KR102192800B1

KR102192800B1 - 전자전달 체인으로 작동하는 Fe-S 융합단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102192800B1
Application number: KR1020180138462A
Authority: KR
Inventors: 이정현; 임재규; 강성균; 임형순; 이종민
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2018-11-12
Filing date: 2018-11-12
Publication date: 2020-12-21
Also published as: KR20200054761A

Abstract

본 발명은 전자전달 기능을 하는 두 개 이상의 Fe-S 단백질을 연결한 Fe-S 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 Fe-S 융합단백질은 이를 매개로 하여 서로 다른 두 개의 효소를 물리적으로 직접 결합함으로써, 어느 하나에서 생성된 전자가 Fe-S 융합단백질의 Fe-S 클러스터를 통해 다른 하나의 효소에 직접적으로 전달될 수 있고, 이에 따라. 목적 물질의 생산에 필요한 전자를 직접 공급함으로써 어느 하나의 효소에서 생성된 전자의 누출이 없는 고효율의 목적물질의 생산반응이 가능하다.
또한, 기존에 없던 새로운 전자전달 반응을 이용해 전체적인 효소 반응속도 및 수율을 획기적으로 개선할 수 있는 장점이 있고, 세포 내에서 효소들이 물리적으로 고정된 상태로 존재할 수 있도록 함으로써, 각 효소들의 안정성 또한 확보할 수 있다.

Description

전자전달 체인으로 작동하는 Fe-S 융합단백질 및 이의 용도{Noble Fe-S Fusion Protein Acting as an Electron Transfer Chain, and Use thereof}

본 발명은 전자전달 체인으로 작동하는 Fe-S 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

유전공학적 기술의 획기적인 발달에 따라 생물공정에 의한 생물학적 물질의 생산이 점차 석유화학 공정을 대체하고 있다. 생물전환 공정을 적용하는 방식에 의한 생물학적 물질의 생산은 값싼 재생자원을 원료로 이용할 수 있고, 이산화탄소 등 온실가스의 발생을 최소화할 수 있어 환경문제를 해결할 수 있는 장점이 있으므로, 최근 생물공정에 의한 생물학적 물질의 생산을 위하여 관련 균주의 개발 및 공정개선 등을 위한 연구가 확대되고 있다.

구체적으로, 대사 조절 변이주를 제조하는 방법으로는, 즉 새로운 물질대사 경로를 만들거나 물질대사 과정에 포함된 경로를 조작/변화시켜서 목적 물질의 생산 효율을 높이는 다양한 기술들이 이용되고 있다. 이러한 기술은 특정/목적 산물의 합성과 관련된 하나 이상의 목적 단백질(또는 효소)의 발현 또는 활성이 촉진되거나 억제되는 것이 전제된다. 예를 들면, 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 대해서, 한국 특허공개공보 제10-2014-0064469호에는 아세틸-CoA를 아세테이트로 전환하는 경로에 관여하는 단백질(또는 효소)의 발현 또는 활성이 억제되고, 아세틸-CoA를 부티릴-CoA로 전환하는 경로에 관여하는 단백질(또는 효소)의 발현 또는 활성이 촉진된 미생물이 개시되어 있다. 또한, 일본 특허등록공보 제4760951호에는 부탄올 합성에 관여하는 효소인 3-히드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, HBD), 3-히드록시부티릴-CoA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase, CRT), 트랜스-에노일-CoA 환원효소(trans-enoyl-CoA reductase, TER), 알데히드/알코올 탈수소효소(aldehyde and alcohol dehydrogenase, AdhE2) 등과 같은 효소를 미생물에 도입하여 부탄올의 생산 효율을 향상시키고자 하는 시도도 있었다.

그러나, 상기와 같은 종래기술들은 반응을 통해 미생물 내에 합성하고자 하는 물질의 생산 경로에 필요한 중간 생성물들이 축적될 수는 있으나, 세포 내부에서는 합성하고자 하는 물질의 합성 경로에 관여하는 효소들 외에도 다양한 전환효소들이 존재하고 있어 그 생산 효율이 낮고, 무엇보다도 생산하고자 하는 목적 물질을 직접 생산할 수 있는 자연계에 존재하지 않는 신규 합성 경로를 직접 생성하거나 목적 물질을 직접 합성하는 반응을 생성할 수 없다는 단점이 발생하였다.

