JP2006227301A - Fluorescence observation device - Google Patents
Fluorescence observation device Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006227301A JP2006227301A JP2005040950A JP2005040950A JP2006227301A JP 2006227301 A JP2006227301 A JP 2006227301A JP 2005040950 A JP2005040950 A JP 2005040950A JP 2005040950 A JP2005040950 A JP 2005040950A JP 2006227301 A JP2006227301 A JP 2006227301A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- light
- light source
- pulse
- sample
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
Abstract
Description
この発明は、蛍光観察装置に関するものである。 The present invention relates to a fluorescence observation apparatus.
従来、パルスレーザ光源を用いて短時間にわたり励起光を試料に照射し、試料において発生する蛍光を検出することで、瞬時に変化する高速現象の1瞬間を画像として捕らえる装置として、パルスレーザ蛍光顕微鏡が知られている(例えば、非特許文献1)。このパルスレーザ蛍光顕微鏡によれば、選択された一瞬に高いエネルギのパルス光を照射することで、十分な蛍光量を発生させることができ、明るい蛍光画像を得ることができる。 Conventionally, a pulse laser fluorescence microscope has been used as an apparatus for capturing an instant of a high-speed phenomenon that changes instantaneously as an image by irradiating a sample with excitation light for a short time using a pulse laser light source and detecting fluorescence generated in the sample. Is known (for example, Non-Patent Document 1). According to this pulse laser fluorescence microscope, a sufficient amount of fluorescence can be generated by irradiating a selected pulse light of high energy instantaneously, and a bright fluorescence image can be obtained.
また、従来、フェムト秒単位のパルス幅を有する極短パルスレーザ光を試料に照射することにより、試料の非常に限られた領域で多光子吸収現象を発生させ、得られる蛍光を観察する多光子励起型蛍光顕微鏡が知られている(例えば、特許文献1参照。)。
この多光子励起型蛍光顕微鏡によれば、試料におけるレーザ光の結像位置のみにおいて多光子吸収現象を生じさせるので、高い空間分解能を達成することができる。また、試料内の深部にまでレーザ光を到達させ、蛍光観察を行うことができる。
According to this multiphoton excitation type fluorescence microscope, the multiphoton absorption phenomenon is caused only at the imaging position of the laser beam in the sample, so that high spatial resolution can be achieved. In addition, fluorescence observation can be performed by allowing the laser beam to reach a deep portion in the sample.
しかしながら、従来のパルスレーザ蛍光顕微鏡による瞬間像はノイズが多く、空間分解能も低いため、試料における微妙な変化を精度よく捕らえるには適していないという問題がある。また、十分な蛍光量を得るために、高いエネルギのパルス光を一瞬に照射するため、例えば、細胞のような試料に損傷を与え、退色を生じさせてしまう不都合もある。仮に、試料に損傷を与えない程度にエネルギを下げたパルス光を照射する場合には、蛍光画像が暗くなるという不都合が考えられる。 However, there is a problem that the instantaneous image obtained by the conventional pulse laser fluorescence microscope is not suitable for accurately capturing subtle changes in the sample because it has a lot of noise and low spatial resolution. In addition, in order to obtain a sufficient amount of fluorescence, high-energy pulsed light is irradiated instantaneously. For example, there is a problem in that a sample such as a cell is damaged and fading occurs. Temporarily, when irradiating the pulse light which reduced energy to the extent that the sample is not damaged, there is a problem that the fluorescent image becomes dark.
一方、多光子励起型蛍光顕微鏡によればそのような不都合はない。すなわち、複数の光子により蛍光を発生させるので、各光子のエネルギが低い長波長のレーザ光を使用することができるため、試料の損傷が少なくて済む。したがって、焦点面以外の観察しない部分における試料の退色を防止し、長時間にわたる観察も可能となる。
しかしながら、多光子励起型蛍光顕微鏡は、極短パルスレーザ光を使用するため、光学素子を通過する際に発生する分散を補償するために、分散補償装置が必要不可欠であり、装置が複雑かつ大型化するという不都合がある。また、極短パルスレーザ自体も大きく、コストが高いという問題もある。
On the other hand, the multiphoton excitation type fluorescence microscope has no such inconvenience. That is, since fluorescence is generated by a plurality of photons, laser light having a long wavelength with low energy of each photon can be used, so that the sample is less damaged. Therefore, fading of the sample in a portion other than the focal plane that is not observed is prevented, and observation over a long time is also possible.
However, since the multiphoton excitation type fluorescence microscope uses an ultrashort pulse laser beam, a dispersion compensation device is indispensable to compensate for dispersion generated when passing through an optical element, and the device is complicated and large. There is an inconvenience of becoming. There is also a problem that the ultrashort pulse laser itself is large and expensive.
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、連続光を照射する場合よりも試料の損傷を抑制し、かつ、明るい蛍光画像を得ることができる蛍光観察装置を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and provides a fluorescence observation apparatus capable of suppressing damage to a sample and obtaining a bright fluorescent image as compared with the case of irradiating continuous light. It is aimed.
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、パルス列状の励起光を発生して試料に照射するパルス光源装置と、試料において発生した蛍光を撮像する撮像素子とを備え、前記パルス光源装置が、前記撮像素子の1コマの撮像時間内に、該撮像素子の各画素に対応する試料の各位置に複数回のパルス状の励起光を照射する蛍光観察装置を提供する。
In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The present invention includes a pulse light source device that generates pulse train-shaped excitation light and irradiates a sample, and an image sensor that images fluorescence generated in the sample, and the pulse light source device captures one frame of the image sensor. Provided is a fluorescence observation apparatus that irradiates each position of a sample corresponding to each pixel of the imaging element with a plurality of pulsed excitation light within a time period.
