JP2006284335A - クロロフィル蛍光測定方法およびクロロフィル蛍光測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 測定現場における植物プランクトンの基礎生産力をリアルタイムで測定することができるクロロフィル蛍光測定方法を提供する。
【解決手段】 水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法において、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を受光検知して受光検知データを読込み、受光検知データに基づいて植物プランクトンの光合成電子伝達系のパラメータを算出し（ｓ１〜ｓ５）、光合成電子伝達系のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を算出する（ｓ６）上記の各手順を時系列的に連続して実行する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、たとえば海水中に存在する植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法およびクロロフィル蛍光測定装置に関する。

二酸化炭素（ＣＯ_２）は、大気中の含有量が増加すると、温室効果によって地球を温暖化する気体成分として知られている。ＣＯ_２は、工業生産活動に伴う燃料の燃焼および動物の生命維持活動に伴う排出によって大量に生成される。このようにして生産されるＣＯ_２は、陸上においては樹木等の植物による光合成、水中においては主に植物プランクトンによる光合成によって消費される。光合成作用は、ＣＯ_２の炭素（Ｃ）を固定して有機物を生産するとともに、副産物として酸素（Ｏ）を生産するので、大気中のＣＯ_２増加に対して抑制する効果がある。

したがって、陸上植物および水中の植物プランクトンの光合成は、地球規模におけるＣＯ_２の循環系において、極めて重要な役割を果たしている。光合成作用を発現する陸上植物および水中の植物プランクトンの中でも、特に地球上の表面積の約７０％を占める海洋中に存在する植物プランクトンが、大きな抑制効果を有することは容易に推測されることであり、その有機物と酸素とを生産する能力である基礎生産力（光合成速度とも呼ぶ）を正確に把握することは、地球規模の環境対策上において重要な課題である。

水中の植物プランクトンの基礎生産力の測定は、従来炭素固定速度によって見積もられてきた。たとえば放射性炭素^１４Ｃを用いて炭素固定速度を測定する方法が知られているけれども、日本では放射性元素を屋外で用いることに厳しい制限が有るので、汎用することはできないという問題がある。

このような問題に対して放射性炭素^１４Ｃの代わりに、炭素安定同位体^１３Ｃを用いる方法がある。しかしながら、炭素安定同位体^１３Ｃを用いる方法では、植物プランクトンを含む水を培養容器に入れて、一定時間培養しなければならないので、測定に長時間を要しかつ実験操作が煩雑であり、植物プランクトンの基礎生産力が環境変化に応じて時空間的に変動するにも関らず、迅速に測定することができないという問題がある。

このようなことから、植物プランクトンの基礎生産力の測定に関し、植物プランクトン細胞内のクロロフィルの生体内蛍光（以後、クロロフィル蛍光と略称する）を利用することが提案されている。クロロフィル蛍光を利用する測定法としては、太陽光によって励起された植物プランクトン細胞内のクロロフィル蛍光を利用するパッシブ蛍光法と、人工光源によって励起された植物プランクトン細胞内のクロロフィル蛍光の量子収率を測定するアクティブ蛍光法とがある（非特許文献１参照）。

パッシブ蛍光法は、太陽光によって励起された植物プランクトンの生体内のクロロフィルが発する波長６８５ｎｍ付近の自然蛍光をたとえば水中分光放射計で測定し、該自然蛍光の放射輝度を用い、各種の演算式に従って基礎生産力を算出するものである。パッシブ蛍光法では、基礎生産力の算出に必要なパラメータ（たとえば蛍光の量子収率など）であって、水中分光放射計で測定できないパラメータの決定いかんによっては、データ精度が変動するので、適用に検討の余地があるとされる。

アクティブ蛍光法は、暗所に適応させた植物プランクトンに対して光合成に有効な光を照射し、光合成電子伝達系（厳密には光合成電子伝達系ＩＩであり、以後ＰＳＩＩと略記することがある）の電子受容体を酸化した状態から還元した状態へと変化させて、生体内クロロフィル蛍光の誘導曲線（Kautsky曲線）を描かせるものであり、ＰＡＭ（Pulse
Amplitude Modulation）法、Ｐ＆Ｐ（Pump & Probe）法、ＦＲＲ（Fast Repetition
Rate）法の３つがある。

