JP2005512508A - Ｄｋｋ媒介性相互作用を変調する試薬および方法 - Google Patents

Ｄｋｋ媒介性相互作用を変調する試薬および方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2005512508A
JP2005512508A JP2002588934A JP2002588934A JP2005512508A JP 2005512508 A JP2005512508 A JP 2005512508A JP 2002588934 A JP2002588934 A JP 2002588934A JP 2002588934 A JP2002588934 A JP 2002588934A JP 2005512508 A JP2005512508 A JP 2005512508A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dkk
lrp5
hbm
protein
lrp6
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2002588934A
Other languages
English (en)
Inventor
アレン，クリスティーナ
アニソウィッツ，アンソニー
バート，ベーム・エム
ダマーニェ，ヴェロニク
ロビンソン，ジョン・アレン
ヤウォースキー，ポール・ジェイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oscient Pharmaceuticals Corp
Original Assignee
Genome Therapeutics Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genome Therapeutics Corp filed Critical Genome Therapeutics Corp
Publication of JP2005512508A publication Critical patent/JP2005512508A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/50—Amphibians, e.g. Xenopus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

本発明は、ＬＲＰ５、ＨＢＭ（ＬＲＰ５の変異体）、および／またはＬＲＰ６の細胞外ドメインとＤｋｋ−１を含むＤｋｋとの新規相互作用に関連する試薬、化合物、組成物および方法を提供する。本発明の種々の核酸、ポリペプチド、抗体、アッセイ方法、診断方法および治療方法はＤｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭおよびＷｎｔシグナル伝達に関連しており、それらに影響を及ぼす。Ｄｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭおよびＷｎｔは骨および脂質細胞シグナル伝達に関与している。したがって、本発明は脂質濃度および／または骨量を変調する試薬および方法を提供し、例えば骨粗鬆症のような異常な脂質濃度および骨量障害の治療および診断において有用である。

Description

本発明は、Ｄｋｋ−１、および／またはＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭを含むＤｋｋまたはもしくはＷｎｔ経路の他のメンバーによって媒介されるシグナル伝達、骨の発達、骨量減少障害、脂質に関連する状態の変調、研究用試薬、薬物リードのスクリーニング方法、新薬開発、骨および／または脂質障害の治療、治療法のスクリーニングおよび開発、骨および／または脂質の発達および維持の分子、細胞および動物モデルに関する。
骨粗鬆症の極めて一般的なタイプのうちの２つは閉経後骨粗鬆症および老人性骨粗鬆症である。骨粗鬆症は男性と女性のどちらもが罹患する疾患であり、他の骨の異常と一緒に、高齢者における増加の一途をたどる健康上のリスクを表している。骨粗鬆症に最も一般的なのは閉経に関連したタイプである。ほとんどの女性は、閉経後３〜６年以内に骨の骨梁区画に含まれる骨量の２０〜６０％を失う。この急速な骨量減少は、一般には骨の吸収および形成の増加に関連している。しかし吸収サイクルの方が優勢であるため、結果として骨量の正味減少が生じる。骨粗鬆症は、閉経後の女性の間で一般的かつ深刻な疾患である。米国内だけでも、この疾患に罹患している女性は２，５００万人と推定されている。骨粗鬆症の結果は個人的には痛みを伴うが、さらにこの疾患が慢性的で疾患の後遺症の結果として広範囲に及ぶ長期的サポート（例えば、入院および在宅看護）の必要が生じることから、大きな経済的損失の原因でもある。これは特に高齢患者について言える。さらに、骨粗鬆症は一般には生命を脅かす状態とは考えられていないが、高齢の女性における股関節骨折には２０〜３０％の死亡率が結び付いている。この死亡率の大きなパーセンテージは、閉経後骨粗鬆症と直接的に関連している可能性がある。
閉経後骨粗鬆症の作用に対して骨の中で最も易損性である組織は骨梁骨である。この組織はしばしば海綿骨と呼ばれており、特に骨端近傍、関節近傍および脊椎に集中している。骨梁組織は、相互に、ならびに骨の外面および中心軸を作り上げているより固く密な皮質組織と相互連結している微小構造を特徴とする。この骨梁の交差網目は外皮質構造への側方支持を与えるので、全体的構造の生体力学的強度にとって極めて重要である。閉経後骨粗鬆症では、主として骨梁の網目吸収や消失が骨の障害や骨折を導く。閉経後の女性における骨梁消失を考えると、大多数の一般的骨折が例えば脊椎、大腿骨頸部および前腕のような骨梁支持に高度に依存する骨に関連する骨折であることは驚くに当たらない。実際に、股関節骨折、コーレス（Ｃｏｌｌｅｓ’ｓ）骨折、および脊椎粉砕骨折は閉経後骨粗鬆症の徴候である。皮質と骨梁骨のどちらもが骨粗鬆症に罹患する。加齢に伴う骨内膜性骨吸収における変化やハーバースリモデリング（Ｈａｖｅｒｓｉａｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）は、骨折のリスク上昇の原因となる皮質厚および構造完全性に影響を及ぼす。
閉経後骨粗鬆症の治療方法として初期に一般的に容認されていた方法の１つは、エストロゲン代償療法であった。この療法は高頻度で成功が得られはするが、主として長期エストロゲン療法の望ましくない副作用が原因で患者のコンプライアンスが低い。しばしば言及されているエストロゲン代償療法の副作用には、月経の再開、膨満感、うつ病、および可能性として乳癌もしくは子宮癌のリスク上昇が含まれる。子宮摘出術を受けていない女性において知られている子宮癌の脅威を抑えるためには、エストロゲンとプロゲスチンの周期療法のプロトコールがしばしば使用されている。だがこのプロトコールは受胎調節レジメンに使用されるプロトコールに類似しており、プロゲスチンに特徴的な副作用が生じるため、しばしば女性には忍容されない。より近年には、最初は乳癌を治療するために開発された一定の抗エストロゲンが閉経後骨粗鬆症の実験モデルにおいて有効であることが証明されている。特に有効な物質はラロキシフェンである（米国特許第５，３９３，７６３号；Ｂｌａｃｋら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３：６３−６９（１９９４）；およびＥｔｔｉｎｇｅｒら，ＪＡＭＡ ２８２：６３７−４５（１９９９）を参照）。さらに、乳癌を治療するために広範に使用されている臨床薬であるタモキシフェンも乳癌に罹患している閉経後女性における骨塩密度を上昇させることが証明されている（Ｌｏｖｅら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２６：８２６−８５６（１９９２））。
閉経後骨粗鬆症を治療するためのまた別の療法はカルシトニンの使用である。カルシトニンは骨吸収を阻害する天然型ペプチドであり、この使用は多数の国々で承認されている（Ｏｖｅｒｇａａｒｄら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３０５：５５６−５６１（１９９２））。しかしカルシトニンを使用するのはいくらか限定されてきた。骨塩密度を上昇させることに関するカルシトニンの作用は極めてささやかであり、そしてその治療は非常に費用がかかるからである。閉経後骨粗鬆症を治療するためのまた別の療法は、ビスホスホネート製剤の使用である。これらの化合物は、最初はぺージェット病や悪性高カルシウム血症を治療するために開発された。ビスホスホネート製剤が骨吸収を抑制することは証明されている。ビスホスホネート製剤の１種であるアレンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の治療のために承認されている。これらの薬剤は骨粗鬆症の治療には有用であるが、これらの薬剤はさらに潜在的不利益も有しており、それには骨軟化症、極めて長い骨中半減期（２年間を超える）、および例えば正常骨リモデリングの停止のような「凍結骨症候群（ｆｒｏｚｅｎ ｂｏｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」が含まれる。
老人性骨粗鬆症は、骨塩密度の減少が顕著で、結果として骨折率、罹病率、および関連死亡率が上昇するという点で閉経後骨粗鬆症に類似している。一般に、老人性骨粗鬆症は高齢期に、すなわち７０歳代以降に発生する。歴史的には、老人性骨粗鬆症は女性における方が一般的であったが、より高齢の男性集団の出現に伴ってこの疾患は男女両性の健康における主要要素になりつつある。テストステロンまたはエストロゲンのようなホルモンがこの疾患において、もしあるとしても、どのような役割を果たすのかは不明であり、その病因ははっきりしていない。この疾患の治療は余り満足が得られていない。女性ではエストロゲン、男性ではテストステロンを使用するホルモン療法は不明瞭な結果を示している；カルシトニンおよびビスホスホネート製剤にはいくらかの有用性があるかも知れない。
成人での骨格のピーク量は高度に遺伝的制御下にある。双子で実施された試験は、成人の一卵性双生児間の骨量変動が二卵性双生児間の骨量変動より小さいことを証明している（Ｓｌｅｍｅｎｄａら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，６：５６１−５６７（１９９１）；Ｙｏｕｎｇら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，６：５６１−５６７（１９９５）；Ｐｏｃｏｃｋら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０：７０６−７１０（１９８７）；Ｋｅｌｌｙら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８：１１−１８（１９９３）を参照）。骨格量における変動の６０％以上までは遺伝性であると推定されている（Ｋｒａｌｌら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：Ｓ３６７（１９９３）を参照）。ピーク骨格量は高齢者における骨量の最も強力な決定因子であるが（Ｈｕｉら，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１１１：３５５−３６１（１９８９））、成人および中年期以降における年齢関連性骨量減少率もまた重要な決定因子である（Ｈｕｉら，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ｉｎｔ．，１：３０−３４（１９９５））。骨量は骨折リスクの測定可能な主要決定因子であるので、成人で達成された遺伝性ピーク骨格量は、中年期以降の個人の骨折リスクにとって重要な決定因子となる。そこで、骨量の遺伝的基礎に関する研究は、骨粗鬆症を原因とする骨折の病因において相当に重要である。
近年、骨粗鬆症の分野においてピーク骨量の遺伝的制御に大きな関心が高まってきた。この関心の焦点は、主として正常範囲内にある骨量における変動との関連について試験するための適切な多型性を備える候補遺伝子に、または骨粗鬆症を有する患者において見いだされる範囲内の低骨量に関連する遺伝子および遺伝子座の試験に当てられてきた。ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）遺伝子座（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６７：２８４−２８７（１９９４））、ＰＴＨ遺伝子（Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８０：２８００−２８０５（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８：１１−１７（１９９５）；Ｇｏｎｇら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：Ｓ４６２（１９９５））およびエストロゲン受容体遺伝子（Ｈｏｓｏｉら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：Ｓ１７０（１９９５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６７：２８４−２８７（１９９４））は、この研究において極めて重要なものとして登場してきた。これらの試験は、骨量（すなわち、表現型）が連続的、定量的、多遺伝子の形質であり、そして例えば栄養、合併疾患、年齢、身体活動度、およびその他の因子のような環境因子によって混乱させられるので困難である。さらに、このタイプの試験デザインには極めて多数の被験者が必要とされる。特に、現在に至るまでのＶＤＲ試験の結果は紛らわしく、矛盾していた（Ｇａｒｎｅｒｏら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：１２８３−１２８８（１９９５）；Ｅｉｓｍａｎら，Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：１２８９−１２９３（１９９５）；Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１０：１２９４−１２９７（１９９５））。さらにその上、これまでのところ、当分野ではそれにより遺伝的影響力が骨量に作用するメカニズムを確定していない。
ピーク骨量が環境因子よりはむしろ主として遺伝的因子により大方決定されることはよく知られているが、骨量の変動に関連する遺伝子座（および最終的には遺伝子）を決定する試験は困難である上に高額の費用がかかる。同胞コントロールまたは拡大家族のような例えば連鎖解析の検出力を利用する試験デザインでは単純関連試験より概してより多くの情報が得られるが、後者にも価値がある。しかし骨量を含む遺伝的連鎖試験は２つの重要な問題によって妨害される。第１の問題は、上記で手短かに考察したような表現型である。骨量は連続的定量的形質であるので、個別の表現型を確定することは困難である。測定のための各解剖学的部位はいくつかの遺伝子によって影響を受けることがあり、それらの多くは部位毎に相違する可能性がある。第２の問題は、表現型の年齢成分である。個人が低骨量を有すると同定できる時点までに彼らの両親またはその他の先行世代のメンバーが死亡していてこのため試験に利用できない可能性が高く、そして若年世代はピーク骨量にさえ達していないので、遺伝子解析のために彼らの表現型の型別が不明確になる可能性がある。
そこで、当分野においては骨の変調の分子機序を解明するため、候補新薬のスクリーニングおよび開発のため、そして骨の発達および骨量減少障害の治療のために、追加の研究用ツールの必要がある。本発明は、これらやその他の重要な目的に向けられる。
骨の変調に加えて、本発明は脂質濃度の変調にも関する。心血管疾患は米国における死亡率の最も一般的な原因であり、アテローム性動脈硬化症は心疾患および心臓発作の主因である。コレステロールがアテローム性動脈硬化症において重要な役割を果たすことは広く理解されている。通常、ほとんどのコレステロールは細胞壁における構造的要素として機能するが、残りの多くは血液を通って通過中であるか、または肝臓における胆汁酸、内分泌細胞におけるステロイドホルモンおよび皮膚内のビタミンＤの合成にとっての出発物質として機能する。循環系を通してのコレステロールおよびその他の脂質の輸送はリポタンパク質担体内へのパッケージングによって促進される。これらの球状粒子には、非エステル化（「遊離」）もしくはエステル化コレステロールおよびトリグリセリドを含む中性脂質のコアを取り囲んでいるタンパク質およびリン脂質の殻が含まれている。アテローム性動脈硬化症のリスクは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの濃度上昇に伴って増加するが、他方このリスクは高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの濃度と反比例している。血漿中ＬＤＬ濃度の受容体媒介性制御は明確にされており、そして近年の研究はＨＤＬ代謝に関する新規の洞察を提供してきた。
ＬＤＬ代謝の解明は、Ｍｉｃｈａｅｌ ＢｒｏｗｎおよびＪｏｓｅｐｈ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎによって１９７４年に開始された。手短かには、肝臓は循環中に中間密度型リポタンパク質（ＩＤＬ）へ、およびその後はＬＤＬへ変換されるリポタンパク質前駆体（超低密度リポタンパク質、ＶＬＤＬ）を合成する。身体内で発現するＬＤＬ受容体の大多数は肝細胞の表面上に存在するが、実質的にその他すべての組織（「末梢組織」）が数種のＬＤＬ受容体を発現する。結合後、受容体リポタンパク質複合体は被覆ピットおよび被覆小胞を介して細胞によって吸収され、そして全ＬＤＬ粒子がリソソームへ送達されるが、このとき粒子は酵素加水分解によって分解され、引き続いて細胞代謝のためにコレステロールが遊離される。この全粒子取り込み経路は「受容体媒介性エンドサイトーシス」と呼ばれている。ＬＤＬ受容体の濃度および細胞コレステロール生合成両方のコレステロール媒介性フィードバック調節は、細胞コレステロールの恒常性を保証するのに役立つ。ヒトにおけるＬＤＬ受容体の遺伝的欠損は、血漿中ＬＤＬコレステロールの上昇および若年性のアテローム性動脈硬化症および心臓発作を特徴とする家族性高コレステロール血症を生じさせる。過剰な血漿中ＬＤＬコレステロールの悪影響についての１つの仮説は、ＬＤＬが動脈壁に進入し、化学修飾され、そしてその後、動脈内でのＬＤＬコレステロールの細胞集積を媒介してマクロファージスカベンジャー受容体と呼ばれる特別クラスの受容体によって認識され、最終的にはアテローム性動脈硬化症病変の形成を生じさせる、というものである。
