JP2006212019A - 植物を用いたユビキノン−10の製造方法 - Google Patents
植物を用いたユビキノン−10の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 Gluconobacter suboxydans由来のデカプレニル2リン酸合成酵素をミトコンドリア標的化配列と作動可能に連結した発現カセットで形質転換した植物を作製し、植物を用いたユビキノンー10の製造方法。および、植物由来のユビキノン10を含む食品および化粧品。
【選択図】なし
Description
1.ポリプレニル2リン酸合成酵素を発現する発現カセットで形質転換された植物。
2.前記ポリプレニル2リン酸合成酵素が、デカプレニル2リン酸合成酵素である、項目1に記載の植物。
3.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、細菌由来の酵素である、項目1に記載の植物。
4.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、Gluconobacter suboxydans由来の酵素である、項目3に記載の植物。
5.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目2に記載の植物。
6.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸によってコードされる、項目2に記載の植物。
7.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、項目2に記載の植物。
8.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号6に示すアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列を有する、項目2に記載の植物。
9.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号6に示すアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、項目2に記載の植物。
10.前記デカプレニル2リン酸合成酵素をコードする核酸が、ミトコンドリア標的化配列をコードする核酸と作動可能に連結されている、項目2に記載の植物。
11.前記ミトコンドリア標的化配列をコードする核酸が、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)のフラグメントをコードする核酸、RPS14タンパク質(配列番号4)のフラグメントをコードする核酸、RPS11タンパク質のフラグメントをコードする核酸、ATPアーゼβサブユニットタンパク質(配列番号10)のフラグメントをコードする核酸、およびATPアーゼγサブユニットタンパク質(配列番号12)のフラグメントをコードする核酸からなる群から選択される、項目10に記載の植物。
12.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、項目10に記載の植物。
13.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目10に記載の植物。
14.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはイネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、項目10に記載の植物。
15.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、項目10に記載の植物。
16.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはイネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位内にあるフラグメントのアミノ酸配列を有する、項目10に記載の植物。
17.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、項目10に記載の植物。
18.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、項目10に記載の植物。
19.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目10に記載の植物。
20.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいは、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、項目10に記載の植物。
21.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、項目10に記載の植物。
22.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいは、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位内にあるフラグメントのアミノ酸配列を有する、項目10に記載の植物。
23.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、項目10に記載の植物。
24.前記ポリプレニル2リン酸合成酵素が、ゴルジ体標的化配列と作動可能に連結されている、項目2に記載の植物。
25.前記ゴルジ体標的化配列をコードする核酸が、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)のフラグメントをコードする核酸である、項目24に記載の植物。
26.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、項目24に記載の植物。
27.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目24に記載の植物。
28.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、項目24に記載の植物。
29.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%同一の配列を有する核酸によってコードされる、項目24に記載の植物。
30.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、項目24に記載の植物。
31.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列と80%同一のアミノ酸配列を有する、項目24に記載の植物。
32.前記ポリプレニル2リン酸合成酵素遺伝子が、種子特異的プロモーターと作動可能に連結されている、項目1に記載の植物。
33.前記植物が、植物細胞、植物培養細胞、植物種子、再生植物体、植物カルス、植物組織、葉、茎、根、花、芽生え、藻類、苔類からなる群から選択される、項目1に記載の植物。
