JP4769026B2 - 反応容器及びこれを用いた物質の検出方法 - Google Patents
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Description
きており、今まで大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下の
チップで少量の試薬で行えるようになってきている。
この状態において、熱による反応を利用する場合、反応のための熱をかけると気泡の膨張により試薬があふれるなどの不具合が生じる。
図1に、本発明における一実施形態を示す図を示す。図1は、略長方形の板状の基板に、試料及び試薬を反応させるためのウェル状反応部が複数形成されている。
このようなものとして、例えば、PC(ポリカーボネート)、PP(ポリプロピレン)、シクロオレフィン系ポリマー、フッ素ポリマー、シリコーン樹脂などを用いることができる。
透明性、耐熱性、耐薬品性や反応系に対する影響などの点からシクロオレフィン系樹脂(ゼオノア(日本ゼオン株式会社製))やメチルペンテン系樹脂(TPX(三井化学株式会社製))を用いることが好ましい。
また、後述ように、本発明では、基板に設けるウェル反応部の内面の純水との接触角は100°以上であることが好ましいため、基板自体の接触角は100°以上であるものを用いても良い。このようなものとしては、ポリテトラフルオロエチレン(TEF)などのフッ素ポリマーやシリコーン樹脂、メチルペンテン系樹脂などが挙げられる。
なお、基板の素材としてガラスを用いてもよい。
ウェル状反応部は、基材がプラスチック、合成樹脂系であれば切削加工、成型加工により形成することができる。ガラスであれば切削加工により形成することができる。
また、ウェル状反応部は複数有することができる。
また、ウェルの大きさは、特に限定はしないが、ライフサイエンス分野では極微量での反応、検出が行われることが多く、開口部の直径及び深さが5mm以下、特に0.01mm〜5mmの範囲内であればよい。また、本発明ではこの大きさの範囲内のときに特に効果を発揮するものである。
濡れ性が高いと、試薬充填時に側面に液が引きずられる。ウェル状反応部内面の純水との接触角がが上記範囲であると、試薬を充填する際、ウェル内の側壁との濡れの影響をあまり受けず滑るように試薬が充填され、気泡の混入の影響も少ない(図2参照)。また、ウェルの底部はミクロ的に見ると表面が粗いが、底部との接触部が少ないため、表面凹凸と試薬の隙間に残った試薬の量も少なく、その影響をあまり受けないものとなる(図4参照)。
接触角が100°より小さい場合、例えば70°以上100°未満の場合、試薬充填の際、ウェル内の側壁との濡れの影響を受けながら試薬が落ちていくため、最終的にウェルの底部まで充填されたときに側壁に引きずられ、気泡が混入した状態になることがある(図3参照)。また、ウェルの底部はミクロ的に見ると表面が粗く、表面凹凸の内部まで試薬が充填されず、表面凹凸と試薬の隙間に気泡が残る(図5参照)。
フッ素系ガスを用いてプラズマ処理を施す場合、基材表面になんらかの被膜または官能基を導入すると考えられるが、この場合、反応系に悪影響を与えず、また耐熱性、耐薬品性があることが好ましい。
また、フッ化メタン、フッ化エタン、テトラフルオロメタン、ヘキサフルオロエタン、1,1,2,2−テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロパン、トリフルオロアセテート、ヘキサフルオロアセトンなどの有機フッ化化合物を含むガスや、フッ化エチレン、フッ化塩化エチレン、フッ化ビニール、フッ化ビニリデンなどフッ素含有モノマーを含むガスが挙げられる。
また、CF3(CF2)nRSiX3(X:ハロゲンまたはR、R:有機官能基、なおRはそれぞれ異なっていてもよい)で表されるフッ素含有珪素化合物を含むガスを用いても良い。このようなものとして、例えば、1H,1H,2H,2H−パーフルオロデシルトリメトキシシラン、1H,1H,2H,2H−パーフルオロデシルトリエトキシシラン、ヘプタデカフルオロデシルトリクロロシラン、トリフルオロプロピルメトキシシランなどが挙げられる。
また、珪素ガスを用いてプラズマ処理を施しても良い。珪素ガスとしてはヘキサメチルジシロキサン(HMDSO)、テトラメチルシロキサン(TMSO)、テトラエトキシシラン(TEOS)などが挙げられる。
表面エネルギーの低い物質は、反応系に悪影響を与えず、また耐熱性、耐薬品性があることが好ましい。
表面エネルギーの低い物質としては、フッ素系またはフッ素含有珪素化合物やシリコーン樹脂などが挙げられる。
フッ素系化合物としては、フッ化メタン、フッ化エタン、テトラフルオロメタン、ヘキサフルオロエタン、1,1,2,2−テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロパン、トリフルオロアセテート、ヘキサフルオロアセトンなどや、フッ化エチレン、フッ化塩化エチレン、フッ化ビニール、フッ化ビニリデンなどフッ素含有モノマーが挙げられる。