主要リポタンパク質クラスには、食事脂肪およびコレステロールを腸管輸送する乳状脂粒、アテローム形成性の可能性がある肝由来ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、および抗アテローム形成性の肝由来および腸管由来ＨＤＬが含まれる。アポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）は、カイロミクロン（ＡｐｏＢ４８）およびＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬ（ＡｐｏＢ１００）の分泌にとって不可欠である。ＶＬＤＬトリグリセリドの血漿中濃度は、主としてＬＤＬ脂肪分解活性における分泌速度によって決定される。ＬＤＬコレステロールの血漿中濃度は主として血漿内へのＡｐｏＢ１００の分泌、それを用いてＶＬＤＬがＬＤＬへ転換される有効性およびＬＤＬ受容体媒介性クリアランスによって決定される。ＨＤＬコレステロール濃度の調節は複雑であり、そのアポタンパク質の合成速度、ＬＣＡＴによる遊離コレステロールからコレステロールエステルへのエステル化速度、トリグリセリドリッチリポタンパク質の濃度およびＨＤＬからのコレステロールエステルのＣＥＴＰ媒介性トランスファー、およびＨＤＬ脂質およびアポタンパク質の血漿からのクリアランスによって影響を受ける。
正常リポタンパク質輸送には、低濃度のトリグリセリドおよびＬＤＬコレステロールならびに高濃度のＨＤＬコレステロールが結び付いている。リポタンパク質輸送が異常であると、リポタンパク質濃度は個人にアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症への素因を与える方法で変化することがある（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ，２７：５０３−１９（１９９８）を参照）。
数種のリポタンパク質受容体は、細胞脂質取り込みに関わっている可能性がある。これらの受容体には次のものが含まれる：スカベンジャー受容体；ＬＤＬ受容体関連タンパク質／α２−マクログロブリン受容体（ＬＲＰ）；ＬＤＬ受容体；およびＶＬＤＬ受容体。ＬＤＬ受容体を除いて、これらの受容体はどれもがアテローム性動脈硬化症病変中で発現するが、他方スカベンジャー受容体はほとんどがマクロファージ中で発現し、ＬＲＰおよびＶＬＤＬ受容体は平滑筋細胞中での脂質取り込みを媒介することに重要な役割を果たすことがある（Ｈｉｌｔｕｎｅｎら，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１３７補遺Ｓ８１−８（１９９８））。
高コレステロール血症の薬物治療における大きな飛躍的進歩は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ）阻害薬の「スタチン」クラスの開発であった。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼはコレステロール生合成における律速酵素であり、肝内でのその阻害はＬＤＬ受容体発現を刺激する。その結果として、血漿中ＬＤＬコレステロール濃度およびアテローム性動脈硬化症のリスクの両方が減少する。ＬＤＬ受容体形の発見および解析は、細胞生物学、生理学および医学に深遠な影響を及ぼしてきた。
ＨＤＬは末梢組織から非エステル化、もしくは「遊離」コレステロール（ＦＣ）を取り除くと考えられており、その後大多数のコレステロールは血漿中の酵素によってコレステロールエステル（ＣＥ）へ変換される。その後に、ＨＤＬコレステロールは選択的取り込み経路およびＨＤＬ受容体を介して肝およびステロイド産生組織へ効果的に直接に送達され、そしてＨＤＬ受容体、ＳＲ−ＢＩ（クラスＢタイプＩスカベンジャー受容体）または一部の種では代謝における追加の輸送のために他のリポタンパク質へ移送される（Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：４０７７−４０８０（１９９８））。
これらの問題は、脂質変調の分子メカニズムを解明するため、候補新薬のスクリーニングおよび開発のため、そして脂質濃度および脂質濃度変調障害の治療のための追加の研究用ツールに対する技術における必要を例証している。本発明は、これらやその他の重要な目的に向けられる。
本発明は、ＬＲＰ５、ＨＢＭ（ＬＲＰ５の変異体）、および／またはＬＲＰ６の細胞外ドメインとＤｋｋタンパク質との新規相互作用に関連する試薬、化合物、組成物および方法を提供する。ＬＲＰ５は、Ｚｍａｘ１もしくはＺｍａｘとも呼ばれる。したがって、ＤｋｋとＬＲＰ５（もしくはＺｍａｘ１）との相互作用に関連する本発明の方法、試薬、化合物、および組成物を考察するときには、本発明はＤｋｋとＬＲＰ６との、およびＤｋｋとＨＢＭとの相互作用に関連する実施形態を含むと理解されなければならない。さらに、ここでＤｋｋを考察する場合は、本発明の方法、試薬、化合物、および組成物には、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、Ｄｋｋ−４およびＳｏｇｇｙを含むがそれらに限定されないＤｋｋファミリーメンバーが含まれると理解しなければならない。さらに、本発明はＬＲＰ５のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）とその他のタンパク質との結合相互作用を証明する、および／またはＬＲＰ５、またはその変異体もしくはフラグメントとＤｋｋタンパク質との相互作用を変調できるＤｋｋ−１の新規フラグメントを含む。本発明は、Ｄｋｋ−Ｗｎｔシグナル伝達に関連するアッセイ、方法、組成物および化合物を提供する。Ｗｎｔ１〜Ｗｎｔ１９、および特にＷｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、およびＷｎｔ１０ｂを含む多数のＷｎｔタンパク質が本発明に適合する。本発明は、さらに１つ以上の他のタンパク質とＤｋｋ−１との相互作用を変調する試薬、化合物、組成物および方法を提供する。本発明は、さらにまたＤｋｋ−１またはＬＲＰ５（またはＨＢＭおよび／またはＬＲＰ６）へ結合する一連のペプチドアプタマーも提供する。
例えばペプチドオリゴマー、アプタマー、タンパク質およびタンパク質フラグメントの形状での本発明のポリペプチド、ならびに本発明のポリペプチドならびにアンチセンスもしくは相補的核酸をコードする核酸の形状での本発明の核酸は、骨量および脂質濃度変調を試験するための試薬として有用である。本発明のポリペプチドおよび核酸は、さらにまた治療薬および診断薬としても有用である。
本発明はＬＲＰ５、ＬＲＰ６、および／またはＨＢＭを用いたＤｋｋタンパク質の変調、Ｄｋｋ−１および／またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質活性の変調、そしてＬＲＰ／Ｄｋｋ−１、ＬＲＰ６／Ｄｋｋ１およびＨＢＭ／Ｄｋｋ−１の相互作用およびＤｋｋ−１／Ｄｋｋ−１相互作用タンパク質の相互作用の変調のための有用な試薬を提供する。本発明はＤｋｋ−１またはＬＲＰ６、ＬＲＰ５および／またはＨＢＭに結合する一連のペプチドアプタマーを提供する。
本発明の目的は、Ｄｋｋ活性を変調する治療有効量の組成物を投与するステップを含む、被検対象においてＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ／ＨＢＮ様活性を調節する方法を提供することである。該被検対象は脊椎動物または無脊椎動物であってよいが、より好ましくは該生物は、イヌ、ネコ、ヒツジ、霊長類、ウマ、ブタ、ヤギ、ラクダ、鳥類、ウシ、または齧歯動物である。より好ましい動物はヒトである。１つの好ましい実施形態では、Ｄｋｋタンパク質はＤｋｋ−１である。特に好ましい実施形態では、Ｄｋｋ−１活性が低下させられる。別の実施形態では、Ｄｋｋ活性が骨量および／または脂質濃度を変調する。１つの好ましい実施形態では、骨量が増加させられ、および／または脂質濃度が低下させられる。また別の好ましい実施形態では、骨量における変調とは骨折率の減少、部分的骨密度の上昇、容積骨塩密度の上昇、骨梁連結性の上昇、骨梁密度の上昇、皮質密度もしくは皮質厚の上昇、骨径の増加、および無機質骨含量の増加のうちの１つ以上を介して決定される骨の強度の増加である。本発明はさらにまた、該組成物が図６に示したものまたは図６に示したそれらのフラグメントの模倣物のようなＤｋｋ、Ｄｋｋ−１もしくはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントを含むような方法を提供する。本発明はさらにまた、該組成物が例えば図５に示したもののようなＤｋｋ−１を含むＤｋｋ、もしくはそのＤｋｋ結合フラグメント、または１つ以上のＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ分子と相互作用する１つ以上のタンパク質を含むような方法を提供する。本発明はさらにまた、該組成物がＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｚｍａｘ１抗体、Ｄｋｋ抗体、Ｄｋｋ−１抗体またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体を含むような方法を提供する。本発明はさらにまた、該組成物が例えば図３（配列番号１７１〜１８８）に示したもののようなＤｋｋまたはＤｋｋ−１のアプタマー、またはこのようなアプタマーの模倣物を提供する。本方法はさらに、本発明がさらにまた該組成物がＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むような方法を提供する。
本発明の組成物は、ＤｋｋのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｚｍａｘ１、特にＤｋｋ−１への結合、またはＤｋｋ−１の図５に示したもののようなＤｋｋ−１相互作用タンパク質への結合を増強または阻害するどちらかによって活性を変調することができる。本発明の組成物は例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２）（特に、ペプチド（配列番号１９１））および１３（配列番号２０４〜２１４を含む）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはこのようなアプタマーの模倣物を含んでいてよい。本発明の好ましい組成物はさらにまたＬＲＰ５抗体も含む。
本発明のまた別の態様は、Ｄｋｋ−Ｗｎｔ経路活性を調節する治療有効量の組成物を投与するステップを含む、被検対象におけるＤｋｋ−Ｗｎｔ経路活性を変調する方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、Ｄｋｋタンパク質はＤｋｋ−１である。特に好ましい実施形態では、Ｄｋｋ−１活性が低下させられる。また別の実施形態では、Ｄｋｋ活性は骨量および／または脂質濃度を変調する。１つの好ましい実施形態では、骨量が増加させられ、および／または脂質濃度が低下させられる。また別の好ましい実施形態では、骨量における変調とは、骨折率の減少、部分的骨密度の上昇、容積骨塩密度の上昇、骨梁連結性の上昇、骨梁密度の上昇、皮質密度もしくは皮質厚の上昇、骨径の増加、および無機質骨含量の増加のうちの１つ以上を介して決定される骨の強度の増加である。また別の好ましい実施形態では、ＷｎｔはＷｎｔ１〜Ｗｎｔ１９である。特に好ましい実施形態では、ＷｎｔはＷｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、またはＷｎｔ１０ｂである。好ましい組成物は、Ｄｋｋ変調化合物またはＤｋｋ−１変調化合物、または１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントを含む。他の好ましいＤｋｋ変調組成物は、Ｄｋｋ抗体もしくはＤｋｋ−１抗体、またはＤｋｋ相互作用タンパク質もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体を含む。同様に意図されているのは１つ以上のＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子である。本発明はさらにまた該組成物が図６に示したもののようなＤｋｋ−１を含むＤｋｋの生物学的に活性もしくはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントまたは図６に示したそれらのフラグメントの模倣物を含むような方法を提供する。Ｄｋｋ−１変調組成物はさらにまたＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含んでいてよい。本発明の組成物は、Ｄｋｋ−１を含むＤｋｋのＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭへの結合またはＤｋｋ−１を含むＤｋｋの例えば図５に示したもののようなＤｋｋ相互作用タンパク質への結合を増強または阻害することのどちらかによって活性を変調することができる。本発明はさらにまた該組成物が例えば図示したもののようなＤｋｋまたはＤｋｋ−１のアプタマーを含むような方法を提供する。本発明の組成物は例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマーを含んでいてよい。本発明の好ましい組成物はさらにまたＬＲＰ５抗体を含む。
本発明のまた別の態様は、Ｄｋｋ活性を変調する、またはＬＲＰ５（またはＬＲＰ６もしくはＨＢＭ）とのＤｋｋ相互作用を変調する治療有効量の組成物を投与するステップを含む、被検対象におけるＷｎｔシグナル伝達を変調する方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、Ｄｋｋタンパク質はＤｋｋ−１である。特に好ましい実施形態では、Ｄｋｋ−１活性は低下させられる。また別の実施形態では、Ｄｋｋ活性は骨量および／または脂質濃度を変調する。１つの好ましい実施形態では、骨量は増加させられ、および／または脂質濃度が低下させられる。また別の好ましい実施形態では、骨量における変調とは骨折率の減少、部分的骨密度の上昇、容積骨塩密度の上昇、骨梁連結性の上昇、骨梁密度の上昇、皮質密度もしくは皮質厚の上昇、骨径の増加、および無機質骨含量の増加のうちの１つ以上を介して決定される骨の強度の増加である。また別の好ましい実施形態では、ＷｎｔはＷｎｔ１〜Ｗｎｔ１９である。特に好ましい実施形態では、ＷｎｔはＷｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、もしくはＷｎｔ１０ｂである。好ましいＷｎｔ変調組成物は１つ以上のＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、もしくはＬＲＰ６／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントを含む。同様に意図されているのは１つ以上のＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子である。本発明はさらにまた該組成物が図６に示したもののようなＤｋｋもしくはＤｋｋ−１の生物学的に活性なフラグメント、もしくはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントまたは図６に示したそれらのフラグメントの模倣物を含むような方法を提供する。Ｄｋｋ変調組成物はさらにまたＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことがある。本発明の組成物は、Ｄｋｋ−１を含むＤｋｋのＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭへの結合またはＤｋｋもしくはＤｋｋ−１の例えば図５に示したもののようなＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質への結合を増強または阻害することのどちらかによって活性を変調することができる。本発明はさらにまた該組成物が例えば図３に示したもの（配列番号１７１〜１８８）のようなＤｋｋまたはＤｋｋ−１のアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むような方法を提供する。本発明はさらにまた、該組成物がＤｋｋもしくはＤｋｋ−１抗体またはＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体を含むような方法を提供する。本発明はさらにまた例えば該組成物がＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２、特にペプチド（配列番号１９１））および図１３（配列番号２０４〜２１４を含む）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むような方法を提供する。本発明のまた別の好ましい組成物はさらにまたＬＲＰ５抗体を含む。
さらに、本発明は被検対象における骨量および／または脂質濃度を変調する方法であって、骨量および／または脂質濃度を変調するために有効な量でＤｋｋ活性またはＤｋｋとＬＲＰ５との相互作用を変調する組成物を該被検対象に投与するステップを含む方法を提供するが、このとき骨量および／または脂質濃度は変調する必要がある。１つの好ましい実施形態では、Ｄｋｋタンパク質はＤｋｋ−１である。特に好ましい実施形態では、Ｄｋｋ−１活性が低下させられる。別の実施形態では、Ｄｋｋ活性が骨量および／または脂質濃度を変調する。１つの好ましい実施形態では、骨量は増加させられ、および／または脂質濃度が低下させられる。また別の好ましい実施形態では、骨量における変調とは骨折率の減少、部分的骨密度の上昇、容積骨塩密度の上昇、骨梁連結性の上昇、骨梁密度の上昇、皮質密度もしくは皮質厚の上昇、骨径の増加、および無機質骨含量の増加のうちの１つ以上を介して決定される骨の強度の増加である。好ましい骨量および／または脂質濃度を変調する組成物は１つ以上のＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、もしくはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントを含む。同様に意図されているのは１つ以上のＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子である。本発明はさらにまた該組成物が図６に示したもののようなＤｋｋ−１を含むＤｋｋの生物学的に活性なフラグメント、もしくはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントまたは図６に示したそれらのフラグメントの模倣物を含むような方法を提供する。Ｄｋｋ変調組成物はさらにまたＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことがある。本発明はさらにまた該組成物が例えば図３に示したもの（配列番号１７１〜１８８）のようなＤｋｋもしくはＤｋｋ−１のアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むような方法を提供する。本発明の組成物はさらにまた、Ｄｋｋ−１を含むＤｋｋのＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭへの結合、またはＤｋｋ−１を含むＤｋｋの例えば図５に示したもののようなＤｋｋ相互作用タンパク質への結合を増強または阻害することのどちらかによって活性を変調することができる。本発明はさらにまた該組成物がＤｋｋもしくはＤｋｋ−１抗体またはＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体を含むような方法を提供する。本発明の組成物は例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２（特にペプチド１３（配列番号１９１））および１３（配列番号２０４〜２１１を含む）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことがある。本発明の好ましい組成物は、さらにまたＬＲＰ５抗体を含む。本発明のまた別の態様は、そのような脂質変調疾患に心臓状態、アテローム性動脈硬化症、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性アポタンパク質ＣＩＩ欠損症、家族性３型高リポタンパク血症、家族性高コレステロール血症、家族性高トリグリセリド血症、多種リポタンパク型高脂血症、透析および／または糖尿病を原因とする脂質濃度上昇、および病因不明の脂質濃度上昇が含まれることである。
