JP3861000B2 - 走査型レーザー顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料に対してレーザー光を走査しながら照射し、試料からの反射または蛍光を検出する走査型レーザー顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
周知のように、走査型レーザー顕微鏡は、レーザー光などの点光源を対物レンズを介して試料に対しＸ、Ｙ軸方向に走査しながら照射し、試料からの蛍光または反射光の観察光を再び対物レンズ、光学系を介して光検出器で検出し、２次元の情報を得るとともに、その結果をＣＲＴなどのモニタ画面に表示することにより画像情報として観察できるようにしたものである。
【０００３】
この場合、通常、試料の画像を取得するための条件設定として、対物レンズの選択、表示画像サイズ(画面に表示する縦横のピクセル数)の設定、モニタに表示する際の走査速度の設定、レーザー光の強度の設定(レーザー光源から出射するレーザー光の強度に対する相対値)などを行うようにしている。つまり、試料の画像を取得するにあたって、これらの条件設定を行うことによって、ＸＹ軸方向にレーザー光を走査するガルバノスキャナの走査速度・振れ角、試料から発せられた蛍光、反射光を検出するサンプリング周波数などが決定され、その結果として得られた画像信号を、例えばＣＲＴなどのモニタに表示するようになっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、これまでの走査型レーザー顕微鏡では、試料から発せられる観察光を測定することにより、試料の蛍光(または反射)画像を共焦点光学系で観察することが主目的になっており、これら試料から発せられる観察光を検出する際に、試料上の１点に対してレーザー光を照射する時間、試料上でサンプリングする点と点との距離あるいは試料に与える刺激(励起)の大きさなどを積極的に設定して各種のデータを取得するようになっていない。このため、所望する分解能でのデータ取得、定量的なデータ取得、再現性のあるデータ取得などができないという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、所望する分解能でのデータ取得、定量的なデータ取得、再現性のあるデータ取得などを積極的に可能にした走査型レーザー顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、倍率の異なる複数の対物レンズと、前記複数の対物レンズの一つを選択的に観察光軸に挿入する対物レンズ切換手段と、レーザー光源と、前記レーザー光源から発せられるレーザー光の強度を調整する強度調整手段と、前記レーザー光を試料上で2次元走査する走査手段と、前記観察光軸に挿入された対物レンズの焦点面と共役な位置に配置されたピンホールと、前記ピンホールを通過した前記試料からの観察光を光電変換するフォトディテクタと、前記フォトディテクタから出力される電気信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータと、前記試料の画像取得の条件が入力される操作手段と、前記操作手段に入力された前記画像取得条件に基づいて前記対物レンズ切換手段、前記強度調整手段、走査手段および前記Ａ／Ｄコンバータを制御するとともに、前記デジタル信号から前記試料の観察画像を構築する顕微鏡制御装置と、前記顕微鏡制御装置によって構築された画像を表示するモニタと、を備えた走査型レーザー顕微鏡において、前記操作手段に入力される前記画像取得条件は、前記試料に照射される前記レーザー光の照射スポット径および照射強度であることを特徴としている。
【０００７】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記操作手段に入力される前記画像取得条件は、さらに前記レーザー光の走査範囲、前記レーザー光が前記試料の一点に照射される時間、ならびに前記観察光のサンプリング間隔の少なくとも一つであることを特徴としている。
【０００８】
請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記対物レンズに入射する前記レーザー光のビーム径を調整するズーム光学系をさらに備え、前記顕微鏡制御装置は、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポット径の条件を満たすように前記ズーム光学系を制御することを特徴としている。
【０００９】
請求項４記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記レーザー光の強度を検出するレーザーパワーモニタ手段をさらに備え、前記顕微鏡制御装置は、前記レーザーパワーモニタ手段の検出結果に基づいて前記操作手段に入カされた前記レーザー光の照射強度の条件を満たすように前記強度調整手段を制御することを特徴としている。
【００１０】
請求項５記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記顕微鏡制御装置は、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポット径の条件を満たすように前記対物レンズ切換手段を制御し、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射強度の条件を満たすように前記強度調整手段を制御し、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポットの走査範囲の条件を満たすように前記走査手段の走査幅を制御し、前記操作手段に入力された前記レーザー光の試料上の一点の照射時間の条件を満たすように前記走査手段の走査速度を制御し、前記操作手段に入力された前記画像の解像度の条件を満たすように前記Ａ／Ｄコンバータのサンプリング間隔を制御することを特徴としている。
【００１１】
この結果、本発明によれば、試料上でのレーザー光のスポット径、レーザー光の照射強度、１点あたりのレーザー光の照射時間、光データ取得ピッチ、光データ取得範囲などを任意に設定することで、これら条件設定に応じた分解能の各種のデータを取得できるので、試料へ与える刺激(励起)の制御、試料から発せられた蛍光または反射光の観察光の検出を定量的に行うことができ、定量的な測定、再現性のある測定が可能になる。
