JP2006227301A - 蛍光観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 連続光を照射する場合よりも試料Ａの損傷を抑制し、かつ、明るい蛍光画像を得る。
【解決手段】 パルス列状の励起光Ｅを発生して試料Ａに照射するパルス光源装置２と、試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆを撮像する撮像素子５とを備え、パルス光源装置２が、撮像素子５の１コマの撮像時間内に、該撮像素子５の各画素に対応する試料Ａの各位置に複数回のパルス状の励起光Ｅを照射する蛍光観察装置１を提供する。
【選択図】 図１

Description

この発明は、蛍光観察装置に関するものである。

従来、パルスレーザ光源を用いて短時間にわたり励起光を試料に照射し、試料において発生する蛍光を検出することで、瞬時に変化する高速現象の１瞬間を画像として捕らえる装置として、パルスレーザ蛍光顕微鏡が知られている（例えば、非特許文献１）。このパルスレーザ蛍光顕微鏡によれば、選択された一瞬に高いエネルギのパルス光を照射することで、十分な蛍光量を発生させることができ、明るい蛍光画像を得ることができる。

また、従来、フェムト秒単位のパルス幅を有する極短パルスレーザ光を試料に照射することにより、試料の非常に限られた領域で多光子吸収現象を発生させ、得られる蛍光を観察する多光子励起型蛍光顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この多光子励起型蛍光顕微鏡によれば、試料におけるレーザ光の結像位置のみにおいて多光子吸収現象を生じさせるので、高い空間分解能を達成することができる。また、試料内の深部にまでレーザ光を到達させ、蛍光観察を行うことができる。
宝谷紘一、他一名、「限界を超える生物顕微鏡−見えないものを見る 日本分光学会 測定法シリーズ」、株式会社学会出版センター、１９９１年６月３０日、２１巻、ｐ．１０５−１１９ 特許第２８４８９５２号公報

しかしながら、従来のパルスレーザ蛍光顕微鏡による瞬間像はノイズが多く、空間分解能も低いため、試料における微妙な変化を精度よく捕らえるには適していないという問題がある。また、十分な蛍光量を得るために、高いエネルギのパルス光を一瞬に照射するため、例えば、細胞のような試料に損傷を与え、退色を生じさせてしまう不都合もある。仮に、試料に損傷を与えない程度にエネルギを下げたパルス光を照射する場合には、蛍光画像が暗くなるという不都合が考えられる。

一方、多光子励起型蛍光顕微鏡によればそのような不都合はない。すなわち、複数の光子により蛍光を発生させるので、各光子のエネルギが低い長波長のレーザ光を使用することができるため、試料の損傷が少なくて済む。したがって、焦点面以外の観察しない部分における試料の退色を防止し、長時間にわたる観察も可能となる。
しかしながら、多光子励起型蛍光顕微鏡は、極短パルスレーザ光を使用するため、光学素子を通過する際に発生する分散を補償するために、分散補償装置が必要不可欠であり、装置が複雑かつ大型化するという不都合がある。また、極短パルスレーザ自体も大きく、コストが高いという問題もある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、連続光を照射する場合よりも試料の損傷を抑制し、かつ、明るい蛍光画像を得ることができる蛍光観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、パルス列状の励起光を発生して試料に照射するパルス光源装置と、試料において発生した蛍光を撮像する撮像素子とを備え、前記パルス光源装置が、前記撮像素子の１コマの撮像時間内に、該撮像素子の各画素に対応する試料の各位置に複数回のパルス状の励起光を照射する蛍光観察装置を提供する。

本発明によれば、パルス光源装置から発せられたパルス列状の励起光が試料に照射される。試料の各位置においては、パルス状の励起光が照射される毎に、蛍光物質が励起されることによって蛍光が発せられ、発生した蛍光は撮像素子によって撮像される。

本発明の発明者は、検討の結果、連続発光の励起光を照射し続けた場合に発生する蛍光よりも、パルス状の励起光を複数回照射した場合に発生する蛍光の方が、明るい蛍光像を得ることができ、また、試料の損傷も少ないという知見を得た。
本発明によれば、撮像素子による１コマの蛍光画像の取得時間内に、パルス状の励起光が試料上の各位置に複数回にわたり照射される。これにより、連続光により走査する場合よりも明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、試料の損傷を抑制することができる。また、多光子吸収現象を発生するような極短パルスレーザを使用する必要がないので、分散補償が不要となり、装置の構成を簡易にして小型化を達成することができる。