이러한 문제점들을 해결하기 위하여 한국 특허공개공보 제10-2017-0024466호 등은 목적 물질의 합성 효율을 높이기 위해 목적 물질의 생합성 관련 효소들 사이에 존재하는 물리적 간격을 좁혀 중간 생성물이 즉각적으로 반응에 참여함으로써 다른 기타 효소들에 의해 축적이 방해되는 문제를 해소할 수 있는 시스템을 개시한 바 있으나, 단순하게 생합성 관련 효소들 사이에 존재하는 물리적 간격을 좁히는 간접적인 방식을 통하여 효소의 활성을 높이는 방법은 복합 효소의 전자전달 또는 산화 환원 반응에 영향을 주지 못하므로, 일정 수준 이상의 효소 활성 증가를 기대할 수 없는 근본적인 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 목적 물질의 합성 효율을 높이고 생산하고자 하는 목적물질을 직접 생산할 수 있는 자연계에 존재하지 않는 반응이 가능하도록 목적 물질의 생합성 관련 효소들 사이에 즉각적이며 직접적으로 전자의 전달이 커플링 될 수 있는 시스템에 대하여 연구하였고, 전자가 이동하는 통로 역할을 하는 전자전달 체인으로 작동할 수 있도록 두 개 이상의 Fe-S 단백질이 플랙서블 링커를 통해 공유결합하여 형성된 Fe-S 융합단백질을 개발하였으며, 이를 이용하여 기존에 자연계에서 발견되지 않은 새로운 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)를 합성하고 이를 통해 목적 물질인 포름산을 고효율/고수율로 생산할 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 전자전달 기능을 하는 두 개 이상의 Fe-S 단백질을 연결한 Fe-S 융합단백질 및 이를 이용하여 전자전달 효율이 향상된 효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 6에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 플랙서블 링커 및 서열번호 7 내지 11에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 Fe-S 단백질로 구성되고, 두 개 이상의 상기 Fe-S 단백질이 상기 플랙서블 링커를 통해 공유결합하여 형성되며, 전자가 이동하는 통로 역할을 하는 전자전달 체인으로 작동하는 Fe-S 융합단백질을 제공한다.

상기 Fe-S 융합단백질에서, 상기 Fe-S 융합단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 또한, 상기 Fe-S 융합단백질의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 4개 내지 1,000개의 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 사슬 형태의 고분자를 의미하며, '폴리펩타이드'와 상호 혼용 가능한 의미이다.

본 발명에서 일컫는 '폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)'는 염기, 당, 인산의 세 가지 요소로 구성된 화학적 단량체인 뉴클레오타이드가 다수의 인산에스테르 결합을 매개로 사슬 형태로 이어진 고분자 화합물을 의미한다.

본 발명에서 상기 Fe-S 융합단백질은 서로 다른 두 개의 Fe-S 단백질이 플랙서블 링커로 연결된 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "Fe-S 단백질(Iron-sulfur protein)"은 다양한 산화 상태에서 다이(di), 트리(tri), 또는 테트라(tetra)의 이온 센터와 연계된 황화물(sulfide)을 포함하는 "Fe-S 클러스터"가 존재하는 것을 특징으로 하는 단백질을 의미한다.

상기 "Fe-S 클러스터"는 페레독신(ferredoxins)과 같은 메탈로프로틴(metalloproteins)에서 나타나는데, NADH 탈수소효소(NADH dehydrogenase), 수소화 효소(hydrogenases), 코엔자임 Q - 시토크롬 C 환원 효소(coenzyme Q - cytochrome c reductase), 숙신산 - 코엔자임 Q 환원 효소(succinate - coenzyme Q reductase and nitrogenase) 및 질소 분해 효소와 같은 다양한 단백질에서 발견된다. 상기, "Fe-S 클러스터"로 구성된 "Fe-S 단백질(Iron-sulfur protein)"은 미토콘드리아의 전자전달의 산화환원 반응에서 그 역할이 가장 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "전자전달 체인"은 "Fe-S 단백질"이 둘 이상 직렬 방식의 체인 형태로 플랙서블 링커를 통해 공유 결합으로 연결된 전자전달의 통로를 의미하며, 본 명세서에서 사용되는 전자전달 체인 역할을 하는 용어 "Fe-S 융합 단백질"은 플랙서블 링커를 통해 공유 결합으로 연결된 두 개 이상의 "Fe-S 단백질"로 구성되고, 상기 전자전달 체인을 형성하는데 단위 요소 역할을 하는 본 발명자에 의해 새롭게 합성된 융합 단백질을 의미한다.

본 발명의 Fe-S 융합단백질에서, 상기 Fe-S 융합단백질은 두 개 이상의 Fe-S 단백질이 하기 [표 1]에 나타낸 서열번호 1 내지 6에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 플랙서블 링커를 통해 공유결합하는 것을 특징으로 하는데, 상기 플랙서블 링커와 유사한 역할을 하는 플랙서블 링커의 예로는 Chen X 등에 의해 공지되어 있다(Chen X, et al. 2013. Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69.).

[표 1]

또한, 상기 플랙서블 링커를 포함하는 펩타이드 링커에 관한 내용은 문헌 "Toon H. Evers et al., 2006, J. Christopher Anderson et al., 2010"에 상세히 개시되어 있으며, 이 문헌에 개시된 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

한편, "Fe-S 단백질이 전자를 수용하여 환원상태가 되면 180kG 정도의 초미세 자기장을 형성하게 되는데, 상기 플랙서블 링커(flexible linker)로 연결되어 근거리에 위치하게 되는 Fe-S 단백질이 상기 형성된 초미세 자기장의 영향으로 인하여 상기 전자를 수용한 Fe-S 단백질과 서로 강한 결합(tight binding)이 유도되고, 이로 인하여 Fe-S 단백질들의 전자전달 체인 사이의 물리적인 거리가 사라져, 결과적으로 "Fe-S 융합 단백질"이 하나의 전자전달의 통로로 이용될 수 있게 된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

또한, 본 발명의 Fe-S 융합단백질에서, 상기 Fe-S 단백질은 하기 서열번호 7 내지 11에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 Fe-S 단백질은 Fe-S 클러스터 형성을 위하여 하기 [표 2]에 나타낸 서열번호 7 내지 11의 시스테인 모티프(cystein motif)를 포함하는데, 본 발명자들은 공지된 190개의 Fe-S 단백질을 비교하여 하기 서열번호 7 내지 11의 아미노산 서열을 갖는 시스테인 모티프를 선정하였고, 이들을 포함하는 Fe-S 단백질이 플랙서블 링커로 공유결합하여 생성된 Fe-S 융합 단백질이 전자전달 체인으로 작용하는 것을 실시예를 통해 확인한 바 있다.