【００１２】
また、本発明によれば、ズーム光学系を設けて対物レンズの開口数（ＮＡ）を微小段階的または無段階に制御することによって試料上のレーザー光のスポット径を細かく制御することができる。
【００１３】
さらに本発明によれば、レーザーパワーモニタを設けることによって試料上に照射するレーザー光の強度をより正確に制御することができ、精度の高い定量的な測定、再現性のある測定を行うことができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１５】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示している。
【００１６】
１はレーザー光源で、このレーザー光源１から発せられたレーザー光は、強度調整手段としてのレーザーパワー制御手段２、ダイクロイックミラー３、対物レンズ４を介して試料５上にスポット状に照射される。この場合、レーザーパワー制御手段２は、レーザー光源１から発せられるレーザー光の照射強度を調整するもので、具体的には、図示しないＮＤフィルタの光路への挿脱またはＡＯＴＦ（音響光学可変波長フィルタ）によりレーザー光の照射強度を調整するようにしている。対物レンズ４は、倍率の異なるものが複数個、対物レンズ切換手段としてのレボルバ４ａに設けられており、このレボルバ４ａにより複数の対物レンズ４のうちの一つが選択的に観察光軸に挿入されるようになっている。
【００１７】
スポット状のレーザー光は、走査手段６により試料５上を走査される。この場合、走査手段６は、顕微鏡制御装置７からの操作制御信号に応じて、レーザー光を試料５上でＸＹ軸方向に２次元走査するようになっており、このとき、レーザー光を試料５上のある１点で停止させたり、所望の速度で移動させることができるようにもなっている。
【００１８】
レーザー光が照射された試料５上から発せられた蛍光または反射光の観察光は、対物レンズ４、走査手段６、ダイクロイックミラー３、対物レンズ４の焦点面と共役の位置に配置された共焦点ピンホール８を介してフォトディテクタ９に投影される。
【００１９】
フォトディテクタ９は、共焦点ピンホール８を通過した試料５からの観察光を光電変換するもので、このフォトディテクタ９で光電変換された電気信号は、顕微鏡制御装置７から発せられるサンプリングパルスに同期してＡ／Ｄコンバータ１０でデジタル信号に変換され、顕微鏡制御装置７に与えられる。
【００２０】
顕微鏡制御装置７は、受け取った信号から試料５の観察画像を構築してモニタ１１に表示するとともに、光量データを生成してグラフや表としてモニタ１１に表示するようにしている。
【００２１】
一方、操作手段１２は、顕微鏡観察者が画像(光強度データ)取得のための条件設定を行うためのもので、ここでは、
（ａ）試料５に照射するレーザー波長、
（ｂ）試料５上に形成するレーザー光のスポット径、
（ｃ）試料５に照射するレーザー光の照度強度
（ｄ）試料５上の１点に照射する時間、または、試料５上を走査するレーザー光のスポット移動速度
（ｅ）試料５から発せられた蛍光または反射光の信号をサンプリングする間隔
（ｆ）試料５上の画像(光強度データ)を取得する走査範囲、
などの条件を設定できるようになっている。
【００２２】
次に、このような条件設定に対しての処理について説明する。
【００２３】
まず、試料５に照射するレーザー波長および試料５上に形成するレーザー光のスポット径を設定すると、ここでの試料５上のレーザー光のスポット径は、対物レンズ４の開口数(ＮＡ)と使用するレーザー波長で決定されるので、これらレーザー波長とスポット径から、使用すべき対物レンズ４が決定される。つまり、操作手段１２において、試料５に照射するレーザー波長および試料５上に形成するレーザー光のスポット径を設定することで、顕微鏡制御装置７によりレーザー波長に適した対物レンズ４が決定される。この場合、決定された対物レンズ４は、レボルバ４ａにより自動的に観察光軸上に挿入されるか、または、光路上に切換えるべき対物レンズ４の種別をモニタ１１上に表示して観察者に知らせ、レボルバ４ａの手動操作により観察光軸上に挿入されるようになる。
【００２４】
次に、試料５に照射するレーザー光の照射強度を設定すると、この設定に基づいて、顕微鏡制御装置７により、レーザーパワー制御手段２の図示しないＮＤフィルタの光路への挿脱またはＡＯＴＦ（音響光学可変波長フィルタ）によりレーザー光の照射強度の調整が可能となる。
【００２５】
ここまでで、試料５上に形成されるレーザー光のスポット径とレーザー光の照射強度が決定され、試料５上の１点に照射されるレーザー光の照射強度が設定できる。
【００２６】
次に、試料上の１点に照射するレーザー光の時間を設定すると、試料５上のレーザー光のスポットの移動速度が決定される。この場合、試料５上の１点にレーザー光が照射される時間は、レーザー光のスポットがスポットの直径分だけ移動する時間に相当するので、スポット径の値とレーザー光を照射する時間とから求めることができる。試料５上の１点に照射する時間を設定する代わりに、直接レーザー光のスポットの移動速度を設定して、試料５上の１点に照射する時間を求めるようにしてもよい。そして、レーザー光のスポットが試料５上を移動する移動速度が決定されると、顕微鏡制御装置７より、例えば、ガルバノメータなどの走査手段６に対し制御信号が出力され、レーザー光のスポットを試料５上のある１点で停止させたり、ある速度で移動させる制御が可能となる。
【００２７】
次に、試料５から発せられた蛍光または反射光をサンプリングする間隔を設定すると、このサンプリング間隔により、試料５から発せられた蛍光または反射光をどのくらいの密度(解像度)で検出するかの程度が決定される。例えば、試料５上でサンプリングする点と点との距離を設定すると、この設定された距離と、レーザー光のスポットが移動する移動速度からサンプリングする時間間隔が決まるので、この時間間隔に基づいて顕微鏡制御装置７よりＡ／Ｄコンバータ１０ヘ発するサンプリシグパルスの周波数を制御することにより、取得画像の解像度を決定する。この場合、直接、蛍光または反射光を検出する時間間隔を設定することで、顕微鏡制御装置７よりＡ／Ｄコンバータ１０ヘ発するサンプリングパルスの周波数を制御するようにしてもよい。
【００２８】