さらに、撮像素子による１コマの撮像時間内に試料からのパルス状の蛍光が複数回入射されて蓄積された後に信号処理系に送られるので、蛍光を蓄積することなく入射の都度に信号処理する場合と比較して、累積的なノイズを低減することが可能となる。その結果、画質を向上することができる。
なお、本発明において、「パルス状」あるいは「パルス列状」の語句には、正弦変調等のように光の強弱の変動があるものや、各パルス間の光の強度がゼロにならない場合も含まれる。

上記発明においては、前記パルス光源装置が、光源と、該光源から発せられた光を複数のパルス列状の光に変調する変調装置とを備えることが好ましい。
このように構成することで、変調装置の作動により光源から出射される連続光をパルス列状の光にし、あるいは光源から発せられるパルス列状の光の周波数を任意に調節することが可能となる。したがって、光源の性能に関わらず、安定したパルス列状の励起光を発生させることが可能となる。

上記発明においては、前記変調装置が、複数のスリットまたはピンホールを有し、前記光源から対物レンズに向かう光軸を遮るように配置されるディスクと、該ディスクを光軸に略平行な軸線回りに回転させる回転手段とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、回転手段を作動させてディスクを回転させると、ディスクに設けられたスリットまたはピンホールが光軸に対して交差する方向に移動する。その結果、試料上における光スポットの位置も時々刻々変化する。ディスクに設けられている複数のスリットまたはピンホールを通過することによって形成された複数の光スポットが、ディスクの回転によって移動して、順次通過する結果、試料上の各位置について見ると、強度がパルス状に変動する光が複数回照射されることになる。その結果、連続光により走査する場合よりも明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、試料の損傷を抑制することができる。この場合に、光源としては、連続発光光源でもよいし、パルス光源を用いてもよい。

また、上記発明においては、前記励起光光源が、連続発光光源からなり、前記変調装置が、前記連続発光光源からの連続光を変調してパルス列状の光を形成することが好ましい。
ストロボ光源は、蓄えたエネルギを瞬時に放出することでパルス状の光を発生するため、高速性および安定性に劣るという問題がある。本発明においては、連続発光光源を採用することで、ストロボ光源によって発生されるパルス光よりも十分に小さなピークパワーで済み、光源自体の安定性を向上できるとともに、変調装置によってパルス列状の光に形成する高速変調をかけることにより、安定性および高速性の高いパルス光源装置を得ることができる。これにより、観察範囲の全域にわたって均一にパルス列状の励起光を照射し、精度の高い蛍光画像を得ることができる。

さらに、上記発明においては、前記励起光源が、同一周期で位相の異なるパルス列状の励起光を発生する複数のストロボ光源からなり、前記変調装置が、前記複数のストロボ光源からのパルス列状の励起光を合成する切替装置からなることとしてもよい。
上述したようにストロボ光源は、安定性を得るために高速化できないという問題があるが、パルスレーザ光源等と比較して安価であるという利点がある。本発明においては、複数のストロボ光源からのパルス列状の光を切替装置によって合成し、ストロボ光源の個数倍の高周波数のパルス列状の励起光を安定的に得ることができる。

上記発明においては、前記パルス光源装置が、パルス列状のレーザ光を出射し、前記パルス光源装置から出射されたレーザ光からスペックルノイズを除去するレーザスペックル除去装置が備えられていることが好ましい。
レーザ光によれば、ピークパワーが比較的大きく、高速かつ安定した励起光として供給することができる反面、レーザの干渉性によってスペックルノイズによる照明ムラが発生することがある。本発明によれば、レーザスペックル除去装置の作動により、スペックルノイズを除去できる。したがって、均一な照明を得ることができ、鮮明な蛍光画像を得ることができる。