[표 2]

또한, 본 발명의 Fe-S 융합단백질에서, 상기 Fe-S 융합단백질은 2 내지 5개의 Fe-S 단백질이 각각 플랙서블 링커를 통해 서로 공유결합하여 형성된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 Fe-S 융합단백질은 전자가 이동하는 통로 역할을 하는 전자전달 체인으로 작동하는 것을 특징으로 하므로, 본 발명의 Fe-S 융합단백질을 매개로 하여 서로 다른 두 개의 효소를 연결할 수 있고, 이 경우 어느 하나의 효소에서 생산된 전자를 다른 하나의 효소로 전이하여 산화환원반응을 직접적으로 매개할 수 있으므로, 자연계에서 발견되지 않은 방식으로 효소 반응을 활성화 할 수 있으며, 생성하고자 하는 목적 물질을 고효율/고수율로 생산할 수 있다.

이 경우 전달하고자 하는 전자를 생성하는 효소는 상기 Fe-S 융합단백질의 C-말단에 작동가능하게 연결될 수 있고, 전자를 전달받는 효소는 상기 Fe-S 융합단백질의 N-말단에 작동가능하게 연결되어 Fe-S 융합단백질을 매개로 하여 전자가 전달되는 형태로 작동된다.

예를 들면, 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 전달하고자 하는 전자를 생성하는 효소가 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)이고, 상기 전자를 전달받는 효소가 포름산 탈수소효소(fomrate dehydrogenase, Fdh)인 경우, CO 탈수소효소에서 생성된 전자가 포름산 탈수소효소로 전달되어 포름산을 고효율/고수율로 생산할 수 있다.

또한, 상기 전자를 전달받는 효소가 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase), DMSO 환원효소(dimethyl sulfoxide(DMSO) reductase), 수소화효소(hydrogenase) 등으로 대체될 경우에도 전자전달 기능이 유지되는 효과가 있으며, 이 경우 대체되는 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase), DMSO 환원효소(dimethyl sulfoxide(DMSO) reductase), 수소화효소(hydrogenase)의 효소 종류에 따라 숙신산 생산, DMSO 환원, 및 수소 생산의 기능이 고효율/고수율로 진행될 수 있다.

또한, 본 발명의 Fe-S 융합단백질은 분리 및 정제를 용이하게 위하여 추가적으로 "택(tag)"을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 다양한 검출 가능한 표지 인자(tag)로 태깅될 수 있으며, 상기 택은 His(n), 플랙(flag), c-Myc, HA, V5, VSV-G 및 HSV을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "택(tag)"은 3개 내지 40개의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드 서열을 의미하며, 본 발명의 융합 단백질, 펩타이드, 단백질 리간드(예컨대, 본 발명의 융합 단백질) 또는 비-펩타이드 리간드에 특이적인 결합 친화성(affinity)을 부여한다. 또한, 본 발명에서 이용될 수 있는 택은 형광(fluorescent) 택, 발광(luminescent) 택 및 발색(chromogenic) 택을 포함할 수 있다.

본 발명의 Fe-S 융합단백질에서, 상기 Fe-S 융합단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 Fe-S 융합단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 구체적으로는 서열번호 13의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열로 예시할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 Fe-S 융합단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이라면 어떠한 것도 이용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 상기 Fe-S 융합단백질 및 이들의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 대한 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 Fe-S 융합단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열과 이의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열은 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 Fe-S 융합단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 발현벡터에서 발현대상물질(즉, Fe-S 융합단백질)-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 발현 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL프로모터, pR프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 이때, 박테리아 복제 개시점은 긴 DNA 삽입물(inserts)의 안정적인 박테리아 복제에 유용한 당업계에 잘 알려진 복제 개시점들로부터 선택될 수 있으며, ColE1, F-인자(F-factor) 및 P1 레플리콘(replicon)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리아 선택마커는 당업계에 알려진 박테리아 선택마커 유전자를 이용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 선택마커 유전자는 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 제오신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 클로람페니콜 같은 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024 (1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445 (1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터가 진핵세포에 적용되는 경우에 이용될 수 있는 프로모터는 본 발명의 발현대상물질의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈(genome)으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 재조합 벡터는 폴리 아데닐화 서열을 포함한다(예: 소 성장 호르몬 터미네이터 또는 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).

상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.

세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 특히, 대장균에서의 발현을 위해서는 안트라닐레이트 합성효소(TrpE) 및 카르복시 말단의 폴리링커를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있으며, 다른 발현 벡터 시스템은 베타-갈락토시다제(pEX); 람다 PL 말토스 결합 단백질(pMAL); 및 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈(pGST)에 기초한다(Gene 67:31, 1988; Peptide Research 3:167, 1990).

