JPH1057072A - ユビキノン−１０の生成方法 - Google Patents
ユビキノン−１０の生成方法Info
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- JPH1057072A JPH1057072A JP8238682A JP23868296A JPH1057072A JP H1057072 A JPH1057072 A JP H1057072A JP 8238682 A JP8238682 A JP 8238682A JP 23868296 A JP23868296 A JP 23868296A JP H1057072 A JPH1057072 A JP H1057072A
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- pld2
- escherichia coli
- dds
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 デカプレニル二リン酸合成酵素の構造遺
伝子ｄｄｓ１を単離、配列決定し、大腸菌を用いてこれ
を発現せしめる。 【効果】 大腸菌からユビキノン−１０を生産すること
ができ、特に宿主としてオクタプレニル二リン酸合成酵
素の構造遺伝子ｉｓｐＢを欠損した大腸菌を用いた場合
には、ユビキノン−８、同−９の生成を抑制して、同−
１０のみを高純度生産することができる。
伝子ｄｄｓ１を単離、配列決定し、大腸菌を用いてこれ
を発現せしめる。 【効果】 大腸菌からユビキノン−１０を生産すること
ができ、特に宿主としてオクタプレニル二リン酸合成酵
素の構造遺伝子ｉｓｐＢを欠損した大腸菌を用いた場合
には、ユビキノン−８、同−９の生成を抑制して、同−
１０のみを高純度生産することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ユビキノン、特に
ユビキノン−１０の生成に関する。更に詳細には、本発
明は、酢酸菌由来のデカプレニル二リン酸合成酵素（Ｄ
ＤＳということもある）をコードする遺伝子を単離、発
現せしめてユビキノン−１０を生成する新規システムに
関するものである。
ユビキノン−１０の生成に関する。更に詳細には、本発
明は、酢酸菌由来のデカプレニル二リン酸合成酵素（Ｄ
ＤＳということもある）をコードする遺伝子を単離、発
現せしめてユビキノン−１０を生成する新規システムに
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】イソプレノイドは炭素数が５のイソペン
テニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とする天然の有機
化合物であり自然界に数多く存在している。その例を挙
げれば、色素のカロチノイド、天然ゴム、呼吸鎖電子伝
達系で働くイソプレノイドキノンなどがそれにあたる。
イソプレノイドキノンにはユビキノン（ＵＱ）、メナキ
ノン、プラストキノンなどキノン骨格の違いにより区別
されるものが数種存在し、またそれぞれについてはイソ
プレノイド側鎖長の違いにより多数のホモログが存在す
る。ユビキノンは、キノン骨格にイソプレノイドが付加
した化合物であって、2,3-dimethoxy-5-methyl-6-polyp
renyl-1,4-benzoquinoneの構造を持ち、補酵素（Ｃｏ
Ｑ）とも称される重要な役割を果たしている生体成分で
ある。ユビキノンは、動植物の組織、微生物の菌体成分
として存在し、抗酸化物質としても知られるビタミン様
物質であり、電子伝達系の必須成分としても生理的、生
化学的に重要な機能を果たしている。天然には側鎖のイ
ソプレノイド単位の数により主にユビキノン−１からユ
ビキノン−１２までの同族体が存在している。
テニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とする天然の有機
化合物であり自然界に数多く存在している。その例を挙
げれば、色素のカロチノイド、天然ゴム、呼吸鎖電子伝
達系で働くイソプレノイドキノンなどがそれにあたる。
イソプレノイドキノンにはユビキノン（ＵＱ）、メナキ
ノン、プラストキノンなどキノン骨格の違いにより区別
されるものが数種存在し、またそれぞれについてはイソ
プレノイド側鎖長の違いにより多数のホモログが存在す
る。ユビキノンは、キノン骨格にイソプレノイドが付加
した化合物であって、2,3-dimethoxy-5-methyl-6-polyp
renyl-1,4-benzoquinoneの構造を持ち、補酵素（Ｃｏ
Ｑ）とも称される重要な役割を果たしている生体成分で
ある。ユビキノンは、動植物の組織、微生物の菌体成分
として存在し、抗酸化物質としても知られるビタミン様
物質であり、電子伝達系の必須成分としても生理的、生
化学的に重要な機能を果たしている。天然には側鎖のイ
ソプレノイド単位の数により主にユビキノン−１からユ
ビキノン−１２までの同族体が存在している。
【０００３】ユビキノンは、その薬理、臨床効果につい
ても研究され、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、貧
血症等に効果があるとされ、心疾患薬その他各種医薬品
としても価値の高い物質である。しかし、医薬品として
効果が認められているのは、ユビキノン−１０のみであ
る。ユビキノン−１０は、現在、たばこの葉、酵母ある
いは微生物菌体から抽出精製されているが、それらの詳
細は明らかにされていない。しかし、その生産は需要に
追いつかず、従来の方法に代るより効率的な生産方法の
開発が求められている。
ても研究され、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、貧
血症等に効果があるとされ、心疾患薬その他各種医薬品