そして、試料５上の画像(光強度データ)を取得する範囲を設定すると、この設定に応じて顕微鏡制御装置７により走査手段６へ発せられる走査制御信号との位相関係を制御しつつ設定されたサンプリング数だけＡ／Ｄコンバータ１０ヘサンプリングパルスが出力されるようになり、設定された走査範囲の光強度データのみが取得されるようになる。
【００２９】
その後、このように設定された画像取得条件の下で、上述したようにレーザー光源１からのレーザー光を対物レンズ４を介して試料５に対し走査手段６によりＸ、Ｙ軸方向に走査しながら照射し、試料５からの観察光を、対物レンズ４を介してフォトディテクタ９で検出する。この場合、フォトディテクタ９より取得される情報は、試料５上でのレーザー光のスポット径、レーザー光の照射強度、１点あたりのレーザー光の照射時間、光データ取得ピッチ、光データ取得範囲などを任意に設定することで、それぞれの条件設定に応じた分解能の各種データが取得できる。これにより、試料５へ与える刺激(励起)の制御、試料５から発せられた蛍光または反射光などの観察光の検出を定量的に行うことができ、定量的な測定、再現性のある測定が可能になる。
【００３０】
なお、上述では、試料５上でのレーザー光のスポット径、レーザー光の照射強度、１点あたりのレーザー光の照射時間、光データ取得ピッチ、光データ取得範囲などの画像取得条件を全て設定する例を述べたが、少なくとも試料５上でのレーザー光のスポット径、レーザー光の照射強度を設定すれば、定量的な測定、再現性のある測定は可能である。
【００３１】
(第２の実施の形態)
図２は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。
【００３２】
この場合、レーザーパワー制御手段２とダイクロイックミラー３との間の光路中にズーム光学系１３が設けられている。このズーム光学系１３は、そのズーム動作により対物レンズ４ヘ入射するレーザー光のビーム径を微小段階または無段階に制御し、対物レンズ４の開口数（ＮＡ）に対する照射光の有効開口数（ＮＡ）を制御するようにしている。
【００３３】
このようにすれば、ズーム光学系１３を設けたことによって、対物レンズ４の開口数（ＮＡ）を微小段階的または無段階に絞り込むことができる。
【００３４】
通常、対物レンズ４の開口数（ＮＡ）は、対物レンズ４の種別(倍率も含む)によって決まっており、例えば、第１の実施の形態の構成により、試料５上にレーザー光のスポット径を設定したとしても、必ずしも所望するレーザー光のスポット径が実現できるとは限らない。そこで、この第２の実施の形態では、ズーム光学系１３を設けて、対物レンズ４ヘ入射するレーザー光のビーム径を微小段階または無段階に制御し、対物レンズ４の開口数（ＮＡ）に対する照射光の有効開口数（ＮＡ）を制御することによって、試料５上のレーザー光のスポット径を細かに制御できるようにしている。これにより、試料５上でのレーザー光の照射設定に、より自由度を増すことができる。
【００３５】
なお、第２の実施の形態の変形例として、ズーム光学系１３の代わりに、開口部を可変可能にした絞りを設けることによっても、同様の制御で同様の作用効果を得ることができる。
【００３６】
(第３の実施の形態)
図３は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。
【００３７】
この場合、走査手段６と対物レンズ４との間の光路中にレーザーパワーモニタ手段１４が設けられている。このレーザーパワーモニタ手段１４は、ビームスプリッタ１４１、絞り１４２およびフォトディテクタ１４３から構成され、このうちのビームスプリッタ１４１は、レーザー光源１から対物レンズ４に入射されるレーザー光の光路中に挿入され、このビームスプリッタ１４１により対物レンズ４ヘ導入されるレーザー光の一部を折り返し、絞り１４２を介してフォトディテクタ１４３で受光するようになっている。また、フォトディテクタ１４３で検出した光強度は、電気信号に変換され顕微鏡制御装置７に伝えられる。絞り１４２は、その開口径を顕微鏡制御装置７により制御可能になっていている。この場合、絞り１４２の開口径は、対物レンズ４から出射するレーザー光の照射強度をより正確にモニタするため、対物レンズ４の瞳径に合わせて制御されるようになっている。つまり、対物レンズ４の瞳径よりレーザー光のビーム径が大きいと、レーザー光は対物レンズ４の瞳径より大きい部分の光がカットされてしまうが、対物レンズ４の瞳径の大きさに相当する絞り１４２を設げることにより、対物レンズ４が切換られても試料５に照射される光量を正確にモニタすることができる。
【００３８】
このようにすれば、レーザーパワーモニタ手段１４を設け、実際に対物レンズ４から出射しているレーザー光の照射強度をモニタするとともに、このモニタ結果をフィードバックすることができるので、観察者が設定したレーザー光の強度の値と比較し、この比較結果に応じてレーザーパワー制御手段２を制御すれば、例え、レーザー光源１から出射されるレーザー光の照射強度が変動したとしても、試料５へ照射するレーザー光の強度を、常に設定値に一致させることができる。これにより、試料５上に照射するレーザー光の照射強度を、より正確に制御できるので、さらに精度の高い定量的な測定、再現性のある測定を行うことができる。
【００３９】
なお、このレーザーパワーモニタ手段１４は、走査手段６と対物レンズ４との間の光路中に常時挿入されていても、出し入れ可能になっていてもよく、例えば、レーザー光源１から出射されるレーザー光の照射強度が小さいような場合や試料５から発せられる蛍光または反射光の強度が弱いような場合は、その減衰を防ぐため、レーザー光の強度のモニタを必要とするとき以外は、光路から外すようにすればよい。
【００４０】
また、このような第３の実施の形態の構成に、上述の第２の実施の形態で説明したズーム光学系を追加することも可能で、こうすれば、上述した第２の実施の形態の効果も期待できる。
【００４１】
(第４の実施の形態)
ところで、走査型レーザー顕微鏡は、その利用方法として、目視で試料の蛍光画像を観察するのと同様に、主に試料の形態を画像として観察する方法と、試料にある刺激を与えて、それによる変化、例えば蛍光強度の時間的変化を測定するなどの方法がある。
【００４２】