本発明によれば、パルス光源装置から発せられたパルス列状の励起光が試料に照射される。試料の各位置においては、パルス状の励起光が照射される毎に、蛍光物質が励起されることによって蛍光が発せられ、発生した蛍光は撮像素子によって撮像される。 According to the present invention, the sample is irradiated with excitation light in the form of a pulse train emitted from the pulse light source device. At each position of the sample, every time the pulsed excitation light is irradiated, the fluorescent material is excited to emit fluorescence, and the generated fluorescence is imaged by the imaging element.
本発明の発明者は、検討の結果、連続発光の励起光を照射し続けた場合に発生する蛍光よりも、パルス状の励起光を複数回照射した場合に発生する蛍光の方が、明るい蛍光像を得ることができ、また、試料の損傷も少ないという知見を得た。
本発明によれば、撮像素子による1コマの蛍光画像の取得時間内に、パルス状の励起光が試料上の各位置に複数回にわたり照射される。これにより、連続光により走査する場合よりも明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、試料の損傷を抑制することができる。また、多光子吸収現象を発生するような極短パルスレーザを使用する必要がないので、分散補償が不要となり、装置の構成を簡易にして小型化を達成することができる。
As a result of the study, the inventors of the present invention have found that the fluorescence generated when the pulsed excitation light is irradiated a plurality of times is brighter than the fluorescence generated when the continuous excitation light is continuously irradiated. It was found that an image could be obtained and that the sample was less damaged.
According to the present invention, pulsed excitation light is irradiated to each position on the sample a plurality of times within the acquisition time of a single-frame fluorescence image by the imaging device. Thereby, a brighter fluorescent image can be obtained than when scanning with continuous light, and damage to the sample can be suppressed. In addition, since it is not necessary to use an ultrashort pulse laser that generates a multiphoton absorption phenomenon, dispersion compensation is unnecessary, and the size of the apparatus can be reduced by simplifying the configuration of the apparatus.
さらに、撮像素子による1コマの撮像時間内に試料からのパルス状の蛍光が複数回入射されて蓄積された後に信号処理系に送られるので、蛍光を蓄積することなく入射の都度に信号処理する場合と比較して、累積的なノイズを低減することが可能となる。その結果、画質を向上することができる。
なお、本発明において、「パルス状」あるいは「パルス列状」の語句には、正弦変調等のように光の強弱の変動があるものや、各パルス間の光の強度がゼロにならない場合も含まれる。
Further, since pulsed fluorescence from the sample is incident and accumulated several times within the imaging time of one frame by the image sensor, it is sent to the signal processing system, so that signal processing is performed for each incident without accumulating fluorescence. Compared to the case, cumulative noise can be reduced. As a result, the image quality can be improved.
In the present invention, the phrase “pulse shape” or “pulse train shape” includes a case where there is a fluctuation in light intensity such as sinusoidal modulation or the case where the light intensity between pulses does not become zero. It is.
上記発明においては、前記パルス光源装置が、光源と、該光源から発せられた光を複数のパルス列状の光に変調する変調装置とを備えることが好ましい。
このように構成することで、変調装置の作動により光源から出射される連続光をパルス列状の光にし、あるいは光源から発せられるパルス列状の光の周波数を任意に調節することが可能となる。したがって、光源の性能に関わらず、安定したパルス列状の励起光を発生させることが可能となる。
In the above invention, it is preferable that the pulse light source device includes a light source and a modulation device that modulates the light emitted from the light source into a plurality of pulse trains.
With this configuration, it is possible to change the continuous light emitted from the light source into a pulse train light by the operation of the modulation device, or arbitrarily adjust the frequency of the pulse train light emitted from the light source. Therefore, it is possible to generate stable pulse train-like excitation light regardless of the performance of the light source.
上記発明においては、前記変調装置が、複数のスリットまたはピンホールを有し、前記光源から対物レンズに向かう光軸を遮るように配置されるディスクと、該ディスクを光軸に略平行な軸線回りに回転させる回転手段とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、回転手段を作動させてディスクを回転させると、ディスクに設けられたスリットまたはピンホールが光軸に対して交差する方向に移動する。その結果、試料上における光スポットの位置も時々刻々変化する。ディスクに設けられている複数のスリットまたはピンホールを通過することによって形成された複数の光スポットが、ディスクの回転によって移動して、順次通過する結果、試料上の各位置について見ると、強度がパルス状に変動する光が複数回照射されることになる。その結果、連続光により走査する場合よりも明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、試料の損傷を抑制することができる。この場合に、光源としては、連続発光光源でもよいし、パルス光源を用いてもよい。
In the above invention, the modulation device has a plurality of slits or pinholes and is arranged so as to block the optical axis from the light source toward the objective lens, and the disk is rotated about an axis substantially parallel to the optical axis. It is good also as providing the rotation means to rotate it.
With this configuration, when the disk is rotated by operating the rotating means, the slit or pinhole provided in the disk moves in a direction intersecting the optical axis. As a result, the position of the light spot on the sample also changes from moment to moment. A plurality of light spots formed by passing through a plurality of slits or pinholes provided on the disc move by the rotation of the disc and pass sequentially. Light that fluctuates in a pulse shape is irradiated multiple times. As a result, a brighter fluorescent image can be obtained than when scanning with continuous light, and damage to the sample can be suppressed. In this case, the light source may be a continuous light source or a pulsed light source.