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체 또는 재조합 미생물을 형성한다. 상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵세포일 수 있고, 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus)와 같은 고세균일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵세포일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114 (1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114 (1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983)) 및 전기천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145 (1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며, 진핵세포인 경우, 트랜스덕션(transduction), 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 마이크로인젝션, 유전자총(particle bombardment), YAC에서 이용되는 효모 구형질체/세포 융합, 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질전환 등을 이용하여 실시할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 형질전환된 동물세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 전기동공법(electroporation), 리포좀-매개 전이방법(Wong, 등, 1980) 및 레트로바이러스-매개 전이방법(Chen, H.Y., et al., (1990), J. Reprod. Fert. 41:173-182; Kopchick, J.J. et al., (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos. In Transgenic Animals, ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275-293, Boston; Butterworth-Heinemann; Lee, M.-R. and Shuman, R. (1990) Proc. 4th World Congr. Genet. Appl. Livestock Prod. 16, 107-110)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 미생물을 배양하여 Fe-S 융합단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 Fe-S 융합단백질의 제조방법을 제공한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 Fe-S 융합단백질은 이를 매개로 하여 서로 다른 두 개의 효소를 물리적으로 직접 결합함으로써, 어느 하나에서 생성된 전자가 Fe-S 융합단백질의 Fe-S 클러스터를 통해 다른 하나의 효소에 직접적으로 전달될 수 있다.

이에 따라. 목적 물질의 생산에 필요한 전자를 직접 공급함으로써 어느 하나의 효소에서 생성된 전자의 누출이 없는 고효율의 목적물질의 생산반응이 가능하다.

또한, 기존에 없던 새로운 전자전달 반응을 이용해 전체적인 효소 반응속도 및 수율을 획기적으로 개선할 수 있는 장점이 있고, 세포 내에서 효소들이 물리적으로 고정된 상태로 존재할 수 있도록 함으로써, 각 효소들의 안정성 또한 확보할 수 있다.

도 1은 본 발명의 Fe-S 융합단백질이 적용된 일산화탄소:포름산 산화·환원효소 (carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)의 구조를 설명하는 그림으로, CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)에 의해 CO 가스가 산화되며 발생한 전자가 전자전달 체인인 Fe-S 융합단백질에 존재하는 Fe-S cluster(◇)를 통해 이동하여 CO₂ 환원효소(CO₂ reductase)인 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH)에 전달됨으로써 효소 반응에 의해 CO₂가 포름산으로 전환되는 일련의 과정을 설명하는 그림이다.
도 2는 일반적으로 Fe-S 단백질(Iron-sulfur protein)에 존재하는 Fe-S 클러스터의 종류를 설명하는 모식도이다.
도 3은 Fe-S 클러스터를 포함하고 있는 페레독신(ferredoxin)(A)과 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH)(B)의 단백질 구조를 나타내는 그림이다.
도 4는 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH) 및 포름산 탈수소효소 (formate dehydrogenase)를 재조합하여 일산화탄소:포름산 산화·환원효소 (carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)의 유전자를 생성하는 과정을 나타내는 그림이다.
도 5는 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)의 유전자가 숙주세포의 유전체에 삽입되어 제조된 각각의 형질전환체가 갖는 유전자 구조를 설명하는 그림이다[(A) T. onnurineus NA1 게놈에 존재하는 fdh3 및 codh 유전자 군집 모식도와 클로닝에 사용한 타겟 유전자; (B) TON_0541과 TON_1017 간의 융합단백질 제작. Flexible linker인 ‘GGGGS’ 아미노산이 1개(T. onnurineus BCF01), 2개(T. onnurineus BCF02), 및 3개(T. onnurineus BCF03) 적용된 균주의 클로닝 모식도; (C) TON_0540과 TON_1017 간의 융합단백질 제작. Flexible linker인 ‘GGGGS’ 아미노산이 1개(T. onnurineus BCF12) 적용된 균주의 클로닝 모식도].
도 6은 CO 조건 하에서, 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)가 도입된 형질전환체(T. onnurineus BCF01, BCF02, BCF03, 및 BCF12)들의 세포 성장(A) 및 포름산 생산(B) 변화를 측정한 그래프이다.
도 7은 Fe-S 융합단백질를 포함하는 일산화탄소:포름산 산화·환원효소가 형질전환된 T. onnurineus BCF12 균주의 Resting cell 실험을 통한 CO 가스의 포름산으로의 생전환 성능을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 Fe-S 융합단백질을 포함하는 일산화탄소:포름산 산화·환원효소가 형질전환된 T. onnurineus BCF12 균주에서 합성된 일산화탄소:포름산 산화·환원효소 (carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)의 PAGE 결과 사진이다.
도 9는 버퍼의 종류를 달리한 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)의 CO 가스-포름산 생전환 효소활성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)를 도입한 돌연변이 균주 T. onnurineus BCF12 균주의 생물반응기 운전 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 일산화탄소:포름산 산화·환원효소 융합 단백질의 클로닝

Fe-S 융합단백질의 C-말단에 작동가능하게 연결된 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH), 및 상기 Fe-S 융합단백질의 N-말단에 작동가능하게 연결된 포름산 탈수소효소(fomrate dehydrogenase, Fdh)로 구성된 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR) 융합 단백질을 클로닝 하였다.