また、フッ素含有珪素化合物としては、CF3(CF2)nRSiX3(X:ハロゲンまたはR、R:有機官能基、なおRはそれぞれ異なっていてもよい)で表されるフッ素含有珪素化合物が挙げられ、例えば、1H,1H,2H,2H−パーフルオロデシルトリメトキシシラン、1H,1H,2H,2H−パーフルオロデシルトリエトキシシラン、ヘプタデカフルオロデシルトリクロロシラン、トリフルオロプロピルメトキシシランなどが挙げられる。
PCR反応部を設けることにより、同一チップ上で検体の調整、DNAの検出を行うことができる。
PCR反応部としては、ウェル状の反応部を設けても良いし、流路を設け流路内で反応を行っても良い。
また、その他の反応部を設けても良い。
本発明でいう検出物質とは、検出をしようとする対象物質のことで、認識物質とは、検出物質を特定するために用いる物質のことを言う。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め各ウェル状反応部内に認識物質として抗原を含む試料を入れておき、後から検出物質として抗体を含む試薬を添加し、認識物質または、検出物質のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が一般的に用いられる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検出物質を収容しておいてもよい。
例えば、インベーダー・アッセイ法(サードウェイブテクノロジーズ,Inc(米国ウィスコンシン州マディソン市)を用いても良い。これによりSNP解析の具現化を図ることが可能となる。
また、認識物質はウェル状反応部内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。
(チップ作成(成形))
図1のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ネオフロン N−20P(ダイキン工業株式会社製)を用いて成形品を作成した。成形温度は350℃、型締め力は50tonF、金型温度は100℃、計量値24mmで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップM3で成形を行い、スクリュー系はφ35mmである。検出部底厚は0.3mmで成形を行った。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
3箇所測定した結果、得られた値の平均値は111°であった。なお、用いた測定装置はFACE自動固体エナジー解析装置CA−VE型である。
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット(ThirdWaveTechonogy社製に順ずる)。
ウェル状反応部にインベーダープローブ0.15μlを針の内径2mmのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてPCR反応により調整済みのPCR産物1μlに対して、インベーダー試薬3.644μl、蛍光物質としてFAMが結合しているFRET 0.75μl、Clevase 0.75μlを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に2μlずつを針の内径2mmのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを4μlを針の内径2mmのピペットを用いて加えて、61℃、40分間インベーダー反応を行った。反応時には気泡の膨張による反応液の噴出しは見られなかった。
反応が完了したら、蛍光検出を行った。測定した結果、蛍光が検出され、反応が起こったことが確認された。なお、ここでいうインベーダープローブ、インベーダー試薬、FRET、Clevaseは認識物質である。
(チップ作成(成形))
図1のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ゼオノア 1420R(日本ゼオン株式会社製を)用いて成形品を作成した。成形温度は280℃、型締め力は100tonF、金型温度は90℃、計量値24mmで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップM3で成形を行い、スクリュー系はφ35mmである。検出部底厚は0.3mmで成形を行った。
(表面処理)
フッ素を含むガスとして、CF4を3%含むHeガスを用い、大気圧近傍下でプラズマ処理を施した。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
3箇所測定した結果、得られた値の平均値は108°であった。なお、用いた測定装置はFACE自動固体エナジー解析装置CA−VE型である。