34.単子葉植物である、項目1に記載の植物。
35.双子葉植物である、項目1に記載の植物。
36.項目1、32、34、または35のいずれか一項に記載の、植物の種子。
37.前記双子葉植物が、イネ、トウモロコシ、オート麦、コムギ、オオムギ、ソバ、ジュズダマ、カラスムギ、インドヒエ、バナナ、およびサトウキビからなる群から選択される、項目35に記載の植物。
38.前記単子葉植物が、ダイズ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、アーモンド、ピスタシオナッツ、ピーナッツ、ヘーゼルナッツ、ウォールナッツ、カシューナッツ、およびゴマからなる群から選択される、項目36に記載の植物。
39.ポリプレニル2リン酸合成酵素を植物で発現するための発現カセット。
40.前記ポリプレニル2リン酸合成酵素が、デカプレニル2リン酸合成酵素である、項目39に記載の発現カセット。
41.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、細菌由来の酵素である、項目39に記載の発現カセット。
42.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、Gluconobactersuboxydans由来の酵素である、項目41に記載の発現カセット。
43.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目40に記載の発現カセット。
44.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいは配列番号5に示す核酸配列のフラグメントによってコードされる、項目40に記載の発現カセット。
45.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸配列と80%り高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、項目40に記載の発現カセット。
46.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号6に示すアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいは配列番号6に示す配列内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、項目40に記載の発現カセット。
47.前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号6に示すアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、項目40に記載の発現カセット。
48.前記デカプレニル2リン酸合成酵素をコードする核酸が、ミトコンドリア標的化配列をコードする核酸と作動可能に連結されている、項目40に記載の発現カセット。
49.前記ミトコンドリア標的化配列をコードする核酸が、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)のフラグメントをコードする核酸、RPS14タンパク質(配列番号4)のフラグメントをコードする核酸、RPS11タンパク質、ATPアーゼβサブユニットタンパク質、およびATPアーゼγサブユニットタンパク質、からなる群から選択される、項目48に記載の発現カセット。
50.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、項目48に記載の発現カセット。
51.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目48に記載の発現カセット。
52.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはイネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、項目48に記載の発現カセット。
53.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、項目48に記載の発現カセット。
54.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはイネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、項目48に記載の発現カセット。
55.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、項目48に記載の発現カセット。
56.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、項目48に記載の発現カセット。
57.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目48に記載の発現カセット。
58.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはイネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、項目48に記載の発現カセット。
59.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、項目48に記載の発現カセット。
60.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはイネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、項目48に記載の発現カセット。
61.前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、項目48に記載の発現カセット。
62.前記ポリプレニル2リン酸合成酵素が、ゴルジ体標的化配列と作動可能に連結されている、項目39に記載の発現カセット。
63.前記ゴルジ体標的化配列をコードする核酸が、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)のフラグメントをコードする核酸である、項目62に記載の発現カセット。
64.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、項目62に記載の発現カセット。
65.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目62に記載の発現カセット。
66.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、項目62に記載の発現カセット。
67.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%同一の配列を有する核酸によってコードされる、項目62に記載の発現カセット。
68.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、項目62に記載の発現カセット。