本明細書開示した方法および組成物による治療および／または診断のために意図された骨障害には、骨の発達障害、骨折、年齢関連性骨量減少、軟骨形成異常、薬物誘発性骨障害、骨の高度の代謝回転、高カルシウム血症、骨化過剰症、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨粗鬆症、ぺージェット病、変形性関節症、およびくる病が含まれる。
本発明のまた別の目的は、ＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントとの相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＤｋｋまたはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントを１つの化合物へ曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＤｋｋまたはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。特に好ましい実施形態では、Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの結合は低下させられる。
本発明のまた別の目的は、ＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはそのＤｋｋ結合フラグメントとの相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＤｋｋまたはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントを１つの化合物へ曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントとの相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。特に好ましい実施形態では、Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用は低下させられる。
本発明のまた別の目的は、ＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントとの相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＤｋｋまたはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントを１つの化合物へ曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＤｋｋまたはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントに結合するかどうかを決定するステップと、
（ｃ）さらに前記化合物がＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントとの相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。
このような方法の１つの好ましい実施形態では、Ｄｋｋまたはその生物学的に活性なフラグメントは固体基質に付着させられる。本発明のまた別の実施形態では、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ、またはその生物学的に活性なフラグメント（例えば、リガンド結合ドメイン）が該化合物に曝露させられる。本発明のまた別の態様は、本明細書開示した方法によって同定される化合物および組成物を提供する。本発明の好ましい実施形態は、上記の方法によってスクリーニングされた化合物が図５に示したようなＤｋｋ、特にＤｋｋ−１と相互作用する１つ以上のタンパク質、またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントであることを提供する。また別の好ましい実施形態は、該化合物が例えば図３に示したもの（配列番号１７１〜１８８）のようなＤｋｋもしくはＤｋｋ−１ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことを提供する。該化合物はさらにまたＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含んでいてよい。本方法はさらにまた、該化合物がＤｋｋもしくはＤｋｋ−１抗体またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体を含むことを提供する。本発明はさらにまた、該化合物が例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２（特にペプチド１３（配列番号１９１））および図１３（配列番号２０４〜２１４を含む）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含んでいてよいことを提供する。本発明の好ましい化合物は、さらにまたＬＲＰ５抗体を含む。
本発明のまた別の目的は、ＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを１つの化合物へ曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
本発明のまた別の目的は、ＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを１つの化合物へ曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。
本発明のまた別の目的は、ＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを１つの化合物へ曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントに結合するかどうかを決定するステップと、
（ｃ）さらに前記化合物がＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
このような方法の好ましい実施形態では、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、特にＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントが固体基質に付着させられる。本発明のまた別の態様は、上記の方法によって同定された化合物および組成物を提供する。１つの好ましい実施形態は、該化合物が例えば図３に示したもの（配列番号１７１〜１８８）のようなＤｋｋもしくはＤｋｋ−１ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことを提供する。該化合物は、さらにまたＤｋｋ相互作用タンパク質もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことができる。該化合物は、Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体を含んでいてよい。
本発明のまた別の目的は、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ変調化合物とそのための医薬上許容される賦形剤および／または担体とを含む骨量障害を治療するための組成物を提供することである。好ましいＬＲＰ５（またはＬＲＰ６もしくはＨＢＭ）変調化合物には、ＤｋｋもしくはＤｋｋ−１またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントが含まれる。同様に意図されるのはＤｋｋ−１を含むＤｋｋに結合するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントと医薬上許容される賦形剤および／または担体とを含む化合物である。また別の好ましい実施形態は、該変調化合物が１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメントを含むことを提供する。同様に意図されるのは、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に結合するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその免疫学的に活性なフラグメント、またはその生物学的に活性なフラグメントと、医薬上許容される賦形剤および／または担体とを含む化合物である。また別の実施形態は、該変調化合物がＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子を含むことを提供する。別の好ましい実施形態は、該変調化合物はＤｋｋもしくはＤｋｋ−１ペプチドアプタマー、ＤｋｋもしくはＤｋｋ−１ペプチドアプタマーの模倣物、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことを提供する。また別の実施形態は、該化合物が例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２（特にペプチド））および図１３（配列番号２０４〜２１４）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことを提供する。本発明の好ましい化合物はさらにまたＬＲＰ５抗体を備えている。
本発明のまた別の目的は、Ｄｋｋ活性を変調する化合物と医薬上許容される賦形剤を含むそのための担体とを含むＤｋｋ媒介性の疾患もしくは状態を治療するための医薬組成物を提供することである。このような組成物には、該化合物がＤｋｋ−１を含むＤｋｋに結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子を含んでおり、そしてそれによって該化合物がＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭと相互作用することを防止する組成物が含まれる。その他のこのような組成物には、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントへ結合する例えば図５に示したもの、もしくはそのＤｋｋ結合フラグメントのような１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはその免疫学的に活性なフラグメントが含まれる。その他に意図される組成物には、Ｄｋｋ相互作用またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子が含まれる。その他の意図される組成物には図３（配列番号１７１〜１８８）に示したもののようなＤｋｋおよびＤｋｋ−１ペプチドアプタマー、そのようなアプタマーの模倣物、Ｄｋｋ相互作用またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物が含まれる。その他の意図される組成物は例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２）（特にペプチド１３（配列番号１９１））および図１３（配列番号２０４〜２１４を含む）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含む。本発明のその他の好ましい組成物には、ＬＲＰ５抗体が含まれる。
本発明のまた別の目的は、例えば図５に示したもののような生物中のＤｋｋ相互作用タンパク質もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸の発現を変調する方法であって、該生物にＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸の発現を変調する有効量の組成物を投与するステップを含む方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、前記組成物はＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子を含む。
本発明の１つの態様は、ＤｋｋもしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する方法であって、ＤｋｋもしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する有効量の組成物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明は、例えば図５に示したもののようなＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む組成物を提供する。この方法のために意図されているその他の物質は、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子である。本方法はさらに、該組成物がＤｋｋもしくはＤｋｋ−１抗体またはＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体を含むことを提供する。また別の好ましい実施形態では、該組成物はＤｋｋもしくはＤｋｋ−１ペプチドアプタマー、ＤｋｋもしくはＤｋｋ−１ペプチドアプタマーの模倣物、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含む。本方法は、本発明の組成物が例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２）（特に（配列番号１９１）を含むペプチド）および（配列番号２０４〜２１４）を含む図のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含んでいてよいことを提供する。本発明の好ましい組成物はさらにまたＬＲＰ５抗体を含む。また別の好ましい実施形態では、変調されたＤｋｋ活性は脂質の変調または骨量の変調である。
最終的にＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭシグナル伝達に影響を及ぼす化合物もしくは組成物を入手するための下記で考察する本発明の試験／スクリーニング実施形態のすべてにおいて、当業者であればＨＢＭは試験サンプルもしくは化合物の不在下でコントロールとして使用できることを認識するであろう。さらに、試験サンプルの化合物がＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を通してＷｎｔシグナル伝達に及ぼす作用は必ずしもＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの関連もしくは相互作用の直接的測定を必要としない。その他の陽性の表現型／活性は、高骨量表現型またはコントロールとしてＨＢＭを使用することによって確立される。
本発明の１つの態様はＤｋｋタンパク質のための結合パートナーを同定するための方法であって、
（ａ）１つ以上のＤｋｋタンパク質またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合フラグメントを潜在的結合パートナーへ曝露させるステップと、
（ｂ）潜在的結合パートナーがＤｋｋタンパク質またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
本発明のまた別の態様は、Ｄｋｋ媒介性活性に影響を及ぼす化合物を同定するための方法であって、
（ａ）（１）調節可能な１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質遺伝子、（２）１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質遺伝子のノックアウトまたは（３）１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質遺伝子のノックインを有する１群のトランスジェニック動物を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）におけるトランスジェニック動物群に対して各々第２群のコントロール動物を用意するステップと、
（ｃ）トランスジェニック動物群およびコントロール動物群を骨量または脂質濃度を変調する潜在的Ｄｋｋを変調する化合物へ曝露させるステップと、
（ｄ）トランスジェニック動物群とコントロール動物群とを比較し、そして該化合物がコントロール動物と比較してトランスジェニック動物における骨量または脂質濃度に及ぼす作用を決定するステップと
を含む方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
本発明のまた別の態様は、１つの化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質を変調するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを前記少なくとも１つの化合物の存在下でＤｋｋのリガンド結合ドメインと混合するステップと、
（ｂ）前記Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントへ結合したＤｋｋの前記結合ドメインの量を前記少なくとも１つの化合物を含まないコントロールと比較して測定するステップと、
（ｃ）該化合物が前記Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントへのＤｋｋの前記結合ドメインの結合の量を減少させるかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