アクティブ蛍光法のうちＦＲＲ法は、コルバーらによって開発されたものであり、測定装置を水中たとえば海水中に沈め、測定現場における植物プランクトンの光合成電子伝達系ＩＩ（ＰＳＩＩ）のパラメータを求めることができる（非特許文献２、特許文献１参照）。このＦＲＲ法に基づく測定装置は、ＦＲＲ式蛍光光度計（ＦＲＲ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ；英国チェルシー・インスツルメント（Chelsea Instruments）社製）として製品化されている。

図６は、ＦＲＲ式蛍光光度計１の典型的な構成を簡略化して示す図である。先行技術のＦＲＲ式蛍光光度計１（以後、ＦＲＲＦ１と略記する）は、大略、装置本体２と、太陽光を浴びた状態のクロロフィル蛍光の量子収率を測るための明室３と、太陽光の影響を受けない状態のクロロフィル蛍光の量子収率を測るための暗室４と、電源であるバッテリ５と、日射センサ６とを含んで構成される。

装置本体２は、たとえばアルミニウムなどからなる耐圧性のケーシング１１の中に測定に必要とされる機器を収容する。ケーシング１１は、略円筒形状を有し、軸線方向の一方の端部１１ａにはフランジ１２が設けられ、他端部１１ｂには底板１３が設けられて、密閉空間１４が形成される。フランジ１２には、ケーシング１１の軸線を含む仮想平面に対して面対称の位置に、フランジ１２を貫通する第１開口部と第２開口部とが形成され、第１および第２開口部には、透光性のたとえばガラスから成る第１耐水窓１７および第２耐水窓１８がそれぞれ装着される。

フランジ１２には、前記第１および第２耐水窓１７，１８の形成される部分以外の部分に、軸線方向に突出すなわちフランジ１２に対して垂直に立ち上がるようにして蛍光受光部１５が設けられる。蛍光受光部１５は、内部空間１６を有する箱状に形成され、内部空間１６がケーシング１１の密閉空間１４に連通する。蛍光受光部１５のフランジ１２からの立ち上がり部分には、該部分を貫通し対向して第３開口部と第４開口部とが形成され、第３および第４開口部には、透光性のたとえばガラスから成る第３耐水窓１９および第４耐水窓２０がそれぞれ装着される。

フランジ１２の第２耐水窓１８が装着される部分と、蛍光受光部１５の第４耐水窓２０が装着される部分とを覆うようにして暗室カバー部材２１が装着される。暗室カバー部材２１が装着されることによって、暗室カバー部材２１、フランジ１２の第２耐水窓１８が装着される部分および蛍光受光部１５の第４耐水窓２０が装着される部分によって、外光が遮蔽される空間である暗室４が構成される。暗室カバー部材２１には、測定試料であるたとえば海水の流入口２２と、海水の流出口２３とが形成され、海水を暗室４内に収容し、また暗室４内を流過できるように構成される。

一方、フランジ１２の第１耐水窓１７が装着される部分と、蛍光受光部１５の第３耐水窓１９が装着される部分とは、外方に対して開放されたままの状態に保たれ、外光であるたとえば太陽光が自由に到達し得るので、フランジ１２の第１耐水窓１７が装着される部分と蛍光受光部１５の第３耐水窓１９が装着される部分とが臨む部分に明室３が構成される。

ケーシング１１の密閉空間１４内において、第１耐水窓１７を臨み、第１耐水窓１７を通して明室３の海水中の植物プランクトンに対して光を照射できるように第１光源２４が設けられ、第２耐水窓１８を臨み、第２耐水窓１８を通して暗室４内の海水中の植物プランクトンに対して光を照射できるように第２光源２５が設けられる。第１および第２光源２４，２５は、いずれも波長：４６０〜５００ｎｍの青色光を出射することのできるたとえば発光ダイオードである。第１および第２光源２４，２５は、ｏｎ／ｏｆｆ動作によって閃光（パルス光）を発するように動作し、パルス光の発光動作における発光間隔すなわち発光周波数は、後述する中央処理装置（ＣＰＵ）３０によって制御される。

明室３の海水中に存在し太陽光を浴びた状態の植物プランクトンが、第１光源２４から出射される光で照射されることによって発するクロロフィル蛍光は、第３耐水窓１９を通して蛍光受光部１５の内部空間１６へ入射し、内部空間１６に設けられる第１反射ミラー２６によって、ケーシング１１の密閉空間１４へ向けて反射される。暗室４の海水中に存在し太陽光の影響を受けない状態の植物プランクトンが、第２光源２５から出射される光で照射されることによって発するクロロフィル蛍光は、第４耐水窓２０を通して蛍光受光部１５の内部空間１６へ入射し、内部空間１６に設けられる第２反射ミラー２７によって、ケーシング１１の密閉空間１４へ向けて反射される。第１および第２反射ミラー２６，２７でそれぞれ反射された光は、蛍光バンドパスフィルタ２８によって、クロロフィル蛍光に該当する光成分である波長６８５ｎｍ付近の赤色光のみが透過されて光電子増倍管２９によって受光検知される。光電子増倍管２９によって受光検知された検知結果は、処理回路であるＣＰＵ３０に入力される。したがって、第１および第２反射ミラー２６，２７、蛍光バンドパスフィルタ２８および光電子増倍管２９が受光検知手段を構成する。