69.前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列と80%同一のアミノ酸配列を有する、項目62に記載の発現カセット。
70.前記ポリプレニル2リン酸合成酵素遺伝子が、種子特異的プロモーターと作動可能に連結されている、項目39に記載の発現カセット。
71.項目70に記載の発現カセットを含む植物。
72.項目71に記載の植物の種子。
73.植物を用いたユビキノン−10の製造方法であって、該方法は、以下:
(1)項目1に記載される植物を得る工程;および
(2)該植物を培養する工程;
を、包含する方法。
74.植物を用いたユビキノン−10の製造方法であって、該方法は、以下:
(1)項目37に記載の発現カセットを植物に導入する工程;
(2)該発現カセットを導入した植物を培養する工程;
を、包含する方法。
75.項目1に記載の植物から得られた、ユビキノン−10を含む植物組織。
76.項目1に記載の植物から得られた、ユビキノン−10を含む植物細胞。
77.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、食品。
78.さらに、項目1に記載の植物由来の成分を含む、項目77に記載の食品。
79.前記項目1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、項目78に記載の食品。
80.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、組成物。
81.さらに、項目1に記載の植物由来の成分を含む、項目80に記載の組成物。
82.前記項目1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、項目81に記載の組成物。
83.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、食事用補添物。
84.さらに、項目1に記載の植物由来の成分を含む、項目83に記載の食事用補添物。
85.前記項目1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、項目84に記載の食事用補添物。
86.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、化粧品。
87.さらに、項目1に記載の植物由来の成分を含む、項目86に記載の化粧品。
88.前記項目1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、項目87に記載の化粧品。
89.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、飲料。
90.さらに、項目1に記載の植物由来の成分を含む、項目89に記載の飲料。
91.前記項目1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、項目90に記載の飲料。
92.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、葉。
93.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、胚。
94.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、果実。
95.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、茎。
96.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、根。
97.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、花。
98.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、種子。
99.項目1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、米ぬか。
100.ユビキノン−10を含むイネ細胞または組織。
101.種子である、項目100に記載の細胞または組織。
102.玄米である、項目100に記載の細胞または組織。
Tm(℃)=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)−600/N−0.72(%ホルムアミド)
ここで、Nは、形成される二重鎖の長さであり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、%G+Cは、ハイブリッド中での(グアニン+シトシン)塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、1%の不一致毎に約1℃下げられる。
Tm=A−T塩基対あたり2℃ + G−C塩基対あたり4℃
*6×塩クエン酸ナトリウム(SSC)中でのナトリウムイオン濃度は、1Mである。Suggsら,Developmental Biology Using Purified Genes 683(BrownおよびFox編,1981)を参照のこと。
本明細書において、用語「形質転換」と「遺伝子導入」は互換可能に使用される。「形質転換」とは、植物細胞または植物組織に、遺伝子を含む外来の核酸を導入することによって、植物細胞または植物組織の遺伝子型に変化を生じることを意味する。
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
本発明のユビキノン−10は、食事用補添物(ダイエット食品)として用いることができる。食事補添物としてのユビキノン−10は、抗酸化物質、皮膚老化、免疫不全、心疾患、歯周病、慢性疲労症候群、退行性脳、神経運動機能障害、糖尿病、脳卒中、動脈硬化、ガン、高血圧、低血圧、脳硬塞、アレルギー疾患などに対しての効果を有することが予想される。また、心臓の能力を高める作用としての、うっ血性心不全の改善、動悸・息切れ、足や顔のむくみ、冷え性などに対する効果も予測される。
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、疾患または障害(例えば、心臓疾患)の処置および/または予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型(例えば、滅菌キャリア)と組み合せた、本発明の組成物を意味する。
本発明のユビキノン−10は、種々の疾患・状態の、予防、処置および予後において使用することが可能である。
形質転換を行うためには、一般に、植物に対して直接的に遺伝子導入を行う方法(直接的遺伝子導入法)、または植物に対して間接的に遺伝子導入を行う方法(間接的遺伝子導入法)が行われる。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