１つの好ましい実施形態では、該結合ドメインが固体基質へ付着させられる。本発明は、さらにまたこの方法によって同定された化合物を提供する。１つの好ましい実施形態では、本発明はＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質が抗体によって検出されることを提供する。また別の好ましい実施形態では、固体基質はマイクロアレイである。また別の好ましい実施形態は、Ｄｋｋおよび／またはＤｋｋ相互作用タンパク質のリガンド結合ドメインがペプチドもしくはタンパク質へ融合または共役結合させられていることを提供する。本発明はさらにまた該化合物にはＤｋｋおよびＤｋｋ−１ペプチドアプタマー、ＤｋｋおよびＤｋｋ−１ペプチドアプタマーの模倣物、ＤｋｋおよびＤｋｋ−１相互作用タンパク質ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物が含まれることを提供する。
本発明の１つの態様は、１つ以上のＤｋｋ−１相互作用タンパク質の１つ以上のポリペプチド配列、またはその生物学的に活性なフラグメント、１つ以上のＤｋｋタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、またはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭポリペプチド配列またはその生物学的に活性なフラグメント（例えば、リガンド結合ドメイン）と医薬上許容される賦形剤および／または担体とを含む組成物を提供する。本発明のまた別の態様は、該組成物がＤｋｋもしくはＤｋｋ−１抗体またはＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体および医薬上許容される賦形剤を含むことを提供する。本発明の組成物は、例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２）（特にペプチド１３（配列番号１９１））および図１３（配列番号２０４〜２１４を含む）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含んでいてよいことを提供する。本発明の好ましい組成物はさらにまた例えば図３に示したもの（配列番号１７１〜１８８）のようなＤｋｋペプチドアプタマーを含んでいてよい。本発明の好ましい組成物はさらにまたＬＲＰ５抗体を含む。
本発明のまた別の態様は、以下の群：ヒトＤｋｋ−１のＡｓｎ３４−Ｈｉｓ２６６（配列番号１１０）、Ａｓｎ３４−Ｃｙｓ２４５（配列番号１１１）、Ａｓｎ３４−Ｌｙｓ１８２（配列番号１１２）、Ｃｙｓ９７−Ｈｉｓ２６６（配列番号１１３）、Ｖａｌ１３９−Ｈｉｓ２６６（配列番号１１４）、Ｇｌｙ１８３−Ｈｉｓ２６６（配列番号１１５）、Ｃｙｓ９７−Ｃｙｓ２４５（配列番号１１６）、またはＶａｌ１３９−Ｃｙｓ２４５（配列番号１１７）から選択されるＤｋｋ−１アミノ酸配列を認識してそれを結合する抗体または免疫学的に活性な抗体フラグメントを提供することである。また別の抗体が図３（配列番号１７１〜１８８）および図４（配列番号１８９〜１９２）に示した配列のいずれかに結合していてよい。本発明のまた別の態様は、以下の１つ以上のアミノ酸配列：ペプチド１−ＧＮＫＹＱＴＩＤＮＹＱＰＹＰＣ（配列番号１１８）、ペプチド２−ＬＤＧＹＳＲＲＴＴＬＳＳＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧ（配列番号１１９）、ペプチド３−ＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ（配列番号１２０）、ペプチド４−ＲＧＥＩＥＥＴＩＴＥＳＦＧＮＤ（配列番号１２１）、およびペプチド５−ＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤ（配列番号１２２）に対するポリクローナル抗体を提供することである。
本発明のまた別の目的は、例えばＤｋｋ−１のようなＤｋｋタンパク質、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質アプタマーをコードする核酸、またはＤｋｋもしくはＤｋｋ−１またはＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸とインフレームであるＧａｌ４もしくはＬｅｘ４の活性化ドメインとインフレームである足場タンパク質をコードする核酸を含むＬＲＰ５アプタマーを提供することである。好ましくは、足場タンパク質はチオレドキシン（ｔｒｘＡ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはＭ１３からのＳ１ヌクレアーゼである。その他の好ましい実施形態には、図６から選択されたＤｋｋ−１アミノ酸配列が含まれる。
本発明のまた別の態様は、図３（配列番号１７１〜１８８）、図４（配列番号１８９〜１９２）、または図５に同定されたＤｋｋ−１相互作用タンパク質のポリペプチド配列と医薬上許容される賦形剤および／または担体とを含む組成物を提供することである。
本発明のまた別の態様には、それらの自然環境における細胞外相互作用を介して結合するペプチド結合対の第１のペプチドおよび第２のペプチドの結合相互作用上の化合物の変調活性を検出する方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの真核細胞を培養するステップであって、このとき真核細胞が
ａ）第１のペプチドまたは転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへ結合したそのセグメントを含む第１の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）第２のペプチドまたは転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへ結合したそのセグメントを含む第２の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（このとき第１のペプチドまたはそのセグメントおよび第２のペプチドまたはそのセグメントの結合は転写活性化タンパク質を再構成する）、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントであって、該レポーターエレメントの発現が選択された表現型を作り出すレポーターエレメントとを含む
ことを特徴とするステップと、
（ｉｉ）選択された表現型を検出するために適した条件下で１つの化合物を真核細胞と一緒に培養するステップと、
（ｉｉｉ）該化合物が選択された表現型を作り出すレポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって該化合物がペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと
（このとき（１）前記第１のペプチドはＤｋｋペプチドであり、第２のペプチドはＬＲＰ５、ＨＢＭ、ＬＲＰ６、およびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭのＤｋｋ結合部分から選択されるペプチドである、または（２）前記第１のペプチドはＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントであり、前記第２のペプチドはＤｋｋペプチドである）、を含む方法が含まれる。
１つの実施形態では、真核細胞は酵母細胞である。１つの好ましい実施形態では、酵母細胞はサッカロミセスである。特に好ましい実施形態では、サッカロミセス細胞はサッカロミセス・セレヴィシエである。本発明はさらにまた、該化合物がＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメントを含んでいてよいことを提供する。１つの実施形態では、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントがアッセイへ直接に添加される。また別の実施形態では、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントは第１および第２のペプチドに加えて真核細胞によって組換え的に発現させられる。１つの好ましい実施形態では、該化合物はＤｋｋもしくはＤｋｋ−１アプタマー、ＤｋｋもしくはＤｋｋ−１ペプチドアプタマーの模倣物、Ｄｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質アプタマー、またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質アプタマーの模倣物を含む。その他の好ましい実施形態は、該化合物が例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２）（特にペプチド１３（配列番号１９１））および図１３（配列番号２０４〜２１４を含む）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことを提供する。あるいはまた、本発明はさらに該化合物がＬＲＰ５抗体またはＤｋｋ抗体を含んでよいことを提供する。また別の実施形態では、酵母細胞はさらに転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列、およびレポーターエレメントをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択された少なくとも１つの内因性ヌクレオチド配列を含むが、このとき少なくとも１つの内因性ヌクレオチド配列は突然変異または欠失によって不活化されている。また別の実施形態では、ペプチド結合対はリガンドおよびそれに該リガンドが結合する受容体を含む。１つの実施形態では、転写活性化タンパク質はＧａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳動物核受容体である。また別の実施形態では、異種融合タンパク質の少なくとも１つが自己複製プラスミドから発現させられる。１つの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは転写活性化タンパク質の異種ＤＮＡ結合ドメインを含む。１つの好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は哺乳動物ステロイド受容体および細菌ＬｅｘＡタンパク質からなる群から選択される。また別の実施形態では、レポーターエレメントはｌａｃＺ、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド、およびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、レポーターエレメントはｌａｃＺである。
本発明はさらにまた１つの化合物がペプチド結合対の第１のペプチドおよび第２のペプチドの結合相互作用を変調する活性を検出するためのレスキュースクリーニングであって、
（ｉ）少なくとも１つの酵母細胞を培養するステップであって、このとき酵母細胞が
ａ）第１のペプチドまたは転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへ結合したそのセグメントを含む第１の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）第２のペプチドまたは転写活性化タンパク質の転写活性ドメインへ結合したそのセグメントを含む第２の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（このとき第１のペプチドまたはそのセグメントおよび第２のペプチドまたはそのセグメントの結合は転写活性化タンパク質を再構成する）、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントであって、該レポーター遺伝子の発現が選択された表現型が現れるのを防止するレポーターエレメントと、を含むステップと、
（ｉｉ）選択された表現型を検出するために適した条件下で１つの化合物を酵母細胞と一緒に培養するステップと、
（ｉｉｉ）該化合物が選択された表現型が現れるのを防止するレポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって該化合物がペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと
（このとき前記第１のペプチドはＤｋｋペプチドであり、第２のペプチドはＬＲＰ５、ＨＢＭ、ＬＲＰ６、およびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントである）、を含む方法が含まれるレスキュースクリーニングを提供する。
１つの好ましい実施形態では、本発明は酵母細胞がサッカロミセス（Saccharomyces）であることを提供する。特に好ましい実施形態では、サッカロミセス細胞はサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae)である。１つの実施形態では、該化合物は１つ以上のＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントを含む。本発明で使用する化合物は、例えばＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２）（特にペプチド１３（配列番号１９１））および図１３（配列番号２０４〜２１４を含む）のようなＬＲＰ５ペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物を含むことができる。あるいはまた、該化合物はＬＲＰ５抗体またはＤｋｋ抗体を含んでいてよい。また別の実施形態では、該酵母細胞はさらに転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列、およびレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択された少なくとも１つの内因性ヌクレオチド配列を含むが、このとき少なくとも１つの内因性ヌクレオチド配列は突然変異または欠失によって不活化されている。また別の実施形態では、転写活性化タンパク質はＧａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳動物核受容体である。１つの実施形態では、異種融合タンパク質の少なくとも１つは自己複製プラスミドから発現させられる。また別の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは転写活性化タンパク質の異種ＤＮＡ結合ドメインである。
本発明はさらにまた１つの化合物がペプチド結合対の第１のペプチドおよび第２のペプチドの結合相互作用に及ぼす変調活性を検出するためのレスキュースクリーニングであって、
（ｉ）少なくとも１つの酵母細胞を培養するステップであって、このとき酵母細胞が、
ａ）第１のペプチドまたは転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへ結合したそのセグメントを含む第１の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）第２のペプチドまたは転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインへ結合したそのセグメントを含む第２の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（このとき第１のペプチドまたはそのセグメントおよび第２のペプチドまたはそのセグメントの結合は転写活性化タンパク質を再構成する）、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントであって、該レポーターエレメントの発現が選択された表現型が現れるのを防止するレポーターエレメントと、を含むステップと、
（ｉｉ）選択された表現型を検出するために適した条件下で１つの化合物を酵母細胞と一緒に培養するステップと、
（ｉｉｉ）該化合物が選択された表現型が現れるのを防止するレポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって該化合物がペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと、
（このとき前記第１のペプチドはＤｋｋ相互作用もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質ペプチドであり、第２のペプチドはＤｋｋもしくはＤｋｋ−１ペプチドである）、
を含む方法が含まれるレスキュースクリーニングを提供する。
レスキュースクリーニングの好ましい実施形態では、酵母細胞はサッカロミセスである。特に好ましい実施形態では、サッカロミセス細胞はサッカロミセス・セレヴィシエである。また別の実施形態では、酵母細胞はさらにまた転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列、およびレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択された少なくとも１つの内因性ヌクレオチド配列を含むが、このとき少なくとも１つの内因性ヌクレオチド配列は突然変異または欠失によって不活化されている。１つの実施形態では、転写活性化タンパク質はＧａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳動物核受容体である。レスキュースクリーニングのまた別の実施形態では、異種融合タンパク質の少なくとも１つは自己複製プラスミドから発現させられる。また別の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは転写活性化タンパク質の異種ＤＮＡ結合ドメインである。
本発明はさらにまたＤｋｋ活性を変調する潜在的化合物を同定するための方法であって、
ａ）１つの化合物の存在下および不在下において１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントと、ＤｋｋまたはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントとの結合に及ぼす影響を測定するステップと、
ｂ）１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントとＤｋｋまたはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭフラグメントとの間の結合を変調する化合物を潜在的Ｄｋｋを変調する化合物であると同定するステップと
を含む方法を提供する。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
本発明はさらにまた図３のＤｋｋペプチドアプタマー（配列番号１７１〜１８８）のいずれかを提供する。本発明はさらにまた図４のＬＲＰペプチドアプタマー（配列番号１８９〜１９２）のいずれかを提供する。