また、上記発明においては、前記励起光光源が、連続発光光源からなり、前記変調装置が、前記連続発光光源からの連続光を変調してパルス列状の光を形成することが好ましい。
ストロボ光源は、蓄えたエネルギを瞬時に放出することでパルス状の光を発生するため、高速性および安定性に劣るという問題がある。本発明においては、連続発光光源を採用することで、ストロボ光源によって発生されるパルス光よりも十分に小さなピークパワーで済み、光源自体の安定性を向上できるとともに、変調装置によってパルス列状の光に形成する高速変調をかけることにより、安定性および高速性の高いパルス光源装置を得ることができる。これにより、観察範囲の全域にわたって均一にパルス列状の励起光を照射し、精度の高い蛍光画像を得ることができる。
Moreover, in the said invention, it is preferable that the said excitation light source consists of a continuous light source, and the said modulation | alteration apparatus modulates the continuous light from the said continuous light source, and forms a pulse-train-shaped light.
The strobe light source generates pulsed light by instantaneously releasing stored energy, and thus has a problem that it is inferior in high speed and stability. In the present invention, by adopting a continuous light source, the peak power is sufficiently smaller than the pulsed light generated by the strobe light source, and the stability of the light source itself can be improved. By applying high-speed modulation to be formed, a pulse light source device having high stability and high speed can be obtained. Thereby, it is possible to irradiate the pulse train-like excitation light uniformly over the entire observation range and obtain a highly accurate fluorescent image.
さらに、上記発明においては、前記励起光源が、同一周期で位相の異なるパルス列状の励起光を発生する複数のストロボ光源からなり、前記変調装置が、前記複数のストロボ光源からのパルス列状の励起光を合成する切替装置からなることとしてもよい。
上述したようにストロボ光源は、安定性を得るために高速化できないという問題があるが、パルスレーザ光源等と比較して安価であるという利点がある。本発明においては、複数のストロボ光源からのパルス列状の光を切替装置によって合成し、ストロボ光源の個数倍の高周波数のパルス列状の励起光を安定的に得ることができる。
Further, in the above invention, the excitation light source includes a plurality of strobe light sources that generate pulse train-like excitation light having different phases in the same period, and the modulation device includes the pulse train-like excitation light from the plurality of strobe light sources. It is good also as comprising the switching device which synthesize | combines.
As described above, the strobe light source has a problem that it cannot be increased in speed to obtain stability, but has an advantage that it is less expensive than a pulse laser light source or the like. In the present invention, pulse train light from a plurality of strobe light sources can be combined by a switching device, and high-frequency pulse train light that is several times the number of strobe light sources can be stably obtained.
上記発明においては、前記パルス光源装置が、パルス列状のレーザ光を出射し、前記パルス光源装置から出射されたレーザ光からスペックルノイズを除去するレーザスペックル除去装置が備えられていることが好ましい。
レーザ光によれば、ピークパワーが比較的大きく、高速かつ安定した励起光として供給することができる反面、レーザの干渉性によってスペックルノイズによる照明ムラが発生することがある。本発明によれば、レーザスペックル除去装置の作動により、スペックルノイズを除去できる。したがって、均一な照明を得ることができ、鮮明な蛍光画像を得ることができる。
In the above invention, it is preferable that the pulse light source device is provided with a laser speckle removing device that emits laser light in a pulse train and removes speckle noise from the laser light emitted from the pulse light source device. .
Although laser light has a relatively large peak power and can be supplied as high-speed and stable excitation light, illumination unevenness due to speckle noise may occur due to the coherence of the laser. According to the present invention, speckle noise can be removed by the operation of the laser speckle removing device. Therefore, uniform illumination can be obtained and a clear fluorescent image can be obtained.
本発明によれば、試料の各位置に断続的に照射されるパルス状の励起光の各々によって蛍光が発生するので、連続した励起光を照射する場合と比較して、試料の損傷を低く抑えながら明るい蛍光を得ることができる。したがって、観察範囲全域にわたって試料の損傷を抑えつつ明るい蛍光を得ることにより、明るい蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。 According to the present invention, fluorescence is generated by each pulsed excitation light that is intermittently applied to each position of the sample, so that the damage to the sample is kept low compared to the case where continuous excitation light is applied. However, bright fluorescence can be obtained. Therefore, by obtaining bright fluorescence while suppressing damage to the sample over the entire observation range, there is an effect that a bright fluorescence image can be acquired.
以下、本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置1について、図1および図2を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置1は、図1に示されるように、パルス列状の励起光Eを発生するパルス光源装置2と、該パルス光源装置2から発せられたパルス列状の励起光Eを試料Aに照射する対物レンズ3と、該対物レンズ3と前記パルス光源装置2との間に配置されたダイクロイックミラー4と、該ダイクロイックミラー4により分離された蛍光Fを撮像する撮像素子5とを備えている。
Hereinafter, a fluorescence observation apparatus 1 according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS. 1 and 2.
