CN1997393A - 胞内复合物作为生物标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过测定选定的胞内复合物表达水平来测定患者疾病状态的方法。在本发明的一个方面，通过测定以凋亡通道为特征的蛋白－蛋白复合物的相对数量来检测患者样品中的凋亡通道活化状态。特别地，本发明提供了一种测定线粒体凋亡通道的活化状态的方法，其中一方面同时测定14－3－3蛋白和BAD蛋白之间复合物的相对数量，另一方面同时测定Bc1－2蛋白与BAD蛋白之间复合物的相对数量。优选地，本发明的方法通过采用成组的具有可释放分子标签的结合化合物来实现，其中所述分子标签对凋亡通道内形成的一种或多种复合物的多种成分具有特异性。结合之后该分子标签被释放并从测定混合物中分离出来用以分析。

Description

胞内复合物作为生物标记

本申请是2002年5月21日提交的序列号为No.10/154042和2003年7月17日提交的序列号为No.10/623057的美国专利申请的部分后续申请；其还要求以下美国临时申请的优先权：2003年4月1日提交的Ser.No.60/459888；2003年8月11日提交的Ser.No.60/494482；2003年10月1日提交的Ser.No.60/508034；2003年10月20日提交的Ser.No.60/512941；2003年11月18日提交的Ser.No.60/523258，上述所有专利都全文引入作为参考。

发明领域

本发明主要涉及生物标记，具体来说，涉及使用胞内分子复合物来作为生物标记。

发明背景

生物标记是一种能够客观地测量并计算的特征物，作为正常的生物学过程、致病过程、或者针对治疗介入手段的药理学反应的指示物，Atkinson等，Clin.Pharmacol.Ther.，69：89-95(2001)。生物标记在性质、测量难易程度、以及与目标物生理状态的关系上有很大的不同，例如Frank等，Nature Reviews Drug Discovery，2：566-580(2003)。人们相信，开发新型有效的生物标记既可以显著减少保健和药物开发的成本，又可以大大改善对多种疾病和身体状况的治疗。为此，人们作了大量的努力，旨在利用新技术来发现新类型的生物标记，例如，Petricoin等，Nature Reviews Drug Discovery，1：683-695(2002)。

分子复合物的形成和解离是一种普遍的生物学现象，其对于活有机体中的调控过程来说十分重要。特别是胞外环境与细胞核之间的信号通道涉及许多分子复合物的形成，多种蛋白质在其中组装以直接或间接地引起分子活动，例如磷酸化或去磷酸化作用，它们是信号发送过程中的步骤，Gomperts等，Signal Transduction(Academic Press，New York，2002)。这种通道及其成分是人们密切研究的对象，因为异常通道的行为在许多疾病条件下起作用，特别是癌症，例如，McCormick，Trends inCell Biology，9：53-56(1999)；Blume-Jensen和Hunter，Nature，411：355-365(2001)；Nicholson等，Cellular Signalling，14：381-395(2002)等等。例如，现已观察到许多癌症都与影响信号通道成分的突变或者其他的基因改变的积聚有关，例如，通过过表达的方式影响信号通道组合物，尤其是那些涉及细胞增殖、细胞运动性、分化和细胞死亡的通道，例如Blume--Jensen和Hunter(引用如上)；Evan和Vousden，Nature，411：342-348(2001)。

研究信号通道较为困难，不仅是因为其复杂性和互相联系性，还因为其需要破坏性的步骤用于分析胞内复合物，例如Weng等，Science，284：92-96(1999)；Machida等，Molecular & Cellular Proteomics，2.4：215-233(2003)；Price等，Methods in Molecular Biology，218：255-267(2003)。已有多种技术用于研究细胞的蛋白-蛋白相互作用和复合物，包括免疫沉淀反应、化学交联、酵母双杂交体系、标记融合蛋白、生物发光共振能量传递(BRET)、荧光共振能量传递(FRET)、质谱法等等，例如Golemis主编，Protein-Protein Interactions(ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，2002)；Price等，(引用如上)；Sorkin等，Curr.Biol.，10：1395-1398(2000)；McVey等，J.Biol.Chem.，17：14092-14099(2001)；Salim等，J.Biol.Chem.，277：15482-15485(2002)；Angers等，Proc.Natl.Acad.Sci.，97：3684-3689(2000)；Jones等，Proteomics，2：76-84(2002)；以及Petricoin III等，The Lancet，359：572-577(2002)。遗憾的是，这些技术难以应用，其通常缺乏足够的灵敏度来提供信号通道状态的准确图像，和/或不能够测定对通道活化具有重要作用的多种成分或相互作用成分。因此，通过这些技术所做的测定不能产生有用的基于复合物形成的生物指标。

鉴于上述原因，根据涉及关键胞内过程，如信号转导过程的胞内复合物的存在、不存在、和/或特征或比例，提供了新种类的生物标记，其对于诊断、预后、患者分级以及药物开发提供了新式的工具，从而将促进医学领域的发展。

发明概述

本发明涉及包含胞内分子复合物的生物标记，其存在于在患者细胞或组织样品，尤其是通过常规方法如冷冻或固定法所保存的样品中。在一个方面，本发明包括一种或多种胞内分子复合物的数量与疾病状态或健康状况的关系。特别地，本发明提供了用于指示与疾病或健康状况有关的信号通道状态的生物标记，其中该生物标记是信号复合物的数量。

在一个方面，本发明可以确定患者的疾病状态，所述患者所患疾病的特征是，一种或多种胞内分子复合物的异常表达，步骤如下：(i)测定患者样品中一种或多种胞内分子复合物中每种的数量；(ii)将上述每种数量与其在标准样品中的相应数量相比较；以及(iii)将患者样品中的数量与标准样品中分别相对应的数量之差与患者的疾病状态相关联。患者样品可以是固定或者冷冻的；然而优选地，患者样品为采用常规方法固定的。

在一个方面，本发明提供了一种通过同时测定信号通道复合物的相对数量来确定患者中癌症状态的方法。在一个实施方式中，这些复合物可以利用至少两种对每种复合物的不同成分具有特异性的试剂来测定，这里称为“试剂对”：一种成分，这里称作裂解探针，具有裂解引发部分，其可以被引发以在其直接近程内裂解敏感键；以及另一种成分，这里称作结合化合物，具有一种或多种分子标签，通过可由所述裂解引发部***解的连接物连接。根据该实施方式，这些不同成分无论何时形成复合物，都在该裂解引发部分的有效裂解近程内引入可裂解连接物，使得分子标签被释放。接着将释放的分子标签从反应混合物中分离并定量以测定复合物的形成。

在本发明的另一个方面，患者样品中胞内复合物的数量可以表示成复合成分与未复合成分的参比测量值，或者多种该复合物的相对数量图像。也就是说，胞内分子复合物的数量表示成该复合物中存在的一种成分的测量值与该复合物的其他成分的总量测量值的比例，无论该其他成分存在于复合物中还是成游离或单体状态。在一个实施方式中，典型的测量值包括与特定分子标签相关的电泳图谱中锋值的峰高度或者峰面积。在另一个实施方式中，本发明将一种或多种蛋白-蛋白复合物的参比测定值与疾病状态相关联。

在一个特定的方面，本发明提供了一种通过对患者样品，尤其是固定的样品的测量来确定患有疾病，如癌症的患者的凋亡状态的方法，所述疾病特征在于异常的凋亡状态，其中该测定是针对形成凋亡信号转导通道成分的胞内分子复合物的种类和/或数量。该胞内复合物包括但不限于，一种或多种14-3-3//BAD、BID//BAX、BAX//BAX、Bcll-X_L//BAD、Bcll-2//BAD、14-3-3//BID、BID//BAK、BAX//Bcll-2、Bcll-X_L//BIK、Bcll-2//BIK、NF-kB//I-kB、BID//Bcll-2、Bcll-X_L//BID、Bcll-2//BID、FADD//caspase-9、BID//Bcll-X_L、Bcll-X_L//Hrk、Bcll-2//Hrk、TRADD//caspase-9、BID//A1/Bfl-1、Bcll-X_L//BIM、Bcll-2//BIM、Apaf-1//caspase-9、Bcll-X_L//Noxa、Bcll-2//Noxa、Bcll-X_L//Bmf、Bcll-2//Bmf、Bcll-X_L//Puma、Bcll-2//Puma、Bcll-X_L//Bcll-G、Bcll-2//Bcll-G、Bcll-X_L//NIP3、Bcll-2//NIP3、Bcll-X_L//Nix和Bcll-2//Nix。在另一个方面，该胞内复合物包括但不限于，14-3-3//BAD、Bcll-2//BAD、14-3-3//BID、BAX//Bcll-2、Bcll-2//BIK、BID//Bcll-2、Bcll-2//BID、Bcll-2//Hrk、Bcll-2//BIM、Bcll-2//Noxa、Bcll-2//Bmf、Bcll-2//Puma、Bcll-2//Bcll-G、Bcll-2//NIP3和Bcll-2//Nix。在另一个方面，该胞内复合物包括但不限于NF-kB//I-kB。在个方面又一个方面，该胞内复合物包括测定NF-kB//I-kB复合物以确定患者的疾病状态，该患者患有癌症或者炎症，例如风湿性关节炎、发炎性肠道疾病、多发性硬化、或者哮喘。优选地，上述测定为参比测定，提供游离和与复合物结合的蛋白质比值。

在一个特定的方面，本发明提供了一种通过对患者样品，尤其是固定的样品的测量来确定患有疾病，如癌症的患者的疾病状态的方法，所述疾病特征在于异常的信号转导通道活化，其中该测定是针对形成选定信号转导通道成分的胞内分子复合物的种类和/或数量。该胞内复合物包括但不限于，一种或多种Her1//Shc、Grb2//Sos、Her1//Grb7、Her1//RasGAP、Grb2//Shc、Her2//Shc、Her3//PI3K、Her3//Shc、Her3//Grb7、YAP//Her4、IGF-1R//PI3K、IGF-1R//Shc、IGFR//IRS1、VEGFR//Shc、VEGFR//PI3K、VEGFR//Src、VEGFR//FRS2、PDGFRa//Crk、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck；PDGFR//Shc、DGFR//STAT5、PDGFRa//Crk、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck，PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、Kit//Shp-1、Kit//PI3K、Kit//Grb2、Kit//CRKL、FGFR//PLCg1、FGFR//Crk、FGFR//FRS2、GFR//Shp2、FGFR//Shb、Trk//p75NTR以及Trk//PI3K。在另一个方面，这种胞内复合物包括但不限于，Her1//Shc、Grb2//Sos、Her1//Grb7、Her1//RasGAP、Grb2//Shc、Her2//Shc、Her3//PI3K、Her3//Shc、和Her3//Grb7。在另一个方面，这种胞内复合物包括但不限于，IGF-1R//PI3K、IGF-1R//Shc、和IGFR//IRS1。在另一个方面，这种胞内复合物包括但不限于，VEGFR//Shc、VEGFR//PI3K、VEGFR//Src、和VEGFR//FRS2。在另一个方面，这种胞内复合物包括但不限于，PDGFRa//Crk、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、DGFR//STAT5、PDGFRa//Crk、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck；PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、和PDGFR//STAT5。

在另一个方面，本发明提供了一种确定患者中癌症状态的方法，其中同时测定了包括Bcll-2蛋白和BH3-only蛋白的凋亡通道复合物和包括14-3-3蛋白和BAD蛋白的复合物的相对数量。在一个实施方式中，这些复合物可以利用至少两种对每种复合物的不同成分具有特异性的试剂来测定：一种成分，这里称作裂解探针，具有裂解引发部分，其可以被引发以在其直接近程内裂解敏感键；以及另一种成分，这里称作结合化合物，具有一种或多种分子标签，通过可由所述裂解引发部***解的连接物连接。根据该实施方式，这些不同成分无论何时形成复合物，都在该裂解引发部分的有效裂解近程内引入可裂解连接物，使得分子标签被释放。接着将释放的分子标签从反应混合物中分离并定量以测定复合物的形成。

本发明提供的生物标记包含对患者样品中胞内分子复合物数量的测定值。特别地，可将胞内分子复合物数量的图形与患者的疾病状态相关，并且在一些实施方式中，可将其与预后、药物对被测复合物的功效、以及患者对治疗的反应可能性相关联。根据本发明，通过直接测定患者样品中的胞内分子复合物，可以克服现有技术中的缺点，无需培养或以其他方式处理细胞或组织样品，例如异种移植，那样会增加成本和工作量并且会给最终测定读数带来噪声和可能的假象。本发明还提供了一种对胞内受体和/或复合物的磷酸化，或其他在样品制备过程中容易被破坏的翻译后修饰的替代性测量方法。该替代性测量方法是基于对复合物的测定，例如PI3K或SHC-受体复合物等等，它取决于对其形成的上述修饰，并且其较少地受到样品制备过程的影响，在其制备过程中较稳定。

附图简述

图1A-1E图示性说明用于测定胞内复合物存在的本发明方法的一些实施方式。

图1F-1G图示性说明使用可释放的分子标签来测定固定的组织样本中细胞表面受体复合物。

图1H说明对两种二聚体复合物的参比测定。

图2A-2E图示性说明将分子标签连接在抗体上的方法。

图3A-3F说明易氧化连接物以及其通过单线态氧介入的相应的裂解反应。

图4A-4J显示设计并合成的标签的结构。

图5A-5D说明图6中所示的标签部分的合成化学方法。

图6A-6C图示性说明用于实施电泳分离分子标签步骤的微流控装置。

图7A-7D说明用于检测PI3激酶-Her3受体活化复合物的测定设计和实验结果。

图8A-8D说明用于检测Shc/Her3受体-适配体复合物的测定设计和实验结果。

图9A-9C说明用于同时测定BAD//14-3-3和BAD//Bcll-2复合物的本发明实施方式。

图10A-10C显示肿瘤细胞中Her2-Her3异型二聚体和PI3K//Her3复合物表达之间的相关性数据。

定义

“14-3-3蛋白”是指能够与Ser-112和/或Ser-155处磷酸化的人类BAD形成稳定复合物的人类蛋白，该蛋白具有与NCBI登录号AAH56867或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，99：16899-16903(2002)中所述的物质基本上相同的氨基酸序列。在一个方面，以下的14-3-3蛋白为至少百分之八十相同于，更优选百分之九十相同于NCBI登录号AAH56867或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，99：16899-16903(2002)中所述的氨基酸。

“Akt蛋白”是指PKBa/Akt1、PKBb/Akt2、PKBg/Akt3、PKBg-1组中成员的人类蛋白，以及与其氨基酸序列基本上相同的蛋白质，并且其无论何时被PI3K蛋白磷酸化后都具有蛋白激酶活性。在一个方面，无论何时位置数在305至310的酪氨酸被磷酸化和/或位置数在470至475的丝氨酸被磷酸化后，Akt蛋白都具有激酶活性。Akt蛋白有多个NCBI登录号，包括NP_005154，以及Nicholson等，Cellular Signalling，14：381-395(2002)；Kandel等，Exp.Cell.Res.，253：210-229(1999)；以及类似的参考文献，在此将其引入作为参考。

“抗体”是指能与另一个分子的特定空间和极性结构特异性地结合，并因此定义为与之互补的免疫球蛋白。抗体可以是单克隆或多克隆的，并能够用本领域熟知的技术制备，如免疫宿主并采集血清(多克隆)，或通过制备持续性杂交细胞系并收集分泌蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变型，所述核苷酸序列至少编码与天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各种类型和亚型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。抗体片段可包括Fab、Fv、F(ab’)2、Fab’等等。此外，适当时可以使用免疫球蛋白的聚集体、聚合物和偶联物或其片段，只要维持了对特定多肽的结合亲和力。免疫测定，包括采用可释放分子标签(如下所述)的这类测定中使用的抗体的制造和选择的指导性技术可以很容易地在教科书和手册中找到，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1988)；Howard和Bethell，Basic Methods in AntibodyProduction and Characterization(CRC Press，2001)；Wild主编，The Immunoassay Handbook(Stockton Press，New York，1994)，等等。

“抗体结合组合物”是指包含一个或多个抗体、或其片段的分子或分子复合物，并且其结合特异性来自于该抗体或抗体片段。抗体结合组合物包括但不限于，(i)抗体对，其中第一个抗体与靶分子特异性结合，第二个抗体与第一个抗体的恒定区特异性结合；生物素化抗体，其通过生物素部分(moiety)特异性结合于靶分子和链亲和素蛋白，其中该链亲和素的蛋白由诸如分子标签或光敏剂等等的部分衍化成；(ii)对靶分子特异并且与聚合物，如葡聚糖偶联的抗体，其中该聚合物是由诸如分子标签或光敏剂的部分衍化而成，其直接通过共价键连接或者间接通过链亲和素-生物素联接；(iii)对靶分子特异并与珠、微珠、或其他固相支持物偶联的抗体，其中该支持物直接或间接地由诸如分子标签或光敏剂的部分衍化而成，或者是含有后者的聚合物。

“抗原决定簇”，或“表位”是指分子，通常是蛋白质分子，表面上的位点，该位点能与单个的抗体分子结合；通常蛋白质具有几个或多个不同的抗原决定簇并能与多种不同的特异性抗体反应。优选的抗原决定簇为蛋白质的磷酸化位点。