ケーシング１１の内部空間１４には、さらに前記ＣＰＵ３０と、メモリ３１と、電源基板３２とが収容される。メモリ３１は、たとえばリードオンリィメモリ（ＲＯＭ）およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）によって実現される記憶手段であり、装置全体を動作制御するためのプログラム、また詳細を後述する植物プランクトンの光合成電子伝達系ＩＩ（ＰＳＩＩ）のパラメータ算出プログラムなどが格納される。ＣＰＵ３０は、装置全体の測定動作を制御するとともに、上記パラメータの算出処理を実行する。

電源基板３２は、ケーシング１１の底板１３に設けられる電源接続端子３３を介して装置本体２外に配されるバッテリ５に接続され、バッテリ５から供給される電力を、ＣＰＵ３０、第１および第２光源２４，２５、光電子増倍管２９などの密閉空間１４内の各部に配する。なお、電源基板３２が、上記各部に電力を配するための接続回路の図示は省略する。

また装置本体２には、ケーシング１１の底板１３に、外方を臨むようにして圧力センサ３４が設けられる。ＦＲＲＦ１は、海水中に浸漬されて測定に使用されるので、圧力センサ３４によって、浸漬深さを測定する。圧力センサ３４による浸漬深さの測定結果は、ＣＰＵ３０に入力される。また装置本体２の外部に配置される日射センサ６は、ケーシング１１の底板１３に設けられる日射センサ接続端子３５を介して電源基板３２から配される電力によって動作し、明室３の海水に注がれる太陽光の光量を検知する。

このＦＲＲＦ１は、海水中に浸漬され、光源２４，２５を高速（高い周波数）で点滅させて、光源２４，２５から出射される光を海水中の植物プランクトンに対して照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を光電子増倍管２９で受光検知し、該受光検知出力に基づいて植物プランクトンのＰＳＩＩのパラメータを測定することに用いられる測定装置であり、高速フラッシュ励起蛍光光度計と呼ばれることもある。

以下、ＦＲＲＦ１による植物プランクトンのＰＳＩＩのパラメータ測定の概要について説明する。

まず飽和過程では、光源２４，２５から青色の励起光を、μｓｅｃオーダーの閃光（パルス光）として出射し、明室３および暗室４にある海水中の植物プランクトンに照射して、植物プランクトンのＰＳＩＩの電子受容体（Ｑ_Ａ）を再酸化させることなく還元する。この電子受容体を再酸化させることなく還元するために、電子受容体が再酸化するために必要とする時間よりもパルス間隔が短くなるように設定される。植物プランクトンに対して励起光のパルスを照射したときのクロロフィル蛍光強度の瞬時の変化を光電子増倍管２９で受光検知する。パルスを照射した回数と、受光検知した蛍光強度との関係から、誘導曲線（Kautsky曲線）が得られる。

図７は、誘導曲線４１を例示する図である。パルス光を照射した回数と、受光検知した蛍光強度との関係を示すデータを連ねるライン４１が誘導曲線である。飽和過程における誘導曲線４１によって、蛍光強度の最小値：Ｆ_０、蛍光強度の最大値：Ｆｍとが求められ、前記Ｆ_０，Ｆｍから、ＰＳＩＩのパラメータの一つである量子収率Ｆ＝Ｆｖ／Ｆｍ（＝（Ｆｍ−Ｆ_０）／Ｆｍ）が求められる。

また誘導曲線４１を、ワンヒットポアソン関数で近似させることにより、式（１）により、ＰＳＩＩのもう一つのパラメータである有効光吸収断面積（σ_ＰＳＩＩ）が求められる。
Ｆ＝Ｆ_０＋Ｆｖ・［１−ｅｘｐ（−σ_ＰＳＩＩ・Ｅ）］ …（１）
ここで、Ｆ：クロロフィル蛍光の量子収率、Ｅ：積算閃光エネルギであり、有効光吸収断面積（σ_ＰＳＩＩ）は、誘導曲線４１の傾き（勾配）として与えられる。