そこで、この第４の実施の形態では、各種の利用方法を考慮して、条件設定方法に、２つの設定モードを用意し、これらの設定モードを選択的に切り換え可能にしている。ここでは、第１の設定モードとして、従来の条件設定方法による画像観察モードと、第２の設定モードとして、上述した各実施の形態で説明した条件設定方法による測定モードが用いられている。
【００４３】
なお、この第４の実施の形態は、上述した第１乃至第３の実施の形態のいずれかの構成を採用したもので、ここでは、これら第１乃至第３の実施の形態の図面を援用するものとする。
【００４４】
まず、第１の設定モードの試料５の形態を画像として観察する画像観察モードの場合は、従来の条件設定、すなわち、画像を取得するための条件設定として、対物レンズ４の選択、表示画像サイズ（ピクセル数）の設定、モニタ表示する際の走査速度の設定(数段階)、レーザー光の照射強度の設定(相対値)などを設定する。すると、これらの条件設定に基づいて、ＸＹ軸方向にレーザー光を走査するガルバノスキャナの走査速度・振れ角、試料５から発せられた蛍光、反射光を検出するサンプリング周波数などが決定され、この結果として得られた試料５の観察画像がモニタ１１に表示される。
【００４５】
一方、試料５にある刺激を与えて、それによる変化を測定する測定モードの場合は、第１乃至第３の実施の形態で説明した条件設定、すなわち、試料５に照射されるレーザー光の照射強度の設定、試料５上に形成するレーザー光のスポット径の設定、試料５上を走査するレーザー光のスポットの移動連度の設定、試料５から発せられた蛍光または反射光の信号をサンプリングする問隔の設定、試料５上の画像（光強度データ）を取得する範囲の設定などを設定する。すると、これら条件設定に基づいた分解能の各種データが取得され、定量的な測定、再現性のある測定を行うことができる。
【００４６】
したがって、このようにすれば、設定モードを２つ用意することにより、様々な用途に適した条件設定を行うことができ、所望する画像観察、光強度測定を実現することができる。
【００４７】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００４８】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００４９】
本発明の実施の形態には、以下の発明も含まれる。
【００５０】
（１）倍率の異なる複数の対物レンズと、前記複数の対物レンズの一つを選択的に観察光軸に挿入する対物レンズ切換手段と、レーザー光源と、前記レーザー光源から発せられるレーザー光の強度を調整する強度調整手段と、前記レーザー光を試料上で2次元走査する走査手段と、前記観察光軸に挿入された対物レンズの焦点面と共役な位置に配置されたピンホールと、前記ピンホールを通過した前記試料からの観察光を光電変換するフォトディテクタと、前記フォトディテクタから出力される電気信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータと、前記試料の画像取得の条件が入力される操作手段と、前記操作手段に入力された前記画像取得条件に基づいて前記対物レンズ切換手段、前記強度調整手段、走査手段および前記Ａ／Ｄコンバータを制御するとともに、前記デジタル信号から前記試料の観察画像を構築する顕微鏡制御装置と、前記顕微鏡制御装置によって構築された画像を表示するモニタと、を備えた走査型レーザー顕微鏡において、
前記操作手段に入力される前記画像取得条件は、表示画像サイズおよびモニタ表示の際の走査速度を設定する画像観察モードと、前記試料に照射される前記レーザー光の照射スポット径、照射強度および走査範囲、前記レーザー光が前記試料の一点に照射される時間、ならびに前記観察光のサンプリング間隔を設定する測定モードを切換えて設定可能にしたことを特徴とする走査型レーザー顕微鏡。
【００５１】
このようにすれば、設定モードを２つ用意し、これらを選択的に適用することで、様々な用途に適した条件設定ができ、結果として所望の画像観察、光強度測定を行うことができる。
【００５２】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、所望する分解能でのデータ取得、定量的なデータ取得、再現性のあるデータ取得などを積極的に可能にした走査型レーザー顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザー光源
２…レーザーパワー制御手段
３…ダイクロイックミラー
４…対物レンズ
４ａ…レボルバ
５…試料
６…走査手段
７…顕微鏡制御装置
８…共焦点ピンホール
９…フォトディテクタ
１０…Ａ／Ｄコンバータ
１１…モニタ
１２…操作手段
１３…ズーム光学系
１４…レーザーパワーモニタ手段
１４１…ビームスプリッタ
１４２…絞り
１４３…フォトディテクタ
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料に対してレーザー光を走査しながら照射し、試料からの反射または蛍光を検出する走査型レーザー顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
周知のように、走査型レーザー顕微鏡は、レーザー光などの点光源を対物レンズを介して試料に対しＸ、Ｙ軸方向に走査しながら照射し、試料からの蛍光または反射光の観察光を再び対物レンズ、光学系を介して光検出器で検出し、２次元の情報を得るとともに、その結果をＣＲＴなどのモニタ画面に表示することにより画像情報として観察できるようにしたものである。
【０００３】
