JP2006501165A - Jnkシグナル伝達経路の細胞透過性ペプチド阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はJNK蛋白質の効果的な阻害剤であるペプチドの発見に一部基づいている。本明細書においてJNKペプチド阻害剤と称されるペプチドは、c−Junアミノ末端キナーゼ(JNK)の下流細胞増殖作用を減少させる。
本発明は、活性化c−Junアミノ末端キナーゼ(JNK)シグナル伝達経路を阻害する細胞透過性ペプチド類の発見に一部基づいている。これらのペプチド類は、本明細書においてJNK阻害剤ペプチドと称される。さらに本発明は、JNKシグナル伝達に関連する病態生理学を処置するための方法および製薬組成物を提供する。
一態様において、本発明はJNK阻害剤ペプチドを提供する。用語の「ペプチド」は特定の長さを意味しない。幾つかの実施形態において、JNK阻害剤ペプチドは、長さがアミノ酸280個以下、例えば長さがアミノ酸150個、100個、75個、50個、35個、または25個以下である。種々の実施形態において、JNK阻害剤ペプチドは、配列番号:1〜6および21〜22の1つ以上のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、JNK阻害剤ペプチドペプチド類はJNKに結合する。他の実施形態において、前記ペプチドは、少なくとも1つのJNK活性化転写因子、例えば、c−Jun、ATF2またはEIK1の活性化を阻害する。
他の態様において、本発明は、第1および第2のドメインを含むキメラペプチドを提供する。第1のドメインは、輸送配列を含み、一方、第2のドメインは、共有結合、例えば、ペプチド結合により第1のドメインに結合しているJNK阻害剤配列を含む。第1および第2のドメインは、ペプチド内いずれの順序においても生じ得、前記ペプチドは、各ドメインの1個以上を含み得る。
JNK阻害剤ペプチドを含むキメラペプチドなどのJNK阻害剤ペプチド(例えば、表1に示されたアミノ酸配列を含むペプチド)ならびにそれらのペプチドまたは誘導体、断片、アナログまたは相同体は、これらのペプチド成分に免疫特異的に結合する抗体を生成するために免疫原として利用し得る。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル鎖、モノクローナル鎖、キメラ鎖、単独鎖、Fab断片およびFab発現ライブラリが挙げられる。特定の実施形態において、ヒトペプチドに対する抗体が開示されている。他の特定の実施形態において、JNK阻害剤ペプチドの断片が抗体生産用の免疫原として使用される。JNK阻害剤ペプチド、またはその誘導体、断片、アナログまたは相同体に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の生産のために、当該分野で公知の種々の操作を使用できる。
(望ましくないJNK活性に関連した障害)
また、本発明には、被験者におけるJNK活性化剤に伴う細胞増殖性障害を、被験者に生物学的に活性な治療用化合物(以後、「治療薬」)を投与することにより治療する方法も含まれる。
また、本発明には有毛不動毛への損傷、有毛アポトーシス、またはニューロンアポトーシスを防ぐ治療薬、すなわち細胞透過性の生物活性ペプチドを被験者に投与することにより、聴力低下を予防または治療する方法も含まれる。前記治療薬は、配列番号:1、2、3、4、5、6、11、12、13、14、15、16、21、22、23、24、25、26、27または28のペプチドであることが好ましい。
また、本発明には、ニューロンへの損傷またはニューロンのアポトーシスを防ぐ細胞透過性生物活性ペプチドの組成物を、細胞または被験者に投与することにより、ニューロン細胞死に関連した障害を治療または予防する方法も含まれる。前記組成物は、例えば、配列番号:1、2、3、4、5、6、11、12、13、14、15、16、または21〜26のペプチドである。
また、被験者に生物活性治療薬を投与すること、細胞、または被験者に細胞死または細胞損傷を防ぐ生物活性ペプチドを含有する組成物(治療薬)を投与することにより、細胞損傷または細胞死の防止または酸化的−ストレス誘導細胞死(例えば、アポトーシス細胞死)などの異常な細胞損傷を防ぐ方法も含まれる。前記細胞は、例えば、膵細胞である。前記治療薬は、配列番号:1、2、3、4、5、6、11、12、13、14、15、16、または21〜26のペプチドであることが好ましい。場合によっては、前記細胞または被験者は、コラゲナーゼもまた投与される。
前記治療薬としては、例えば:(i)JNK阻害剤ペプチドおよびその誘導体、断片、アナログおよび相同体のいずれか1つ以上;(ii)JNK阻害剤ペプチドに向けられた抗体;(iii)JNK阻害剤ペプチドおよびその誘導体、断片、アナログおよび相同体をコードする核酸;(iv)JNK阻害剤ペプチドをコードする配列に対するアンチセンス核酸および(v)モジュレーター(すなわち、阻害剤、アゴニストおよびアンタゴニスト)が挙げられる。