さらに飽和過程の後に続いて行われる緩和過程では、５０〜１０，０００μｓｅｃ間隔で植物プランクトンに対して励起光のパルスが照射される。図８は、緩和過程における閃光回数とクロロフィル蛍光強度との関係を示す図である。図８に示す緩和過程における閃光回数とクロロフィル蛍光強度との関係を示すライン４２から、蛍光強度が減衰して一定値に収束するまで時間として、ＰＳＩＩのパラメータである電子受容体（Ｑ_Ａ）の再酸化時定数：τ_ＱＡが求められる。これらのＰＳＩＩのパラメータである量子収率（Ｆ＝Ｆｖ／Ｆｍ）、有効光吸収断面積（σ_ＰＳＩＩ）、再酸化時定数：τ_ＱＡの算出は、ＣＰＵ３０において実行される。

ＦＲＲＦ１では、明室３および暗室４の両者において、パラメータである量子収率（Ｆ）、有効光吸収断面積（σ_ＰＳＩＩ）、再酸化時定数：τ_ＱＡを求め、これらのパラメータを用いることによって植物プランクトンの基礎生産力を求めることができる。

しかしながら、先行技術のＦＲＲＦ１では、ＰＳＩＩのパラメータを求めるところまでは装置内で実行可能であるけれども、パラメータを用いた基礎生産力の算出は、別途演算装置を用いて行わなければならないので、測定現場の基礎生産力をリアルタイムで得ることができないという問題がある。

また海中の環境によっては、植物プランクトンにとどまらず、光合成細菌が光合成作用を発現することが往々にしてあり、植物プランクトンの基礎生産力の測定だけでは、海洋の基礎生産力を正確に評価し得ないことがあるので、光合成細菌のバクテリオクロロフィル蛍光も測定することが求められている。しかしながら、先行技術のＦＲＲＦ１では、このような光合成細菌の基礎生産力を求める構成を有しておらず、光合成細菌の基礎生産力を求めることについては全く示唆もしていない。

鈴木光次，吉川尚，古谷研，才野敏郎，クロロフィル蛍光による植物プランクトンの光合成活性の測定，「日本プランクトン学会報」，日本プランクトン学会，２００２年，４９（１），ｐ．２７−３６ コルバー（Zbigniew S. Kolber），プレイジル（Ondrej Prasil），ファルコウスキィ（Paul G. Falkowski），高速フラッシュ励起法を用いたクロロフィル蛍光の測定：方法論と実験的プロトコルの定義（Measurements of Variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques : defining methodology and experimental protocols），「生化学と生物理（Biochim.Biopys.Acta.）」，１９９８年，１３６７，ｐ．８８−１０６ 米国特許第５，４２６，３０６号明細書

本発明の目的は、測定現場における植物プランクトンの基礎生産力をリアルタイムで測定することができるクロロフィル蛍光測定方法およびクロロフィル蛍光測定装置を提供することである。

本発明は、水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法において、
植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が受光検知されることによって得られる受光検知データを読込む手順と、
受光検知データに基づいて植物プランクトンの光合成電子伝達系のパラメータを算出する手順と、
光合成電子伝達系のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を算出する手順とを含み、
前記の手順を時系列的に連続してリアルタイムで実行することを特徴とするクロロフィル蛍光測定方法である。

また本発明は、受光検知データを読込む手順においては、植物プランクトンに対して光を照射する光源である発光ダイオードのｏｎ／ｏｆｆをフィールドプログラマブルゲートアレイによって高速で制御し、発光ダイオードから出射される光が照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を光検出器で受光して受光検知データを読込み、
光合成電子伝達系のパラメータを算出する手順においては、読込んだ受光検知データをフィールドプログラマブルゲートアレイから中央処理装置へ転送し、中央処理装置によって光合成電子伝達系のパラメータを算出することを特徴とする。

また本発明は、水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定装置において、
水中の植物プランクトンに対して連続光を光量可変に照射する連続光光源と、
水中の植物プランクトンに対してパルスを照射するパルス光光源と、
光量可変の連続光とパルス光とが照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を受光検知する受光検知手段と、
受光検知手段の検知出力に基づいて、植物プランクトンに対して照射される光強度と、植物プランクトンの基礎生産力を表す光合成速度との関係を求める光合成能算出手段とを含むことを特徴とするクロロフィル蛍光測定装置である。