本発明のまた別の態様は、ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調する物質を同定する方法であって、
（ａ）ＤｋｋをコードするｍＲＮＡおよび１種の物質をアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）割球内へ注入するステップと、
（ｂ）体軸重複を評価する、またはマーカー遺伝子発現を解析するステップと；および
（ｃ）体軸重複またはマーカー遺伝子発現における変化を引き出す物質を、ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調する物質であると同定するステップと
を含む方法を提供する。このとき該物質は特にＤｋｋ相互作用タンパク質をコードするｍＲＮＡ、そのフラグメント、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、および抗体から選択することができる。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。また別の実施形態では、ＨＢＭ、ＬＲＰ５／６、いずれかのＷｎｔ（Ｗｎｔ１〜Ｗｎｔ１９、特にＷｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、およびＷｎｔ１０ｂを含む）、Ｗｎｔアンタゴニスト、またはこれらの組み合わせのｍＲＮＡがアフリカツメガエル割球内に共注入される。また別の実施形態では、解析されるマーカー遺伝子はＳｉａｍｏｉｓ、Ｘｎｒ３、ｓｌｕｇ、Ｘｂｒａ、ＨＮＫ−１、ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｎ、Ｘｌｈｂｏｘ８、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＸＬＲＰ６、ＥＦ−１またはＯＤＣを含むことができよう。
本発明はＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調する物質を同定するための方法であって、
（ａ）Ｄｋｋおよび潜在的Ｄｋｋ相互作用タンパク質をコードする構築物、そのｍＲＮＡフラグメント、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはアンチセンス、をＬＲＰ５／ＨＢＭ／ＬＲＰ６／Ｄｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質に対する抗体を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
（ｂ）Ｗｎｔ反応性プロモーターへ連結したレポーター遺伝子の発現における変化を評価するステップと、
（ｃ）Ｄｋｋ構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかのタンパク質をＤｋｋ相互作用タンパク質であると同定するステップと
を含む方法を提供する。また別の好ましい実施形態では、該細胞はＨＯＢ−０３−ＣＥ６、ＨＥＫ２９３、またはＵ２ＯＳ細胞であってよい。
また別の実施形態では、Ｗｎｔ反応性プロモーターはＴＣＦまたはＬＥＦである。その他の好ましい実施形態では、該細胞はＣＭＶ β−ガラクトシダーゼまたはｔｋ−Ｒｅｎｉｌｌａを用いて共トランスフェクトされる。
本発明はさらにまた、アミノ酸配列ＭＹＷＴＤＷＶＥＴＰＲＩＥ（配列番号１２３）、ＭＹＷＴＤＷＧＥＴＰＲＩＥ（配列番号１２４）、ＫＲＴＧＧＫＲＥＩＬＳＡ（配列番号１２５）、ＥＲＶＥＫＴＴＧＤＫＲＴＲＩＱＧＲ（配列番号１２６）、またはＫＱＱＣＤＳＦＰＤＣＩＤＧＳＤＥ（配列番号１２７）の１つ以上のペプチドに対するＬＲＰ５／ＨＢＭモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供する。
さらに、本発明はＤｋｋおよびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭを固体表面へ固定化するステップと、
（ｂ）分泌Ｄｋｋタンパク質もしくは分泌エピトープタグＤｋｋおよび試験化合物を用いて固体表面を処理するステップと、
（ｃ）Ｄｋｋもしくはエピトープタグに対する抗体を使用して、またはエピトープタグの活性を直接に測定するステップによって、該化合物がＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの間の結合を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。
１つの実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。１つの好ましい実施形態では、エピトープタグはアルカリホスファターゼ、ヒスチジン、ｍｙｃまたはＶ５タグである。
本発明のまた別の実施形態は、ＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭの相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）第１蛍光タグを使用してＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭ蛍光融合タンパク質を作製するステップと、
（ｂ）第２蛍光タグを含むＤｋｋ融合タンパク質を作製するステップと、
（ｃ）試験化合物を添加するステップと、
（ｄ）蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を使用して該化合物がＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭの相互作用を変調するかどうかを決定するために蛍光タグ放出の比率における変化を評価するステップと
を含む方法を提供する。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
本発明はさらに、被検対象における低もしくは高骨量および／または低もしくは高脂質濃度を診断する方法であって、該被検対象におけるＤｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭまたはＨＢＭ様変異体の発現を検査し、そして該被検対象が（ａ）高骨量もしくは低骨量および／または（ｂ）高脂質もしくは低脂質濃度を有しているかどうかを決定するためにＤｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭまたはＨＢＭ様変異体が過剰もしくは過小発現しているかどうかを決定するステップを含む方法を提供する。
本発明はさらに、組織特異的方法でＤｋｋがノックアウトされているトランスジェニック動物を提供する。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。１つの好ましい実施形態では、組織特異性は骨組織である。また別の実施形態では、組織特異性は肝臓または脂質代謝を変調することに関わるその他の組織もしくは細胞または癌組織である。
本発明はさらに、ＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭとの相互作用を変調する化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）ＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭ、またはＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントを１つの化合物へ曝露させるステップと；および
（ｂ）前記化合物がＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭ、またはＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントへ結合したかどうかを決定し、そして前記化合物がＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭとの相互作用を変調するかどうかを決定するステップと、を含む方法を提供する。
１つの実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。１つの好ましい実施形態では、該化合物はＬＲＰ５ペプチドアプタマーを含む。他の好ましい組成物には、ＯＳＴ２６２（配列番号２０８）、図４（配列番号１８９〜１９２）（特にペプチド１３（配列番号１９１）を含む）および図１３（配列番号２０４〜２１４）のペプチドアプタマー、またはそのようなアプタマーの模倣物、およびＬＲＰ５抗体が含まれる。
本発明はさらにまた、ＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を変調する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭを固体表面へ不動化するステップと、
（ｂ）分泌Ｄｋｋタンパク質もしくは分泌エピトープタグＤｋｋおよび試験化合物を用いて固体表面を処理するステップと、
（ｃ）Ｄｋｋに対する抗体もしくはエピトープタグを使用して、または１つのエピトープタグの活性を直接的に測定することによって該化合物がＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ相互との結合を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。１つの好ましい実施形態では、該エピトープタグはアルカリホスファターゼ、ヒスチジン、ｍｙｃまたはＶ５タグである。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
本発明はさらに、ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＤｋｋおよびＷｎｔタンパク質を含有する構築物を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
（ｂ）Ｗｎｔ反応性プロモーターへ連結したレポーターエレメントの発現における変化を評価するステップと、
（ｃ）Ｄｋｋ構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかの化合物をＤｋｋ／Ｗｎｔ相互作用を変調する化合物であると同定するステップと
を含む方法を提供する。
１つの実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。また別の実施形態では、ＷｎｔはＷｎｔ１〜Ｗｎｔ１９である。１つの好ましい実施形態では、ＷｎｔはＷｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、またはＷｎｔ１０ｂである。特に好ましい実施形態では、Ｗｎｔ構築物はＷｎｔ３ａを含有する。別の特に好ましい実施形態では、Ｗｎｔ構築物はＷｎｔ１を含有する。また別の好ましい実施形態では、Ｗｎｔ構築物は正規Ｗｎｔ経路を通してシグナル伝達するＷｎｔをコードする。特に好ましい実施形態では、Ｗｎｔ３ａおよびＷｎｔ１構築物はどちらも細胞内へ共トランスフェクトされる。また別の実施形態では、細胞はＵ２−ＯＳ、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６、またはＨＥＫ２９３細胞であってよい。また別の実施形態では、使用されるレポーターエレメントはＴＣＦ−ルシフェラーゼ、ｔｋ−Ｒｅｎｉｌｌａ、またはその組み合わせである。
本発明はさらに、哺乳動物におけるＤｋｋ−媒介性活性を変調する化合物を試験する方法であって、
（ａ）（１）調節可能な１つ以上のＤｋｋ遺伝子、（２）Ｄｋｋ遺伝子のノックアウト、もしくは（３）１つ以上のＤｋｋ遺伝子のノックインを有する１群のトランスジェニック動物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）におけるトランスジェニック動物群に対して各々第２群のコントロール動物を提供するステップと、
（ｃ）骨量または脂質濃度を変調する潜在的Ｄｋｋを変調する化合物へトランスジェニック動物群およびコントロール動物群を曝露させるステップと、
（ｄ）トランスジェニック動物とコントロール動物群とを比較し、そしてコントロール動物群とを比較してトランスジェニック動物における骨量または脂質濃度に該化合物が及ぼす作用を決定するステップと
を含む方法を提供する。１つの好ましい実施形態では、ＤｋｋはＤｋｋ−１である。
本発明はさらに、ＨＢＭ生物学的活性を示す、すなわち「ＨＢＭ様」であるＬＲＰ５の変異体を提供する。好ましい実施形態では、ＬＲＰ５の変異体Ｇ１７１Ｆ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｑ、Ａ６５Ｖ、Ｇ１７１Ｖ、Ｇ１７１Ｉ、およびＡ２１４Ｖが提供される。本発明はさらに上記の方法におけるこれらの変異体のいずれかの使用を提供する。
１．用語の定義
一般に、本出願における用語は、それらの用語が当分野で理解されている方法に一致して使用した。明細書およびクレームを理解する際に役立つように、以下の定義を提供する。
「遺伝子」とは、そのテンプレートまたはメッセンジャーＲＮＡを通して特定ペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。用語「遺伝子」には介在する非コード領域、ならびに調節領域が含まれ、さらに５’末端および３’末端が含まれることがある。
「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）、ｒＲＮＡ、アンチセンス核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、およびポリヌクレオチドを含むがそれらに限定されない一本鎖および二本鎖核酸を含むことが意図されている。この用語には、さらにまたＲＮＡおよび／またはＤＮＡの三本鎖領域または二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのようなハイブリッドが含まれることもある。この用語は、さらにまた例えばビオチン化核酸、トリチル化核酸、蛍光体標識核酸、イノシン等を含むがそれらに限定されない修飾核酸を含むことも意図されている。
「遺伝子配列」とは、１個の遺伝子を含む非転写もしくは非翻訳配列を含有するＤＮＡを含む核酸分子を意味する。この用語はさらにまた、同一ＤＮＡ分子上に存在する１つ以上の遺伝子、１つ以上の遺伝子フラグメント、１つ以上の非転写配列もしくは非翻訳配列のいずれかの組み合わせを含むことも意図されている。
本発明の核酸配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む様々な起源から引き出されてよい。このような配列は、天然型イントロンを含んでも含まなくてもよいゲノムＤＮＡを含んでいてよい。さらに、このようなゲノムＤＮＡはプロモーター領域および／またはポリ（Ａ）配列と結び付けて入手することができる。これらの配列、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡは数種の方法のうちのいずれかで入手することができる。ゲノムＤＮＡは、当分野でよく知られている手段によって適切な細胞から抽出かつ精製することができる。あるいはまた、ｍＲＮＡを細胞から単離して、逆転写またはその他の手段によってｃＤＮＡを作製するために使用することもできる。
「ｃＤＮＡ」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によってＲＮＡテンプレートから生成した相補的もしくはコピーＤＮＡを意味する。したがって「ｃＤＮＡクローン」はクローニングベクターで運ばれた、またはＰＣＲ増幅された当該ＲＮＡ分子にそのうちの１本の鎖が相補的である二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。ｃＤＮＡはさらにまた、逆転写酵素による第１鎖合成後に一本鎖化することもできる。この形ではｃＤＮＡは有用なＰＣＲテンプレートであり、クローニングベクターで運ばれる必要がない。この用語には、介在配列が取り除かれている遺伝子が含まれる。したがって、時々一般的に使用されるように、用語「遺伝子」はさらにｃＤＮＡおよびｃＤＮＡクローンを含む核酸分子を含んでいてよい。
「組換えＤＮＡ」とは、インビトロでｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列をスプライシングすることによって、または例えばＰＣＲ突然変異誘発のような方法によって配列を変化させることによって工学的に作製された分子を意味する。
「クローニング」とは、特定遺伝子またはその他のＤＮＡ配列をベクター分子内に挿入するためのインビトロ組換え技術の使用を意味する。所望の遺伝子をクローン化するのに成功するためには、ＤＮＡフラグメントを生成させる方法、該フラグメントをベクター分子へ結合させる方法、複合ＤＮＡ分子をその中で複製できる宿主細胞内へ導入する方法、およびレシピエント宿主細胞の中から標的遺伝子を有するクローンを選択する方法を使用することが必要である。
「ｃＤＮＡライブラリー」とは、一緒に特定組織もしくは細胞源内で発現した遺伝子の全もしくは部分範囲を含むｃＤＮＡ挿入断片を含有する組換えＤＮＡ分子のコレクションを意味する。このようなｃＤＮＡライブラリーは当業者によく知られている方法によって作製することができ、例えばＣｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ａｕｓｔｉｎ，「ｃＤＮＡライブラリープロトコール（ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）によって記載されている。
「クローニングビヒクル」とは、宿主細胞中で複製することができるプラスミドもしくはファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列を意味する。この用語には、さらにまた例えばＢＡＣｓおよびＹＡＣｓのような人工染色体を含むことができる。クローニングビヒクルは、そこで形質転換細胞の同定において使用するために適合するマーカーを含むことのあるＤＮＡの本質的な生物学的機能の消失を伴わずにそのようなＤＮＡ配列を確定方法で切断できる１つ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする。
「発現」とは、遺伝子配列の転写および、例えば遺伝子の最終産物を作製するための結果として生じたｍＲＮＡの翻訳のような引き続いての処理ステップを含むプロセスを意味する。最終産物は、タンパク質（例えば、酵素もしくは受容体）または核酸（例えば、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはその他の調節因子）であってよい。用語「発現制御配列」とは、それらの遺伝子と機能的に連結したときに構造的遺伝子の発現を制御または調節するヌクレオチドの配列を意味する。これらには、例えばｌａｃ系、ｔｒｐ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域および原核もしくは真核細胞中の遺伝子発現を制御するために知られているその他の配列が含まれる。発現制御配列は、ベクターが原核宿主もしくは真核宿主中の機能的に連結した遺伝子を発現させるように構成されているかどうかに依存して変動し、そして例えばエンハンサーエレメント、終結配列、組織特異的エレメントおよび／または翻訳開始および終結部位のような転写エレメントを含んでいてよい。
