JPH1114627A - Immunological diagnosis reagent - Google Patents
Immunological diagnosis reagentInfo
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- JPH1114627A JPH1114627A JP16711197A JP16711197A JPH1114627A JP H1114627 A JPH1114627 A JP H1114627A JP 16711197 A JP16711197 A JP 16711197A JP 16711197 A JP16711197 A JP 16711197A JP H1114627 A JPH1114627 A JP H1114627A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、診断学上有用であ
る抗原タンパク質、特に梅毒トレポネーマ表面抗原タン
パク質が担持された不溶性担体からなる免疫学的診断試
薬に関する。The present invention relates to an immunological diagnostic reagent comprising an insoluble carrier carrying an antigenic protein useful in diagnostics, particularly a Treponema pallidum surface antigenic protein.
【０００２】[0002]
【従来の技術】一般に感染症では、感染しているか否か
は、血液中の細菌やウイルス等に対する抗体の存在によ
り判断される。また、ある種のガンにおいてはガン細胞
が分泌するタンパク質に対する抗体が出現することが知
られており、ガンの診断に利用されている。臨床検査分
野において、従来より、これら感染症の抗原タンパク質
やガン細胞分泌タンパク質を不溶性担体に担持させ、抗
体との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度
合いを検出することにより、該抗体を測定する免疫測定
方法が用いられてきた。このような測定方法としては、
赤血球凝集反応法、ラテックス凝集法が知られている。2. Description of the Related Art In general, infectious diseases are determined by the presence of antibodies against bacteria, viruses and the like in blood. Further, it is known that an antibody against a protein secreted by cancer cells appears in a certain kind of cancer, and is used for cancer diagnosis. In the field of clinical examination, conventionally, these infectious disease antigen proteins and cancer cell secreted proteins are supported on an insoluble carrier, and the antibody is detected by detecting the degree of aggregation of the insoluble carrier caused by the antigen-antibody reaction with the antibody. Immunoassay methods for measuring have been used. Such measurement methods include:
Hemagglutination and latex agglutination methods are known.
【０００３】このような方法の一つとして、特表平２−
５００４０３号公報には、梅毒トレポネーマの分子量４
７ｋＤａの抗原を遺伝子工学的に調製し、これを用いて
抗梅毒トレポネーマ抗体を免疫測定することが記載され
ている。One of such methods is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No.
No. 500403 discloses that the molecular weight of Treponema pallidum is 4
It describes that a 7 kDa antigen is prepared by genetic engineering, and immunoassay for an anti-Treponemal antibody is performed using the antigen.
【０００４】また、特開平７−２８７０１７号公報に
は、梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク質とグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴという）
との融合タンパク質を用いて、抗梅毒トレポネーマ抗体
を測定する診断試薬が開示されている。しかしながら、
この試薬においては、梅毒トレポネーマの表面抗原タン
パク質の分子量が大きい場合、その抗原の疎水性のため
にＧＳＴとの融合タンパク質の水溶性が低下してしまう
という欠点があった。Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-287017 discloses a surface antigen protein of Treponema pallidum and glutathione-S-transferase (hereinafter referred to as GST).
A diagnostic reagent for measuring an anti-Treponemal antibody using a fusion protein with the above is disclosed. However,
This reagent has the disadvantage that if the molecular weight of the surface antigen protein of Treponema pallidum is large, the water solubility of the fusion protein with GST is reduced due to the hydrophobicity of the antigen.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するものであり、その目的は、不溶性担体に担持
される融合タンパク質として水溶性のより高い融合タン
パク質を用い、抗原タンパク質とグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼとの融合タンパク質を用いる場合より
も、より感度の高い免疫学的診断試薬を提供することで
ある。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to use a fusion protein having a higher water solubility as a fusion protein supported on an insoluble carrier, and to combine an antigen protein and glutathione. An object of the present invention is to provide a more sensitive immunological diagnostic reagent than when a fusion protein with -S-transferase is used.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】請求項１記載の免疫学的
診断試薬は、診断学上有用である抗原タンパク質とマル
トース結合タンパク質との融合タンパク質が、不溶性担
体に担持されていることを特徴とする。The immunological diagnostic reagent according to claim 1 is characterized in that a fusion protein of an antigen protein and maltose binding protein, which is diagnostically useful, is carried on an insoluble carrier. I do.
【０００７】請求項２記載の免疫学的診断試薬は、抗原
タンパク質が梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク質で
ある請求項１記載の免疫学的診断試薬である。[0007] The immunological diagnostic reagent according to claim 2 is the immunological diagnostic reagent according to claim 1, wherein the antigen protein is a surface antigen protein of Treponema pallidum.
【０００８】請求項３記載の免疫学的診断試薬は、不溶
性担体が、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン
酸（塩）共重合体又はスチレン−メタクリル酸共重合体
からなるラテックス粒子である請求項１又は２記載の免
疫学的診断試薬である。[0008] In the immunological diagnostic reagent according to claim 3, the insoluble carrier is latex particles composed of polystyrene, styrene-styrenesulfonic acid (salt) copolymer or styrene-methacrylic acid copolymer. 2. The immunological diagnostic reagent according to 2.
【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【００１０】本発明の免疫学的診断試薬は、診断学上有
用である抗原タンパク質とマルトース結合タンパク質と
の融合タンパク質が、不溶性担体に担持されている。[0010] In the immunological diagnostic reagent of the present invention, a fusion protein of an antigen protein and a maltose binding protein, which is diagnostically useful, is supported on an insoluble carrier.
【００１１】上記マルトース結合タンパク質は、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９０，４５９
−４６３（１９８２）に記載されている。[0011] The maltose binding protein is Met
hods in Enzymology 90,459
-463 (1982).
【００１２】本発明で用いられる融合タンパク質は、一
般的には、遺伝子工学的手法により得られる。この手法
を詳しく説明すると、抗原タンパク質の遺伝子が公知の
ものであれば、ＰＣＲ法により抗原タンパク質のＤＮＡ
を増幅、精製し、これをマルトース結合タンパク質遺伝
子を含むプラスミドベクターに導入する。得られたプラ
スミドベクターを大腸菌に導入し、大腸菌に融合タンパ
ク質を大量生産させる。The fusion protein used in the present invention is generally obtained by a genetic engineering technique. This technique will be described in detail. If the gene of the antigen protein is known, the DNA of the antigen protein is determined by PCR.