としても価値の高い物質である。しかし、医薬品として
効果が認められているのは、ユビキノン−１０のみであ
る。ユビキノン−１０は、現在、たばこの葉、酵母ある
いは微生物菌体から抽出精製されているが、それらの詳
細は明らかにされていない。しかし、その生産は需要に
追いつかず、従来の方法に代るより効率的な生産方法の
開発が求められている。
【０００４】このユビキノンの側鎖を形成するイソプレ
ノイドは炭素数が５のイソペンテニル二リン酸（ＩＰ
Ｐ）を基本単位とする、天然有機化合物であり、自然界
に数多く存在する。ユビキノンの側鎖として利用される
他に、カロチノイド、天然ゴム、またプレニル化蛋白質
としての姿も知られている。生体内での生合成は、基本
となるＩＰＰや、ＦＰＰ（ファネシル二リン酸）に新た
なＩＰＰが結合していき、徐々に長い鎖長のイソプレノ
イドに成っていく。このようにイソプレノイドの合成を
触媒する酵素はプレニルトランスフェラーゼという。プ
レニルトランスフェラーゼはバクテリアを中心として多
種類存在が確認されている。E. coliではＦＰＳ，ＯＰ
Ｓ，ＵＰＳの３つの酵素の存在が確認されており、遺伝
子として単離されているのはＦＰＳの構造遺伝子である
ｉｓｐＡとオクタプレニル二リン酸合成酵素（ＯＰＳ）
の構造遺伝子ｉｓｐＢである。
ノイドは炭素数が５のイソペンテニル二リン酸（ＩＰ
Ｐ）を基本単位とする、天然有機化合物であり、自然界
に数多く存在する。ユビキノンの側鎖として利用される
他に、カロチノイド、天然ゴム、またプレニル化蛋白質
としての姿も知られている。生体内での生合成は、基本
となるＩＰＰや、ＦＰＰ（ファネシル二リン酸）に新た
なＩＰＰが結合していき、徐々に長い鎖長のイソプレノ
イドに成っていく。このようにイソプレノイドの合成を
触媒する酵素はプレニルトランスフェラーゼという。プ
レニルトランスフェラーゼはバクテリアを中心として多
種類存在が確認されている。E. coliではＦＰＳ，ＯＰ
Ｓ，ＵＰＳの３つの酵素の存在が確認されており、遺伝
子として単離されているのはＦＰＳの構造遺伝子である
ｉｓｐＡとオクタプレニル二リン酸合成酵素（ＯＰＳ）
の構造遺伝子ｉｓｐＢである。
【０００５】このプレニルトランスフェラーゼの作用に
よって、大腸菌では側鎖長が８のオクタプレニル二リン
酸が、出芽酵母では側鎖長が６のヘキサプレニル二リン
酸が合成される。一方、大腸菌ｕｂｉＡ産物、酵母ＣＯ
Ｑ２産物によって、ＰＨＢ（ｐ−ヒドロキシベンゾエー
ト）から派生したベンゾキノン骨格にこれらのイソプレ
ノイドが付加されて、それぞれユビキノン−８、ユビキ
ノン−６が完成する。このようなことから、ｉｓｐＢ産
物とｕｂｉＡ産物等の触媒するポイントがユビキノン合
成にとって重要であると考えられる。ユビキノン−１０
は、上述のように薬理作用の高い生理活性物質として注
目されているが、側鎖を合成するデカプレニル二リン酸
合成酵素の遺伝子とｕｂｉＡ産物、酵母ＣＯＱ２産物を
利用することでユビキノン−１０の効率的生産につなが
るとの新しい観点にたち、デカプレニル二リン酸合成酵
素遺伝子のクローニングの必要性に着目した。
よって、大腸菌では側鎖長が８のオクタプレニル二リン
酸が、出芽酵母では側鎖長が６のヘキサプレニル二リン
酸が合成される。一方、大腸菌ｕｂｉＡ産物、酵母ＣＯ
Ｑ２産物によって、ＰＨＢ（ｐ−ヒドロキシベンゾエー
ト）から派生したベンゾキノン骨格にこれらのイソプレ
ノイドが付加されて、それぞれユビキノン−８、ユビキ
ノン−６が完成する。このようなことから、ｉｓｐＢ産
物とｕｂｉＡ産物等の触媒するポイントがユビキノン合
成にとって重要であると考えられる。ユビキノン−１０
は、上述のように薬理作用の高い生理活性物質として注
目されているが、側鎖を合成するデカプレニル二リン酸
合成酵素の遺伝子とｕｂｉＡ産物、酵母ＣＯＱ２産物を
利用することでユビキノン−１０の効率的生産につなが
るとの新しい観点にたち、デカプレニル二リン酸合成酵
素遺伝子のクローニングの必要性に着目した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、ＵＱ−１０の側鎖であるデカプレノイ
ド合成に係わる遺伝子を利用し、ＵＱ−１０を微生物で
生産する技術を開発する目的でなされたものである。
術の現状に鑑み、ＵＱ−１０の側鎖であるデカプレノイ
ド合成に係わる遺伝子を利用し、ＵＱ−１０を微生物で
生産する技術を開発する目的でなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、生理活性を有するＵＱ−１０を生成する生物よ
り、その合成に必要な遺伝子、すなわち側鎖のデカプレ
ニル二リン酸を合成するのに必要なデカプレニル二リン
酸合成酵素遺伝子を単離し、大腸菌内で発現させること
でＵＱ−１０生成を行うこととした。
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、生理活性を有するＵＱ−１０を生成する生物よ
り、その合成に必要な遺伝子、すなわち側鎖のデカプレ
ニル二リン酸を合成するのに必要なデカプレニル二リン
酸合成酵素遺伝子を単離し、大腸菌内で発現させること
でＵＱ−１０生成を行うこととした。
【０００８】この新規技術課題を解決するため、ＵＱ−
１０を生成するバクテリアの酢酸菌Gluconobacter subo
xydansのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。そ
の際使用するプライマーは、ポリプレニル二リン酸合成
酵素に高く保存された領域を参考にしてデザインしたmi
xed primerを使用した。このＰＣＲで得られた断片をベ
クターにクローン化し、塩基配列を決定した後、推定さ
れるアミノ酸を既知のポリプレニル二リン酸合成酵素と
比較して似ているものを選択した。その後、得られた断