“凋亡”或“程序性细胞死亡”是指一种细胞通过一系列的步骤破坏其自身的过程，该过程包括释放蛋白水解酶，如caspase酶。“凋亡通道”或等同的“凋亡信号通道”涉及一系列特殊的导致细胞破坏的步骤，其中该步骤包括特征分子的活动，如特定蛋白质的磷酸化或去磷酸化过程，在特定蛋白质之间形成复合物，复合物的解离等等。“凋亡复合物”是指构成特定凋亡通道的一部分的蛋白-蛋白复合物。“凋亡状态”是一个相对程度的术语，指在一个或多个凋亡通道中与细胞死亡或细胞存活相关的一种或多种复合物的相对数量的图案或图像。例如，同一样品中14-3-3//BAD复合物的数量超过Bcll-2//BAD复合物的数量时，表明细胞存活；因此，其凋亡状态的值很低。凋亡状态的特定水平或值或测量规模取决于一些因素，包括样品中的细胞种类，是否存在疾病状况，靶定的复合物的种类等等。凋亡状态的水平或值可通过参考已知或正常水品的选定凋亡复合物的标准样品来确定。这里所使用的“状态”涉及癌症患者，是指来自癌症患者的样品、样本或活检样品的细胞凋亡状态。该“状态”可以涉及疾病确定或分类、预后、药物功效、患者对治疗的反应、是否推荐辅助治疗、疾病复发的可能性等等。

“BAD”蛋白是指无论何时在Ser-112和/或Ser-155处磷酸化后都能够与人类14-3-3蛋白形成稳定复合物，并且在Ser-112和Ser-155处没有连接上磷酸基团的任何时候能够与人类Bcl-2蛋白形成稳定复合物的人类蛋白质，该BAD蛋白具有与NCBI登录号AAH01901或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，99：16899-16903(2002)中所述的物质基本上相同的氨基酸序列。在一个方面，以下的BAD蛋白为至少百分之八十相同于，更优选百分之九十相同于NCBI登录号AAH01901或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，99：16899-16903(2002)中所述的氨基酸。

“Bcl-2蛋白”是指在BAD蛋白的Ser-112和Ser-155处没有连接上磷酸基团的任何时候都能够于能够与人类BAD形成稳定复合物的人类蛋白，其具有与NCBI登录号AAH17214或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，99：16899-16903(2002)中所述的物质基本上相同的氨基酸序列。在一个方面，以下的Bcl-2蛋白为至少百分之八十相同于，更优选百分之九十相同于NCBI登录号AAH17214或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，99：16899-16903(2002)中所述的氨基酸。

“Bcl-X_L蛋白”是指在BAD蛋白的Ser-112和Ser-155处没有连接上磷酸基团的任何时候都能够与人类BAD形成稳定复合物的人类蛋白，其具有与NCBI登录号NP_620120或Oltvai等，Cell，74：609-619(1993)中所述的物质基本上相同的氨基酸序列。在一个方面，以下的Bcl-X_L蛋白为至少百分之八十相同于，更优选百分之九十相同于NCBI登录号NP_620120或Oltvai等，Cell，74：609-619(1993)中所述的氨基酸。

“BH3 only蛋白”是指含有BH3域但不含BH1、BH2或BH4域的人类蛋白，其能够与Bcl-2蛋白形成稳定的复合物。多肽域BH1、BH2、BH3和BH4是蛋白质的Bcl-2家族的特征域，这在以下参考文献中有所描述：Baell和Huang，Biochem.Pharmacology，64：851-863(2002)；Sattler等，Science，275：983-985(1997)；Gross等，Genes & Development，13：1899-1911(1999)；以及Puthalakath等，Cell Death andDifferentiation，9：505-512(2002)，引入它们作为参考。BH3域由以下12个氨基酸的共有序列表示：“-I-A-X₁-X₂-L-R-R-I-G-D-E-F-”，其中X₁是任何氨基酸，X₂是带电荷的氨基酸。优选地，BH3域包含共有序列的氨基酸序列，或者是共有序列中有1至4个保守氨基酸被取代和/或缺失的序列，同时满足第五位上的亮氨酸(L)和第10位上的天冬氨酸(D)未被取代或缺失。示范性的BH3 only蛋白包括BID、BAD、BIK、BLK、HRK、BIM、NIP3和NIX/BNIP3，其说明可从National Centerfor Biotechnology Information(NCBI)获得。优选的BH3 only蛋白是BAD。

“结合部分”是指能够特异性地与分析物结合、并且分子标签能够直接或间接地附着于其上的任何分子。结合部分包括但不限于，抗体、抗体结合组合物、肽、蛋白质、核酸，以及分子量达到1000道尔顿并且由选自以下物质构成的组中的原子所构成的有机分子：氢、碳、氧、氮、硫和磷。优选地，结合部分为抗体或抗体结合组合物。

“癌症”和“癌的”涉及或描述了哺乳动物中典型地以无规则细胞生长为特征的生理状态。癌症实例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、和白血病。这些癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠道癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头部和颈部癌症。

“毛细尺寸的”涉及分离柱，是指板或微流控装置中的毛细管或通道，其中该分离柱的直径或最大尺寸在大约25-500微米之间，使得在整个分离介质中可以有效地散热，因而在介质内具有较低的热对流。

这里所使用的“色谱法”或“色谱分离”是指或涉及一种分析方法，其中是根据一种或多种物理或化学性质在移动相和固定相之间的不同分布，使含有化合物如分子标签的混合物的移动相促进对该化合物的分离，所述移动相通常为液体，所述固定相通常为固体。构成分析物，如分子标签色谱分离的基础的一种或多种物理性质包括但不限于，分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性等等。在一个方面，这里所使用的“高压(或高效)液相色谱法”(“HPLC”)涉及一种液相色谱分离，其中(i)采用长度达300mm内径达5mm的刚性圆柱形分离柱，(ii)固定相包括直径相同并长达5μm的刚性球状颗粒(如硅石、氧化铝等等)，填充在分离柱中，(iii)在35℃至80℃的温度范围，柱压达150bar的条件下操作，以及(iv)采用的流速范围在1μl/min至4mL/min。优选地，用于HPLC的固定相颗粒进一步具有以下特征(i)平均颗粒直径分布范围窄，基本上所有的颗粒直径在平均值的10％以内，(ii)孔大小相同的，范围在70至300埃，(iii)表面积范围在50至250m²/g，以及(iv)结合相密度(即每单位面积保持的配体数目)范围在1至5每nm²。用于分离分子标签的示范性反相色谱介质包括颗粒，如如硅石或氧化铝，其具有连接到其表面上的保留配体，如苯基、氰基、或选自C₈至C₁₈的脂肪族基团。涉及本发明的色谱法包括“毛细管电色谱法”(“CEC”)，以及相关的技术。CEC是一种液相色谱技术，其中流体通过电渗流动通过毛细尺寸的柱体，例如其内径在30至100μm的范围内。CEC在Svec，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.76：1-47(2002)；Vanhoenacker等，Electrophoresis，22：4064-4013(2001)等等文献中有公开。CEC柱可采用与常规的反相HPLC相同的固定相材料，还可以使用所说的“整体式”非特殊填充。在一些形式的CEC中，压力和电渗作用驱动含分析物的溶剂通过柱体。

“复合物”在这里指的是直接或间接彼此接触的分子的集合体或聚集体。这里所使用的“接触”，或者更具体地说，“直接接触”涉及分子的复合物，或者涉及特异性或特异的结合，指的是两个分子足够接近使得弱非共价的化学相互作用，如范德华力、氢键、离子和疏水相互作用等等，为分子作用力的主导作用。一般来说，由于在测定条件下该复合物在热力学上比其组成分子的非聚集状态更为有利，因此该分子复合物较稳定。这里所使用的“复合物”通常涉及两种或多种蛋白质的稳定聚集体，还被等价地称为“蛋白-蛋白复合物”。这里所使用的“胞内复合物”或“胞内蛋白-蛋白复合物”指的是通常出现在生物细胞的细胞质或细胞核中的蛋白质复合物，其可以包括一种或多种胞内蛋白质和表面膜受体的复合物。属于这类复合物的示范性胞内蛋白包括但不限于，PI3K蛋白、Grb2蛋白、Grb7蛋白、Shc蛋白、和Sos蛋白、Src蛋白、Cbl蛋白、PLCγ蛋白、Shp2蛋白、GAP蛋白、Nck蛋白、Vav蛋白、和Crk蛋白。在一个方面，该复合物包括PI3K或Shc蛋白。在另一个方面，复合物为包含两种蛋白质，或2至4种蛋白质，或2至6种蛋白质的稳定聚集体。这里所使用的“信号复合物”是一种作为信号通道成分的胞内蛋白-蛋白复合物。示范性的信号复合物列于表IIIA-B中。在一个方面，术语“复合物”包括核类固醇或者脂肪酸受体与它们的辅助因子，例如过氧化物酶体增殖活化因子的复合物。

“二聚体”指两种或多种相同或不同蛋白的复合物，包括膜结合受体。相同蛋白的二聚体称为“同型二聚体”，不同蛋白的二聚体称为“异型二聚体”。二聚体通常由两种彼此接触的蛋白组成。二聚体可通过被动的过程，如范德华作用等等，如上在“复合物”的定义中所述，形成于细胞表面膜上，或者二聚体也可以通过主动的过程形成，例如通过配体引发的二聚化作用，磷酸化作用、共价连接，与胞内成分的相互作用等等，例如Schlessinger，Cell，103：211-225(2000)。

“疾病状态”包括但不限于以下的特征：染上疾病的可能性，疾病的存在与否，疾病严重性的预后，以及通过胞内复合物作用的特殊治疗试剂引起的患者对治疗的反应可能性。至于癌症，“疾病状态”或“癌症状态”进一步包括对癌症前期或癌细胞或组织的检测，对病人的选择，其通过一种或多种胞内复合物，如一种或多种蛋白-蛋白二聚体，作用的治疗剂的治疗后的可能反应，以及这种治疗剂的改进治疗效果。

“ErbB受体”或“Her受体”是属于ErbB受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(“Her1”)、ErbB2(“Her2”)、ErbB3(“Her3”)以及ErbB4(“Her4”)受体。ErbB受体通常包含可以连接ErbB配体的胞外区域；亲脂性跨膜区域；保守胞内酪氨酸激酶域；以及带有几个可磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号域。ErbB受体可以是天然序列的ErbB受体或者是其氨基酸序列的变异体。优选该ErbB受体为天然序列人类ErbB受体。在一个方面，ErbB受体包括Her受体的截短形式，包括但不限于，EGFRvIII和p95Her2，在Chu等，Biochem.J.，324：855-861(1997)；Xia等，Oncogene，23：646-653(2004)；等等中公开。

术语“ErbB1”，“表皮生长因子受体”和“EGFR”以及“Her1”在这里可以互相替换使用，指天然序列EGFR，例如在Carpenter等，Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987)中公开，包括其变异体(例如，EGFR的缺失突变体，如Humphrey等，PNAS(USA)87：4207-4211(1990))。erbB1指编码EGFR蛋白产物的的基因。能结合EGFR的抗体实例包括MAb579(ATCC CRL RB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利No.4943533，Mendelsohn等)以及其变异体，例如嵌合的225(C225)以及重塑的人类抗体225(H225)(参见WO 96/40210，Imclone SystemsInc)。

“Her2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”可以互相替换使用。除非另有说明，这里使用术语“ErbB2”、“c-Erb-B2”和“Her2”时是指人类蛋白质。该人类ErbB2基因和ErbB2蛋白质例如描述于，Semba等，PNAS(USA)82：6497-650(1985)和Yamanoto等，Nature319：230-234(1986)(Genebank登录号X03363)。与Her2特异性结合的抗体实例在美国专利5677171；5772997；Fendly等，Cancer Res.，50：1550-1558(1990)等中公开。

“ErbB3”和“Her3”指受体多肽，例如在美国专利No.5183884和5480968以及Kraus等PNAS(USA)86：9193-9197(1989)中公开，包括其变异体。能结合Her3的抗体实例在美国专利No.5968511中有描述，例如8B8抗体(ATCC HB 12070)。

术语“ErbB4”和“Her4”这里指受体多肽，例如在欧洲专利申请No.599274；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：1746-1750(1993)；以及Plowman等，Nature，366：473-475(1993)中所述，包括其变异体，如WO 99/19488中公开的Her4异构型。

“***-1受体”或“IGF-1R”指人类受体酪氨酸激酶，其基本上与Ulrich等EMBO J.，5：2503-2512(1986)或Steele-Perkins等，J.Biol.Chem.，263：11486-11492(1988)中披露的那些相同。

“I-kB蛋白”或者“NF-kB蛋白抑制物”是指在I-kB蛋白处于部分磷酸化状态的任何时候能够与人类NF-kB蛋白形成稳定复合物的人类蛋白。在一个方面I-kB蛋白具有与NCBI登录号000221或Baeuerle和Baltimore，Science，242：540-546(1988)中所述的物质基本上相同的氨基酸序列。

“分离的”涉及多肽或蛋白质，是指基本上从其天然环境的成分中分离出。优选地，分离的多肽或蛋白质是一种与其天然环境成分相比由至少百分之八十重量的相同序列多肽或蛋白质构成的组合物；更优选地，该组合物与其天然环境成分相比由至少百分之九十五重量的相同序列的多肽或蛋白质构成；并且更优选地，该组合物与其天然环境成分相比由至少百分之九十九重量的相同序列的多肽或蛋白质构成。最优选地，该分离的多肽或蛋白质为同质的组合物，通过基于分子量和等电点的二维凝胶电泳的常规分离之后，其能够被分辨成单个的点。通过常规的二维凝胶电泳来进行这种分析的方案对本领域普通技术人员来说是公知的，例如，Hames和Rickwood主编，Gel Electrophoresis ofProteins：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，1981)；Scope，Protein Purfication(Springer-Verlag，New York，1982)；Rabilloud主编，Proteome Research：Two-Dimensioned Gel Electrophoresis andIdentification Methods(Springer-Verlag，Berlin，2000)。

“试剂盒”指的是用于运送材料的任何输送***。就反应测定而言，这种输送***包括可以从一个地点到另一个地点进行储藏、运送或交付反应试剂(例如，在适当容器中的探针、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液，对实现测定的书面说明等)的***。例如，试剂盒包括一个或多个装有相关反应试剂和/或支持材料的外包装(如盒子)。这些内容物可以一起或分别地交给预定的接受者。例如，第一个容器可含有测定中所用的酶，而第二个容器包含探针。

“NF-kB蛋白”或者“核因子κB蛋白”是指作为由Rel(也叫作c-Rel)、RelA(也叫作p65和NF-kB3)、RelB、NF-kB1(也叫作p50)和NF-kB2(也叫作p52)构成的相关转录因子组中的成员的人类蛋白。在一个方面，NF-kB蛋白为p50-RelA二聚体，并且在I-kB蛋白处于部分磷酸化的任何时候能够与人类I-kB蛋白形成稳定的复合物。NF-kB蛋白以及其与I-kB蛋白的关系在以下参考文献中有所描述：Karin等，Nature Reviews Drug Discovery，3：17-26(2004)；Karin等，NatureReviews Cancer，2：301-310(2002)；Li等，Nature ReviewsImmunology，2：725-734(2002)；和Baldwin，Annu.Rev.Immunol.，14：649-681(1996)。

“百分比相同的”或类似术语在此涉及参照序列与另一序列(即“候选”序列)的比对，指在两个序列之间的最佳比对中，候选序列与参照序列在许多亚单位位点上相同达到了指明的百分比，所述亚单位对于多核苷酸的比对来说是核苷酸，对于多肽的比对来说是氨基酸。这里所使用的术语被比对序列的“最佳比对”是指亚单元之间的最大匹配程度和构建比对中所采用差别数量的最小化。百分相同比可以采用市场上可购得的算法工具来测定，该算法在Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)(Wisconsin Sequence Analysis Package“GAP”程序，Genetics Computer Group，Madison，WI)中有描述。本领域中用于构建比对和计算百分相同比或其他相似性测量的其他软件包包括“BestFit”程序，基于Smith和Waterman的算法，Advances in AppliedMathematics，2：482-489(1981)(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Genetics Computer Group，Madison，WI)。换句话说，例如，为获得具有与参照氨基酸序列至少95％相同氨基酸序列的多肽，该参照序列中有多达5％的氨基酸残基可以缺失或被另一氨基酸所取代，或者占参照序列总氨基酸残基数目5％的氨基酸可以***该参照序列中。参照序列的这些变换可能发生在该参照氨基酸序列的氨基或者羧基端位点处或者那些端点位置之间的任何位置，或者单个地散布在作为整体的参照序列的残基中间，或者以较邻近基团的形式散布在该参照序列中。应当明白，在与本发明的参照序列进行比对时，候选序列可以为较大多肽或多核苷酸的组分或片段，并且为计算百分相同比目的进行的这种比对涉及相关的组分或片段。

“磷脂酰肌醇3激酶蛋白”或者等同的“PI3K蛋白”指人类蛋白质组中的一种人类胞内蛋白，NCBI登录号NP_852664、NP_852556和NP_852665，以及氨基酸序列基本与之相同的蛋白质。

“血小板衍生生长因子受体”或者“PDGFR”指与PDGFRα或PDGFRβ或其变异体基本上相同的人类受体酪氨酸激酶蛋白，在Heldin等，Physiological Reviews，79：1283-1316(1999)中有描述。在一个方面，本发明包括通过测定以下组中的一种或多种二聚体来确定癌症状态，癌症早期状态，纤维化或硬化状态：PDGFRα同型二聚体、PDGFRβ同型二聚体以及PDGFRα-PDGFRβ异型二聚体。特别地，纤维化状态包括肺或肾纤维化，硬化状态包括动脉硬化症。癌症包括但不限于，乳腺癌、直肠癌、成胶质细胞瘤以及卵巢癌。单独涉及“PDGFR”时应理解成指“PDGFRα”或“PDGFRβ”。

