下には限らないが、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、電荷/質量比、極性などを含む、分離させる分子間の1種またはそれ以上の物理的、化学的または光学的差異に基づいて、分子を区別できる多様な分離技術を使用することができる。一態様では、複数のまたは組み合わせた分子タグは、電気泳動移動度および光学的検出特性が異なり、電気泳動によって分離される。他の態様では、複数のまたは組み合わせた分子タグは、分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、極性が異なっていてもよく、順相または逆相HPLC、イオン交換HPLC、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィー、または同様の技術によって分離される。
結合性化合物から遊離した後で分離技術によって別々のバンドまたはピークに分離される、分子タグの組み合わせを提供する。そのようなピークを同定し定量することにより、受容体二量体の種類および量についての測定値またはプロファイルがもたらされる。組み合わせ内の分子タグは、化学的に多様であってよい。しかし、便宜には、分子タグの組み合わせは通常、化学的に関係がある。例えば、下記でより十分に記載するように、それらはすべてペプチドであってよく、あるいは、同じ基本構成単位または単量体の異なる組合せからなるものでもよく、あるいは、異なる分離特性を与える異なる置換基を有する同じ基本骨格を用いて合成されたものでもよい。複数の分子タグの数は、使用する分離様式、分子タグに使用する検出用の標識、結合性部分の感度、切断可能な結合を切断する効率などを含めた、いくつかの要因に応じて異なってよい。一態様では、受容体二量体の集団を測定するための複数の分子タグの数は、2〜10の範囲内である。他の態様では、複数のサイズは、2〜8、2〜6、2〜4、または2〜3の範囲内であってよい。
均一形式の、または非均一形式のすなわち不均一形式のアッセイで、受容体二量体を検出することができる。均一形式では、結合していない結合性化合物から、標的複合体と特異的に結合した結合性化合物を分離するステップは不要である。好ましい実施形態では、均一形式は、(i)遊離可能な分子タグを有する1種またはそれ以上の結合性化合物、および、(ii)切断性プローブの有効な近接範囲内で分子タグと反応し、それを遊離させる活性種を発生させることができる少なくとも1つの切断性プローブ、を含む試薬の対を使用する。
不均一形式を使用するアッセイによって、受容体二量体を検出することもできる。不均一形式の技術は通常、分離ステップを使用し、そのステップでは、特異的に結合した結合性化合物を有する細胞内複合体を、結合していない結合性化合物、および場合によってはタンパクや膜の断片などの他の試料成分から、分離する。複合体と結合した結合性化合物と、結合していない結合性化合物とを区別する固体支持体に結合した試薬を使用するなどの、様々な方法で分離を行うことができる。固体支持体は、容器壁、例えばマイクロタイターウェルプレートのウェル、毛細管、プレート、スライド、磁性ビーズを含めたビーズ、リポソームなどであってよい。固体支持体の主要な特徴は、それが(1)結合した結合性化合物と結合していない結合性化合物との分離を可能にすること、および(2)結合複合体の形成、または受容体二量体の決定における他の操作に、干渉しないことである。通常、固定された試料では、結合していない結合性化合物は、洗浄によって簡単に除去される。
不均一形式で分子タグを使用する検出では、洗浄後、分子タグがその中に遊離する溶媒と試料を混合してもよい。切断可能な結合の性質および切断方法に応じて、溶媒は、切断用のいかなるさらなる試薬を含んでもよい。切断用の試薬が不要である場合、溶媒は、好都合なように分離バッファー、例えば、電気泳動用の分離溶液でもよい。例えば、切断可能な結合が感光性であるか、または光増感剤によって発生した活性種によって切断可能である場合、分離溶液に適当な波長の光を照射して、バッファー中に分子タグを遊離させることができる。
どちらの形式でも、そのアッセイ反応条件が、使用する分離技術に干渉する場合、分子タグを切断し分離する前に、アッセイ反応バッファーの除去または交換を必要とする可能性がある。例えば、いくつかの実施形態では、アッセイ条件には、電気泳動移動度に基づいて分子タグを分離する場合に分離能を低下させる(例えば特異的結合に必要な)塩濃度が含まれる。そのような実施形態では、分子タグを遊離させ分離する前に、アッセイバッファーを分離バッファーまたは分離溶液で置換する。
遊離可能な分子タグおよび切断性プローブを使用するアッセイは、検出しまたは測定する複合体に応じて、多数の異なる形式および構成で行うことができる。本開示に基づいて、特定の結合性化合物および切断性プローブの数および特異性を選択することは、当業者にとって設計上の選択である。
本発明の一態様では、細胞表面膜の二量体を測定するための遊離可能な分子タグの使用は、図1Aおよび1Bに概略図として示される。分子タグ「mT1」および「mT2」を有する結合性化合物(100)、ならびに光増感剤「PS」を有する切断性プローブ(102)を生物細胞(104)と混合する。分子タグ「mT1」を有する結合性化合物は、細胞表面受容体R1(106)に特異的であり、分子タグ「mT2」を有する結合性化合物は、細胞表面受容体R2(108)に特異的である。細胞表面受容体R1およびR2は、細胞表面膜(112)中で単量体、例えば(106)および(108)として、ならびに二量体(110)として存在する。これらのアッセイの構成成分を適切な結合バッファー中でインキュベートして、結合性化合物とそのそれぞれの受容体標的との安定な複合体、および切断性プローブとその受容体標的との安定な複合体を形成(114)させる。図示したように、好ましくは、結合性化合物および切断性プローブはそれぞれ抗体結合性組成物を含み、それは、分子タグおよび切断誘導部分を膜成分へと特異的に標的化させる。一態様では、そのような抗体結合性組成物は、モノクローナル抗体である。そのような実施形態では、結合バッファーは、従来のELISA技術などで使用されるバッファーを含んでもよい。結合性化合物および切断性プローブが安定な複合体(116)を形成した後、そのアッセイ混合物を照射(118)して、一重項酸素を発生させるように光増感剤(120)を誘導する。一重項酸素はアッセイ混合物の成分と速やかに反応し、それにより、分子タグの切断可能な結合の切断に有効な一重項酸素の近接範囲(122)が、その有効な近接範囲内に偶然に存在する分子タグだけが遊離するように(124)空間的に制限されるようになる。図示したように、その唯一遊離した分子タグは、R1−R2二量体および切断性プローブと安定した複合体を形成する結合性化合物上にあるものである。遊離した分子タグ(126)は、アッセイ混合物から除去され、分離プロファイル(132)において別々のピーク(130)を形成するような分離特性に従って分離(128)される。本発明によれば、このような除去および分離は、同じステップでもよい。場合によっては、光照射の前に、結合バッファーを除去し、分離のためにより適したバッファー、すなわち分離バッファーで置換してもよい。例えば、結合バッファーは通常、キャピラリー電気泳動などの、分子タグを別々のピークに分離するためのいくつかの分離技術の性能を低下させる可能性がある塩濃度を有する。一実施形態では、バッファーのこのような交換は、膜ろ過によって行うことができる。
ヘテロ二量体のレシオメトリーによる測定を例示する実施形態を図1Cに示し、この測定では追加の結合性化合物を使用して、試料中のタンパク質(1104)の総量を測定する。本発明の試薬(1122)は、(i)切断性プローブ(1108)、第1の結合性化合物(1106)、および第2の結合性化合物(1107)を含み、ここで、切断性プローブ(1108)が特異的である抗原決定基とは異なる抗原決定基において、第1の結合性化合物(1106)はタンパク質(1102)に特異的であり、第2の結合性化合物(1107)はタンパク質(1104)に特異的である。試薬の結合後、切断性プローブ(1108)が活性化されて、光増感剤の有効な近接範囲内で分子タグの切断可能な結合を切断する活性種が生じる。この実施形態では、分子タグは、試薬(1107)および(1108)がどちらも結合したタンパク質の単量体(1104)から、また、試薬(1108)が結合し、試薬(1106)と(1107)の一方または両方が結合したヘテロ二量体から、遊離する。遊離した分子タグ(1123)を分離し、分離プロファイル(1126)中のピーク(1118および1124)を、遊離した分子タグの量と相関させる。この実施形態では、ピークの相対的な高さまたは面積は、(i)そのそれぞれの抗原決定基に対する第1および第2の結合性化合物の親和性の差、および/または(ii)結合性化合物が特異的である抗原決定基の有無を反映しうる。結合性化合物を使用してタンパク質の翻訳後の状態、例えばリン酸化状態をモニターするときはいつでも、後者の状況は重要である。
図1Dに示すように、ホモ二量体を測定することができる。上記のように、アッセイは3種の試薬(1128):切断性プローブ(1134)、第1の結合性化合物(1130)、および第2の結合性化合物(1132)を、含んでもよい。第1の結合性化合物(1130)および切断性プローブ(1134)は、試料中にホモ二量体(1136)または単量体(1138)として存在(1140)するタンパク質(1138)上の同じ抗原決定基(1135)に特異的となるように構築する。試薬とそのそれぞれの標的との安定な複合体の形成を促進する条件下で試薬(1128)を試料と混合した後、複数の複合体(1142〜1150)がアッセイ混合物中で形成される。切断性プローブ(1134)および結合性化合物(1130)が同じ抗原決定基(1135)に特異的であるので、試薬の4種の異なる組合せ(1144〜1150)が、ホモ二量体の複合体を形成する可能性がある。アッセイ混合物中の複合体のうち、切断性プローブ(1134)と少なくとも1つの結合性化合物をどちらも伴うもの(1143)だけが、分離され検出される(1154)遊離した分子タグ(1151)をもたらすことになる。この実施形態では、ピーク(1153)のサイズは、アッセイ混合物中のホモ二量体の量に比例するが、ピーク(1152)のサイズは、アッセイ混合物中の、単量体型(1142)またはホモ二量体型(1146および1148)の両方のタンパク質(1138)の総量に比例する。図1Eは、細胞表面膜(1161)中でヘテロ二量体を形成する細胞表面受容体の同様の測定を示す。当業者であれば、細胞または組織の溶解液において、あるいはその膜が固定処理によって浸透化されまたは除去された固定試料において二量体を測定できることを理解するであろう。そのような場合、結合性化合物は、細胞表面膜受容体の細胞外または細胞内ドメインに特異的なものでよい。
図1Eおよび1Fに図示するように、細胞試料中の複数の二量体および細胞内複合体の同時検出または測定に、遊離可能な分子タグを使用することもできる。細胞(160)は、in vitro培養物由来の試料からのものでもよく、あるいは患者組織の検体由来のものでもよいが、それを溶解(172)することにより、細胞膜と結合した分子複合体、および/または膜分子の細胞質ドメイン内にあるリン酸化部位などの翻訳後修飾部位の利用が可能となる。溶解後、得られた溶解液(174)を、複数の切断性プローブ(175)および複数の結合性化合物(177)を含むアッセイ試薬(176)と混合する。活性化の際に切断誘導部分の有効な近接範囲(180)内の切断可能な結合が切断され、分子タグが遊離(182)するように、試薬(176)がそのそれぞれの標的と特異的に結合するアッセイ条件を選択(178)する。上記のように、切断後、遊離した分子タグを分離(184)し、電気泳動図などの分離プロファイル(186)において同定し、測定した分子タグの数および量に基づいて、試料の細胞中の選択した分子複合体のプロファイルを得る。
図1Gおよび1Hは、固定または凍結した組織試料中の受容体複合体を測定する本発明の実施形態を図示するものである。固定した組織試料(1000)、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋試料を、ミクロトームまたは類似の器具を用いてスライスして、切片(1004)を得、顕微鏡用スライドでもよい表面(1006)上に置いた後、アッセイ試薬を適用するためにそれを脱蝋し再水和する。拡大図(1007)は、顕微鏡用スライド(1006)の一部(1014)上の切片(1004)の一部(1008)を示す。受容体二量体分子(1018)は、固定試料の膜構造(1016)の残余物中に埋まっているものとして図示されている。本発明のこの態様によれば、切断性プローブおよび結合性化合物を、それらがその標的分子と結合するように、固定試料とインキュベートする。例えば、切断性プローブ(1012)(図中で光増感剤(「PS」)が結合した抗体として示す)および第1の結合性化合物(1010)(分子タグ「mT1」が結合した抗体として示す)は、示した二量体すべてに共通する受容体(1011)と特異的に結合し、第2の結合性化合物(1017)(「mT2」を伴う)は受容体(1015)に特異的に結合し、第3の結合性化合物(1019)(「mT3」を伴う)は受容体(1013)に特異的に結合する。洗浄して、そのそれぞれの標的分子と特異的に結合していない結合性化合物および切断性プローブを除去した後、バッファー(1024)(図中で「イルミネーションバッファー」と称する)を加える。便宜上、例えば、ワックスペンでスライド(1006)上に疎水性の障壁を作ることによって、バッファー(1024)が切片(1004)またはその一部の上に含まれるようにしてもよい。光増感剤を照射し分子タグ(1026)が遊離した後、いまや遊離分子タグ(1025)を含むバッファー(1024)を、キャピラリー電気泳動機器などの分離デバイスに移し、遊離した分子タグを、例えば、電気泳動図(1030)において分離(1028)し同定する。
試料中の総細胞数および/または試料中の特定の細胞サブタイプの数を示す細胞または組織の標的に対する測定を含めることにより、図1Gおよび1Hに特に図示するような、組織試料に対して直接行われる測定を標準化することができる。患者試料、特に腫瘍の試料には、正常細胞がかなりの割合で含まれる可能性があり、細胞および組織が不均一であるので、さらなる測定が好ましい場合があり、あるいは必要でさえあるかもしれない。例えば、図1Hでは、受容体(1011)の総量の値は、次の2つの測定値の比として得ることができる:分子タグ(「mT1」)のピーク(1032)の面積、および試料中の細胞すべてに共通する細胞または組織成分、例えばチューブリンなどと相関する分子タグに対応するピークの面積。試料中の細胞すべてが上皮細胞であるいくつかの場合では、サイトケラチンを使用することができる。したがって、遊離可能な分子タグに基づく検出法は、チューブリンなどの標準化タンパク質に特異的な結合性化合物(区別される分子タグが付いたもの)を用意するさらなるステップを含みうる。
図2A〜2Eは、複数の受容体タイプの間の二量体化についてプロファイルを作成するための本発明の他の実施形態を図示するものである。図2Aは、そのようなアッセイの基本ステップの概説するものである。細胞表面受容体の二量体について試験する細胞膜(200)を、結合性化合物(202)および(204)の組み合わせ、ならびに切断性プローブ(206)と混合する。膜分画(200)は、その細胞膜中に3つの異なるタイプの単量体受容体分子(「1」、「2」、および「3」)を含み、それらは会合して、3種の異なるヘテロ二量体:1−2、1−3、および2−3、を形成する。3つの抗体試薬(202)および(204)を膜分画(200)と混合するが、その抗体試薬のそれぞれは3種の受容体分子のうち1つに対する結合特異性を有し、抗体(206)は受容体分子1に特異的であり、抗体(204)は受容体分子2に特異的であり、抗体(202)は受容体分子3に特異的である。第1の受容体分子に対する抗体は、PSと称する光増感剤分子と共有結合している。第2および第3の受容体分子に対する抗体は、光増感剤部分により発生する活性種で切断可能な結合によって、それぞれT2およびT3と称する2つの異なるタグと結合している。
混合後、抗体を膜の表面上の分子と結合(208)させる。光増感剤が活性化(210)され、増感剤分子から作用可能な距離内にあるタグと抗体の結合が切断され、それによってアッセイ溶液中にタグが遊離する。次いで、図示したように、例えばキャピラリー電気泳動によって反応液から物質を分離(212)する。図2Aの下部に示すように、タグT2およびT3が遊離し、電気泳動による分離はこれらのタグに対応する2つのバンドを示す。タグが既知の電気泳動移動度を示すように設計されているので、各バンドを、アッセイで使用したタグの1つに一意的に特定することができる。
図2Aに示すように、細胞膜中に存在する3種の異なるヘテロ二量体のうち2種だけが、光増感剤を含む抗体と、タグを含む抗体のどちらにも結合し、したがって、これら2種だけが、遊離タグを生じるはずである。しかし、異なる二量体の相対量を決定するのに複数の実験が必要となる。図2Bに、5つの異なるアッセイの組合せを列挙する表を示す。図2Cに、各アッセイ構成の結果を示す。アッセイIは、図2Aに記載の完全なアッセイの結果を表す。アッセイIIでは、光増感剤と結合させた、受容体分子1に特異的な抗体を除外する。このアッセイではシグナルが得られず、このことからアッセイIで得られたT2およびT3のシグナルが光増感剤試薬を必要とすることが示唆される。同様に、アッセイVから、タグのシグナルが膜の存在を必要とすることが示される。アッセイIIIおよびIVから、それぞれのタグ付き試薬が、切断される他方の試薬の存在を必要としないことが示される。まとめて考えると、これらの結果から、図2Cに示すように、膜中に存在する受容体へテロ二量体の存在および組成に関する結論、すなわち、1−2と1−3のヘテロ二量体がどちらも存在するという結論を導くことが可能である。さらに、各タグの相対的なシグナル強度から、各へテロ二量体の相対量を算出することが可能である。
しかし、このアッセイで使用する試薬の組合せでは、2−3のヘテロ二量体の存在に関する結論は得られない。この複合体にはそれと結合する光増感剤試薬がないので、この複合体が存在してもしなくても、この複合体を表すシグナルは得られない。3つの単量体の考えられるあらゆる二量体の組合せに関する結論を導くためには、単量体1、2、および/または3を含む、考えられるあらゆるオリゴマーに局在することができる第4の試薬を使用するか、あるいは、この実験で使用する3種の結合物質に、タグおよび増感剤分子を異なる組合せで結合しなければならない。後者の戦略を、図2Dおよび2Eに図示する。3種の抗体試薬の間での光増感剤およびタグの3種の考えられる組合せの配分を、図2Dの左側の表に列挙する。第1の組合せは、単量体番号1に特異的な抗体に結合させた光増感剤を含み、それは図2A〜2Cの図解中で使用したものと同じ組合せであり、図2Cの場合と同じ二量体集団を有する。第2の組合せは、単量体番号2に特異的な抗体に結合させた光増感剤を含み、その集団プロファイルから、同じ数のヘテロ二量体1−2に加えて、ヘテロ二量体2−3についての値が得られる。第3の組合せは、単量体番号3に特異的な抗体に結合させた光増感剤を含み、その集団プロファイルから、最初の2つの組合せから得られたものと同じ数がヘテロ二量体1−3および2−3について得られる。これらの結果を組み合わせて、図2Eに示す全体的なヘテロ二量体集団プロファイルを得ることができる。