片をプローブとしてG. suboxydansのゲノムを対象にゲ
ノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。そこ
で得られた情報を元に部分ゲノムライブラリーを作製
し、コロニーリフトアッセイによってこの遺伝子の全領
域を含む遺伝子領域を得た。この遺伝子領域内のプレニ
ル二リン酸合成酵素をコードするであろう領域の塩基配
列を決定した後、ｏｒｆを新たにＰＣＲで増幅後、大腸
菌発現ベクターにクローン化し、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子
のプロモーターを利用して発現を行った。この遺伝子を
発現させた大腸菌よりＵＱを調製し、その種類をＨＰＬ
Ｃで確認した。また、同様な菌体より調製した粗酵素タ
ンパク質を利用して酵素活性測定を行った。
１０を生成するバクテリアの酢酸菌Gluconobacter subo
xydansのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。そ
の際使用するプライマーは、ポリプレニル二リン酸合成
酵素に高く保存された領域を参考にしてデザインしたmi
xed primerを使用した。このＰＣＲで得られた断片をベ
クターにクローン化し、塩基配列を決定した後、推定さ
れるアミノ酸を既知のポリプレニル二リン酸合成酵素と
比較して似ているものを選択した。その後、得られた断
片をプローブとしてG. suboxydansのゲノムを対象にゲ
ノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。そこ
で得られた情報を元に部分ゲノムライブラリーを作製
し、コロニーリフトアッセイによってこの遺伝子の全領
域を含む遺伝子領域を得た。この遺伝子領域内のプレニ
ル二リン酸合成酵素をコードするであろう領域の塩基配
列を決定した後、ｏｒｆを新たにＰＣＲで増幅後、大腸
菌発現ベクターにクローン化し、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子
のプロモーターを利用して発現を行った。この遺伝子を
発現させた大腸菌よりＵＱを調製し、その種類をＨＰＬ
Ｃで確認した。また、同様な菌体より調製した粗酵素タ
ンパク質を利用して酵素活性測定を行った。
【０００９】また、ＵＱ−８合成に必要なオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素遺伝子（ｉｓｐＢ遺伝子）を欠損せ
しめた大腸菌を作成しておき、一方、上記と同様にし
て、ｄｄｓ１遺伝子を大腸菌発現ベクターにクローン化
しておき、これを上記したｉｓｐＢ破壊株で発現させる
ことにより、ＵＱ−１０をメイン産物として生成せしめ
ることも確認した。
ル二リン酸合成酵素遺伝子（ｉｓｐＢ遺伝子）を欠損せ
しめた大腸菌を作成しておき、一方、上記と同様にし
て、ｄｄｓ１遺伝子を大腸菌発現ベクターにクローン化
しておき、これを上記したｉｓｐＢ破壊株で発現させる
ことにより、ＵＱ−１０をメイン産物として生成せしめ
ることも確認した。
【００１０】そしてその結果、ＵＱ−１０を製造するこ
とにはじめて成功した。そしてその際、前者の場合は、
ＵＱ−８、ＵＱ−９とともにＵＱ−１０を製造するのに
成功し、また、ｉｓｐＢ破壊株を用いる後者の場合にお
いては、主としてＵＱ−１０を製造することができ、高
純度のＵＱ−１０を効率的に製造するのに成功し、これ
らの成功に基づき、本発明を完成するに至った。以上、
本発明について詳述する。
とにはじめて成功した。そしてその際、前者の場合は、
ＵＱ−８、ＵＱ−９とともにＵＱ−１０を製造するのに
成功し、また、ｉｓｐＢ破壊株を用いる後者の場合にお
いては、主としてＵＱ−１０を製造することができ、高
純度のＵＱ−１０を効率的に製造するのに成功し、これ
らの成功に基づき、本発明を完成するに至った。以上、
本発明について詳述する。
【００１１】
（１）配列表の配列番号４（センスプライマー）及び配
列番号５（アンチセンスプライマー）に示す２種類のオ
リゴプライマーを合成委託し、それらを使用して数回Ｐ
ＣＲを行った。すなわち、９５℃ １分、５５℃ ２
分、７２℃ １分、３０サイクルで初めのＰＣＲを行
い、４００〜５００ｂ付近をアガロース電気泳動により
切り出して再度同様の反応を行った。その結果、約４０
０ｂ付近にメインバンドを得た。このＰＣＲ断片をその
ままベクターにクローン化し、塩基配列決定を行ったと
ころ３種類の配列が決定された。それらの全てについて
アミノ酸配列を既存のプレニルトランスフェラーゼと比
較したところ、その内の一つが大腸菌オクタプレニル二
リン酸合成酵素と約４０％の相同性を有していた。そこ
で、この断片はG. suboxydansのデカプレニル二リン酸
合成酵素遺伝子の一部であると考え、全領域を以下のよ
うにスクリーニングした。
列番号５（アンチセンスプライマー）に示す２種類のオ
リゴプライマーを合成委託し、それらを使用して数回Ｐ
ＣＲを行った。すなわち、９５℃ １分、５５℃ ２
分、７２℃ １分、３０サイクルで初めのＰＣＲを行
い、４００〜５００ｂ付近をアガロース電気泳動により
切り出して再度同様の反応を行った。その結果、約４０
０ｂ付近にメインバンドを得た。このＰＣＲ断片をその
ままベクターにクローン化し、塩基配列決定を行ったと
ころ３種類の配列が決定された。それらの全てについて
アミノ酸配列を既存のプレニルトランスフェラーゼと比
較したところ、その内の一つが大腸菌オクタプレニル二
リン酸合成酵素と約４０％の相同性を有していた。そこ
で、この断片はG. suboxydansのデカプレニル二リン酸
合成酵素遺伝子の一部であると考え、全領域を以下のよ
うにスクリーニングした。
【００１２】（２）まず、この断片をプローブとし、G.