일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)의 발현벡터로는 fosmid vector pCC1FOS로부터 유래된 pNA1comFosC1096이 사용되었다.

pNA1comFosC1096은 pCC1FOS으로부터 숙주세포로 사용되는 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) NA1의 TON_1126 및 TON_1127 사이에 insert DNA가 삽입될 수 있도록 1kb의 측부영역을 가지며 제작되었다.

Insert DNA는 스트롱 프로모터(strong promoter)인 P₀₁₅₇ 프로모터와 심바스타틴(simvastatin)에 저항성을 가지도록 HMG-CoA 환원효소(reductase)와 함께 삽입되도록 하였다.

써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) NA1의 fdh3 영역(TON_0539-0541)과 codh 영역(TON_1017-1020)을 PCR을 통해 증폭하였으며, pFd3CoL1C1118, pFd3CoL2C1119, 및 pFd3CoL1C1120의 재조합 플라스미드는 각각 Fe-S 단백질인 TON_0541과 TON_1017이 linker (GGGGS)₁, (GGGGS)₂, (GGGGS)₃를 통해 융합되도록 제작하였다. 재조합 플라스미드 pFd3NHisCoL1C1128은 pFd3CoL1C1118과 동일한 구조를 가지고 있으며, Fdh3 N-말단에 His₆-tag을 삽입하여 His-tag affinity chromatography를 통해 분리할 수 있도록 하였다.

재조합 플라스미드 pFd3NHisCoL1C1132는 CFOR의 구조를 단순화하고 CO로부터 포름산으로의 전환 효율을 증대시키기 위하여 제작하였다. fdh3 영역의 TON_0540과 TON_0541은 모두 Fe-S 단백질로서 전자전달에 관여하는 소단위이다. 앞서 TON_0541과 TON_1017이 linker를 통해 융합되도록 제작한 반면, pFd3NHisCoL1C1132는 TON_0540과 TON_1017이 직접 연결되도록 제작하였다. 또한, Fdh3 N-말단에 His₆-tag을 삽입하여 CFOR 단백질의 분리가 가능하도록 하였다.

돌연변이주 D04의 제작을 위하여 fdh3 유전자 영역이 유전체상에서 제거되도록 하였는데, 이를 위하여 pUC118 vector로부터 유래된 재조합 플라스미드 pldFdh3clusterA를 제작하였다. pldFdh3clusterA는 선택 마커(selection marker)로서 심바스타틴(simvastatin) 저항성 유전자인 HMG-CoA 환원효소(reductase)를 가지고 있으며, 제거하고자 하는 유전자 fdh3 영역(TON_0539-0542)의 측부영역 1kb를 각각 Right arm (RA), Left arm(LA)으로 삽입하였다.

각각의 재조합 플라스미드에 삽입된 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

실시예 2. 돌연변이주의 제작

써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus)의 돌연변이주 D01은 fdh2C (TON_1563-1564)와 fdh3(TON_0539)을 각각 유전체 상에서 제거한 돌연변이 균주이다. 돌연변이주 D02는 D01을 모균주로 하여 fdh1C(TON_0280-0281)를 유전체 상에서 제거하였으며, 돌연변이주 D04는 D02를 모균주로 하여 fdh3C(TON_0539-0542)가 모두 제거되도록 제작하였다.

써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus)의 형질전환을 위하여 말토덱스트린(maltodextrin)이 첨가된 MM1(modified medium 1) 배지에서 전배양하여 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus)의 배양체를 확보하였다. 이를 0.8X Artificial Sea Water(ASW)에 재부유(resuspension) 한 후, 실시예 1의 재조합 플라스미드 5μg을 첨가하여, 이를 80℃에서 열 충격(heat shock)을 통해 세포 내로 도입하였다. 그 후 소량의 배지를 첨가하여 80℃에서 2시간 동안 안정화시켰다. 안정화된 형질전환 세포를 심바스타틴(simvastatin)이 10μM이 포함된 배지에 접종하여 배양하고 2회 계대하여 충분히 농후 배양되도록 하였다. 이후 단일 콜로니(single colony)를 얻어 PCR을 통해 유전자형을 확인하였다.

돌연변이주 BCF01, BCF02, BCF03은 D02를 모균주로 하여 fdh3 영역 (TON_0538-0541)과 codh 영역(TON_1017-1020)이 각각 linker (GGGGS)₁, (GGGGS)₂, 및 (GGGGS)₃로 융합되도록 제작하였다.

돌연변이주 BCF01, BCF02, BCF03은 각각 pFd3CoL1C1118, pFd3CoL2C1119, 및 pFd3CoL3C1120의 재조합 플라스미드에 의하여 형질전환 되었으며, 재조합 플라스미드에 도입된 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)는 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus)의 TON_1126과 TON_1127 사이에 삽입되었다.

또한, 돌연변이주 BCF09는 D02를 모균주로 하여 pFd3NHisCoL1C1128의 재조합 플라스미드에 의해 형질전환되어 BCF01과 동일한 CFOR 단백질이 도입되었으며, Fdh3의 N-말단에 ‘His₆-tag’을 부가하였다.

그리고, 돌연변이주 BCF12는 D04를 모균주로 하여 pFd3NHisCoL1C1132의 재조합 플라스미드에 의해 형질전환되어, fdh3 영역(TON_0538-0540)과 codh 영역(TON_1017-1020)이 링커(linker) (GGGGS)₁로 융합되도록 제작하였으며, Fdh3 (TON_0539) N-말단에 His₆-tag을 삽입하였다.