また本発明は、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光よりも波長が長い蛍光を受光検知するもう一つの受光検知手段を含み、
もう一つの受光検知手段が、光合成細菌が発するバクテリオクロロフィル蛍光を受光検知することを特徴とする。

本発明によれば、水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法において、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が受光検知されることによって得られる受光検知データを読込み、受光検知データに基づいて植物プランクトンの光合成電子伝達系のパラメータを算出し、光合成電子伝達系のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を算出する手順を時系列的に連続して実行するので、測定現場における植物プランクトンの基礎生産力をリアルタイムで測定することができる方法が実現される。

また本発明によれば、植物プランクトンに対して光を照射する光源である発光ダイオードのｏｎ／ｏｆｆをフィールドプログラマブルゲートアレイ（以後、ＦＰＧＡと略称する）によって高速で制御し、発光ダイオードから出射される光が照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を光検出器で受光して受光検知データを読込み、読込んだ受光検知データをＦＰＧＡから中央処理装置へ転送し、中央処理装置によって光合成電子伝達系のパラメータを算出するので、大量の受光検知データを読込み、該受光検知データを迅速かつ高精度で処理し、リアルタイムで測定することが可能になる。

また本発明によれば、水中の植物プランクトンに対して連続光を光量可変に照射する連続光光源と、パルス光を照射するパルス光光源とを含み、光量可変の連続光とパルス光とが照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を、受光検知手段によって受光検知するので、該受光検知出力に基づいて、光強度と基礎生産力を表す光合成速度との関係を求めることができる。

また本発明によれば、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光よりも波長が長いバクテリオクロロフィル蛍光を受光検知するもう一つの受光検知手段を含むので、植物プランクトンの基礎生産力と、光合成細菌の基礎生産力とを同時に測定することができる。

図１は、本発明の測定方法に好適に用いられるクロロフィル蛍光測定装置５０の構成を簡略化して示す図である。クロロフィル蛍光測定装置５０は、前述した図６に示すクロロフィル蛍光装置（ＦＲＲＦ）１に類似するので、対応する部分については同一の参照符号を付して説明を省略する。なお、クロロフィル蛍光測定装置５０は、前述のＦＲＲＦ１と同様にＦＲＲ式光度計（ＦＲＲＦ）であるので、以後ＦＲＲＦ５０と略記する。

ＦＲＲＦ５０において注目すべきは、植物プランクトンの光合成電子伝達系ＩＩ（ＰＳＩＩ）のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を演算する演算手段５１を含むことである。演算手段５１は、中央処理回路（ＣＰＵ）３０と、フラッシュロム５７とスタティックラム５８とから成るメモリ３１と、プログラミングすることのできる大規模集積回路（ＬＳＩ）であるＦＰＧＡ５２と、アナログ／デジタル変換器であるＡ／Ｄコンバータ５３と、デジタル／アナログ変換器であるＤ／Ａコンバータ５４とを含んで構成される。また、ＦＲＲＦ５０は、その他増幅器であるアンプ基板５５と、後述する光源をｏｎ／ｏｆｆ動作させるドライバ基板５６とを含む。

ＦＰＧＡ５２には、クロロフィル蛍光の測定目的に応じた光源の動作制御プログラムが予め格納される。クロロフィル蛍光測定時には、ＦＰＧＡ５２から光源を動作させる指令がＤ／Ａコンバータ５４に対して出力され、該出力信号がアナログ信号に変換されてドライバ基板５６に与えられる。ドライバ基板５６が、ＦＰＧＡ５２からの動作指令に従って光源のｏｎ／ｏｆｆを高速で動作させる。

ＦＲＲＦ５０の光源としては、２つの第１および第２光源６１，６２が備えられ、いずれの光源も青色発光ダイオード（青色ＬＥＤ）で構成される。第１光源６１と第１耐水窓１７との間、および第２光源６２と第２耐水窓１８との間には、第１および第２光学フィルタ６３，６４がそれぞれ設けられる。第１および第２光学フィルタ６３，６４は、第１および第２光源６１，６２からそれぞれ出射される光のうち、波長５５０ｎｍ以上の赤色光成分をカットするフィルタである。ＦＲＲＦ５０は、基本的に人工的な励起光を用いるアクティブ蛍光法であり、そのために人工的な励起光源として青色ＬＥＤから成る第１および第２光源６１，６２を備えるけれども、青色ＬＥＤは単一波長成分の光を発するのではなく、わずかながら長波長側の赤色成分をも含むので、第１および第２光学フィルタ６３，６４によって励起に不用な赤色成分をカットするものである。