本発明によれば、試料の各位置に断続的に照射されるパルス状の励起光の各々によって蛍光が発生するので、連続した励起光を照射する場合と比較して、試料の損傷を低く抑えながら明るい蛍光を得ることができる。したがって、観察範囲全域にわたって試料の損傷を抑えつつ明るい蛍光を得ることにより、明るい蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置１について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示されるように、パルス列状の励起光Ｅを発生するパルス光源装置２と、該パルス光源装置２から発せられたパルス列状の励起光Ｅを試料Ａに照射する対物レンズ３と、該対物レンズ３と前記パルス光源装置２との間に配置されたダイクロイックミラー４と、該ダイクロイックミラー４により分離された蛍光Ｆを撮像する撮像素子５とを備えている。

図中、符号６は、ダイクロイックミラー４によって分岐された蛍光Ｆに含まれる励起光Ｅ成分を除去するバリアフィルタ、符号７は、バリアフィルタ６を透過した蛍光Ｆを撮像素子５の撮像面に結像させる集光レンズ、符号８は、撮像素子５において発生した電気信号を処理して画像情報を形成する信号処理装置、符号９は信号処理装置８により形成された画像情報を表示するモニタである。

前記パルス光源装置２は、図１に示されるように、キセノンランプのような連続発光光源１０と、該連続発光光源１０からの光を略平行光に変換するコリメートレンズ１１と、該コリメートレンズ１１により変換された平行光をパルス列状の光に変換する変調装置１２と、パルス列状の光を対物レンズ３に導くリレーレンズ１３と、該リレーレンズ１３によりリレーされた光を入射させて励起光Ｅのみを透過させる励起フィルタ１４とを備えている。

前記変調装置１２は、例えば、図２に示されるように、複数のスリット１５を備える回転ディスク１６と、該回転ディスク１６を回転駆動するモータ１７とを備えている。回転ディスク１６は、前記コリメートレンズ１１を通過した平行光を遮るように、光軸に略直交して配置され、回転ディスク１６に入射した平行光の入射範囲内に配されるスリット１５部分の光のみの通過を許容するようになっている。また、回転ディスク１６は、対物レンズ３の焦点位置と共役な位置に配置されている。

回転ディスク１６に設けられたスリット１５は、共焦点ディスクにおけるスリットの間隔よりも十分に小さくすることが好ましい。また、スリット１５のパターンも図２の形態に限られず、放射状にスリット１５が形成されていてもよい。

ダイクロイックミラー４は、励起光Ｅを反射し、蛍光Ｆを透過するように、その波長特性を設定されている。ダイクロイックミラー４は、励起光Ｅの入射光軸に対して４５°傾斜して配置されている。これにより、ダイクロイックミラー４は、励起光Ｅを反射することで、９０°偏向させ、対物レンズ３に指向させるようになっている。
撮像素子５は、例えば、冷却ＣＣＤ（Cooled Charge Coupled Device）または、ＣＭＯＳ（Complementary Metal
Oxide Semiconductor）イメージング装置である。

このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いて試料Ａの蛍光観察を行うには、パルス光源装置２を構成する連続発光光源１０を作動させるとともに、変調装置１２を作動させる。変調装置１２を作動させると、モータ１７が回転ディスク１６を回転させる。

連続発光光源１０から発せられた連続光は、回転ディスク１６上に照射されることにより、回転ディスク１６に設けられたスリット１５部分の光のみが回転ディスク１６を通過させられて、リレーレンズ１３によりリレーされ、励起フィルタ１４を通過させられることで励起光Ｅとなってダイクロイックミラー４に入射される。ダイクロイックミラー４に入射された励起光Ｅは反射されることにより９０°偏向されて対物レンズ３によって試料Ａに結像される。

各瞬間において、試料Ａ上には、回転ディスク１６に設けられた複数本のスリット１５の像が結像される。本実施形態においては、回転ディスク１６が回転させられることにより、連続発光光源１０からの光が通過するスリット１５が逐次移動させられる。その結果、試料Ａ上のスリット１５の像も逐次移動していくことになる。