suboxydansのゲノムに対してサザンハイブリダイゼー
ションを行った。その結果、ゲノムのＥｃｏＲＩ消化物
を使用した場合約５ｋｂ付近にシグナルを得たので、ゲ
ノムのＥｃｏＲＩ消化後、５ｋｂ付近をアガロース電気
泳動により切り出してベクターの同サイトにライゲーシ
ョンして部分ゲノムライブラリーとした。その後、この
ライブラリーを保持する大腸菌に対して先のＰＣＲ断片
をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行
った。約６０００個の形質転換体をスクリーニングした
結果、数個のポジティブコロニーを得たのでその菌体よ
りプラスミドを調製し、サザンハイブリダイゼーション
を行った。その結果、ポジティブと判断できるプラスミ
ドを得たのでｐＧＳ１と名付けた。
suboxydansのゲノムに対してサザンハイブリダイゼー
ションを行った。その結果、ゲノムのＥｃｏＲＩ消化物
を使用した場合約５ｋｂ付近にシグナルを得たので、ゲ
ノムのＥｃｏＲＩ消化後、５ｋｂ付近をアガロース電気
泳動により切り出してベクターの同サイトにライゲーシ
ョンして部分ゲノムライブラリーとした。その後、この
ライブラリーを保持する大腸菌に対して先のＰＣＲ断片
をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行
った。約６０００個の形質転換体をスクリーニングした
結果、数個のポジティブコロニーを得たのでその菌体よ
りプラスミドを調製し、サザンハイブリダイゼーション
を行った。その結果、ポジティブと判断できるプラスミ
ドを得たのでｐＧＳ１と名付けた。
【００１３】（３）プラスミドｐＧＳ１は、約５ｋｂの
断片を保持していたので、その内のＳａ１Ｉ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ約２．１ｋｂの塩基配列を決定した（図１）。シ
ークエンスしたＤＮＡ配列の中からＤＮＡの遺伝情報が
ｍ−ＲＮＡへ転写され蛋白質へと翻訳される部分である
ＯＲＦ（オープン リーディング フレーム）を検索し
た。ＤＮＡコドンでは、ｍ−ＲＮＡの転写開始部分はＡ
ＴＧ、転写停止部分はＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡのいずれ
かであるので、開始コドン、停止コドンの検索を行い、
ＯＲＦの決定を行った。その結果、先のＰＣＲ断片を含
む約１ｋｂのＯＲＦを発見した。
断片を保持していたので、その内のＳａ１Ｉ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ約２．１ｋｂの塩基配列を決定した（図１）。シ
ークエンスしたＤＮＡ配列の中からＤＮＡの遺伝情報が
ｍ−ＲＮＡへ転写され蛋白質へと翻訳される部分である
ＯＲＦ（オープン リーディング フレーム）を検索し
た。ＤＮＡコドンでは、ｍ−ＲＮＡの転写開始部分はＡ
ＴＧ、転写停止部分はＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡのいずれ
かであるので、開始コドン、停止コドンの検索を行い、
ＯＲＦの決定を行った。その結果、先のＰＣＲ断片を含
む約１ｋｂのＯＲＦを発見した。
【００１４】（４）図１に示すように、この遺伝子は、
図１の塩基配列で示される８０８の位置（ＡＴＧ：メチ
オニン）から始まり１７５６の位置（ＴＡＡ：対応する
アミノ酸なし）で終了する９４８ｂｐ、３１５アミノ酸
からなるＯＲＦを保持しており、他のプレニル二リン酸
合成酵素と高い相同性を示し、大腸菌ＩｓｐＢ、酵母Sa
ccharomyces cerevisiae Ｃｏｑ１、枯草菌Bacillus su
btilisヘプタプレニル二リン酸合成酵素と、それぞれ、
４７．９％、４５．３％、３２．４％の相同性があっ
た。そこでこの遺伝子をデカプレニル二リン酸合成酵素
遺伝子ｄｄｓ１と命名し、その塩基配列をＤＤＳのアミ
ノ酸配列とともに配列表の配列番号１及び２にそれぞれ
示した。
図１の塩基配列で示される８０８の位置（ＡＴＧ：メチ
オニン）から始まり１７５６の位置（ＴＡＡ：対応する
アミノ酸なし）で終了する９４８ｂｐ、３１５アミノ酸
からなるＯＲＦを保持しており、他のプレニル二リン酸
合成酵素と高い相同性を示し、大腸菌ＩｓｐＢ、酵母Sa
ccharomyces cerevisiae Ｃｏｑ１、枯草菌Bacillus su
btilisヘプタプレニル二リン酸合成酵素と、それぞれ、
４７．９％、４５．３％、３２．４％の相同性があっ
た。そこでこの遺伝子をデカプレニル二リン酸合成酵素
遺伝子ｄｄｓ１と命名し、その塩基配列をＤＤＳのアミ
ノ酸配列とともに配列表の配列番号１及び２にそれぞれ
示した。
【００１５】（５）得られたシークエンスデータを基
に、ＯＲＦを含む領域が増幅できるオリゴプライマー
（配列番号４に示すセンスプライマー、配列番号５に示
すアンチセンスプライマー）を合成し、ｄｄｓ１のイン
サートＤＮＡ（その塩基配列を配列番号３に示す）をＰ
ＣＲで増幅した。増幅されたインサートＤＮＡは、５′
側にＢａｍＨＩサイト、３′側にＨｉｎｄＩＩＩサイト
をそれぞれ保存させており、プラスミドベクターｐＵＣ
１８（宝酒造）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに
クローン化した。上記のサイトにインサートＤＮＡを連
結することによりベクターのｌａｃＺ遺伝子と融合する
形でｄｄｓ１を発現させた。すなわち、ｄｄｓ１のＯＲ
Ｆを大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のプロモーター下で発現させ
るためにプラスミドｐＬＤ２を構築した（図２）。
に、ＯＲＦを含む領域が増幅できるオリゴプライマー
（配列番号４に示すセンスプライマー、配列番号５に示
すアンチセンスプライマー）を合成し、ｄｄｓ１のイン
サートＤＮＡ（その塩基配列を配列番号３に示す）をＰ
ＣＲで増幅した。増幅されたインサートＤＮＡは、５′
側にＢａｍＨＩサイト、３′側にＨｉｎｄＩＩＩサイト
をそれぞれ保存させており、プラスミドベクターｐＵＣ
１８（宝酒造）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに
クローン化した。上記のサイトにインサートＤＮＡを連
結することによりベクターのｌａｃＺ遺伝子と融合する
形でｄｄｓ１を発現させた。すなわち、ｄｄｓ１のＯＲ
Ｆを大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のプロモーター下で発現させ
るためにプラスミドｐＬＤ２を構築した（図２）。
【００１６】アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液
体培地１０ｍｌに、プラスミドｐＬＤ２を保持させた大