配列番号5の核酸配列を有するddsA遺伝子を、ミトコンドリア標的化配列、またはゴルジ体標的化配列と連結したプラスミドを構築した。ミトコンドリア標的化配列としては、配列番号4のRPS14由来のミトコンドリア標的化配列であるS14(Kuboら、Plant Science 164(2003)1047−1055;配列番号4のアミノ酸残基1位〜48位に対応)を用いた。ゴルジ体標的化配列としては、配列番号8のタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnT1)のN末端にあるゴルジ体標的化シグナルであるCTS(Esslら、FEBS letters、453(1999)169〜173;配列番号8の1〜77)を用いた。これら標的化配列を、Gluconobacter suboxydans由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子(ddsA)(Okadaら(Eur.J.Biochem.255、52−59(1998)))と作動可能に連結し、構成的プロモーターであるCaMV35Sプロモーターと、NOSターミネーターとの間に連結し、pUS14ddsAプラスミドおよびpUCTddsAプラスミドを、それぞれ構築した。各プラスミドのHindIII/EcoRIフラグメントを、バイナリーベクターであるpCAMBIA1301のマルチプルクローニング部位に連結した。構築した各種プラスミドの模式図を図1に示した。
(実施例2:ddsA遺伝子の発現の確認)
実施例1において作製した種々のプラスミドを用いて、イネを形質転換した。具体的には、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)EHA105株をエレクトロポーレーションによって、形質転換し、そのアグロバクテリウムを、WO01/06844に記載の形質転換方法に従って用い、植物を形質転換した。形質転換したイネを、ハイグロマイシン(50mg/L)を含む培地にて選抜した。ddsA遺伝子が植物細胞に導入されたことは、以下に示すPCR増幅実験またはサザンハイブリダイゼーションによって確認した(データ示さず)。
(実施例3:抗G.saboxydans DDSA抗体の調製)
ddsA遺伝子のコード領域全体を、PCRで増幅し、pGEX4T−3ベクター(Amersham Pharmacia)に連結し、E.coli JM109を形質転換した。GST/DDSA融合タンパク質の発現を、1mM IPTGの添加によって誘導し、そしてAsanoら(Plant Cell (2002)14、619−628)の方法に従って、精製した。精製した融合タンパク質を、6回、2週間の間隔でウサギに注射した。その結果、ウサギ血清中に抗G.saboxydans DDSA抗体が確認された。
(実施例4:DDSAタンパク質発現の確認)
組換え植物の葉に、葉の重量の8倍容量の抽出緩衝液(50mM Tris−HCl、pH6.8、2% SDS、6% 2−メルカプトエタノール、10% グリセロール)を添加して、微細粉末に砕いた。懸濁液を12,000rpmで5分間4℃で遠心し、そして上清を回収した。各形質転換体由来の10μgの総タンパク質を12.5%ポリアクリルアミドゲルで分離して、ImmobillonPVDFメンブレン(Millopore社)にトランスファーした。
(実施例5:ユビキノンの抽出および測定)
ユビキノンを、Okadaら(前出)の方法を若干修正した方法に従って抽出した。乳鉢でイネの葉を液体窒素を加えながら砕き、1.0gを15ml容量のチューブに量り取った。3% H2SO4 2mlを添加して、数秒間ボルテックスミキサーで攪拌した後、キャップを外して、アルミ箔で蓋をした。オートクレーブ120℃、30分後を行った。14% NaOHを4ml添加した。次に、オートクレーブ120℃、15分後を行った。すぐに氷水中で冷却した。ヘキサン:イソプロパノール(5:1)を3ml添加し、ボルテックスミキサーで、1分間攪拌した。2000rpm、室温で2分間遠心した。上清1.5mlを2mlチューブに分取した。加熱しながら、真空乾燥を10分間行った。乾燥物を、20μlのクロロホルム:メタノール(2:1)に懸濁して、TLCプレートにスポットした。ユビキノン−10の標準(1mg/ml)5μlもまた、別のプレートにスポットした。
(実施例6:イネ玄米からのユビキノン−10の抽出および測定)
実施例2において作製したイネの後代を調製し、その後代から、玄米を得た。
配列番号2:イネRPS10のアミノ酸配列。1位〜56位のアミノ酸配列はミトコンドリア標的化配列である。
配列番号3:イネRPS14遺伝子の核酸配列(cDNA配列)。
配列番号4:イネRPS14のアミノ酸配列。1位〜48位のアミノ酸配列はミトコンドリア標的化配列である。
配列番号5:Gluconobacter suboxydans ddsA遺伝子の核酸配列(cDNA配列)。
配列番号6:Gluconobacter suboxydans由来のデカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列
配列番号7:タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質をコードする核酸配列(cDNA配列)。
配列番号8:タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質のアミノ酸配列。1位〜77位のアミノ酸配列はゴルジ体標的化配列である。
配列番号9:イネATPアーゼβサブユニットタンパク質をコードする核酸配列(cDNA配列)。
配列番号10:イネATPアーゼβサブユニットタンパク質のアミノ酸配列。1位〜85位のアミノ酸配列はミトコンドリア標的化配列である。
配列番号11:アラビドプシスATPアーゼγサブユニットタンパク質をコードする核酸配列(cDNA配列)。
配列番号12:アラビドプシスATPアーゼγサブユニットタンパク質のアミノ酸配列。1位〜42位のアミノ酸配列はミトコンドリア標的化配列である。
Claims (102)
- ポリプレニル2リン酸合成酵素を発現する発現カセットで形質転換された植物。
- 前記ポリプレニル2リン酸合成酵素が、デカプレニル2リン酸合成酵素である、請求項1に記載の植物。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、細菌由来の酵素である、請求項1に記載の植物。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、Gluconobacter suboxydans由来の酵素である、請求項3に記載の植物。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項2に記載の植物。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸によってコードされる、請求項2に記載の植物。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項2に記載の植物。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号6に示すアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列を有する、請求項2に記載の植物。