“多肽”是指由氨基酸残基组成的一类化合物，氨基酸残基通过酰氨键去除了一个氨基酸羧基和另一个氨基酸氨基之间的水的而化学连接在一起。多肽是氨基酸残基的聚合体，它可以含有大量的这种残基。通常，除了由较少数量的氨基酸所组成以外，肽与多肽类似。肽有时被称作寡肽。多肽和肽之间没有明确的区分。为了方便起见，在此公开说明和权利要求中，术语“多肽”一般将用于指肽和多肽。氨基酸残基可以是天然的或合成的。

“蛋白质”指多肽，通常由生物细胞合成，折叠成固定的三维结构。蛋白质的分子量通常在约5,000至约5,000,000或以上，更常见在约5,000至约1,000,000的分子量，并且可包括翻译后的修饰，如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰氨化、共价连接核黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、法尼基化(farnesylation)、脱甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸化合物、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羧基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、selenoylation、硫酸化，以及泛醌化，如Wold，F.的Post-translational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，1-12页，B.C.Johnson 主编，AcademicPress，New York，1983。蛋白质包括，例如而并非限制，细胞因子或白介素，酶如激酶、蛋白酶、半乳糖苷酶等等，鱼精蛋白，组蛋白，白蛋白，免疫球蛋白，硬蛋白，磷蛋白，粘蛋白，色蛋白，脂蛋白，核蛋白，糖蛋白，T-细胞受体、蛋白多糖等等。

“受体酪氨酸激酶活化状态”、“受体酪氨酸激酶通道活化状态”或“RTK通道活化状态”或类似术语，是指在一个或多个通道中与RTK相关的一种或多种信号复合物的相对数量的图案或图像。例如，同一样品中PI3K//RTK复合物的数量超过Shc//Grb2复合物的数量时，表明PI3K-Akt通道相对于Ras-MAPK通道占优势活性。RTK通道活化状态的特定水平或值或测量规模取决于一些因素，包括样品中的细胞种类，是否存在疾病状况，各通道中靶定的复合物的种类等等。RTK通道活化状态的水平或值可通过在标准或预定条件下参考已知或正常水品的选定复合物的标准或参照样品来确定。这里所使用的“状态”涉及癌症患者，是指来自癌症患者的样品、样本或活检样品的RTK通道活化状态。该“状态”可以涉及疾病确定或分类、预后、药物功效、患者对治疗的反应、是否推荐辅助治疗、疾病复发的可能性等等。

“受体酪氨酸激酶”或者“RTK”指具有胞内激酶活性并且选自蛋白质RTK家族的人类受体蛋白，如Schlessinger，Cell，103：211-225(2000)；和Blume-Jensen与Hunter(引用见上)中所述。“受体酪氨酸激酶二聚体”指细胞表面膜中包含两种受体酪氨酸激酶蛋白的复合物。在一些方式中，受体酪氨酸激酶二聚体可包含两种共价连接的受体酪氨酸激酶蛋白。示范性的RTK二聚体列于表I中。特别受到关注的RTK二聚体有Her受体二聚体和VGEFR二聚体。

“标准样品”指代表正常或非疾病状态的一种或多种细胞、异种移植物、或组织样品，将患者样品的测量值与其对照以确定受体复合物的存在是否过量或者在患者样品中的存在量减少。标准样品的性质对于特定的测定来说是设计选择的问题，可以从患者自己的正常组织中获得或测得，或者从健康个体的人群的组织中获得。优选地，标准样品中涉及受体复合物数量的值是在与被测患者样品中相应值基本上相同的实验条件下获得的。标准样品可以来自与患者样品同种的组织，或者可以来自不同的组织类型，并且用以获得该标准样品组织的人群可以选择与患者具有相符合的特征，例如年龄、性别、种族等等。典型地，在本发明的测定中，将患者样品中受体复合物的数量与标准样品中相应的值相比较，该标准样品预先制成表格并提供平均范围、平均值和标准偏差，或类似表示方式。

“样品”或“组织样品”或“患者样品”或“患者细胞或组织样品”或“样本”都是指从受试者或患者的组织中获得的相似细胞集合。组织样品的来源可以是固体组织，如来自于新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检或吸入气；血液或任何血液成分；体液例如脑脊液、羊水、腹水、或者组织液；或者是来自于受试者怀孕或成长中任何时期的细胞。组织样品可包含与该组织非自然混合的化合物，其本质是例如防腐剂、抗凝血剂、缓冲液、固定剂、营养物、抗生素等等。在本发明的一个方面，组织样品或患者样品为固定的，特别是常规的***固定的石蜡包埋样品。这些样品典型地用在对固定组织的薄切片形式的受体复合物测定中，例如3-10μm厚，其中该固定组织设置在显微镜载玻片，或等同物的表面上。这些样品还典型地经过常规的再水合过程，并且可选择地，进行了抗原修复过程作为测定试验预处理过程的一部分。

“分离图像”(separation profile)涉及分子标签的分离，是指表、图、曲线、柱形图，或者其他表示信号强度数据与有关分子标签的参数例如停留时间、质量等之间关系的方法，它提供了测定试验中产生的各种类型分子标签的数量读数或测量值。分离图像可以是电泳图谱、色谱图、电色谱图、质谱图，或类似的根据所采用的分离技术的数据图形表示。涉及分离图像的“峰”或“带”或“区”是指分离化合物所集中的区域。一个测定试验可能有多个分离图表，例如，当不同的分子标签具有独特发射光谱的不同荧光标记，并且在多个波长下采集和记录数据时。在一个方面，所释放的分子标签由于电泳迁移率的差异而形成电泳图谱从而被分离，其中不同的分子标签对应于电泳图谱上不同的峰。电泳图谱中对不同或者较少重叠的相邻峰值的测量值即为“电泳分辨率”，它可被视为相邻峰值最大值之间的距离除以该峰值的两个标准偏差中较大值的4倍。优选地，相邻峰值的分辨率至少为1.0，更优选至少为1.5，最优选至少为2.0。在给定的分离和检测***中，所需的分辨率可通过选择多个分子标签来获得，这些分子标签成分的电泳迁移率至少有分辨峰数量的区别，该数量依赖于几个本领域普通技术人员公知的因素，包括信号检测***，荧光部分的性质，标签的扩散系数，筛选基质的存在与否，电泳设备的特性，例如有无通道、分离通道的长度等等。利用分析程序可以分析电泳图谱，从而与分子标签的存在、不存在或者数量的数据特征相关联，该程序例如在William等人的美国专利公开2003/0170734A1中所披露。

“SHC”(代表“Src同源2/α-胶原蛋白有关的”)指与Pelicci等在Cell，70：93-104(1992)中所述基本相同的、RTK信号通道中的适配体蛋白家族(66，52和46kDalton)中的任何一个。在一个方面，SHC指这种适配体蛋白的人类形式。

“信号通道”或者“信号传导通道”指一系列的分子活动，其开始通常是细胞表面受体与胞外配体的相互作用或者胞内分子与细胞表面受体的磷酸化位点相结合，其导致了对细胞核中基因表达的调控。“Ras-MAPK通道”指的是一种信号通道，其包括在形成Ras-GTP复合物之后对MAPK蛋白的磷酸化。“PI3K-Akt通道”指的是一种信号通道，其包括通过PI3K蛋白对Akt蛋白的磷酸化。

“特异”或“特异性”涉及一个分子与另一个分子的结合，例如对靶分析物或复合物的结合化合物或探针，指的是探针与靶之间的识别、接触并形成稳定的复合物，同时该探针与其他的分子基本上较少地识别、接触或形成复合物。在一个方面，“特异”涉及第一分子与第二分子相结合，是指第一分子与反应或样品中的另一分子进行识别并形成复合物的程度，其能与该第二分子形成最大数目的复合物。在一个方面，该最大数目至少占第一分子所形成全部这种复合物的50％。一般来说，涉及特异性结合过程的分子在其表面或空穴中有一些区域，能在彼此结合的分子之间产生特异的识别。特异性结合的实例包括抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸中形成双重体或三重体、受体-配体相互作用等等。

这里所使用的“光谱分辨的”涉及多个荧光标记，指该标记的荧光发射波段足够明显，即足以不发生重叠，使得各标记物连接的分子标签可以根据相应标记物所产生的荧光信号通过标准光电检测***来区分，例如，采用带通滤波器和光电倍增管等等，如示例性地描述于美国专利No.4230558；4811218等等，或者Wheeless等，21-76页，in FlowCytometry：Instrumentation and Data Analysis(Academic Press，New York，1985)。

“基本相同”涉及被比对的蛋白质或者相关蛋白质家族中的蛋白质氨基酸序列，指的是或者一种蛋白质的氨基酸序列有至少百分之五十与另一种蛋白质相同，或者一种蛋白质是另一种蛋白质相同基因的异构型或剪接变异体。在一个方面，基本上相同指一种蛋白质，或其氨基酸序列，与另一种蛋白质或其氨基酸序列有至少百分之八十相同。

这里所使用的“VEGF受体”或“VEGFR”涉及血管内皮生长因子(VEGF)的细胞受体，是一种存在于血管内皮细胞上，以及保持有结合人类VEGF能力的其变异体上的常见的细胞表面受体。VEGF受体包括VEGFR1(也叫作Flt1)、VEGFR2(也叫作Flk1或KDR)和VEGFR3(也叫作Flt4)。这些受体描述于：DeVries等，Science255：989(1992)；Shibuya等，Oncogene 5：519(1990)；Matthews等，Proc.Nat.Acad.Sci.88：9026(1991)；Terman等，Oncogene 6：1677(1991)；Terman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.187：1579(1992)。VEGF受体二聚体公开于：Shibuya，Cell Structure and Function，26：25-35(2001)；和Ferrara等，Nature Medicine，9：669-676(2003)。

发明详述

本发明提供了一种用胞内复合物作为生物有机体中疾病状态或其他生理状态，特别是人类癌症状态的生物标记的方法。在一个方面，直接测定来自于患者样品的胞内复合物；也就是说，进行测量而不作培养，形成异种移植物，或采用类似的技术，这需要额外劳动和费用并且可能在测量中引入假象和/或噪声。在本发明的一个特定方面，直接在冷冻患者样品的组织裂解物或者固定患者样品的切片上测定一种或多种受体复合物。在优选实施方式中，在***固定的石蜡包埋(FFPE)样品切片中测定一种或多种胞内复合物。

在另一个方面，本发明提供了一种间接测量胞内蛋白磷酸化的方法，通过测定其形成依赖于这种翻译后修饰的复合物而实现。

在另一个方面，本发明提供了一种在同一测定反应混合物中同时测定多个胞内复合物的方法。优选地，采用可释放性地连接着一个或多个分子标签的结合化合物来测定该复合物，这样在结合了复合物中的蛋白质之后，该分子标签可以从反应或测定混合物中释放和分离出来用以检测和/或定量。

在另一个方面，本发明提供了一种测定患者疾病状态的方法，包括以下步骤：测定一种或多种胞内蛋白-蛋白复合物在患者样品中每种的数量；将该每种的数量与其标准样品中的相应数量相比较；以及将患者样品中的数量与标准样品中的各相应数量之差与患者疾病状态的存在或严重性相关联。在优选实施方式中，测定步骤包括：(i)提供一种或多种结合化合物，其对一种或多种复合物的每种中的蛋白质具有特异性，使得每种结合化合物具有一种或多种分子标签，分别通过可裂解连接物连接于其上，并且使该一种或多种分子标签连接着具有不同分离特性的不同结合化合物，这样通过将分子标签从不同的结合化合物上分离，而形成了分离图像上的独特峰；(ii)将该结合化合物与一种或多种复合物混合，使得结合化合物特异性地结合于其相应的复合物蛋白从而形成可检测的复合物；(iii)裂解形成可检测的复合物的每种结合化合物的可裂解连接物，以及(iv)分离和鉴定所释放的分子标签以确定该一种或多种蛋白复合物的存在与否或者数量。

在另一个方面，测定一种或多种复合物的数量的方法包括以下步骤：i)向一种或多种复合物的每种提供裂解探针，其对所述一种或多种复合物的每种的第一蛋白具有特异性，各裂解探针具有有效近程的裂解引发部分；(ii)提供一种或多种结合化合物，其对所述一种或多种复合物的每种的第二蛋白具有特异性，使每种结合化合物具有一种或多种分子标签，分别通过可裂解连接物连接与其上，并且使所述一种或多种分子标签连接着具有不同分离特性的不同结合化合物，这样通过将分子标签从不同的结合化合物上分离，而形成了分离图像上的独特峰；(iii)将裂解探针、结合化合物与所述一种或多种复合物混合，使得裂解探针特异性地结合于复合物的第一蛋白，而结合化合物特异性地结合于复合物的第二蛋白，这样结合化合物的可裂解连接物处于裂解探针裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及(iv)分离和鉴定所释放的分子标签以确定该一种或多种蛋白复合物的存在与否或者数量。优选地，复合物和第一与第二蛋白选自表IIA和IIB中列出的复合物。

在另一个方面，本发明通过采用能产生局部作用的裂解剂的裂解探针和由可释放分子标签标记的结合化合物的方法来实现，其中所述分子标签可通过所述裂解剂来释放。通过设计裂解探针和结合化合物，使得至少一种裂解探针特异性地结合到与至少一种结合化合物不同的复合物成分上，从而可以检测复合物的形成。在该方式下，预定类型的分子标签仅在复合物形成时被释放出来。

在本发明的另一个方面，从患者获得生物样品，其中包括怀疑含有稀少目标细胞的混合细胞群体。接着通过将该生物样本与偶联生物特异性配体的磁性颗粒混合来制备样品，所述生物特异性配体能与所述稀少细胞上不同于或不存在于血细胞上的抗原特异性反应(这里称为“捕获抗原”)，这样可以基本去除其他的样品成分。使样品处于磁场中，该磁场可有效地分离磁性颗粒标记的细胞，包括所述稀少的目标细胞，如果其存在于样本中的话。然后采用对胞内复合物特异的结合部分所偶联的分子标签来分析上述分离的细胞群体，以确定稀少细胞的存在与否和/或数量。在优选实施方式中，该方法中使用的磁性颗粒为胶体磁性纳米颗粒。优选地，该稀少细胞群体为循环上皮细胞，其可以利用上皮特异性捕获抗原从患者血液中分离，该抗原例如以下文献中所公开：Hayes等，Internation J.of Oncology，21：1111-1117(2002)；Soria等，Clinical Cancer Research，5：971-975(1999)；Ady等，BritishJ.Cancer，90：443-448(2004)；其均引入作为参考。特别地，可采用单克隆抗体BerEP4(Dynal A.S.，Oslo，Norway)通过磁性颗粒来捕获人类表皮细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种确定患者癌症状态的方法，包括以下步骤：(i)通过将患者血液样品与一种或多种抗体组合物接触来免疫磁分离包含循环上皮细胞的患者样品，每种抗体组合物对捕获抗原具有特异性并连接着磁性颗粒；(ii)测定患者样品中一种或多种胞内复合物每种的数量；将每种这些数量与其对应的标准样品中的数量相比较；并将患者样品中的数量与标准样品中的各相应数量之差与患者癌症状况的存在性或严重性相关联。在优选的实施方式中，测量方法包括步骤：(i)提供一种或多种结合化合物，其对一种或多种胞内复合物的每种中的蛋白质具有特异性，使得每种结合化合物具有一种或多种分子标签，分别通过可裂解连接物连接于其上，并且使该一种或多种分子标签连接着具有不同分离特性的不同结合化合物，这样通过将分子标签从不同的结合化合物上分离，而形成了分离图像上的独特峰；(ii)将该结合化合物与一种或多种胞内复合物混合，使得该结合化合物特异性地结合于该一种或多种胞内复合物中的相应蛋白从而形成可检测的复合物；(iii)裂解形成可检测的复合物的每种结合化合物的可裂解连接物，以及(iv)分离和鉴定所释放的分子标签以确定该一种或多种胞内复合物的存在与否或者数量。

形成可检测复合物的示范性蛋白质

在一个方面，通过同时测定蛋白-蛋白复合物，可用本发明的测定来确定一种或多种凋亡通道是否被活化。特别受关注的蛋白-蛋白复合物包括但不限于下表中的蛋白质。优选的是下列蛋白的人类形式和蛋白质家族。

表I.