腸菌ＪＭ１０９のシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で
植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。上記と同様の培
地２５０ｍｌに、前培養しておいた培養液２．５ｍｌ
（１％植菌）を植菌し、３７℃で２〜３時間振とう培養
した。その後、分光光度計でＯＤ600が約０．５である
ことを確認して、１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−
チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド）を０．２５ｍｌ（最終
濃度１ｍＭ）添加して、更に１２時間同様に培養した。
得られた菌体からＵＱを調製しＨＰＬＣで解析したとこ
ろ、図３に示すように従来ＪＭ１０９の保持しないＵＱ
が検出された。ピーク１はＵＱ−８であるが、ピーク３
は標準物質のＵＱ−１０と一致することからＵＱ−１０
であり、ピーク２はＵＱ−９であると考えられる。
体培地１０ｍｌに、プラスミドｐＬＤ２を保持させた大
腸菌ＪＭ１０９のシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で
植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。上記と同様の培
地２５０ｍｌに、前培養しておいた培養液２．５ｍｌ
（１％植菌）を植菌し、３７℃で２〜３時間振とう培養
した。その後、分光光度計でＯＤ600が約０．５である
ことを確認して、１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−
チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド）を０．２５ｍｌ（最終
濃度１ｍＭ）添加して、更に１２時間同様に培養した。
得られた菌体からＵＱを調製しＨＰＬＣで解析したとこ
ろ、図３に示すように従来ＪＭ１０９の保持しないＵＱ
が検出された。ピーク１はＵＱ−８であるが、ピーク３
は標準物質のＵＱ−１０と一致することからＵＱ−１０
であり、ピーク２はＵＱ−９であると考えられる。
【００１７】上記ｄｄｓ１で形質転換した形質転換微生
物である、ｐＬＤ２を保持させた大腸菌ＪＭ１０９（Es
cherichia coli ＪＭ１０９／ｐＬＤ２）を、遺伝子発
現の誘導物質であるイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）非存在下で培養し、同様に
ＵＱを調製したところ、生成量は１０分の１にまで減少
した。このことからも、プラスミドとして導入したｄｄ
ｓ１遺伝子を利用することによりＵＱ−１０を生成でき
ることが明らかになった。
物である、ｐＬＤ２を保持させた大腸菌ＪＭ１０９（Es
cherichia coli ＪＭ１０９／ｐＬＤ２）を、遺伝子発
現の誘導物質であるイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）非存在下で培養し、同様に
ＵＱを調製したところ、生成量は１０分の１にまで減少
した。このことからも、プラスミドとして導入したｄｄ
ｓ１遺伝子を利用することによりＵＱ−１０を生成でき
ることが明らかになった。
【００１８】次に、Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐ
ＬＤ２より粗酵素蛋白質を調製し、活性測定を行った。
すなわち、基質として14Ｃ−ＩＰＰ（インペンテニル二
リン酸：Amersham LIFESCIENCE社）とＦＰＰ（ファルネ
シル二リン酸）を使用し、３０℃で４時間反応させた
後、ブタノールで抽出したポリプレニル二リン酸を加水
分解後、ポリプレノールの状態でＴＬＣ展開した。その
結果、図４に示すようにｐＬＤ２を保持させたＪＭ１０
９においてデカプレノールが検出された。これらの結果
から、我々が得たｄｄｓ１遺伝子はＵＱ−１０合成に必
要な側鎖のデカプレニル二リン酸合成を担う遺伝子であ
ることが明らかとなり、ｄｄｓ１遺伝子を大腸菌内で発
現させてやることでＵＱ−１０生成が可能であることが
証明された。
ＬＤ２より粗酵素蛋白質を調製し、活性測定を行った。
すなわち、基質として14Ｃ−ＩＰＰ（インペンテニル二
リン酸：Amersham LIFESCIENCE社）とＦＰＰ（ファルネ
シル二リン酸）を使用し、３０℃で４時間反応させた
後、ブタノールで抽出したポリプレニル二リン酸を加水
分解後、ポリプレノールの状態でＴＬＣ展開した。その
結果、図４に示すようにｐＬＤ２を保持させたＪＭ１０
９においてデカプレノールが検出された。これらの結果
から、我々が得たｄｄｓ１遺伝子はＵＱ−１０合成に必
要な側鎖のデカプレニル二リン酸合成を担う遺伝子であ
ることが明らかとなり、ｄｄｓ１遺伝子を大腸菌内で発
現させてやることでＵＱ−１０生成が可能であることが
証明された。
【００１９】（６）以上、プラスミドｐＬＤ２で形質転
換した大腸菌ＪＭ１０９を用いる、ＵＱ−８、ＵＱ−９
の生成を伴うＵＱ−１０の生成についての実施例につい
て述べた。次に、より純品でＵＱ−１０を生成できる系
についての実施例について述べる。
換した大腸菌ＪＭ１０９を用いる、ＵＱ−８、ＵＱ−９
の生成を伴うＵＱ−１０の生成についての実施例につい
て述べた。次に、より純品でＵＱ−１０を生成できる系
についての実施例について述べる。
【００２０】（７）ＫＯ２２９／ｐＬＤ２の作製 下記するように、大腸菌ＫＯ２２９（Escherichia coli
ＫＯ２２９）は、ＵＱ−８合成に必要なｉｓｐＢ遺伝
子を欠損している株であるため、ＵＱ−８を合成するこ
とはできない。したがって、この株においてプラスミド
ｐＬＤ２を発現させることにより、ＵＱ−１０のみを単
一品として生成させたり、その生成量を増加させること
が期待できる。換言すれば、上記した大腸菌ＪＭ１０９
／ｐＬＤ２は、ＵＱ−１０は生成するものの、ＵＱ−８
がメイン産物であるのに対し、本菌株である大腸菌ＫＯ
２２９／ｐＬＤ２はＵＱ−１０をメイン産物とするもの
であって、本実施例はＵＱ−１０の高純度生産を目的と
したものである。
ＫＯ２２９）は、ＵＱ−８合成に必要なｉｓｐＢ遺伝
子を欠損している株であるため、ＵＱ−８を合成するこ
とはできない。したがって、この株においてプラスミド
ｐＬＤ２を発現させることにより、ＵＱ−１０のみを単
一品として生成させたり、その生成量を増加させること
が期待できる。換言すれば、上記した大腸菌ＪＭ１０９
／ｐＬＤ２は、ＵＱ−１０は生成するものの、ＵＱ−８
がメイン産物であるのに対し、本菌株である大腸菌ＫＯ
２２９／ｐＬＤ２はＵＱ−１０をメイン産物とするもの
であって、本実施例はＵＱ−１０の高純度生産を目的と
したものである。
【００２１】ａ）プラスミド上でのｉｓｐＢ遺伝子の破