As shown in FIG. 1, the fluorescence observation apparatus 1 according to this embodiment includes a pulse
図中、符号6は、ダイクロイックミラー4によって分岐された蛍光Fに含まれる励起光E成分を除去するバリアフィルタ、符号7は、バリアフィルタ6を透過した蛍光Fを撮像素子5の撮像面に結像させる集光レンズ、符号8は、撮像素子5において発生した電気信号を処理して画像情報を形成する信号処理装置、符号9は信号処理装置8により形成された画像情報を表示するモニタである。
In the figure,
前記パルス光源装置2は、図1に示されるように、キセノンランプのような連続発光光源10と、該連続発光光源10からの光を略平行光に変換するコリメートレンズ11と、該コリメートレンズ11により変換された平行光をパルス列状の光に変換する変調装置12と、パルス列状の光を対物レンズ3に導くリレーレンズ13と、該リレーレンズ13によりリレーされた光を入射させて励起光Eのみを透過させる励起フィルタ14とを備えている。
As shown in FIG. 1, the pulse
前記変調装置12は、例えば、図2に示されるように、複数のスリット15を備える回転ディスク16と、該回転ディスク16を回転駆動するモータ17とを備えている。回転ディスク16は、前記コリメートレンズ11を通過した平行光を遮るように、光軸に略直交して配置され、回転ディスク16に入射した平行光の入射範囲内に配されるスリット15部分の光のみの通過を許容するようになっている。また、回転ディスク16は、対物レンズ3の焦点位置と共役な位置に配置されている。
For example, as shown in FIG. 2, the
回転ディスク16に設けられたスリット15は、共焦点ディスクにおけるスリットの間隔よりも十分に小さくすることが好ましい。また、スリット15のパターンも図2の形態に限られず、放射状にスリット15が形成されていてもよい。
It is preferable that the
ダイクロイックミラー4は、励起光Eを反射し、蛍光Fを透過するように、その波長特性を設定されている。ダイクロイックミラー4は、励起光Eの入射光軸に対して45°傾斜して配置されている。これにより、ダイクロイックミラー4は、励起光Eを反射することで、90°偏向させ、対物レンズ3に指向させるようになっている。
撮像素子5は、例えば、冷却CCD(Cooled Charge Coupled Device)または、CMOS(Complementary Metal
Oxide Semiconductor)イメージング装置である。
The wavelength characteristics of the
The
Oxide Semiconductor) imaging device.
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置1の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置1を用いて試料Aの蛍光観察を行うには、パルス光源装置2を構成する連続発光光源10を作動させるとともに、変調装置12を作動させる。変調装置12を作動させると、モータ17が回転ディスク16を回転させる。
The operation of the fluorescence observation apparatus 1 according to this embodiment configured as described above will be described below.
In order to perform fluorescence observation of the sample A using the fluorescence observation apparatus 1 according to the present embodiment, the continuous
連続発光光源10から発せられた連続光は、回転ディスク16上に照射されることにより、回転ディスク16に設けられたスリット15部分の光のみが回転ディスク16を通過させられて、リレーレンズ13によりリレーされ、励起フィルタ14を通過させられることで励起光Eとなってダイクロイックミラー4に入射される。ダイクロイックミラー4に入射された励起光Eは反射されることにより90°偏向されて対物レンズ3によって試料Aに結像される。
The continuous light emitted from the continuous
各瞬間において、試料A上には、回転ディスク16に設けられた複数本のスリット15の像が結像される。本実施形態においては、回転ディスク16が回転させられることにより、連続発光光源10からの光が通過するスリット15が逐次移動させられる。その結果、試料A上のスリット15の像も逐次移動していくことになる。
At each moment, an image of a plurality of
したがって、回転ディスク16が所定角度だけ回転させられることにより、試料A上の観察範囲全域にスリット15状の励起光Eが走査されるようにして照射される。
この場合において、試料A上の各位置について見れば、スリット15の像が形成されている状態では励起光Eが照射され、スリット15の像間に配されている状態では励起光Eの照射が停止される。その結果、所定時間にわたって見ると、試料A上の全ての位置において、励起光Eが照射されている時間と停止されている時間とが交互に複数回にわたって発生する。すなわち、試料A上の各位置において、励起光Eの強度がパルス列状に変動することになる。
Therefore, when the
In this case, when looking at each position on the sample A, the excitation light E is irradiated when the image of the
また、本実施形態に係る蛍光観察装置1においては、変調装置2が回転ディスク16およびモータ17によって構成されているので、回転ディスク16の回転速度を適宜選択することにより、簡易に、パルス列状の励起光Eの周波数を適宜調節することができる。
Further, in the fluorescence observation apparatus 1 according to the present embodiment, since the
励起光Eが試料Aに照射されると、試料A内に含有されている蛍光分子が励起され蛍光Fが発せられる。
ここで、蛍光分子の励起と蛍光発光機構について、図3を参照して説明する。
一般的に、蛍光分子は安定な基底準位レベル(E0)の状態に多数存在している。この状態の分子に対して、上準位のエネルギー状態(E1)との差に相当するエネルギー(E1−E0=hν1)の光を吸収すると、ある確率(F01)にて励起が起こり、上準位のエネルギー状態に遷移する。
ここで、h:プランク定数、ν1:E1−E0のエネルギー差に相当する振動数である。
When the sample A is irradiated with the excitation light E, the fluorescent molecules contained in the sample A are excited and the fluorescence F is emitted.
Here, the excitation of the fluorescent molecules and the fluorescence emission mechanism will be described with reference to FIG.
In general, a large number of fluorescent molecules exist in a stable ground level level (E 0 ). When a molecule of this state absorbs light (E 1 −E 0 = hν 1 ) corresponding to the difference from the upper energy state (E 1 ), it is excited with a certain probability (F 01 ). Occurs and transitions to the upper energy state.
Here, h is Planck's constant, and ν 1 is a frequency corresponding to an energy difference of E 1 −E 0 .
主に光励起方法としては、レーザ光やランプ光が用いられ、hν1にあったエネルギーの光を選択している。
上準位のエネルギー状態は、比較的寿命が短く、また不安定であり、別の安定なエネルギー状態に移行する。例えば、下準位のエネルギー状態(E2)へある確率γ1で移行し、その準位から光(hν2)を放出して、基底状態(E0)へ遷移する。このとき発生する光が蛍光である。
As a light excitation method, laser light or lamp light is mainly used, and light having energy suitable for hν 1 is selected.
The upper-level energy state has a relatively short lifetime and is unstable, and shifts to another stable energy state. For example, transition to the lower level energy state (E 2 ) with a certain probability γ 1 , light (hν 2 ) is emitted from the level, and transition to the ground state (E 0 ). The light generated at this time is fluorescence.