本発明のペプチドおよび抗体は、JNKまたはJNK阻害剤ペプチドの異常濃度を特徴とする種々の病態、疾患および障害を検出、予測、診断またはモニターするため、または、それらの治療をモニターするため、アッセイ(例えば、免疫アッセイ)に利用できる。「異常濃度」とは、身体の冒されていない部分からの、またはその疾患を有さない被験者からの類似サンプルに存在する濃度に対してあるサンプル中の増加した、または減少した濃度を意味する。免疫アッセイは、患者由来のサンプルを、免疫特異的結合から生じ得るような条件下で抗体と接触させ、引き続き抗体による何らかの免疫特異的結合量を検出または測定することを含む方法によって実施できる。ある特定の実施形態において、JNKまたはJNK阻害剤ペプチドの存在に関して、患者の組織サンプルまたは血清サンプルを分析するために、JNK阻害剤ペプチドに特異的な抗体が使用でき、ここでJNKまたはJNK阻害剤ペプチドの異常濃度は、疾病状態を示している。利用し得る免疫アッセイとしては、限定はしないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈澱アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、蛍光免疫アッセイ、補体固定アッセイ、免疫ラジオメータアッセイ、および蛋白−A免疫アッセイなどの方法を用いた競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。
本発明はさらに、抗JNK阻害剤ペプチド抗体および場合によっては、その抗体に対する標識結合パートナーを含有する1つ以上の容器を含む診断または治療に使用するキットを提供する。前記抗体に組み込まれる前記標識として、限定はしないが、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、比色部分または放射活性部分を挙げることができる。他の特定の実施形態において、JNK阻害剤ペプチドをコードするか、もしくはJNK阻害剤ペプチドに相補的な修飾または未修飾核酸および場合によっては、前記核酸に対する標識結合パートナーを含有する1つ以上の容器からなる診断使用のためのキットもまた、提供される。ある特定の代替実施形態において、1つ以上の容器において、前記キットは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR;例えば、Innisら、1990年、PCR PROTOCOLS、Academic Press社、カリフォルニア州サンディエゴを参照)、リガーゼ連鎖反応、環状プローブ反応など、または当該分野に公知の他の方法のための増幅プライマーとして作用することのできる1対のオリゴヌクレオチドプライマー(例えば、各々、長さが6〜30ヌクレオチド)を含み得る。前記キットは、場合によっては、診断薬、標準品またはアッセイにおける対照として使用するために、予め決められた量の精製JNK阻害剤ペプチドまたはその核酸をさらに含み得る。
JNKとの効率的な相互作用にとって重要なアミノ酸配列を、公知のJBD間の配列整列によって同定した。IB1[配列番号:17]、IB2[配列番号:18]、c−Jun[配列番号:19]およびATF2[配列番号:20]のJBD間の配列比較により、弱く保存された8個のアミノ酸配列が定められた(図1A)。IB1とIB2のJBDは、JNK結合においてc−JunまたはATF2の約100倍効率的であるために(Dickensら、Science 277:p.693(1997))、最大の結合を与える上で、IB1とIB2間の保存された残基が重要であるに違いないと推論された。IB1とIB2のJBD間の比較により、2つの配列間で保存性の高い7個のアミノ酸と3個のアミノ酸の2つのブロックが定められた。これらの2つのブロックは、IB1における23個のアミノ酸[配列番号:1]およびIB2における21個のアミノ酸[配列番号:2]のペプチド配列内に含まれている。これらの配列は図1Bに示されており、IB2配列におけるダッシュは、保存された残基を整列させるための配列における間隙を示している。