在凋亡通道中形成胞内复合物的示范性蛋白质

缩写	注释NCBI参考	参考文献
			14-3-3 protein	BC003047	Aitken et al，Biochem.Soc.Trans.，30：351-360(2002)；Subramanian et al，Exp.CellRes.，271：142-151(2001)
BAD	BC001901AF031523BT006678	Ottilie et al，J.Biol.Chem，272：30866-30872(1997)；Schurmannet al，Mol.Cell.Biol.20：453-461(2000)；Baell et al，Biochem.Pbarmacology，64：851-863(2002)
			BID		Gross et al，Genes &Development，13：1899-1911(1999)；Baell et al(引用如上)
BIK/NBK		Gross et al(1999，引用如上)；Baell et al(引用如上)
			Blk		Gross et al(1999，引用如上)；Baell et al(引用如上)
Hrk		Gross et al(1999，引用如上)
			BLM/BOD		Gross et al(1999，引用如上)；Baell et al(引用如上)
NIP3		Gross et al(1999，引用如上)；Baell et al(引用如上)
			NIX/BNIP3		Gross et al(1999，引用如上)；Baell et al(引用如上)
Noxa		Antonsson，Cell Tissue Res，306：347-361(2001)
			PUMA		Antonsson(引用如上)
			BAX		Antonsson(引用如上)；Gross etal，Mol.Cell.Biol.20：3125-3136(2000)；Baell et al(citedabove)
BAK		Gross et al(1999，引用如上)
			Bcl-Xs		Gross et al(1999，引用如上)
BOK/MTD		Gross et al(1999，引用如上)
			Bcl-G		Puthalakath et al，Cell Death andDifterentiation，9：505-512(2002)
			Bcl-2	M14745	Srivastava et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，96：3775-3780(1999)；Baell

		et al(引用如上)
			Bcl-XL		Gross et al(1999，引用如上)
Bcl-W		Gross et al(1999，引用如上)
			MCL-1		Gross et al(1999，引用如上)
A1/Bfl-1		Gross et al(1999，引用如上)
			BOO/DIVA		Gross et al(1999，引用如上)
NR-13		Gross et al(1999，引用如上)
NF-kB
			I-kB
			caspase-9		Creagh et al，BiochemicalSociety Transactions，29：696-702(2001)；
FADD		Creagh et al(引用如上)
			TRADD		Creagh et al(引用如上)
Apaf-1		Creagh et al(引用如上)

表IIA

凋亡通道中的示范性蛋白-蛋白复合物

(其中“蛋白1//蛋白2”表示由蛋白质1和蛋白质2组成的复合物)

14-3-3//BAD	BID//BAX	BAX//BAX	Bcl-XL//BAD	Bcl-2//BAD
					14-3-3//BID	BID//BAK	BAX//Bcl-2	Bcl-XL//BIK	Bcl-2//BIK
NF-kB//I-kB	BID//Bcl-2		Bcl-XL//BID	Bcl-2//BID
					FADD//caspase-9	BID//Bcl-XL		Bcl-XL//Hrk	Bcl-2//Hrk
TRADD//caspase-9	BID//A1/Bfl-1		Bcl-XL//BIM	Bcl-2//BIM
					Apaf-1//caspase-9			Bcl-XL//Noxa	Bcl-2//Noxa
			Bcl-XL//Bmf	Bcl-2//Bmf
								Bcl-XL//Puma	Bcl-2//Puma
			Bcl-XL//Bcl-G	Bcl-2//Bcl-G
								Bcl-XL//NIP3	Bcl-2//NIP3
			Bcl-XL//Nix	Bcl-2//Nix

表IIB

示范性的RTK二聚体和胞内复合物

(其中“蛋白1//蛋白2”表示由蛋白质1和蛋白质2组成的复合物)

RTK二聚体	下游复合物
		Her1-Her1	Her1//Shc，Grb2//Sos，Her1//Grb7，Her1//RasGAP
Her1-Her2	Her1//Shc，Grb2//Shc，Her2//Shc，Grb2//Sos，14-3-3//Bad，Her1//RasGAP
		Her1-Her3	Her3//PI3K，Her3//Shc，Her3//Grb7，Her1//Shc，Grb2//Sos，14-3-3//Bad，Her1//RasGAP
Her1-Her4	Her3//PI3K，Her1//Shc，Grb2//Sos，Her1//RasGAP
		Her2-Her2	Her2//Shc，Grb2//Sos，14-3-3//Bad，Her1//RasGAP
Her2-Her3	Her3//PI3K，Her3//Shc，Her3//Grb7，Grb2//Shc，Her2//Shc，Grb2//Sos，14-3-3//Bad，Her1//RasGAP
		Her2-Her4	Her3//PI3K，Grb2//Shc，Her2//Shc，Grb2//Sos，14-3-3//Bad；YAP//Her4，Her1//RasGAP
Her3-Her4	Her3//PI3K，Her3//Shc，Her3//Grb7，YAP//Her4，Her1//RasGAP
		Her4-Her4	Her3//PI3K，YAP//Her4，Her1//RasGAP
IGF-1R(covalenthomodimers)	IGF-1R//PI3K，IGF-1R//Shc；IGFR//IRS1
		VEGFR1(Flt1)-VEGFR2(KDR)	VEGFR//Shc；VEGFR//PI(3)K；VEGFR//Src；VEGFR//FRS2
VEGFR2(KDR)-VEGFR2(KDR)	VEGFR//Shc；VEGFR//PI(3)K；VEGFR//Src；VEGFR//FRS2
		PDGFRa-PDGFRa	PDGFRa//Crk，PDGFR//Grb2；PDGFR//Grb7；PDGFR//Nck；PDGFR//Shc；，PDGFR//STAT5
PDGFRa-PDGFRb	PDGFRa//Crk，PDGFRb//GAP，PDGFR//Grb2；PDGFR//Grrb7；PDGFR//Nck；PDGFR//Shc，PDGFR//Shp2；PDGFR//RasGAP，PDGFR//STAT5
		PDGFRb-PDGFRb	PDGFRb//GAP，PDGFR//Grb2；PDGF//Grb7；PDGFR//Nck；PDGFR//Shc，PDGFR//Shp2，PDGFR//RasGAP；，PDGFR//STAT5
Kit/SCFR(homodimers)	Kit//Shp-1；Kit//p85PI(3)K；Kit//Grb2；Kit//CRKL
		FGFRR(particularly FGFR1homodimers)	FGFR//PLCg1；FGFR//Crk；FGFR//FRS2；FGFR//Shp2；FGFR//Shb
NGFR(TrkA)-NGFR(TrkA)	Trk//p75NTR；Trk//PI(3)K
			Shc//Grb2；Grb2//SOS Shc//Her1；Shc//Her2；Shc//Her3；PI3K//Her1；IGF-1R//PI3K；IGF-1R//Shc；Erk//Rsk；14-3-3//FKHRL1；CyclinD1//Cdk4；14-3-3//tuberin；14-3-3//Cdc25C；14-3-3σ//Cdc2；RXRα//CAR；RXRα//PPARα；RXRα//PXR；Hsp90//Akt1

样品制备

含有分子复合物的样品可以广泛地来自于适用于本发明的各种来源，从而使受体复合物的数量与疾病状态或健康状态相关，包括细胞培养物、动物或植物组织、患者活组织切片等等。优选地，样品为人类患者样品。可利用常规的技术来制备样品用于本发明的测定，所用技术可根据取得样品的来源确定。

A.固体组织样品。

对于活检和医学样本来说，以下参考文献中提供了技术指导：Bancroft JD & Stevens A主编，Theory and Practice of HistologicalTechniques(Churchill Livingstone，Edinburgh，1977)；Pearse，Histochemistry.Theory and applied.第四版(ChurchillLivingstone，Edinburgh，1980)。

在癌症状态区域中，可以采用的患者组织样品实例包括但不限于，乳腺、***、卵巢、结肠、肺、子宫内膜、胃、唾液腺、或胰腺。所述组织样品可通过多种方法获得，包括但不限于，外科切除、抽吸或活组织切片。组织可以是新鲜的或者是冷冻的。在一个实施方式中，本发明的测定是在固定并用石蜡或类似物包埋的组织样品上实施的；因此，在该实施方式中，要进行脱去石蜡的步骤。组织样品可以通过常规的方法固定(即防腐)[参见例如，“Manual of Histological Staining Methodof the Armed Forces Institute of Pathology”，第3版(1960)，Lee G.Luna，HT(ASCP)主编，The Blakston Division McGraw-Hill BookCompany，New York；The Armed Forces Institute of PathologyAdvanced Labotatory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Miked主编，Armed Forces Institute of Pathology，American Registry of Pathology，Washington，D.C.。本领域技术人员应当明白，固定剂的选择是根据被组织染色或作其他分析所用的组织的用途来决定的。本领域技术人员还应当明白，固定的长度取决于组织样品的尺寸和所使用的固定剂。举例来说，可用中性缓冲液***、布安氏液或多聚甲醛来固定组织样品。

一般来说，首先固定组织样品，然后通过递增系列的乙醇脱水，用石蜡或其他切片介质渗透和包埋，使该组织样品形成切片。或者，可以将组织进行切片并固定所获得的切片。举例来说，可用常规的方法在石蜡中包埋和处理该组织样品(参见例如，“Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，supra)。可使用的石蜡实例包括但不限于，Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦组织样品被包埋后，该样品就可通过显微切片机或类似仪器进行切片(参见例如，“Manual of Histological Staining Methodof the Armed Forces Institute of Pathology”，supra)。对于该步骤举例来说，切片厚度可在约三微米至约十二微米的范围内，优选地，厚度在约5微米至约10微米的范围内。在一个方面，切片面积可以从约10mm²至约1cm²。一旦切片之后，可通过一些标准的方法将该切片加到载玻片上。载玻片粘合剂的实例包括但不限于硅烷、凝胶、聚-L-赖氨酸等等。举例来说，可将该石蜡包埋的组织粘贴到带正电的载玻片上和/或涂附有聚-L-赖氨酸的载玻片上。

如果使用了石蜡作为包埋材料，该组织切片一般来说要脱去石蜡并与水进行再水合。该组织切片可通过几种常规的标准方法来脱去石蜡。例如，可采用二甲苯和逐渐递减系列的乙醇(参见例如，Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute ofPathology”，supra)。或者，可采用市场上可购买到的脱石蜡无机试剂，如Hemo-De(CMS，Houston Tex.)。

对于哺乳动物的组织培养细胞、新鲜组织或类似来源来说，可以通过常规的细胞裂解技术来制备样品(例如0.14M NaCl，1.5mM MgCl₂，10mM Tris-Cl(pH8.6)，0.5％Nonidet P-40以及所需的蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂)。对于新鲜的哺乳动物组织来说，样品的制备还可以包括组织解聚步骤，例如破碎、剁碎、研磨、超声处理等等。

B.细胞的磁性分离。

在一些应用中，例如在测定来自于患者血液的稀少转移性细胞上的二聚体时，可以在进行表面受体二聚体数量测定之前实施一个富集的步骤。可以利用各种本领域已知的技术和材料来进行免疫磁性分离或者富集过程，如以下代表性参考文献中所公开，引入其作为参考：Terstappen等的美国专利6365362；Terstappen等的美国专利5646001；Robr等的美国专利5998224；Kausch等的美国专利5665582；Kresse等的美国专利6048515；Kausch等的美国专利5508164；Miltenyi等的美国专利5691208；Molday的美国专利4452773；Kronick的美国专利4375407；Radbruch等，Methods in Cell Biology，Vol42中第23章，(AcademicPress，New York，1994)；Uhlen等，Advances in BiomagneticSeparation(Eaton Publishing，Natick，1994)；Safarik等，J.Chromatography B，722：33-53(1999)；Miltenyi等，Cytometry，11：231-238(1990)；Nakamura等，Biotechnol.Prog.，17：1145-1155(2001)；Moreno等，Urology，58：386-392(2001)；Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.，95：4589-4594(1998)；Zigeuner等，J.Urology，169：701-705(2003)；Ghossein等，Seminars in SurgicalOncology，20：304-311(2001)。

优选用于实施本发明的磁性颗粒是性质如胶体的颗粒。这种颗粒的特征在于其亚微密级的颗粒尺寸，通常小于约200纳米(nm)(0.20微米)，并且其稳定性对于溶液中的重力分离能持续较长时间。除了许多其他的优点之外，该尺寸范围还使其对于细胞分析中常用的分析技术来说基本上不可见。预计在90-150nm范围内并且磁质量在70-90％之间的颗粒适用于本发明。适合的磁性颗粒由周围围绕着分子的超顺磁性材料晶核构成，该分子例如通过物理吸附或共价连接而结合到磁性核心上并赋予其稳定的胶体特性。涂覆材料优选的施加量应有效地防止生物样品中的生物大分子与磁性核心之间的非特异性相互作用。这种生物大分子可包括非目标细胞表面上的唾液酸残基、外源凝集素、糖蛋白以及其他的膜成分。此外，该材料应当含有尽可能多的磁质量/纳米颗粒。包括核心的磁性晶体尺寸应足够小使其不含有完整的磁畴。纳米颗粒的尺寸足够小使得其布朗能量超过了其磁矩。结果，这些胶体磁性颗粒几乎不出现北极、南极的对齐以及之后的相互吸引/排斥作用，甚至于在适度强大的磁场下也是，这有助于其溶液的稳定性。最后，该磁性颗粒应当可在高磁场梯度的外部场分离器中被分离。该特征有利于样品处理，并且具有比加载铁磁性珠或钢丝绒的较复杂内部梯度柱更经济的优点。具有上述特性的磁性颗粒可以通过美国专利No.4795698、5597531、5698271中所述的基本材料来制备，引入这些专利作为参考。

采用可释放分子标签的测定试验

采用可释放分子标签来测定胞内复合物的数量具有许多优点，包括：(1)从测定混合物中分离所释放的分子标签可以大大降低本底和显著提高灵敏度；以及(2)使用为简化分离和检测过程而特别设计的分子标签提供了便利的多元化性能，这样很容易在同一测定中同时测得多个受体复合物成分。采用了这种标签的测定可具有多种形式并在以下参考文献中所公开：Singh等的美国专利6627400；Singh等的美国专利公开2002/0013126；以及2003/0170915，和Williams等的2002/0146726；和Chan-Hui等的国际专利公开WO2004/011900，所有文献在此引入作为参考。例如，可采用根据被分离分子之间的物理、化学或光学特性差异来区分分子的多种分离技术，所述特性包括但不限于电泳迁移率、分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、荷/质比、极性等等。在一个方面，多个或一组分子标签在电泳迁移率和光学检测特性上有所不同，因而通过电泳来分离。在另一个方面，多个或一组分子标签可以在分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性上有所不同，因而通过正相或反相HPLC、离子交换HPLC、毛细管电泳、质谱法、气相色谱法等等技术来分离。

提供成组的分子标签，在其从结合化合物上释放之后通过分离技术分离成不同的带或峰。鉴定并定量这些峰可提供对受体二聚体种类和数量的测定值或图像。一组分子标签可具有不同的化学性质；然而，为方便起见，成组的分子标签通常化学性质相关。例如，其可以都为肽，或者其可以由相同碱基构建区或单体的不同组合构成，或者其可以采用具有不同取代基的相同碱基骨架来合成以赋予不同的分离特性，如下面所详细描述。多个分子标签的数量根据一些因素可以有所不同，包括采用的分离模式，分子标签上使用的检测标记物，结合部分的灵敏度，裂解可裂解连接物的效率等等。在一个方面，用于测定受体二聚体数量的多个分子标签的数量在2到10的范围内。在其他方式中，多个分子标签的数量可在2到8，2到6，2到4，或2到3的范围内。

可以在均匀相或非均匀，即多相的测定试验中检测胞内复合物。在均匀相中，不需要任何步骤来将特异性结合于靶复合物的结合化合物从未结合的结合化合物中分离。在优选实施方式中，均匀相采用的试剂对包括(i)具有可释放分子标签的一种或多种结合化合物和(ii)能够产生活性物质的至少一个裂解探针，该活性物质可与分子标签反应并在该裂解探针的有效近程内释放分子标签。

胞内复合物还可以通过采用多相形式的测定试验来测定。多相技术通常涉及分离步骤，其中将具有特异性结合的结合化合物的胞内复合物从未结合的结合化合物中分离，并且可选择地从其他样品成分，如蛋白质、膜碎片等中分离出来。可以通过各种方式实现分离过程，例如采用结合着固相支持物的试剂，其可以区分出结合的复合物和未结合的结合化合物。固相支持物可以是容器壁，例如微滴定孔板的孔、毛细管、平板、载玻片、微珠，包括磁珠，脂质体等等。该固体支持物的主要特征是(1)可以分离结合的与未结合的结合化合物，以及(2)不干扰结合复合物的形成，或者在确定胞内复合物时的其他操作。通常，在固定样品中，未结合的结合化合物通过洗涤可容易地去除掉。

在多相形式中利用分子标签检测时，在洗涤之后，可将样品与溶剂混合，在其中释放分子标签。根据可裂解键的性质和裂解方法，该溶剂中可包括用于裂解的任何附加试剂。在不需要裂解试剂的情况下，该溶剂可以方便地作为分离缓冲液，例如，电泳分离介质。例如，通过光敏剂产生的活性物质，该可裂解连接物具有光敏感性的或易分解性时，可以用适当波长的光照射该介质以将该分子标签释放到缓冲液中。

无论哪种形式下，如果测定反应的条件干扰了所采用的分离技术，则可能需要在裂解和分离分子标签之前去除或交换该测定反应缓冲液。例如，在一些实施方式中，测定条件包括盐浓度(例如特异性结合所需的)，当分子标签在电泳迁移率基础上进行分离时，该盐浓度其会使分离的性能降低。在该实施方式中，释放和分离分子标签之前，要用分离缓冲液或介质来替代测定缓冲液。

采用了可释放分子标签和裂解探针的测定试验根据被检测或测定的复合物可以采取多种不同的形式和构造。根据本公开说明书，对于本领域普通技术人员来说选择特定的结合化合物和裂解探针的数量和特异性是一种设计选择。