また、中にはhν2の光を放出せずに、別のエネルギー準位へ遷移したり、イオン化が起こり異なる分子状態になったり、また分子解離など発生し組成が変わることも考えられる。このような現象はある確率γ2で発生し、光を発しないため、長時間観察をしている場合、蛍光量が時間と共に減少していく場合がある。これは、基底状態に戻る分子数が減り、結果的に蛍光を発する分子が減少するためで、一般的に退色と言われる。
本説明に使ったモデルは3準位系モデルであるが、2準位又は4準位であっても、基本的なメカニズムは変わらない。
In addition, it is conceivable that the composition changes due to transition to another energy level, ionization, a different molecular state, or molecular dissociation without emitting hν 2 light. Such a phenomenon occurs at a certain probability γ 2 and does not emit light. Therefore, when observation is performed for a long time, the amount of fluorescence may decrease with time. This is because the number of molecules that return to the ground state decreases, resulting in a decrease in the number of molecules that fluoresce and is generally referred to as fading.
The model used in this description is a three-level system model, but the basic mechanism does not change even if it is two or four levels.
なお、蛍光量の多さは、蛍光分子に与える励起光の単位時間あたりのエネルギーやその時間変化と、蛍光分子の励起確率や上準位のエネルギーの寿命などに依存している。例えば、エネルギーの高い励起光を連続的に与え続けても強い蛍光が得られるとは限らず、上準位レベルの分子が飽和状態になったり、また退色現象が多数発生したりしてしまい、効率のよい蛍光発生のプロセスとは言えない。
長時間観察や細胞ダメージ回避のためには、できるだけ少ない励起エネルギーで、分子を効率的に励起し、また退色現象をできるだけ低減し、効率よい蛍光を得ることが非常に重要である。
Note that the amount of fluorescence depends on the energy per unit time of excitation light given to the fluorescent molecule and its change over time, the excitation probability of the fluorescent molecule, the lifetime of the upper level energy, and the like. For example, even if high energy excitation light is continuously applied, strong fluorescence is not always obtained, molecules at the upper level are saturated, and many fading phenomena occur, It is not an efficient fluorescence generation process.
For long-term observation and avoidance of cell damage, it is very important to efficiently excite molecules with as little excitation energy as possible and to reduce the fading phenomenon as much as possible to obtain efficient fluorescence.
試料Aにおいて発生した蛍光Fは、対物レンズ3によって集められ、ダイクロイックミラー4を通過させられることで励起光Eから分岐され、バリアフィルタ6を通過して集光レンズ7により撮像素子5に結像させられる。撮像素子5は、1コマの蛍光画像を形成するのに十分な情報を得るまでの所定時間にわたって試料Aからの蛍光Fを撮像し続けた後、各画素において取得した蛍光Fの強度に応じた画素ごとの電気信号を信号処理装置8に送る。そして、信号処理装置8においては、撮像素子5から送られてきた画素ごとの電気信号に基づいて蛍光画像が形成され、形成された蛍光画像がモニタ9に表示される。
The fluorescence F generated in the sample A is collected by the
本実施形態においては、撮像素子5が1コマの蛍光画像を形成するのに十分な情報を得るまでの所定時間の間に、試料A上の各位置に複数のパルス列状の励起光Eが照射される。
単一のパルスにより十分な蛍光量を得る従来のパルスレーザ蛍光顕微鏡と比較して、同じ蛍光量を得るための各パルス状の励起光Eのピークパワーを十分に低減することができる。また、連続的な励起光Eを各位置に連続照射する場合と比較すると、各パルス列状の励起光Eのピークパワーを大きくしても、パルス間に配される休止期間を設けることによって、その平均パワーを低減することができる。
In the present embodiment, a plurality of pulse trains of excitation light E are applied to each position on the sample A during a predetermined time until the
Compared with a conventional pulsed laser fluorescence microscope that obtains a sufficient amount of fluorescence with a single pulse, the peak power of each pulsed excitation light E for obtaining the same amount of fluorescence can be sufficiently reduced. Further, compared with the case where continuous excitation light E is continuously irradiated to each position, even if the peak power of each pulse train-like excitation light E is increased, by providing a pause period arranged between the pulses, Average power can be reduced.
その結果、ピークパワーを単一のパルスの場合よりも低減して、試料Aの瞬間的な損傷を防止することができるとともに、連続的な励起光Eを照射する場合よりも平均パワーを低減して、試料Aに加える総エネルギが過大となることによる試料Aの損傷防止を図ることができる。また、発明者の知見によれば、励起光Eを連続的に照射する場合と比較して、十分に低い平均パワーでも明るい蛍光Fを得ることができる。したがって、励起光Eのパワーを低減しながら明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。 As a result, the peak power can be reduced as compared with the case of a single pulse to prevent instantaneous damage to the sample A, and the average power can be reduced as compared with the case where the continuous excitation light E is irradiated. Therefore, it is possible to prevent damage to the sample A due to excessive total energy applied to the sample A. Further, according to the inventor's knowledge, bright fluorescence F can be obtained even with a sufficiently low average power as compared with the case where the excitation light E is continuously irradiated. Therefore, there is an advantage that a bright fluorescent image can be acquired while reducing the power of the excitation light E.