실험에 사용된 균주와 플라스미드의 종류는 아래 [표 4]에 정리하였다.

[표 4]

실시예 3. 형질전환체의 배양 및 포름산 생산량의 측정

상기 실시예 2에서 제조된 형질전환체는 4g/L yeast extract, 35g/L NaCl, 0.7g/L KCl, 3.9g/L MgSO₄, 0.4g/L CaCl₂·H₂O, 0.3g/L NH₄Cl, 0.15g/L Na₂HPO₄, 0.03g/L NaSiO₃, 0.5g/L NaHCO₃, 0.5g/L cysteine-HCl, 1 ml/L Holden’s trace element, 2ml/L Fe-EDTA solution, 1ml/L Balch’s vitamin solution, 및 0.05g/L Na₂S·9H₂O를 포함하는 MM1(modified medium 1) 배지에서 배양하였다. Fe-EDTA solution은 1.54g/L FeSO₄·9H₂O, 2.06g/L Na₂·EDTA를 포함하고 있다. 제작된 배지는 멸균된 후 혐기챔버에서 보관되어 혐기적 조건을 유지하였다. 돌연변이주 D02, D04, BCF01, BCF02, BCF03, 및 BCF12는 160ml serum vial에서 80ml의 배지와 head space가 3bar의 CO로 치환되어 80℃ 조건에서 배양되었다.

성장 곡선을 관찰하기 위하여 Optical density는 UV-Vis spectrophotometer (Shimadzu, UV-2600)를 이용하여 측정하였다. 포름산의 농도는 High performance liquid chromatography(YL instrument, YL9100)의 Ion exclusion chromatography column(Shodex, RSpak, KC-811)을 이용하여 분석하였고, UV detector를 이용하여 측정하였다. 이동상으로는 0.1% phosphoric acid 수용액을 사용하였다. 최종 head space의 gas 조성을 분석하기 위해 Gas chromatography(YL instrument, YL6100)의 Molsieve 5A column(Supelco, Bellefonte, PA)와 Porapack N column(Supelco)을 사용하였으며, 이동상으로는 Argon gas를 이용하였다.

그 결과, 도 6을 참조하면, 재조합 플라스미드가 도입된 형질전환체의 최고성장이 숙주 균주인 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) D02 균주와 비교하여 비교적 낮은 수준에서 저해를 보이는 것이 관찰되었다(도 6A). 또한, 숙주 균주인 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) D02 균주에서는 포름산 생산이 없는 반면 재조합 플라스미드가 도입된 BCF01, BCF02, BCF03, 및 BCF12 균주 모두에서 포름산 생산이 확인되었다(도 6B). 이러한 결과를 통해, 두 개 이상의 Fe-S 단백질을 ‘GGGGS’의 플랙서블 링커 1개 내지 3개를 통해 공유결합된 Fe-S 융합단백질을 포함하여 합성된 본 발명의 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)는 모두 전자전달이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 또한 (GGGGS)₁ 플랙서블 링커로 제작된 BCF12 균주의 포름산 생산이 19mM 농도로 가장 높게 나타난 것으로 확인되었다.

실시예 4. Resting cell 실험을 통한 CO 가스의 포름산 생전환 성능 분석

Resting cell 실험에 사용할 균주혼탁액(cell suspension)은 생물배양기로 5L 균주 배양을 실시하였으며, CO를 연속 공급하여 OD 0.9에서 균주를 회수하고 6000rpm에서 30분간 원심분리하여 균주만을 분리하여 회수하였다. 확보한 균주를 영양성분이 없는 MM1 base(yeast extract 제외)에서 세척하여 균주를 제외한 나머지 성분들을 제거하는 wash step을 3회 반복하였다. 최종적으로 MM1 base로 현탁한 OD₆₀₀ 0.5 균주를 사용하여 resting cell 실험을 진행하였다.

Resting cell 실험은 OD₆₀₀ 0.5인 균주 현탁액 6ml를 20 ml serum vial에 넣은 후 밀봉하고, headspace에 100% CO 가스를 2bar 압력으로 채워준 다음 80℃에서 배양하면서 진행하였으며, 시간에 따른 포름산 생산성과 CO 소모량 및 수소 생산성을 확인하였다.

그 결과, 48시간 경과 시점까지 포름산의 생산량이 지속적으로 증가하고, CO 가스의 소모 및 수소의 생산이 지속해서 유지됨을 확인할 수 있었다. 48시간 경과 시점에서 stoichiometry 분석 결과, CO 소모량의 약 10%가 포름산으로 전환되고 약 90%가 바이오 수소로 전환되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 단백질의 분리 및 정제

모든 단백질 분리 정제 과정은 혐기조건 하에서 진행하였다. CO를 포름산으로 전환하는지 여부를 단백질 수준에서 확인하기 위해 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)의 CODH C-term. his-tag 균주인 nadFd3CoHisL1C1127 균주로부터 affinity coloumn purification 방법을 사용하여 해당 융합단백질의 분리를 진행하였다. 융합단백질을 포함하고 있는 돌연변이주 nadFd3CoHisL1C1127 균주를 MMC(bis-Tris pH 6.5) 배지 350 ml로 배양하였으며 이를 생물 배양기에 접종하였다.