したがって、回転ディスク１６が所定角度だけ回転させられることにより、試料Ａ上の観察範囲全域にスリット１５状の励起光Ｅが走査されるようにして照射される。
この場合において、試料Ａ上の各位置について見れば、スリット１５の像が形成されている状態では励起光Ｅが照射され、スリット１５の像間に配されている状態では励起光Ｅの照射が停止される。その結果、所定時間にわたって見ると、試料Ａ上の全ての位置において、励起光Ｅが照射されている時間と停止されている時間とが交互に複数回にわたって発生する。すなわち、試料Ａ上の各位置において、励起光Ｅの強度がパルス列状に変動することになる。

また、本実施形態に係る蛍光観察装置１においては、変調装置２が回転ディスク１６およびモータ１７によって構成されているので、回転ディスク１６の回転速度を適宜選択することにより、簡易に、パルス列状の励起光Ｅの周波数を適宜調節することができる。

励起光Ｅが試料Ａに照射されると、試料Ａ内に含有されている蛍光分子が励起され蛍光Ｆが発せられる。
ここで、蛍光分子の励起と蛍光発光機構について、図３を参照して説明する。
一般的に、蛍光分子は安定な基底準位レベル（Ｅ_０）の状態に多数存在している。この状態の分子に対して、上準位のエネルギー状態（Ｅ_１）との差に相当するエネルギー（Ｅ_１−Ｅ_０＝ｈν_１）の光を吸収すると、ある確率(Ｆ_０１)にて励起が起こり、上準位のエネルギー状態に遷移する。
ここで、ｈ：プランク定数、ν_１：Ｅ_１−Ｅ_０のエネルギー差に相当する振動数である。

主に光励起方法としては、レーザ光やランプ光が用いられ、ｈν_１にあったエネルギーの光を選択している。
上準位のエネルギー状態は、比較的寿命が短く、また不安定であり、別の安定なエネルギー状態に移行する。例えば、下準位のエネルギー状態（Ｅ_２）へある確率γ_１で移行し、その準位から光（ｈν_２）を放出して、基底状態（Ｅ_０）へ遷移する。このとき発生する光が蛍光である。

また、中にはｈν_２の光を放出せずに、別のエネルギー準位へ遷移したり、イオン化が起こり異なる分子状態になったり、また分子解離など発生し組成が変わることも考えられる。このような現象はある確率γ_２で発生し、光を発しないため、長時間観察をしている場合、蛍光量が時間と共に減少していく場合がある。これは、基底状態に戻る分子数が減り、結果的に蛍光を発する分子が減少するためで、一般的に退色と言われる。
本説明に使ったモデルは３準位系モデルであるが、２準位又は４準位であっても、基本的なメカニズムは変わらない。

なお、蛍光量の多さは、蛍光分子に与える励起光の単位時間あたりのエネルギーやその時間変化と、蛍光分子の励起確率や上準位のエネルギーの寿命などに依存している。例えば、エネルギーの高い励起光を連続的に与え続けても強い蛍光が得られるとは限らず、上準位レベルの分子が飽和状態になったり、また退色現象が多数発生したりしてしまい、効率のよい蛍光発生のプロセスとは言えない。
長時間観察や細胞ダメージ回避のためには、できるだけ少ない励起エネルギーで、分子を効率的に励起し、また退色現象をできるだけ低減し、効率よい蛍光を得ることが非常に重要である。

試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ３によって集められ、ダイクロイックミラー４を通過させられることで励起光Ｅから分岐され、バリアフィルタ６を通過して集光レンズ７により撮像素子５に結像させられる。撮像素子５は、１コマの蛍光画像を形成するのに十分な情報を得るまでの所定時間にわたって試料Ａからの蛍光Ｆを撮像し続けた後、各画素において取得した蛍光Ｆの強度に応じた画素ごとの電気信号を信号処理装置８に送る。そして、信号処理装置８においては、撮像素子５から送られてきた画素ごとの電気信号に基づいて蛍光画像が形成され、形成された蛍光画像がモニタ９に表示される。

本実施形態においては、撮像素子５が１コマの蛍光画像を形成するのに十分な情報を得るまでの所定時間の間に、試料Ａ上の各位置に複数のパルス列状の励起光Ｅが照射される。
単一のパルスにより十分な蛍光量を得る従来のパルスレーザ蛍光顕微鏡と比較して、同じ蛍光量を得るための各パルス状の励起光Ｅのピークパワーを十分に低減することができる。また、連続的な励起光Ｅを各位置に連続照射する場合と比較すると、各パルス列状の励起光Ｅのピークパワーを大きくしても、パルス間に配される休止期間を設けることによって、その平均パワーを低減することができる。