すなわち、パルス光源装置2を用いることにより、試料Aに加える平均パワーを低減して明るい蛍光画像を得ることができる。したがって、試料Aに与える損傷を低減して長期間にわたる観察が可能となる。また、超短パルスレーザ光を使用する多光子励起型蛍光観察装置とは異なり、励起光Eの分散を考慮する必要がないので、装置の構成を簡易にし、また、小型化を図ることができる。
That is, by using the pulse
また、撮像素子5が1コマの蛍光画像を形成するのに十分な情報を得るまでの所定時間の間に、試料A上の各位置から発生したパルス状の蛍光Fが撮像素子5の撮像面に複数回入射して撮像素子5に蓄積される。撮像素子5は、蓄積した蛍光を電気信号に変換して信号処理装置8に送るので、1個のパルス状の蛍光Fが入射するたびに電気信号に変換して信号処理装置8で積算処理する場合と比較すると、累積ノイズを低減することができるという利点がある。
Further, the pulsed fluorescence F generated from each position on the sample A during the predetermined time until the
なお、本実施形態に係る蛍光観察装置1においては、複数のスリット15を有する回転ディスク16を変調装置12の一例として説明したが、これに代えて、複数のピンホールを有する回転ディスク16を採用してもよい。また、光源として連続発光光源10を採用したが、これに代えて、パルス光源を採用してもよい。
In the fluorescence observation apparatus 1 according to the present embodiment, the
次に、本発明の第2の実施形態に係る蛍光観察装置20について、図4〜図6を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第1の実施形態に係る蛍光観察装置20と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略することにする。
Next, the
In the description of the present embodiment, portions having the same configuration as those of the
本実施形態に係る蛍光観察装置20は、図4に示されるように、パルス光源装置21、ダイクロイックミラー4、対物レンズ3、バリアフィルタ6、集光レンズ7、撮像素子5、信号処理装置8よびモニタ9を有する基本構成において、第1の実施形態に係る蛍光観察装置1と共通している。
本実施形態に係る蛍光観察装置20は、パルス光源装置21において第1の実施形態に係る蛍光観察装置1と相違している。
As shown in FIG. 4, the
The
本実施形態において、パルス光源装置21は、2つのストロボ光源22A,22B、例えば、キセノンフラッシュランプ等と、各ストロボ光源22A,22Bからの光を略平行光に変換するコリメートレンズ11と、略平行光に変換された2つの光を合成する切替装置(変調装置)23とを備えている。切替装置23は、回転ディスク24と、該回転ディスク24を回転させるモータ25とを備えている。符号26はモータ25の動力を回転ディスク24に伝達するベルトである。
In the present embodiment, the pulse
回転ディスク24は、図5に示されるように、光を略100%反射するミラー部分24aと、光を略100%透過する透過部分24bとを周方向に交互に並べて構成されている。
前記2つのストロボ光源22A,22Bは、図4に示されるように、相互に90°の角度をなして配置され、その光軸の交差位置に前記回転ディスク24が配置されている。これにより、第1のストロボ光源22Aから発せられた光は、回転ディスク24の透明部分24bが光軸上に配置されているときに、回転ディスク24を透過させられてリレーレンズ13に入射されるようになっている。また、第2のストロボ光源22Bから発せられた光は、回転ディスク24のミラー部分24aが光軸上に配置されているときに回転ディスク24によって反射され、90°偏向させられて第1のストロボ光源22Aからの光と同一の光軸上に入射させられるようになっている。
As shown in FIG. 5, the
As shown in FIG. 4, the two
各ストロボ光源22A,22Bは、図6(a),(b)に示されるように、同一の周波数のパルス列状の光を出射するようになっている。また、第1のストロボ光源22Aと第2のストロボ光源22Bとは、その周期が90°ずれている。これにより、切替装置23によって合成された後には、図6(c)に示されるように、各ストロボ光源22A,22Bの2倍の周波数のパルス列状の光が出射されるようになっている。
As shown in FIGS. 6A and 6B, each of the
本実施形態に係る蛍光観察装置20によれば、切替装置23によって、各ストロボ光源22A,22Bよりも高い周波数のパルス列状の励起光Eを試料Aに入射させることができる。したがって、比較的低速のストロボ光源22A,22Bを用いても、高い周波数のパルス状の励起光Eを試料Aに入射させ、明るい蛍光画像を取得することが可能となる。ストロボ光源22A,22Bから出射されるパルス列状の光の周波数は低いままでよいので、ストロボ光源22A,22Bを安定性の高い条件で使用でき、安定した蛍光観察を行うことができる。
According to the
なお、本実施形態に係る蛍光観察装置20においては、2つのストロボ光源22A,22Bを用いたが、これに限定されるものではなく、3以上の複数のストロボ光源を用いるとともに、2以上の切替装置23をカスケード的に接続して、より高い周波数のパルス状の励起光Eを試料Aに照射することにしてもよい。
In the
次に、本発明の第3の実施形態に係る蛍光観察装置30について、図7を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明においても、第1の実施形態に係る蛍光観察装置30と構成を同一とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
Next, a
Also in the description of the present embodiment, the same reference numerals are given to portions having the same configuration as the
本実施形態に係る蛍光観察装置30も、パルス光源装置31において第1の実施形態に係る蛍光観察装置1と相違している。
本実施形態においては、パルス光源装置31は、連続発光レーザ光Lを発生する連続発光レーザ光源32と、発生されたレーザ光Lを断続させてパルス状に整形する高速光変調素子(変調装置)33とを備えるものとしてもよい。高速光変調素子33としては、音響光学素子あるいは電気光学素子を採用することができる。このようにすることで、より安定したピークパワーとパルス幅およびパルス間隔を有するパルスレーザ光L1を発生させることができる。したがって、試料Aの各位置を均一なパルスレーザ光L1により照射して、精度の高い蛍光画像を得ることができる。また、安価な連続発光レーザ32で高い繰り返し周波数のパルス状の光を照射することができる。
The
In the present embodiment, the pulse
