JP2006230251A - 融合タンパク質発現ベクター - Google Patents
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Abstract
【課題】 難溶性タンパク質を効率的に生産できる手段を提供すること。
【解決手段】 好塩性細菌由来のタンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の下流にプロテアーゼ切断部位と目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するための制限酵素部位とを含み、目的タンパク質を好塩性細菌由来のタンパク質との融合タンパク質として発現させることを特徴とする、融合タンパク質発現ベクター。
【選択図】 なし
Description
(1) 好塩性細菌由来のタンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の下流にプロテアーゼ切断部位と目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するための制限酵素部位とを含み、目的タンパク質を好塩性細菌由来のタンパク質との融合タンパク質として発現させることを特徴とする、融合タンパク質発現ベクター。
(3) 好塩性細菌由来のタンパク質が、ハロバクテリウム・サリナーラム(Halobacterium salinarum)由来のヌクレオシド二リン酸キナーゼである、(1)に記載の融合タンパク質発現ベクター。
(5) 目的タンパク質が、難溶性タンパク質である、(4)に記載の融合タンパク質発現ベクター。
(7) (6)に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から好塩性細菌由来のタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を採取し、プロテアーゼで消化することを含む、タンパク質の製造方法。
本発明の融合タンパク質発現ベクターは、目的タンパク質を好塩性細菌由来のタンパク質との融合タンパク質として発現させるものであり、好塩性細菌由来のタンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の下流に目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するための制限酵素部位(マルチクローニングサイトという)、および発現した融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すために必要なプロテアーゼ切断部位とを含む。
ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは20〜100mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。
本発明の形質転換体は、上記の融合タンパク質発現ベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、融合タンパク質遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌;サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母;サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウスL細胞、ヒトGH3、ヒトFL細胞等の動物細胞;あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。
目的タンパク質は、前記形質転換体を培養して好塩性細菌由来のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、その培養物から融合タンパク質を採取した後、プロテアーゼで消化することにより製造することができる。ここで、「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
目的タンパク質をChromohalobacter sp.由来β−ラクタマーゼ(β-lactamase:BLA)との融合タンパク質として発現させるためのベクターを以下のようにして構築した。
ヒトαデフェンシン1(hαD1)遺伝子をベースに、酵母において出現頻度の高いコドンを用いて合成した配列番号8に示す塩基配列を有する遺伝子の5'側にSmaI-トロンビン切断部位、3'側にKpnI部位を付加したDNA断片(図4)を、フォワードプライマー:5'- aaaCCCGGGttggttccaagaggtt-3’(配列番号9)とリバースプライマー:5'- GGGggtaccttaACAACAAAAAGCC-3’(配列番号10)とを用いて増幅し、実施例1で構築したpBFベクターのSmaI/KpnI部位に挿入して、pBLA-hαD1を得た。この pBLA-hαD1又はpET-bla(コントロールベクター)をそれぞれ大腸菌BL21(DE3)株に導入し、培養した。培養後、菌体を集め、50mM Tris-HCl buffer(pH8.0)に懸濁し、超音波処理にて菌体を破砕し、細胞粗抽出液を得た。該抽出液を10000×gにて約15分間遠心し、可溶性(上清)画分と不溶性(沈殿)画分に分け、各画分をSDS−PAGEに供した。図5に可溶性画分と不溶性画分のSDS-PAGE分析結果を示す(MW:分子量マーカー、レーン1:pET-bla導入大腸菌の可溶性画分、レーン2:pET-bla導入大腸菌の不溶性画分、レーン3:pBLA-hαD1導入大腸菌の可溶性画分、レーン4:pBLA-hαD1導入大腸菌の不溶性画分。●印:BLA、○印:BLA-hαD1)。