Is amplified and purified, and this is introduced into a plasmid vector containing a maltose binding protein gene. The obtained plasmid vector is introduced into Escherichia coli, and Escherichia coli is caused to produce a large amount of the fusion protein.
【００１３】上記プラスミドベクターとしてはマルトー
ス結合タンパク質遺伝子を持っているもので融合タンパ
ク質を作成可能なものであればどのようなものでもよ
い。従って、融合タンパク質を発現させるためのプロモ
ーターまたは薬剤耐性遺伝子などはどのようなものであ
ってもよい。マルトースを含む融合タンパク質を精製す
る過程は、大腸菌を破砕する過程とその抽出液から融合
タンパク質を精製する過程に分けられる。大腸菌の破砕
は、超音波による方法が既知であるが細胞内のタンパク
質を分解しなければどのような方法でもよい。大腸菌抽
出液からの融合タンパク質の抽出はマルトース結合タン
パク質とマルトースとの結合を利用したアフィニティー
クロマトグラフィーにより行う。アフィニティークロマ
トグラフィーの担体はマルトースを構成単位とするアミ
ロースを結合した樹脂が既知であるが、アミロペクチ
ン、グリコーゲンなどでもよい。The above plasmid vector may be any plasmid vector having a maltose binding protein gene and capable of producing a fusion protein. Therefore, any promoter or drug resistance gene for expressing the fusion protein may be used. The process of purifying a fusion protein containing maltose can be divided into a process of disrupting Escherichia coli and a process of purifying the fusion protein from the extract. Escherichia coli is disrupted by an ultrasonic method, but any method may be used as long as it does not decompose intracellular proteins. Extraction of the fusion protein from the Escherichia coli extract is performed by affinity chromatography utilizing the binding between maltose-binding protein and maltose. As a carrier for affinity chromatography, a resin to which amylose having maltose as a constitutional unit is bound is known, but amylopectin, glycogen and the like may be used.
【００１４】上記融合タンパク質の作成に用いられる、
診断学上有用である抗原タンパク質としては、本発明の
目的にあった病原体等の抗原タンパク質であれば特に限
定されない。例えば、細菌の抗原タンパク質として、梅
毒トレポネーマ、ヘリコバクター・ピロリ、マイコプラ
ズマ、淋菌などの抗原タンパク質が挙げられる。ウイル
スの抗原タンパク質として、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ
型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイル
ス、陰部ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病
ウイルス、などの抗原タンパク質が挙げられる。また、
ガン細胞が特異的に発現する抗原タンパク質などであっ
てもよい。本発明は、梅毒トレポネーマの表面抗原タン
パク質の場合に特に有効である。[0014] used for the preparation of the above fusion protein,
The antigenic protein that is useful in diagnostics is not particularly limited as long as it is an antigenic protein such as a pathogen, which is the object of the present invention. For example, antigenic proteins of bacteria include antigenic proteins such as Treponema pallidum, Helicobacter pylori, Mycoplasma, and Neisseria gonorrhoeae. As a virus antigen protein, human immunodeficiency virus, B
Antigen proteins such as hepatitis C virus, hepatitis C virus, hepatitis G virus, genital herpes virus, Japanese encephalitis virus, and rabies virus. Also,
It may be an antigen protein specifically expressed by cancer cells. The present invention is particularly effective in the case of Treponema pallidum surface antigen protein.
【００１５】上記梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク
質の場合、該抗原タンパク質としては、分子量４７ｋＤ
ａの梅毒トレポネーマ表面抗原タンパク質（Infection
andImmunity 57(1),196-203(1989)）、４４ｋＤａの梅
毒トレポネーマ表面抗原タンパク質（Journal of Genet
ical Microbiology 133,1793-1803(1987))、４２ｋＤａ
の梅毒トレポネーマ表面抗原タンパク質（Infection an
d Immunity 57(9),2612-2623(1989)) 、３５ｋＤａの梅
毒トレポネーマ表面抗原タンパク質（Infection and Im
munity 59(10),3536-3546(1991))、３４ｋＤａの梅毒ト
レポネーマ表面抗原タンパク質（Infection and Immuni
ty 57(11),3314-3323(1989))、１７ｋＤａの梅毒トレポ
ネーマ表面抗原タンパク質（Infection and Immunity 6
1,1202-1210(1993) ）、１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ
表面抗原タンパク質（MolecularMicrobiology 4,1371-1
379(1990)) などが知られており、これらはいずれも使
用可能である。これらの中でも、梅毒トレポネーマの主
要な表面抗原タンパク質と考えられている４７ｋＤａの
表面抗原タンパク質、１７ｋＤａの表面抗原タンパク
質、１５ｋＤａの表面抗原タンパク質などが好ましい。
このうち特に４７ｋＤａの表面抗原タンパク質が主要抗
原である。In the case of the surface antigen protein of Treponema pallidum, the antigen protein has a molecular weight of 47 kD.
a) Treponema pallidum surface antigen protein (Infection
andImmunity 57 (1), 196-203 (1989)), 44 kDa Treponema pallidum surface antigen protein (Journal of Genet)
ical Microbiology 133, 1793-1803 (1987)), 42 kDa
Treponema pallidum surface antigen protein (Infection an
d Immunity 57 (9), 2612-2623 (1989)), 35 kDa Treponema pallidum surface antigen protein (Infection and Im
munity 59 (10), 3536-3546 (1991)), 34 kDa Treponema pallidum surface antigen protein (Infection and Immuni
ty 57 (11), 3314-3323 (1989)), 17 kDa Treponema pallidum surface antigen protein (Infection and Immunity 6
1,1202-1210 (1993)), 15 kDa Treponema pallidum surface antigen protein (Molecular Microbiology 4,1371-1).
379 (1990)), and any of them can be used. Among these, a 47 kDa surface antigen protein, a 17 kDa surface antigen protein, and a 15 kDa surface antigen protein, which are considered to be major surface antigen proteins of Treponema pallidum, are preferred.
Among them, the surface antigen protein of 47 kDa is the main antigen.