その結果、ピークパワーを単一のパルスの場合よりも低減して、試料Ａの瞬間的な損傷を防止することができるとともに、連続的な励起光Ｅを照射する場合よりも平均パワーを低減して、試料Ａに加える総エネルギが過大となることによる試料Ａの損傷防止を図ることができる。また、発明者の知見によれば、励起光Ｅを連続的に照射する場合と比較して、十分に低い平均パワーでも明るい蛍光Ｆを得ることができる。したがって、励起光Ｅのパワーを低減しながら明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。

すなわち、パルス光源装置２を用いることにより、試料Ａに加える平均パワーを低減して明るい蛍光画像を得ることができる。したがって、試料Ａに与える損傷を低減して長期間にわたる観察が可能となる。また、超短パルスレーザ光を使用する多光子励起型蛍光観察装置とは異なり、励起光Ｅの分散を考慮する必要がないので、装置の構成を簡易にし、また、小型化を図ることができる。

また、撮像素子５が１コマの蛍光画像を形成するのに十分な情報を得るまでの所定時間の間に、試料Ａ上の各位置から発生したパルス状の蛍光Ｆが撮像素子５の撮像面に複数回入射して撮像素子５に蓄積される。撮像素子５は、蓄積した蛍光を電気信号に変換して信号処理装置８に送るので、１個のパルス状の蛍光Ｆが入射するたびに電気信号に変換して信号処理装置８で積算処理する場合と比較すると、累積ノイズを低減することができるという利点がある。

なお、本実施形態に係る蛍光観察装置１においては、複数のスリット１５を有する回転ディスク１６を変調装置１２の一例として説明したが、これに代えて、複数のピンホールを有する回転ディスク１６を採用してもよい。また、光源として連続発光光源１０を採用したが、これに代えて、パルス光源を採用してもよい。

次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置２０について、図４〜図６を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る蛍光観察装置２０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略することにする。

本実施形態に係る蛍光観察装置２０は、図４に示されるように、パルス光源装置２１、ダイクロイックミラー４、対物レンズ３、バリアフィルタ６、集光レンズ７、撮像素子５、信号処理装置８よびモニタ９を有する基本構成において、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１と共通している。
本実施形態に係る蛍光観察装置２０は、パルス光源装置２１において第１の実施形態に係る蛍光観察装置１と相違している。

本実施形態において、パルス光源装置２１は、２つのストロボ光源２２Ａ，２２Ｂ、例えば、キセノンフラッシュランプ等と、各ストロボ光源２２Ａ，２２Ｂからの光を略平行光に変換するコリメートレンズ１１と、略平行光に変換された２つの光を合成する切替装置（変調装置）２３とを備えている。切替装置２３は、回転ディスク２４と、該回転ディスク２４を回転させるモータ２５とを備えている。符号２６はモータ２５の動力を回転ディスク２４に伝達するベルトである。

回転ディスク２４は、図５に示されるように、光を略１００％反射するミラー部分２４ａと、光を略１００％透過する透過部分２４ｂとを周方向に交互に並べて構成されている。
前記２つのストロボ光源２２Ａ，２２Ｂは、図４に示されるように、相互に９０°の角度をなして配置され、その光軸の交差位置に前記回転ディスク２４が配置されている。これにより、第１のストロボ光源２２Ａから発せられた光は、回転ディスク２４の透明部分２４ｂが光軸上に配置されているときに、回転ディスク２４を透過させられてリレーレンズ１３に入射されるようになっている。また、第２のストロボ光源２２Ｂから発せられた光は、回転ディスク２４のミラー部分２４ａが光軸上に配置されているときに回転ディスク２４によって反射され、９０°偏向させられて第１のストロボ光源２２Ａからの光と同一の光軸上に入射させられるようになっている。