また、図8に示されるように、複数の波長の連続発光レーザ光源32A,32Bと高速光変調素子33A,33Bとの組合せからなるパルス光源装置31を用いてもよい。この場合、連続発光レーザ光源32A,32Bから出射されたパルスレーザ光をミラー34およびダイクロイックミラー35によって合成し、同時に試料Aに照射させるようにすることができる。また、図9に示されるように、高速光変調素子33を複数の連続発光レーザ光源32A,32Bに対して共用するようにしてもよい。
Further, as shown in FIG. 8, a pulse
さらに、図10に示されるように、2つの連続発光レーザ光源32A,32Bをダイクロイックミラー35によって接続する場合に、一方の連続発光レーザ光源32Bから出射されたレーザ光L′のみを1/2波長板36に通過させることにより、他方の連続発光レーザ光源32Aから出射されたレーザ光Lに対して、高速光変調素子33に入射する際のレーザ光L′の偏光面を異ならせることとしてもよい。このようにすることで、単一の高速光変調素子33により、2つの連続発光レーザ光源32A,32Bから出射された2種類のレーザ光L,L′を交互に強弱をつけて変調することができる。
Further, as shown in FIG. 10, when two continuous light emitting
また、図11に示されるように、高速光変調素子33により変調されたパルスレーザ光L1をレーザスペックル除去手段37に通過させることにしてもよい。レーザスペックル除去手段37としては、例えば、1本1本の長さの違い光ファイバを複数本束ねたマルチレングスファイバが挙げられる。マルチレングスファイバにレーザ光Lを入射させると、レーザ光Lの干渉性を著しく低下させることができる。通常、レーザ光Lで面照射するとレーザ光Lの干渉でレーザ照射面が粒々の明暗パターンとなり、著しい照明ムラ(スペックルノイズ)が発生するが、マルチレングスファイバを通過させることによって、スペックルノイズをほとんどなくすことができ均一な照明を得ることができる。
Further, as shown in FIG. 11, the pulsed laser light L 1 modulated by the high-speed
また、レーザスペックル除去手段37としては、マルチレングスファイバに代えて、拡散板を回転させ、得られた画像を積算することが挙げられる。ランダムなスペックルパターン照明による粒々の明暗画像が、積算により均一な画像となる。
Further, as the laser
また、試料の表面の限られた領域のみに照明を行う方法として全反射照明法が知られているが、本発明においては、この全反射照明法の光源として上記いずれかのパルス光源装置を採用することにしてもよい。 In addition, the total reflection illumination method is known as a method for illuminating only a limited area of the surface of the sample. In the present invention, any one of the pulse light source devices described above is employed as a light source for the total reflection illumination method. You may decide to do it.
また、上記各実施形態においては、対物レンズ3側から励起光を照射する落射照明方式の蛍光観察装置について説明したが、これに代えて、図12に示されるように、透明部材40上に搭載した試料Aに対し、対物レンズ3とは反対側から励起光Eを照射し、試料Aから励起光Eとは反対方向に出射した蛍光Fを観察する透過蛍光方式に本発明を適用してもよい。図12において、符号41はパルス光源、符号42はミラー、符号43は試料Aに励起光Eを導くコンデンサレンズである。
In each of the above-described embodiments, the epi-illumination type fluorescence observation apparatus that irradiates the excitation light from the
A 試料
E 励起光
F 蛍光
L,L1 レーザ光(励起光)
1 蛍光観察装置
2,31 パルス光源装置
3 対物レンズ
4 ダイクロイックミラー
5 撮像素子
10 光源
12,33 変調装置
15 スリット
16 ディスク(回転ディスク)
17 モータ
22A,22B ストロボ光源
23 切替装置
32,32A,32B 連続発光光源
33A,33B 高速変調素子(変調装置)
A Sample E Excitation light F Fluorescence L, L1 Laser light (Excitation light)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1
17
Claims (6)
試料において発生した蛍光を撮像する撮像素子とを備え、
前記パルス光源装置が、前記撮像素子の1コマの撮像時間内に、該撮像素子の各画素に対応する試料の各位置に複数回のパルス状の励起光を照射する蛍光観察装置。 A pulse light source device for generating pulsed excitation light and irradiating the sample; and
An imaging device for imaging fluorescence generated in the sample,
A fluorescence observation apparatus in which the pulsed light source device irradiates each position of a sample corresponding to each pixel of the image sensor a plurality of times of pulsed excitation light within an imaging time of one frame of the image sensor.
前記変調装置が、前記連続発光光源からの連続光を変調してパルス列状の光を形成する請求項2に記載の蛍光観察装置。 The light source comprises a continuous light source;
The fluorescence observation apparatus according to claim 2, wherein the modulation device modulates continuous light from the continuous light emission light source to form pulse train light.
前記変調装置が、前記複数のストロボ光源からのパルス列状の光を合成する切替装置からなる請求項2に記載の蛍光観察装置。 The light source comprises a plurality of strobe light sources that generate light in a pulse train having different phases at the same period,
The fluorescence observation apparatus according to claim 2, wherein the modulation device includes a switching device that synthesizes pulse train light from the plurality of strobe light sources.