この場合、通常、試料の画像を取得するための条件設定として、対物レンズの選択、表示画像サイズ(画面に表示する縦横のピクセル数)の設定、モニタに表示する際の走査速度の設定、レーザー光の強度の設定(レーザー光源から出射するレーザー光の強度に対する相対値)などを行うようにしている。つまり、試料の画像を取得するにあたって、これらの条件設定を行うことによって、ＸＹ軸方向にレーザー光を走査するガルバノスキャナの走査速度・振れ角、試料から発せられた蛍光、反射光を検出するサンプリング周波数などが決定され、その結果として得られた画像信号を、例えばＣＲＴなどのモニタに表示するようになっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、これまでの走査型レーザー顕微鏡では、試料から発せられる観察光を測定することにより、試料の蛍光(または反射)画像を共焦点光学系で観察することが主目的になっており、これら試料から発せられる観察光を検出する際に、試料上の１点に対してレーザー光を照射する時間、試料上でサンプリングする点と点との距離あるいは試料に与える刺激(励起)の大きさなどを積極的に設定して各種のデータを取得するようになっていない。このため、所望する分解能でのデータ取得、定量的なデータ取得、再現性のあるデータ取得などができないという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、所望する分解能でのデータ取得、定量的なデータ取得、再現性のあるデータ取得などを積極的に可能にした走査型レーザー顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、倍率の異なる複数の対物レンズと、前記複数の対物レンズの一つを選択的に観察光軸に挿入する対物レンズ切換手段と、レーザー光源と、前記レーザー光源から発せられるレーザー光の強度を調整する強度調整手段と、前記レーザー光を試料上で2次元走査する走査手段と、前記観察光軸に挿入された対物レンズの焦点面と共役な位置に配置されたピンホールと、前記ピンホールを通過した前記試料からの観察光を光電変換するフォトディテクタと、前記フォトディテクタから出力される電気信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータと、前記試料の画像取得の条件が入力される操作手段と、前記操作手段に入力された前記画像取得条件に基づいて前記対物レンズ切換手段、前記強度調整手段、走査手段および前記Ａ／Ｄコンバータを制御するとともに、前記デジタル信号から前記試料の観察画像を構築する顕微鏡制御装置と、前記顕微鏡制御装置によって構築された画像を表示するモニタと、を備えた走査型レーザー顕微鏡において、前記操作手段に入力される前記画像取得条件は、前記試料に照射される前記レーザー光の照射スポット径および照射強度であることを特徴としている。
【０００７】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記操作手段に入力される前記画像取得条件は、さらに前記レーザー光の走査範囲、前記レーザー光が前記試料の一点に照射される時間、ならびに前記観察光のサンプリング間隔の少なくとも一つであることを特徴としている。
【０００８】
請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記対物レンズに入射する前記レーザー光のビーム径を調整するズーム光学系をさらに備え、前記顕微鏡制御装置は、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポット径の条件を満たすように前記ズーム光学系を制御することを特徴としている。
【０００９】
請求項４記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記レーザー光の強度を検出するレーザーパワーモニタ手段をさらに備え、前記顕微鏡制御装置は、前記レーザーパワーモニタ手段の検出結果に基づいて前記操作手段に入カされた前記レーザー光の照射強度の条件を満たすように前記強度調整手段を制御することを特徴としている。
【００１０】
請求項５記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記顕微鏡制御装置は、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポット径の条件を満たすように前記対物レンズ切換手段を制御し、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射強度の条件を満たすように前記強度調整手段を制御し、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポットの走査範囲の条件を満たすように前記走査手段の走査幅を制御し、前記操作手段に入力された前記レーザー光の試料上の一点の照射時間の条件を満たすように前記走査手段の走査速度を制御し、前記操作手段に入力された前記画像の解像度の条件を満たすように前記Ａ／Ｄコンバータのサンプリング間隔を制御することを特徴としている。
【００１１】
この結果、本発明によれば、試料上でのレーザー光のスポット径、レーザー光の照射強度、１点あたりのレーザー光の照射時間、光データ取得ピッチ、光データ取得範囲などを任意に設定することで、これら条件設定に応じた分解能の各種のデータを取得できるので、試料へ与える刺激(励起)の制御、試料から発せられた蛍光または反射光の観察光の検出を定量的に行うことができ、定量的な測定、再現性のある測定が可能になる。
【００１２】
また、本発明によれば、ズーム光学系を設けて対物レンズの開口数（ＮＡ）を微小段階的または無段階に制御することによって試料上のレーザー光のスポット径を細かく制御することができる。
【００１３】
さらに本発明によれば、レーザーパワーモニタを設けることによって試料上に照射するレーザー光の強度をより正確に制御することができ、精度の高い定量的な測定、再現性のある測定を行うことができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１５】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示している。
【００１６】
１はレーザー光源で、このレーザー光源１から発せられたレーザー光は、強度調整手段としてのレーザーパワー制御手段２、ダイクロイックミラー３、対物レンズ４を介して試料５上にスポット状に照射される。この場合、レーザーパワー制御手段２は、レーザー光源１から発せられるレーザー光の照射強度を調整するもので、具体的には、図示しないＮＤフィルタの光路への挿脱またはＡＯＴＦ（音響光学可変波長フィルタ）によりレーザー光の照射強度を調整するようにしている。対物レンズ４は、倍率の異なるものが複数個、対物レンズ切換手段としてのレボルバ４ａに設けられており、このレボルバ４ａにより複数の対物レンズ４のうちの一つが選択的に観察光軸に挿入されるようになっている。
【００１７】