JNK阻害剤融合蛋白質は、JBD23のC末端、またはIB2(JBD21)由来の21個のアミノ酸配列、または、JBD20のアミノ酸配列のC末端と、HIV−TAT48〜57由来のN末端の10個のアミノ酸長担体ペプチド(Viresら、J.Biol.Chem.272:p.16010(1997))とを、2つのプロリン残基からなるスペーサーによって共有結合させることによって合成した。このスペーサーは、最大の屈曲性を可能にするため、また、不必要な二次構造の変化を防ぐために用いられた。図1Cに示されるように、これらの調製物は、各々L−TAT[配列番号:7]、L−TAT−IB1[配列番号:11]、L−TAT−IB2[配列番号:12]およびL−TAT−JNKI1[配列番号:21]と称された。全てのD−レトロ・インベルソペプチドのTAT融合蛋白質もまた合成され、各々D−TAT[配列番号:8]、D−TAT−IB1[配列番号:14]およびD−TAT−JNKI1[配列番号:22]と称された。全てのDおよびLペプチド類は、古典的なF−モック合成によって製造され、さらに質量分析によって分析された。これらを最終的にHPLCによって精製した。プロリンスペーサーの効果を測定するために、2つのプロリンを有する、および有さない2つのタイプのTATペプチドを製造した。2つのプロリンの添加により、TATペプチドの細胞内への進入または局在化は変化しないようであった。
次に、JNK生物学的活性に及ぼすIB1の23個のアミノ酸長JBD配列の効果を試験した。23個のアミノ酸配列を緑色蛍光蛋白質にN末端結合させ(GFP−JBD23構築体)、IL−1βによって誘導された膵臓β細胞のアポートシスに及ぼすこの構築体の効果を評価した。図3を参照されたい。このアポートシス様式は、JBD1〜280によるトランスフェクションによって妨げられることが以前示されていたが、一方、ERK1/2の特異的阻害剤またはp38によっては防止されなかった。上記のAmmendrupらを参照されたい。
TAT、TAT−IB1およびTAT−IB2ペプチド類(「TAT−IBペプチド類」)のLおよびD鏡像異性体の細胞進入能力を評価した。
JNKの標的転写因子のJNK媒介リン酸化に及ぼす前記ペプチドの効果をインビトロで調べた。転写および翻訳ウサギ網状赤血球ライゼートキット(Promega)を用いて、組換え非活性JNK1、JNK2およびJNK3を製造し、基質としてc−Jun、ATF2およびEIK1を単独で、またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)に融合させた固相キナーゼアッセイに用いた。L−TAT、L−TAT−IB1またはL−TAT−IB2ペプチド(0〜25μM)を、反応緩衝液(20mMトリスアセテート、1mM EGTA、10mM p−ニトロフェニルホスフェート(pNPP)、5mMピロリン酸ナトリウム、10mM p−グリセロホスフェート、1mMジチオトレイトール)中、組換えJNK1、JNK2またはJNK3キナーゼと20分間混合した。次に10mM MgCl2および5μCi33P−γーdATPおよび1μgのGST−Jun(アミノ酸1〜89)か、GST−AFT2(アミノ酸1〜96)か、またはGST−ELK1(アミノ酸307〜428)の添加により、キナーゼ反応を開始した。GST融合蛋白質は、Stratagene(カリフォルニア州ラジョーラ)から購入した。また、10μLのグルタチオン−アガロースビーズも、前記混合物に加えた。次に反応産物を、変性10%ポリアクリルアミドゲル上SDS−PAGEにより分離した。ゲルを乾燥し、引き続きX線フィルム(Kodak)に曝露した。TAT−IBペプチドの2.5μMという低用量で、JNK類によるc−Jun、ATF2およびElk1リン酸化のほぼ完全な阻害が見られた。しかし、顕著な例外は、Elk1のJNK3リン酸化のTAT−IB阻害欠如であった。全体的に見て、TAT−IB1ペプチドは、それらの標的転写因子のJNKファミリーリン酸化の阻害において、TAT−IB2よりもわずかに優れているようであった(図4Aを参照)。
ストレスの多い刺激により活性化したJNK類に及ぼすL−TAT、L−TATIB1、またはL−TATIB2ペプチドの効果をUV光照射Hela細胞またはIL−1β処理βTC細胞のJNK類を減弱させるGST−Junを用いて評価した。βTC細胞は上記のとおり培養した。Hela細胞は、10%ウシ胎仔血清、100μg/mLストレプトマイシン、100単位/mLペニシリンおよび2mMグルタミンを補足したDMEM培地中で培養した。細胞抽出調製物と用いる1時間前に、βTC細胞は上記のとおりIL−1βによって活性化し、一方、Hela細胞は、UV−光(20J/m2)によって活性化した。溶解緩衝液(20mMトリスアセテート、1mM EGTA、1%トリトンX−100、10mM p−ニトロフェニルホスフェート、5mMピロリン酸ナトリウム、10mM p−グリセロホスフェート、1mMジチオトレイトール)中、細胞培養物をこすり取って、対照物、UV光照射HeLa細胞およびIL−1β処理βTC−3細胞から細胞抽出物を調製した。SS−34ベックマンローター中15,000で5分間の遠心分離により、砕片を除去した。100μgの抽出物を室温で1時間、1μgのGST−jun(アミノ酸1〜89)および10μLのグルタチオン−アガロースビーズ(Sigma)と共に温置した。こすりおとし、緩衝液で4回洗浄後、L−TAT、L−TATIB1、またはL−TATIB2ペプチド(25μM)で補足した同一の緩衝液中に、前記ビーズを20分間再懸濁した。次に10mM MgCl2および5μCi33P−γーdATPの添加により、キナーゼ反応を開始し、30℃で30分間温置した。次に反応産物を、変性10%ポリアクリルアミドゲル上SDS−PAGEにより分離した。ゲルを乾燥し、引き続きX線フィルム(Kodak)に曝露した。これらの実験において、TAT−IBペプチド類は、活性化JNK類によるc−Junのリン酸化を効率よく防いだ(図6を参照)。