共通する成分受容体を含む受容体二量体の相対量を測定する好ましい実施形態を図2Fに図示する。このアッセイの設計では、共通する成分「2」をそれぞれ有する2つの異なる受容体二量体(「1−2」(240)および「2−3」(250))を、その共通成分に関してレシオメトリーで測定することができる。受容体「1」(222)および受容体「2」(220)を含む受容体ヘテロ二量体(240)、ならびに受容体「2」(220)および受容体「3」(224)を含む受容体ヘテロ二量体(250)を測定するためのアッセイの設計を示す。この実施形態の重要な特徴は、切断性プローブ(227)が、ヘテロ二量体の対の共通する受容体に対して特異的に作製されていることである。受容体「2」に特異的な結合性化合物(228)は、アッセイにおける受容体「2」の総量に関連するシグナル(234)をもたらすが、受容体「1」に特異的な結合性化合物(226)および受容体「3」に特異的な結合性化合物(230)は、受容体「2」を有するヘテロ二量体としてそれぞれ存在する受容体「1」および受容体「3」の量だけに関連するシグナル(それぞれ232および236)をもたらす。さらなる複合体の構成成分に特異的な結合性化合物を単に加えることにより、共通する構成成分を含む受容体複合体の2種を超える種類に、図2Fの設計を一般化することができる。
A.結合性化合物
上記で述べたように、それぞれが切断可能な結合を介して結合した1種またはそれ以上の分子タグを有する複数の異なる結合性化合物を含む、混合物を提供することができる。結合性化合物、切断可能な結合および分子タグの性質は、非常に様々でありうる。結合性化合物は、タンパク質の複合体などの対象とする分析物と特異的に結合するかまたは安定な複合体を形成することができる、抗体結合性組成物、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチド性または非ペプチド性リガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは他の任意の分子実体を含んでもよい。一態様では、下記の式で表すことができる結合性化合物は、結合性部分と結合した1種またはそれ以上の分子タグを含む。
B−(L−E)k
式中、Bは結合性部分であり、Lは切断可能な結合であり、Eは分子タグである。均一アッセイでは、切断可能な結合Lは、酸化に不安定な結合でもよく、より好ましくは、一重項酸素によって切断することができる結合である。部分「−(L−E)k」は、単一の結合性化合物が、切断可能な結合を介して結合した複数の分子タグを有する可能性があることを示す。一態様では、kは1以上の整数であるが、他の実施形態では、kは数百より大きく、例えば100〜500であってもよく、あるいは、kは数百より大きい数〜数千程度、例えば500〜5000である。通常、複数の異なるタイプの結合性化合物はそれぞれ異なる分子タグEを有する。切断可能な結合、例えば酸化に不安定な結合、および分子タグEは、従来の化学反応によってBと結合する。
上記で述べたように、それぞれが切断可能な結合を介して結合した1種またはそれ以上の分子タグを有する複数の異なる結合性化合物を含む、混合物を提供することができる。結合性化合物、切断可能な結合および分子タグの性質は、非常に様々でありうる。結合性化合物は、タンパク質の複合体などの対象とする分析物と特異的に結合するかまたは安定な複合体を形成することができる、抗体結合性組成物、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチド性または非ペプチド性リガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは他の任意の分子実体を含んでもよい。一態様では、下記の式で表すことができる結合性化合物は、結合性部分と結合した1種またはそれ以上の分子タグを含む。
B−(L−E)k
式中、Bは結合性部分であり、Lは切断可能な結合であり、Eは分子タグである。均一アッセイでは、切断可能な結合Lは、酸化に不安定な結合でもよく、より好ましくは、一重項酸素によって切断することができる結合である。部分「−(L−E)k」は、単一の結合性化合物が、切断可能な結合を介して結合した複数の分子タグを有する可能性があることを示す。一態様では、kは1以上の整数であるが、他の実施形態では、kは数百より大きく、例えば100〜500であってもよく、あるいは、kは数百より大きい数〜数千程度、例えば500〜5000である。通常、複数の異なるタイプの結合性化合物はそれぞれ異なる分子タグEを有する。切断可能な結合、例えば酸化に不安定な結合、および分子タグEは、従来の化学反応によってBと結合する。
好ましくは、Bは、抗体結合性組成物であり、これは細胞表面受容体などの標的タンパク質の所定の抗原決定基などの標的と特異的に結合する。そのような組成物は、対象とするタンパク質に特異的な、種々の市販されているモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の抗体から容易に形成される。特に、上皮成長因子受容体に特異的な抗体は、下記の特許中で開示されている:第5,677,171号;第5,772,997号;第5,968,511号;第5,480,968号;第5,811,098号(これらは参照により組み込まれる)。米国特許第6,488,390号(参照により本明細書に組み込まれる)は、Gタンパク共役型受容体CCR4に特異的な抗体を開示している。米国特許第5,599,681号(参照により本明細書に組み込まれる)は、タンパク質のリン酸化部位に特異的な抗体を開示している。Cell Signaling Technology(Beverly、MA)、Biosource International(Camarillo、CA)およびUpstate(Charlottesville、VA)などの商業的供給メーカーも、多数の受容体に特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を提供している。
切断可能な結合Lは、その構造を分解せず、または遊離した分子タグEの検出特性に影響を与えない条件下で切断されうる実際上いかなる化学結合基でもよい。切断性プローブを均一アッセイ形式で使用する場合はいつでも、切断可能な結合Lは、切断性プローブのすぐ近接した範囲内にある切断可能な結合だけが切断されるように、短い距離で作用する、切断性プローブにより生成される切断作用因子によって切断される。通常、反応混合物に物理的または化学的変化を生じさせることによりそのような作用因子を活性化して、それによって作用因子が、切断可能な結合に拡散して切断を実施する寿命の短い活性種を生成するように、しなければならない。均一形式では、切断作用因子は、活性化前に、遊離可能な分子タグの付いた結合性化合物の近接範囲内にある特定の部位へと切断作用因子を標的化する、抗体などの結合性部分と結合させることが好ましい。そのような実施形態では、切断作用因子は、本明細書において「切断誘導部分」と呼ばれ、下記でより十分に論じる。
非均一形式では、特異的に結合している結合性化合物が、結合していない結合性化合物から分離されることから、使用できる切断可能な結合および切断作用因子をより広く選択することができる。切断可能な結合としては、過酸化水素や一重項酸素などの局所作用性反応種との反応を受けやすい結合だけでなく、塩基に不安定な結合、光切断可能な結合、還元によって切断可能な結合、酸化によって切断される結合、酸に不安定な結合、特異的プロテアーゼによって切断可能なペプチド結合などの、反応混合物全体にわたって作用する作用因子に不安定な結合が挙げられる。そのような結合を多数記載している参照文献には、GreeneおよびWuts、Protective Groups in Organic Synthesis、第2版(John Wiley & Sons、New York、1991);Hermanson、Bioconjugate Techniques(Academic Press、New York、1996);ならびにStillら、米国特許第5,565,324号がある。
一態様では、市販されている切断可能な試薬系を本発明に使用することができる。例えば、N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)などの、Pierce Chemical Company(Rockford、IL)などの販売業者から入手可能なヘテロ官能性薬剤を用いて、抗体結合性組成物と分子タグの間にジスルフィド結合を導入することができる。ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール(DTE)、2−メルカプトエタノール、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤で処理することにより、そのような結合によって導入されたジスルフィド結合を切断することができる。ジスルフィド結合を切断させるための還元剤の典型的な濃度は、10〜100mMの範囲内にある。過ヨウ素酸ナトリウムでの切断(例えば、生理的pHで15mM過ヨウ素酸塩で4時間処理)に感受性がある中央のシスジオールを含む、ホモ二官能性NHSエステル架橋試薬のジスクシンイミジルタルタレート(DST)(Pierceから入手可能)を用いて、抗体結合性組成物と分子タグの間に、酸化に不安定な結合を導入することができる。エステル化したスペーサー成分を含む結合を、ヒドロキシルアミンなどの強い求核性薬剤を用いて、例えば0.1N ヒドロキシルアミン、pH8.5を用いて37℃で3〜6時間処理して、切断することができる。そのようなスペーサーは、Pierce(Rockford、IL)から入手可能なエチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)などのホモ二官能性架橋剤によって導入することができる。スルホン基を用いて、塩基に不安定な結合を導入することができる。切断可能な結合中にスルホン基を導入するのに使用することができるホモ二官能性架橋剤には、ビス[2−(スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、および4,4−ジフルオロ−3,3−ジニトロフェニルスルホン(DFDNPS)がある。切断のための例示的な塩基性条件としては、6M尿素、0.1%SDS、および2mM DTTを含み、トリス塩基を加えてpH11.6に調整した0.1Mリン酸ナトリウムを用いて、37℃で2時間インキュベートするものが挙げられる。光切断可能な結合には、Rothschildら、米国特許第5,986,076号中に開示されているものがある。
Lが酸化に不安定である場合、Lは、チオエーテルもしくはそのセレン類似体であるか、または炭素−炭素の二重結合を含むオレフィンでもよく、これは二重結合を切断してオキソ基にすると、分子タグEが遊離する。例示的な、酸化に不安定な結合が、Singhら、米国特許第6,627,400号;米国特許公開、Singhら、第2002/0013126号;および第2003/0170915号、ならびにWillnerら、米国特許第5,622,929号(これらすべては参照により本明細書に組み込まれる)中に開示されている。
本発明において、分子タグEは、ガスクロマトグラフィーまたは質量分析によって複数の分子タグの分離を実施する場合、下記の参照文献に記載の電気泳動(electrophoric)タグを含んでよい。Zhangら、Bioconjugate Chem.、13:1002−1012(2002);Giese、Anal. Chem.、2:165−168(1983);および米国特許第4,650,750号;第5,360,819号;第5,516,931号;第5,602,273号など。
分子タグEは、好ましくは、活性種、特に一重項酸素に対して安定であり、検出基またはレポーター基を含む、水溶性の有機化合物である。さもなければ、Eは、サイズおよび構造が大幅に様々なものでよい。一態様では、Eの分子量は、約50〜約2500ダルトンの範囲内であり、より好ましくは、約50〜約1500ダルトンの範囲内である。Eの好ましい構造は、下記でより十分に記載する。Eは、電気化学的シグナル、蛍光シグナル、または発色シグナルを生じる検出基を含んでもよい。質量による検出を使用する実施形態では、Eは、検出目的では別個の部分を有さなくてよい。好ましくは、検出基は、蛍光シグナルを発生する。
複数集団内の分子タグは、同じ複数集団の他のメンバーに対してそれぞれが固有の分離特性および/または固有の光学的特性を有するように選択する。他の態様では、クロマトグラフィーでのまたは電気泳動での分離特性は、当技術分野で慣用的な一連の標準的分離条件下、例えば、電圧、カラム圧、カラムタイプ、移動相、電気泳動分離溶液などの下での保持時間である。他の態様では、光学的特性は、発光スペクトル、蛍光寿命、所与の波長または波長バンドでの蛍光強度などの蛍光特性である。好ましくは、蛍光特性は、蛍光強度である。例えば、複数集団の各分子タグが同じ蛍光発光特性を有することがありうるが、固有の保持時間を有する点で、それぞれが互いに異なる。一方、複数集団の2つ以上の分子タグが同じ移動または保持時間を有することがありうるが、分子の分離と蛍光測定を組み合わせることによってその複数集団のメンバーをすべて区別できるように、それらが固有の蛍光特性、例えばスペクトル分解可能な発光スペクトルを有する。
好ましくは、電気泳動による分離、および検出基の蛍光によって、遊離した分子タグを検出する。このような実施形態では、実質的に同一の蛍光特性を有する分子タグは、電気泳動図において分離条件下で別々のピークが形成されるような、異なる電気泳動移動度を有する。好ましくは、従来のキャピラリー電気泳動装置によって、従来のふるいマトリックスの存在下または不在下で、本発明の複数の分子タグを分離する。例示的なキャピラリー電気泳動装置には、Applied Biosystems(Foster City、CA)のモデル310、3100および3700;Beckman(Fullerton、CA)のモデルP/ACE MDQ;Amersham Biosciences(Sunnyvale、CA)のMegaBACE1000または4000;SpectruMedix遺伝子分析システムなどがある。電気泳動移動度は、q/M2/3に比例し、ここで、qは分子の電荷であり、Mは分子の質量である。望ましくは、最も近い電気泳動標識間の、測定条件下での移動度の差は、少なくとも約0.001であり、通常は0.002であり、より通常は少なくとも約0.01であり、0.02以上でもよい。好ましくは、そのような従来の装置では、複数の分子タグの電気泳動移動度は、少なくとも1%、より好ましくは少なくとも1〜10%の範囲の割合で異なる。分離プロファイル、またはより具体的には電気泳動図の分析によって分子タグを同定し定量し、そしてそのような値を、試料中に存在する受容体二量体の量および種類と相関させる。例えば、電気泳動で分離する際またはその後に、分離した化合物の蛍光シグナルおよび移動時間(または移動距離)を記録し、または分子タグの相対的蛍光および移動の順についての(例えば、電気泳動図のような)図表を構築することによって分子タグを検出しまたは同定する。好ましくは、Williamsら、米国特許公開第2003/0170734A1号(参照により本明細書に組み込まれる)で開示されている、1種またはそれ以上の標準物質を使用することによって、分子タグの有無および/または量を測定する。
分子量、形状、溶解度、pKa、疎水性、電荷、極性など、例えば、米国特許公開第2003/0235832号(参照により組み込まれる)に開示されているものを含むがそれだけに限らない1種またはそれ以上の物理的特性に基づき、クロマトグラフィーによる分離用に、複数の分子タグを設計することもできる。クロマトグラフィーによる分離技術を、カラムタイプ、固相、移動相などのパラメーターに基づいて選択し、その後、単一操作で分離されて別々のピークまたはバンドを形成しうる複数の分子タグを選択する。検出する分子タグの数(すなわち複数集団のサイズ)、アッセイで発生する各分子タグの推定される量、多重化アッセイで使用する組み合わせの候補となる分子タグの合成の利用性および容易性、使用する検出形式、ならびにHPLC機器、カラムおよび溶媒の利用可能性、頑強性、コストおよび操作容易性を含めたいくつかの要因によって、本発明での使用にどのHPLC技術を選択するかが決まる。一般に、限られた量の試料の分析に適し、最高の分解能での分離をもたらすカラムおよび技術が好ましい。そのような選択を行うための手引きは、文献中に、例えば、Snyderら、Practical HPLC Method Development、(John Wiley & Sons、New York、1988);Millner、「High Resolution Chromatography: A Practical Approach」、Oxford University Press、New York(1999)、Chi−San Wu、「Column Handbook for Size Exclusion Chromatography」、Academic Press、San Diego(1999)、およびOliver、「HPLC of Macromolecules: A Practical Approach、Oxford University Press」、Oxford、England(1989)中に認めることができる。特に、カラムタイプ、固相などのクロマトグラフィーによる分離の所与の条件の体系的な開発および最適化のための手順を使用することができる、例えば、Haberら、J. Chromatogr. Sci.、38:386−392(2000);Outinenら、Eur. J. Pharm. Sci.、6:197−205(1998);Lewisら、J. Chromatogr.、592:183−195および197−208(1992)など。本発明での使用に適した例示的なHPLCの機器システムは、Agilent 1100シリーズHPLCシステム(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)である。
一態様では、分子タグEは、(M,D)であり、ここで、Mは移動度改変部分であり、Dは検出部分である。表記「(M,D)」を使用して、MおよびD部分の順番が、どちらかの部分が切断可能な結合Lと隣接しうるようなものでありうることを示す。すなわち、「B−L−(M,D)」は、2つの形態:「B−L−M−D」または「B−L−D−M」のいずれかの結合性化合物を示す。
検出部分Dは、蛍光標識または色素、発色標識または色素、電気化学的標識などでよい。好ましくは、Dは蛍光色素である。本発明で使用する例示的な蛍光色素としては、下記の参照文献に開示されている、水溶性ローダミン色素、フルオレセイン、4,7−ジクロロフルオレセイン、ベンゾキサンテン色素、およびエネルギー移動色素が挙げられる:Handbook of Molecular Probes and Research Reagents、第8版(Molecular Probes、Eugene、2002);Leeら、米国特許第6,191,278号;Leeら、米国特許第6,372,907号;Menchenら、米国特許第6,096,723号;Leeら、米国特許第5,945,526号;Leeら、Nucleic Acids Research、25:2816−2822(1997);Hobb,Jr.、米国特許第4,997,928号;Khannaら、米国特許第4,318,846号など。好ましくは、Dはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。
図3Aに図示する実施形態では、結合性化合物は、結合性部分としてビオチン化抗体(300)を含む。分子タグは、アビジンまたはストレプトアビジン架橋(306)によって結合性部分(300)と結合している。好ましくは、操作において、結合性部分(300)を初めに標的複合体と反応させ、その後アビジンまたはストレプトアビジンを加えて(304)、抗体−ビオチン−アビジン複合体(305)を形成させる。そのような複合体(305)にビオチン化分子タグ(310)を加えて、結合性化合物(312)を形成させる。