图1A说明本发明一个实施方式的操作。分子复合物(100)由蛋白(104)和(102)的结合形成，例如14-3-3和磷酸化BAD。本发明的试剂(107)包含裂解探针(108)(在该图示中连接有光敏剂“PS”)和结合化合物(106)，将其与含有复合物(100)的样品混合，在该混合条件下裂解探针(108)和结合化合物(106)与复合物(100)上其相应的抗原决定簇发生特异性结合(112)，其中其相应的抗原决定簇位于复合物的不同蛋白上。结合之后，选择性地进行洗涤或缓冲液交换，活化裂解探针(108)以产生活性物质，例如单线态氧，其从光敏剂上扩散出来在有效近程(110)内。该近程内的可裂解连接物被裂解并释放出分子标签(114)。接着分离(117)所释放的分子标签(116)并制作分离图像(120)，例如电泳图谱，其中识别出峰(118)并与分子标签“mT₁”相对应。采用其他的结合化合物和分子标签可以测定其他的复合物。图1B表示了一个更复杂的实施方式，其中采用了额外的结合化合物来测定样品中蛋白(104)的总量。本发明的反应试剂(122)包含(i)裂解探针(108)、第一结合化合物(106)和第二结合化合物(107)，其中第一结合化合物(106)对蛋白(102)具有特异性，第二结合化合物(107)对蛋白(104)在与裂解探针(108)特异性不同的抗原决定簇处具有特异性。与图1A的实施方式类似，在结合反应试剂之后，裂解探针(108)被活化产生活性物质，其可以在光敏剂的有效近程内裂解该分子标签的可裂解连接物。在该实方式中，分子标签从同时连接着反应试剂(107)和(108)蛋白(104)的单体上，以及连接着试剂(108)并单独或同时连接着试剂(106)和(107)的异型二聚体上释放出来。将释放的分子标签(123)分离，分离图像(126)中的峰(118和124)与所释放分子标签的数量相关。在该实施方式中，相关峰的高度或面积可以反映(i)第一和第二结合化合物对其相应抗原决定簇的亲和性差异，和/或(ii)对结合化合物具有特异性的抗原决定簇的存在与否。无论何时将结合化合物用于监测蛋白质的翻译后状态，如磷酸化状态，后一种情况都很重要。

对凋亡信号分子的同型二聚体以及异型二聚体复合物的测定如图1A-1C中所示。图1C说明了一种用于测定同型二聚体复合物的方法。如上所述，测定可包括三种反应试剂(128)：裂解探针(134)、第一结合化合物(130)和第二结合化合物(132)。第一结合化合物(130)和裂解探针(134)被构建成对样品中以同型二聚体(136)或单体(138)形式存在(140)的蛋白(138)上相同的抗原决定簇(135)具有特异性。在能促进反应试剂和其相应靶之间形成稳定复合物的条件下，反应试剂(128)与样品混合之后，测定混合物中形成了多种复合物(142至150)。由于裂解探针(134)和结合化合物(130)特异于相同的抗原决定簇(135)，反应试剂的四种不同组合(144至150)可形成具有同型二聚体的复合物。在测定混合物中的复合物中，只有那些(143)同时具有裂解探针(134)和至少一个结合化合物的复合物能够贡献出释放的分子标签(151)用以分离和检测(154)。在该实施方式中，峰(153)的大小与测定混合物中同型二聚体的数量成正比，而峰(152)的大小与测定混合物中蛋白(138)的总量成正比，其既有单体形式(142)又有同型二聚体形式(146和148)。

本发明的另一个方面如图1D和1E所示，其中提供了对细胞样品中的多种复合物的同时检测或测定。将细胞(160)，其可来自于体外培养或者来自于患者组织样本，裂解(172)以提供可接近的分子复合物，其连接着细胞膜，和/或在细胞质中，和/或在细胞核中。与凋亡信号相联系的复合物包括但不限于，表面受体复合物，如受体二聚体，包括适配体或多种类型的分子骨架的受体复合物，二聚体和较高度有序化的胞内蛋白复合物，该复合物中的蛋白质磷酸化位点等等。裂解之后，得到的裂解物(174)与包含多个裂解探针(175)和多个结合化合物(177)的测定试剂(176)混合。选择(178)测定条件使得试剂(176)与其相应的靶特异性结合，这样经过活化后，裂解引发部分的有效近程(180)内的可裂解连接物被裂解，并释放出(182)分子标签。如上所述，裂解之后，将释放的分子标签分离(184)并在分离图像(186)如电泳图谱中进行鉴定，并根据所测得的分子标签数和量来获得样品细胞中选定分子复合物的图像。

图1F和1G说明了本发明测定固定或冷冻的组织样品中受体复合物的实施方式。将固定的组织样品(1000)，例如***固定的石蜡包埋样品，利用显微切片机或类似仪器切割获得切片(1004)，放置在表面(1006)如显微载玻片上之后，进行脱蜡和再水化以便加入测定试剂。放大图(1007)表示了部分(1014)显微载玻片(1006)上的部分(1008)切片(1004)。所示胞内复合物(1018)与固定样品的残余膜结构(1016)在一起。根据本发明的这个方面，裂解探针和结合化合物与固定样品一起温育，使得它们与其靶分子结合。例如，裂解探针(1012)(图中表示为连接着光敏剂(“PS”)的抗体)与第一结合化合物(1010)(表示为连接着分子标签“mT₁”的抗体)特异性地结合着通用于所有所示复合物的蛋白(1011)，第二结合化合物(1017)(具有“mT₂”)特异性地结合着蛋白(1015)，以及第三结合化合物(1019)(具有“mT₃”)特异性地结合着蛋白(1013)。洗涤以去除未特异性结合其相应靶分子的结合化合物和裂解探针之后，加入缓冲液(1024)(图中称为“照射缓冲液”)。为方便起见，可通过在载玻片(1006)上形成疏水性载体，例如用蜡笔，将缓冲液(1024)包含在切片(1004)或其一部分上。照射光敏剂并释放分子标签(1026)之后，将当前含有释放的分子标签(1025)的缓冲液转移到分离装置中，例如毛细管电泳仪，用以在例如电泳图谱(1030)中分离(1028)和鉴别所释放的分子标签。

对直接在组织样品上进行的测定，尤其如图1F和1G所示，可以进行标准化处理，其包括测定对样品中总细胞数和/或样品中特性亚型的细胞具有代表性的靶细胞或组织。这种靶组织在此称为“组织指示物”。优选甚至必须进行额外的测定，因为患者样品，尤其是肿瘤样品中的细胞和组织具有不均匀性，其可能包含正常细胞的基本片段。例如，图1H中，受体(1011)的总量值可作为以下两个测量值的比例给出：分子标签(“mT₁”)的峰(1032)面积和与样品中所有细胞共有的细胞或组织成分，如微管蛋白，有关的分子标签的相应峰面积。在一些情况下，样品中所有细胞都是上皮细胞时，或者目标细胞是侵入非上皮组织的上皮细胞时，可以采用细胞角蛋白，或者细胞角蛋白和微管蛋白。因此，基于可释放分子标签的方法可以包括额外的步骤，即提供特异于标准化蛋白如微管蛋白的结合化合物(具有独特的分子标签)。

图1H说明用于测定含有共有成分受体的受体二聚体的相关数量优选实施方式。在该测定设计中，可根据该共有成分参比测量两种不同的受体二聚体(“1-2”(240)和“2-3”(250))，其中每种都含有共有成分“2”。所示的测定设计是用于测定包含受体“1”(222)和受体“2”(220)的受体异型二聚体(240)，以及包含受体“2”(220)和受体“3”(224)的受体异型二聚体(250)。该实施方式的一个关键特征是裂解探针(227)对异型二聚体对的共有受体具有特异性。特异于受体“2”的结合化合物(228)提供了与测定中受体“2”总量相关的信号(234)，而特异于受体“1”的结合化合物(226)和特异于受体“3”的结合化合物(230)提供的信号(分别是232和236)分别仅与受体“1”和受体“3”的数量相关，所述受体“1”和受体“3”分别存在于与受体“2”形成的异型二聚体中。图1H的设计可以推广到含有共有成分的两种以上的受体复合物中，仅需要加入特异于额外复合物成分的结合化合物。

A.结合化合物

如上所述，本发明的一个方面包括提供多种不同结合化合物的混合物，其中每种不同的结合化合物具有一种或多种通过可裂解连接物连接的分子标签。结合化合物、可裂解连接物以及分子标签的性质可以在很大范围内变化。结合化合物可包含抗体结合组分、抗体、肽、针对细胞表面受体的肽或非肽配体、蛋白、寡核苷酸、寡核苷酸类似物如肽核酸，外源凝集素，或者其他的能够与目标分析物特异性结合或者形成稳定复合物，如蛋白质复合物，的分子实体。在一个方面，结合化合物可用以下通式表示，包含一种或多种连接着结合部分的分子标签。

B-(L-E)_k

其中B为连接部分；L为可裂解连接物；E为分子标签。在均相测定中，可裂解连接物L可以为易氧化的连接物，更优选是能够被单线态氧裂解的连接物。部分“-(L-E)_k”表示单个结合化合物可具有多个分子标签，通过可裂解连接物连接。在一个方面，k是大于或等于一的整数，而在其他实施方式中，k可以大于几百，例如100至500，或者k大于几百并多达几千，例如500至5000。通常多个不同类型的结合化合物的每个都具有不同的分子标签E。可裂解连接物，例如易氧化连接物，与分子标签E通过常规的化学方法连接到B上。

优选地，B为抗体结合组合物。这种组合物很容易由市场上可购买的各种抗体制得，其可以是单克隆和多克隆的，对目标蛋白质具有特异性。特别地，以下专利中公开了对表皮生长因子受体具有特异性的抗体，引入其作为参考：5677171；5772997；5968511；5480968；5811098。美国专利6488390，这里引入作为参考，其公开了对G蛋白偶联受体CCR4具有特异性的抗体。美国专利5599681，这里引入作为参考，其公开了对蛋白质的磷酸化位点具有特异性的抗体。供应商如Cell Signaling Technology(Beverly，MA)；BiosourceInternational(Camarillo，CA)，和Upstate(Charlottesville，VA)，也提供对多种蛋白具有特异性的单克隆和多克隆抗体，例如凋亡通道中的蛋白质，包括表II中列出的蛋白质。

可裂解连接物L，实质上可以是任何化学连接基团，其可以在不降解所释放分子标签E的结构或影响其检测特性的条件下发生裂解。无论何时将裂解探针用于均相测定，可裂解连接物L都会被该裂解探针产生的裂解剂裂解，其中裂解探针在短距离中起作用使得仅在该裂解探针的直接近程中的可裂解连接物会发生裂解。典型地，这种试剂必须通过反应混合物发生物理或化学变化才能被活化，使得该试剂产生短暂的活性物质扩散到可裂解连接物处进行裂解作用。在均匀相中，裂解剂优选连接着结合部分，如抗体，其在活化之前使裂解试剂靶向特定的位点，该位点位于具有可释放分子标签的结合化合物的近程内。在该实施方式中，裂解剂在此被称为“裂解引发部分”，其将在下面更为详细的论述。

在非均匀相中，由于特异性结合的结合化合物从未结合的结合化合物中分离出来，所以可以更广泛地选择使用可裂解连接物和连接试剂。可裂解连接物不仅包括容易与局部作用反应物质，如过氧化氢、单线态氧等起反应的连接物，也包括对整个反应混合物中的试剂不稳定的连接物，例如对碱不稳定的连接物、可光裂解的连接物、可由还原反应裂解的连接物、由氧化反应裂解的连接物、对酸不稳定的连接物、可由特异性蛋白酶裂解的肽键等等。参考文献中描述了许多这类连接物，包括Greene和Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第二版(John Wiley & Wons，New York，1991)；Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，New York，1996)；以及Still等的美国专利5565324。示范性的可裂解连接物如表III中所示。

表III

连接基团                        裂解试剂

甲硅烷	氧化物或酸
		A	hv
B	Ce(NH4)2(NO3)6
		-NCO2-	HO-，H+，或LiAlH4
C	O3，OsO4/IO4 -，或KMnO4
		D	1)O2或Br2，MeOH2)H3O+
-Si-	氧化，H+，Br2，Cl2，etc.等
		E	H3O+
F	H3O+
		G	F-orH+
H，其中x为酮、酯氨基、NO2、亚砜、砜以及吸电子基团	碱，HO-
		I	H3O+或还原(e.g.Li/NH3)
J	(Ph3P)3RhCl(H)
		K	Li，Mg，或BuLi
M	Hg+2
		N，其中x为卤素或拟卤素	Zn或Mg
O	氧化(e.g.Pb(OAc)4或H3IO6)
		P，其中X为吸电子基团	碱

示例性的可裂解连接基团和裂解剂(L)表示了分子标签(E)的连接位点

在一个方面，本发明可以采用市场上可购买的可裂解反应物体系。例如，可在抗体结合组合物与分子标签之间利用杂官能试剂引入二硫键连接物，这些试剂如N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、succinimidyloxycarbonyl-α-甲基-α(2-吡啶二硫代)甲苯(SMPT)等等，购自供应商如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)。以还原剂处理可以破坏通过这种连接物引入的二硫键，所述还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2-巯基乙醇、硼氢化钠等等。能有效裂解二硫键的还原剂的典型浓度在10到100mM的范围内。利用同双功能的NHS酯交联剂，二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)(购自Pierce)，其中含有容易被高碘酸钠裂解的顺-二醇(例如15mM高碘酸在生理pH下4小时)，可在抗体结合组合物与分子标签之间引入对氧化剂不稳定的连接物。含有酯化间隔物成分的连接物可以用强亲核试剂裂解，例如羟胺，例如0.1N羟胺，pH8.5，37℃下3-6小时。通过同双功能的交联剂如购自Pierce(Rockford，IL)的乙二醇二(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)可以引入这种间隔物。例用砜基可引入对碱不稳定的连接物。可用于向可裂解连接物中引入砜基的同双功能的交联剂包括二[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]砜(BSOCOES)，和4，4-二氟-3，3-二硝基苯砜(DFDNPS)。示范性的裂解的碱性条件包括0.1 M磷酸钠、加入Tris碱调节至pH11.6，含有6M尿素、0.1％SDS，以及2mM DTT，37℃下温育2小时。可光裂解连接物包括Rothschild等的美国专利5986076中所公开的那些物质。

当L易被氧化时，L可以是硫醚或其硒类似物；或含有碳-碳双键的烯烃，其中双键裂解成含氧基团，释放出分子标签E。Willner等人的美国专利5622929中公开了硫醚键的例子，在此引入作为参考。烯烃的实例包括二乙烯硫、乙烯醚、烯胺、碳原子处用亚胺取代的α-次甲基(CH，具有至少一个氢原子的碳原子)，其中乙烯基可以在环中，杂原子可以在环中，或者在环烯烃的碳原子上取代，并且可有至少一个和至多四个杂原子连接到烯烃碳原子上。得到的dioxetane通过加热到环境温度以上，通常在大约75℃以下，与酸或碱反应，或者在光敏剂存在或不存在的情况下通过光活化，可以自发地分解。这类连接物和反应在以下示范性参考文献中有所描述：美国专利No.5756726，5800999和5886238。

示范性的可裂解连接物及其裂解产物如图3A-F所示。噻唑可裂解连接物，“-CH₂-噻唑-(CH2)_n-C(＝O)-NH-蛋白”，如图3A所示，形成了具有“-CH₂-C(＝O)-NH-CHO”部分的分子标签。优选地，n的范围在1至12，更优选地，在1至6。恶唑可裂解连接物，“-CH₂-恶唑-(CH2)_n-C(＝O)-NH-蛋白”，如图3B所示，形成了具有“-CH₂-C(＝O)O-CHO”部分的分子标签。所示烯烃可裂解连接物(图3C)与上述结合化合物实施方式“B-L-M-D”有关，其中D为检测部分，如荧光素染料。烯烃可裂解连接物也可以用于其他的实施方式中。所示烯烃连接物裂解产生的分子标签形式为“R-(C＝O)-M-D”，其中“R”可以是上述分子标签E的主要说明内的任何取代物。优选地，R是供电子基团，例如Ullman等的美国专利6251581；Smith和March，March’sAdvanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，andStructure，第五版(Wiley-Interscience，New York，2001)等等。更优选地，R为具有1-8个碳原子和0-4个选自O、S和N的杂原子的供电子基团。进一步优选地，R为-N(Q)₂、-OQ、p-[C₆H₄N(Q)₂]、furanyl、n-烷基吡咯、2-indolyl等等，其中Q是烷基或芳基。进一步参见图3C的烯烃可裂解连接物，取代基“X”和“R”等价于以上在说明可裂解连接物“L”的通式中的取代基“X”和“Y”。特别地，图3C中的X优选为吗啉基，-OR’或-SR”，其中R’和R”为脂肪族基、芳基、脂环族或具有1至8个碳原子和0至4个选自杂原子O、S和N的杂环。优选硫醚可裂解连接物如图3D所示，形式为“-(CH₂)₂-S-CH(C₆H₅)C(＝O)NH-(CH₂)_n-NH-”，其中n在2至12的范围内，更优选在2至6的范围内。图3D所示的硫醚可裂解连接物可通过图3E和3F中所示的前体化合物的方式连接到结合部分T和分子标签E。为与结合部分T的氨基基团相连，要通过常规的化学方法将其末端羟基转化成NHS酯。与氨基基团反应并连接之后，去除Fmoc保护基团以生成游离的氨基，之后其与分子标签的NHS酯反应。

当通过气相色谱法或质谱法对多个分子标签进行分离时，分子标签E，在本发明中可包含电泳标签，如以下文献中所描述：Zhang等，Bioconjugate Chem.，13：1002-1012(2002)；Giese，Anal.Chem.，2：165-168(1983)；以及美国专利4650750；5360819，5516931，5602273等等。

分子标签E优选为对活性物质尤其是单线态氧稳定的，并且包含检测或报告基团的水溶性有机化合物。另外，E的大小和结构可以在很大范围内变化。在一个方面，E的分子量在约50至约2500道尔顿范围内，更优选地，在约50至约1500道尔顿。E的优选结构在下面有更为详细的描述。E可包含检测基团用以产生电化学、荧光、或显色信号。在利用质量检测的实施方式中，E可以不含用于检测目的的分离部分。优选地，检测基团产生荧光信号。