各ストロボ光源２２Ａ，２２Ｂは、図６（ａ），（ｂ）に示されるように、同一の周波数のパルス列状の光を出射するようになっている。また、第１のストロボ光源２２Ａと第２のストロボ光源２２Ｂとは、その周期が９０°ずれている。これにより、切替装置２３によって合成された後には、図６（ｃ）に示されるように、各ストロボ光源２２Ａ，２２Ｂの２倍の周波数のパルス列状の光が出射されるようになっている。

本実施形態に係る蛍光観察装置２０によれば、切替装置２３によって、各ストロボ光源２２Ａ，２２Ｂよりも高い周波数のパルス列状の励起光Ｅを試料Ａに入射させることができる。したがって、比較的低速のストロボ光源２２Ａ，２２Ｂを用いても、高い周波数のパルス状の励起光Ｅを試料Ａに入射させ、明るい蛍光画像を取得することが可能となる。ストロボ光源２２Ａ，２２Ｂから出射されるパルス列状の光の周波数は低いままでよいので、ストロボ光源２２Ａ，２２Ｂを安定性の高い条件で使用でき、安定した蛍光観察を行うことができる。

なお、本実施形態に係る蛍光観察装置２０においては、２つのストロボ光源２２Ａ，２２Ｂを用いたが、これに限定されるものではなく、３以上の複数のストロボ光源を用いるとともに、２以上の切替装置２３をカスケード的に接続して、より高い周波数のパルス状の励起光Ｅを試料Ａに照射することにしてもよい。

次に、本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置３０について、図７を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明においても、第１の実施形態に係る蛍光観察装置３０と構成を同一とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る蛍光観察装置３０も、パルス光源装置３１において第１の実施形態に係る蛍光観察装置１と相違している。
本実施形態においては、パルス光源装置３１は、連続発光レーザ光Ｌを発生する連続発光レーザ光源３２と、発生されたレーザ光Ｌを断続させてパルス状に整形する高速光変調素子（変調装置）３３とを備えるものとしてもよい。高速光変調素子３３としては、音響光学素子あるいは電気光学素子を採用することができる。このようにすることで、より安定したピークパワーとパルス幅およびパルス間隔を有するパルスレーザ光Ｌ_１を発生させることができる。したがって、試料Ａの各位置を均一なパルスレーザ光Ｌ_１により照射して、精度の高い蛍光画像を得ることができる。また、安価な連続発光レーザ３２で高い繰り返し周波数のパルス状の光を照射することができる。

また、図８に示されるように、複数の波長の連続発光レーザ光源３２Ａ，３２Ｂと高速光変調素子３３Ａ，３３Ｂとの組合せからなるパルス光源装置３１を用いてもよい。この場合、連続発光レーザ光源３２Ａ，３２Ｂから出射されたパルスレーザ光をミラー３４およびダイクロイックミラー３５によって合成し、同時に試料Ａに照射させるようにすることができる。また、図９に示されるように、高速光変調素子３３を複数の連続発光レーザ光源３２Ａ，３２Ｂに対して共用するようにしてもよい。

さらに、図１０に示されるように、２つの連続発光レーザ光源３２Ａ，３２Ｂをダイクロイックミラー３５によって接続する場合に、一方の連続発光レーザ光源３２Ｂから出射されたレーザ光Ｌ′のみを１／２波長板３６に通過させることにより、他方の連続発光レーザ光源３２Ａから出射されたレーザ光Ｌに対して、高速光変調素子３３に入射する際のレーザ光Ｌ′の偏光面を異ならせることとしてもよい。このようにすることで、単一の高速光変調素子３３により、２つの連続発光レーザ光源３２Ａ，３２Ｂから出射された２種類のレーザ光Ｌ，Ｌ′を交互に強弱をつけて変調することができる。

また、図１１に示されるように、高速光変調素子３３により変調されたパルスレーザ光Ｌ_１をレーザスペックル除去手段３７に通過させることにしてもよい。レーザスペックル除去手段３７としては、例えば、１本１本の長さの違い光ファイバを複数本束ねたマルチレングスファイバが挙げられる。マルチレングスファイバにレーザ光Ｌを入射させると、レーザ光Ｌの干渉性を著しく低下させることができる。通常、レーザ光Ｌで面照射するとレーザ光Ｌの干渉でレーザ照射面が粒々の明暗パターンとなり、著しい照明ムラ（スペックルノイズ）が発生するが、マルチレングスファイバを通過させることによって、スペックルノイズをほとんどなくすことができ均一な照明を得ることができる。