【００１６】本発明の免疫学的診断試薬において、上記
の梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク質のように、一
つの細菌、ウイルス又はガン細胞などに対して、複数の
抗原タンパク質が公知となっているものの場合、複数の
抗原タンパク質の各々について融合タンパク質を作成
し、それらを適当な比率で混合して不溶性担体に担持さ
せてもよいし、または各々を不溶性担体に担持させた
後、適当な比率で混合してもよい。In the immunological diagnostic reagent of the present invention, in the case where a plurality of antigen proteins are known for one bacterium, virus or cancer cell, such as the above-mentioned surface antigen protein of Treponema pallidum, A fusion protein may be prepared for each of a plurality of antigen proteins and mixed at an appropriate ratio to be supported on an insoluble carrier, or after each of them is supported on an insoluble carrier, mixed at an appropriate ratio. You may.
【００１７】本発明で用いられる不溶性担体としては、
例えば、有機高分子粒子、微生物、血球、細胞膜片など
が挙げられる。The insoluble carrier used in the present invention includes:
For example, organic polymer particles, microorganisms, blood cells, cell membrane fragments and the like can be mentioned.
【００１８】上記有機高分子粒子としては、例えば、不
溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなど
の天然高分子粒子；ポリスチレン、スチレン−スチレン
スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共
重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重
合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸
ビニル−アクリル酸エステル共重合体などの合成高分子
粒子等が挙げられ、特に合成高分子粒子を均一に懸濁さ
せたラテックスが好ましく、特に、ポリスチレン、スチ
レン−スチレンスルホン酸（塩）共重合体又はスチレン
−メタクリル酸共重合体粒子が好ましい。Examples of the organic polymer particles include natural polymer particles such as insoluble agarose, cellulose, and insoluble dextran; polystyrene, styrene-styrenesulfonic acid (salt) copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, acrylonitrile -Synthetic polymer particles such as butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, vinyl acetate-acrylate copolymer, etc. Latex is preferred, and polystyrene, styrene-styrenesulfonic acid (salt) copolymer particles or styrene-methacrylic acid copolymer particles are particularly preferred.
【００１９】上記ラテックス粒子を用いる場合、粒径
は、０．１〜１．０μｍが好ましく、０．１〜０．５μ
ｍがより好ましい。When the latex particles are used, the particle size is preferably from 0.1 to 1.0 μm, more preferably from 0.1 to 0.5 μm.
m is more preferred.
【００２０】上記不溶性担体への融合タンパク質の担持
方法としては、物理化学的吸着を利用する方法、化学反
応により結合させる方法などが挙げられる。Examples of the method for supporting the fusion protein on the insoluble carrier include a method utilizing physicochemical adsorption and a method of binding by a chemical reaction.
【００２１】上記化学反応を利用する方法としては、例
えば、水溶性カルボジイミドを用いて縮合反応にて結合
させる方法が挙げられる。この場合は、不溶性担体を懸
濁した懸濁液と融合タンパク質溶液とを混合したもの
に、水溶性カルボジイミド溶液を添加する。これを攪拌
することにより容易にペプチド結合を形成する架橋反応
が起こり、不溶性担体と融合タンパク質を結合すること
ができる。なお、この場合は、不溶性担体表面にカルボ
キシル基が存在するものでなければならない。このよう
な不溶性担体としては、例えば、スチレン−メタクリル
酸共重合体からなるラテックス粒子等が好ましい。As a method utilizing the above-mentioned chemical reaction, for example, there is a method of bonding by a condensation reaction using a water-soluble carbodiimide. In this case, a water-soluble carbodiimide solution is added to a mixture of the suspension in which the insoluble carrier is suspended and the fusion protein solution. By stirring the mixture, a crosslinking reaction for easily forming a peptide bond occurs, and the insoluble carrier and the fusion protein can be bound. In this case, a carboxyl group must be present on the surface of the insoluble carrier. As such an insoluble carrier, for example, latex particles composed of a styrene-methacrylic acid copolymer are preferable.
【００２２】上記スチレン−メタクリル酸共重合体から
なるラテックス粒子を用いる場合、そのカルボキシル基
の量は、表面荷電が０．０３〜０．７５ｍｅｑＣＯＯ-
／ｇが好ましく、０．０５〜０．４０ｍｅｑＣＯＯ- ／
ｇがより好ましい。[0022] The styrene - When using the latex particles consisting of methacrylic acid copolymer, the amount of the carboxyl groups, the surface charge 0.03～0.75MeqCOO -
/ G is preferable, and 0.05 to 0.40 meqCOO − /
g is more preferred.
【００２３】上記縮合反応を用いる場合、ラテックス粒
子と融合タンパク質の間に、適当なスペーサーを介して
結合させることもできる。このようなスペーサーとして
は、β−アミノアラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノ
カプロン酸、グルタミン酸などのアミノ酸が好ましい。When the above-mentioned condensation reaction is used, the latex particles and the fusion protein can be bound via an appropriate spacer. As such a spacer, amino acids such as β-aminoalanine, γ-aminobutyric acid, ε-aminocaproic acid, and glutamic acid are preferable.
【００２４】上記水溶性カルボジイミドとしては、例え
ば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣという）、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジ
イミドメト−ｐ−トルエンスルホネート、１−エチル−
３−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド過
塩素酸塩などが挙げられるが、水への溶解度、反応性な
どの点からＥＤＣが好ましい。The water-soluble carbodiimide is, for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)
Carbodiimide hydrochloride (hereinafter referred to as EDC), 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide meth-p-toluenesulfonate, 1-ethyl-
Examples thereof include 3- (3-diethylaminopropyl) carbodiimide perchlorate, and EDC is preferred from the viewpoint of solubility in water, reactivity, and the like.
【００２５】上記ＥＤＣを用いる場合、反応液中のＥＤ
Ｃ濃度は、低くなると十分に反応が進行しなくなり、高
くなるとＥＤＣが溶解せずに析出するので５〜３０％
（ｗ／ｖ）が好ましい。When the above EDC is used, ED in the reaction solution is used.
When the C concentration is low, the reaction does not proceed sufficiently, and when the C concentration is high, EDC precipitates without dissolving.
(W / v) is preferred.