前記細胞透過性ペプチド類が、インビボでJNKシグナル伝達を妨害し得るかどうかを判定するために、非相同性GAL4系を用いた。上記のとおり培養したHeLa細胞にGAL4 DNA結合ドメインに結合させたc−Junの活性化ドメイン(アミノ酸1〜89)を含むGAL−Jun発現構築体(Strategene)と共に、5xGAL−LUCリポーターベクターの同時トランスフェクションを行った。JUNKの活性化は、直接上流のキナーゼ、MKK4およびMKK7を発現するベクター類の同時トランスフェクションにより達成した(Whitmarshら、Science 285:p.1573(1999)を参照)。簡略に述べると、DOTAP(Boehringer Mannheim)を製造元の説明書に従って用い、3.5cm皿に3x105の細胞にプラスミドのトランスフェクションを行った。GAL−Junに関する実験では、1μgのリポータープラスミドpFR−Luc(Strategene)および0.5μgのMKK4かまたはMKK7の発現プラスミドと共に、20ngのプラスミドのトランスフェクションを行った。トランスフェクション3時間後、細胞培地を交換し、L−TAT、L−TATIB1、またはL−TATIB2ペプチド(1μM)を加えた。16時間後、蛋白質含量を標準化してから、Promegaの「二重リポーターシステム」を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図5に示されるように、MKK4およびMKK7に媒介されたJNKの活性化後、TAT−IB1ペプチドおよびTAT−IB2ペプチド双方の添加により、c−Junの活性化が妨害された。HeLa細胞はJNK1異性体とJNK2異性体の双方を発現するが、JNK3異性体は、発現しないため、細胞にJNK3のトランスフェクションを行った。やはり2つのTAT−IBペプチド類は、c−JunのJNK2媒介活性化を阻害した。
IL−1βによって誘導された膵臓β細胞アポトーシス促進に及ぼすL−TAT−IBペプチド類の効果を調べた。βTC−3細胞培養液を1μMのL−TATIB1ペプチドか、またはL−TATIB2ペプチドのいずれかと共に30分間温置し、その後10ng/mLのIL−1βと共に温置した。ペプチド(1μM)の2回目の添加を24時間後に行った。IL−1βとの温置2日後、ヨウ化プロピジウム(赤い染色細胞と死滅細胞)およびヘキスト33342(青い染色細胞ともとのままの細胞膜を有する細胞)の核染色を用いて、アポトーシス細胞をカウントした。図5に示されるように、IL−1β存在下、2日間培養したβTC−3細胞のIL−1β誘導アポトーシスは、TAT−IBペプチド類の添加によって阻害された。
本発明のペプチド類は、自然的プロテオリシスを防ぐため、逆に合成された、全D−アミノ酸ペプチド(すなわち全D−レトロ・インベルソペプチド)であり得る。本発明の全D−レトロ・インベルソペプチドは、天然ペプチドと同様の官能性を有するペプチドを提供するが、このペプチドにおいて構成要素のアミノ酸の側鎖基は、天然ペプチド配列に相当するが、プロテアーゼ耐性骨格を保持すると考えられる。
実施例5に示されるように、天然プロテアーゼによる分解からのD−TAT−IBペプチド保護により、D−TAT−IBレトロ・インベルソ含有ペプチド共役体では、天然のL−アミノ酸アナログに較べた場合、長期の生物学的活性が予測される。
JNKは、イオン化照射によっても活性化される。照射誘導JNK損傷に対してTAT−IBペプチド類が保護を提供するかどうかを測定するために、図10に示されるように、D−TAT、L−TAT−IB1またはD−TAT−IB1ペプチド(照射30分前に1μMを添加)の存在下または不在下で、「WiDr」細胞を照射した(30Gy)。対照細胞(CTRL)は照射しなかった。48時間後、上記のとおりPIおよびヘキスト33342染色により細胞を分析した。n=3でSEMは示されている。このヒト大腸癌細胞系において、L−TAT−IB1ペプチド、およびD−TAT−IB1ペプチドの双方とも照射誘導アポトーシスを防ぐことができた。
TAT−IBペプチド類の放射線保護効果を測定するために、フィリップス RT 250 R線により、0.74Gy/分の線量比でC57B1/6マウス(2〜3月齢)を照射した(17mA、0.5mm Cuフィルタ)。照射30分前に、マウスにTAT、L−TAT−IB1およびD−TAT−IB1ペプチド類(1mM溶液/30μl)を腹腔内注射した。簡略に述べると、マウスを以下のとおり照射した:マウスを小型のプラスチックボックスに入れ、頭部をボックスの外に出した。照射器の下に仰向けにマウスを置き、頭部を正しい位置に維持するために、マウスの頚部を小型プラスチックトンネル内に固定した。身体は鉛で保護した。照射前マウスは、標準的なマウスペレット食餌を給餌したが、照射後は、半流動食を毎日取り換えて与えた。