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号6に示すアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項2に記載の植物。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素をコードする核酸が、ミトコンドリア標的化配列をコードする核酸と作動可能に連結されている、請求項2に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列をコードする核酸が、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)のフラグメントをコードする核酸、RPS14タンパク質(配列番号4)のフラグメントをコードする核酸、RPS11タンパク質のフラグメントをコードする核酸、ATPアーゼβサブユニットタンパク質(配列番号10)のフラグメントをコードする核酸、およびATPアーゼγサブユニットタンパク質(配列番号12)のフラグメントをコードする核酸からなる群から選択される、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはイネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはイネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位内にあるフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいは、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいは、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位内にあるフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項10に記載の植物。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項10に記載の植物。
- 前記ポリプレニル2リン酸合成酵素が、ゴルジ体標的化配列と作動可能に連結されている、請求項2に記載の植物。
- 前記ゴルジ体標的化配列をコードする核酸が、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)のフラグメントをコードする核酸である、請求項24に記載の植物。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、請求項24に記載の植物。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項24に記載の植物。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、請求項24に記載の植物。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%同一の配列を有する核酸によってコードされる、請求項24に記載の植物。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項24に記載の植物。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列と80%同一のアミノ酸配列を有する、請求項24に記載の植物。
- 前記ポリプレニル2リン酸合成酵素遺伝子が、種子特異的プロモーターと作動可能に連結されている、請求項1に記載の植物。
- 前記植物が、植物細胞、植物培養細胞、植物種子、再生植物体、植物カルス、植物組織、葉、茎、根、花、芽生え、藻類、苔類からなる群から選択される、請求項1に記載の植物。
- 単子葉植物である、請求項1に記載の植物。
- 双子葉植物である、請求項1に記載の植物。
- 請求項1、32、34、または35のいずれか一項に記載の、植物の種子。
- 前記双子葉植物が、イネ、トウモロコシ、オート麦、コムギ、オオムギ、ソバ、ジュズダマ、カラスムギ、インドヒエ、バナナ、およびサトウキビからなる群から選択される、請求項35に記載の植物。
- 前記単子葉植物が、ダイズ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、アーモンド、ピスタシオナッツ、ピーナッツ、ヘーゼルナッツ、ウォールナッツ、カシューナッツ、およびゴマからなる群から選択される、請求項36に記載の植物。
- ポリプレニル2リン酸合成酵素を植物で発現するための発現カセット。
- 前記ポリプレニル2リン酸合成酵素が、デカプレニル2リン酸合成酵素である、請求項39に記載の発現カセット。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、細菌由来の酵素である、請求項39に記載の発現カセット。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、Gluconobactersuboxydans由来の酵素である、請求項41に記載の発現カセット。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項40に記載の発現カセット。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいは配列番号5に示す核酸配列のフラグメントによってコードされる、請求項40に記載の発現カセット。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号5に示す核酸配列と80%り高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項40に記載の発現カセット。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号6に示すアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいは配列番号6に示す配列内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項40に記載の発現カセット。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素は、配列番号6に示すアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項40に記載の発現カセット。