【００２６】上記ＥＤＣによる反応の反応温度は、低く
なると十分に反応が進行しなくなり、高くなると抗原タ
ンパク質が変性して抗原性を失ってしまう恐れがあるの
で、０℃〜４０℃が好ましい。The reaction temperature of the above EDC reaction is preferably 0 ° C. to 40 ° C., as the reaction may not proceed sufficiently if the temperature is low, and the antigen protein may be denatured and lose antigenicity if the temperature is high.
【００２７】不溶性担体への融合タンパク質の物理吸着
を利用する方法の場合、不溶性担体と融合タンパク質と
を溶液中で接触させることにより、抗原タンパク質と不
溶性担体の荷電により容易に吸着が起こる。In the case of the method utilizing physical adsorption of the fusion protein to the insoluble carrier, by bringing the insoluble carrier and the fusion protein into contact in a solution, the adsorption easily occurs due to the charge of the antigen protein and the insoluble carrier.
【００２８】上記吸着反応の反応温度は、低くなると十
分に反応が進行しなくなり、高くなると抗原タンパク質
またはマルトース結合タンパク質の立体構造が変化した
り、分解する恐れがあるので、０℃〜４０℃が好まし
い。When the reaction temperature of the above adsorption reaction is low, the reaction does not proceed sufficiently, and when the reaction temperature is high, the steric structure of the antigen protein or the maltose binding protein may change or decompose. preferable.
【００２９】本発明の免疫学的診断試薬は、検体と混合
されて使用されることにより、測定対象である検体中の
抗体と、本発明の試薬の抗原タンパク質との抗原抗体反
応に基づいて上記抗体を測定することができる。[0029] The immunological diagnostic reagent of the present invention is used by being mixed with a sample, whereby the above-mentioned immunological diagnostic reagent is used based on the antigen-antibody reaction between the antibody in the sample to be measured and the antigen protein of the reagent of the present invention. Antibodies can be measured.
【００３０】上記の抗原抗体反応に際しては、検体を、
ｐＨ５．０〜９．０の緩衝液を用いて希釈してもよい。
上記の検体の希釈液としては、例えば、リン酸緩衝液、
グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液などが挙げられる。In the above antigen-antibody reaction, the specimen is
It may be diluted with a buffer having a pH of 5.0 to 9.0.
Examples of the diluent for the above-mentioned specimen include a phosphate buffer,
Glycine buffer, veronal buffer, borate buffer, citrate buffer and the like can be mentioned.
【００３１】上記検体希釈液には、測定感度の向上、及
び抗原抗体反応の促進を目的として種々の増感剤を添加
することができる。上記増感剤としては、例えば、特開
平２−１７３５６７号公報に記載されたメチルセルロー
ス、エチルセルロースなどのアルキル化多糖類、特開平
５−１８０８３８号公報に記載されたプルラン、ポリビ
ニルピロリドンなどが挙げられる。Various sensitizers can be added to the sample diluent for the purpose of improving the measurement sensitivity and promoting the antigen-antibody reaction. Examples of the sensitizer include alkylated polysaccharides such as methylcellulose and ethylcellulose described in JP-A-2-173567, pullulan and polyvinylpyrrolidone described in JP-A-5-180838.
【００３２】また、上記検体希釈液には、検体中に存在
する他の物質により起こる非特異反応抑制を目的とし
て、牛血清アルブミン、卵性アルブミンなどを添加する
こともできる。In addition, bovine serum albumin, ovalbumin and the like can be added to the sample diluent for the purpose of suppressing non-specific reactions caused by other substances present in the sample.
【００３３】本発明の免疫学的診断試薬によって、検体
中の抗体を測定する際の測定系としては、例えば、前記
不溶性担体と検体中の抗体との反応による前記不溶性担
体の凝集の程度を測定するものが挙げられ、特に、不溶
性担体としてラテックス粒子を用いるラテックス凝集反
応系が好ましい。As a measurement system for measuring an antibody in a sample using the immunological diagnostic reagent of the present invention, for example, the degree of aggregation of the insoluble carrier due to the reaction between the insoluble carrier and the antibody in the sample is measured. In particular, a latex agglutination reaction system using latex particles as an insoluble carrier is preferred.
【００３４】上記反応により生じた凝集を測定する方法
としては、凝集の程度を光学的に観察する方法あるいは
目視により観察する方法などが挙げられる。As a method of measuring the agglutination generated by the above reaction, a method of optically observing the degree of agglutination or a method of visually observing the degree of agglutination may be mentioned.
【００３５】具体的には、光学的に観察する方法におい
ては、検体を検体希釈液で希釈した液に、本発明の免疫
学的診断試薬を含有する液（通常、リン酸緩衝液、グリ
シン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン
酸緩衝液など）を混合した後、該混合液の散乱光強度、
吸光度又は透過光強度を測定する。測定の波長は３００
〜２４００ｎｍが使用でき、測定方法は公知の方法に従
い、用いる不溶性担体の粒径、濃度、反応時間によって
散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加もしくは減
少を測定する。またこれらの方法は単独で用いられても
併用されてもよい。Specifically, in the optical observation method, a solution containing the immunological diagnostic reagent of the present invention (usually phosphate buffer, glycine buffer) is added to a solution obtained by diluting a sample with a sample diluent. Liquid, veronal buffer, borate buffer, citrate buffer, etc.), and then the scattered light intensity of the mixture,
Measure absorbance or transmitted light intensity. Measurement wavelength is 300
２2400 nm can be used, and the increase or decrease in scattered light intensity, absorbance, or transmitted light intensity is measured according to the particle size, concentration, and reaction time of the insoluble carrier to be used, according to a known method. These methods may be used alone or in combination.
【００３６】目視により観察する方法においては、通
常、検体と本発明の免疫学的診断試薬を含む液を判定板
上で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定する。
判定には単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメラで撮
影し画像処理を施すことによって判定することもでき
る。In the method of visual observation, usually, a sample and a solution containing the immunological diagnostic reagent of the present invention are mixed on a determination plate, shaken, and then the presence or absence of aggregation is determined.
The determination can be made not only by the naked eye but also by photographing with a video camera and performing image processing.
【００３７】前記抗原抗体反応は通常の条件で行われ、
反応媒体としては、例えば、上記のように、リン酸緩衝
液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液等が用いられる。
反応時のｐＨは、４．５〜１０．０が好ましく、さらに
好ましくは５．８〜８．０である。反応時の温度は、０
〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０℃で
ある。反応時間は適宜決められる。The antigen-antibody reaction is performed under normal conditions.