「発現ビヒクル」とは、クローニングビヒクルに類似するが、宿主内へ形質転換された後にその中にクローン化されている遺伝子を発現させることのできるビヒクルもしくはベクターを意味する。クローン化遺伝子は、通常は発現制御配列の制御下に置かれて（すなわち、機能的に連結されて）いる。
「オペレーター」とは、特異的リプレッサーと相互作用して、それにより１つ以上の隣接遺伝子の転写を制御することのできるＤＮＡ配列を意味する。
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが認識することのできるＤＮＡ配列を意味する。このような配列が存在すると、ＲＮＡポリメラーゼは機能的に連結した配列に結合してその転写を開始することができる。
「プロモーター領域」は、プロモーターならびに転写開始のために必要な可能性があるその他の遺伝子配列を含むことが意図されている。プロモーター領域が存在すると、機能的に連結した遺伝子配列の発現を十分に惹起することができる。用語「プロモーター」は、当分野においてときどき一般的にプロモーター領域を示すために使用されている。当分野では一定の細胞型における遺伝子の発現を指令する多数の様々なプロモーターが知られている。組織特異的プロモーターは、一定の組織タイプの細胞中でより大きな（またはより低い）発現レベルを惹起する核酸配列を含むことができる。
「機能的に連結した」とは、プロモーターが遺伝子の発現の開始を制御することを意味する。プロモーターは、宿主細胞内に導入されると該プロモーターが１つ以上のＲＮＡ種内への１つ以上の隣接ＤＮＡ配列の転写を決定する場合に、近接ＤＮＡの配列へ機能的に連結されている。プロモーターは、該プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を開始することができる場合はＤＮＡ配列に機能的に連結している。
「原核生物」とは、細菌を含む真の核を有していないすべての生物を意味する。
「真核生物」とは、哺乳動物細胞を含む真の核を有する生物および細胞を意味する。
「宿主」には、例えば酵母や糸状菌、ならびに植物および動物細胞のような原核生物および真核生物が含まれる。この用語には、複製可能な発現ビヒクルのレシピエントである生物または細胞が含まれる。
用語「動物」は、ここではヒトを除くすべての脊椎動物を含むように使用する。動物にはさらにまた、胚形成期および胎生期を含む全発生期にある個体動物が含まれる。好ましい動物には、例えば鳥類、齧歯類（例えば、マウス、ウサギ、ラット、チンチラ、モルモット、ハムスター等）、および哺乳類のような高等真核生物が含まれる。好ましい哺乳動物には、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、バッファロー、ヒト、および霊長類が含まれる。
「トランスジェニック動物」は、例えば組換えウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス）を用いてのマイクロインジェクションもしくは感染によるような、細胞以下レベルでの操作された先祖から、直接的もしくは間接的に、故意による遺伝操作によって、または遺伝によって受容した遺伝情報を持っている１つ以上の細胞を含有する動物である。導入されたこのＤＮＡ分子は、染色体内に統合されてよい、または染色体外複製ＤＮＡであってよい。
ここで使用する「胚性幹細胞」もしくは「ＥＳ細胞」は、通常はそれらが未分化細胞であることを意味する多分化性である胚に由来する細胞もしくは細胞系である。これらの細胞は、さらにまた相同組換えによって外来性ＤＮＡを取り込み、そして引き続いて宿主胚内に組み込まれると身体内のいずれかの組織内に発達することができる。当分野においてよく知られている方法によって胚組織以外の源から多分化能細胞を単離することは可能である。
マウスにおける胚性幹細胞によって、研究者らはトランスジェニック細胞を選択して遺伝子ターゲティングを実施することが可能になってきた。これは、他のトランスジェニック技術を用いた場合より多数の遺伝子操作を可能にする。例えば、マウスＥＳ細胞はインビトロでコロニーとして相当容易に増殖させることができる。これらの細胞は標準方法および抗生物質耐性によってクローン的に選択したトランスジェニック細胞によってトランスフェクトすることができる。例えば、Ｐｉｎｋｅｒｔ（編集），「トランスジェニック動物テクノロジー：実験ハンドブック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１１５−１４６に掲載されたＤｏｅｔｓｃｈｍａｎら，１９９４，「胚性幹細胞中の遺伝子導入（Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」を参照。さらに、このプロセスの効率は、相同組換え体のための第２選択を許容するように十分なトランスジェニックコロニー（数百個〜数千個）を作製できるような効率である。マウスＥＳ細胞はその後正常宿主胚と結合させることができ、そしてそれらはそれらの潜在力を維持しているので、結果として生じるキメラ動物において生殖細胞を含むすべての組織内に発達させることができる。トランスジェニック修飾は、その後次世代へ伝達することができる。
早期着床前マウス胚から胚性幹（ＥＳ）細胞系をインビトロで誘導するための方法はよく知られている。例えば、Ｅｖａｎｓら，１９８１ Ｎａｔｕｒｅ２９：１５４−６およびＭａｒｔｉｎ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７６３４−８を参照。ＥＳ細胞は、繊維芽細胞のフィーダー層または分化阻害源が存在することを前提に、未分化状態で継代させることができる。
用語「体細胞」とは、***もしくは卵細胞ではない、または***もしくは卵細胞になることのできるあらゆる動物もしくはヒト細胞を示している。用語「生殖細胞」もしくは「生殖細胞系細胞」とは、***もしくは卵細胞のいずれかである、または***もしくは卵細胞内へ発生することができる、そしてこのためにその遺伝情報を子孫へ伝えることのできるあらゆる細胞を意味する。用語「生殖細胞系トランスジェニック動物」とは、遺伝情報が生殖細胞系細胞内に組み込まれており、それによって該情報を子孫へ転送する能力を与えるトランスジェニック動物を意味する。そのような子孫が実際にその情報の一部もしくは全部を有している場合は、それらもまたトランスジェニック動物である。
遺伝情報の遺伝的変化はレシピエントが属する動物種にとって外来のものである場合がある、または特定個別レシピエントにとってのみ外来のものである場合がある。後者の場合には、変化した、もしくは導入された遺伝子はネイティブ遺伝子とは相違して発現することがある。
遺伝子の「フラグメント」とは、遺伝子配列のあらゆる部分を意味する。「生物学的に活性なフラグメント」とは、該遺伝子の少なくとも１つの生物学的活性を維持している遺伝子のあらゆる部分を意味する。例えば、該フラグメントは、おそらくその同系配列にハイブリダイズできる、またはそれに由来する遺伝子によってコードされたポリペプチドフラグメント内に翻訳されることができる。
「変異体」とは、全遺伝子または該遺伝子のフラグメントのいずれかと構造および生物学的活性または免疫学的特徴において実質的に類似である遺伝子を意味する。２つの遺伝子が類似活性を有することを前提に、その用語はここではたとえコードされたアミノ酸残基の配列が同一ではない場合でさえ、それらは変異体と見なされる。優先的に、ここで使用するように（他に定義されていない限り）変異体はＬＲＰ５、ＨＢＭもしくはＬＲＰ６の１つである。変異体は、好ましくはＨＢＭ様表現型を産生する（すなわち、骨量を増強する、および／または脂質濃度を変調する）変異体である。これらの変異体には、ミスセンス突然変異、一ヌクレオチド変異多型（ＳＮＰｓ）、遺伝子もしくは核酸によってコードされたタンパク質のアミノ酸配列における変化を生じさせる突然変異、およびそれらの組合せ、ならびにＨＢＭ遺伝子のエクソンドメインにおけるｃｏｍおよびＨＢＭ様表現型を生じさせるＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６における突然変異が含まれる。
「核酸の増幅」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結増幅（もしくはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）およびＱ−βレプリカーゼの使用に基づく増幅法のような方法を意味する。これらの方法は技術においてよく知られており、例えば米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲを実施するための試薬およびハードウェアは市販されている。ＨＢＭ領域からの配列を増幅させるために有用なプライマーは、好ましくはＨＢＭ領域内、またはその中の標的領域の側面に位置する領域内の配列に相補的であり、そしてそれに特異的にハイブリダイズする。増幅によって生成したＨＢＭ配列は直接にシーケンシングすることができる。あるいはまた、１つ以上の増幅した配列は配列解析前にクローン化されてもよい。
「抗体」とは、ＨＢＭタンパク質およびそのフラグメントまたはＨＢＭ領域から、特にＨＢＭ遺伝子座またはその一部分からの核酸配列に結合できるポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびそのフラグメント、およびその免疫学的結合等価物を意味することができる。好ましい抗体には、さらにまたＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびＨＢＭ変異体へ結合できる抗体が含まれる。用語の抗体は、同種分子実体、または例えば複数の種々の分子実体から作り上げられた血清製剤のような混合物の両方を意味するために使用される。タンパク質はタンパク質合成装置内で合成的に作製して担体分子へ結合させて、数ヵ月間に渡ってウサギに注入することができる。ウサギ血清はＨＢＭタンパク質もしくはフラグメントに対する免疫反応性について試験される。モノクローナル抗体はマウスにタンパク質、またはそのフラグメントを注入することによって作製することができる。モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングして、ＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントを用いて特異的免疫反応性について試験される。Ｈａｒｌｏｗら，「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，Ｈａｒｌｏｗら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）および「抗体を使用する：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｄ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）を参照。これらの抗体はアッセイならびに医薬品において有用である。「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、ヒト化、二重特異性、多重特異性、ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体を含むことが意図されているが、それらに限定されない。
「ＨＢＭタンパク質」は、それがグリシン１７１からバリンへの変化を含有している以外はＺｍａｘ１（ＬＲＰ５）タンパク質と同一であるタンパク質を意味する。ＨＢＭタンパク質は、Ｚｍａｘ１（ＬＲＰ５）真性ホモログをコードするあらゆる生物に対して定義されている。例えば、マウスＨＢＭタンパク質とはグリシン１７１からバリンへの置換を有するマウスＺｍａｘ１（ＬＲＰ５）タンパク質を意味する。
「ＨＢＭ様」とは、細胞中で発現すると骨量、脂質濃度、Ｄｋｋ活性、および／またはＷｎｔ活性を変調することができるＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭの変異体を意味する。
本発明の１つの実施形態では、「ＨＢＭ遺伝子」とはＨＢＭの特徴もしくは表現型を示している個体において見いだされるゲノムＤＮＡ配列を意味するが、このとき該配列は配列番号４によって示されるタンパク質をコードする。ＨＢＭ遺伝子およびＺｍａｘ１（ＬＲＰ５）遺伝子は対立遺伝子である。ＨＢＭ遺伝子によってコードされるタンパク質は骨量増加を誘導する特性を有するが、Ｚｍａｘ１（ＬＲＰ５）によってコードされるタンパク質はこの特性を有していない。ＨＢＭ遺伝子およびＺｍａｘ１（ＬＲＰ５）遺伝子は、ＨＢＭ遺伝子が５８２位でチミンを有するが、Ｚｍａｘ１（ＬＲＰ５）遺伝子は５８２位でグアニンを有するという点で相違する。ＨＢＭ遺伝子は配列番号２として示した核酸配列を含む。ＨＢＭ遺伝子はさらにまた「ＨＢＭ多型」と呼ぶこともできる。他のＨＢＭ遺伝子はさらにまた例えば以下の第３章で考察するようなサイレント突然変異を有することがある。
本発明のまた別の実施形態では、「ＨＢＭ遺伝子」はさらにまた結果としてＨＢＭ表現型を生じるＺｍａｘ１（ＬＲＰ５）もしくはＬＲＰ６のいずれかの対立遺伝子変異体も意味する。このような変異体には、ここで記載したような野生型タンパク質コード配列からの変化および／またはＺｍａｘ１（ＬＲＰ５）の発現制御配列における変化を含むことがある、または結果として生じるタンパク質が骨量を増強する、および／または脂質濃度を変調する表現型を生成するようにＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６におけるアミノ酸突然変異を含有する。このような変異体の好ましい例は、Ｚｍａｘ１（ＬＲＰ５）タンパク質の発現増加を生じさせる内因性Ｚｍａｘ１（ＬＲＰ５）プロモーター領域の変化である。
「正常」、「野生型」、「影響を受けない」、「Ｚｍａｘ１」、「Ｚｍａｘ」、「ＬＲ３」および「ＬＲＰ５」はすべて配列番号３によって指示されるタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列を意味する。ＬＲＰ５はさらにまたマウスにおいてはＬＲＰ７とも言われてきた。Ｚｍａｘ１、ＬＲＰ５およびＺｍａｘは本明細書を通して互換的に使用することができ、おそらくは相違する生物における遺伝子にのみ関連する同一遺伝子であることを意味する。Ｚｍａｘ１遺伝子はヒト配列における５８２位でグアニンを有している。ヒトのＺｍａｘ１遺伝子は配列番号１として示される核酸配列を含む。「正常」、「野生型」、「影響を受けない」、「Ｚｍａｘ１」および「ＬＲＰ５」はすべて骨量増加には貢献しないタンパク質をコードするゲノム配列の対立遺伝子変異体も意味する。Ｚｍａｘ１（ＬＲＰ５）遺伝子はヒト集団において一般的であるが、ＨＢＭ遺伝子はまれである。
「骨の発達」とは、一般に例えば正常発達、および症患状態中に発生する変化および加齢中に発生する変化を含む経時的な骨の変化に含まれるあらゆるプロセスを意味する。これは例えば成長率、吸収率、骨修復率等のような構造的変化および動的比率の変化を意味することがある。「骨の発達障害」は、特に例えば疾患状態中に発生する変化および加齢中に発生する変化を含む骨の発達におけるあらゆる障害を意味する。骨の発達は本質的に漸進的または周期的なことがある。発達中に変化する可能性がある骨の態様には、例えば無機物化、特異的解剖学的特徴の形成、および種々の細胞型の相対数もしくは絶対数が含まれる。
「骨の変調」もしくは「骨形成の変調」とは、当業者には理解されるように、例えば特に破骨細胞および骨芽細胞活性による骨吸収および付加骨成長を含む骨リモデリングに含まれる生理学的プロセスのいずれかに影響を及ぼす能力を意味しており、そしてここで使用するように骨形成および発達の一部または全部を含むことがある。
骨は破骨細胞による古い、もしくは不要な骨の再生および骨芽細胞による新しい骨の再建を通して持続的に適応および再生し続ける動的組織である。これらのプロセス間の結び付きの性質は、成長中の骨のモデリングならびに機械的使用の毎日の必要を満たすためのリモデリングおよび修復を通した成体骨格完全性の維持両方に責任を負っている。骨吸収と形成の間の平衡がくずれた結果として生じる多数の疾患がある。加齢に伴って、骨の代謝回転には段階的な「生理学的」不均衡が生じ、この不均衡は漸進的な骨量減少をもたらすエストロゲンサポートの閉経期消失を原因として特に女性において悪化する。骨塩密度が集団標準値より下へ低下するにつれて、結果として骨虚弱性および特発性骨折への易罹患性が増加する。骨が１０％減少する毎に骨折リスクは２倍になる。脊椎もしくは近位大腿骨において正常ピーク骨量より２．５標準偏差以上低い骨塩密度（ＢＭＤ）を有する個体は骨粗鬆症性であると分類されている。しかし正常値より１〜２．５標準偏差低いＢＭＤを有する骨量減少性個体は明確にリスク状態にある。
骨は数種の形態のＸ線吸光光度分析法によって測定される。これらの機器のすべてが骨の無機質量もしくは骨ミネラル量を測定する。標準ＤＸＡ測定値は、伝統的な密度の定義による真の密度測定値（質量／単位容積）ではない面積密度である数値を提供する。それでもこれは骨粗鬆症を診断するために臨床的に使用される測定タイプである。しかしＢＭＤは骨の強度にとって主要な寄与因子ではあるが、骨の強度の４０％は以下を含む他の因子から生じる：１）骨のサイズ（すなわち、径が大きければ、たとえ低密度であっても、器官レベルの剛性が増加する）；２）骨梁構造の連結性；３）リモデリングのレベル（リモデリング位置は歪みの局所的コンセントレータである）；および４）順に負荷履歴（すなわち、累積疲労損傷を通しての）の関数である骨材料自体の固有強度およびコラーゲン架橋結合の程度および無機物化のレベル。骨格外の多数の影響（例えば、骨量減少パターン、軟組織充填、および中枢神経系反射反応性）と同様に、これらの強度／脆弱性の因子の全部が骨粗鬆症性骨折において何らかの役割を果たすという明確な証拠がある。
これらの骨の特徴を取り扱うために追加の分析用機器を使用することができる。例えば、ｐＱＣＴはサイズおよび密度についての個別骨梁および皮質区画の測定を許容し、そしてμＣＴは例えば骨梁連結性のような構造上の特徴に関する定量的情報を提供する。μＣＴはまた、忠実な骨密度を測定する。これらのツールを用いると、疾患の程度および治療の有効性を診断するために重要な非ＢＭＤパラメータを測定することができる。骨粗鬆症のための最新治療法は、薬物が骨吸収を防止または遅延させる能力に基づいている。より新規の抗吸収性物質は骨粗鬆症の治療において有用であることを実証しつつあり、それらは骨量および／または上記の骨質についてのパラメータを増加させるであろう治療法を開発するためのより明確な挑戦に比べて短期的解決策と見なされている。