以下、ＦＲＲＦ５０を用いて、試料海水中の植物プランクトンのクロロフィル蛍光を測定する方法について説明する。図２は、クロロフィル蛍光測定動作を説明するフローチャートである。

スタートでは、ＦＲＲＦ５０が、測定現場の海洋において、測定対象とする深度に浸漬され、バッテリ５から電力供給されて測定動作の準備が完了している状態である。ステップｓ１では、ＦＰＧＡ５２から動作指令を出力し、Ｄ／Ａコンバータ５４およびドライバ基板５６を介して第１光源６１を動作させて所定の周波数、たとえば飽和過程では２００ｋＨｚ〜５００ｋＨｚ、緩和過程では１００Ｈｚ〜２０ｋＨｚでパルス状の励起光を明室３の試料海水に対して照射させる。

ステップｓ２では、明室３の試料海水中に存在する植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が、光電子増倍管２９で受光検知されて得られる蛍光強度の変化値を受光検知データとして、アンプ基板５５およびＡ／Ｄコンバータ５３を介してＦＰＧＡ５２へ読込む。ＦＰＧＡ５２は、読込んだ受光検知データをＣＰＵ３０へ転送し、ＣＰＵ３０において、受光検知データとパルス光照射回数とから明室３の誘導曲線を作成する。

ステップｓ３では、上記ステップｓ１と同様に、ＦＰＧＡ５２から出力される動作指令によって第２光源６２を動作させて所定の周波数で励起光を暗室４の試料海水に対して照射させる。ステップｓ４では、暗室４の試料海水中に存在する植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が、光電子増倍管２９で受光検知されて得られる蛍光強度の変化値を受光検知データとして、アンプ基板５５およびＡ／Ｄコンバータ５３を介してＦＰＧＡ５２へ読込む。ＦＰＧＡ５２は、読込んだ受光検知データをＣＰＵ３０へ転送し、ＣＰＵ３０において、受光検知データとパルス光照射回数とから暗室４の誘導曲線を作成する。

ステップｓ５では、ＣＰＵ３０が、受光検知データに基づいて作成される誘導曲線から、植物プランクトンのＰＳＩＩのパラメータである量子収率（Ｆ）、有効光吸収断面積（σ_ＰＳＩＩ）、電子受容体（Ｑ_Ａ）の再酸化時定数（τ_ＱＡ）などを算出する。なお、このパラメータの算出については、前述の非特許文献２、特許文献１に詳述されているので、ここでは省略する。

ステップｓ６では、ＣＰＵ３０が、ＰＳＩＩのパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力（ＰｂＯ）を算出する。基礎生産力（ＰｂＯ）の演算は、メモリ３１に予め格納される演算式（２）を読出すとともに、ステップｓ５で得られるパラメータ、受光検知データおよび光合成有効放射（ＰＡＲ）を用いて行われる。なお、光合成有効放射（ＰＡＲ）とは、藻類の光合成に必要なエネルギ３５０〜７００ｎｍの波長域の光量子数である。

また明室３で得られる受光検知データおよびパラメータには「Ｌ」を付して表し、暗室４で得られる受光検知データおよびパラメータには「Ｄ」を付して表す。
ＰｂＯ[l/sec]＝ＰＡＲ×σ_ＰＳＩＩＬ×Ｑｐ×φｅ×ｎＰＳ２
×（ＦｖＤ／ＦｍＤ／０．６５） …（２）
ここで、ＦｖＤ＝Ｆ_０Ｄ−ＦｍＤ
Ｑｐ＝（ＦｍＤ−Ｆ´）／（ＦｍＤ−Ｆ_０Ｄ）
Ｆ´＝Ｆ_０Ｄ＋（ＦｍＤ−Ｆ_０Ｄ）×Ｃ（Ｅ）
Ｃ（Ｅ）＝ＰＡＲ×σ_ＰＳＩＩＬ／（ＰＡＲ×σ_ＰＳＩＩＬ＋１／τ_１Ｌ）
φｅ；ＰＡＲ×σ_ＰＳＩＩＬ×Ｑｐ≦１／τｐであるとき、
φｅ＝０．２５０
ＰＡＲ×σ_ＰＳＩＩＬ×Ｑｐ＞１／τｐであるとき、
φｅ＝０．２５０／（ＰＡＲ×σ_ＰＳＩＩＬ×Ｑｐ）／τｐ
τｐ＝Ｅｋ×σ_ＰＳＩＩＬ
Ｅｋ＝１．２０４Ｅ＋２０［ｑｕａｎｔａ ｍ^−２ ｓ^−１］
ｎＰＳ２＝０．００２