配列番号11に示す塩基配列を有するヒトインターロイキン1α(hIL1α)遺伝子の5’末端にSmaI、3’末端にSpeIの制限酵素部位を付加したDNA断片をフォワードプライマー:5'- ggCCCgggTCATCACCTTTTAgCTT-3’(配列番号12)とリバースプライマー:5'-: gggACTAgTCTACgCCTggTTTTCCA-3’(配列番号13)とを用いてPCRで増幅して、実施例1で構築した発現ベクターpBF-ThのSmaI/SpeI部位に挿入し、pBLA-hIL1αを得た。このpBLA-hIL1α又はpET-bla(コントロールベクター)をそれぞれ大腸菌BL21(DE3)株に導入し、培養した。培養後、実施例2と同様にして菌体から可溶性画分と不溶性画分を得、各画分をSDS−PAGEに供した。図8にその結果を示す(レーン1:pET-bla導入大腸菌の可溶性画分、レーン2、3:pBLA-hIL1α導入大腸菌の可溶性画分、レーン4:pET-bla導入大腸菌の不溶性画分、レーン5、6:pBLA-hIL1α導入大腸菌の不溶性画分。●印:BLA、○印:BLA-hIL1α)。
配列番号14に示す塩基配列を有するヒトセリンラセマーゼ (hSR)遺伝子の5'側にSmaI-リンカー-トロンビン切断部位-リンカー、3’側にSpeI部位を付加したDNA断片(図9)を、フォワードプライマー:5'- AAAACCCGGGAGCAGCGGCCTGGT-3’(配列番号15)とリバースプライマー:5'- CCCACTAGTTTAAACAGAAACAGACTGA-3’(配列番号16)とを用いてPCRで増幅して、実施例1で構築した発現ベクターpBFのSmaI/SpeI部位に挿入し、pBLA-hSRを得た。このpBLA-hSR又はpET-bla(コントロールベクター)をそれぞれ大腸菌BL21(DE3)株に導入し、培養した。培養後、実施例2と同様にして菌体から可溶性画分と不溶性画分を得、各画分をSDS−PAGEに供した。図10にその結果を示す(MW:分子量マーカー、レーン1:pET-bla導入大腸菌の可溶性画分、レーン2:pET-bla導入大腸菌の不溶性画分、レーン3:pBLA-hSR導入大腸菌の可溶性画分、レーン4:pBLA-hSR導入大腸菌の不溶性画分。●印:BLA、○印:BLA-hSR)。
Claims (7)
- 好塩性細菌由来のタンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の下流にプロテアーゼ切断部位と目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するための制限酵素部位とを含み、目的タンパク質を好塩性細菌由来のタンパク質との融合タンパク質として発現させることを特徴とする、融合タンパク質発現ベクター。
- 好塩性細菌由来のタンパク質が、クロモハロバクター・エスピー(Chromohalobacter sp.)由来のβ−ラクタマーゼである、請求項1に記載の融合タンパク質発現ベクター。
- 好塩性細菌由来のタンパク質が、ハロバクテリウム・サリナーラム(Halobacterium salinarum)由来のヌクレオシド二リン酸キナーゼである、請求項1に記載の融合タンパク質発現ベクター。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の融合タンパク質発現ベクターに、目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだことを特徴とする、融合タンパク質発現ベクター。
- 目的タンパク質が、難溶性タンパク質である、請求項4に記載の融合タンパク質発現ベクター。
- 請求項4に記載の融合タンパク質発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
- 請求項6に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から好塩性細菌由来のタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を採取し、プロテアーゼで消化することを含む、タンパク質の製造方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN110438140A (zh) * | 2018-05-04 | 2019-11-12 | 北京谱峰源生物科技有限公司 | 生物活性重组人hnp-1蛋白的制备 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004001041A1 (ja) * | 2002-06-25 | 2003-12-31 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | 発現ベクター、宿主、融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法 |
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2005
- 2005-02-23 JP JP2005047809A patent/JP2006230251A/ja active Pending
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WO2004001041A1 (ja) * | 2002-06-25 | 2003-12-31 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | 発現ベクター、宿主、融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法 |
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CN110438140A (zh) * | 2018-05-04 | 2019-11-12 | 北京谱峰源生物科技有限公司 | 生物活性重组人hnp-1蛋白的制备 |
CN110438140B (zh) * | 2018-05-04 | 2021-06-08 | 北京谱峰源生物科技有限公司 | 生物活性重组人hnp-1蛋白的制备 |
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