図3Bに図示するさらなる他の実施形態では、結合性化合物は、複数の官能基(318)を含む多官能性部分(316)で誘導体化した抗体(314)を含み、その官能基が分子タグ前駆体と反応(320)して、複数の分子タグ(322)が結合した最終的な結合性化合物が得られる。例示的な多官能性部分としては、アミノデキストランおよび同様の物質が挙げられる。
各結合性化合物を異なる分子タグによって別々に誘導体化した後、それを他の結合性化合物とともにプールして、複数の結合性化合物を形成させる。通常、異なる種類の結合性化合物のそれぞれは、組成物中に同じ割合で存在する。しかし、特定の結合性化合物の1つまたはサブセットが、特定の実施形態またはアッセイに対する所望性または必要性に応じてより高いかまたは低い割合で存在するように、設計上の選択として割合は様々であってもよい。そのような設計上の選択に影響を及ぼす可能性がある要因としては、以下には限らないが、特定の標的に対する抗体の親和性およびアビディティ、標的の相対的普及率、分子タグの検出部分の蛍光特性などが挙げられる。
B.活性種を産生する切断誘導部分
切断誘導部分、または切断作用因子とは、好ましくは酸化によって切断可能な結合を切断することができる活性種を産生する基である。好ましくは、活性種は、その切断誘導作用が、その生成部位の近接範囲内だけで有効であるような寿命の短い活性を示す化学種である。活性種が本質的に寿命が短いことにより、その生成部位の近接範囲を超えるため有意なバックグラウンドを生じないか、または、活性種を効率よく除去する捕捉剤を使用することにより、その生成部位からの短い距離を超えた切断可能な結合との反応には活性種を利用できないかのいずれかである。例示的な活性種としては、一重項酸素、過酸化水素、NaDH、ヒドロキシラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキシドなどが挙げられる。酸化を引き起こす、活性種に対する失活剤の例としては、ポリエン、カロチノイド、ビタミンE、ビタミンC、ならびにチロシン、ヒスチジン、およびグルタチオンのアミノ酸−ピロールN−結合物などが挙げられる。例えば、Beutnerら、Meth. Enzymol.、319:226−241(2000)。
切断誘導部分、または切断作用因子とは、好ましくは酸化によって切断可能な結合を切断することができる活性種を産生する基である。好ましくは、活性種は、その切断誘導作用が、その生成部位の近接範囲内だけで有効であるような寿命の短い活性を示す化学種である。活性種が本質的に寿命が短いことにより、その生成部位の近接範囲を超えるため有意なバックグラウンドを生じないか、または、活性種を効率よく除去する捕捉剤を使用することにより、その生成部位からの短い距離を超えた切断可能な結合との反応には活性種を利用できないかのいずれかである。例示的な活性種としては、一重項酸素、過酸化水素、NaDH、ヒドロキシラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキシドなどが挙げられる。酸化を引き起こす、活性種に対する失活剤の例としては、ポリエン、カロチノイド、ビタミンE、ビタミンC、ならびにチロシン、ヒスチジン、およびグルタチオンのアミノ酸−ピロールN−結合物などが挙げられる。例えば、Beutnerら、Meth. Enzymol.、319:226−241(2000)。
切断誘導部分および切断可能な結合を使用するアッセイを設計する際に重要な考慮点は、受容体複合体と結合する場合、それらは互いに遠く離れないので、切断誘導部分によって生成された活性種が切断可能な結合を効率よく切断できないことである。一態様では、切断可能な結合は、好ましくは結合した切断誘導部分の1000nm以内にあり、好ましくは20〜200nm以内に存在する。より好ましくは、一重項酸素を発生させる光増感剤の切断誘導部分については、切断可能な結合は、受容体複合体中の光増感剤の約20〜100nm以内にある。切断誘導部分が、切断可能な結合を効率よく切断する(すなわち、検出可能なシグナルを生じるのに十分な分子タグを切断する)ことができる範囲を、本明細書において、その「有効な近接範囲」と称する。特定の増感剤の有効な近接範囲は、特定のアッセイ設計の詳細に依存しうること、そして日常的な実験によってそれを決定または改変することができることは当業者が認識するところである。
増感剤とは、反応中間体、または反応種、通常は一重項酸素を発生するよう誘導されうる化合物である。好ましくは、本発明に従って使用する増感剤は、光増感剤である。本発明の範囲に含まれる他の増感剤は、熱、光、電離放射線、または化学的活性化によって励起の際に一重項酸素の分子を遊離する化合物である。この種の化合物のうち最もよく知られているものとしては、1,4−ビスカルボキシエチル−1,4−ナフタレンエンドペルオキシド、9,10−ジフェニルアントラセン−9,10−エンドペルオキシド、5,6,11,12−テトラフェニルナフタレン5,12−エンドペルオキシドなどのエンドペルオキシドが挙げられる。加熱またはこれらの化合物による光の直接吸収によって、一重項酸素が遊離する。さらなる増感剤が下記の参照文献中に開示されている:Di Mascioら、FEBS Lett.、355:287(1994)(ペルオキシダーゼおよびオキシゲナーゼ);Kanofsky、J. Biol. Chem.258:5991−5993(1983)(ラクトペルオキシダーゼ);Pierlotら、Meth. Enzymol.、319:3−20(2000)(エンドペルオキシドの熱溶解)など。切断誘導部分との結合作用因子の結合は、直接的でも間接的でも、共有結合でも非共有結合でもよく、文献において通常使用される周知の技術によってそれを行うことができる。例えば、「Immobilized Enzymes」、Ichiro Chibata、Halsted Press、New York(1978);Cuatrecasas、J. Biol. Chem.、245:3059(1970)を参照されたい。
上記で述べたように、本発明による好ましい切断誘導部分は、一重項酸素を生成する光増感剤である。本明細書において、「光増感剤」とは、光によって活性化されたとき、酸素分子を一重項酸素に変換する光吸収分子を指す。共有結合または非共有結合を介して、クラス特異的な試薬の結合性作用因子に、直接的にまたは間接的に光増感剤を結合することができる。そのような組成物を構築するための、特に結合作用因子としての抗体に関する手引きは、例えば、光線力学療法、免疫診断などの分野の文献において入手できる。以下は例示的な参照文献である:Ullmanら、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 91、5426−5430(1994);Strongら、Ann. New York Acad. Sci.、745:297−320(1994);Yarmushら、Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst.、10:197−252(1993);Peaseら、米国特許第5,709,994号;Ullmanら、米国特許第5,340,716号;Ullmanら、米国特許第6,251,581号;McCapra、米国特許第5,516,636号など。
光増感剤を光活性化して一重項酸素を生成させるために、多様な光源を使用することができる。実際の持続時間中に十分な一重項酸素を産生させるために光源が十分強い限り、多色光源も単色光源も使用することができる。照射の長さは、光増感剤の性質、切断可能な結合の性質、照射源の出力、試料からのその距離などに依存する。一般に、照射時間は、約1マイクロ秒未満〜約10分ほどの長さでよく、通常は約1ミリ秒〜約60秒の範囲である。照射の強さおよび長さは、光増感剤分子の少なくとも約0.1%を、通常は光増感剤分子の少なくとも約30%を、好ましくは、光増感剤分子の実質上すべてを励起するのに十分であるべきである。例示的な光源としては、例示の目的であって限定するものではないが、例えば、ヘリウムネオンレーザー、アルゴンレーザー、YAGレーザー、He/Cdレーザー、およびルビーレーザーなどのレーザー;光ダイオード;水銀、ナトリウムおよびキセノン放電ランプ;例えば、タングステンやタングステン/ハロゲンなどの白熱ランプ;閃光ランプなどが挙げられる。例として、Bjornsonら、国際特許公開WO03/051669で開示されている光活性化装置を使用する。簡潔に述べると、その光活性化装置は、一連の発光ダイオード(LED)が筐体中に取り付けられたものであり、96穴プレート中のすべてのウェルを同時照明することを可能にするものである。本発明での使用に適したLEDは、OPTO DIODE CORP.(Newbury Park、CA)製のモデルOD−880Wなどの、高出力のGaAIAs IRエミッターである。
本発明で使用することができる光増感剤の例は、上記の特性を有し、下記の参照文献中に列挙されているものである:SinghおよびUllman、米国特許第5,536,834号;Liら、米国特許第5,763,602号;Martinら、Methods Enzymol.、186:635−645(1990);Yarmushら、Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst.、10:197−252(1993);Peaseら、米国特許第5,709,994号;Ullmanら、米国特許第5,340,716号;Ullmanら、米国特許第6,251,581号;McCapra、米国特許第5,516,636号;Thetford、欧州特許公開第0484027号;Sesslerら、SPIE、1426:318−329(1991);Magdaら、米国特許第5,565,552号;Roelant、米国特許第6,001,673号など。
増感剤の場合と同様に、特定の実施形態では、固相支持体の表面に共有結合または非共有結合させ、あるいは支持体の内部に組み込むことによって、光増感剤を固相支持体に結合することができる。一般に、必要量の一重項酸素を産生するのに必要な量の光増感剤を、支持体に結合する。一般に、光増感剤の量は、経験的に決定される。
一実施形態では、例えば、Peaseら、米国特許第5,709,994号;Pollner、米国特許第6,346,384号;およびPeaseら、PCT公開WO01/84157に開示されるようにして、光増感剤をラテックス粒子中に組み込んで光増感剤ビーズを形成する。あるいは、J. Amer. Chem. Soc.、97:3741(1975)に記載のようにして、ラテックス上のクロロメチル基によってローズベンガルなどの光増感剤を0.5ミクロンのラテックスビーズに共有結合させてエステル結合基をもたらすことにより、光増感剤ビーズを調製することもできる。そのような光増感剤ビーズの使用を、図3Cに図示する。ヘテロ二重体の検出について図1Cに記載したように、試薬(1122)を試料と混合した後、複合体(330)が形成する。例えば、ウェルの1つの壁、例えば底を形成する、吸引することによって試薬の除去を可能にするフィルター膜を有する、従来の96穴または384穴マイクロタイタープレートなどの中で、この反応を行うことができる。結合性化合物の特異的な結合に必要なバッファーが、一重項酸素の発生または分離に必要なバッファーと異なる場合、これによってバッファーの便利な交換が可能となる。例えば、抗体に基づく結合性化合物の場合、高塩バッファーが必要である。遊離したタグを電気泳動で分離する場合、バッファーを、電気泳動に適したより低い塩濃度のものに交換することによって、より良好な成果が得られる。この実施形態では、光増感剤を抗体などの結合性化合物と直接結合する代わりに、切断性プローブが2つの成分:ビオチン(図3Cで「bio」として示す)などの捕獲部分で誘導体化された抗体(332)と、アビジンやストレプトアビジンなどの、その捕獲部分と特異的に結合する作用因子(334)でその表面が誘導体化された光増感剤ビーズ(338)を、含む。次いでビオチン(336)などの捕獲部分により、光増感剤ビーズによって複合体(330)を捕獲(335)する。好都合なことに、光増感剤ビーズ(338)が通過できないようにフィルター膜の孔の直径を選択した場合、バッファーの交換は、結合していない結合性化合物を除去するようにも働き、それによってシグナルが改善する。分離に適したバッファーを加えた後、必要なら、一重項酸素が発生(342)し分子タグが遊離(344)するように、光増感剤ビーズ(338)に照射する。次いでそのような遊離した分子タグ(346)を分離して、分離プロファイル(352)を形成し、ピーク(348)および(350)から二量体をレシオメトリーで定量する。光感受性ビーズは、均一アッセイ形式で使用することもでき、あるいは不均一アッセイ形式で使用することもできる。
好ましくは、細胞表面受容体などの分析物または抗原を固定試料において検出する場合、切断性プローブは、第1のハプテン化抗体と、複数の光増感剤分子で誘導体化した第2の抗ハプテン結合タンパク質とを含みうる。好ましい第1のハプテン化抗体は、ビオチン化抗体であり、好ましい第2の抗ハプテン結合タンパク質は、抗ビオチン抗体でもよく、ストレプトアビジンでもよい。そのような第1と第2の試薬の他の組合せは、当技術分野で周知である、例えば、Haugland、Handbook of Fluorescent Probes and Research Reagents、第9版(Molecular Probes、Eugene、OR、2002)。そのような試薬の組合せの例を図3Eに図示する。遊離可能なタグ(図中の「mT1」および「mT2」)を有するそれらの結合性化合物(366および368)、およびビオチン(369)で誘導体化された第1の抗体(368)は、膜(360)中の受容体二量体(362)の異なるエピトープと特異的に結合する。ビオチン特異的な結合タンパク質(370)、例えばストレプトアビジンは、ビオチン(369)と結合し、それにより複数の光増感剤(372)を、結合性化合物(366および368)の有効な近接範囲中へと導く。ビオチン特異的結合タンパク質(370)はまた、抗ビオチン抗体でもよく、例えば、Hermanson(上記で引用)のような従来の結合化学反応によって、タンパク質上の遊離アミン基を介して光増感剤を結合することができる。そのような使用についての光増感剤の例は、Shimadzuら、欧州特許公報第0510688号中で開示されるようにして調製したメチレンブルーのNHSエステルである。
アッセイ条件
方法ならびに特定の条件および材料についての下記の概論は、例示の目的であって限定するものではない。当業者であれば、特に、異なる試料、細胞型および標的複合体を用いた他の適用例に、本明細書に記載の方法をどのように適合することができるかは理解できるであろう。
方法ならびに特定の条件および材料についての下記の概論は、例示の目的であって限定するものではない。当業者であれば、特に、異なる試料、細胞型および標的複合体を用いた他の適用例に、本明細書に記載の方法をどのように適合することができるかは理解できるであろう。
本発明の方法を行う際に、試験する試料、結合性化合物、および場合によっては切断性プローブを含めたアッセイの構成成分を混合する。一般に、アッセイの構成成分は、どんな順に混合してもよい。しかし、特定の適用例では、加える順番が重要である可能性がある。例えば、定量的アッセイなどで、競合的結合をモニターすることが望まれる場合がある。あるいは、組み立てた複合体の安定性をモニターすることが望まれる場合もある。そのような適用例では、完全な混合物を構築する前に、あるいは切断反応を開始する前に、反応物を段階的に構築し、さらにインキュベーションすることが必要となることがある。
各試薬の量は、通常は経験的に決定される。アッセイで用いる試料の量は、存在する標的複合体の推定数、およびアッセイのシグナルをモニターするのに使用する分離および検出手段によって決定される。一般に、結合性化合物および切断性プローブの量は、試料中の標的分子の予想量と比べてモル過剰となる量で、通常は少なくとも1.5倍のモル過剰で、より望ましくは約10倍以上のモル過剰で、提供される。特定の適用例では、使用する濃度は、結合作用因子の親和性および単一の細胞上に存在する標的分子の予想数に応じて、より高くてもより低くてもよい。オリゴマー細胞表面複合体の形成に対する化合物の効果を決定しようとする場合、モニターする効果に応じて、プローブを添加する前に、それと同時に、またはその後に化合物を細胞に添加してもよい。
通常は水性培地中で、一般に約10〜200mMの範囲の濃度のバッファーによって維持された生理的pH(細胞が培養物であるpHと同等)でプローブが細胞表面分子と結合するようにする条件下で、アッセイ混合物を混合しインキュベートする。従来のバッファー、ならびに塩、増殖培地、安定化剤などの必要に応じた他の従来の付加物を使用することができる。生理的かつ一定の温度を通常使用する。インキュベーションの温度は、一般に約4℃〜70℃の範囲、通常は約15℃〜45℃、より通常には25℃〜37℃である。
アッセイ混合物を構築し、インキュベートして、プローブを細胞表面分子に結合させた後、その混合物を処理して切断作用因子を活性化し、切断作用因子の有効な近接範囲内にある結合性化合物からタグを切断して、細胞表面から対応するタグを溶液中に遊離させる。この処理の性質は、切断作用因子の作用機序によって決まる。例えば、光増感剤を切断作用因子として使用する場合、切断の活性化は、使用する特定の増感剤に適した光の波長での混合物の照射を含む。
切断後、次いで試料を分析して、遊離したタグの正体を判定する。複数の結合性化合物を使用するアッセイを使用する場合、遊離したタグの分離は、一般にその検出の前に行う。分離と検出のどちらの方法も、アッセイ用のタグを設計するプロセス中で決定する。分離の好ましい様式は、種々のタグが、その電気泳動移動度における既知の差に基づいて分離される電気泳動を、使用する。
上記で述べたように、いくつかの実施形態では、そのアッセイ反応条件が、使用する分離技術に干渉する可能性がある場合、分子タグを切断し分離する前に、アッセイ反応バッファーの除去または交換を必要としうる。例えば、アッセイ条件には、電気泳動移動度に基づいて分子タグを分離する際に分離能を低下させる(例えば特異的結合に必要な)塩濃度が含まれうる。したがって、そのような高塩バッファーを、例えば分子タグを切断する前に除去し、ろ過、吸引、希釈、または他の手段によって電気泳動での分離に適した他のバッファーと置換してもよい。
実施例で使用する材料の供給元
Her受容体に特異的な抗体、アダプター分子、ならびに標準化用標準品は、Labvision、Cell Signaling Technology、BD Biosciencesなどの販売業者から得られる。すべての細胞系は、ATCCから購入した。すべての急速凍結されたヒト組織試料は、William Bainbridge Genome Foundation(Seattle、WA)もしくはBio Research Support(Boca Raton、FL)から購入し、供給者側でInstitutional Research Board;治験審査委員会(IRB)によって承認された。
Her受容体に特異的な抗体、アダプター分子、ならびに標準化用標準品は、Labvision、Cell Signaling Technology、BD Biosciencesなどの販売業者から得られる。すべての細胞系は、ATCCから購入した。すべての急速凍結されたヒト組織試料は、William Bainbridge Genome Foundation(Seattle、WA)もしくはBio Research Support(Boca Raton、FL)から購入し、供給者側でInstitutional Research Board;治験審査委員会(IRB)によって承認された。
下記で使用される分子タグ−抗体結合体は、従来の手順を用いて分子タグのNHSエステルを記載の抗体上の遊離アミンと反応させることによって形成される。その「Pro N」の表記によって下記で特定する分子タグは、次の参考文献:Singhらによる米国特許出願公開第2003/017,915号および米国特許出願公開第2002/0,013,126号(これらは参照により組み込む)の中で開示されている。簡単に言えば、下記の結合性化合物は、従来の反応において分子タグのNHSエステルを抗体の遊離アミンと反応させることによって形成される分子タグ−モノクローナル抗体結合体である。