壊 まずｉｓｐＢを保持するプラスミドｐＫＡ３のｉｓｐＢ
内に存在するＰｓｔＩサイトを制限酵素で切断した。そ
こにｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ）遺伝子を導入した。その際、ｐＫＡ３、ｃａ
ｔの両方のサイトをＴ４ポリメラーゼで平滑末端に修飾
してからライゲーションした。なお、ｃａｔ遺伝子はｐ
ＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン社）をＨａｅＩＩ処理
することで調製した。得られたプラスミドｐＴＣ２より
ｃａｔで分断されたｉｓｐＢ遺伝子の領域をＥｃｏＲＩ
処理により切り出し、これを断片Ｑとした。
壊 まずｉｓｐＢを保持するプラスミドｐＫＡ３のｉｓｐＢ
内に存在するＰｓｔＩサイトを制限酵素で切断した。そ
こにｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ）遺伝子を導入した。その際、ｐＫＡ３、ｃａ
ｔの両方のサイトをＴ４ポリメラーゼで平滑末端に修飾
してからライゲーションした。なお、ｃａｔ遺伝子はｐ
ＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン社）をＨａｅＩＩ処理
することで調製した。得られたプラスミドｐＴＣ２より
ｃａｔで分断されたｉｓｐＢ遺伝子の領域をＥｃｏＲＩ
処理により切り出し、これを断片Ｑとした。
【００２２】ｂ）ｉｓｐＢ欠損株の作製 相同組換えの起こりやすい大腸菌ＦＳ１５７６をｐＫＡ
３で形質転換した。得られた形質転換体ＦＳ１５７６／
ｐＫＡ３を、ａ）で調製した断片Ｑを用いて再度形質転
換した。ここで得られる形質転換体は、クロラムフェニ
コール（Ｃｍ）とスペクチノマイシン（Ｓｐｃ）を５０
μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地で生育してきた菌株であ
り、染色体か、あるいはｐＫＡ３上のｉｓｐＢ遺伝子が
断片Ｑで置き換わっていた（相同組換えが起こってい
た）。得られたＣｍ＋Ｓｐｃ耐性株よりｐＫＡ３をと
り、その大きさに変化のない株を選択した。ここで選択
された株は、染色体上のｉｓｐＢ遺伝子がｃａｔで破壊
されており、そのかわりに無傷のｉｓｐＢ遺伝子をプラ
スミドｐＫＡ３として保持していた。この株を大腸菌Ｋ
Ｏ２２９／ｐＫＡ３とした。
３で形質転換した。得られた形質転換体ＦＳ１５７６／
ｐＫＡ３を、ａ）で調製した断片Ｑを用いて再度形質転
換した。ここで得られる形質転換体は、クロラムフェニ
コール（Ｃｍ）とスペクチノマイシン（Ｓｐｃ）を５０
μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地で生育してきた菌株であ
り、染色体か、あるいはｐＫＡ３上のｉｓｐＢ遺伝子が
断片Ｑで置き換わっていた（相同組換えが起こってい
た）。得られたＣｍ＋Ｓｐｃ耐性株よりｐＫＡ３をと
り、その大きさに変化のない株を選択した。ここで選択
された株は、染色体上のｉｓｐＢ遺伝子がｃａｔで破壊
されており、そのかわりに無傷のｉｓｐＢ遺伝子をプラ
スミドｐＫＡ３として保持していた。この株を大腸菌Ｋ
Ｏ２２９／ｐＫＡ３とした。
【００２３】ｃ）ＫＯ２２９／ｐＬＤ２株の単離 ｂ）で得られたＫＯ２２９／ｐＫＡ３をｄｄｓ１遺伝子
を持つプラスミドｐＬＤ２で形質転換した。ｐＬＤ２は
アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子を持つのでＣｍ、Ｓ
ｐｃ、Ａｍｐをそれぞれ５０μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培
地で選択した。得られたＫＯ２２９／ｐＫＡ３＋ｐＬＤ
２株をＡｍｐ＋Ｃｍを含むＬＢ液体培地で培養し、飽和
したところで同様な新たな培地に継代培養した。この操
作を計５回繰り返し、Ａｍｐ＋Ｃｍを含むＬＢ寒天培地
に希釈してまく。生えてきたＡｍｐ＋Ｃｍ耐性株をＡｍ
ｐ＋ＣｍおよびＳｐｃ＋Ｃｍ寒天培地に１００個づつレ
プリカし、Ａｍｐ＋Ｃｍ耐性、Ｓｐｃ感受性株を選択し
た。得られた株を大腸菌ＫＯ２２９／ｐＬＤ２としてＵ
Ｑ−１０の生産に利用した。本菌株の有用性に鑑み、本
菌株を大腸菌ＫＯ２２９／ｐＬＤ２と命名し、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５６２６
として国際寄託した。
を持つプラスミドｐＬＤ２で形質転換した。ｐＬＤ２は
アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子を持つのでＣｍ、Ｓ
ｐｃ、Ａｍｐをそれぞれ５０μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培
地で選択した。得られたＫＯ２２９／ｐＫＡ３＋ｐＬＤ
２株をＡｍｐ＋Ｃｍを含むＬＢ液体培地で培養し、飽和
したところで同様な新たな培地に継代培養した。この操
作を計５回繰り返し、Ａｍｐ＋Ｃｍを含むＬＢ寒天培地
に希釈してまく。生えてきたＡｍｐ＋Ｃｍ耐性株をＡｍ
ｐ＋ＣｍおよびＳｐｃ＋Ｃｍ寒天培地に１００個づつレ
プリカし、Ａｍｐ＋Ｃｍ耐性、Ｓｐｃ感受性株を選択し
た。得られた株を大腸菌ＫＯ２２９／ｐＬＤ２としてＵ
Ｑ−１０の生産に利用した。本菌株の有用性に鑑み、本
菌株を大腸菌ＫＯ２２９／ｐＬＤ２と命名し、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５６２６
として国際寄託した。
【００２４】（８）ＵＱ−１０の生産 先の実施例においてｐＬＤ２で形質転換した大腸菌ＪＭ
１０９を培養した場合と同様に、Escherichia coli Ｋ
Ｏ２２９／ｐＬＤ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６２６）をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ培地において３７℃
で振とう培養し、前培養した菌体を新しい培地に１％植
菌し、ＯＤ600が約０．５に達したところでＩＰＴＧを
１ｍＭになるように加えて更に対数増殖期後期まで培養
した。得られた菌体からＵＱを調製し、ＨＰＬＣで解析
したところ、図５に示すようにＵＱ−１０のメインピー
クが認められ、ＫＯ２２９／ｐＬＤ２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５６２６）によるＵＱ−１０の高純品生産が確認され
た。なお本菌株の場合は、先の実施例のＪＭ１０９／ｐ
ＬＤ２の場合とは異なり、ＩＰＴＧ添加培地で培養した
場合は若干のＵＱ−１０の生産量の増加が認められた
が、ＩＰＴＧ無添加培地で培養した場合と格段の生産量
の差は認められなかった。
１０９を培養した場合と同様に、Escherichia coli Ｋ