As the reaction medium, for example, a phosphate buffer, a citrate buffer, a glycine buffer and the like are used as described above.
The pH during the reaction is preferably from 4.5 to 10.0, more preferably from 5.8 to 8.0. The temperature during the reaction is 0
To 50 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. The reaction time is appropriately determined.
【００３８】[0038]
【発明の実施の形態】本発明を実施例につき述べ、その
効果を具体的に説明する。 実施例１（化学結合法による診断試薬の作成） （１）梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原とマルトース結
合タンパク質との融合タンパク質の調製 トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサ
ギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパ
リダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出してＤＮＡラ
イブラリーを作成した。すでに４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ
配列は既知であるので、それをもとにＤＮＡ合成装置を
用いてプライマーを作成した。このプライマーを用いて
ＰＣＲ法により、先に作成したＤＮＡライブラリーを用
いて４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ断片を得た。次に、マルト
ース結合タンパク質との融合タンパク質を発現するため
に作られたプラスミドベクターｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ社製）に、上記のＤＮＡ断
片を挿入し、ｐＭＡＬ−４７ｋと命名した。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described with reference to embodiments, and its effects will be specifically described. Example 1 (Preparation of Diagnostic Reagent by Chemical Bonding Method) (1) Preparation of Fusion Protein of Treponema pallidum 47 kDa Antigen and Maltose Binding Protein Crushed rabbit testes of Treponema Pallidum subculture (manufactured by Tokiwa Chemical Co., Ltd.) Thus, Treponema pallidum cells were extracted, and genomic DNA was extracted to prepare a DNA library. Already DNA of 47kDa antigen
Since the sequence is known, primers were prepared based on the sequence using a DNA synthesizer. A DNA fragment of a 47 kDa antigen was obtained by PCR using the primers and the DNA library prepared above. Next, a plasmid vector pMAL-c2 (New) was constructed to express a fusion protein with a maltose binding protein.
(England Biola), and the DNA fragment was inserted and named pMAL-47k.
【００３９】次に、ｐＭＡＬ−４７ｋを大腸菌に導入
し、培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）チオ
ガラクトピラノシドを加えることにより、４７ｋＤａ抗
原とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質の発
現を誘導した。十分に融合タンパク質が発現した大腸菌
を超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により細胞
膜、核などを除いた上清を、アミロース樹脂（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ社製）に通し、融合タンパ
ク質を吸着させた。十分にカラムを洗浄した後、融合タ
ンパク質を１０ｍＭマルトース溶液により溶出させた。
次に、溶出液をリン酸緩衝食塩水（以下、ＰＢＳとい
う。食塩の濃度０．９重量％、ｐＨ７．４）で透析する
ことにより、過剰のマルトースを除去し、トレポネーマ
パリダム４７ｋＤａ抗原とマルトース結合タンパク質と
の融合タンパク質を得た。Next, pMAL-47k was introduced into E. coli and cultured. By adding isopropyl-β-(−) thiogalactopyranoside to the culture solution, the expression of a fusion protein of the 47 kDa antigen and the maltose binding protein was induced. Escherichia coli in which the fusion protein was sufficiently expressed was disrupted by sonication, and the supernatant from which cell membranes, nuclei, etc. had been removed by centrifugation was purified using an amylose resin (New
(England Biola) to adsorb the fusion protein. After washing the column thoroughly, the fusion protein was eluted with a 10 mM maltose solution.
Next, the eluate was dialyzed against a phosphate buffered saline (hereinafter, referred to as PBS; a salt concentration of 0.9% by weight, pH 7.4) to remove excess maltose, and to prepare a 47 kDa antigen of Treponema pallidum and maltose. A fusion protein with the binding protein was obtained.
【００４０】（２）免疫学的梅毒診断試薬の調製 スチレン−メタクリル酸共重合体ラテックス〔カルボキ
シル基０．２５ｍｅｑＣＯＯ- ／ｇ、粒径０．４μｍ、
積水化学工業社製、１０％（ｗ／ｖ）〕０．２ｍｌに、
ｐＨ６．８の５０ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢ緩衝液
という）にＥＤＣを３０％（ｗ／ｖ）の割合で溶解した
溶液を１ｍｌ加え、室温で５時間攪拌した。遠心分離に
より未反応のＥＤＣを除去し、ＰＢ緩衝液で２回洗浄
後、２ｍｌのｐＨ９．０の１００ｍＭホウ酸緩衝液（以
下、ＢＢ緩衝液という）に懸濁した。この懸濁液に、上
記（１）で得られた融合タンパク質溶液１００μｌ（融
合タンパク質濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加し、室温で
１２時間攪拌した。遠心分離により未反応の融合タンパ
ク質を除去し、ＢＢ緩衝液で２回洗浄後、牛血清アルブ
ミンを１％（ｗ／ｖ）含むＰＢＳ４ｍｌに懸濁し、本発
明の免疫学的梅毒診断試薬を得た。(2) Preparation of immunological diagnostic reagent for syphilis Styrene-methacrylic acid copolymer latex [carboxyl group 0.25 meq COO − / g, particle size 0.4 μm,
Sekisui Chemical Co., Ltd., 10% (w / v)] 0.2 ml,
One ml of a solution in which EDC was dissolved at a ratio of 30% (w / v) in 50 mM phosphate buffer (hereinafter referred to as PB buffer) at pH 6.8 was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. Unreacted EDC was removed by centrifugation, washed twice with PB buffer, and suspended in 2 ml of 100 mM borate buffer (pH 9.0) (hereinafter referred to as BB buffer). To this suspension was added 100 μl of the fusion protein solution obtained in the above (1) (fusion protein concentration: 100 μg / ml), and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours. Unreacted fusion protein was removed by centrifugation, washed twice with BB buffer, and suspended in 4 ml of PBS containing 1% (w / v) of bovine serum albumin to obtain an immunological syphilis diagnostic reagent of the present invention. .