前記パルス光源装置から出射されたレーザ光からスペックルノイズを除去するレーザスペックル除去装置が備えられている請求項1から請求項4のいずれかに記載の蛍光観察装置。 The pulse light source device emits a pulse train of laser light,
The fluorescence observation device according to any one of claims 1 to 4, further comprising a laser speckle removal device that removes speckle noise from the laser light emitted from the pulse light source device.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005040950A JP2006227301A (en) | 2005-02-17 | 2005-02-17 | Fluorescence observation device |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005040950A JP2006227301A (en) | 2005-02-17 | 2005-02-17 | Fluorescence observation device |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006227301A true JP2006227301A (en) | 2006-08-31 |
Family
ID=36988723
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005040950A Withdrawn JP2006227301A (en) | 2005-02-17 | 2005-02-17 | Fluorescence observation device |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2006227301A (en) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011158413A (en) * | 2010-02-03 | 2011-08-18 | Olympus Corp | Laser microscope device |
CN103105669A (en) * | 2011-11-11 | 2013-05-15 | 徕卡显微***复合显微镜有限公司 | Method and apparatus for illumination and detection in RESOLFT microscopy |
JP2014533696A (en) * | 2011-11-21 | 2014-12-15 | ケーシーアイ ライセンシング インコーポレイテッド | System, device, and method for identifying portions of wound filler remaining in a tissue site |
JP2016509206A (en) * | 2012-12-21 | 2016-03-24 | マイクロニクス, インコーポレイテッド | Portable fluorescence detection system and microassay cartridge |
KR20160036959A (en) * | 2014-09-26 | 2016-04-05 | 한국과학기술원 | Image generating apparatus and image generating method |
US10065186B2 (en) | 2012-12-21 | 2018-09-04 | Micronics, Inc. | Fluidic circuits and related manufacturing methods |
US10087440B2 (en) | 2013-05-07 | 2018-10-02 | Micronics, Inc. | Device for preparation and analysis of nucleic acids |
US10190153B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-01-29 | Micronics, Inc. | Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions |
US10386377B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-08-20 | Micronics, Inc. | Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching |
US10518262B2 (en) | 2012-12-21 | 2019-12-31 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Low elasticity films for microfluidic use |
-
2005
- 2005-02-17 JP JP2005040950A patent/JP2006227301A/en not_active Withdrawn
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011158413A (en) * | 2010-02-03 | 2011-08-18 | Olympus Corp | Laser microscope device |
CN103105669A (en) * | 2011-11-11 | 2013-05-15 | 徕卡显微***复合显微镜有限公司 | Method and apparatus for illumination and detection in RESOLFT microscopy |
US9952155B2 (en) | 2011-11-11 | 2018-04-24 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Method and apparatus for illumination and detection in RESOLFT microscopy |
JP2014533696A (en) * | 2011-11-21 | 2014-12-15 | ケーシーアイ ライセンシング インコーポレイテッド | System, device, and method for identifying portions of wound filler remaining in a tissue site |
US10506928B2 (en) | 2011-11-21 | 2019-12-17 | Kci Licensing, Inc. | Systems, devices, and methods for identifying portions of a wound filler left at a tissue site |
US10436713B2 (en) | 2012-12-21 | 2019-10-08 | Micronics, Inc. | Portable fluorescence detection system and microassay cartridge |
JP2016509206A (en) * | 2012-12-21 | 2016-03-24 | マイクロニクス, インコーポレイテッド | Portable fluorescence detection system and microassay cartridge |
US11181105B2 (en) | 2012-12-21 | 2021-11-23 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Low elasticity films for microfluidic use |
US10518262B2 (en) | 2012-12-21 | 2019-12-31 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Low elasticity films for microfluidic use |
US10065186B2 (en) | 2012-12-21 | 2018-09-04 | Micronics, Inc. | Fluidic circuits and related manufacturing methods |
US10087440B2 (en) | 2013-05-07 | 2018-10-02 | Micronics, Inc. | Device for preparation and analysis of nucleic acids |
US10386377B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-08-20 | Micronics, Inc. | Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching |
US10190153B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-01-29 | Micronics, Inc. | Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions |
US11016108B2 (en) | 2013-05-07 | 2021-05-25 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching |
KR101641777B1 (en) * | 2014-09-26 | 2016-07-21 | 한국과학기술원 | Image generating apparatus and image generating method |
KR20160036959A (en) * | 2014-09-26 | 2016-04-05 | 한국과학기술원 | Image generating apparatus and image generating method |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006227301A (en) | Fluorescence observation device | |
JP5485352B2 (en) | Luminescence microscopy with increased resolution | |
JP6039760B2 (en) | Apparatus and method for imaging a sample structure spatially with high resolution | |
JP5687201B2 (en) | Combined microscopy | |
JP5776992B2 (en) | STED microscopy, STED fluorescence correlation spectroscopy, and STED fluorescence microscope for pulse excitation, continuous deexcitation, and gate recording of spontaneous emission fluorescence | |
US7394063B2 (en) | Microscope for investigating the lifetime of excited states in a sample | |
JP3917731B2 (en) | Laser scanning microscope | |
JP5554965B2 (en) | Laser microscope using phase modulation spatial light modulator | |
US8773760B2 (en) | Multi-point scan architecture | |
JP5265070B2 (en) | Light source device for illumination in scanning microscope inspection, and scanning microscope | |
JP2003028795A (en) | Test sample examining method and scanning electron microscope | |
JP2007233370A (en) | Method and microscope for high spatial resolution examination of sample | |
JP2010102332A (en) | Photoactivation localization microscope and photoactivation localization observation method | |
JP4545337B2 (en) | microscope | |
JP5135066B2 (en) | Optical microscope and observation method | |
JP2005055895A (en) | Raster microscope | |
JP6393451B2 (en) | Method and apparatus for illumination and detection in RESOLFT microscopy | |
CN109073873B (en) | Image acquisition device and image acquisition method | |
JP2017102266A (en) | Scanning type microscope | |
WO2017090075A1 (en) | Optical measurement apparatus and optical measurement method | |
JP2008026471A (en) | Sample observation method and microscope | |
WO2017082357A1 (en) | Super-resolution microscope | |
JP4869749B2 (en) | Scanning microscope | |
JP2011141311A (en) | Multi-photon microscope | |
JP2012208442A (en) | Scanning type microscope and scanning type microscope system |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080513 |