実施例1
Her2ヘテロ二量体化および受容体リン酸化についての細胞溶解液の解析
本実施例では、Her1−Her2およびHer2−Her3のヘテロ二量体ならびにリン酸化状態は、様々な濃度の上皮成長因子(EGF)およびヘレグリン(HRG)で処理した後の数種類の細胞系由来の細胞溶解液において測定される。下記に示すように、3種類の結合性化合物および切断性プローブを用いて測定を行う。
Her2ヘテロ二量体化および受容体リン酸化についての細胞溶解液の解析
本実施例では、Her1−Her2およびHer2−Her3のヘテロ二量体ならびにリン酸化状態は、様々な濃度の上皮成長因子(EGF)およびヘレグリン(HRG)で処理した後の数種類の細胞系由来の細胞溶解液において測定される。下記に示すように、3種類の結合性化合物および切断性プローブを用いて測定を行う。
試料調製:
1. 使用するまで一晩、血清飢餓状態で乳癌細胞系を培養する。
2. 10分間、37℃で培地中でEGFおよび/またはHRGによって細胞系を刺激する。すべての細胞系(例えば、MCF−7、T47D、SKBR−3)に対するEGF/HRGの典型的用量は、0、0.032、0.16、0.8、4、20、100nMであるが、BT20については例外的に、100nM EGFでは飽和に達しないために最大用量は500nMまで増加する。
3. 培地を吸引し、氷上に移し、溶解バッファーを添加してin situで細胞を溶解させる。
4. 溶解液をかき取り、マイクロチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間、微量遠心する(遠心分離はオプションである)。
5. 溶解液として上清を収集し、使用するまで−80℃で保存するため小分けする。
1. 使用するまで一晩、血清飢餓状態で乳癌細胞系を培養する。
2. 10分間、37℃で培地中でEGFおよび/またはHRGによって細胞系を刺激する。すべての細胞系(例えば、MCF−7、T47D、SKBR−3)に対するEGF/HRGの典型的用量は、0、0.032、0.16、0.8、4、20、100nMであるが、BT20については例外的に、100nM EGFでは飽和に達しないために最大用量は500nMまで増加する。
3. 培地を吸引し、氷上に移し、溶解バッファーを添加してin situで細胞を溶解させる。
4. 溶解液をかき取り、マイクロチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間、微量遠心する(遠心分離はオプションである)。
5. 溶解液として上清を収集し、使用するまで−80℃で保存するため小分けする。
アッセイ:
アッセイデザイン:図4Aに図示するように、Her2−Her3ヘテロ二量体(900)は、切断性プローブ(902)と結合性化合物(904)、(906)および(908)の結合に基づき、レシオメトリーによって定量される。「PS」で表す光増感剤は、アビジン−ビオチン結合を介して切断性プローブ(902)に結合され、結合性化合物(904)、(906)および(908)は、分子タグのPro14、Pro10およびPro11のそれぞれによって標識されている。結合性化合物(904)は、Her3上のリン酸化部位に対して特異的である。
アッセイデザイン:図4Aに図示するように、Her2−Her3ヘテロ二量体(900)は、切断性プローブ(902)と結合性化合物(904)、(906)および(908)の結合に基づき、レシオメトリーによって定量される。「PS」で表す光増感剤は、アビジン−ビオチン結合を介して切断性プローブ(902)に結合され、結合性化合物(904)、(906)および(908)は、分子タグのPro14、Pro10およびPro11のそれぞれによって標識されている。結合性化合物(904)は、Her3上のリン酸化部位に対して特異的である。
アッセイ総容量は40μlである。溶解液容量は、溶解バッファーによって30μlに調節される。抗体を溶解バッファー中に10μlになるまで希釈する。通常、約5000〜15000細胞相当の溶解液を反応ごとに用いる。検出限界は、約1000細胞相当の溶解液である。
手順:予備混合した結合性化合物(すなわち、分子タグまたはビオチン−抗体結合体)の反応液中の最終濃度は以下の通りである:
Pro4 抗Her2:0.1μg/ml
Pro10 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1μg/ml
ビオチン 抗Her2:1〜2μg/ml
Pro4 抗Her2:0.1μg/ml
Pro10 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1μg/ml
ビオチン 抗Her2:1〜2μg/ml
1. 96ウェルをアッセイするために、10μl抗体混合物を30μl溶解液に添加し、室温で1時間インキュベートする。
2. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 2μl(最終2μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
3. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
4. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
5. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
6. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
8. 22cmのキャピラリーを備えるABI3100 CE機器を用いた解析のために各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す(注入条件:5kV、75秒、30℃;稼動条件:600秒、30℃)。
3. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
4. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
5. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
6. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
8. 22cmのキャピラリーを備えるABI3100 CE機器を用いた解析のために各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す(注入条件:5kV、75秒、30℃;稼動条件:600秒、30℃)。
アッセイバッファーは以下のとおりである。
溶解バッファー(新たに作製し、氷上で保存)
最終 μl ストック液
1% Triton X−100 1000 10%
20mMトリス塩酸(pH7.5) 200 1M
100mM NaCl 200 5M
50mM NaF 500 1M
50mM βグリセロリン酸Na 1000 0.5M
1mM Na3VO4 100 0.1M
5mM EDTA 100 0.5M
10μg/ml ペプスタチン 100 1mg/ml
1錠(10ml当たり)Roche Completeプロテアーゼ阻害剤
(#1836170) N/A N/A
水 6500 N/A
総量10ml
最終 μl ストック液
1% Triton X−100 1000 10%
20mMトリス塩酸(pH7.5) 200 1M
100mM NaCl 200 5M
50mM NaF 500 1M
50mM βグリセロリン酸Na 1000 0.5M
1mM Na3VO4 100 0.1M
5mM EDTA 100 0.5M
10μg/ml ペプスタチン 100 1mg/ml
1錠(10ml当たり)Roche Completeプロテアーゼ阻害剤
(#1836170) N/A N/A
水 6500 N/A
総量10ml
洗浄用バッファー(4℃で保存)
最終 ml ストック液
1% NP−40 50 10%
1×PBS 50 10×
150mM NaCl 15 5M
5mM EDTA 5 0.5M
水 380 N/A
総量500ml
最終 ml ストック液
1% NP−40 50 10%
1×PBS 50 10×
150mM NaCl 15 5M
5mM EDTA 5 0.5M
水 380 N/A
総量500ml
イルミネーションバッファー:
最終 μl ストック液
0.005×PBS 50 1×
CE標準 3 100×
10mMトリス塩酸(pH8.0) 0.1M
10pM A160 1nM
10pM A315 1nM
10pM HABA 1nM
水 10,000 N/A
総量10ml
最終 μl ストック液
0.005×PBS 50 1×
CE標準 3 100×
10mMトリス塩酸(pH8.0) 0.1M
10pM A160 1nM
10pM A315 1nM
10pM HABA 1nM
水 10,000 N/A
総量10ml
データ解析:
1. CE参照標準A315(電気泳動分離の際にアッセイ由来の分子タグに対して既知のピーク位置を有するフルオレセイン誘導体化デオキシアデノシン一リン酸)に対する各分子タグの相対蛍光単位(RFU)シグナルを標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを対応する分子タグシグナルから差し引く。
3. Her1またはHer3に対するヘテロ二量体化を、ビオチン−抗Her2を用いたアッセイウェル由来のPro4 抗Her2からのRFUに対するレシオメトリーによる対応RFUとして記録する。
4. Her1、2、3に対する受容体リン酸化を、ビオチン−抗Her2を用いたアッセイウェル由来のPro4 抗Her2からのRFUに対するレシオメトリーによるPro2 PT100抗ホスホチロシンからのRFUとして記録する。
1. CE参照標準A315(電気泳動分離の際にアッセイ由来の分子タグに対して既知のピーク位置を有するフルオレセイン誘導体化デオキシアデノシン一リン酸)に対する各分子タグの相対蛍光単位(RFU)シグナルを標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを対応する分子タグシグナルから差し引く。
3. Her1またはHer3に対するヘテロ二量体化を、ビオチン−抗Her2を用いたアッセイウェル由来のPro4 抗Her2からのRFUに対するレシオメトリーによる対応RFUとして記録する。
4. Her1、2、3に対する受容体リン酸化を、ビオチン−抗Her2を用いたアッセイウェル由来のPro4 抗Her2からのRFUに対するレシオメトリーによるPro2 PT100抗ホスホチロシンからのRFUとして記録する。
図4B〜4Hに、このアッセイ結果を示す。図4Bは、Her1−Her2ヘテロ二量体の量がEGF濃度の上昇に伴ってMCF−7細胞上で増加する一方で、同二量体の量がHRG濃度の上昇に伴って本質的に何の変化も示さないことを示す。図4Cは、Her2−Her3ヘテロ二量体についての逆の結果を示す。すなわち、Her2−Her3ヘテロ二量体の量は、HRG濃度の上昇に伴ってMCF−7細胞上で増加する一方で、同二量体の量がEGF濃度の上昇に伴って本質的に何の変化も示さない。図4Dおよび4Eは、Her1−Her2ヘテロ二量体の量がEGF濃度の上昇に伴ってSKBR−3細胞およびBT−20細胞のそれぞれにおいて増加することを示す。
実施例2
Her2ヘテロ二量体化および受容体リン酸化についての組織溶解液の解析
本実施例では、ヒト乳癌検体由来の組織溶解液においてHer1−Her2およびHer2−Her3のヘテロ二量体ならびにリン酸化状態を測定する。
Her2ヘテロ二量体化および受容体リン酸化についての組織溶解液の解析
本実施例では、ヒト乳癌検体由来の組織溶解液においてHer1−Her2およびHer2−Her3のヘテロ二量体ならびにリン酸化状態を測定する。
試料調製:
1. 切断により凍結状態で急速凍結組織を機械的に破壊する。
2. 組織をマイクロチューブに移し、(付録Iからの)溶解バッファーの3倍組織容量を添加してから、ボルテックスして組織をバッファーに分散させる。
3. 間欠的にボルテックスして混合しながら氷上で30分間インキュベートする。
4. 14,000rpm、4℃で20分間遠心分離する。
5. 溶解液として上清を収集し、少量のアリコートを用いたBCAアッセイ(Pierce)を用いて総タンパク質濃度を決定する。
6. 使用するまで−80℃で保存するため、残りを小分けする。
1. 切断により凍結状態で急速凍結組織を機械的に破壊する。
2. 組織をマイクロチューブに移し、(付録Iからの)溶解バッファーの3倍組織容量を添加してから、ボルテックスして組織をバッファーに分散させる。
3. 間欠的にボルテックスして混合しながら氷上で30分間インキュベートする。
4. 14,000rpm、4℃で20分間遠心分離する。
5. 溶解液として上清を収集し、少量のアリコートを用いたBCAアッセイ(Pierce)を用いて総タンパク質濃度を決定する。
6. 使用するまで−80℃で保存するため、残りを小分けする。
アッセイデザイン:
1. アッセイ総容量は40μlである。
2. 溶解液を総量相当で40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31μgの連続滴定系列で試験し、容量は溶解バッファーで30μlに調節する。滴定系列から得られるデータによって、二量体化またはリン酸化シグナルの特異性が確認される。
3. 溶解バッファー中に希釈されるすべてのeTag−抗体を含むユニバーサル抗体混合物は、後述の濃度で使用される。
4. 各受容体に対する個々のビオチン抗体は、これらの反応に別々に添加する。
5. 各組織溶解液を用いて3種のeTagアッセイを実施する。この場合、各アッセイは、被測定対象である特異的受容体二量体化に対応する種々のビオチン抗体を使用する。
6. 各受容体の発現レベルは、受容体に特異的なビオチン抗体を含む種々のアッセイから決定される。
7. 二量体化およびリン酸化シグナルは、ビオチン−抗Her2を含むアッセイにおいてのみ、レシオメトリーによって決定される。
1. アッセイ総容量は40μlである。
2. 溶解液を総量相当で40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31μgの連続滴定系列で試験し、容量は溶解バッファーで30μlに調節する。滴定系列から得られるデータによって、二量体化またはリン酸化シグナルの特異性が確認される。
3. 溶解バッファー中に希釈されるすべてのeTag−抗体を含むユニバーサル抗体混合物は、後述の濃度で使用される。
4. 各受容体に対する個々のビオチン抗体は、これらの反応に別々に添加する。
5. 各組織溶解液を用いて3種のeTagアッセイを実施する。この場合、各アッセイは、被測定対象である特異的受容体二量体化に対応する種々のビオチン抗体を使用する。
6. 各受容体の発現レベルは、受容体に特異的なビオチン抗体を含む種々のアッセイから決定される。
7. 二量体化およびリン酸化シグナルは、ビオチン−抗Her2を含むアッセイにおいてのみ、レシオメトリーによって決定される。
アッセイ対照:MCF−10AおよびMCF−7細胞系は、それぞれ定性的な陰性対照および陽性対照として用いられる。細胞系は、100nM EGFまたは100nM HRGによって刺激されないか、もしくは刺激される。溶解バッファーは、組織試料を置換する際に、バックグラウンド対照として含まれる。
反応における予備混合された抗体の最終濃度:
ユニバーサル抗体混合物:
Pro4 抗Her2:0.1μg/ml
Pro10 抗Her1:0.05μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.01μg/ml
個々のビオチン抗体:
ビオチン 抗Her1:2μg/ml
ビオチン 抗Her2:2μg/ml
ビオチン 抗Her3:2μg/ml
ユニバーサル抗体混合物:
Pro4 抗Her2:0.1μg/ml
Pro10 抗Her1:0.05μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.01μg/ml
個々のビオチン抗体:
ビオチン 抗Her1:2μg/ml
ビオチン 抗Her2:2μg/ml
ビオチン 抗Her3:2μg/ml
手順:
1. ビオチン抗体をユニバーサル抗体混合物に添加することによって抗体反応混合物を調製する。
2. 96ウェルをアッセイするために、10μlのユニバーサル反応混合物を30μlの溶解液に添加し、室温で1時間インキュベートする。
3. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 2μl(最終2μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
4. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
5. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
6. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
8. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
9. 22cmのキャピラリーを備えるABI3100キャピラリー電気泳動機器を用いた解析のために、各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す(注入条件:5kV、75秒、30℃;稼動条件:600秒、30℃)。
1. ビオチン抗体をユニバーサル抗体混合物に添加することによって抗体反応混合物を調製する。
2. 96ウェルをアッセイするために、10μlのユニバーサル反応混合物を30μlの溶解液に添加し、室温で1時間インキュベートする。
3. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 2μl(最終2μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
4. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
5. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
6. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
8. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
9. 22cmのキャピラリーを備えるABI3100キャピラリー電気泳動機器を用いた解析のために、各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す(注入条件:5kV、75秒、30℃;稼動条件:600秒、30℃)。
データ解析:
1. CE参照標準A315に対する各分子タグのRFUシグナルを標準化する。
2. シグナルが低すぎて信頼性が低いので、(二量体化またはリン酸化用にそれぞれ)RFUのカットオフ値を決める。ここでカットオフ値に満たないと比は算出されない。カットオフ値未満では、試験対象の溶解液希釈系列においてRFUシグナルは滴定不可能である。同値は、二量体化およびリン酸化シグナルがないかまたは最低レベルであると見られる一連の多数の正常組織を用いて決定可能である。また、これらの値は、腫瘍組織と比較される正常組織における二量体化またはリン酸化の基準レベルを示す。