そこで、骨の変調は例えばｐＤＸＡ Ｘ線法による骨密度（ＢＭＤ）および骨ミネラル量（ＢＭＣ）、Ｘ線によって測定される骨のサイズ、厚さもしくは容積、カルセイン標識によって測定される骨形成率、ｐＱＣＴおよび／またはμＣＴ法によって測定される総、骨梁、および中軸密度、μＣＴ法によって測定される連結性および他の組織学的パラメータ、好ましくは各々大腿骨および脊椎において測定される機械的曲げ強さおよび圧縮強さのようなパラメータを測定することによって評価できる。これらの測定の性質のために、各々は当業者にはよく理解できるように一定の状況についてはより適切である場合も、余り適切ではない場合もある。さらに、骨折がない臨床歴、骨の形状、骨の形態、連結性、正常組織学、骨折修復速度、およびその他の骨質のパラメータのようなパラメータおよび方法は当分野においてよく知られていて使用されている。最も好ましくは、骨質はこのような測定が適切な場合は脊椎の圧縮強さによって評価できる。骨の変調は、さらにまた種々のパラメータにおける変化速度によって評価することもできる。最も好ましくは、骨の変調は２つ以上の年齢で評価する。
「正常骨密度」とは、ＨＢＭ関連試験の状況において０であるＺスコアの２標準偏差以内の骨密度を意味する。一般的状況において、正常骨密度パラメータの範囲はルーチンの統計学的方法によって決定される。正常パラメータは年齢および性別に関して正規化されたパラメータの約１もしくは２標準偏差以内、好ましくは約２標準偏差以内である。重要な統計的尺度は、関連測定値が平均値から統計的有意に相違する確率を表すＰ値である。統計的有意なＰ値はＰ＜０．０５、０．０１、０．００５、および０．００１、好ましくは少なくともＰ＜０．０１である。
「ＨＢＭ」とは「高骨量」を意味するが、この用語はさらにまた骨密度、骨ミネラル量およびサイズを言い表すこともある。
「ＨＢＭ表現型」および「ＨＢＭ様表現型」は、骨の変調の１、２、３、４、５、もしくはそれ以上の量的パラメータ、好ましくは骨密度および骨ミネラル量および骨強度パラメータの、そのパラメータに対する年齢および性別標準値を超える約２標準偏差以上の、好ましくは２、２．５、３、もしくはそれ以上の標準偏差の上昇によって特徴付けることができる。ＨＢＭ表現型およびＨＢＭ様表現型は、少なくとも１つのパラメータ、好ましくは少なくとも２つのパラメータ、およびより好ましくは少なくとも３つ以上のパラメータにおける統計的有意な上昇によって特徴付けられる。ＨＢＭ表現型およびＨＢＭ様表現型はさらにまた、１つ以上の骨質のパラメータにおける上昇によっても特徴付けることができ、そして最も好ましくは上昇するパラメータにはいずれかの骨質のパラメータにおける低下が付随しない。最も好ましくは、骨の変調パラメータおよび／または骨質の測定値における上昇は２つ以上の年齢で観察される。ＨＢＭ表現型およびＨＢＭ様表現型はさらにまた、脂質濃度、Ｗｎｔ活性および／またはＤｋｋ活性の変化も含む。
用語「単離（された）」および「精製（された）」は自然環境から人間の手によって変化させられた物質を意味する。単離ペプチドは、実質的に純粋形であても、またはさもなければ例えば単離細胞系もしくはトランスジェニック動物中での発現によってその自然環境から置き換えられていてもよい。単離配列は、例えば実質的に純粋形の分子であっても、または前記単離配列の少なくとも一端が自然状態ではそれが隣接しているであろう配列と隣接していないその自然環境から置き換えられていている分子であってもよい。
「生物学的に活性な」とは、野生型タンパク質もしくはポリペプチドの生物学的および／または免疫学的活性を維持している１つのタンパク質またはタンパク質のポリペプチドフラグメントをコードする遺伝子の対立遺伝子である保存的に置換された変異体を含むタンパク質およびポリペプチドの形態を意味する。好ましくは、該活性は例えばＤｋｋとリガンド結合パートナーとの相互作用（例えば、図５に示したもののようなＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６もしくはＤｋｋ−１とＤｋｋ−１相互作用タンパク質）を阻害することのようなＤｋｋ活性の変化を誘導する活性である。生物学的に活性なとは、Ｗｎｔシグナル伝達を変調するあらゆる形態を含むことも意図されている。
「変調する」および「調節する」は、酵素、インヒビター、シグナルトランスデューサー、受容体、転写アクチベーター、コファクター等の野生型活性を増加または減少させる方法、条件、または物質に使用する。活性におけるこの変化は、ｍＲＮＡ翻訳、ｍＲＮＡもしくはＤＮＡ転写、および／またはｍＲＮＡもしくはタンパク質変性の増加または減少である可能性があり、これらは順に生物学的活性における増加または減少に一致することがある。
「変調された活性」は、タンパク質の生物学的に活性な形によって変調されたあらゆる活性、条件、疾患または表現型に使用する。変調は、生物学的に活性なタンパク質の濃縮または細胞以下局在に影響を及ぼすことによって、すなわち発現もしくは変性を変調することによって、または例えば阻害、活性化、結合、もしくは基質の遊離、化学的もしくは構造的いずれかの修飾を通してのような直接的な作用的もしくは拮抗的作用によって、または追加の因子を含むことがある直接的もしくは間接的相互作用によってもたらされることがある。
「有効量」または「有効用量」または「治療有効量」とは、本発明のポリペプチドの生物学的活性を変調する物質の量を意味する。
「免疫学的に活性な」とは、１つの抗原を認識して結合するあらゆる免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントを意味する。
「Ｄｋｋ」とは、Ｄｋｋ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）ファミリーのメンバーの核酸およびタンパク質を意味することが意図されている。これには、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、Ｄｋｋ−４、Ｓｏｇｇｙおよび関連Ｄｋｋタンパク質が含まれるが、それらに限定されない。Ｄｋｋ−１は本発明の好ましい実施形態である。しかし、Ｄｋｋタンパク質は実質的相同性を有しており、当業者であればＤｋｋ−１を利用する本発明の実施形態のすべてを他のＤｋｋタンパク質と一緒に利用できることを理解するであろう。
「Ｄｋｋ−１」は、Ｄｋｋ−１タンパク質とＤｋｋ−１タンパク質をコードする核酸とを意味することが意図されている。Ｄｋｋ−１はＤｉｃｋｋｏｐｆ−１を意味しており、アフリカツメガエルではＤｋｋ−１は少なくともＤｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、およびＤｋｋ−４に関連する（Ｋｒｕｐｎｉｋら，Ｇｅｎｅ ２３８：３０１〜３１３（１９９９）を参照）。Ｄｋｋ−１は最初にアフリカツメガエルにおいて同定された（Ｇｌｉｎｋａら，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３５７−６２（１９９８））。Ｄｋｋ−１は、ＢＭＰ経路の阻害の存在下で異所性頭部形成を誘導できる因子として認識された。Ｄｋｋ−１はその後、Ｗｎｔシグナル伝達の細胞外アンタゴニストとして作用することにより数種のアフリカツメガエルＷｎｔ分子の体軸誘導活性を阻害することも見いだされた。Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、Ｄｋｋ−４およびＳｏｇｇｙを含む哺乳動物ホモログが見いだされている（Ｆｅｄｉら，１９９９およびＫｒｕｐｎｉｃｋら，１９９９）。ヒトＤｋｋ−１はまたｓｋとも呼ばれた（Ｆｅｄｉら，１９９９）。ここで使用するように、Ｄｋｋ−１はその中でＤｋｋ−１が相互作用するＷｎｔ経路を有するあらゆる種からのタンパク質を含むことが意図されている。特に好ましいのは哺乳動物種（例えば、マウス、ヤギ、イヌ、ウシ、ネコ、ウマ、霊長類、ヒツジ、ブタ等）であり、特に好ましい哺乳動物はヒトである。Ｄｋｋ−１をコードする核酸配列には、ヒトＤｋｋ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００９８３４、ＸＭ＿００５７３０、ＡＦ２６１１５８、ＡＦ２６１１５７、ＡＦ１７７３９４、ＡＦ１２５７６３およびＮＭ＿０１２２４２）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１００５１）、およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１１６８５２およびＡＢ０２３４８８）が含まれるが、それらに限定されない。エクソン注釈を含むゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２６１１５７およびＡＦ１６１１５８である。同様に意図されているのはＷｎｔ経路内にＤｋｋ−１活性を有するこれらの配列のホモログである。Ｄｋｋ−１アミノ酸配列には、ヒトｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ１５５４４、ＢＡＡ３４６５１、ＮＰ＿０３６３７４、ＡＡＦ０２６７４、ＡＡＤ２１０８７、およびＸＰ＿００５７３０）、ゼブラフィッシュｄｉｃｋｋｏｐｆ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ８２１３５およびＡＡＤ２２４６１）およびマウスｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｏ５４９０８およびＮＰ＿０３４１８１）が含まれるが、それらに限定されない。Ｄｋｋ−１について言うときは、Ｄｋｋ−１活性を有するこれらの配列の変異体およびホモログもまた含まれる。
「Ｄｋｋ媒介性」の障害、状態もしくは疾患とは、Ｄｋｋ活性に関連するあらゆる異常な状態を意味する。異常な状態は、環境的曝露または薬物投与によって誘導され得る。あるいは、症患または障害は遺伝子欠陥によることがある。Ｄｋｋ媒介性の疾患、障害および状態には、骨量障害もしくは状態および脂質障害および状態が含まれるがそれらに限定されない。例えば、Ｄｋｋによって媒介される可能性がある骨量障害／状態／疾患には、年齢関連性骨量減少、骨折（例えば、股関節骨折、コーレス骨折、脊椎粉砕骨折）、軟骨形成異常症、薬物誘発性障害（例えば、糖質コルチコイド剤またはヘパリンの投与に起因する骨粗鬆症、および水酸化アルミニウム、抗痙攣薬、もしくはグルテチミドの投与に起因する骨軟化症）、骨の高度の代謝回転、高カルシウム血症、骨化過剰症、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨粗鬆症、ぺージェット病、変形性関節症、およびくる病が含まれる。
Ｄｋｋによって媒介される可能性がある脂質の障害／疾患／状態には、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性アポタンパク質ＣＩＩ欠損症、家族性３型高リポタンパク血症、家族性高コレステロール血症、家族性高トリグリセリド血症、多種リポタンパク型高脂血症、透析および／または糖尿病を原因とする脂質濃度上昇、および病因不明の脂質濃度上昇が含まれるがそれらに限定されない。
「認識して結合する」は、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ（小さい抑制性ＲＮＡ）、もしくはｓｈＲＮＡ（ショートヘアピン構造を有するＲＮＡ）と標的配列との相互作用を定義するときに使用すると、特定のアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｈＲＮＡ配列が標的配列と実質的に相補的であり、したがってｍＲＮＡをコードするポリペプチドの一部分に特異的に結合することを意味する。したがって、典型的には該配列はｍＲＮＡ標的配列と高度に相補的であり、そして配列全部を通して１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０塩基を以下のミスマッチを有するであろう。多くの場合、該配列が厳密にマッチする、すなわちそれにオリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列と完全に相補的であり、このため相補的伸長に沿ってミスマッチを全く有していないことが望ましい。したがって高度に相補的な配列は、典型的にはｍＲＮＡの標的配列領域に極めて特異的に結合し、このためポリペプチド産物内への標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を減少させる、および／または阻害することにさえ高度に有効であろう。
実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列はそれに該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に約８０％を超えて相補的（もしくは「％厳密マッチ」）であり、そしてより好ましくはそれに該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に約８５％を超えて相補的であろう。上記のような一定の態様では、本発明の実践において使用するためにはよりいっそう実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することが望ましく、そしてそのような場合には、該オリゴヌクレオチド配列はそれに該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に約９０％を超えて相補的であり、一定の実施形態ではそれに該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に約９５％を超えて相補的である可能性があり、そしてそれに該構成されたオリゴヌクレオチドが特異的に結合する標的ｍＲＮＡに９６％、９７％、９８％、９９％までさえ、そして１００％厳密マッチさえ含めて相補的である。
本明細書開示した配列のいずれかの類似性率もしくは相補性率は、例えばウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）大学Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータ・プログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することによって決定できる。ＧＰＡプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）のアライメント法を利用している。手短かには、ＧＰＡプログラムは類似性を、２つの配列の短い方における記号の総数で割った、類似している整列した記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として定義している。ＧＰＡプログラムのための好ましいデフォルトパラメータには以下のものが含まれる：（１）ヌクレオチドについての単項比較行列（同一性に対しては１の数値、非同一性に対しては０の数値を含有する）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ（１９８６）の加重比較行列、（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ内の各記号に対する追加の０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対してはペナルティなし。
「模倣物」とは、模倣された化合物と同一機能を実行する、または類似して挙動する化合物もしくは分子を意味する。
「レポーターエレメント」とは、スクリーニングアッセイにおいて検出することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。レポーターエレメントによってコードされるポリペプチドの例には、ｌａｃＺ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが含まれるが、それらに限定されない。
２．はじめに
ＬＲＰ５（Ｚｍａｘ）内の多型でＨＢＭと指名されたＧ１７１Ｖは、これによりそれらの全体が参照することにより本明細書組み込まれる同時継続出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ ００／１６９５１号、および米国特許出願第０９／５４３，７７１号および第０９／５４４，３９８号に記載されている関連被検対象の集団中で高骨量表現型を与えると同定されている（Ｌｉｔｔｌｅら，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７０：１１−１９（２００２））。ＬＲＰ５はさらにまた、その全体が参照することにより本明細書組み込まれる国際公開第ＷＯ９８／４６７４３号にも記載されている。ＬＲＰ５機能の消失は、骨に有害な作用を及ぼすことが証明されている（Ｇｏｎｇら，Ｃｅｌｌ １０７：５１３−５２３（２００１））。さらに、ＨＢＭ多型およびＬＲＰ５はまた心臓の健康および脂質媒介性障害において重要な可能性がある。したがって、それらの活性を変調する方法は心臓障害および脂質関連性障害を治療および／または防止する方法として機能することができる。
近年の試験は、ＬＲＰ５がＷｎｔシグナル伝達経路に関わっていると指摘してきた。Ｗｎｔ経路は、四肢の初期胎生期発生において極めて重要である。Ｗｎｔシグナル伝達の構成要素について近年発表されたスケッチを図１に示した（Ｎｕｓｓｅ，２００１ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｍｕｓｓｅ／ｐａｔｈｗａｙｓ／ｃｅｌｌ２．ｈｔｍｌ）（さらにＮｕｓｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：２５５−６（２００１）；およびＭａｏら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３２１−５（２００１）も参照されたい）。手短かに要約すると、Ｗｎｔタンパク質は膜貫通タンパク質Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）と相互作用する分泌タンパク質である。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６のようなＬＲＰタンパク質は、Ｆｚとの複合体中でＷｎｔシグナルを変調すると考えられている（Ｔａｍａｉら，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：５３０−５（２０００））。Ｗｎｔ経路は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄタンパク質（Ｄｓｈ）を介して細胞内で作用し、このタンパク質は順にリン酸化β−カテニンからのグリコーゲンシンテターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）を阻害する。リン酸化β−カテニンは、ユビキチン化に引き続いて急速に分解される。しかし、安定化β−カテニンは蓄積して核へ転位し、そこでＴ細胞因子（ＴＣＦ）転写活性化因子複合体のコファクターとして機能する。