スポット状のレーザー光は、走査手段６により試料５上を走査される。この場合、走査手段６は、顕微鏡制御装置７からの操作制御信号に応じて、レーザー光を試料５上でＸＹ軸方向に２次元走査するようになっており、このとき、レーザー光を試料５上のある１点で停止させたり、所望の速度で移動させることができるようにもなっている。
【００１８】
レーザー光が照射された試料５上から発せられた蛍光または反射光の観察光は、対物レンズ４、走査手段６、ダイクロイックミラー３、対物レンズ４の焦点面と共役の位置に配置された共焦点ピンホール８を介してフォトディテクタ９に投影される。
【００１９】
フォトディテクタ９は、共焦点ピンホール８を通過した試料５からの観察光を光電変換するもので、このフォトディテクタ９で光電変換された電気信号は、顕微鏡制御装置７から発せられるサンプリングパルスに同期してＡ／Ｄコンバータ１０でデジタル信号に変換され、顕微鏡制御装置７に与えられる。
【００２０】
顕微鏡制御装置７は、受け取った信号から試料５の観察画像を構築してモニタ１１に表示するとともに、光量データを生成してグラフや表としてモニタ１１に表示するようにしている。
【００２１】
一方、操作手段１２は、顕微鏡観察者が画像(光強度データ)取得のための条件設定を行うためのもので、ここでは、
（ａ）試料５に照射するレーザー波長、
（ｂ）試料５上に形成するレーザー光のスポット径、
（ｃ）試料５に照射するレーザー光の照度強度
（ｄ）試料５上の１点に照射する時間、または、試料５上を走査するレーザー光のスポット移動速度
（ｅ）試料５から発せられた蛍光または反射光の信号をサンプリングする間隔
（ｆ）試料５上の画像(光強度データ)を取得する走査範囲、
などの条件を設定できるようになっている。
【００２２】
次に、このような条件設定に対しての処理について説明する。
【００２３】
まず、試料５に照射するレーザー波長および試料５上に形成するレーザー光のスポット径を設定すると、ここでの試料５上のレーザー光のスポット径は、対物レンズ４の開口数(ＮＡ)と使用するレーザー波長で決定されるので、これらレーザー波長とスポット径から、使用すべき対物レンズ４が決定される。つまり、操作手段１２において、試料５に照射するレーザー波長および試料５上に形成するレーザー光のスポット径を設定することで、顕微鏡制御装置７によりレーザー波長に適した対物レンズ４が決定される。この場合、決定された対物レンズ４は、レボルバ４ａにより自動的に観察光軸上に挿入されるか、または、光路上に切換えるべき対物レンズ４の種別をモニタ１１上に表示して観察者に知らせ、レボルバ４ａの手動操作により観察光軸上に挿入されるようになる。
【００２４】
次に、試料５に照射するレーザー光の照射強度を設定すると、この設定に基づいて、顕微鏡制御装置７により、レーザーパワー制御手段２の図示しないＮＤフィルタの光路への挿脱またはＡＯＴＦ（音響光学可変波長フィルタ）によりレーザー光の照射強度の調整が可能となる。
【００２５】
ここまでで、試料５上に形成されるレーザー光のスポット径とレーザー光の照射強度が決定され、試料５上の１点に照射されるレーザー光の照射強度が設定できる。
【００２６】
次に、試料上の１点に照射するレーザー光の時間を設定すると、試料５上のレーザー光のスポットの移動速度が決定される。この場合、試料５上の１点にレーザー光が照射される時間は、レーザー光のスポットがスポットの直径分だけ移動する時間に相当するので、スポット径の値とレーザー光を照射する時間とから求めることができる。試料５上の１点に照射する時間を設定する代わりに、直接レーザー光のスポットの移動速度を設定して、試料５上の１点に照射する時間を求めるようにしてもよい。そして、レーザー光のスポットが試料５上を移動する移動速度が決定されると、顕微鏡制御装置７より、例えば、ガルバノメータなどの走査手段６に対し制御信号が出力され、レーザー光のスポットを試料５上のある１点で停止させたり、ある速度で移動させる制御が可能となる。
【００２７】
次に、試料５から発せられた蛍光または反射光をサンプリングする間隔を設定すると、このサンプリング間隔により、試料５から発せられた蛍光または反射光をどのくらいの密度(解像度)で検出するかの程度が決定される。例えば、試料５上でサンプリングする点と点との距離を設定すると、この設定された距離と、レーザー光のスポットが移動する移動速度からサンプリングする時間間隔が決まるので、この時間間隔に基づいて顕微鏡制御装置７よりＡ／Ｄコンバータ１０ヘ発するサンプリシグパルスの周波数を制御することにより、取得画像の解像度を決定する。この場合、直接、蛍光または反射光を検出する時間間隔を設定することで、顕微鏡制御装置７よりＡ／Ｄコンバータ１０ヘ発するサンプリングパルスの周波数を制御するようにしてもよい。
【００２８】
そして、試料５上の画像(光強度データ)を取得する範囲を設定すると、この設定に応じて顕微鏡制御装置７により走査手段６へ発せられる走査制御信号との位相関係を制御しつつ設定されたサンプリング数だけＡ／Ｄコンバータ１０ヘサンプリングパルスが出力されるようになり、設定された走査範囲の光強度データのみが取得されるようになる。
【００２９】
その後、このように設定された画像取得条件の下で、上述したようにレーザー光源１からのレーザー光を対物レンズ４を介して試料５に対し走査手段６によりＸ、Ｙ軸方向に走査しながら照射し、試料５からの観察光を、対物レンズ４を介してフォトディテクタ９で検出する。この場合、フォトディテクタ９より取得される情報は、試料５上でのレーザー光のスポット径、レーザー光の照射強度、１点あたりのレーザー光の照射時間、光データ取得ピッチ、光データ取得範囲などを任意に設定することで、それぞれの条件設定に応じた分解能の各種データが取得できる。これにより、試料５へ与える刺激(励起)の制御、試料５から発せられた蛍光または反射光などの観察光の検出を定量的に行うことができ、定量的な測定、再現性のある測定が可能になる。
【００３０】
なお、上述では、試料５上でのレーザー光のスポット径、レーザー光の照射強度、１点あたりのレーザー光の照射時間、光データ取得ピッチ、光データ取得範囲などの画像取得条件を全て設定する例を述べたが、少なくとも試料５上でのレーザー光のスポット径、レーザー光の照射強度を設定すれば、定量的な測定、再現性のある測定は可能である。
【００３１】
(第２の実施の形態)
図２は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。