3. RFU値がカットオフ値を超える少数の正常組織については(もし存在するならば)、検出対象のHer1あるいはHer3のヘテロ二量体化またはリン酸化のピークの個々のRFUレベルおよびレシオメトリー読取値を決定する。これらの試料は、スコアリングの際、対応する腫瘍組織試料に対して適合するドナー対照として用いられるべき外れ値を示す。
4. 滴定可能なRFUシグナルを示すすべての腫瘍試料については、組織溶解液滴定系列由来のHer1、Her2、Her3のそれぞれ、またはリン酸化の最低値のシグナルをバックグラウンドとして使用する。このバックグラウンドを高用量の溶解液(例えば40μg)の分子タグシグナルから差し引き、特異的RFUシグナルを得る。もし滴定系列においてシグナル用量反応が得られなければ、すべてのシグナル(通常、極めて低い)がバックグラウンドであると考えられ、レシオメトリー解析に使用できる特異的シグナルはない。
5. Her1またはHer3のヘテロ二量体化を、Pro4 抗Her2からの特異的RFUに対するレシオメトリーによる対応する特異的RFUとして記録する。もし特異的RFUが得られなければ、二量体化は陰性である。
6. Her1、2、3に対する受容体リン酸化を、Pro4 抗Her2からの特異的RFUに対するレシオメトリーによるPro2 抗ホスホチロシンからの特異的RFUとして記録する。もし特異的RFUが得られなければ、リン酸化は陰性である。
1. CE参照標準A315に対する各分子タグのRFUシグナルを標準化する。
2. シグナルが低すぎて信頼性が低いので、(二量体化またはリン酸化用にそれぞれ)RFUのカットオフ値を決める。ここでカットオフ値に満たないと比は算出されない。カットオフ値未満では、試験対象の溶解液希釈系列においてRFUシグナルは滴定不可能である。同値は、二量体化およびリン酸化シグナルがないかまたは最低レベルであると見られる一連の多数の正常組織を用いて決定可能である。また、これらの値は、腫瘍組織と比較される正常組織における二量体化またはリン酸化の基準レベルを示す。
3. RFU値がカットオフ値を超える少数の正常組織については(もし存在するならば)、検出対象のHer1あるいはHer3のヘテロ二量体化またはリン酸化のピークの個々のRFUレベルおよびレシオメトリー読取値を決定する。これらの試料は、スコアリングの際、対応する腫瘍組織試料に対して適合するドナー対照として用いられるべき外れ値を示す。
4. 滴定可能なRFUシグナルを示すすべての腫瘍試料については、組織溶解液滴定系列由来のHer1、Her2、Her3のそれぞれ、またはリン酸化の最低値のシグナルをバックグラウンドとして使用する。このバックグラウンドを高用量の溶解液(例えば40μg)の分子タグシグナルから差し引き、特異的RFUシグナルを得る。もし滴定系列においてシグナル用量反応が得られなければ、すべてのシグナル(通常、極めて低い)がバックグラウンドであると考えられ、レシオメトリー解析に使用できる特異的シグナルはない。
5. Her1またはHer3のヘテロ二量体化を、Pro4 抗Her2からの特異的RFUに対するレシオメトリーによる対応する特異的RFUとして記録する。もし特異的RFUが得られなければ、二量体化は陰性である。
6. Her1、2、3に対する受容体リン酸化を、Pro4 抗Her2からの特異的RFUに対するレシオメトリーによるPro2 抗ホスホチロシンからの特異的RFUとして記録する。もし特異的RFUが得られなければ、リン酸化は陰性である。
図5A〜5Cに示されるデータは、本発明のアッセイによって試験した複数の患者の***組織試料の典型例である。10の腫瘍試料のうち9つについての免疫組織化学(DAKO社、Herceptest)から得た臨床的なHer2状態は陰性であり、それは、検出不能なHer2の染色、10%未満の腫瘍細胞の染色、または10%を超える腫瘍細胞の細胞膜部分における弱くほとんど認識できない染色のいずれかであることを示した。本発明のアッセイでは、正常組織および腫瘍組織の両方で、Her1、Her2およびHer3の発現が決定された。Her1とHer2のヘテロ二量体化およびHer2とHer3のヘテロ二量体化は、腫瘍組織においてのみ検出され、正常組織ではまったく検出されなかった。
実施例3
Her1またはHer2ホモ二量体化および受容体リン酸化についての細胞溶解液の解析
本質的に実施例2に記載されるようにして試料調製を行った。Her1ホモ二量体化は、細胞系をEGFまたはTGFαで処理することによって誘導された。リガンドを有しないHer2のホモ二量体化について、Her2を過剰発現する未刺激のSKBR−3細胞またはMDA−MD−453細胞を、Her2を低レベルで発現する未刺激のMCF−7細胞と比較する。
Her1またはHer2ホモ二量体化および受容体リン酸化についての細胞溶解液の解析
本質的に実施例2に記載されるようにして試料調製を行った。Her1ホモ二量体化は、細胞系をEGFまたはTGFαで処理することによって誘導された。リガンドを有しないHer2のホモ二量体化について、Her2を過剰発現する未刺激のSKBR−3細胞またはMDA−MD−453細胞を、Her2を低レベルで発現する未刺激のMCF−7細胞と比較する。
アッセイデザイン:受容体に特異的なモノクローナル抗体は、分子タグまたはビオチン(これはその後、アビジン架橋を介して光増感剤に結合される)のいずれかと別々に結合され、本実施例において切断性プローブと結合性化合物は同じエピトープへの結合に対して競合する。受容体上の重複するエピトープを認識する第2の抗体からなる別の結合性化合物が用いられ、それにより、レシオメトリーシグナルがホモ二量体化の尺度として生成されうる。第2の抗体由来のシグナルはまた、試料中の受容体の総量の測定値を提供する。受容体の総量は、別々のアッセイウェルにおいて決定される。受容体リン酸化は、ホモ二量体化もしくは総受容体量とともに定量可能である。
手順:アッセイ容量は40μlであり、一般的手順は実施例2と同様である。AとBの2個のアッセイウェルを各試料に対してセットアップし、ホモ二量体化と受容体総量を別々に定量する。
Her1−Her1ホモ二量体の定量用:
アッセイウェルAにおける抗体混合物の最終濃度:
Pro12 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
ビオチン 抗Her1:1〜2μg/ml
アッセイウェルBにおける抗体混合物の最終濃度:
Pro10 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1μg/ml
ビオチン 抗Her1:1〜2μg/ml
Her2−Her2ホモ二量体の定量用:
アッセイウェルAにおける抗体混合物の最終濃度:
Pro4 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
ビオチン 抗Her1:1〜2μg/ml
アッセイウェルBにおける抗体混合物の最終濃度:
Pro4 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1μg/ml
ビオチン 抗Her1:1〜2μg/ml
アッセイウェルAにおける抗体混合物の最終濃度:
Pro12 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
ビオチン 抗Her1:1〜2μg/ml
アッセイウェルBにおける抗体混合物の最終濃度:
Pro10 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1μg/ml
ビオチン 抗Her1:1〜2μg/ml
Her2−Her2ホモ二量体の定量用:
アッセイウェルAにおける抗体混合物の最終濃度:
Pro4 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
ビオチン 抗Her1:1〜2μg/ml
アッセイウェルBにおける抗体混合物の最終濃度:
Pro4 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1μg/ml
ビオチン 抗Her1:1〜2μg/ml
データ解析:
1. CE参照標準A315に対する各分子タグのRFUシグナルを標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを対応する分子タグシグナルから差し引く。
3. Her1またはHer2に対するホモ二量体化を、対応するアッセイウェルB由来の総受容体量の標準化RFUに対するレシオメトリー値として対応するアッセイウェルA由来の標準化RFUとして記録する。
4. Her1またはHer2ホモ二量体に対する受容体リン酸化を、同じアッセイウェルB由来の総受容体量からの標準化されたRFUに比率測定で対応する、アッセイウェルB由来のPro2 PT100抗リン酸化チロシンからの標準化されたRFUとして記録する。
1. CE参照標準A315に対する各分子タグのRFUシグナルを標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを対応する分子タグシグナルから差し引く。
3. Her1またはHer2に対するホモ二量体化を、対応するアッセイウェルB由来の総受容体量の標準化RFUに対するレシオメトリー値として対応するアッセイウェルA由来の標準化RFUとして記録する。
4. Her1またはHer2ホモ二量体に対する受容体リン酸化を、同じアッセイウェルB由来の総受容体量からの標準化されたRFUに比率測定で対応する、アッセイウェルB由来のPro2 PT100抗リン酸化チロシンからの標準化されたRFUとして記録する。
アッセイの結果は、図6A〜6Bおよび図7に示される。図6Aは、EGF濃度の上昇に伴ってBT−20細胞上のHer1−Her1ホモ二量体の量が増加することを示す。図6Bは、BT−20細胞におけるHer1リン酸化の量はEGF濃度の上昇に伴って増加することを示す。Her2−Her2ホモ二量体の検出は、Her2を発現するSKBR−3細胞からのシグナルを、細胞表面でのHer2を低減されたレベルで発現するMCF−7細胞からのシグナルと比較することによって示された。図7のグラフに示すように、特異的で滴定可能なHer2−Her2ホモ二量体シグナルは、MCF−7細胞について検出されなかった。一方、SKBR−3細胞由来のHer2−Her2ホモ二量体シグナルは、明らかにMCF−7細胞由来のシグナルを上回った。
実施例4
Her1−Her3ヘテロ二量体化および受容体リン酸化についての細胞溶解液の解析
試料は以下のように調製される。
Her1−Her3ヘテロ二量体化および受容体リン酸化についての細胞溶解液の解析
試料は以下のように調製される。
1. 使用するまで一晩、血清飢餓状態で乳癌細胞系を培養する。
2. 10分間、37℃で培地中でHRGによって細胞系を刺激する。T47D細胞に対するHRGの典型的用量は、0、0.032、0.16、0.8、4、20、100nMである。
3. 培地を吸引し、氷上に移し、溶解バッファーを添加してin situで細胞を溶解させる。
4. 溶解液をかき取り、マイクロチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間、微量遠心する(遠心分離はオプションである)。
5. 溶解液として上清を収集し、使用するまで−80℃で保存するために小分けする。
2. 10分間、37℃で培地中でHRGによって細胞系を刺激する。T47D細胞に対するHRGの典型的用量は、0、0.032、0.16、0.8、4、20、100nMである。
3. 培地を吸引し、氷上に移し、溶解バッファーを添加してin situで細胞を溶解させる。
4. 溶解液をかき取り、マイクロチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間、微量遠心する(遠心分離はオプションである)。
5. 溶解液として上清を収集し、使用するまで−80℃で保存するために小分けする。
アッセイデザイン:総アッセイ容量は40μlである。溶解液容量は、溶解バッファーによって30μlに調節する。抗体は、溶解バッファー中に5μlまで希釈する。通常、約5000〜50000細胞相当の溶解液を反応ごとに用いる。反応における予備混合された抗体の最終濃度は以下の通りである:
Pro10 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1μg/ml
ビオチン 抗Her3:1〜2μg/ml
1. 96ウェルをアッセイするために、5μlの抗体混合物を30μlの溶解液に添加し、室温で1時間インキュベートする。
2. ストレプトアビジン誘導体化分子バサミ 5μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
3. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
4. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
5. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
6. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
8. 22cmキャピラリーを備えるABI3100キャピラリー電気泳動機器を用いた解析のために各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す(注入条件:5kV、425秒、30℃;稼動条件:600秒、30℃)。
Pro10 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1μg/ml
ビオチン 抗Her3:1〜2μg/ml
1. 96ウェルをアッセイするために、5μlの抗体混合物を30μlの溶解液に添加し、室温で1時間インキュベートする。
2. ストレプトアビジン誘導体化分子バサミ 5μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
3. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
4. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
5. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
6. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
8. 22cmキャピラリーを備えるABI3100キャピラリー電気泳動機器を用いた解析のために各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す(注入条件:5kV、425秒、30℃;稼動条件:600秒、30℃)。
データ解析:
1. CE参照標準A315に対する各eTagレポーターのRFUシグナルを標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを対応するeTagレポーターシグナルから差し引く。
3. ヘテロ二量体化を、抗Her3由来のPro11 RFUに対するレシオメトリーによるHer1由来のPro10 RFUとして記録する。
4. Her1/3に対する受容体リン酸化を、ビオチン−抗Her3を用いたアッセイウェル由来のPro11 抗Her3からのRFUに対するレシオメトリーによるPro2 PT100抗ホスホチロシンからのRFUとして記録する。
1. CE参照標準A315に対する各eTagレポーターのRFUシグナルを標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを対応するeTagレポーターシグナルから差し引く。
3. ヘテロ二量体化を、抗Her3由来のPro11 RFUに対するレシオメトリーによるHer1由来のPro10 RFUとして記録する。
4. Her1/3に対する受容体リン酸化を、ビオチン−抗Her3を用いたアッセイウェル由来のPro11 抗Her3からのRFUに対するレシオメトリーによるPro2 PT100抗ホスホチロシンからのRFUとして記録する。
図8Aおよび8Bに、アッセイの結果を図示する。このデータは、Her1−Her3ヘテロ二量体化および二量体リン酸化の両方がHRG濃度の上昇に伴って増加することを示す。
実施例5
上皮成長因子の増加に応答した癌細胞系におけるHer1−Her3受容体二量体発現の増加
本実施例において、様々な濃度の上皮成長因子(EGF)を用いて処理した後、癌細胞系の22RvlおよびA549由来の細胞溶解液においてHer1−Her3ヘテロ二量体を測定する。下記に示すように、3種類の結合性化合物および切断性プローブを用いて測定を行う。
上皮成長因子の増加に応答した癌細胞系におけるHer1−Her3受容体二量体発現の増加
本実施例において、様々な濃度の上皮成長因子(EGF)を用いて処理した後、癌細胞系の22RvlおよびA549由来の細胞溶解液においてHer1−Her3ヘテロ二量体を測定する。下記に示すように、3種類の結合性化合物および切断性プローブを用いて測定を行う。
試料調製:
1. 使用するまで一晩、血清飢餓状態で乳癌細胞系を培養する。
2. 10分間、37℃で培地中でEGFによって細胞系を刺激する。両方の細胞系に適用するEGFの典型的用量は、0〜100nMの範囲で様々である。
3. 培地を吸引し、氷上に移し、溶解バッファーを添加してin situで細胞を溶解させる。
4. 溶解液をかき取り、マイクロチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間、微量遠心する(遠心分離はオプションである)。タンパク質濃度を決定する。
5. 溶解液として上清を収集し、使用するまで−80℃で保存するために小分けする。
1. 使用するまで一晩、血清飢餓状態で乳癌細胞系を培養する。
2. 10分間、37℃で培地中でEGFによって細胞系を刺激する。両方の細胞系に適用するEGFの典型的用量は、0〜100nMの範囲で様々である。
3. 培地を吸引し、氷上に移し、溶解バッファーを添加してin situで細胞を溶解させる。
4. 溶解液をかき取り、マイクロチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間、微量遠心する(遠心分離はオプションである)。タンパク質濃度を決定する。
5. 溶解液として上清を収集し、使用するまで−80℃で保存するために小分けする。
アッセイデザインは、次の例外を除いて図4Aでの説明と本質的に同一である。すなわち、結合性化合物(904)、(906)および(908)は、分子タグであるPro10、Pro11およびPro2のそれぞれで標識されている。アッセイ総容量は40μlである。溶解液容量は、溶解バッファーによって30μlに調節する。抗体は、溶解バッファー中で5μlまで希釈する。通常、約5000〜15000細胞相当の溶解液を反応ごとに用いる。検出限界は、約1000細胞相当の溶解液である。
手順:反応における予備混合された結合性化合物(すなわち、分子タグまたはビオチン−抗体結合体)の最終濃度は以下の通りである:
Pro10 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1〜0.2μg/ml
ビオチン 抗Her3:1〜2μg/ml
Pro10 抗Her1:0.05〜0.1μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.1〜0.2μg/ml
ビオチン 抗Her3:1〜2μg/ml
1. 96ウェルをアッセイするために、5μlの抗体混合物を30μlの溶解液に添加し、室温で1時間インキュベートする。
2. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 5μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
3. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
4. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
5. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
6. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
8. 22cmのキャピラリーを備えるABI 3100CE機器を用いた解析のために各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す(注入条件:5kV、70秒、30℃;稼動条件:425秒、30℃)。
2. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 5μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
3. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
4. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
5. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
6. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
8. 22cmのキャピラリーを備えるABI 3100CE機器を用いた解析のために各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す(注入条件:5kV、70秒、30℃;稼動条件:425秒、30℃)。
アッセイバッファーは以下のとおりである。
溶解バッファー(新たに作製し、氷上で保存)
最終 μl ストック液
1% Triton X−100 1000 10%
20mMトリス塩酸(pH7.5) 500 1M
100mM NaCl 200 5M
50mM NaF 500 1M
50mM βグリセロリン酸Na 500 1.0M
1mM Na3VO4 100 0.1M
5mM EDTA 100 0.5M
10μg/mlペプスタチン 100 1mg/ml
1錠(10ml当たり)Roche Completeプロテアーゼ阻害剤
(#1836170) N/A N/A
水 7ml N/A
総量10ml
最終 μl ストック液
1% Triton X−100 1000 10%
20mMトリス塩酸(pH7.5) 500 1M
100mM NaCl 200 5M
50mM NaF 500 1M
50mM βグリセロリン酸Na 500 1.0M
1mM Na3VO4 100 0.1M
5mM EDTA 100 0.5M
10μg/mlペプスタチン 100 1mg/ml
1錠(10ml当たり)Roche Completeプロテアーゼ阻害剤
(#1836170) N/A N/A
水 7ml N/A
総量10ml
洗浄用バッファー(4℃で保存):1×PBS中0.5% Triton X100
イルミネーションバッファー:
最終 μl ストック液
0.005×PBS 50 1×
CE標準1
(A27, ACLARA Biosciences,Inc., Mountain View, CA) 4 5000×
CE標準2(フルオレセイン) 4 5000×
水 9942 N/A
総量10ml
イルミネーションバッファー:
最終 μl ストック液
0.005×PBS 50 1×
CE標準1
(A27, ACLARA Biosciences,Inc., Mountain View, CA) 4 5000×
CE標準2(フルオレセイン) 4 5000×
水 9942 N/A
総量10ml
データ解析:
1. CE参照標準2に対する各分子タグの相対蛍光単位(RFU)シグナルを標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを対応する分子タグシグナルから差し引く。
3. Her1に対するヘテロ二量体化を、ビオチン−抗Her3を用いたアッセイウェル由来のPro11 抗Her3からのRFUに対応する比率のRFUとして記録する。
4. Her1、2、3に対する受容体リン酸化を、ビオチン−抗Her3を用いたアッセイウェル由来のPro11 抗Her3からのRFUに対するレシオメトリーによる、Pro2 PT100抗ホスホチロシンからのRFUとして記録する(データは示さない)。
1. CE参照標準2に対する各分子タグの相対蛍光単位(RFU)シグナルを標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを対応する分子タグシグナルから差し引く。
3. Her1に対するヘテロ二量体化を、ビオチン−抗Her3を用いたアッセイウェル由来のPro11 抗Her3からのRFUに対応する比率のRFUとして記録する。
4. Her1、2、3に対する受容体リン酸化を、ビオチン−抗Her3を用いたアッセイウェル由来のPro11 抗Her3からのRFUに対するレシオメトリーによる、Pro2 PT100抗ホスホチロシンからのRFUとして記録する(データは示さない)。
図9Aおよび9Bは、EGF濃度の上昇に伴う、22RvlおよびA549の細胞それぞれにおけるHer1−Her3ヘテロ二量体の数の増加を示す。
実施例6
***腫瘍組織溶解液におけるHer1、Her2およびHer3を有するIGF−1Rヘテロ二量体の産生
本実施例では、Her1−IGF−1R、Her2−IGF−1RおよびHer3−IGF−1R二量体の存在について、図4Aにて説明したものと本質的に同一のアッセイを用いて、12種のヒト***腫瘍組織由来の細胞をアッセイした。以下のように試料調製を行った:
1. 切断により凍結状態で急速凍結組織を機械的に破壊する。
2. 組織をマイクロチューブに移し、溶解バッファーの3倍組織容量を添加してから、ボルテックスして組織をバッファーに分散させる。
3. 間欠的にボルテックスして混合しながら氷上で30分間インキュベートする。
4. 14,000rpm、4℃で20分間遠心分離する。
5. 溶解液として上清を収集し、少量のアリコートを用いたBCAアッセイ(Pierce)によって総タンパク質濃度を決定する。
6. 使用まで−80℃で保存するために残りを小分けする。
***腫瘍組織溶解液におけるHer1、Her2およびHer3を有するIGF−1Rヘテロ二量体の産生
本実施例では、Her1−IGF−1R、Her2−IGF−1RおよびHer3−IGF−1R二量体の存在について、図4Aにて説明したものと本質的に同一のアッセイを用いて、12種のヒト***腫瘍組織由来の細胞をアッセイした。以下のように試料調製を行った:
1. 切断により凍結状態で急速凍結組織を機械的に破壊する。
2. 組織をマイクロチューブに移し、溶解バッファーの3倍組織容量を添加してから、ボルテックスして組織をバッファーに分散させる。
3. 間欠的にボルテックスして混合しながら氷上で30分間インキュベートする。
4. 14,000rpm、4℃で20分間遠心分離する。
5. 溶解液として上清を収集し、少量のアリコートを用いたBCAアッセイ(Pierce)によって総タンパク質濃度を決定する。
6. 使用まで−80℃で保存するために残りを小分けする。
アッセイを以下のように準備した。
1. アッセイ総容量は40μlである。
2. 溶解液を総量相当で40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31μgの連続滴定系列で試験し、容量は溶解バッファーで30μlに調節する。滴定系列から得られるデータにより、二量体化の特異性が確認される。
3. 溶解バッファー中に希釈されるすべての結合性化合物およびビオチン抗体を含むユニバーサル抗体混合物は、下記に示す濃度で使用される。
1. アッセイ総容量は40μlである。
2. 溶解液を総量相当で40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31μgの連続滴定系列で試験し、容量は溶解バッファーで30μlに調節する。滴定系列から得られるデータにより、二量体化の特異性が確認される。
3. 溶解バッファー中に希釈されるすべての結合性化合物およびビオチン抗体を含むユニバーサル抗体混合物は、下記に示す濃度で使用される。
反応における予備混合された抗体の最終濃度は以下の通りである:
Pro10 抗Her2:0.lμg/ml
Pro14 抗Her1:0.1μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro7 抗IGF−lR:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.2μg/ml
ビオチン 抗Her2:2μg/ml
Pro10 抗Her2:0.lμg/ml
Pro14 抗Her1:0.1μg/ml
Pro11 抗Her3:0.1μg/ml
Pro7 抗IGF−lR:0.1μg/ml
Pro2 抗ホスホチロシン:0.2μg/ml
ビオチン 抗Her2:2μg/ml
手順:
1. 96ウェルをアッセイするために、5μlのユニバーサル反応混合物を30μlの溶解液に添加し、室温で1時間インキュベートする。
2. ストレプトアビジン誘導体化分子バサミ 5μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
3. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
4. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
5. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
6. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
8. (i)CE機器:ABI3100、22cmキャピラリー、(ii)CE注入条件:5kV、70秒、30℃、および(iii)CE稼動条件:425秒、30℃を用いて、解析を行うため、各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す。
1. 96ウェルをアッセイするために、5μlのユニバーサル反応混合物を30μlの溶解液に添加し、室温で1時間インキュベートする。
2. ストレプトアビジン誘導体化分子バサミ 5μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、45分間インキュベートする。
3. 1%BSAを含むPBS 150μlを96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)に添加し、ブロッキングのために室温で1時間インキュベートする。
4. 真空吸引によってフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、真空にして空にする。
5. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
6. 200μlのイルミネーションバッファーを添加し、真空にして空にする。1回繰り返す。
7. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、20分間照射する。
8. (i)CE機器:ABI3100、22cmキャピラリー、(ii)CE注入条件:5kV、70秒、30℃、および(iii)CE稼動条件:425秒、30℃を用いて、解析を行うため、各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す。
データ解析:
1. CE参照標準1に対する各分子タグのRFUシグナルを標準化する。
2. 各分子タグに対する滴定可能なシグナルを探す。滴定されないシグナルは、非特異的シグナルと推定され、データ解釈に用いない。カットオフ値は、二量体化シグナルがないかまたは最低であると見られる一連の多数の正常組織から得られる値に基づいて決定される。また、これらの値は、腫瘍組織と比較される正常組織についての二量体化の基準レベルを示す。
3. Her1またはHer2またはHer3を有するIGF−1Rについて、対応する特異的RFUとしてヘテロ二量体化を記録する。
1. CE参照標準1に対する各分子タグのRFUシグナルを標準化する。
2. 各分子タグに対する滴定可能なシグナルを探す。滴定されないシグナルは、非特異的シグナルと推定され、データ解釈に用いない。カットオフ値は、二量体化シグナルがないかまたは最低であると見られる一連の多数の正常組織から得られる値に基づいて決定される。また、これらの値は、腫瘍組織と比較される正常組織についての二量体化の基準レベルを示す。
3. Her1またはHer2またはHer3を有するIGF−1Rについて、対応する特異的RFUとしてヘテロ二量体化を記録する。
図10A〜Cに示すように、アッセイした12の***腫瘍のうちの2つが、Her1−IGF−1R、Her2−IGF−1R、およびHer3−IGF−1Rのヘテロ二量体を発現した。各図中の線は、記載のヘテロ二量体に対して陽性であった2つの***腫瘍試料における、受容体ヘテロ二量体の測定量と溶解液のアッセイ量の間の傾向を示す。
実施例7
PI3K/Her3受容体活性化複合体
本実施例において、アッセイは、乳癌細胞系MCF−7中のHer2、Her3およびPI3Kを含む受容体複合体を測定するために、図11Aおよび11Cに示されるようにデザインされた。第1の分子タグ(図中の「mT1」および下記「eTag1」)を有する結合性化合物(1106)はHer3受容体(1102)の細胞外ドメインに対して特異的であり、第2の分子タグ(図中の「mT2」および下記「eTag2」)を有する結合性化合物(1110)はPI3Kタンパク質(1100)のp185成分(1111)に特異的であり、また結合した光増感剤を有する切断性プローブ(1108)はHer3受容体(1102)の細胞内ドメインに特異的である。ここで、「H2」はHer2受容体(1104)を示し、「H3」はHer3受容体(1102)を示し、「p85」および「p110」はH3のリン酸化部位(「P」で示される)にp85部分を介して結合するPI3キナーゼ(1100)の成分である。この2つのアッセイデザインは、図11Aのデザインにおいて切断性プローブがHer3受容体に特異的であり、図11Cのデザインにおいては切断性プローブがPI3キナーゼのp85成分に特異的であること以外は、類似している。これらのアッセイは以下のように実施された。
PI3K/Her3受容体活性化複合体
本実施例において、アッセイは、乳癌細胞系MCF−7中のHer2、Her3およびPI3Kを含む受容体複合体を測定するために、図11Aおよび11Cに示されるようにデザインされた。第1の分子タグ(図中の「mT1」および下記「eTag1」)を有する結合性化合物(1106)はHer3受容体(1102)の細胞外ドメインに対して特異的であり、第2の分子タグ(図中の「mT2」および下記「eTag2」)を有する結合性化合物(1110)はPI3Kタンパク質(1100)のp185成分(1111)に特異的であり、また結合した光増感剤を有する切断性プローブ(1108)はHer3受容体(1102)の細胞内ドメインに特異的である。ここで、「H2」はHer2受容体(1104)を示し、「H3」はHer3受容体(1102)を示し、「p85」および「p110」はH3のリン酸化部位(「P」で示される)にp85部分を介して結合するPI3キナーゼ(1100)の成分である。この2つのアッセイデザインは、図11Aのデザインにおいて切断性プローブがHer3受容体に特異的であり、図11Cのデザインにおいては切断性プローブがPI3キナーゼのp85成分に特異的であること以外は、類似している。これらのアッセイは以下のように実施された。
試料調製:
1. 使用するまで一晩、血清飢餓状態で乳癌細胞系を培養する。
2. 10分間、37℃で培地中でHRGによって細胞系を刺激する。MCF−7細胞に対するHRGの典型的用量は、0、0.032、0.16、0.8、4、20、100nMである。
3. 培地を吸引し、氷上に移し、溶解バッファーを添加して(上述)、in situで細胞を溶解させる。
4. 溶解液をかき取り、マイクロチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間、微量遠心する。
5. 溶解液として上清を収集し、使用するまで−80℃で保存するため小分けする。
1. 使用するまで一晩、血清飢餓状態で乳癌細胞系を培養する。
2. 10分間、37℃で培地中でHRGによって細胞系を刺激する。MCF−7細胞に対するHRGの典型的用量は、0、0.032、0.16、0.8、4、20、100nMである。
3. 培地を吸引し、氷上に移し、溶解バッファーを添加して(上述)、in situで細胞を溶解させる。
4. 溶解液をかき取り、マイクロチューブに移す。氷上で30分間インキュベートする。14,000rpm、4℃で10分間、微量遠心する。
5. 溶解液として上清を収集し、使用するまで−80℃で保存するため小分けする。
溶解バッファー(新たに作製し、氷上で保存):
最終 μl ストック液
1% Triton X−100 1000 10%
20mMトリス塩酸(pH7.5) 200 1M
100mM NaCl 200 5M
50mM NaF 500 1M
50mM βグリセロリン酸Na 1000 0.5M
1mM Na3VO4 100 0.1M
5mM EDTA 100 0.5M
10μg/ml ペプスタチン 100 1mg/ml
1錠(10ml当たり)Roche Completeプロテアーゼ阻害剤
(#1836170) N/A N/A
水 6500 N/A
総量10ml
最終 μl ストック液
1% Triton X−100 1000 10%
20mMトリス塩酸(pH7.5) 200 1M
100mM NaCl 200 5M
50mM NaF 500 1M
50mM βグリセロリン酸Na 1000 0.5M
1mM Na3VO4 100 0.1M
5mM EDTA 100 0.5M
10μg/ml ペプスタチン 100 1mg/ml
1錠(10ml当たり)Roche Completeプロテアーゼ阻害剤
(#1836170) N/A N/A
水 6500 N/A
総量10ml
アッセイデザイン:各図面に示された概略図に基づき、受容体複合体の形成をレシオメトリーで定量する。すなわち、このアッセイの読取値は、分子タグのピーク比率であるeTag2/eTag1である。
アッセイ総容量は40μlである。溶解液容量は、溶解バッファーによって10μlに調節される。抗体を溶解バッファー中に20μlになるまで希釈する。通常、約5000〜500000細胞相当の溶解液を反応ごとに用いる。
手順:反応に添加する前の、予備混合された抗体の使用濃度は下記の通りである:
Her3/PI3K複合体についてはHer3にて切断性プローブを用いる(図11Aのデザイン):
10nMのeTag1 抗Her3(本アッセイではeTag1がPro14)
10nMのeTag2 抗PI3K(本アッセイではeTag2がPro1)
20nMのビオチン 抗Her3
700nMのユニバーサル標準US−1
[ユニバーサル標準US−1は、ビオチンおよび分子タグPro8とコンジュゲート化したBSAであり、アッセイにおいてストレプトアビジン−光増感剤ビーズの量を標準化するのに用いる。]Hermanson(前記)などの従来手法を用いて、分子タグ前駆体のNHSエステル(図4A〜4Jを参照)を抗体上の遊離アミンと反応させることにより、分子タグを直接抗体に結合させた。