- 前記デカプレニル2リン酸合成酵素をコードする核酸が、ミトコンドリア標的化配列をコードする核酸と作動可能に連結されている、請求項40に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列をコードする核酸が、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)のフラグメントをコードする核酸、RPS14タンパク質(配列番号4)のフラグメントをコードする核酸、RPS11タンパク質、ATPアーゼβサブユニットタンパク質、およびATPアーゼγサブユニットタンパク質、からなる群から選択される、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはイネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはイネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS10タンパク質(配列番号2)の1位〜56位のアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはイネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%より高い配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはイネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ミトコンドリア標的化配列は、イネのRPS14タンパク質(配列番号4)の1位〜48位のアミノ酸配列と80%より高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項48に記載の発現カセット。
- 前記ポリプレニル2リン酸合成酵素が、ゴルジ体標的化配列と作動可能に連結されている、請求項39に記載の発現カセット。
- 前記ゴルジ体標的化配列をコードする核酸が、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)のフラグメントをコードする核酸である、請求項62に記載の発現カセット。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列からなるフラグメントである、請求項62に記載の発現カセット。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項62に記載の発現カセット。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有する核酸、あるいはタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列のフラグメントによってコードされる、請求項62に記載の発現カセット。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列をコードする核酸配列と80%同一の配列を有する核酸によってコードされる、請求項62に記載の発現カセット。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列に1または数個の欠失、付加、または置換を有するアミノ酸配列、あるいはタバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位内のフラグメントのアミノ酸配列を有する、請求項62に記載の発現カセット。
- 前記ゴルジ体標的化配列は、タバコのN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIタンパク質(配列番号8)の1位〜77位のアミノ酸配列と80%同一のアミノ酸配列を有する、請求項62に記載の発現カセット。
- 前記ポリプレニル2リン酸合成酵素遺伝子が、種子特異的プロモーターと作動可能に連結されている、請求項39に記載の発現カセット。
- 請求項70に記載の発現カセットを含む植物。
- 請求項71に記載の植物の種子。
- 植物を用いたユビキノン−10の製造方法であって、該方法は、以下:
(1)請求項1に記載される植物を得る工程;および
(2)該植物を培養する工程;
を、包含する方法。 - 植物を用いたユビキノン−10の製造方法であって、該方法は、以下:
(1)請求項37に記載の発現カセットを植物に導入する工程;
(2)該発現カセットを導入した植物を培養する工程;
を、包含する方法。 - 請求項1に記載の植物から得られた、ユビキノン−10を含む植物組織。
- 請求項1に記載の植物から得られた、ユビキノン−10を含む植物細胞。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、食品。
- さらに、請求項1に記載の植物由来の成分を含む、請求項77に記載の食品。
- 前記請求項1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、請求項78に記載の食品。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、組成物。
- さらに、請求項1に記載の植物由来の成分を含む、請求項80に記載の組成物。
- 前記請求項1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、請求項81に記載の組成物。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、食事用補添物。
- さらに、請求項1に記載の植物由来の成分を含む、請求項83に記載の食事用補添物。
- 前記請求項1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、請求項84に記載の食事用補添物。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、化粧品。
- さらに、請求項1に記載の植物由来の成分を含む、請求項86に記載の化粧品。
- 前記請求項1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、請求項87に記載の化粧品。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、飲料。
- さらに、請求項1に記載の植物由来の成分を含む、請求項89に記載の飲料。
- 前記請求項1に記載の植物由来の成分が、タンパク質である、請求項90に記載の飲料。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、葉。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、胚。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、果実。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、茎。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、根。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、花。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、種子。
- 請求項1に記載の植物由来のユビキノン−10を含む、米ぬか。
- ユビキノン−10を含むイネ細胞または組織。
- 種子である、請求項100に記載の細胞または組織。
- 玄米である、請求項100に記載の細胞または組織。
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