Ｏ２２９／ｐＬＤ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６２６）をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ培地において３７℃
で振とう培養し、前培養した菌体を新しい培地に１％植
菌し、ＯＤ600が約０．５に達したところでＩＰＴＧを
１ｍＭになるように加えて更に対数増殖期後期まで培養
した。得られた菌体からＵＱを調製し、ＨＰＬＣで解析
したところ、図５に示すようにＵＱ−１０のメインピー
クが認められ、ＫＯ２２９／ｐＬＤ２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５６２６）によるＵＱ−１０の高純品生産が確認され
た。なお本菌株の場合は、先の実施例のＪＭ１０９／ｐ
ＬＤ２の場合とは異なり、ＩＰＴＧ添加培地で培養した
場合は若干のＵＱ−１０の生産量の増加が認められた
が、ＩＰＴＧ無添加培地で培養した場合と格段の生産量
の差は認められなかった。
【００２５】
【発明の効果】本発明によって、デカプレニル二リン酸
合成酵素の構造遺伝子を単離し、その配列決定に成功し
ただけでなく、大腸菌で発現させることにはじめて成功
した。その結果、ＵＱ−８、ＵＱ−９の生産のほか、Ｕ
Ｑ−１０の大腸菌による生産がはじめて可能になっただ
けでなく、ｉｓｐＢ遺伝子欠損株を用いることにより、
ＵＱ−８の生産を抑制してＵＱ−１０を選択的に高純
度、大量生産することもはじめて可能となった。
合成酵素の構造遺伝子を単離し、その配列決定に成功し
ただけでなく、大腸菌で発現させることにはじめて成功
した。その結果、ＵＱ−８、ＵＱ−９の生産のほか、Ｕ
Ｑ−１０の大腸菌による生産がはじめて可能になっただ
けでなく、ｉｓｐＢ遺伝子欠損株を用いることにより、
ＵＱ−８の生産を抑制してＵＱ−１０を選択的に高純
度、大量生産することもはじめて可能となった。
【００２６】
【配列表】本発明に係るＤＤＳのアミノ酸配列（３１５
アミノ酸）を配列番号１に示し、それをコードする遺伝
子（ｄｄｓ１）の塩基配列（９４８ｂｐ）を配列番号２
に示し、ｄｄｓ１遺伝子を含みセンスプライマーからア
ンチセンスプライマーまでの領域を配列番号３に示す。
アミノ酸）を配列番号１に示し、それをコードする遺伝
子（ｄｄｓ１）の塩基配列（９４８ｂｐ）を配列番号２
に示し、ｄｄｓ１遺伝子を含みセンスプライマーからア
ンチセンスプライマーまでの領域を配列番号３に示す。
【００２７】配列番号４、５は、ＰＣＲ用プライマーを
示し、配列番号４はセンスプライマー、配列番号５はア
ンチセンスプライマーを示す。下記表１〜１０に、配列
番号１〜５で示される各配列を示す。
示し、配列番号４はセンスプライマー、配列番号５はア
ンチセンスプライマーを示す。下記表１〜１０に、配列
番号１〜５で示される各配列を示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】
【表４】
【００３２】
【表５】
【００３３】
【表６】
【００３４】
【表７】
【００３５】
【表８】
【００３６】
【表９】
【００３７】
【表１０】
【図１】ＤＤＳをコードする遺伝子を含む塩基配列を示
す。
す。
【図２】発現プラスミドｐＬＤ２を示す。
【図３】大腸菌 ＪＭ１０９／ｐＬＤ２培養物から抽出
したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】大腸菌 ＪＭ１０９／ｐＬＤ２産物の薄層クロ
マトグラムを示す。
マトグラムを示す。
【図５】大腸菌 ＫＯ２２９／ｐＬＤ２培養物から抽出
したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (11)
- 【請求項１】 デカプレニル二リン酸合成酵素（ＤＤ
Ｓ）をコードする遺伝子で形質転換してなる形質転換微
生物。 - 【請求項２】 オクタプレニル二リン酸合成酵素（ＯＰ
Ｓ）をコードする遺伝子は破壊しておくことを特徴とす
る請求項１に記載の形質転換微生物。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示
されるＤＤＳをコードする遺伝子のＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号２の塩基配列で示される、請求
項３に記載のＤＤＳをコードする遺伝子（ｄｄｓ１遺伝
子）のＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号３の塩基配列で示され、配列番
号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡを含有
してなる遺伝子のＤＮＡ。 - 【請求項６】 ＤＤＳをコードする遺伝子のＤＮＡを組
み込んでなるプラスミド。 - 【請求項７】 請求項３〜５のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡをベクターｐＵＣ１８に挿入してなる発現プラスミ
ドｐＬＤ２。 - 【請求項８】 請求項６又は７に記載のプラスミドで形
質転換してなる形質転換微生物。 - 【請求項９】 形質転換微生物が、大腸菌ＪＭ１０９／
ｐＬＤ２又は大腸菌ＫＯ２２９／ｐＬＤ２である、請求
項８に記載の形質転換微生物。 - 【請求項１０】 請求項１、２、８又は９に記載の形質
転換微生物を培養することを特徴とするユビキノン−１
０の生成方法。 - 【請求項１１】 大腸菌ＫＯ２２９／ｐＬＤ２を培養す
ることを特徴とする高純度ユビキノン−１０の生成方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8238682A JPH1057072A (ja) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | ユビキノン−１０の生成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8238682A JPH1057072A (ja) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | ユビキノン−１０の生成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1057072A true JPH1057072A (ja) | 1998-03-03 |
Family
ID=17033745