本クロロフィル蛍光測定方法においては、図２のフローに示す手順を、時系列的に連続して実行するので、植物プランクトンの基礎生産力をリアルタイムで測定することが可能である。なお、ステップｓ５およびステップｓ６で求められるパラメータおよび基礎生産力の求められた結果は、装置本体２の底板１３に設けられる接続端子６５にケーブルを接続し、陸上または船上に設営されるたとえば測定制御室にリアルタイムで伝送されるように構成されることが望ましい。また、測定結果の伝送は、接続端子６５に接続する有線通信に限定されることなく、無線通信手段をＦＲＲＦ５０に設け、衛星回線を利用して遠方へリアルタイムで行うことができるように構成されてもよい。

図３は、本発明の実施の形態であるクロロフィル蛍光測定装置７０の構成を簡略化して示す斜視図である。本実施の形態のクロロフィル蛍光測定装置７０は、前述のＦＲＲＦ５０に類似するので、全体構成を省略して励起系と検出系とのみを図示するとともに、対応する部分については同一の参照符号を付して説明を省略する。またクロロフィル蛍光測定装置７０は、ＦＲＲＦ５０のような水中浸漬タイプとは異なり、陸上組立式のいわゆるベンチトップタイプである。しかしながら、図３に示す励起系と検出系とを、水中浸漬タイプの装置本体内に組込んで水中に浸漬して測定できる構成とすることも可能である。

本実施形態のクロロフィル蛍光測定装置７０において注目すべきは、水中の植物プランクトンに対して連続光を光量可変に照射する連続光光源７１と、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光よりも波長が長い蛍光を受光検知するもう一つの受光検知手段７２と、ＰＳＩＩのリセットを行うための赤ＬＥＤ７９とを含むことである。

なお、クロロフィル蛍光測定装置７０が、励起光をパルス光として出射し水中の植物プランクトンに対してパルス光を照射するパルス光光源である第１光源６１と、光量可変の連続光とパルス光とが照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を受光する受光検知手段である光電子増倍管２９と、光電子増倍管２９の検知出力に基づいて、植物プランクトンの基礎生産力をあらわす光合成速度との関係を求める光合成能算出手段である演算手段５１とを備えることは、前述のＦＲＲＦ５０と同じである。

クロロフィル蛍光測定装置７０は、ベンチトップタイプであるので、植物プランクトンを含む試料海水は、光を透過するたとえばガラス製の容器である試料セル７３に収容されて測定される。第１光源６１から出射されて第１光学フィルタ６３で赤色光がカットされたパルス光８１が、試料セル７３の海水中に存在する植物プランクトンに照射される。なお、このときの第１光源６１から出射される励起光であるパルス光８１の強度は、試料セル７３の上方に設けられるＬＥＤモニタセンサ７４によって測定される。

試料セル７３中において励起光を照射された植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光７５は、蛍光バンドパスフィルタ２８を通過することによって、波長６８５ｎｍ付近の光が選択透過され、光電子増倍管２９によって受光検知される。光電子増倍管２９によって受光検知された蛍光強度に基づいて、光合成能算出手段である演算手段５１によって植物プランクトンのＰＳＩＩのパラメータおよび基礎生産力が求められる。

もう一つの受光検知手段７２は、波長８００ｎｍ以上の光を選択的に透過させるロングパス光学フィルタ７６と、もう一つの長波長用光電子増倍管７７とを含んで構成される。試料セル７３の海水中に植物プランクトンだけでなく光合成細菌も存在するとき、第１光源６１からの励起光が試料セル７３中の海水に照射されると、光合成細菌がバクテリオクロロフィル蛍光を発する。この光合成細菌から発せられるバクテリオクロロフィル蛍光７８は、植物プランクトンによるクロロフィル蛍光７５の波長（６８５ｎｍ付近）よりも波長が長く、波長が８００ｎｍ以上である。

したがって、長波長用光電子増倍管７７の前に、波長８００ｎｍ以上の光を選択的に透過させるロングパス光学フィルタ７６を設けることによって、バクテリオクロロフィル蛍光７８を受光検知することができる。このバクテリオクロロフィル蛍光７８を受光検知することによって、植物プランクトンの場合と同様の処理をして光合成細菌の基礎生産力を求めることができる。すなわち、クロロフィル蛍光測定装置７０によれば、植物プランクトンと光合成細菌との両方の基礎生産力を求めることが可能になる。