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット(ThirdWaveTechonogy社製に順ずる)。
ウェル状反応部にインベーダープローブ0.15μlを針の内径2mmのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてPCR反応により調整済みのPCR産物1μlに対して、インベーダー試薬3.644μl、蛍光物質としてFAMが結合しているFRET 0.75μl、Clevase 0.75μlを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に2μlずつを針の内径2mmのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを4μlを針の内径2mmのピペットを用いて加えて、61℃、40分間インベーダー反応を行った。反応時には気泡の膨張による反応液の噴出しは見られなかった。
反応が完了したら、蛍光検出を行った。測定した結果、蛍光が検出され、反応が起こったことが確認された。なお、ここでいうインベーダープローブ、インベーダー試薬、FRET、Clevaseは認識物質である。
(チップ作成(成形))
図1のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ノバテック PPMA04(日本ポリプロ株式会社製)を用いて成形品を作成した。成形温度は210℃、型締め力は50tonF、金型温度は20℃、計量値24mmで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップM3で成形を行い、スクリュー系はφ35mmである。検出部底厚は0.3mmで成形を行った。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
3箇所測定した結果、得られた値の平均値は91°であった。なお、用いた測定装置はFACE自動固体エナジー解析装置CA−VE型である。
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット(ThirdWaveTechonogy社製に順ずる)。
ウェル状反応部にインベーダープローブ0.15μlを針の内径2mmのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてPCR反応により調整済みのPCR産物1μlに対して、インベーダー試薬3.644μl、蛍光物質としてFAMが結合しているFRET 0.75μl、Clevase 0.75μlを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に2μlずつを針の内径2mmのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを4μlを針の内径2mmのピペットを用いて加えて、61℃、40分間インベーダー反応を行った。反応時に、気泡の上昇による反応液の噴出しにより、その後の蛍光検出による反応の有無が確認できなかった。
2 基板
4 反応溶液
3 ウェル状反応部
5 試薬収納部
6 PCR反応部(流路タイプ)
7 流路
8 ウェル底面の微細な凹凸
Claims (7)
- 光透過性を有する基板と、
前記基板に成形され、底部側が光透過性を有し底部側から蛍光検出可能なウェル状反応部と、
を有し、
前記ウェル状反応部の内面における全ての面に対して、純水との接触角が100°以上となる表面処理が施されていることを特徴とする反応容器。 - 前記ウェル状反応部の直径が0.01〜5mmの範囲内であり、かつ深さが0.01〜5mmの範囲内であることを特徴とする請求項1記載の反応容器。
- 前記表面処理がフッ素を含むガスを用いたプラズマ処理であることを特徴とする請求項1または2に記載の反応容器。
- 前記ウェル状反応部の内面に撥水性被膜を有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の反応容器。
- さらに試薬収容部及び/またはPCR反応部を有することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の反応容器。
- 純水との接触角が100°以上となる表面処理が内面における全ての面に施されたウェル状反応部が成形された光透過性の基板を備える反応容器のウェル状反応部内に、認識物質を注入する工程と、ウェル状反応部に検出物質を注入する工程とを有し、前記認識物質又は前記検出物質のいずれかが蛍光標識されており、前記認識物質と前記検出物質との反応の有無を前記ウェル状反応部の底部側から蛍光検出する工程を有することを特徴とする物質の検出方法。
- 前記検出物質が核酸であることを特徴とする請求項6記載の物質の検出方法。
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