Her3/PI3K複合体についてはHer3にて切断性プローブを用いる(図11Aのデザイン):
10nMのeTag1 抗Her3(本アッセイではeTag1がPro14)
10nMのeTag2 抗PI3K(本アッセイではeTag2がPro1)
20nMのビオチン 抗Her3
700nMのユニバーサル標準US−1
[ユニバーサル標準US−1は、ビオチンおよび分子タグPro8とコンジュゲート化したBSAであり、アッセイにおいてストレプトアビジン−光増感剤ビーズの量を標準化するのに用いる。]Hermanson(前記)などの従来手法を用いて、分子タグ前駆体のNHSエステル(図4A〜4Jを参照)を抗体上の遊離アミンと反応させることにより、分子タグを直接抗体に結合させた。
Her3/PI3K複合体についてはPI3Kにて切断性プローブを用いる(図11Cのデザイン):
10nM eTag1 抗PI3K(このアッセイではeTag1がProl)
10nM eTag2 抗Her3(このアッセイではeTag2がPro14)
20nM ビオチン 抗PI3K
700nM ユニバーサル標準US−1
10nM eTag1 抗PI3K(このアッセイではeTag1がProl)
10nM eTag2 抗Her3(このアッセイではeTag2がPro14)
20nM ビオチン 抗PI3K
700nM ユニバーサル標準US−1
9. 96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)をアッセイするために、20μlの抗体混合物を10μlの溶解液に添加し、4℃で1時間インキュベートする。
10. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 10μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、40分間インキュベートする。
11. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。
12. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、照射する。
13. 解析のために各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す。
10. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 10μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、40分間インキュベートする。
11. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。
12. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、照射する。
13. 解析のために各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す。
データ解析:
5. 各分子タグの相対蛍光単位(RFU)シグナルを、内部ユニバーサル標準US−1のそれに対して標準化する。
6. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを、対応する標準化eTagレポーターシグナルから差し引く。
7. 標準化されたeTag2/eTag1シグナルのレシオメトリー値として、受容体複合体の形成を記録する(図11Bおよび11Dに示す)。
5. 各分子タグの相対蛍光単位(RFU)シグナルを、内部ユニバーサル標準US−1のそれに対して標準化する。
6. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを、対応する標準化eTagレポーターシグナルから差し引く。
7. 標準化されたeTag2/eTag1シグナルのレシオメトリー値として、受容体複合体の形成を記録する(図11Bおよび11Dに示す)。
実施例8
Shc/Her3受容体−アダプター相互作用
本実施例において、図12Aおよび12Cに示すようにアッセイをデザインした。図12Aでは、Her2受容体(1200)およびHer3受容体(1202)は、細胞表面膜(1204)中で二量体を形成し、各受容体はリン酸化部位(1209および1210)を有することが示される。Shcタンパク質(1206および1208)は、リン酸化部位(1210)および(1209)のそれぞれに結合する。第1の結合性化合物(1214)および切断性プローブ(1216)は、Her2受容体(1200)の細胞外ドメインの種々の抗原決定基に特異的である。第2の結合性化合物(1212)は、Shcタンパク質(1206および1208)に特異的である。図12Aおよび12Cのアッセイデザインは、図12Aのデザインにおいて切断性プローブがHer2受容体に特異的であり、図12Cのデザインにおいては切断性プローブがHer3受容体に特異的であること以外では類似している。したがって、前者の場合ではHer2受容体全体が測定されるのに対し、後者の場合ではHer3受容体全体が測定される。以下のようにアッセイを実施した。試料調製を上記の如く行った(実施例7)。
Shc/Her3受容体−アダプター相互作用
本実施例において、図12Aおよび12Cに示すようにアッセイをデザインした。図12Aでは、Her2受容体(1200)およびHer3受容体(1202)は、細胞表面膜(1204)中で二量体を形成し、各受容体はリン酸化部位(1209および1210)を有することが示される。Shcタンパク質(1206および1208)は、リン酸化部位(1210)および(1209)のそれぞれに結合する。第1の結合性化合物(1214)および切断性プローブ(1216)は、Her2受容体(1200)の細胞外ドメインの種々の抗原決定基に特異的である。第2の結合性化合物(1212)は、Shcタンパク質(1206および1208)に特異的である。図12Aおよび12Cのアッセイデザインは、図12Aのデザインにおいて切断性プローブがHer2受容体に特異的であり、図12Cのデザインにおいては切断性プローブがHer3受容体に特異的であること以外では類似している。したがって、前者の場合ではHer2受容体全体が測定されるのに対し、後者の場合ではHer3受容体全体が測定される。以下のようにアッセイを実施した。試料調製を上記の如く行った(実施例7)。
アッセイデザイン:各図に示された概略図に基づき、受容体複合体の形成をレシオメトリーにより定量する。すなわち、図12Bおよび12Dにおいて、アッセイの読取値は、HRG濃度の関数としてのmT2/mT1のピーク比率である。
アッセイ総容量は40μlである。溶解液容量は、溶解バッファーによって10μlに調節される。抗体を溶解バッファー中に20μlになるまで希釈する。通常、約5000〜500,000細胞相当の溶解液を反応ごとに用いる。
手順:反応に添加する前の、予備混合された抗体の使用濃度は下記の通りである:
Her3/Shc複合体についてはHer3にて切断性プローブを用いる(図12Aのデザイン):
10nMのeTag1 抗Her3(本アッセイではeTag1がPro14)
10nMのeTag2 抗Shc(本アッセイではeTag2がPro12)
10nMのeTag3 抗ホスホチロシン(本アッセイではeTag3がPro2)
20nMのビオチン 抗Her3
700nMのユニバーサル標準US−1
Her2/Shc複合体についてはHer2にて切断性プローブを用いる(12Aのデザイン):
10nM eTag1 抗Her2(本アッセイではeTag1がPro14)
10nM eTag2 抗Shc(本アッセイではeTag2がPro12)
10nM eTag3 抗ホスホチロシン(本アッセイではeTag3がPro2)
20nM ビオチン 抗Her2
700nM ユニバーサル標準US−1
Her3/Shc複合体についてはHer3にて切断性プローブを用いる(図12Aのデザイン):
10nMのeTag1 抗Her3(本アッセイではeTag1がPro14)
10nMのeTag2 抗Shc(本アッセイではeTag2がPro12)
10nMのeTag3 抗ホスホチロシン(本アッセイではeTag3がPro2)
20nMのビオチン 抗Her3
700nMのユニバーサル標準US−1
Her2/Shc複合体についてはHer2にて切断性プローブを用いる(12Aのデザイン):
10nM eTag1 抗Her2(本アッセイではeTag1がPro14)
10nM eTag2 抗Shc(本アッセイではeTag2がPro12)
10nM eTag3 抗ホスホチロシン(本アッセイではeTag3がPro2)
20nM ビオチン 抗Her2
700nM ユニバーサル標準US−1
1. 96ウェルフィルタープレート(Millipore MAGVN2250)をアッセイするために、20μlの抗体混合物を10μlの溶解液に添加し、4℃で1時間インキュベートする。
2. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 10μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、40分間インキュベートする。
3. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。
4. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、照射する。
5. 解析のためにの各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す。
2. ストレプトアビジン誘導体化切断性プローブ 10μl(最終4μg/ウェル)をアッセイウェルに添加し、40分間インキュベートする。
3. 200μlの洗浄用バッファーを添加し、真空にして空にする。
4. 30μlのイルミネーションバッファーを添加し、照射する。
5. 解析のためにの各反応液の10μlをCEアッセイプレートに移す。
データ解析:
1. 各分子タグの相対蛍光単位(RFU)シグナルを、内部ユニバーサル標準US−1のそれに対して標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを、分子タグに対応する標準化シグナルから差し引く。
3. 標準化mT2/mT1シグナルのレシオメトリー値として受容体複合体の形成を(図12Bおよび12Dに示す)、またmT3/mT1シグナルとして受容体リン酸化を(データは示していない)、記録する。
1. 各分子タグの相対蛍光単位(RFU)シグナルを、内部ユニバーサル標準US−1のそれに対して標準化する。
2. 「溶解液なし」のバックグラウンド対照のRFUを、分子タグに対応する標準化シグナルから差し引く。
3. 標準化mT2/mT1シグナルのレシオメトリー値として受容体複合体の形成を(図12Bおよび12Dに示す)、またmT3/mT1シグナルとして受容体リン酸化を(データは示していない)、記録する。
実施例9
***腫瘍試料におけるHer2−Her3ヘテロ二量体測定値とHer3−PI3K複合体測定値の間の相関
本実施例において、上述した方法を用いてヒト***腫瘍試料を別々にアッセイし、Her2−Her3ヘテロ二量体の量およびHer3−PI3K複合体の量を決定する。図13は、このようなアッセイから得られたデータを示し、この2つの測定値が相関することを示す。
***腫瘍試料におけるHer2−Her3ヘテロ二量体測定値とHer3−PI3K複合体測定値の間の相関
本実施例において、上述した方法を用いてヒト***腫瘍試料を別々にアッセイし、Her2−Her3ヘテロ二量体の量およびHer3−PI3K複合体の量を決定する。図13は、このようなアッセイから得られたデータを示し、この2つの測定値が相関することを示す。
実施例10
***腫瘍組織溶解液および正常組織溶解液におけるHer1−Her2およびHer2−Her3ヘテロ二量体の発現
凍結したヒト***腫瘍組織試料および正常組織試料をWilliam Bainbridge Genomic Foundation(Bainbridge Island、WA)から得た。32の腫瘍組織試料および30の正常組織試料について図3Eに示されるような形式のアッセイを実施した。販売業者により組織とともに供給された病理学データによれば、腫瘍組織は約25%から90%を超えるまでの様々な腫瘍細胞と正常細胞の混合物からなるものであった。本質的には実施例2および6に記載のようにして試料を調製し、アッセイを実施した。データは、切断性プローブの相手となる受容体に特異的に結合する結合性化合物から遊離した分離分子タグ(すなわち、図3Eにおいて「mT1」に対応する分子タグ)のピーク面積または強度として記録された。試料中の腫瘍細胞の比率に従って生成されたシグナルを標準化するための試みはなされなかった。
***腫瘍組織溶解液および正常組織溶解液におけるHer1−Her2およびHer2−Her3ヘテロ二量体の発現
凍結したヒト***腫瘍組織試料および正常組織試料をWilliam Bainbridge Genomic Foundation(Bainbridge Island、WA)から得た。32の腫瘍組織試料および30の正常組織試料について図3Eに示されるような形式のアッセイを実施した。販売業者により組織とともに供給された病理学データによれば、腫瘍組織は約25%から90%を超えるまでの様々な腫瘍細胞と正常細胞の混合物からなるものであった。本質的には実施例2および6に記載のようにして試料を調製し、アッセイを実施した。データは、切断性プローブの相手となる受容体に特異的に結合する結合性化合物から遊離した分離分子タグ(すなわち、図3Eにおいて「mT1」に対応する分子タグ)のピーク面積または強度として記録された。試料中の腫瘍細胞の比率に従って生成されたシグナルを標準化するための試みはなされなかった。
これらの測定から得られるデータは、図14A(Her1−Her2ヘテロ二量体測定)および図14B(Her2−Her3ヘテロ二量体測定)に示される。ここで白抜き四角(□)は腫瘍組織に関する測定値を示し、塗りつぶされた菱形(◆)は正常組織についての測定値を示す。このデータは、正常組織試料の細胞における発現と比較して、腫瘍組織試料のかなりの割合の腫瘍細胞が大量のHer1−Her2ヘテロ二量体およびHer2−Her3ヘテロ二量体を発現することを示す。
実施例11
ホルマリン固定したパラフィン包埋組織試料における受容体二量体の測定
本実施例において、ペレット化した細胞系から作製したモデル固定組織を、Her受容体二量体の存在についてアッセイした。ヘテロ二量体に対するアッセイデザインは、下記に記載する場合を除いて、図4Aの記載と本質的に同一である。すなわち、以下の4つの構成要素を用いる:(i)切断誘導部分(本実施例においては、図3Eに示されるような光増感剤誘導体化ストレプトアビジン)が結合した、二量体の受容体の一方に特異的なビオチン化モノクローナル抗体を含む切断性プローブ、(ii)第1の分子タグによって誘導体化され、かつ切断性プローブと同一の受容体に特異的なモノクローナル抗体、(iii)第2の分子タグによって誘導体化され、かつ切断性プローブが特異的に反応する受容体の相手の受容体に特異的なモノクローナル抗体、ならびに(iv)第3の分子タグによって誘導体化され、かつ細胞内でリン酸化されたチロシンに特異的なモノクローナル抗体。ホモ二量体のためのアッセイデザインは、下記の記載以外は、図1Dで記載したものと本質的に同一であった。
ホルマリン固定したパラフィン包埋組織試料における受容体二量体の測定
本実施例において、ペレット化した細胞系から作製したモデル固定組織を、Her受容体二量体の存在についてアッセイした。ヘテロ二量体に対するアッセイデザインは、下記に記載する場合を除いて、図4Aの記載と本質的に同一である。すなわち、以下の4つの構成要素を用いる:(i)切断誘導部分(本実施例においては、図3Eに示されるような光増感剤誘導体化ストレプトアビジン)が結合した、二量体の受容体の一方に特異的なビオチン化モノクローナル抗体を含む切断性プローブ、(ii)第1の分子タグによって誘導体化され、かつ切断性プローブと同一の受容体に特異的なモノクローナル抗体、(iii)第2の分子タグによって誘導体化され、かつ切断性プローブが特異的に反応する受容体の相手の受容体に特異的なモノクローナル抗体、ならびに(iv)第3の分子タグによって誘導体化され、かつ細胞内でリン酸化されたチロシンに特異的なモノクローナル抗体。ホモ二量体のためのアッセイデザインは、下記の記載以外は、図1Dで記載したものと本質的に同一であった。
それぞれの場合において、モデル固定組織を以下のように調製した。すなわち、組織培養プレート上で増殖した細胞を、前述の実施例に記載のようにEGFもしくはHRGによって刺激した後、洗浄し、スクラッピングにより取り出した。取り出した細胞は、遠心分離してペレットを形成させた後、ホルマリンを添加し、その混合物を4℃で一晩インキュベートした。固定化ペレットを、Miles Tissue TekIII Embedding Centerを用いてパラフィンに包埋した後、ミクロトーム(Leicaモデル2145)を用いて10μm組織切片をペレットからスライスした。組織切片は、正に荷電した顕微鏡用スライドガラス上に置き(通常はスライド当たり複数の組織切片)、60℃で1時間焼き固めた。
スライド上の組織切片を以下のようにアッセイした。すなわち、製造業者が推奨するプロトコルを用いて、スライド上の組織切片についてEZ−Dewax試薬(Biogenex、San Ramon、CA)を用いてワックスを除去した。簡単に述べると、500μL EZ−Dewaxを各組織切片に添加し、切片を室温で5分間インキュベートした後、70%EtOHによってスライドを洗浄した。このステップを繰り返し、スライドは最終的に脱イオン水でリンスした後、スライドを水中で室温で20分間インキュベートした。次いで、スライドは、pH10で1X Antigen Retrieval溶液(Biogenesis、Brentwood、NH)中に浸けた後、電子レンジで15分間(高出力にセットして5分経過後、低出力にセットして10分)加熱した。室温まで冷却後(約45分)、スライドを水浴中に5分間置いてから乾燥させた。乾燥したスライド上の組織切片に疎水性のワックスペンで丸を付け、組織切片上に置いた試薬を含むことが可能な領域を作り出した後(図3H〜3Iに示すのと同様)、1× Perm/Wash(BD Biosciences)でスライドを3回洗浄した。各切片に50〜100μLのブロッキング用バッファーを添加し、脱イオン水を含む蓋をした加湿ボックス中にスライドを4℃で2時間置いた後、ブロッキング用バッファー(ブロッキング用バッファーは、プロテアーゼ阻害剤(Roche)、ホスファターゼ阻害剤(フッ化ナトリウム、バナジン酸ナトリウム、βグリセロールリン酸)、および10%マウス血清を含むI×Perm/Wash溶液である)を吸引によって各切片から除去した。各切片に、結合性化合物および切断性プローブを含む40〜50μLの抗体混合物(Her1−Her2アッセイでは、ビオチン−Ab5(抗Her1)が10μg/mLであること以外は、それぞれは5μg/mLずつであった)を添加し、スライドを加湿ボックス内に4℃で一晩置いた。次いで、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む100μL Perm/Washで切片を3回洗浄した後、光増感剤を加えた1×Perm/Wash溶液(プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む)を50μL添加した。次いで、加湿ボックス内の暗所でスライドを4℃で1〜1.5時間インキュベートした後、スライドを暗所に保持しながら光増感剤を吸引によって除去した。次いで、スライドは、暗所に保持しながら、0.01×PBSに浸漬し、氷上で1時間インキュベートした。スライドをPBSから取り出し、乾燥させ、2pMフルオレセインを含む0.01×PBS 40〜50μLを各切片に添加した後、高出力レーザーダイオード(GaAIAs IRエミッター、モデルOD−880W、OPTO DIODE CORP、Newbury Park、CA)を用いて1時間照射した。フルオレセインは、電気泳動図中のピークを分子タグと相関させる際に助けとなる標準として機能する。照射後、各組織切片を覆っている溶液を穏やかなピペッティングによって混合し、Applied Biosystems(Foster City、CA)のモデル3100キャピラリー電気泳動機器において解析するためCEプレートに移した。