本実施形態のクロロフィル蛍光測定装置７０では、連続光光源７１が試料セル７３の下方に設けられ、連続光光源７１から出射される連続光８２が試料セル７３中の試料海水に対して光量可変に照射される。連続光光源７１は、たとえば白色ＬＥＤであり、常時点灯させることによって連続光を出射できる。

図４は、第１光源６１によるパルス光と連続光光源７１による連続光とが重畳されている状態を示す図である。パルス光光源である第１光源６１からパルス光８１を出射して試料セル７３中の試料海水に照射するとともに、連続光源７１から連続光８２を出射して試料セル７３中の試料海水に照射して、植物プランクトンおよび／または光合成細菌の基礎生産力（光合成速度）を測定する。この光合成速度の測定に際し、連続光光源７１から出射される連続光８２の光量（光強度）を変化させることによって、試料海水に照射される光強度と光合成速度との関係を求めることが可能になる。

図５は、光強度と光合成速度との関係を例示する図である。図５に示す光強度と光合成速度との関係を求めることによって、試料海水中の植物プランクトンおよび／または光合成細菌の量子収率Ｆに相当する立ち上がり勾配、最大光合成速度、総光合成Ｐｇ、総光合成から呼吸Ｒを引いた純光合成Ｐｎを求めることができる。

本発明の測定方法に好適に用いられるクロロフィル蛍光測定装置５０の構成を簡略化して示す図である。 クロロフィル蛍光測定動作を説明するフローチャートである。 本発明の実施の形態であるクロロフィル蛍光測定装置７０の構成を簡略化して示す斜視図である。 第１光源６１によるパルス光と連続光光源７１による連続光とが重畳されている状態を示す図である。 光強度と光合成速度との関係を例示する図である。 ＦＲＲ式蛍光光度計１の典型的な構成を簡略化して示す図である。 誘導曲線を例示する図である。 緩和過程における閃光回数とクロロフィル蛍光強度との関係を示す図である。

符号の説明

５０，７０ クロロフィル蛍光測定装置
２ 装置本体
３ 明室
４ 暗室
５ バッテリ
６ 日射センサ
１１ ケーシング
１５ 蛍光受光部
１７，１８ 耐水窓
２１ 暗室カバー部材
２４，２５，６１，６２ 光源
２６，２７ 反射ミラー
２８ 蛍光バンドパスフィルタ
２９ 光電子増倍管
３０ ＣＰＵ
３１ メモリ
３２ 電源基板
３４ 圧力センサ
５１ 演算手段
７１ 連続光光源
７２ 受光検知手段
７３ 試料セル
７６ ロングパス蛍光フィルタ
７７ 長波長用光電子増倍管

Claims (4)

1. 水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法において、
   植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が受光検知されることによって得られる受光検知データを読込む手順と、
   受光検知データに基づいて植物プランクトンの光合成電子伝達系のパラメータを算出する手順と、
   光合成電子伝達系のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を算出する手順とを含み、
   前記の手順を時系列的に連続してリアルタイムで実行することを特徴とするクロロフィル蛍光測定方法。
2. 受光検知データを読込む手順においては、植物プランクトンに対して光を照射する光源である発光ダイオードのｏｎ／ｏｆｆをフィールドプログラマブルゲートアレイによって高速で制御し、発光ダイオードから出射される光が照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を光検出器で受光して受光検知データを読込み、
   光合成電子伝達系のパラメータを算出する手順においては、読込んだ受光検知データをフィールドプログラマブルゲートアレイから中央処理装置へ転送し、中央処理装置によって光合成電子伝達系のパラメータを算出することを特徴とする請求項１記載のクロロフィル蛍光測定方法。
3. 水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定装置において、
   水中の植物プランクトンに対して連続光を光量可変に照射する連続光光源と、
   水中の植物プランクトンに対してパルスを照射するパルス光光源と、
   光量可変の連続光とパルス光とが照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を受光検知する受光検知手段と、
   受光検知手段の検知出力に基づいて、植物プランクトンに対して照射される光強度と、植物プランクトンの基礎生産力を表す光合成速度との関係を求める光合成能算出手段とを含むことを特徴とするクロロフィル蛍光測定装置。
4. 植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光よりも波長が長い蛍光を受光検知するもう一つの受光検知手段を含み、
   もう一つの受光検知手段が、光合成細菌が発するバクテリオクロロフィル蛍光を受光検知することを特徴とする請求項３記載のクロロフィル蛍光測定装置。

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