【００４１】実施例２ 実施例１における梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原の代
わりに、梅毒トレポネーマ１５ｋＤａ抗原としたことの
他は、実施例１と同様に操作して、本発明の免疫学的梅
毒診断試薬を得た。Example 2 The immunological syphilis diagnostic reagent of the present invention was obtained in the same manner as in Example 1, except that the Treponema pallidum 15 kDa antigen was used in place of the Treponema pallidum 47 kDa antigen in Example 1. Was.
【００４２】比較例１ （１）梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原とＧＳＴとの融
合タンパク質の調製 実施例１の（１）と同様にして、４７ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合タンパク質を発現
するために作られたプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ
−３（ファルマシア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入
し、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−４７ｋと命名した。Comparative Example 1 (1) Preparation of Fusion Protein of Treponema pallidum 47 kDa Antigen and GST In the same manner as in (1) of Example 1, DN of the 47 kDa antigen
A fragment was obtained. Next, a plasmid vector pGEX-4T made to express a fusion protein with GST
-3 (manufactured by Pharmacia), and the DNA fragment was inserted and named pGEX-4T-3-47k.
【００４３】次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−４７ｋを大腸
菌に導入し、培養した。培養液にイソプロピル−β−
（−）−チオガラクトピラノシドを加えることにより、
４７ｋＤａ抗原とＧＳＴとの融合タンパク質の発現を誘
導した。十分に融合タンパク質が発現した大腸菌を超音
波処理により菌体を破砕し、遠心分離により細胞膜、核
などを除いた上清に、グルタチオンセファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）を加え、４℃で一晩ゆるやかに振
とうし、融合タンパク質をグルタチオンセファロース４
Ｂに吸着させた。遠心分離により融合タンパク質が吸着
したグルタチオンセファロース４Ｂを回収し、これをカ
ラムに充填した。数回洗浄の後、グルタチオン溶液を流
すことにより融合タンパク質がグルタチオンセファロー
ス４Ｂから遊離し溶出した。溶出液をＰＢＳで透析する
ことにより、過剰のグルタチオンを除去し、融合タンパ
ク質を得た。Next, pGEX-4T-3-47k was introduced into E. coli and cultured. Isopropyl-β-
By adding (−)-thiogalactopyranoside,
The expression of a fusion protein of the 47 kDa antigen and GST was induced. Escherichia coli in which the fusion protein has been sufficiently expressed is disrupted by sonication, and the supernatant from which cell membranes, nuclei, etc. have been removed by centrifugation is added to glutathione Sepharose 4B.
(Manufactured by Pharmacia) and gently shake at 4 ° C. overnight, and glutathione Sepharose 4
B. Glutathione Sepharose 4B to which the fusion protein had been adsorbed was collected by centrifugation, and packed into a column. After washing several times, the fusion protein was released and eluted from glutathione sepharose 4B by flowing a glutathione solution. The eluate was dialyzed against PBS to remove excess glutathione and obtain a fusion protein.
【００４４】（２）免疫学的梅毒診断試薬の調製 実施例１の（２）における、４７ｋＤａ抗原とマルトー
ス結合タンパク質との融合タンパク質の代わりに、上記
（１）で得られた４７ｋＤａ抗原とＧＳＴとの融合タン
パク質を用いたことの他は、実施例１の（２）と同様に
操作して、免疫学的梅毒診断試薬を得た。(2) Preparation of Immunological Syphilis Diagnostic Reagent In place of the fusion protein of 47 kDa antigen and maltose binding protein in (2) of Example 1, the 47 kDa antigen obtained in (1) and GST were used. The procedure of Example 1 (2) was repeated, except that the fusion protein was used to obtain an immunological syphilis diagnostic reagent.
【００４５】比較例２ 比較例１における梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原の代
わりに、梅毒トレポネーマ１５ｋＤａ抗原としたことの
他は、比較例１と同様に操作して、免疫学的梅毒診断試
薬を得た。Comparative Example 2 An immunological syphilis diagnostic reagent was obtained in the same manner as in Comparative Example 1, except that the Treponema pallidum 15 kDa antigen was used instead of the Treponema pallidum 47 kDa antigen in Comparative example 1.
【００４６】比較例３ （１）４７ｋＤａ抗原の精製 実施例１の（１）で作成したトレポネーマパリダム４７
ｋＤａ抗原とマルトース結合タンパク質との融合タンパ
ク質溶液５ｍｌ（融合タンパク質濃度１００μｇ／ｍ
ｌ）に、１０ｕｎｉｔｓのウシ由来ファクターＸａを添
加し、３７℃で１２時間反応させ４７ｋＤａ抗原とマル
トース結合タンパク質を切断した。次に、アミロース樹
脂カラムに通し、マルトース結合タンパク質を除去し
た。このようにして４７ｋＤａ抗原を精製した。Comparative Example 3 (1) Purification of 47 kDa Antigen Treponema pallidum 47 prepared in (1) of Example 1
5 ml of a fusion protein solution of kDa antigen and maltose binding protein (fusion protein concentration 100 μg / m
To l), 10 units of bovine factor Xa were added and reacted at 37 ° C. for 12 hours to cleave the 47 kDa antigen and maltose binding protein. Next, the protein was passed through an amylose resin column to remove maltose-bound protein. Thus, the 47 kDa antigen was purified.
【００４７】（２）免疫学的梅毒診断試薬の調製 実施例１の（２）における、４７ｋＤａ抗原とマルトー
ス結合タンパク質との融合タンパク質の代わりに、上記
（１）で得られた４７ｋＤａ抗原を用いたことの他は、
実施例１の（２）と同様に操作して、免疫学的梅毒診断
試薬を得た。(2) Preparation of immunological syphilis diagnostic reagent The 47 kDa antigen obtained in (1) above was used in place of the fusion protein of 47 kDa antigen and maltose binding protein in (2) of Example 1. Other than that,
By operating in the same manner as in Example 1 (2), an immunological syphilis diagnostic reagent was obtained.
【００４８】比較例４ 比較例３の（１）における、実施例１の（１）で作成し
た４７ｋＤａ抗原とマルトース結合タンパク質との融合
タンパク質の代わりに、実施例２で作成した１５ｋＤａ
抗原とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質を
用いたことの他は、比較例３と同様に操作して、免疫学
的梅毒診断試薬を得た。Comparative Example 4 In place of the fusion protein of the 47 kDa antigen and the maltose binding protein prepared in (1) of Example 1 in (1) of Comparative Example 3, the 15 kDa prepared in Example 2 was used.