図15Aは、刺激していない細胞もしくは100nM EGFで刺激した細胞から調製された乳腺癌細胞系MDA−MB−468(ATCC受託番号HTB−132)の固定化ペレット由来の切片における、Her1−Her1ホモ二量体および受容体リン酸化の解析から得られるデータを示す。ビオチン化された抗Her1モノクローナル抗体(Labvision)は、2μg/mLで、切断性プローブの一次抗体(切断用にメチレンブルー誘導体化ストレプトアビジン(上述)を、ビオチンを介して結合した)として用いられた。ホモ二量体化Her1を測定するために、2μg/mLのPro10誘導体化抗Her1モノクローナル抗体(Labvision)を使用した。Her1全体を測定するために、0.8μg/mLのPro1誘導体化抗Her1モノクローナル抗体(Labvision)を使用した。非標識抗体Ab−5も3.2μg/mLで反応液に含めた。細胞内リン酸化を測定するために、0.5μg/mLのPro2誘導体化モノクローナル抗体(抗リン酸化チロシン、Cell Signaling)を使用した。固定組織の測定から得られたデータによって、EGF刺激に起因するHer1−Her1ホモ二量体の発現および細胞内リン酸化の増加が確認され、同データはそれを示す細胞溶解液の測定値と一致する。
図15Bは、乳癌細胞系MCF−7およびSKBR−3の固定化ペレット由来の切片におけるHer2−Her2ホモ二量体および受容体リン酸化の解析から得られたデータを示す。切断性プローブまたは結合性化合物として使用したすべてのモノクローナル抗体は、5μg/mLの濃度で使用した。よりよい切断を生成するために、本アッセイでは、2つの切断性プローブを用いたが、その1つはHer2の細胞外抗原決定基、1つはHer2の細胞内抗原決定基に対するものであった。固定組織の測定から得られるデータによって、SKBR3細胞は、MCF−7細胞よりもHer2−Her2ホモ二量体をより高レベルで発現することが確認された。
図15Cは、刺激していない細胞もしくは40nM EGFで刺激した細胞から調製された乳腺癌細胞系MCF−7の固定化ペレット由来の切片におけるHer1−Her2ヘテロ二量体および受容体リン酸化の解析から得られたデータを示す。分子タグが遊離する速度を増大させるために、1つは抗Her1モノクローナル抗体を含み(5μg/mL)、もう1つは抗Her1モノクローナル抗体を含む(10μg/mL)、2つの切断性プローブを用いた(両方ともLabvision)。このデータは、EGF刺激に起因するHer1−Her2ヘテロ二量体発現の増加が固定組織内で検出されることを示す。
図15Dは、刺激していない細胞もしくは100nM EGFで刺激した細胞から調製された乳腺癌細胞系22Rv1の固定化ペレット由来の切片における、Her1−Her2ヘテロ二量体および受容体リン酸化の解析から得られるデータを示す。さらに、固定組織に関する測定は、EGFでの処理に応答したHer1−Her2二量体およびHer受容体リン酸化のアップレギュレーションを証明する。
図15Eは、刺激していない細胞もしくは40nM HRGで刺激した細胞から調製された乳腺癌細胞系MCF−7の固定化ペレット由来の切片における、Her2−Her3ヘテロ二量体および受容体リン酸化の解析から得られるデータを示す。本実施例では、顕微鏡スライドではなく切片を含むチューブ中で、結合反応および切断反応が生じた。それ以外は、そのプロトコルはHer1−Her2二量体検出用プロトコルと本質的に同一であった(例えば、洗浄ステップは、遠心分離によって行う)。データは、HRG刺激に起因するHer2−Her3ヘテロ二量体発現の増加が固定組織内で検出されることを示す。
図15Fは、刺激していないもしくは40nM HRGで刺激したMCF−7細胞の固定化ペレット由来の切片における、Her2−Her3ヘテロ二量体およびPI3K−Her3二量体の解析から得られるデータを示す。PI3K−Her3に対するアッセイデザインは、本質的には図11Aに記載された通りである。いずれの場合も、抗原回復試薬を用いて資料を処理しなかったこと以外は、上記の固定化プロトコルに準じた。このデータは、Her2−Her3二量体がHRGによる処理に伴って増加したが、PI3K−Her3二量体の量は本質的に変化しないままであったことを示す。
図15Gは、いずれもチューブリンの量と関連する、PI3K全体、Her2−Her3二量体全体、およびHer3全体の解析から得られるデータを示す。切断性プローブ、および分子タグを伴う結合性化合物を用いた従来のサンドイッチ型アッセイによって、チューブリンを測定した。チューブリンを測定して、試料中の総細胞数を代表する標的に対する二量体測定値を標準化するための手法を試験した。この手法は、異質細胞種を含む試料についての測定に必要な場合がある。このデータは、チューブリンに対するPI3K−Her3とHer2−Her3の比率が、PI3K−Her3とHer2−Her3についての直接的な測定値と同質の結果であることを示す。
Claims (26)
- 1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体の異常な発現を特徴とする疾患に罹患した患者の疾患状態を判定する方法であって、
1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体のそれぞれの量を患者試料において直接測定するステップと、
そのような量のそれぞれを参照試料のその対応する量と比較するステップと、
患者試料からの量と参照試料からのそれぞれの対応する量との差を、患者の疾患状態と相関させるステップと、
を含む方法。 - 前記患者試料が、固定組織試料または凍結組織試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体が、1種またはそれ以上の受容体チロシンキナーゼ複合体であり、前記疾患が癌である、請求項2に記載の方法。
- 前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体が、1種またはそれ以上のPDGF受容体複合体である、請求項1に記載の方法。
- 前記1種またはそれ以上のPDGF受容体複合体が、PDGFRαホモ二量体、PDGFRβホモ二量体、PDGFRα−PDGFRβヘテロ二量体、PDGFR−SHC複合体、PDGFR−PI3K複合体、Her1−PDGFR受容体二量体、Her2−PDGFR受容体二量体、Her3−PDGFR受容体二量体、およびPDGFR−IGF−1R受容体二量体からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記疾患が癌であるか、または前記疾患が異常な線維化状態と関係するものである、請求項4または5に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌、卵巣癌、および膠芽腫からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 有効な近接範囲をもつ切断誘導部分を有する切断性プローブと、切断可能な結合によって結合された1種またはそれ以上の分子タグをそれぞれが有する1種またはそれ以上の結合性化合物とを含み、但し異なる結合性化合物の分子タグが異なる分離特性を有する、試薬対を、前記1種またはそれ以上のPDGF受容体複合体のそれぞれについて用意するステップと、
前記1種またはそれ以上のPDGF受容体複合体のそれぞれに対する前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物を、前記患者試料と混合して、それにより前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物がそのそれぞれのPDGF受容体複合体と特異的に結合し、そして前記1種またはそれ以上の結合性化合物の切断可能な結合が、前記切断誘導部分の有効な近接範囲内に入り、その結果として分子タグが遊離されるようにするステップと、
遊離した分子タグを分離および同定して、前記患者試料中の前記1種またはそれ以上のPDGF受容体複合体の有無または量を決定するステップと、
によって、前記1種またはそれ以上のPDGF受容体複合体を測定する、請求項7に記載の方法。 - 前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体が、1種またはそれ以上のVEGF受容体複合体である、請求項1に記載の方法。
- 前記1種またはそれ以上のVEGF受容体複合体が、VEGFR1ホモ二量体、VEGFR2ホモ二量体、VEGFR1−VEGFR2ヘテロ二量体、VEGFR2−VEGFR3ヘテロ二量体、VEGFR2−SHC複合体、およびVEGFR3−SHC複合体からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記疾患が癌であるか、または前記疾患が異常な血管新生と関係するものである、請求項9または10に記載の方法。
- 有効な近接範囲をもつ切断誘導部分を有する切断性プローブと、切断可能な結合によって結合された1種またはそれ以上の分子タグをそれぞれが有する1種またはそれ以上の結合性化合物とを含み、但し異なる結合性化合物の分子タグが異なる分離特性を有する、試薬対を、前記1種またはそれ以上のVEGF受容体複合体のそれぞれについて用意するステップと、
前記1種またはそれ以上のVEGF受容体複合体のそれぞれに対する前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物を、前記患者試料と混合して、それにより前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物がそのそれぞれのVEGF受容体複合体と特異的に結合し、そして前記1種またはそれ以上の結合性化合物の切断可能な結合が、前記切断誘導部分の有効な近接範囲内に入り、その結果として分子タグが遊離されるようにするステップと、
遊離した分子タグを分離および同定して、前記患者試料中の前記1種またはそれ以上のVEGF受容体複合体の有無または量を決定するステップと、
によって、前記1種またはそれ以上のVEGF受容体複合体を測定する、請求項11に記載の方法。 - 前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体が、VEGFR1(Flt1)−VEGFR2(KDR)、VEGFR2(KDR)−VEGFR2(KDR)、PDGFRα−PDGFRα、PDGFRα−PDGFRβ、PDGFRβ−PDGFRβ、Kit/SCFRホモ二量体、FGFR二量体、NGFR(TrkA)−NGFR(TrkA)、α2アドレナリン受容体ホモ二量体、α2アドレナリン−β2アドレナリン受容体ヘテロ二量体、β2アドレナリン受容体ホモ二量体、GABABR1−GABABR2受容体ヘテロ二量体、ATII受容体ホモ二量体、コレシストキニン−ドーパミン受容体ヘテロ二量体、ブラジキニニンB2受容体ホモ二量体、M2−M3ムスカリン受容体ヘテロ二量体、CCR2受容体ホモ二量体、μ−δオピオイド受容体ヘテロ二量体、D1ドーパミン受容体ホモ二量体、5−HT 1B−5−HT 1D受容体ヘテロ二量体、D2ドーパミン受容体ホモ二量体、α2cアドレナリン−M3ムスカリン受容体ヘテロ二量体、D3ドーパミン受容体ホモ二量体、およびβ2アドレナリン−δオピオイド受容体ヘテロ二量体からなる群から選択される受容体二量体である、請求項1に記載の方法。
- 有効な近接範囲をもつ切断誘導部分を有する切断性プローブと、切断可能な結合によって結合された1種またはそれ以上の分子タグをそれぞれが有する1種またはそれ以上の結合性化合物とを含み、但し異なる結合性化合物の分子タグが異なる分離特性を有する、試薬対を、前記1種またはそれ以上の受容体二量体のそれぞれについて用意するステップと、
前記1種またはそれ以上の受容体二量体のそれぞれに対する前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物を、前記患者試料と混合して、それにより前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物がそのそれぞれの受容体二量体と特異的に結合し、そして前記1種またはそれ以上の結合性化合物の切断可能な結合が、前記切断誘導部分の有効な近接範囲内に入り、その結果として分子タグが遊離されるようにするステップと、
遊離した分子タグを分離および同定して、前記患者試料中の前記1種またはそれ以上の受容体二量体の有無または量を決定するステップと、
によって、前記1種またはそれ以上の受容体二量体を測定する、請求項13に記載の方法。 - 1種またはそれ以上の二量体作用性薬剤を用いた癌の治療のために患者を選択する方法であって、
患者から癌細胞を含む患者試料を単離するステップと、
1種またはそれ以上の細胞表面受容体二量体のそれぞれの量を前記患者試料において直接測定するステップと、
そのような量のそれぞれを参照試料のその対応する量と比較するステップと、
前記患者試料の1種またはそれ以上の細胞表面受容体二量体の量が、前記参照試料のそれぞれの対応する量を上回る場合には、1種またはそれ以上の二量体作用性薬剤を用いた治療に対して、その患者を選択するステップと、
を含む方法。 - 前記細胞表面受容体二量体がVEGFR二量体であり、前記二量体作用性薬剤が、PTK787/K222584、ZD6474、SU6668、SU11248、CHR200131、CP547632、AG13736、CEP7055/5214、およびKRN633からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞表面受容体二量体がPDGFR二量体であり、前記二量体作用性薬剤が、SU6668、SU11248、AG13736、CHR200131からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞表面受容体二量体がFGFR二量体であり、前記二量体作用性薬剤が、CP547632およびCHR200131からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 有効な近接範囲をもつ切断誘導部分を有する切断性プローブと、切断可能な結合によって結合された1種またはそれ以上の分子タグをそれぞれが有する1種またはそれ以上の結合性化合物とを含み、但し異なる結合性化合物の分子タグが異なる分離特性を有する、試薬対を、前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体二量体のそれぞれについて用意するステップと、
前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体二量体のそれぞれに対する前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物を、前記患者試料と混合して、それにより前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物がそのそれぞれの細胞表面受容体二量体と特異的に結合し、そして前記1種またはそれ以上の結合性化合物の切断可能な結合が、前記切断誘導部分の有効な近接範囲内に入り、その結果として分子タグが遊離されるようにするステップと、
遊離した分子タグを分離および同定して、前記固定組織試料中の前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体二量体の有無または量を決定するステップと、
によって、前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体二量体を測定する、請求項15、16、17、または18に記載の方法。 - 前記患者試料が固定組織試料、凍結組織試料、または循環系上皮細胞である、請求項19に記載の方法。
- 1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体の異常な発現を特徴とする疾患に罹患した患者の疾患状態を判定する方法であって、
1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体のそれぞれの量を患者試料において直接測定するステップと、
そのような量のそれぞれを参照試料のその対応する量と比較するステップと、
患者試料からの量と参照試料からのそれぞれの対応する量との差を、患者の疾患状態と相関させるステップと、
を含み、
ここで、有効な近接範囲をもつ切断誘導部分を有する切断性プローブと、切断可能な結合によって結合された1種またはそれ以上の分子タグをそれぞれが有する1種またはそれ以上の結合性化合物とを含み、但し異なる結合性化合物の分子タグが異なる分離特性を有する、試薬対を、前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体および1種またはそれ以上の組織指標のそれぞれについて用意するステップと、
前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体および1種またはそれ以上の組織指標のそれぞれに対する前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物を、前記患者試料と混合して、それにより前記切断性プローブおよび前記1種またはそれ以上の結合性化合物がそのそれぞれの標的と特異的に結合し、そして前記1種またはそれ以上の結合性化合物の切断可能な結合が、前記切断誘導部分の有効な近接範囲内に入り、その結果として分子タグが遊離されるようにするステップと、
遊離した分子タグを分離および同定して、前記患者試料中の前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体の有無または量を決定するステップと、
によって、前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体のそれぞれを測定する、方法。 - 前記疾患が癌であり、前記患者試料が固定組織試料、凍結組織試料、または循環系上皮細胞である、請求項21に記載の方法。
- 前記疾患状態が、二量体作用性薬剤を用いた治療に対する前記患者の応答性である、請求項22に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記1種またはそれ以上の細胞表面受容体複合体が、PDGFRαホモ二量体、PDGFRβホモ二量体、PDGFRα−PDGFRβヘテロ二量体、PDGFR−SHC複合体、PDGFR−PI3K複合体、Her1−PDGFR受容体二量体、Her2−PDGFR受容体二量体、Her3−PDGFR受容体二量体、PDGFR−IGF−1R受容体二量体、VEGFR1ホモ二量体、VEGFR2ホモ二量体、VEGFR1−VEGFR2ヘテロ二量体、VEGFR2−VEGFR3ヘテロ二量体、VEGFR2−SHC複合体、およびVEGFR3−SHC複合体からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記組織指標がチューブリンまたはサイトケラチンである、請求項21、22、23、24、または25に記載の方法。
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