【００３２】
この場合、レーザーパワー制御手段２とダイクロイックミラー３との間の光路中にズーム光学系１３が設けられている。このズーム光学系１３は、そのズーム動作により対物レンズ４ヘ入射するレーザー光のビーム径を微小段階または無段階に制御し、対物レンズ４の開口数（ＮＡ）に対する照射光の有効開口数（ＮＡ）を制御するようにしている。
【００３３】
このようにすれば、ズーム光学系１３を設けたことによって、対物レンズ４の開口数（ＮＡ）を微小段階的または無段階に絞り込むことができる。
【００３４】
通常、対物レンズ４の開口数（ＮＡ）は、対物レンズ４の種別(倍率も含む)によって決まっており、例えば、第１の実施の形態の構成により、試料５上にレーザー光のスポット径を設定したとしても、必ずしも所望するレーザー光のスポット径が実現できるとは限らない。そこで、この第２の実施の形態では、ズーム光学系１３を設けて、対物レンズ４ヘ入射するレーザー光のビーム径を微小段階または無段階に制御し、対物レンズ４の開口数（ＮＡ）に対する照射光の有効開口数（ＮＡ）を制御することによって、試料５上のレーザー光のスポット径を細かに制御できるようにしている。これにより、試料５上でのレーザー光の照射設定に、より自由度を増すことができる。
【００３５】
なお、第２の実施の形態の変形例として、ズーム光学系１３の代わりに、開口部を可変可能にした絞りを設けることによっても、同様の制御で同様の作用効果を得ることができる。
【００３６】
(第３の実施の形態)
図３は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。
【００３７】
この場合、走査手段６と対物レンズ４との間の光路中にレーザーパワーモニタ手段１４が設けられている。このレーザーパワーモニタ手段１４は、ビームスプリッタ１４１、絞り１４２およびフォトディテクタ１４３から構成され、このうちのビームスプリッタ１４１は、レーザー光源１から対物レンズ４に入射されるレーザー光の光路中に挿入され、このビームスプリッタ１４１により対物レンズ４ヘ導入されるレーザー光の一部を折り返し、絞り１４２を介してフォトディテクタ１４３で受光するようになっている。また、フォトディテクタ１４３で検出した光強度は、電気信号に変換され顕微鏡制御装置７に伝えられる。絞り１４２は、その開口径を顕微鏡制御装置７により制御可能になっていている。この場合、絞り１４２の開口径は、対物レンズ４から出射するレーザー光の照射強度をより正確にモニタするため、対物レンズ４の瞳径に合わせて制御されるようになっている。つまり、対物レンズ４の瞳径よりレーザー光のビーム径が大きいと、レーザー光は対物レンズ４の瞳径より大きい部分の光がカットされてしまうが、対物レンズ４の瞳径の大きさに相当する絞り１４２を設げることにより、対物レンズ４が切換られても試料５に照射される光量を正確にモニタすることができる。
【００３８】
このようにすれば、レーザーパワーモニタ手段１４を設け、実際に対物レンズ４から出射しているレーザー光の照射強度をモニタするとともに、このモニタ結果をフィードバックすることができるので、観察者が設定したレーザー光の強度の値と比較し、この比較結果に応じてレーザーパワー制御手段２を制御すれば、例え、レーザー光源１から出射されるレーザー光の照射強度が変動したとしても、試料５へ照射するレーザー光の強度を、常に設定値に一致させることができる。これにより、試料５上に照射するレーザー光の照射強度を、より正確に制御できるので、さらに精度の高い定量的な測定、再現性のある測定を行うことができる。
【００３９】
なお、このレーザーパワーモニタ手段１４は、走査手段６と対物レンズ４との間の光路中に常時挿入されていても、出し入れ可能になっていてもよく、例えば、レーザー光源１から出射されるレーザー光の照射強度が小さいような場合や試料５から発せられる蛍光または反射光の強度が弱いような場合は、その減衰を防ぐため、レーザー光の強度のモニタを必要とするとき以外は、光路から外すようにすればよい。
【００４０】
また、このような第３の実施の形態の構成に、上述の第２の実施の形態で説明したズーム光学系を追加することも可能で、こうすれば、上述した第２の実施の形態の効果も期待できる。
【００４１】
(第４の実施の形態)
ところで、走査型レーザー顕微鏡は、その利用方法として、目視で試料の蛍光画像を観察するのと同様に、主に試料の形態を画像として観察する方法と、試料にある刺激を与えて、それによる変化、例えば蛍光強度の時間的変化を測定するなどの方法がある。
【００４２】
そこで、この第４の実施の形態では、各種の利用方法を考慮して、条件設定方法に、２つの設定モードを用意し、これらの設定モードを選択的に切り換え可能にしている。ここでは、第１の設定モードとして、従来の条件設定方法による画像観察モードと、第２の設定モードとして、上述した各実施の形態で説明した条件設定方法による測定モードが用いられている。
【００４３】
なお、この第４の実施の形態は、上述した第１乃至第３の実施の形態のいずれかの構成を採用したもので、ここでは、これら第１乃至第３の実施の形態の図面を援用するものとする。
【００４４】
まず、第１の設定モードの試料５の形態を画像として観察する画像観察モードの場合は、従来の条件設定、すなわち、画像を取得するための条件設定として、対物レンズ４の選択、表示画像サイズ（ピクセル数）の設定、モニタ表示する際の走査速度の設定(数段階)、レーザー光の照射強度の設定(相対値)などを設定する。すると、これらの条件設定に基づいて、ＸＹ軸方向にレーザー光を走査するガルバノスキャナの走査速度・振れ角、試料５から発せられた蛍光、反射光を検出するサンプリング周波数などが決定され、この結果として得られた試料５の観察画像がモニタ１１に表示される。
【００４５】
一方、試料５にある刺激を与えて、それによる変化を測定する測定モードの場合は、第１乃至第３の実施の形態で説明した条件設定、すなわち、試料５に照射されるレーザー光の照射強度の設定、試料５上に形成するレーザー光のスポット径の設定、試料５上を走査するレーザー光のスポットの移動連度の設定、試料５から発せられた蛍光または反射光の信号をサンプリングする問隔の設定、試料５上の画像（光強度データ）を取得する範囲の設定などを設定する。すると、これら条件設定に基づいた分解能の各種データが取得され、定量的な測定、再現性のある測定を行うことができる。