An immunological syphilis diagnostic reagent was obtained in the same manner as in Comparative Example 3, except that a fusion protein of an antigen and a maltose binding protein was used.
【００４９】実施例３（物理吸着法による診断試薬の作
成） 実施例１の（１）で作成した４７ｋＤａ抗原とマルトー
ス結合タンパク質との融合タンパク質の溶液（融合タン
パク質濃度１００μｇ／ｍｌ）１００μｌを、ポリスチ
レンラテックス（平均粒径０．４μｍ、固形分１０％
（ｗ／ｖ）、積水化学工業社製）１００μｌに添加し、
４℃で１時間攪拌した。次いで、牛血清アルブミン（以
下、ＢＳＡという）を１％（ｗ／ｖ）含有するｐＨ７．
４の１００ｍＭリン酸緩衝液（以下、１００ｍＭＰＢ緩
衝液という）を２ｍｌ添加し、１．５時間攪拌した。こ
の液を１０℃で３０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分離
した。得られた沈殿物に、ＢＳＡを０．２５％（ｗ／
ｖ）含有する１００ｍＭＰＢ緩衝液５ｍｌを添加し、ラ
テックス粒子を懸濁させ、融合タンパク質担持ラテック
スを調製し、本発明の免疫学的梅毒診断試薬を得た。Example 3 (Preparation of Diagnostic Reagent by Physical Adsorption Method) 100 μl of a solution (fusion protein concentration: 100 μg / ml) of the fusion protein of the 47 kDa antigen and maltose binding protein prepared in Example 1 (1) was added to polystyrene. Latex (average particle size 0.4 μm, solid content 10%
(W / v), manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.)
Stirred at 4 ° C. for 1 hour. Next, pH7 containing 1% (w / v) of bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA).
2 ml of 100 mM phosphate buffer (hereinafter referred to as 100 mM MPB buffer) was added and stirred for 1.5 hours. This solution was centrifuged at 18000 rpm for 30 minutes at 10 ° C. 0.25% of BSA (w /
v) 5 ml of a 100 mM MPB buffer solution was added, and the latex particles were suspended to prepare a fusion protein-carrying latex, thereby obtaining an immunological syphilis diagnostic reagent of the present invention.
【００５０】実施例４ 実施例３における、実施例１の（１）で作成した４７ｋ
Ｄａ抗原とマルトース結合タンパク質との融合タンパク
質の代わりに、実施例２で作成した１５ｋＤａ抗原とマ
ルトース結合タンパク質との融合タンパク質を用いたこ
との他は、実施例３と同様に操作して、本発明の免疫学
的梅毒診断試薬を得た。Example 4 In Example 3, 47k prepared in (1) of Example 1 was used.
The present invention was carried out in the same manner as in Example 3, except that the fusion protein of the 15 kDa antigen and the maltose binding protein prepared in Example 2 was used instead of the fusion protein of the Da antigen and maltose binding protein. Diagnostic reagents for immunological syphilis were obtained.
【００５１】比較例５ 実施例３における、実施例１の（１）で作成した４７ｋ
Ｄａ抗原とマルトース結合タンパク質との融合タンパク
質の代わりに、比較例１の（１）で作成した４７ｋＤａ
抗原とＧＳＴとの融合タンパク質を用いたことの他は、
実施例３と同様に操作して、免疫学的梅毒診断試薬を得
た。Comparative Example 5 In Example 3, 47k prepared in (1) of Example 1 was used.
Instead of the fusion protein of the Da antigen and the maltose binding protein, the 47 kDa prepared in (1) of Comparative Example 1 was used.
Other than using a fusion protein of antigen and GST,
By operating in the same manner as in Example 3, an immunological syphilis diagnostic reagent was obtained.
【００５２】比較例６ 実施例３における、実施例１の（１）で作成した４７ｋ
Ｄａ抗原とマルトース結合タンパク質との融合タンパク
質の代わりに、比較例２で作成した１５ｋＤａ抗原とＧ
ＳＴとの融合タンパク質を用いたことの他は、実施例３
と同様に操作して、免疫学的梅毒診断試薬を得た。Comparative Example 6 In Example 3, 47k produced in (1) of Example 1 was used.
Instead of the fusion protein of Da antigen and maltose binding protein, the 15 kDa antigen prepared in Comparative Example 2 and G
Example 3 except that a fusion protein with ST was used.
In the same manner as described above, an immunological syphilis diagnostic reagent was obtained.
【００５３】比較例７ 実施例３における、実施例１の（１）で作成した４７ｋ
Ｄａ抗原とマルトース結合タンパク質との融合タンパク
質の代わりに、比較例３の（１）で作成した４７ｋＤａ
抗原を用いたことの他は、実施例３と同様に操作して、
免疫学的梅毒診断試薬を得た。Comparative Example 7 In Example 3, 47k prepared in (1) of Example 1 was used.
The 47 kDa prepared in Comparative Example 3 (1) was used instead of the fusion protein of the Da antigen and the maltose binding protein.
Except that the antigen was used, the same operation as in Example 3 was performed.
An immunological syphilis diagnostic reagent was obtained.
【００５４】比較例８ 実施例３における、実施例１の（１）で作成した４７ｋ
Ｄａ抗原とマルトース結合タンパク質との融合タンパク
質の代わりに、比較例４で作成した１５ｋＤａ抗原を用
いたことの他は、実施例３と同様に操作して、免疫学的
梅毒診断試薬を得た。Comparative Example 8 In Example 3, 47k produced in (1) of Example 1
An immunological syphilis diagnostic reagent was obtained in the same manner as in Example 3, except that the 15 kDa antigen prepared in Comparative Example 4 was used instead of the fusion protein of the Da antigen and the maltose binding protein.