在许多量中选择分子标签应使得每个对于同一量中的其他成员来说都具有独特的分离特性和/或独特的光学特性。在一个方面，色谱或电泳分离特性是在本领域常规的一套标准分离条件下的停留时间，所述条件例如压力、柱压、柱类型、移动相、电泳分离介质等等。在另一个方面，光学特性为荧光特性，例如发射光谱、荧光寿命、给定波长或波段的荧光强度等等。优选地，荧光特性为荧光强度。例如，许多量中的每种分子标签可具有相同的荧光发光特性，但每种由于独特的保持时间而与其他的相区别开。另一方面，或者许多量中的两种或更多种的分子标签可具有相同的迁移率或停留时间，但它们具有独特的荧光特性，例如光谱可分辨的发射光谱，这样许多量中的所有成员通过分子分离和荧光测定的组合而可以被区分开。

优选地，释放的分子标签可通过电泳分离以及检测基团的荧光而测得。在这些实施方式中，具有基本相同荧光特性的分子标签具有不同的电泳迁移率，这样在分离条件下电泳图谱上会形成不同的峰。优选地，本发明的多个分子标签通过常规的毛细管电泳设备来分离，在存在或不存在常规的筛选基质的情况下进行。示范性的毛细管电泳设备包括Applied Biosysterms(Foster City，CA)310、3100和3700型；Beckman(Fullerton，CA)P/ACE MDQ型；Amersham Biosciences(Sunnyvale，CA)MegaBACE1000或4000；SpectRuMedix geneticanalysis system，等等。电泳迁移率与q/M^2/3成正比，其中q为分子上的电荷数，M是分子质量。理想地，在测定条件下最接近的电泳标记物之间的迁移率之差至少约为0.001，通常为0.002，更通常为至少约0.01，并且可以为0.02以上。优选地，在这种常规设备中，许多量中的分子标签的电泳迁移率至少有百分之一的差别，更优选范围在至少百分之1至10。

在一个方面，分子标签E为(M，D)，其中M是移动改变部分，D是检测部分。符号“(M，D)”用于表明M和D部分的顺序是这样的，其中每部分都可以邻近于可裂解连接物L。也就是说，“B-L-(M，D)”表示了结合化合物的两种形式中的任何一种：“B-L-M-D”或“B-L-D-M”。

检测部分D可以是荧光标记或染料，显色标记或染料，电化学标记等等。优选地，D为荧光染料。用于本发明的示范性荧光染料包括水溶性罗丹明染料、荧光素、4，7-二氯荧光黄、苯并氧杂蒽染料、以及能量转移染料，如以下参考文献中所公开：Handbook of MolecularProbes and Research，第八版，(Molecular Probes，Eugene，2002)；Lee等的美国专利6191278；Lee等的美国专利6372907；Menchen等的美国专利6096723；Lee等的美国专利5945526；Lee等，NucleicAcids Research，25：2816-2822(1997)；Hobb，Jr.的美国专利4997928；Khanna等的美国专利4318846；等等。优选地，D为荧光素或荧光素衍生物。

移动改变部分M的大小和组成可以是链中的一个键到大约100个原子，通常不大于约60个原子，更常见的是不大于约30个原子，其中所述原子是碳、氧、氮、磷、硼和硫。一般来说，当其非键时，该移动改变部分具有约0至约40个，更常见从约0至约30个杂原子，其除了上述杂原子之外还可以包括卤素或其他的杂原子。除氢外原子总数目一般小于约200个原子，通常小于约100个原子。在存在酸根的情况下，根据该移动改变部分所存在介质的pH值，该酸根可以与多种阳离子相结合。所述酸可以是有机或无机酸，包括羧酸、thionocarboxyl、thiocarboxyl、羟肟酸、磷酸、亚磷酸、膦酸盐、亚膦酸、磺酸、亚磺酸、硼酸、硝酸、亚硝酸等等。对于正电荷来说，取代基包括氨基(包括铵)、膦、锍、氧  等等，其中取代基通常为大约1-6个碳原子的脂肪族，每个杂原子的碳原子总数通常小于约12，通常小于约9。侧链包括胺、铵盐、羟基、包括苯酚基、羧基、酯类、酰胺、磷酸根、杂环类。M可以是同型寡聚体或异型寡聚体，具有相同或不同化学性质的不同的单体，例如核苷酸和氨基酸。

B.分子标签连接到结合部分

用于将分子标签共价连接到结合化合物如抗体上的普遍性技术指导可在文献中找到，例如Hermanson，Bioconjugate Techniques，(Academic Press，New York，1996)等等。在本发明的一个方面，一种或多种分子标签直接或间接地连接到结合化合物上的共有反应基团上。共有反应基团包括胺基、硫醇基、羧酸根、羟基、醛基、酮基等等，并且可以通过市场上可购买的交联剂与分子标签偶联，例如Hermanson(引用如上)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probesand Research Products，第九版(Molecular Probe，Eugene，OR，2002)。在一个实施方式中，分子标签的NHS-酯与结合化合物上的游离氨基进行反应。

在图2A所示的另一个实施方式中，结合化合物包含作为结合部分的生物素化抗体(200)。分子标签通过亲和素或链亲和素桥(206)连接到结合部分(200)。优选地，在操作中，结合部分(200)首先与靶复合物反应，之后加入(204)亲和素或链亲和素以形成抗体-生物素-亲和素复合物(205)。向该复合物(205)加入(208)生物素化分子标签(210)以形成结合化合物(212)。

在图2B所示的另一个实施方式中，结合化合物包含由多官能部分(216)衍生的抗体(214)，该多官能部分含有多官能团(218)，其能与分子标签前体反应(220)得到连接着多个分子标签(222)的最终结合化合物。示范性的多官能部分包括氨基葡聚糖以及类似物质。

一旦每种结合化合物通过不同的分子标签分别衍生后，其即与其他的结合化合物汇合形成多个结合化合物。通常，每个不同种类的结合化合物以相同的比例存在于组合物中；然而，作为设计选择比例可以改变，使得根据特定实施方式或测定的期望或需要，特定结合化合物的一类或小类以较高或较低的比例存在。可能影响该设计选择的因素包括但不限于，对特定靶的抗体亲和性和亲和力，靶的相对优势度，分子标签检测部分的荧光特性等等。

C.产生活性物质的裂解引发部分

裂解引发部分或裂解剂是一种能产生活性物质的基团，所述活性物质能够裂解可裂解连接物，优选通过氧化的方式。优选地，该活性物质为表现出短时活性的化学物质，这样其裂解引发效果仅仅在其产生位点的近程内起作用。要么该活性物质本身寿命短，这样由于超出了其产生近程将不会产生明显的本底，要么采用能有效清除该活性物质的清除剂，使得其不会与其产生位点短距离之外的可裂解连接物反应。示例性的活性物质包括单线态氧，过氧化氢，NADH，和氢氧根，苯氧基，超氧化物等等。产生氧化反应的活性物质的说明性猝灭剂包括聚烯类、类胡萝卜素、维生素E、维生素C、酪氨酸的氨基酸-吡咯N-偶联物，组氨酸、和谷胱甘肽等等，例如Beuther等，Meth.Enzymol.，319：226-241(2000)。

对于裂解引发部分和可裂解连接物来说，一个重要考虑是当结合于靶蛋白时它们彼此去除的距离不能太远，以至于该由敏化剂产生的活性物质在其能够与可裂解连接物发生作用之前就扩散并失去了活性。因此，可裂解连接物优选在所结合的裂解引发部分的1000nm之内，并优选在20-200nm之内。裂解引发部分的该有效范围在此称为其“有效近程”。

活性物质的产生物质包括酶，例如氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、嘌呤素氧化酶(xanthene oxidase)、D-氨基酸氧化酶、NADH-FMN氧化还原酶、半乳糖氧化酶、磷酸甘油氧化酶、肌氨酸氧化酶、胆碱氧化酶以及能生成过氧化氢的乙醇氧化酶、能生成羟基的辣根过氧化物酶、能生成NADH或NADPH的各种脱氢酶、能生成氨从而形成局部高pH的脲酶。

敏化剂是一种能够被引导产生反应中间物或物质，通常为单线态氧的化合物。优选地，根据本发明使用的敏化剂是光敏剂。包括在本发明范围内的其他敏化剂有通过热、光、电离辐射，或化学活化而激活后，将释放单线态氧分子的化合物。该类化合物中最熟知的成员包括内过氧化物，例如1，4-biscarboxyethy1-1，4-萘内过氧化物，9，10-联苯蒽-9，10-内过氧化物以及5，6，11，12-四苯基萘5，12-内过氧化物。这些化合物加热或直接吸收光从而释放出单线态氧。以下文献中公开了另一些敏化剂：DiMascio等，FEBS Lett.，355：287(1994)(过氧化物酶和加氧酶)；Kanofsky，J.Biol.Chem.258：5991-5993(1983)(乳过氧物酶)；Pierlot等，Meth.Enzymol.，319：3-20(2000)(内过氧化物的热裂解)等等。

结合剂连接到裂解引发部分的方式可以是直接或间接的，共价或非共价的，并可通过公知的技术实现，其在许多文献中可以获得。参见例如，“Immobilized Enzymes”，Ichiro Chibata，Halsted Press，New York(1978)；Cuatrecasas，J.Biol.Chem.，245：3059(1970)。现已存在或者可以加入许多种类的官能团。官能团包括羧酸、醛类、氨基、氰基、乙烯、羟基、巯基等等。连接各种化合物的方法是公知的，并且在文献中有详细的说明(如上)。结合剂上连接基团的长度范围很宽，其根据被连接的化合物性质、对特定连接特性的距离效果等等而定。

裂解引发部分可与支持物结合，共价或非共价地结合到支持物的表面上或者加入支持物主体中。可通过上面所讨论的方法连接到表面上。裂解引发部分可以在支持物制备过程中或者之后加入支持物主体中。一般来说，与支持物结合的裂解引发部分的数量必须能获得所需数量的活性物质。一般来说，裂解引发部分的数量根据经验确定。

如上所述，根据本发明优选的裂解引发部分是能产生单线态氧的光敏剂。这里所使用的“光敏剂”涉及光吸收分子，其在光活化时将分子氧转换成单线态氧。光敏剂可由共价或非共价的连接物直接或间接地连接到类特异性反应物的结合剂上。对于构建这种组合物，尤其是作为结合剂的抗体的技术指导可在文献中获得，例如在光动力性疗法、免疫诊断等等领域。以下是示例性的参考文献：Ullman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，5426-5430(1994)；Strong等，Ann.NewYork Acad.Sci.，745：297-320(1994)；Yarmush等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst.，10：197-252(1993)；Pease等的美国专利5709994；Ullman等的美国专利5340716；Ullman等的美国专利6251581；McCapra的美国专利5516636等等。

同样，文献中有对于适用于本发明的光敏剂的特性和选择的技术指导。以下是参考文献的例子：Wasserman和R.W.Murray.SingletOxygen.(Academic Press，New York，1979)；Baumstark，SingletOxygen，Vol.2(CRC Press Inc.，Boca Raton，FL1983)；和Turro，Modern Molecular Photochemistry(University Science Books，1991)。

光敏剂是通过光激发可生成单线态氧的敏化剂。光敏剂包括染料和芳香族化合物，通常是由共价键连接的原子构成的化合物，通常具有多个共轭双键或三键。典型地，该化合物的吸收波长范围在约200至约1100nm，通常在约300至约1000nm，优选约450至约950nm，其吸收最大值处的消光系数大于约500M^-1cm^-1，优选地，在其激发波长处约5000M^-1cm^-1，更优选地大约50000M^-1cm^-1。在没有氧时光吸收之后所产生的激发态寿命通常至少大约100纳秒，优选至少大约1毫秒。一般来说，其寿命必须足够长以便可以裂解根据本发明的试剂中的连接物。这类试剂通常以下面所讨论的浓度存在。光敏剂的激发态通常具有与其基态不同的自旋量子数(S)，并且当基态是如同通常情况的单线态(S＝0)时，激发态通常是三线态(S＝1)。优选地，光敏剂具有高度的***间跨越形成。也就是说，光敏剂的光激发通常以至少约10％，希望至少约40％，优选大于约80％的效率形成三线态。

所选择的光敏剂是相对光稳定的，并且优选地，不与单线态氧有效地反应。大多数有用的光敏剂中存在数种结构特征。大多数光敏剂具有至少一个，有时三个或更多的共轭双键或三键，其存在于刚性的，通常是芳香族结构中。其通常含有至少一个能加速***间跨越的基团，如羰基或亚胺基，或者选自周期表3-6排的重原子，尤其是碘或溴，或者其可具有加长的芳香族结构。

已存在大量的光源用以光活化光敏剂以产生单线态氧。多色和单色光源都可以采用，只要该光源在实际的持续时间内有足够的强度产生足够的单线态氧。照射波长取决于光敏剂的性质，可裂解连接物的性质，照射源的功率，以及其到样品的距离等等。一般来说，照射时间可以是小于大约一微秒至长达10分钟，通常在大约一毫秒至大约60秒的范围内。照射的强度和波长应足够激发至少大约0.1％的光敏剂分子，通常至少大约30％的光敏剂分子，优选几乎所有的光敏剂分子。示范性的光源包括，举例而并非限制性地说，激光器，如氦-氖激光器、氩激光器、YAG激光器、He/Cd激光器、以及红宝石激光器，光电二极管，汞、钠和氙蒸汽灯，白炽灯例如钨和钨/卤素，闪光灯等等。举例来说，采用Bjornson等的国际专利公开WO 03/051669中披露的光活化装置。简而言之，光活化装置是一种安装在外壳中的发光二极管(LED)的阵列，其可以同时照亮96孔板中的所有的板孔。适用于本发明的LED有高功率GaAIAs IR发射器，例如由OPTO DIODE CORP.(Newbury Park，CA)生产的OD-880W型。

可用于本发明的光敏剂实例应具有上述特性，列举在以下文献中：Singh和Ullman的美国专利5536834；Li等的美国专利5763602；Martin等，Methods Enzymol.，186：635-645(1990)；Yarmush等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst.，10：197-252(1993)；Pease等的美国专利5709994；Ullman等的美国专利5340716；Ullman等的美国专利6251581；McCapra的美国专利5516636；Thetford的欧洲专利公开0484027；Sessler等，SPIE，1426：318-329(1991)；Magda等的美国专利5565552，Roelant的美国专利6001673等等。

在一些实施方式中，如同敏化剂一样，光敏剂可与固相支持物结合，共价或非共价地结合到支持物的表面上或者加入支持物主体中。一般来说，与支持物结合的光敏剂的数量必须能获得所需数量的单线态氧。一般来说，光敏剂的数量根据经验确定。在一个优选的实施方式中，将光敏剂加入乳胶颗粒中以形成光敏剂胶珠，例如Pease等的美国专利5709994，Pollner的美国专利6346384，和Pease等的PCT公开WO 01/84157中有披露。这种光敏剂胶珠的使用如图2C所示。如图1B中所描述的用于异源双链核酸分子的检测中，试剂(122)与样品混合之后形成了复合物(230)。在这种情况下，为代替直接将光敏剂连接到结合化合物如抗体上，裂解探针可包含两种成分：用捕获部分衍生出的抗体(232)，例如生物素(图2C中标为“bio”)，和光敏剂胶珠(238)，该胶珠的表面用与捕获部分如亲和素或链亲和素特异性结合的试剂(234)衍生得到。接着将复合物(230)通过光敏剂胶珠的捕获部分来捕获(236)。光敏剂胶珠可用于均匀或非均匀的测定相中。

在另一个示例性实施方式中，光敏剂玫瑰红通过乳胶上的氯甲基而共价连接到0.5微米的乳胶珠上，从而提供了酯连接基团，如J.Amer.Chem.Soc.，97：3741(1975)中所述。

测定条件

下面对方法、特定条件和材料的大致论述出于示例目的而非限制。本领域普通技术人员应明白如何使这里所述的方法适用于其他的应用，特别是采用不同样品、细胞类型和靶复合物的应用。

在实施本发明的方法中，混合测定成分，包括被测样品、结合化合物、以及可选择的裂解探针。一般来说，测定成分可以以任何顺序混合。然而在一些应用中，加入的顺序会有关系。例如，有人希望监测竞争性结合，例如在定量测定中。或者有人希望监测所组成的复合物的稳定性。在这些应用中，可以分步进行反应，并且在全部混合物组合好之前，或者在启动裂解反应之前可能需要温育过程。

每种反应试剂的数量通常根据经验来确定。测定中所用的样品数量由存在的靶复合物的预测数量以及用于监测测定信号的分离和检测方法所决定。一般来说，所提供的结合化合物和裂解探针数量的摩尔数应相对大于样品中靶分子的预计量，通常摩尔数应过量至少1.5倍，更优选过量10倍或更多。在特定应用中，使用的浓度可较高或较低，根据结合剂的亲和性和单个细胞上存在的靶分子预计数目而定。在测定化学化合物对形成寡聚细胞表面复合物的作用的情况下，该化合物可以在加入探针之前，同时或之后加入，根据被监测的作用而定。

在用于将探针连接到细胞表面分子的条件下，混合并温育测定混合物，通常是在水溶液介质中，一般在生理pH(类似培养细胞的pH)下，通过浓度在大约10至200mM范围内的缓冲液来保持。可采用常见的缓冲液，以及所需的其他常见添加剂，例如盐类、培养基、稳定剂等。通常采用生理和恒定的温度。温育温度的正常范围在大约4°至70℃，一般在大约15 °至45℃，更常见的在25 °至37℃。

测定混合物组成并进行温育使探针结合到细胞表面分子上之后，处理该混合物以活化裂解剂，从而将裂解剂有效近程内的标签从结合化合物上裂解下来，将相应的标签从细胞表面释放到溶液中。该处理的性质取决于裂解剂的作用机制。例如，在采用光敏剂作为裂解剂的情况下，裂解活化包括在适用于所使用的特定敏化剂的波长光下照射该混合物。