X値は日数である。
示されるようにAP−1二重標識プローブ(5’−CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA−3’、5ng/mlのTNF−αで1時間処理した、または未処理のHeLa細胞核抽出物を用いて、ゲル遅延化アッセイを実施した。TATペプチドおよびL−TAT−IB1ペプチドを、TNF−αの30分前に添加した。特異的AP−1DNA複合体を有するゲルの部分だけ(未標識の特異的および非特異的競合体による競合実験によって証明された)が示されている。L−TAT−IB1ペプチドは、TNF−αの存在下でAP−1DNA結合複合体の形成を減少させる(図11を参照)。
図13、パネルAに示されるように、モルモットの右内耳内へD−JNKI(1μM、1μl/時間)の溶液を注入し、一方、左耳には、生理食塩水のみを注入した。次にモルモットを騒音傷害(120db、30分)に曝露し、3日後にに聴力感受性(図13、パネルB)ならびに内耳の組織学的検査(図13、パネルCおよびD)を実施した。図13に示されるように、組織学的検査から判断されるように線毛構造の多くが消失した未処理の耳とは対照的に、JNKIで処理した耳では、線毛構造が騒音誘導破壊から完全に保護されている。さらに、D−JNKIで処理した耳の騒音に対する感受性は、保存されているようである(図13、パネルB)。
D JNKIの存在/不在下で、ニワトリの内耳をストレプトマイシンにより処理した。次にアポトーシスを検出(緑色核)するために、TUNEL実験を実施した。図14に示されるように、D−JNKIはストレプトマイシン誘導アポトーシスから内耳を完全に保護する。しがって、D−JNKIは抗生物質療法によって被る聴力低下状態の防止に有用である。
膵臓小島細胞を、インターロイキン1B(10ng/ml)に曝露する前にD−JNKI(1mMを1時間)で処理した。図15に示されるように、D−JNKIで処理された小島はIL−1B誘導破壊に抵抗する。このことは、D−JNKIによる処理が移植された小島の保存を助けることを示している。
小島細胞単離時、コラゲナーゼと共にD−JNKIを添加した。これは乳酸デヒドロゲナーゼの増加を測定すると、3日後、培養液中の小島収量の増加をもたらした。図15を参照されたい。
(一般的ニューロン培養)
2日齢のラットの脳から皮質小片を切開し、200単位のパパリンと共に、34℃で30分間温置した。次に、100μg/mLのポリ−D−リジンで予め被覆した皿上に約1x106細胞/皿の密度でニューロンを入れた。0.5mグルタミン、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンで補足したB27/ニューロベーサル(Neurobasal)(Life Technologies)培地を用いて前記細胞を培養した。
培地内に放出されたLDH量を、サイトトックス(Cytotox)96非放射性細胞毒性アッセイキット(Promega)を用いて測定した。
:リシス緩衝液(20mMトリスアセテート、1mM EGTA、1%トリトン×−100、10mM p−ニトロフェニルホスフェート、5mMピロリン酸ナトリウム、10mM p−グリセロホスフェート、1mMジチオトレイトール)中に細胞をこすりとって細胞抽出液を調製した。25μgのサンプルを、1μgのGST−Jun(アミノ酸1〜89)および10μLのグルタチオン−アガロースビーズ(Sigma)と共に、室温で1時間温置した。前記ビーズを4回洗浄し、上記のリシス緩衝液に再懸濁した。次いで組み換えJNKIα1およびGST融合蛋白質類(例えば、GST−JunおよびGST−Elk1融合蛋白質)、カゼインおよびヒストン(Sigma)よりなる群から選択された0.5μgの基質を用いて、インビトロキナーゼアッセイを実施した。5μCi33P−ATPの存在下、10mM MgCl2およびおよび10μM ATPによって反応を開始させ、摂氏30度で30分間温置した。反応産物を、SDS−PAGEにより分離し、ゲルを乾燥してから、X線フィルム(Kodak)に曝露した。
リシス緩衝液(上記)中に細胞をこすりとって、総蛋白抽出物を得、前記蛋白質を12%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離した。次に前記の分離蛋白質をフッ化ポリビニリデン(PVDF)膜上に移した。本明細書に記載したウェスタンブロットにおいて使用した抗体は、Alexisから入手した。
ウェスタンブロット分析用に核を単離するために(図17Bを参照)、ニューロンをリシス緩衝液中に15分間溶解してから、サンプルを4℃で10分間、300gで遠心分離した。核ペレットをリシス緩衝液中で再構成してから音波処理した。