また、レーザスペックル除去手段３７としては、マルチレングスファイバに代えて、拡散板を回転させ、得られた画像を積算することが挙げられる。ランダムなスペックルパターン照明による粒々の明暗画像が、積算により均一な画像となる。

また、試料の表面の限られた領域のみに照明を行う方法として全反射照明法が知られているが、本発明においては、この全反射照明法の光源として上記いずれかのパルス光源装置を採用することにしてもよい。

また、上記各実施形態においては、対物レンズ３側から励起光を照射する落射照明方式の蛍光観察装置について説明したが、これに代えて、図１２に示されるように、透明部材４０上に搭載した試料Ａに対し、対物レンズ３とは反対側から励起光Ｅを照射し、試料Ａから励起光Ｅとは反対方向に出射した蛍光Ｆを観察する透過蛍光方式に本発明を適用してもよい。図１２において、符号４１はパルス光源、符号４２はミラー、符号４３は試料Ａに励起光Ｅを導くコンデンサレンズである。

本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置の全体構成を概略的に示す模式図である。 図１の蛍光観察装置の変調装置に使用される回転ディスクの一例を示す正面図である。 蛍光分子の励起と、蛍光発光機構を説明するための蛍光分子の３準位系モデルを示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置の全体構成を概略的に示す模式図である。 図４の蛍光観察装置の切替装置の一例を示す正面図である。 図４の蛍光観察装置の連続発光光源とパルス光源装置のパルス列状の励起光の関係を示すグラフである。 本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置の全体構成を概略的に示す模式図である。 図７の蛍光観察装置の第１の変形例を示す模式図である。 図７の蛍光観察装置の第２の変形例を示す模式図である。 図７の蛍光観察装置の第３の変形例を示す模式図である。 図７の蛍光観察装置の第４の変形例を示す模式図である。 本発明の蛍光観察装置の他の変形例を示す模式図である。

符号の説明

Ａ 試料
Ｅ 励起光
Ｆ 蛍光
Ｌ，Ｌ１ レーザ光（励起光）
１ 蛍光観察装置
２，３１ パルス光源装置
３ 対物レンズ
４ ダイクロイックミラー
５ 撮像素子
１０ 光源
１２，３３ 変調装置
１５ スリット
１６ ディスク（回転ディスク）
１７ モータ
２２Ａ，２２Ｂ ストロボ光源
２３ 切替装置
３２，３２Ａ，３２Ｂ 連続発光光源
３３Ａ，３３Ｂ 高速変調素子（変調装置）

Claims (6)

1. パルス列状の励起光を発生して試料に照射するパルス光源装置と、
   試料において発生した蛍光を撮像する撮像素子とを備え、
   前記パルス光源装置が、前記撮像素子の１コマの撮像時間内に、該撮像素子の各画素に対応する試料の各位置に複数回のパルス状の励起光を照射する蛍光観察装置。
2. 前記パルス光源装置が、光源と、該光源から発せられた光を複数のパルス列状の光に変調する変調装置とを備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
3. 前記変調装置が、複数のスリットまたはピンホールを有し、前記光源から対物レンズに向かう光軸を遮るように配置されるディスクと、該ディスクを光軸に略平行な軸線回りに回転させる回転手段とを備える請求項２に記載の蛍光観察装置。
4. 前記光源が、連続発光光源からなり、
   前記変調装置が、前記連続発光光源からの連続光を変調してパルス列状の光を形成する請求項２に記載の蛍光観察装置。
5. 前記光源が、同一周期で位相の異なるパルス列状の光を発生する複数のストロボ光源からなり、
   前記変調装置が、前記複数のストロボ光源からのパルス列状の光を合成する切替装置からなる請求項２に記載の蛍光観察装置。
6. 前記パルス光源装置が、パルス列状のレーザ光を出射し、
   前記パルス光源装置から出射されたレーザ光からスペックルノイズを除去するレーザスペックル除去装置が備えられている請求項１から請求項４のいずれかに記載の蛍光観察装置。

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