생물 배양기로 5L 균주 배양을 실시하였으며, CO를 연속 공급하여 OD 0.9에서 균주를 회수하고 6000rpm에서 30분간 원심분리하여 균주만 따로 회수하였다. 확보한 균주는 talon buffer[50mM Tris-HCl(Ph 8.0), 0.1M KCl, 10% glycerol]에 잘 풀어준 후, 소니케이터(sonicator)를 사용하여 균주를 균일하게 파쇄한 다음 Talon affinity column을 사용하여 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)를 분리하였다.

단백질은 최종 300mM 이미다졸(imidazol)이 포함된 탈론 버퍼(talon buffer)를 사용하여 talon resin으로부터 분리하였으며, 브래드포드 어세이(Bradford assay) 방법으로 단백질 농도를 정량하고, 12% SDS-PAGE로 분리·정제한 단백질을 확인하였다.

그 결과, CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 포름산 탈수소효소(fomrate dehydrogenase, Fdh)가 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)인 TON_0540-TON_1017 단백질과 함께 분리되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 따라서 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH3)가 Fe-S 융합단백질을 매개로 하여 하나의 새로운 융합단백질을 형성하고 있음을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

실시예 6. 효소 활성 측정

상기 실시예 5에서 분리된 일산화탄소:포름산 산화·환원효소(carbon monoxide:formate oxidoreductase, CFOR)의 CODH 효소 활성과 Fdh 효소 활성, 그리고 CO 가스의 포름산 전환 능을 확인하였으며, 모든 단백질 활성측정 실험은 혐기 조건에서 진행하였다.

CODH 효소 활성은 CO를 전자공여자로 주었을 때 환원되는 methylviologen (MV)의 농도를 정량하는 Methylviologen 방법을 사용하여 측정하였다.

활성 측정은 스크류 캡(screw-cap)으로 밀봉되는 큐벳에 50mM Tris-Hcl(pH 8.0) buffer 1ml에 2mM DTT, 10mM MV와 0.5ug CFOR 단백질을 첨가한 후, 뚜껑을 닫아 밀봉한 다음, headspace를 CO 가스로 purging 하고, 최종적으로 1bar CO 가스로 충진하여 반응을 준비하였다.

혼합액이 담긴 큐벳을 80℃ heat block에 정치하여 반응을 실시한 다음, 1분간 반응 후, 얼음으로 옮겨 반응을 종료하고, spectrophotometer를 사용하여 578nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH)의 활성측정은 CODH 효소 활성측정과 동일한 방법으로 진행하되, 50mM photassium phosphate(pH 7.6) buffer를 사용하였고, CO 대신 포름산을 전자공여자로 사용한 것을 달리하였으며, 또한 효소반응은 80℃ heat block에서 5분간 진행하였다.

CODH 효소와 Fdh 효소의 활성은 2mmol의 메틸비올로겐(methylviologen)이 환원되는 양으로 계산하였는데, 이는 1mmol의 CO 또는 포름산이 산화되는 양과 동일하다. 이때 흡광 계수(extinction coefficient) 값은 ε₅₇₈=9.7mM^-1·cm^-1 이다.

분리^·정제한 융합 단백질의 CO 전환/포름산 생산 활성은 5 종류의 buffer(50 mM Bis-Tris pH 6.5, 150 mM HEPES pH 7.5, 50 mM potassium phosphate pH 7.6, 100 mM Tris pH 8.0, 및 200 mM Bicine-KOH pH 8.5)에서 분리된 융합 단백질을 최종 100ug/ml 농도로 사용하여 25ml 시럼 바이알(serum vial)에 2ml의 혼합액으로 실험하였다. 23ml head space에 CO-CO₂ 혼합가스(CO:CO₂=53.5:46.5, vol./vol.)를 주입한 후, 80℃에서 인큐베이션하여 반응을 진행하였다. 5시간 동안 반응시킨 후, 생성된 포름산의 농도를 LC로 측정하였다.

포름산 측정결과 모든 buffer 조건에서 포름산의 생성이 관찰되었으며, 150mM HEPES(pH 7.5)에서 가장 많은 약 5mmol/L의 포름산이 측정되었다. In vitro 조건에서 CO와 CO₂ 가스만으로 포름산 생성이 최종 확인되었다(도 9 참조).

[표 5]

상기와 같은 결과를 통하여, 전자전달 역할을 하는 Fe-S 단백질의 융합을 통해 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH)가 복합체를 이루는 새로운 형태의 융합 단백질이 제작되었고, Fe-S 단백질을 통해 전자전달이 이루어져 효소 반응에 의해 CO₂가 포름산으로 전환되는 기능이 실제 작동함을 최종적으로 확인할 수 있었다.

실시예 7. 포름산 생산 활성 측정

MMC 배지 1.5L에 균주를 접종한 후 100% CO 가스를 퍼징하고, 80℃에서 회분식(batch culture) 생물반응기 운전하였으며, 혐기조건에서 균주배양을 실시하였다. 체크 밸브(check valve)는 가스 아울렛(outlet) 부분에 설치하여 반응기 내 가스 압력을 가압하고 조절하였다.