ライトサイクラー器具(Roche)上で特異的プライマーを用いて、リアルタイムRT−PCRを実施した。Chomczynski法により抽出されたRNA類の量と品質を統一するために、ハウスキーピングアクチン転写物を用いた。本明細書に参照としてその全体が組み込まれているChomczynskiら、Anal.Biochem.、162:p.156−59(1987)を参照されたい。用いられたプライマー類の配列は以下のとおりである:
cFos 正:5’−GCTGACAGATACACTCCAAG−3’
逆:5’−CCTAGATGATGCCGGAAACA−3’
アクチン 正:5’−AACGGCTCCGGCATGTGCAA−3’
逆:5’−ATTGTAGAAGGTGTGGTGCCA−5’
(P−c−jun免疫組織化学)
本明細書に用いられるP−c−junは、c−junのリン酸化形態を言う。P−c−junは、ウサギポリクローナル抗体(PBS中500x)によってターゲットにされた。生じた抗体複合体を、3,3−ジアミノベンジジンを基質として用いて視覚化した。
オスICR−CD1マウス(約6週齢で体重は約18〜37gの範囲)(Harlan社)を用い、通常の頚動脈から1本のフィラメントを内部の頚動脈内へ導入し、前記フィラメントを動脈循環内へ進入させ、そのことにより、中央大脳動脈を閉塞させることによって、虚血を引き起こした。例えば、それぞれ参照として本明細書にその全体が組み込まれている、Huangら、Science、265:p.1883−85(1994);Haraら、Proc.Natl.Acad.Sci.(米国)94:p.2007−12(1997)を参照されたい。虚血時を通し、また再灌流10分後まで頭蓋骨に固定したプローブを有するレーザー−ドップラー流量計によって、局所大脳血流を測定した。直腸温度を測定し、37℃に維持した。再灌流48時間後にマウスを殺処理した。連続低温槽切片20μM厚を、Neurolucidaプログラムを装備したコンピュータ顕微鏡システム(Microbrightfield)を用いて追跡し、Neuroexplorerプログラムによって、虚血領域および脳全体容積を算出した(盲検)3匹の追加マウスにおいて、動脈カテーテルによって、収縮期血圧と拡張期血圧を、D−JNKI注入10分前から30分後まで測定した。これらの血圧測定により、前記注入が血圧に影響を与えないことが示された(すなわち、10%未満の変化)。全ての実験は、Swiss Federal Veterinary Officeの指針に従った。
嗅覚枝との接合部における起点に対して閉じている位置で、中央大脳動脈を電気凝固することにより、中央大脳動脈閉塞を得た。体重が約27〜35gの範囲のラット(Wistarより)を中央大脳動脈閉塞24時間後に殺処理した。前記ラットは、抱水クロラールの過剰用量を用いて殺処理し、Zamboni固定剤によって左脳室を灌流した。前記脳を灌流に用いたものと同じ溶液中で2時間固定してから、前記脳を寒冷保護のため、30%スクロース中に一晩浸潤させた。各虚血領域の輪郭を、コンピュータ顕微鏡システムによって描いた(染色した)。虚血傷害および脳全体の面積を、クレシルバイオレットで染色した50μm連続低温槽切片から、Neurolucidaプログラムを用いて追跡し、各々の容積を上記のとおりNeuroexplorerプログラムを用いてを算出した。
これらの実験に用いられるJNKI1ペプチド類は、直接競合的機構により、c−Junおよび他の基質に対するJNKのアクセスを妨げることを目的としている。各々が参照としてその全体が本明細書に組み込まれているBonnyら、Diabetes、50:p.77−82(2001);Barrら、J.Biol.Chem.、277:p.10987−97(2002)を参照されたい。
ニューロン内部の種々のJNK標的に及ぼすJNKIペプチド類の効果を分析するために、一連の実験を実施した。培養液内のN−メチル−D−アスパルテート(NMDA)で処理した皮質ニューロンにおけるJNK活性化は、上記の方法を用いて、GST−c−Junを用いる減弱JNKについてのキナーゼアッセイによって予測した(例えば、各々が参照として本明細書にその全体が組み込まれているKoら、J.Neurochem.71:p.1390−1395(1998);Coffeyら、J.Neurosci.20:p.7602−7613(2000)を参照)。これらの実験結果は、図17〜18に示されている。
インビボ適用における細胞透過性ペプチド類の使用可能性を試験するために、FITCで標識したL−JNKI1およびD−JNKI1を用いて、脳内へ浸透するそれらの能力を評価した。生物学的活性蛋白質のマウスへのインビボ送達についての検討に関しては、参照として本明細書にその全体が組み込まれているSchwarzeら、Science、285:p.1569〜72(1999)を参照されたい。これらの実験により、FITCで標識したL−JNKI1およびD−JNKI1の双方とも、成体マウスおよび種々の年齢のラットの血液−脳関門を通過でき、ニューロン内へ浸透できることが示された。FITCで標識したL−JNKI1およびD−JNKI1の双方とも、、腹腔内注射の1時間以内にニューロン内へ浸透することができた。(データは示していない)。