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8238682A Pending JPH1057072A (ja) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | ユビキノン−１０の生成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1057072A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000047746A1 (fr) * | 1999-02-10 | 2000-08-17 | Kaneka Corporation | Procede de production de coenzyme q10 |
| WO2002040682A1 (fr) * | 2000-11-20 | 2002-05-23 | Kaneka Corporation | Procede servant a preparer un coenzyme q¿10? |
| WO2002052017A1 (fr) * | 2000-12-27 | 2002-07-04 | Kaneka Corporation | Procede relatif a la production de coenzyme q¿10? |
| WO2002088365A1 (fr) * | 2001-04-25 | 2002-11-07 | Kaneka Corporation | Procede de production de coenzyme q¿10? |
| WO2003056024A1 (fr) * | 2001-12-27 | 2003-07-10 | Kaneka Corporation | Procedes de production de la co-enzyme q10 |
| JP2006212019A (ja) * | 2004-04-30 | 2006-08-17 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 植物を用いたユビキノン−１０の製造方法 |
| US7402413B2 (en) | 2001-05-11 | 2008-07-22 | Kaneka Corporation | Method of expressing long-chain prenyl diphosphate synthase |
| JP4668495B2 (ja) * | 1999-10-14 | 2011-04-13 | 協和発酵バイオ株式会社 | ユビキノン−１０の製造法 |
| US8815567B2 (en) | 2007-11-30 | 2014-08-26 | E I Du Pont De Nemours And Company | Coenzyme Q10 production in a recombinant oleaginous yeast |
-
1996
- 1996-08-22 JP JP8238682A patent/JPH1057072A/ja active Pending
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6461842B1 (en) | 1999-02-10 | 2002-10-08 | Kaneka Corporation | Process for producing coenzyme Q10 |
| WO2000047746A1 (fr) * | 1999-02-10 | 2000-08-17 | Kaneka Corporation | Procede de production de coenzyme q10 |
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| US7320883B2 (en) | 2000-12-27 | 2008-01-22 | Kaneka Corporation | Process for producing coenzyme Q10 |
| JP2002191367A (ja) * | 2000-12-27 | 2002-07-09 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | コエンザイムｑ１０の製造法 |
| WO2002052017A1 (fr) * | 2000-12-27 | 2002-07-04 | Kaneka Corporation | Procede relatif a la production de coenzyme q¿10? |
| WO2002088365A1 (fr) * | 2001-04-25 | 2002-11-07 | Kaneka Corporation | Procede de production de coenzyme q¿10? |
| US7402413B2 (en) | 2001-05-11 | 2008-07-22 | Kaneka Corporation | Method of expressing long-chain prenyl diphosphate synthase |
| US8163525B2 (en) | 2001-05-11 | 2012-04-24 | Kaneka Corporation | Method of expressing long-chain prenyl diphosphate synthase |
| WO2003056024A1 (fr) * | 2001-12-27 | 2003-07-10 | Kaneka Corporation | Procedes de production de la co-enzyme q10 |
| US7910340B2 (en) | 2001-12-27 | 2011-03-22 | Kaneka Corporation | Processes for producing coenzyme Q10 |
| US9315839B2 (en) | 2001-12-27 | 2016-04-19 | Kaneka Corporation | Processes for producing coenzyme Q10 |
| US9926580B2 (en) | 2001-12-27 | 2018-03-27 | Kaneka Corporation | Process for producing coenzyme Q10 |
| JP2006212019A (ja) * | 2004-04-30 | 2006-08-17 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 植物を用いたユビキノン−１０の製造方法 |
| US8815567B2 (en) | 2007-11-30 | 2014-08-26 | E I Du Pont De Nemours And Company | Coenzyme Q10 production in a recombinant oleaginous yeast |
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