9시간 동안 운전한 결과, 포름산 생산성은 150mmol/L, 비특이적 포름산 생산성(specific formate production rate)은 22 mmol/g-DCW/hr로 확인되었다(도 10 참조).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[수탁번호]

기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터

수탁번호 : KCTC13649BP

수탁일자 : 2018. 9. 21

<110> KOREA OCEAN RESEARCH AND DEVELOPMENT INSTITUTE <120> Noble Fe-S Fusion Protein Acting as an Electron Transfer Chain, and Use thereof <130> PP180016AN <150> KR 10-2018-0138475 <151> 2018-11-12 <150> KR 10-2018-0138467 <151> 2018-11-12 <150> KR 10-2018-0138462 <151> 2018-11-12 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker of Fe-S Fusion Protein <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker of Fe-S Fusion Protein <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker of Fe-S Fusion Protein <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker of Fe-S Fusion Protein <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 5 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tactgtggga tggggtgcag gttttacata 60 aagactctta acgggcagcc cataggaata gagccgtatc ccggtggtgt taatgaagga 120 aagctctgtc caaagggtgt cgccgccgtt gacttcctca gacacaaaga taggctgaaa 180 aagccgctca agagaactga aaacggcttc gtcgagataa gctgggaaca ggcgataaag 240 gagattgctg aaaagcttct ggagatacgc gagaagtacg ggccggatac gttaggcttc 300 ttctcaagtg cccgttgttc caacgaggag aactacctcc tgcagaaaat agcccgcctt 360 ctgggcacca acaacgtcga ccactgcgcg aggctctgtc acgcctcaac ggtcgtcggt 420 cttgctcaga cggttggcgc tgccgctcag agcggctcct acacggacat acccaaggct 480 aaggtactcc tgatatgggg atacaacccg tcagaaaccc acccggttct catgcgctac 540 atcctccgcg cgagggacaa cggggccaag ataatcgtcg tagatccgag gaagacgagg 600 actgtctggt tcgccgatat gcacctccag cttaagcctg gaacggacat agtcctagcc 660 aacgccatga tgcacgtcat cattgaagaa aggctctatg acagggagtt catcatgaac 720 cggacgaagg gctttgagaa gctcatagca gctgtccaga agtacacgcc agaatacgcc 780 gaggaaataa ccggtgttcc cgccaagctc atcagagaag ccgctataac ctttgctact 840 gccggacggg gcatcgtgat gtgggcaatg ggactgacgc agcacgtcac 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1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fe-S Fusion Protein <400> 17 atggagaaaa agctgttcat aaacctcggg cgctgcattg cctgccgcgc ctgcgaggtg 60 gcctgtgaga aggagcacgg aatttcattc atcacggtct atgagttcag ggacatagcg 120 gttcccctca actgccgcca ctgtgagaag gctccgtgta tcgaagtctg cccgacgaag 180 gccatctatc gcgacgaaga tggcgcagtt gtgatagacg agtccaagtg tatcggctgc 240 tacatgtgtt cggccgtctg cccctacgcg attccgatag ttgacccgat aaaggagctg 300 gctgtgaagt gtgacctatg tgccgaaaga aggaaggagg gcagagatcc gctctgcgct 360 gcggtctgtc ccaccgatgc gataatctac gctgacctca acgagctgat ggaagagaag 420 aggaggcgca aggccgagcg catcgtcgaa gcccagagga aggcggtcga aacgctcgcc 480 tacttcgggg gcggcggagg cagcccagct ttttccggtt ccaacatgga gaagcttaca 540 atttacataa atccagagag atgcacgggg tgcagggcct gcgaaattgc ctgtgcagtt 600 gaacattcaa tgagcaaaaa cctctttggc gcaatttttg aaaaaccaac ccccaaaccc 660 cgactccaag ttgttgtcgc cgacttcttt aatgttccaa tgagatgcca gcactgtgag 720 gacgctccct gtatggaggc ctgcccaaca ggagcgatct caaggaccaa agaaggcttt 780 gttgtcctta acgccaacaa gtgcataggc tgtctcatgt gtgtgatggc ctgtccattt 840 ggccatccca agttcgagcc cgaatacaag gctgtgataa aatgcgacag ttgtgttgat 900 agggtcagag aaggcaaaga gccagcatgt gtcgaggcct gtccaactag agccctgaag 960 ttcgggactc tcggcgaaat actggaagag gttagaaagg agaaggcaga gagtctcata 1020 tctgggctga aatcgcaggg gatggtctac atgaagcccg tctccgagtc aaagaagaaa 1080 gaggatcttg ttagacctat ggatctgtat cttgcctatt caaatgtagt gtggtattga 1140 1140

Claims

플랙서블 링커 및 Fe-S 단백질로 구성되고,
두 개 이상의 상기 Fe-S 단백질이 상기 플랙서블 링커를 통해 공유결합하여 형성되며,
서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되고,
전자가 이동하는 통로 역할을 하는 전자전달 체인으로 작동하는 Fe-S 융합단백질.
삭제
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제1항의 Fe-S 융합단백질을 인코딩하고,
서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열로 표시되는 Fe-S 융합단백질 유전자.
(a) 제4항의 Fe-S 융합단백질 유전자; 및 (b) 상기 Fe-S 융합단백질 유전자에 작동가능하게 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
제6항의 형질전환된 세포를 배양하여 Fe-S 융합단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 Fe-S 융합단백질의 제조방법.