マウスにおける軽度虚血のモデルにおいて、左中央大脳動脈を30分間閉塞させ、続いて48時間の灌流を行った。対照媒体処理群は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のみの注射を受けた。対照媒体処理群では、この閉塞は、重篤なピクノーゼ細胞を含有する顕著な梗塞を系統的に引き起こし、これらは主に全ての脳の皮質および層に見られ、脳のうち7つで、これらの細胞が海馬においても見られた。対照媒体処理群において、それらの被験体における平均梗塞容積は67.4mm3であった(n=12)。
一般に、他の神経保護的化合物の高い毒性により、それらの臨床的使用は厳しく制限されてきた(参照としてその全体が組み込まれているGladstoneら、Stroke、33:p.2123−36(2002)を参照)。種々の用量のD−JNKI1およびMK−801の治療用量(1mg/Kg、標準的治療用量)の可能的副作用の基準として、水平な回転棒上で自身を保持するマウスの能力を用いた。特にD−JNKI1のi.p.注射(11mg/kgおよび110mg/kg)およびicv注射(15.7ngまたは157ngのD−JNKI1を含有する2μl)双方の3時間後、24時間後、6日後および12日後に回転棒試験を用いて、マウスの運動機能を評価した。この評価操作時にMK−801(1mg/kg)のi.p.注射剤を対照化合物として用いた。
本発明の特定な実施形態の前述の詳細な説明から、独自の細胞透過性生物活性ペプチド類が説明されたことは明白である。特定の実施形態が、本明細書に詳細に開示されたが、これは例示のみを目的とした例としてなされたのであって、以下の添付請求項の範囲に関する限定を意図してはいない。特に本発明に対して種々の置換、変更および修飾が、請求項によって規定された本発明の精神と範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本発明者によって考慮されている。
Claims (45)
- ニューロン細胞の損傷を確認する前に、配列番号:1〜6、11〜16および23〜26のアミノ酸配列よりなる群から選択されるペプチドを含む組成物を、被験体に投与することを含んでなる、被験体におけるニューロン細胞の損傷を防ぐ方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:23のアミノ酸配列を含む請求項1に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:24のアミノ酸配列を含む請求項1に記載の方法。
- 前記被験体が、異常な細胞損傷を特徴とする病態を発症する危険にある請求項1に記載の方法。
- 前記異常な細胞損傷が、興奮毒性細胞死である請求項4に記載の方法。
- 前記異常な細胞損傷が、アポトーシス細胞死である請求項4に記載の方法。
- 前記被験体が、発作、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、神経ラチリスム、ヒト免疫不全ウィルス痴呆または自己免疫疾患を発現させる危険にある請求項1に記載の方法。
- 前記発作が、虚血性発作である請求項7に記載の方法。
- 発作、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、神経ラチリスム、ヒト免疫不全ウィルス痴呆または自己免疫疾患を含む虚血または再灌流傷害の症状を確認する前に、被験体に投与することを含んでなる、被験体における虚血性または再灌流関連傷害を防ぐ方法。
- 配列番号:1〜6、11〜16および23〜26のアミノ酸配列よりなる群から選択されるペプチドを、ニューロン障害を患って、またはニューロン障害発現の危険にある哺乳動物に投与することを含んでなる、前記哺乳動物におけるニューロン細胞死を防ぐ方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:23のアミノ酸配列を含む請求項10に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:24のアミノ酸配列を含む請求項10に記載の方法。
- 前記ニューロン障害が、発作、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、神経ラチリスム、およびヒト免疫不全ウィルス痴呆よりなる群から選択される請求項10に記載の方法。