【００５５】感度の測定 実施例１〜４で得られた本発明の免疫学的梅毒診断試
薬、及び比較例１〜８で得られた免疫学的梅毒診断試薬
について、以下のようにして感度を測定した。生化学自
動分析装置（日立７０５０形、日立製作所社製）によ
り、０、５０、１００、２５０、５００各タイターユニ
ット（以下、Ｔ．Ｕ．と略す）の標準梅毒トレポネーマ
陽性血清からなる標準液を測定した。測定条件は、温度
３７℃、波長５７０ｎｍとした。測定方法は、上記標準
液２０μｌを分注後、直ちに検体希釈液（梅毒診断用試
薬「メディエースＴＰＬＡ」（積水化学工業社製）に含
まれているものを用いた。）３５０μｌを添加・混合
し、次いで上記免疫学的梅毒診断試薬の５０μｌを添加
・混合した。反応量は、上記免疫学的梅毒診断試薬添加
後８０秒から３２０秒の間の吸光度変化量とした。この
吸光度変化量を１００００倍した値と標準血清のＴ．
Ｕ．との関係を図１（実施例１、比較例１と比較例
３）、図２（実施例２、比較例２と比較例４）、図３
（実施例３、比較例５と比較例７）及び図４（実施例
４、比較例６と比較例８）に示した。Measurement of Sensitivity The sensitivity of the immunological syphilis diagnostic reagent of the present invention obtained in Examples 1 to 4 and the immunological syphilis diagnostic reagents obtained in Comparative Examples 1 to 8 was determined as follows. It was measured. Using a biochemical automatic analyzer (Hitachi 7050, manufactured by Hitachi, Ltd.), a standard solution consisting of a standard treponema-positive serum of 0, 50, 100, 250, 500 titer units (hereinafter abbreviated as TU) was prepared. It was measured. The measurement conditions were a temperature of 37 ° C. and a wavelength of 570 nm. As a measurement method, after dispensing 20 μl of the above-mentioned standard solution, 350 μl of a sample diluent (the one contained in a reagent for diagnosis of syphilis “MEDIACE TPLA” (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) was used) was immediately added and mixed Then, 50 μl of the immunological syphilis diagnostic reagent was added and mixed. The reaction amount was the change in absorbance between 80 seconds and 320 seconds after the addition of the immunological syphilis diagnostic reagent. The value obtained by multiplying the absorbance change by 10,000 times and the T.V.
U. 1 (Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 3), FIG. 2 (Example 2, Comparative Example 2 and Comparative Example 4), and FIG.
(Example 3, Comparative Example 5, and Comparative Example 7) and FIG. 4 (Example 4, Comparative Example 6, and Comparative Example 8).
【００５６】[0056]
【発明の効果】請求項１記載の免疫学的診断試薬の構成
は上記の通りであり、抗原タンパク質とマルトース結合
タンパク質との融合タンパク質が不溶性担体に担持され
ているので、抗原タンパク質とグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼとの融合タンパク質が不溶性担体に担持
されている免疫学的診断試薬に比べて、融合タンパク質
の水溶性が高く、より感度の高い免疫学的診断試薬を提
供する。請求項２記載の免疫学的診断試薬の構成は上記
の通りであり、梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク質
とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質が不溶
性担体に担持されているので、梅毒トレポネーマの表面
抗原タンパク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼとの融合タンパク質が不溶性担体に担持されている免
疫学的診断試薬に比べて、融合タンパク質の水溶性が高
く、より感度の高い免疫学的診断試薬を提供する。請求
項３記載の免疫学的診断試薬の構成は上記の通りであ
り、不溶性担体が、ポリスチレン、スチレン−スチレン
スルホン酸（塩）共重合体又はスチレン−メタクリル酸
共重合体であるので、より感度の高い免疫学的診断試薬
を提供する。The structure of the immunological diagnostic reagent according to the first aspect is as described above. Since the fusion protein of the antigen protein and the maltose binding protein is supported on an insoluble carrier, the antigen protein and glutathione-S -The present invention provides an immunological diagnostic reagent having higher solubility in a fusion protein and higher sensitivity than an immunological diagnostic reagent in which a fusion protein with transferase is carried on an insoluble carrier. The composition of the immunological diagnostic reagent according to claim 2 is as described above, and the fusion protein of the surface antigen protein of Treponema pallidum and the maltose binding protein is supported on an insoluble carrier. The present invention provides an immunological diagnostic reagent having a higher solubility in a fusion protein and higher sensitivity than an immunological diagnostic reagent in which a fusion protein with glutathione-S-transferase is carried on an insoluble carrier. The configuration of the immunological diagnostic reagent according to claim 3 is as described above, and the insoluble carrier is polystyrene, a styrene-styrenesulfonic acid (salt) copolymer or a styrene-methacrylic acid copolymer, so that the sensitivity is higher. To provide an immunological diagnostic reagent having a high
【図１】実施例１、比較例１及び比較例３の感度測定の
結果を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results of sensitivity measurements of Example 1, Comparative Examples 1 and 3.
【図２】実施例２、比較例２及び比較例４の感度測定の
結果を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the results of sensitivity measurement of Example 2, Comparative Example 2, and Comparative Example 4.
【図３】実施例３、比較例５及び比較例７の感度測定の
結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the results of sensitivity measurement of Example 3, Comparative Example 5, and Comparative Example 7.
【図４】実施例４、比較例６及び比較例８の感度測定の
結果を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the results of sensitivity measurement of Example 4, Comparative Example 6, and Comparative Example 8.
Claims (3)
ルトース結合タンパク質との融合タンパク質が、不溶性
担体に担持されていることを特徴とする免疫学的診断試
薬。An immunodiagnostic reagent characterized in that a fusion protein of an antigen protein and maltose binding protein, which is diagnostically useful, is carried on an insoluble carrier.
面抗原タンパク質である請求項１記載の免疫学的診断試
薬。2. The immunological diagnostic reagent according to claim 1, wherein the antigen protein is a surface antigen protein of Treponema pallidum.
−スチレンスルホン酸（塩）共重合体又はスチレン−メ
タクリル酸共重合体からなるラテックス粒子である請求
項１又は２記載の免疫学的診断試薬。3. The immunological diagnostic reagent according to claim 1, wherein the insoluble carrier is latex particles composed of polystyrene, styrene-styrenesulfonic acid (salt) copolymer or styrene-methacrylic acid copolymer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16711197A JPH1114627A (en) | 1997-06-24 | 1997-06-24 | Immunological diagnosis reagent |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP16711197A JPH1114627A (en) | 1997-06-24 | 1997-06-24 | Immunological diagnosis reagent |
Publications (1)
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|---|---|
| JPH1114627A true JPH1114627A (en) | 1999-01-22 |
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