裂解之后，接着分析样品以测定被释放的标记身份。在采用多个结合化合物的情况下，其检测之前通常要对所释放的标记进行分离。分离和检测的方法在设计用于该测定的标记的过程中已确定。优选的分离方式是采用电泳法，即根据其电泳迁移率的已知差异来分离各种标记。

如上所述，在一些实施方式中，如果测定反应的条件可能干扰所采用分离技术，就需要在裂解和分离分子标签之前去除或改变测定反应缓冲液。例如，测定条件可包括盐浓度(例如特异性结合所需的)，当在电泳迁移率基础上分离分子标签时其会降低分离性能。因此，可去除这种高盐缓冲液，例如在裂解分子标签之前，并通过过滤、抽吸、稀释或其他的手段用另一种适合电泳分离的缓冲液替换。

所释放分子标签的分离

如上所述，所设计的分子标签用于分离，其中分离技术是基于一种或多种物理、化学、和/或光学特征(这里称为“分离特性”)来区分分子标签。上面还提到，可用于本发明的各种实施方式的分离技术包括正常相或反相HPLC、离子交换HPLC、毛细管电色谱法、质谱法、气相色谱法等等。优选地，选择的分离技术能够提供有关分子标签存在与否的定量信息以及定性信息(并因而对应于分析物)。在一个方面，采用了液相分离技术，这样处理含有分子标签混合物的溶液，如缓冲溶液、反应溶剂等以引起单个种类的分子标签分离。通常，该分离伴随着分子标签从这类起始混合物沿着通道的进行的差别运动，直到形成了对应于各分子标签浓度增加区域的可辨别的峰或带。这种通道可以通过流体流动、电场、磁场等等来限定。对特定分离技术的选择取决于不同的因素，包括使用该技术的成本和便利程度，该技术对分子标签化学特征的分辨能力，被分离的分子标签数目，采用的检测方法类型等等。优选地，通过电泳分离分子标签以形成电泳图谱，其通不同的峰表示被分离的分子标签。

用于电泳的方法是公知的，并且对于本领域普通技术人员来说有丰富的技术指导来进行设计选择用以形成和分离特定的多个分子标签。以下是示范性的电泳的参考文献：Krylov等，Anal.Chem.，72：111R-128R(2000)；P.D.Grossman和J.C.Colburn，CapillaryElectrophoresis：Theory and Practice，Academic Press，Inc.NY(1992)；美国专利5374527，5624800；5552028；ABI PRISM 377 DNASequencer User’s Manual，Rev.A，January 1995，Chapter 2(AppliedBiosystems，Foster City，CA)等等。在一个方面，通过毛细管电泳来分离分子标签。在本领域普通技术人员知识范围内的设计选择包括但不限于，从数种市场上可购买的型号中选择仪器，选择操作条件，包括分离介质类型和浓度、pH、预期的分离时间、温度、电压、毛细管种类和尺寸、检测模式、被分离的分子标签数目等等。

在本发明的一个方面，在电泳分离过程中或之后，通过记录所分离化合物的荧光信号和迁移时间(或迁移距离)，或者通过构建分子标签的相对荧光和迁移顺序的图表(例如电泳图谱)，可检测和鉴别分子标签。优选地，利用一种或多种标准来测定分子标签的存在与否和/或数量，如Williams等的美国专利公开2003/0170734A1中所述，在此引入作为参考。在分离过程中或者之后，可用标准方法照射荧光分子标签，例如，高强度的水银蒸气灯、激光器等等。典型地，通过He-Ne气体激光器或固态二极管激光器产生的激光来照射分子标签。接着通过光敏检测器，例如光电倍增管、电耦合装置等等来检测该荧光信号。示范性的电泳检测***在其他地方也有所描述，例如美国专利No.5543026，5274240，4879012，5091652，6142162等等。在另一个方面，可通过电化学检测法来检测分子标签，例如美国专利No.6045676中所述。

电泳分离涉及根据移动性的不同在电场中形成的分子迁移和分离。各种形式的电泳分离包括，例如而并非限制地，自由区带电泳、凝胶电泳、等电聚焦、等速电泳、毛细管电泳、以及胶束电动层析法。毛细管电泳包括电分离，优选通过电动流动，包括电泳、介电泳(dielectrophoretic)和/或电渗流动的方式，其中在横截面直径约1至约200微米，通常为约10至约100微米的管道或通道中进行。所述毛细管通常是在硅、石英、玻璃或塑料构成的薄片或薄膜中的长独立毛细管道或者通道。

在毛细管电分离中，将含有分子标签的分装反应混合物进行电分离，其中将该分装物引入作为毛细管装置一部分，或者连接于其上的电分离通道中，所述毛细管装置中还进行扩增和其他的反应。然后向通道中包含的电解质施加电压以实现混合物中成分的迁移。一般来说，根据本领域公知的技术，所施加的电压要足以达到预期成分的电分离。本领域普通技术人员应当能够确定用于本发明的给定试剂组的合适电压，和/或所裂解标记物的特征，反应介质的特征等等。电分离的参数包括介质和电压的参数，其通常进行优化以实现预定化合物的最大分离。这可以根据经验获得，并且是技术人员公知的。通过任何已知的有关毛细管电泳柱分析的方法可进行检测，包括美国专利No.5560811(11栏，19-30行)，4675300，4274240和5324401中所述，其相关说明在此引入作为参考。电泳领域的技术人员应当明白可以采用的电压或电场强度范围很宽，例如，10至1000V/cm的电场，更典型的是约200至约600V/cm的电场。商用***的电压上限是大约30kV，毛细管长度为约40至约60cm，最大场强约600V/cm。对于DNA来说，典型的毛细管具有涂层以减小电渗流动，并且毛细管的注入端保持在负电势下。

为了简化检测，整个设备可以用光学透明的塑料材料制成，其通常可以通过波长范围在约180至约1500nm，一般在约220至约800nm，更常见在约450至约700nm的光，并且透射损失低。适合的材料包括熔融硅石、塑料、石英、玻璃等等。

在本发明的一个方面，在微流控装置中电泳分离分子标签，如图6A-6C中图解所示。微流控装置在例如，美国专利5750015，5900130，6007690，和WO 98/45693，WO 99/19717和WO 99/15876中所述。方便的是，将分装物，一般不大于约5μl，直接通过电泳或者气动注入集成式***中的方式，或者通过注射器、毛细管等方式转移到微流控装置的样品储液池中。实施分离的条件是常规的并且根据产物的性质而有所不同。

如图所示，图6A-6C表示了上述应用中详细描述的微流控装置类型中的微通道网络100，用于加载样品和电泳分离上述测定中产生的探针和标签的样品。简而言之，该网络包括主分离通道102，分别以上游和下游的储液池104、106为端点。该主通道通过端点位于储液池110的侧通道108和端点位于储液池114的侧通道112而在分支轴位置处形成交叉点。两个侧通道之间的分支点形成了主通道内的样品加载区116。

在操作中，将测定混合物置于样品储液池110中，如图6A所示。正如所述那样，该测定混合物含有一种或多种具有表面结合裂解剂的靶细胞，一种或多种蛋白质探针，以及可选择地，分子标签标准物。测定反应，包括原始探针与靶细胞的结合，可在样品储液池110中进行，或者该测定反应可通过反应样品组分加入样品储液池的情况下在另一个反应容器中进行，之后在结合探针的细胞中进行探针连接物的裂解。

为将所释放的分子标签加载到样品加载区中，可在图6B所示的方向上施加跨储液池110、114的电场，其中使带负电的释放的分子标签从储液池110牵引到加载区116，同时未带电荷或者带正电荷的样品成分保留在样品储液池中。现在即可由常规的毛细管电泳法，通过在图6C所示的方向上施加跨储液池104、106的电场，来分离加载区中的释放标签。

从得到的电泳图案中可以鉴别出分子标签和相应的分析物。典型地，该方法的实施是，将荧光检测器设置在分离通道的下游端附近并构建分离分子标签的电泳图谱，首先测定上述分离特性(该情况下是电泳迁移率)，然后测定信号强度，例如峰高度或峰面积，作为与各种探针相关的分子标签相对数量的测定值。用于检测和定量可检测探针水平的方法是公知的。在一个优选的方法中，分子标签为荧光标记的。标准的荧光发射源针对分离介质下游部分中的检测区，通过标准的光检测器来检测该区域的荧光发射。所记录的信号高度或面积提供了样品中产物和底物浓度的测定值。利用上述检测信息，就可以将每种测得的分子标签指定到探针组中的一个特定的探针，并且比较各种可检测探针的相对水平，以作为其相对底物转化率或配体结合率的测定值。

在本发明的一个方面，针对分离设计了多个分子标签，通过基于一种或多种物理特性的色谱法实现，所述物理特性包括但不限于分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性等等。色谱分离技术的选择是根据参数例如柱类型、固定相、移动相等等，接着选择多种可在单次操作中可分离形成独特峰或带的分子标签。一些因素决定了本发明应选择的HPLC技术，包括被检测的分子标签数量，(即所述许多量的量)，测定中可能生成的每种分子标签的估计量，合成用于多元测定中的一组候选分子标签的可能性和容易程度，采用的检测形式，以及HPLC仪器、柱和溶剂的的可获得性、耐用程度、成本和操作容易程度。一般来说，优选那些适合于分析有限量样品并能提供最高分辨率的分离的柱和技术。对进行该选择的技术指导可以在以下文献中找到：例如Snyder等，Practical HPLC Method Development，(JoheWiley & Sons，New York，1988)；Millner，“High ResolutionChromatography：A Practical Approach”，Oxford UniversityPress，New York(1999)，Chi-San Wu，“Column Handbook for SizeExclusion Chromatography”，Academic Press，San Diego(1999)和Oliver，“HPLC of Macromolecules：A Practical Approach，Oxford University Press”，Oxford，England(1989)。特别地，可采取措施对色谱分离的给定条件，如柱类型，固定相等进行***开发和优化，例如，Haber等，J.Chromatogr.Sci.，38：386-392(2000)；Outinen等，Eur.J.Pharm.Sci.，6：197-205(1998)；Lewis等，J.Chromatogr.，592：183-195和197-208(1992)等等。

在一个方面，对分子标签候选物的最初选择受到典型地由选定柱和固定相来分离的分子的生理化学性质的制约。然后通过以下常规的优化步骤根据经验改进该最初选择，如上述参考文献中所述，并可用更适合的候选分子标签来代替特定实施方式的分离对象。在一个方面，本发明的分离对象包括(i)将许多量中的分子标签分离成可区分的峰或带中，其分离时间小于60分钟，更优选小于40分钟，更加优选地在10至40分钟的范围内，(ii)形成的峰或带应使任意结合对的分辨率至少为1.0，更优选至少为1.25，更将优选至少为1.50，(iii)分离过程中的柱压小于150bar，(iv)分离的温度在25℃至90℃的范围内，优选在35℃至80℃的范围内，以及(v)多个可区别的峰的数量在5至30个的范围并且所有的峰都在同一个色谱图中。这里所使用“分辨率”涉及两个峰或带，是这两个峰或带之间的距离除以该峰基部宽度的平均值，如Snyder等(引用如上)。多种市场上可购买到的***都十分适合于对分子标签的高通量色谱分析。本领域技术人员能够确定合适的设备用于对分子标签的自动化HPLC分析，例如自动样品制备***和自动注射***。自动化方法可用于对分子标签进行高通量分析，例如，当处理大量样品时，或者当本发明方法用于多元化应用以检测靶分析物时。适用于本发明的示范性HPLC仪器有Agilent 1100 Series HPLC***(Agilent Technologies，PaloAlto，C A)。

测定试剂的合成

用于本发明的结合化合物按照以下参考文献中的方法合成，在此引入其作为参考：国际专利公开WO 00/66607，WO 01/83502，WO02/95356，WO 03/06947，以及美国专利6322980和6514700。用于合成结合化合物的示范性试剂如图4A-J中所示。示范性合成方法如图5A-7D所示。

实施例

实施例中所使用的材料来源

对Her受体具有特异性的抗体、适配体分子、以及标准化的标准可从市场供应商处购得，包括Labvision，Cell SignalingTechnology和BD Biosciences。所有细胞系从ATCC处购得。所有的人类速冻组织样品购自William Baibridhe Genome Foundation(Seattle，WA)或者Bio Research Support(Boca Raton，FL)，并通过了供应商处的Institutional Reseach Board(IRB)认可。

以下所使用的分子标签-抗体偶联物由分子标签的NHS酯与指示抗体上的游离氨基通过常规的步骤反应而形成。分子标签，以下标记为名称“Pro_N”，在以下参考文献中有披露：Singh等的美国专利公开2003/017915和2002/0013126，引入其作为参考。简而言之，下面的结合化合物是由分子标签的NHS酯与抗体的游离氨基通过常规反应形成的分子标签-单克隆抗体偶联物。

实施例1

PI3K/Her-3受体活化复合物

在该实施例中，测定设计如图7A和7C中所示，用以测定乳腺癌细胞系MCF-7中含有Her2、Her3和PI3K的受体复合物。具有第一分子标签(图中为“mT₁”，以下为“eTagl”)结合化合物(1106)对Her3受体(1102)的胞外区域具有特异性，具有第二分子标签(图中为“mT2”，以下为“eTag2”)结合化合物(1110)对PI3K蛋白(1100)的p185成分具有特异性，而连接有光敏剂的裂解探针(1108)对Her3受体(1102)的胞内区域具有特异性。这两个测定设计类似，除了图7A的设计中裂解探针特异于Her3受体，而图7C的设计中裂解探针特异于PI3激酶的p85成分之外。该测定操作如下。

样品制备：

1.血清饥饿的乳腺癌细胞系在使用前培养过夜。

2.37℃下在培养基中用HRG刺激细胞系10分钟。用于MCF-7细胞的HRG剂量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。

3.抽吸培养基，转移到冰上，并加入如上所述的裂解缓冲液以裂解原位细胞。

4.刮取并转移裂解物至微离心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微离心10min。(可选择进行离心)

5.收集上清液作为裂解产物，分装储存于-80℃待使用。裂解缓冲液(新制作并在冰上保存)

终浓度                                 ul   储存量

1％Triton X-100                       1000 10％

20mM Tris-HCl(pH7.5)                  200  1M

100mM NaCl                            200  5M

50mM NaF                              500  1M

50mM β-甘油磷酸Na                    1000 0.5M

1mM Na₃VO₄                      100  0.1M

5mM EDTA                              100  0.5M

10ug/ml胃蛋白酶抑制剂                 100  1mg/ml

1片(每10ml)Roche Complete

蛋白酶抑制剂(#1836170)                 N/A  N/A

水                                        6500  N/A

                                         共计 10ml

测定设计：根据各图中所示的图解来参比定量受体复合物的形成。也就是说，测定读数是分子标签eTag2/eTag1的峰值比。

总测定体积为40ul。用裂解缓冲液将裂解物体积调整到10ul。抗体用裂解缓冲液稀释至20ul。典型地，每个反应中使用相当于～5000至500000个细胞的裂解产物。

步骤：在加入反应之前预先混合的抗体工作浓度为：

对于在Her-3处具有裂解探针的Her-3/PI3K复合物(图11A的设计)

eTag1_抗Her-3为10nM(该测定中eTag1为Pro14)

eTag2_抗PI3K为10nM(该测定中eTag2为Pro1)

生物素_抗Her-3为20nM

通用标准US-1为700nM

[所述通用标准US-1为偶联着生物素和分子标签Pro8的BSA，其用于使测定中链亲和素-光敏剂胶珠的量标准化]。利用常规技术例如Hermanson(引用如上)使分子标签前体(见图4A-4J)的NHS-酯与抗体上的游离氨基反应，从而使分子标签直接连接到抗体上。对于在PI3K处具有裂解探针的Her-3/PI3K复合物(图7C的设计)

eTag1_抗PI3K为10nM(该测定中eTag1为Pro1)

eTag2_抗Her-3为10nM(该测定中eTag2为Pro14)

生物素_抗PI3K为20nM

通用标准US-1为700nM

1.向测定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗体混合物到10ul的裂解物中并4℃下温育1小时。

2.加入10ul的链亲和素衍生的裂解探针(终浓度4ug/孔)到测定的孔中并温育45min。

3.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。

4.加入30ul照射缓冲液并照射。

5.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析。

数据分析：

1.使每个分子标签的相对荧光单位(RFU)信号按照其国际通用标准US-1而标准化。

2.从相应的标准化eTag报告物信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。

3.报告受体复合物的形成，作为标准化eTag2/eTag1信号的参比(如图7B和7D所示)。

实施例2

Shc/Her-3受体-适配体相互作用

在该实施例中，测定设计如图8A和8C中所示。图8A中，Her2受体(1200)和Her3受体(1202)在细胞表面膜(1204)中形成二聚体，并且所表示的每个受体都具有磷酸化位点(1209和1210)。Shc蛋白(1206和1208)分别结合于磷酸化位点(1210)和(1209)上。第一结合化合物(1214)和裂解探针(1216)对Her2受体(1200)胞外区域的不同抗原决定簇具有特异性。第二结合化合物(1212)对Shc蛋白(1206和1208)具有特异性。图8A和8C的测定设计类似，除了图8A的设计中裂解探针特异于Her2受体，而图8C的设计中裂解探针特异于Her3受体之外。因此，在前一种情况中，测定了总的Her2受体，而后一种情况中测定了总的Uer3受体。测定操作如下。样品的制备操作如上(实施例1)。

测定设计：根据各图中所示的图解来参比定量受体复合物的形成。也就是说，图8B和8D中，测定读数是作为HRG浓度的函数的mT₂/mT₁峰值比。

总测定体积为40ul。用裂解缓冲液将裂解物体积调整到10ul。抗体用裂解缓冲液稀释至20ul。典型地，每个反应中使用相当于～5000至500000个细胞的裂解产物。