- 配列番号:1〜6、11〜16および23〜26のアミノ酸配列よりなる群から選択されるペプチドを含む組成物を、哺乳動物に投与することを含んでなるニューロン障害を治療する方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:23のアミノ酸配列を含む請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:24のアミノ酸配列を含む請求項14に記載の方法。
- 前記ニューロン障害が、発作、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、神経ラチリスム、およびヒト免疫不全ウィルス痴呆よりなる群から選択される請求項14に記載の方法。
- ニューロン細胞を、配列番号:1〜6、11〜16および23〜26のアミノ酸配列よりなる群から選択されるペプチドを含む組成物に接触させることを含んでなる、ニューロン細胞死を防ぐ方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:23のアミノ酸配列を含む請求項18に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:24のアミノ酸配列を含む請求項18に記載の方法。
- 前記細胞が、興奮毒性細胞死である請求項18に記載の方法。
- 前記細胞が、アポトーシス細胞死である請求項18に記載の方法。
- 有毛不動毛、有毛アポトーシス、またはニューロンアポトーシスに対する損傷を防ぐ細胞透過性生物活性ペプチドを被験体に投与することを含んでなる、被験体における聴力低下を予防または治療する方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:1、2、4、5、6、11、12、13、14、15、16および23〜26よりなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか1つを含む請求項23に記載の方法。
- 前記被験体は、騒音障害に曝露される前に前記ペプチドが投与される請求項23に記載の方法。
- 前記被験体は、騒音障害に曝露される前に前記ペプチドが投与される請求項24に記載の方法。
- 前記被験体は、騒音障害に曝露された後に前記ペプチドが投与される請求項23に記載の方法。
- 前記騒音傷害が、少なくとも90dB SPLの騒音である請求項27に記載の方法。
- 前記被験体が、抗生物質に曝露される前に前記ペプチドが投与される請求項23に記載の方法。
- 前記被験体が、抗生物質に曝露される前に前記ペプチドが投与される請求項24に記載の方法。
- 前記被験体が、抗生物質に曝露された後に前記ペプチドが投与される請求項23に記載の方法。
- 前記抗生物質が、アミノグリコシドである請求項30に記載の方法。
- 前記被験体は、化学療法剤に曝露される前に前記ペプチドが投与される請求項23に記載の方法。
- 前記被験体は、化学療法剤に曝露される前に前記ペプチドが投与される請求項24に記載の方法。
- 前記被験体は、化学療法剤に曝露された後に前記ペプチドが投与される請求項23に記載の方法。
- 細胞透過性生物活性ペプチドに細胞を接触させて、膵臓細胞死を防ぐことを含んでなる膵臓小島細胞死を防ぐ方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:1、2、4、5、6、11、12、13、14、15、16および23〜26よりなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか1つを含む請求項36に記載の方法。
- 前記細胞を、コラーゲナーゼと接触させることをさらに含んでなる請求項36に記載の方法。
- 細胞透過性生物活性ペプチドを被験体に投与して膵臓細胞死を防ぐことを含んでなる、被験体における膵臓小島細胞死を防ぐ方法。
- 前記ペプチドが、配列番号:1、2、4、5、6、11、12、13、14、15、16および23〜26よりなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか1つを含む請求項39に記載の方法。
- コラゲナーゼを投与することをさらに含んでなる請求項39に記載の方法。
- 前記被験体が、炎症誘発性サイトカインに曝露される前に前記ペプチドが投与される請求項39に記載の方法。
- 前記被験体が、炎症誘発性サイトカインに曝露された後に前記ペプチドが投与される請求項39に記載の方法。
- 前記投与が、心耳内、腹腔内、鼻腔内、静脈内、経口およびパッチ送達よりなる群から選択されるいずれか1つの投与経路により送達される請求項23に記載の方法。
- 前記投与が、心耳内、腹腔内、鼻腔内、静脈内、経口およびパッチ送達よりなる群から選択されるいずれか1つの投与経路により送達される請求項39に記載の方法。
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