【００４６】
したがって、このようにすれば、設定モードを２つ用意することにより、様々な用途に適した条件設定を行うことができ、所望する画像観察、光強度測定を実現することができる。
【００４７】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００４８】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００４９】
本発明の実施の形態には、以下の発明も含まれる。
【００５０】
（１）倍率の異なる複数の対物レンズと、前記複数の対物レンズの一つを選択的に観察光軸に挿入する対物レンズ切換手段と、レーザー光源と、前記レーザー光源から発せられるレーザー光の強度を調整する強度調整手段と、前記レーザー光を試料上で2次元走査する走査手段と、前記観察光軸に挿入された対物レンズの焦点面と共役な位置に配置されたピンホールと、前記ピンホールを通過した前記試料からの観察光を光電変換するフォトディテクタと、前記フォトディテクタから出力される電気信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータと、前記試料の画像取得の条件が入力される操作手段と、前記操作手段に入力された前記画像取得条件に基づいて前記対物レンズ切換手段、前記強度調整手段、走査手段および前記Ａ／Ｄコンバータを制御するとともに、前記デジタル信号から前記試料の観察画像を構築する顕微鏡制御装置と、前記顕微鏡制御装置によって構築された画像を表示するモニタと、を備えた走査型レーザー顕微鏡において、
前記操作手段に入力される前記画像取得条件は、表示画像サイズおよびモニタ表示の際の走査速度を設定する画像観察モードと、前記試料に照射される前記レーザー光の照射スポット径、照射強度および走査範囲、前記レーザー光が前記試料の一点に照射される時間、ならびに前記観察光のサンプリング間隔を設定する測定モードを切換えて設定可能にしたことを特徴とする走査型レーザー顕微鏡。
【００５１】
このようにすれば、設定モードを２つ用意し、これらを選択的に適用することで、様々な用途に適した条件設定ができ、結果として所望の画像観察、光強度測定を行うことができる。
【００５２】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、所望する分解能でのデータ取得、定量的なデータ取得、再現性のあるデータ取得などを積極的に可能にした走査型レーザー顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザー光源
２…レーザーパワー制御手段
３…ダイクロイックミラー
４…対物レンズ
４ａ…レボルバ
５…試料
６…走査手段
７…顕微鏡制御装置
８…共焦点ピンホール
９…フォトディテクタ
１０…Ａ／Ｄコンバータ
１１…モニタ
１２…操作手段
１３…ズーム光学系
１４…レーザーパワーモニタ手段
１４１…ビームスプリッタ
１４２…絞り
１４３…フォトディテクタ
Claims (5)
- 倍率の異なる複数の対物レンズと、
前記複数の対物レンズの一つを選択的に観察光軸に挿入する対物レンズ切換手段と、
レーザー光源と、
前記レーザー光源から発せられるレーザー光の強度を調整する強度調整手段と、
前記レーザー光を試料上で2次元走査する走査手段と、
前記観察光軸に挿入された対物レンズの焦点面と共役な位置に配置されたピンホールと、
前記ピンホールを通過した前記試料からの観察光を光電変換するフォトディテクタと、
前記フォトディテクタから出力される電気信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータと、
前記試料の画像取得の条件が入力される操作手段と、
前記操作手段に入力された前記画像取得条件に基づいて前記対物レンズ切換手段、前記強度調整手段、走査手段および前記Ａ／Ｄコンバータを制御するとともに、前記デジタル信号から前記試料の観察画像を構築する顕微鏡制御装置と、
前記顕微鏡制御装置によって構築された画像を表示するモニタと、
を備えた走査型レーザー顕微鏡において、
前記操作手段に入力される前記画像取得条件は、前記試料に照射される前記レーザー光の照射スポット径および照射強度であることを特徴とする走査型レーザー顕微鏡。 - 前記操作手段に入力される前記画像取得条件は、さらに前記レーザー光の走査範囲、前記レーザー光が前記試料の一点に照射される時間、ならびに前記観察光のサンプリング間隔の少なくとも一つであることを特徴とする請求項１記載の走査型レーザー顕微鏡。
- 前記対物レンズに入射する前記レーザー光のビーム径を調整するズーム光学系をさらに備え、
前記顕微鏡制御装置は、前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポット径の条件を満たすように前記ズーム光学系を制御することを特徴とする請求項１または２記載の走査型レーザー顕微鏡。 - 前記レーザー光の強度を検出するレーザーパワーモニタ手段をさらに備え、
前記顕微鏡制御装置は、前記レーザーパワーモニタ手段の検出結果に基づいて前記操作手段に入カされた前記レーザー光の照射強度の条件を満たすように前記強度調整手段を制御することを特徴とする請求項１または２記載の走査型レーザー顕微鏡。 - 前記顕微鏡制御装置は、
前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポット径の条件を満たすように前記対物レンズ切換手段を制御し、
前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射強度の条件を満たすように前記強度調整手段を制御し、
前記操作手段に入力された前記レーザー光の照射スポットの走査範囲の条件を満たすように前記走査手段の走査幅を制御し、
前記操作手段に入力された前記レーザー光の試料上の一点の照射時間の条件を満たすように前記走査手段の走査速度を制御し、
前記操作手段に入力された前記画像の解像度の条件を満たすように前記Ａ／Ｄコンバータのサンプリング間隔を制御する
ことを特徴とする請求項２記載の走査型レーザー顕微鏡。
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