步骤：在加入反应之前预先混合抗体工作浓度为：

对于在Her-3处具有裂解探针的Her-3/Shc复合物(图8B的设计)：

eTag1_抗Her-3为10nM(该测定中eTag1为Pro14)

eTag2_抗Shc为10nM(该测定中eTag2为Pro12)

eTag3_抗磷-Tyr为10nM(该测定中eTag3为Pro2)

生物素_抗Her-3为20nM

通用标准US-1为700nM

对于在Her-2处具有裂解探针的Her-2/Shc复合物(图8A的设计)：

eTag1_抗Her-2为10nM(该测定中eTag1为Pro14)

eTag2_抗Shc为10nM(该测定中eTag2为Pro12)

eTag3_抗磷-Tyr为10nM(该测定中eTag3为Pro2)

生物素_抗Her-2为20nM

通用标准US-1为700nM

1.向测定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗体混合物到10ul的裂解物中并4℃下温育1小时。

2.加入10ul的链亲和素衍生的裂解探针(终浓度4ug/孔)到测定的孔中并温育40min。

3.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。

4.加入30ul照射缓冲液并照射。

5.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析。

数据分析：

1.使每个分子标签的相对荧光单位(RFU)信号按照其国际通用标准US-1而标准化。

2.从分子标签相应的标准化信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。

3.报告受体复合物的形成，作为标准化mT₂/mT₁信号的参比(如图8B和8D所示)，以及受体磷酸化程度(数据未示出)作为mT3/mT1信号。

实施例3

同时测定14-3-3//BAD和Bcl-2//BAD凋亡复合物

在该实施例中，如图9A-9C所示，描述了一种用于测定含BAD蛋白的两种化合物的相对数量的测定试验：(i)14-3-3蛋白//BAD蛋白，和(ii)Bcl-2蛋白//BAD蛋白。裂解探针(906)对BAD蛋白(900)的第一抗原决定簇具有特异性，结合化合物(908)对BAD蛋白(900)的第二抗原决定簇具有特异性，结合化合物(910)对14-3-3蛋白(902)具有特异性，结合化合物(912)对Bcl-2蛋白(904)具有特异性。裂解探针和结合化合物应如此选择，使得其结合位点不会彼此干扰，并且该位点在任何复合物形成之时不会被挡住。测定步骤实施如下：

样品制备：

1.血清饥饿的乳腺癌细胞系在使用前培养(MCF-7)过夜。

2.37℃下在培养基中用HRG刺激细胞系10分钟。用于MCF-7细胞的HRG剂量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。

3.抽吸培养基，转移到冰上，并加入裂解缓冲液(说明如下)以裂解原位细胞。

4.刮取并转移裂解物至微离心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微离心10min。(可选择进行离心)

5.收集上清液作为裂解产物，分装储存于-80℃待使用。

裂解缓冲液(新制作并在冰上保存)

终浓度                              ul   储存量

1％Triton X-100                    1000 10％

20mM Tris-HCl(pH7.5)               200  1M

100mM NaCl                         200  5M

50mM NaF                           500  1M

50mM β-甘油磷酸Na                 1000 0.5M

1mM Na₃VO₄                         100  0.1M

5mM EDTA                           100  0.5M

10ug/ml胃蛋白酶抑制剂              100  1mg/ml

1片(每10ml)Roche Complete

蛋白酶抑制剂(#1836170)             N/A  N/A

水                                       6500  N/A

                                        共计10ml

总测定体积为40ul。用裂解缓冲液将裂解物体积调整到10ul。抗体用裂解缓冲液稀释至20ul。典型地，每个反应中使用相当于～5000至500000个细胞的裂解产物。

步骤：在加入反应之前预先混合的抗体工作浓度为：对于在Her-3处具有裂解探针的Her-3/PI3K复合物(图9A的设计)

eTag1_抗BAD为10nM

eTag2_抗Bcl-2为10nM

eTag3_抗14-3-3为10nM

生物素_抗BAD为20nM

通用标准US-1为700nM

[所述通用标准US-1为偶联着生物素和分子标签Pro8的BSA，其用于使测定中链亲和素-光敏剂胶珠的数量标准化]。利用常规技术例如Hermanson(引用如上)使分子标签前体(参见图4A-4J)的NHS-酯与抗体上的游离氨基反应，从而使分子标签直接连接到抗体上。

6.向测定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗体混合物到10ul的裂解物中并4℃下温育1小时。

7.加入10ul的链亲和素衍生的裂解探针(终浓度4ug/孔)到测定的孔中并温育40min。

8.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。

9.加入30ul照射缓冲液并照射。

10.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析。

数据分析：

1.使每个分子标签的相对荧光单位(RFU)信号按照其国际通用标准US-1而标准化。

2.从相应的标准化eTag受体信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。

测定读数如图9B和9C中所示的条形图。这些图表说明了14-3-3和Bc1-2之间的BAD的分布是如何表现的。在图9B和9C中，代表分子标签1“mT₁”的最左边条为该测定中的BAD总量测定值，既包括与14-3-3形成复合物中的，与Bc1-2形成复合物中的，也包括单体形式的。图9B表示结合到14-3-3的BAD比结合到Bc1-2上的相对更多的情况下，如图所示，最右边的条比中间的条大。图9C表示了相反的情况，即，结合到Bc1-2上的BAD比结合到14-3-3上的相对更多，如图所示，最右边的条比中间的条小。

实施例4

乳腺肿瘤样品中Her2-Her3异型二聚体测量值与

Her3-PI3K复合物测量值之间的关系

在该实施例中，利用上述方法分别测定人类乳腺肿瘤样品以确定Her2-Her3异型二聚体的数量和Her3-PI3K复合物的数量。图10表示了从该测定中获得的数据，表明这两个测量值有关联。

实施例5

***固定的石蜡包埋组织样品中的胞内复合物测定

在该实施例中，测定由球状细胞系制成的典型固定组织中是否存在PI3K-Her3复合物。对异型二聚体的测定设计与图7A中所述的基本上相同，除了以下所述的不同点之外。

典型的固定组织制备如下：用EGF或者HRG刺激组织培养基上生长的细胞，如前面实施例中所述，之后将其洗涤并刮取。离心所取下的细胞以形成球状，然后加入***并在4℃下将混合物温育过夜。用Miles Tissue Tek III Embedding Center在石蜡中包埋该固定球，之后用显微切片机(Lecia 2145型)从该球上切下10μm的组织切片。将组织切片放置在带正电的玻璃显微载玻片上(通常每片上有多个组织切片)并在60℃下烘烤1hr。

对载玻片上的组织切片测定如下：用EZ-Dewax试剂(Biogenex，San Ramon CA)采取制造商推荐的方法脱去载玻片上组织切片的石蜡。简而言之，向每个组织切片中加入500μL EZ-Dewax并在室温下温育该切片5min，之后用70％的EtOH洗涤该载玻片。重复该步骤并最后用去离子水冲洗该载玻片，之后将该载玻片在室温下水中温育20min。接着将载玻片浸入pH10的1X Antigen Retrieval溶液(Biogenesis，Brentwood，NH)，之后在微波炉中加热15min(高功率设定下5min然后在低功率设定下10min)。冷却到室温后(大约45min)将载玻片放在水中水浴5min，然后干燥。将干燥载玻片上的组织切片用疏水蜡笔圈上从而形成了能够容纳置于组织切片上的试剂的区域(如图1F-1G所示)，之后在1X Perm/Wash(BDBiosciences)中洗涤载玻片三遍。向每个切片加入50-100μL阻断缓冲液，将该载玻片放在含有去离子水的封闭潮湿盒子中4℃下2hr，之后通过抽吸去掉各切片中的阻断缓冲液。(阻断缓冲液为含有蛋白酶抑制剂(Roche)、磷酸酶抑制剂(氟化钠、钒酸钠、β-磷酸甘油)和10％鼠血清的1X Perm/Wash溶液)。向各切片加入含有结合化合物和裂解探针的40-50μL抗体混合物(每种5μg/mL，除了Her1-Her2测定中生物素-Ab5(抗Her1)为10μg/mL之外)，并将载玻片放置在潮湿的盒子中4℃下过夜。然后用100μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的Perm/Wash洗涤切片三遍，之后加入50μL在1X Perm/Wash溶液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中的光敏剂。接着将载玻片在黑暗潮湿的盒子中4℃下温育1-1.5hr，之后在保持载玻片在黑暗中的同时通过抽吸去除光敏剂。当保持在黑暗中时，接着将载玻片浸入.01XPBS中并冰育1hr。从PBS中取出载玻片，干燥，并向各切片加入40-50μL具有2pM荧光素的0.01X PBS，之后用高功率的激光二极管(GaAIAs IR发射器，型号OD-880W，OPTO DIODE CORP，Newbury Park，CA)照射1hr。荧光素作为一个标准有助于将电泳图上峰值与分子标签相关联。照射之后，将包裹着各个组织切片的溶液用吸球轻柔地混匀并转移到Applied Biosystems(Foster City，CA)3100型毛细管电泳仪上的CE板上进行分析。

图15A显示对MCF-7固定球切片中的Her2-Her3异型二聚体和PI3K-Her3二聚体的分析数据，其中细胞未受刺激或者受到40nM HRG刺激。用于PI3K-Her3的该测定设计基本上如图7A中所描述。在两种情况下都接着进行上述固定化方法，除了都不用抗原修复试剂处理样品之外。数据显示通过HRG处理，Her2-Her3二聚体增加，但PI3K-Her3二聚体的数量基本保持不变。

图15B显示对总PI3K，总Her2-Her3二聚体，以及总Her3的分析数据，其均与微管蛋白的数量相关。用常规的夹心式测定法来测定微管蛋白，该方法采用了裂解探针和具有分子标签的结合化合物。测定微管蛋白用来测试针对代表样品中总细胞数目的靶的标准化二聚体测定的步骤，这在测定具有不同细胞类型的样品时可能需要。数据表明PI3K-Her3和Her2-Her3与微管蛋白的比例与直接在PI3K-Her3和Her2-Her3上进行的测定的定性相同。

Claims (23)

1.一种确定患者疾病状态的方法，该患者所患疾病的特征在于一种或多种胞内复合物的异常表达，该方法包括以下步骤：

直接测定患者样品中一种或多种胞内复合物中每种的数量；

将上述每种数量与其在标准样品中的相应数量相比较；以及

将患者样品中的数量与标准样品中分别相对应的数量之差与患者的疾病状态相关联。

2.权利要求1所述的方法，其中所述患者样品是所述固定的组织样品、所述冷冻的组织样品或者循环上皮细胞。

3.权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种胞内复合物选自以下物质构成的组：14-3-3//BAD、BID//BAX、BAX//BAX、Bc1-X_L//BAD、Bc1-2//BAD、14-3-3//BID、BID//BAK、BAX//Bc1-2、Bc1-X_L//BIK、Bc1-2//BIK、NF-kB//I-kB、BID//Bc1-2、Bc1-X_L//BID、Bc1-2//BID、FADD//caspase-9、BID//Bc1-X_L、Bc1-XL//Hrk、Bc1-2//Hrk、TRADD//caspase-9、BID//A1/Bf1-1、Bc1-X_L//BIM、Bc1-2//BIM、Apaf-1//caspase-9、Bc1-X_L//Noxa、Bc1-2//Noxa、Bc1-X_L//Bmf、Bc1-2//Bmf、Bc1-X_L//Puma、Bc1-2//Puma、Bc1-X_L//Bc1-G、Bc1-2//Bc1-G、Bc1-X_L//NIP3、Bc1-2//NIP3、Bc1-X_L//Nix和Bc1-2//Nix。

4.权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种胞内复合物选自以下物质构成的组：  14-3-3//BAD、Bc1-2//BAD、14-3-3//BID、BAX//Bc1-2、Bc1-2//BIK、BID//Bc1-2、Bc1-2//BID、Bc1-2//Hrk、Bc1-2//BIM、Bc1-2//Noxa、Bc1-2//Bmf、Bc1-2//Puma、Bc1-2//Bc1-G、Bc1-2//NIP3和Bc1-2//Nix。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述疾病是癌症。

6.权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种胞内复合物是NF-kB//I-kB。

7.权利要求6所述的方法，其中所述疾病是炎症状态。

8.权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种胞内复合物选自以下物质构成的组：Her1//Shc、Grb2//Sos、Her1//Grb7、Her1//RasGAP、Grb2//Shc、Her2//Shc、Her3//PI3K、Her3//Shc、Her3//Grb7、YAP//Her4、IGF-1R//PI3K、IGF-1R//Shc、IGFR//IRS1、VEGFR//Shc、VEGFR//PI3K、VEGFR//Src、VEGFR//FRS2、PDGFRa//Crk、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、DGFR//STAT5、PDGFRa//Crk、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck，PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、Kit//Shp-1、Kit//PI3K、Kit//Grb2、Kit//CRKL、FGFR//PLCg1、FGFR//Crk、FGFR//FRS2、GFR//Shp2、FGFR//Shb、Trk//p75NTR以及Trk//PI3K。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述疾病是癌症。

10.权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种胞内复合物选自以下物质构成的组：Her1//Shc、Grb2//Sos、Her1//Grb7、Her1//RasGAP、Grb2//Shc、Her2//Shc、Her3//PI3K、Her3//Shc、和Her3//Grb7。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述疾病是癌症。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌或***癌。

13.权利要求2所述的方法，其中所述疾病是癌症并且其中所述一种或多种胞内复合物选自以下物质构成的组：IGF-1R//PI3K、IGF-1R//Shc、和IGFR//IRS1。

14.权利要求2所述的方法，其中所述疾病是癌症并且其中所述一种或多种胞内复合物选自以下物质构成的组：VEGFR//Shc、VEGFR//PI3K、VEGFR//Src、和VEGFR//FRS2。

15.权利要求2所述的方法，其中所述疾病是癌症并且其中所述一种或多种胞内复合物选自以下物质构成的组：PDGFRa//Crk、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck；PDGFR//Shc、DGFR//STAT5、PDGFRa//Crk、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck；PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、如PDGFR//STAT5。

16.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的方法，其中每种所述一种或多种胞内复合物通过以下步骤确定：

向所述一种或多种胞内复合物的每种提供一种试剂对，该试剂对包含具有有效近程的裂解引发部分的裂解探针，以及一种或多种结合化合物，每种具有一种或多种分子标签，通过可裂解连接物连接于其上，不同结合化合物的所述分子标签具有不同的分离特征；

将所述裂解探针和针对每种所述一种或多种胞内复合物的一种或多种结合化合物与所述患者样品混合，使得裂解探针和一种或多种结合化合物特异性结合于其相应的胞内复合物上，并且所述一种或多种结合化合物的可裂解连接物处于裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及

分离和鉴定所释放的分子标签，从而确定在所述患者样品中所述一种或多种胞内复合物的存在与否或者数量。

17.一种确定样品中细胞凋亡状态的方法，该方法包括步骤：同时测定至少一种复合物的数量，所述复合物选自以下物质构成的组：包含Bc1-2蛋白和BH3-only蛋白复合物，和包含14-3-3蛋白和BAD蛋白复合物。

18.权利要求17所述的方法，进一步包括同时测定游离的NF-kB蛋白和游离的I-kB蛋白，并且其中所述组进一步由包含NF-kB蛋白和I-kB蛋白的复合物组成。

19.权利要求18所述的方法，其中所述组进一步由包含BAX蛋白的同型二聚体组成。

20.根据权利要求17、18或19所述的方法，其中每种所述一种或多种胞内复合物通过以下步骤来确定：

向所述一种或多种胞内复合物的每种提供一种试剂对，该试剂对包含具有有效近程的裂解引发部分的裂解探针，以及一种或多种结合化合物，每种具有一种或多种分子标签，通过可裂解连接物连接于其上，不同结合化合物的所述分子标签具有不同的分离特征；

将所述裂解探针和针对每种所述一种或多种胞内复合物的一种或多种结合化合物与所述患者样品混合，使得裂解探针和一种或多种结合化合物特异性结合于其相应的胞内复合物上，并且所述一种或多种结合化合物的可裂解连接物处于裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及

分离和鉴定所释放的分子标签，从而测定在所述患者样品中所述一种或多种胞内复合物的存在与否或者数量。

21.一种测定患者中癌症状态的方法，该方法包括步骤：同时测定来自患者的样品中至少一种胞内复合物的数量，所述胞内复合物选自以下物质构成的组：包含Bc1-2蛋白和BH3-only蛋白的第一复合物，和包含14-3-3蛋白和BAD蛋白的第二复合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种胞内复合物通过以下步骤来确定：

向所述一种或多种胞内复合物的每种提供一种试剂对，该试剂对包含具有有效近程的裂解引发部分的裂解探针，以及一种或多种结合化合物，每种具有一种或多种分子标签，通过可裂解连接物连接于其上，不同结合化合物的所述分子标签具有不同的分离特征；

将所述裂解探针和针对每种所述一种或多种胞内复合物的一种或多种结合化合物与所述患者样品混合，使得裂解探针和一种或多种结合化合物特异性结合于其相应的胞内复合物上，并且所述一种或多种结合化合物的可裂解连接物处于裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及

分离和鉴定所释放的分子标签，从而测定在所述患者样品中所述第一和第二胞内复合物的存在与否或者数量。

23.一种测定样品中细胞凋亡状态的方法，该方法包括步骤：同时测定至少一种复合物的数量以及游离NF-kB蛋白和游离I-kB蛋白的数量，所述复合物选自由包含NF-kB蛋白和I-kB蛋白的复合物构成的组。

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