タンパク質ｄｉｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）はＷｎｔ経路のアンタゴニストであると報告されている。Ｄｋｋ−１は、初期発生における頭部形成のために必要とされる。Ｄｋｋ−１およびＷｎｔ経路におけるその機能は例えばＫｒｕｐｎｉｋら，Ｇｅｎｅ ２３８：３０１−１３（１９９９）；Ｆｅｄｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９４６５−７２（１９９９）に記載されている；さらにＤｋｋ−１およびＷｎｔ経路については、Ｗｕら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：１６１１−１４（２０００）；Ｓｈｉｎｙａら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９８：３−１７（２０００）；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １：４２３−４３４（２００１）および国際公開第ＷＯ００／５２０４７号、および各々において言及された参考文献も参照されたい。Ｄｋｋ−１がＤｓｈの上流で機能することは知られているが、Ｄｋｋ−１による阻害の機序の性質についてはまさにその解明の端緒についたところである。Ｄｋｋ−１はマウス胎生期肢芽において発現し、その崩壊は異常な四肢形態、特に発達欠損を生じさせる（Ｇｏｔｅｗｏｌｄら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８９：１５１−３（１９９９）；およびＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ １：４２３−４３４（２００１））。
関連する米国仮出願第６０／２９２，３１１号はＤｋｋ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ００５７３０）とＬＲＰ５との新規相互作用を開示した。Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５との相互作用は、実施例１に記載したようにＬＲＰ５のリガンド結合ドメインと相互作用するタンパク質に対する酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーニングによって発見された。２ハイブリッドスクリーニングは当分野において一般的な方法であり、この方法については例えばＧｉｅｔｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：６７−７９（１９９７）；Ｙｏｕｎｇ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８：３０２−１１（１９９８）；Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｆｉｎｌｅｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３１：６６３−７０４（１９９７）；およびＬｕ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ編集、「酵母ハイブリッドテクノロジー（Ｙｅａｓｔ Ｈｙｂｒｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）」，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ナティック，ＭＡ，（２０００）によって記載されている。より近年には、Ｄｋｋ−１がＬＲＰに対する結合パートナーであり、ＬＲＰとの直接結合を介してＷｎｔ経路を変調することが、他の試験により確証されている（Ｒ．Ｎｕｓｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：２５５−２５６（２００１）；Ａ．Ｂａｆｉｃｏら，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：６８３−６８６（２００１）；Ｍ．Ｓｅｍｅｅｎｏｖ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：９５１−９６１（２００１）；Ｂ．Ｍａｏ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３２１−３２５（２００１），Ｚｏｒｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：Ｒ５９２−５（２００１）；およびＬ．Ｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：５９７７−８１（２００２））。
Ｍａｏら（２００１）は、Ｄｋｋ−１をＬＲＰ６に対するリガンドであると同定した。Ｍａｏらは、Ｄｋｋ−１とＬＲＰ６とが拮抗的に相互作用し、そこでＤｋｋタンパク質はＬＲＰ６のＷｎｔコ受容体機能を阻害することを示唆している。共免疫沈降法を使用して、この研究グループはＤｋｋ−１／ＬＲＰ６相互作用が直接的であることを検証した。Ｄｋｋ−２もまたＬＲＰ６へ直接的に結合することが見いだされた。仮出願第６０／２９１，３１１号に含まれるデータとは対照的に、ＭａｏらはＤｋｋタンパク質とＬＲＰ５との相互作用は検出されず、同様にＬＤＬＲ、ＶＬＤＬＲ、ＡｐｏＥＲもしくはＬＲＰとの相互作用も検出されなかったと報告している。さらに、ＭａｏらはＬＲＰ６が市販のＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（ＴＯＰＦＬＡＳＨ）を使用してＷｎｔシグナル伝達を阻害するＤｋｋ−１の作用を滴定できることを証明した。同様の結論は、アフリカツメガエル胚における類似試験からも引き出された。ＬＲＰ６機能的ドメインの欠失解析は、Ｄｋｋ−１結合のためにはＥＧＦリピート（β−プロペラ）３および４が不可欠であること、そしてＬＲＰ６のリガンド結合ドメインはＤｋｋ−１結合には何の影響も及ぼさないことを解明した。Ｍａｏらの所見は、酵母中でのＤｋｋ−１結合のためにＬＲＰ５のリガンド結合ドメインが不可欠かつ十分であることを指摘している本発明者らが入手したデータとは対照的である。古典的な生化学的リガンド受容体試験を使用して、Ｍａｏらは、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ６に対してはＫｄ＝０．３４ｎＭおよびＤｋｋ−２／ＬＲＰ６に対してはＫｄ＝０．７３ｎＭと決定した。
Ｓｅｍｅｎｏｖら（２００１）は、Ｍａｏ研究グループの結果を検証し、共免疫沈降法によってＤｋｋ−１がＷｎｔもしくはＦｒｉｚｚｌｅｄへは直接的に結合せず、むしろＬＲＰ６と相互作用することを確証した。彼らが実施したスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）解析は、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ６に対してはＫｄ＝０．５ｎＭであることを見いだした。Ｓｅｍｅｎｏｖらはさらに、Ｄｋｋ−１がＬＲＰ５／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８複合体を無効にできることを証明したが、これはＤｋｋ−１がＬＲＰ５との相互作用を介してＷｎｔシグナル伝達も抑制できることを示唆している。システイン２２０がアラニンへ変化させられたＤｋｋ−１突然変異体は、ＬＲＰ６結合を無効にしたがＷｎｔシグナル伝達を抑制することはできなかった。アフリカツメガエル胚における試験はこれらの結果を確証し、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ６：Ｗｎｔシグナル伝達の抑制の機能的重要性を解明した。アフリカツメガエルを使用した彼らの研究は、ＬＲＰ６／Ｄｋｋ−１がＷｎｔ平面内細胞極性（Ｐｌａｎａｒ Ｃｅｌｌ Ｐｏｌａｒｉｔｙ）経路とは対照的に正規β−カテニン媒介性Ｗｎｔ経路に対して特異的であることも示唆した。
Ｂａｆｉｃｏら（２００１）は、125Ｉ−標識Ｄｋｋ−１分子を使用してＬＲＰ６がＫｄ＝０．３９ｎＭを備える唯一の膜受容体であると同定した。さらに、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ６相互作用の機能的重要性は、Ｄｋｋ−１が極めて低濃度（３０ｐＭ）で添加された場合でさえ正規Ｗｎｔシグナル伝達の抑制であった。
理論で結び付けることを望まなくても、本発明はＷｎｔ経路のＤｋｋ−１による阻害メカニズムについての説明を提供する、そしてそれによりＷｎｔ経路を変調できるメカニズムについての説明を提供すると考えられる。本出願および関連仮出願第６０／２９１，３１１号は、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ５相互作用について記載しており、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとＤｋｋとの相互作用をタンパク同化骨治療薬または脂質代謝の変調剤のためのＷｎｔ経路における介入点として１つの方法に使用できることを証明している。
以下の「結合パートナーを同定する方法」のセクションおよび実施例６および７で詳述するように、Ｄｋｋ−１はＬＲＰ５媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を抑制することはできるが、ＨＢＭ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を抑制することはできない。この観察は、ＬＲＰ５におけるＨＢＭ突然変異もまた機能もしくは活性化突然変異の利得であるので、特に興味深い。すなわち、正規経路を介してのＷｎｔシグナル伝達はＬＲＰ５に対してＨＢＭを用いて増強される。本発明のデータは、この機能的活性化のメカニズム、すなわちＤｋｋ−１がＨＢＭ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を抑制できないことを示唆している。他のＷｎｔもしくはＤｋｋファミリーメンバーに関する他の研究は、特定細胞もしくは組織中で発現するＬＲＰ／Ｄｋｋ／Ｗｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄレパートリーに依存して達成できるＷｎｔシグナル伝達における複雑性および変動性を示す正規Ｗｎｔ経路における示差的な活性を証明している。これはヒトおよびＨＢＭトランスジェニック動物におけるＨＢＭ表現型の明白な骨特異性を証明していると思われる。
さらに、本発明のデータはＬＲＰ５の第１β−プロペラドメインの潜在的な構造的摂動についての重要性および機能的重要性を解明している。我々のデータは、ＬＲＰ５のリガンド結合ドメインがＤｋｋ−１との相互作用領域であると同定したが、他方Ｍａｏらの出版物は彼らのＬＲＰ６／Ｄｋｋ−１試験におけるプロペラ３および４の機能的役割を証明した。本発明では、我々は残基１７１でのＨＢＭ突然変異を介して第１β−プロペラドメインがＤｋｋ−１媒介性Ｗｎｔ経路における機能的重要性を有すると見なしている。プロペラ１の１７１はＤｋｋ−１と直接的または間接的に関与する可能性がある。直接的関与は、Ｄｋｋ−１を結合不能にさせるＨＢＭ細胞外ドメインの３次元構造の摂動から生じるのであろう。あるいは、プロペラ１の残基１７１はＤｋｋ−１と直接的に相互作用する可能性がある；しかし、単独では結合するのに不十分で、ＬＲＰ５以外のドメインを必要とする。潜在的な間接的候補分子は、特にＤｋｋ−１酵母２ハイブリッド実験によって同定されたタンパク質の可能性がある。
Ｄｋｋ活性の破壊は、ＤｋｋのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭへの結合の増強または防止によって必ずしも媒介されない。２つ以上のメカニズムが関与する可能性がある。実際に、本発明者らはＤｋｋ−１がＬＲＰ５、ＬＲＰ６、およびＨＢＭに結合するのを観察した。Ｄｋｋ−１はまたＬＲＰ６を効果的に阻害したり、そしてわずかに低い程度でＬＲＰ５活性を阻害することができる。さらに、Ｄｋｋファミリーの様々なメンバーがＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ活性に示差的に影響を及ぼすことも観察されている。例えば、Ｄｋｋ−１はＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ活性を阻害するが、他のＤｋｋはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ活性を増強することがある。最終的に考察しなければならないのは、単純な結合ではなくＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ活性の変調である。
本明細書の開示は、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ５相互作用の崩壊を標的とすることがＨＢＭ模倣物物質に対する治療介入点であることを証明している。本発明の治療薬は、小分子、ペプチドもしくは核酸アプタマー、抗体、またはその他のペプチド／タンパク質等であってよい。Ｄｋｋ−１発現を低下させる方法は、例えばＲＮＡ干渉、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴヌクレオチド、ＰＮＡｓ、Ｄｋｋ−１もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体、おとりまたはスカベンジャーＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６受容体、およびＤｋｋ−１もしくはＤｋｋ−１インタラクター転写のノックダウンのような方法を使用した治療法であってよい。
本発明の１つの実施形態では、Ｄｋｋ−１の活性もしくはＤｋｋ−１相互作用タンパク質の活性は、例えば本発明のペプチドアプタマーとの結合によって変調することができる。また別の実施形態では、ＬＲＰ５活性は、本発明によって提供される試薬（ペプチドアプタマー）によって変調することができる。また別の実施形態では、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ５相互作用は本発明の試薬（例えば、図５に同定したもののようなＤｋｋ−１相互作用タンパク質）によって変調することができる。また別の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路は１つ以上の上記の方法の使用によって変調することができる。本発明の１つの好ましい実施形態では、Ｗｎｔ経路のＤｋｋ−１媒介性活性は１つ以上の上記の方法によって特異的に変調することができる。本発明のまた別の好ましい実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路はＤｋｋ−１相互作用タンパク質活性をダウンレギュレートすることによって刺激できる；このようなダウンレギュレーションは、例えばより大きなＬＲＰ５活性を産生するであろう。より好ましい実施形態では、ＬＲＰ５活性を刺激することによって、より最適なレベルを回復もしくは維持するために骨量変調を刺激することができる。また別の実施形態では、ＬＲＰ５活性を刺激することによって、より最適なレベルを回復もしくは維持するために脂質代謝を刺激することができる。また別の実施形態は、骨量障害または脂質代謝障害の矯正に向けられる候補薬および候補治療をスクリーニングする方法を提供する。そして、本発明の好ましい実施形態は本発明の試薬および／または方法の使用によって開発された薬剤および治療を提供する。当業者は、本発明が骨粗鬆症の効果的モデルを開発するため、骨量および脂質の変調についての理解を増加させるため、そして骨量および脂質代謝を変調するために重要な研究用ツールを提供することを理解するであろう。
以前に実施された高骨量が単一遺伝子（常染色体優性）形質（ＨＢＭ−１）として遺伝性である大家族に関する研究は、それにより骨密度が変調されるメカニズムに関する重要な洞察を提供した。この家族構成員の脊椎および股関節ＢＭＤは統計的有意に高く（標準値を＞３標準偏差超える）、若年成人ならびに９０歳代に入る高齢の家族構成員に影響を及ぼしている。罹患した家族の骨は、Ｘ線検査では極めて密に見えるが、正常な外形および外径を有している。皮質骨は骨内膜面上で肥厚しており、「罹患した」個人は、他の表現型異常を何ら伴わずに無症候性である。骨格代謝回転を反映する生化学的マーカーについてのアッセイは、この障害が骨リモデリングの正常速度と関連することを示唆している。罹患した個人は正常な骨格負荷のために必要であるより統計的有意に大きい密度で骨の代謝回転における均衡を達成している。重要なことに、最も罹患することが多い骨は最大の機械的および引力による負荷を受ける荷重を支える骨（脊椎および股関節）である。これらは骨粗鬆症における治療介入のための標的となる最も重要な骨である。この表現型に責任を負っていると同定された遺伝子であるＺｍａｘまたはＬＲＰ５は、以前は骨の生理学とは結び付けられなかった。ＨＢＭファミリー表現型の常染色体優性遺伝をもたらす多型性によって生み出されるようなこの遺伝子の修飾は、Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５および上記で考察したＤｋｋ／Ｗｎｔ経路を含むそれが変調される経路を骨密度のモジュレーターを開発するための重要な標的であると同定している。ＨＢＭ多型性によって機能における利得を模倣するためのＺｍａｘ／ＬＲＰ５の変調は、骨消耗状態に対する重要な療法を提供すると予想されるであろう。さらに、若年成人におけるそのような変調はピーク骨量を増強して、後年における骨折リスクを防止するもしくは遅延させることができよう。あるいはまた、機能を低下させる変調は、骨が不適切に産生されている状態を治療するために使用できよう。
３．ポリペプチド
本発明に使用することが意図されるポリペプチドには、ＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質活性を変調するものが含まれる。好ましいポリペプチドおよびペプチドには、Ｗｎｔ経路を変調するものが含まれる。好ましい配列の例には、図２に例示したＹ２Ｈベイト配列、図３（配列番号１７１〜１８８）および図４（配列番号１８９〜１９２）のペプチドアプタマー、図５に同定したＤｋｋ−１相互作用タンパク質のポリペプチド、図６に示したようなポリペプチド、ＤｋｋのＬＲＰ結合ドメイン（ｈＤｋｋ１のアミノ酸１３８〜２６６）、システインリッチドメイン２（ａ．ａ．ｈＤｋｋのアミノ酸１８３〜２４５）、システインリッチドメイン１（ａ．ａ．ｈＤｋｋのアミノ酸９７〜１３８）、および図１３（配列番号２０４〜２１３を含む）のＬＲＰ５結合アプタマーが含まれる。Ｄｋｋ−１を例示したが、その他のＤｋｋタンパク質も実質的に類似の領域を含有しており、同様に本発明にしたがって使用することができる。
例えば、図２に示したベイト配列を酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーニングに使用した。Ｙ２Ｈスクリーニングを実施例２に記載した通りに実施してＤｋｋ−１がＬＲＰ５に結合するために最小必要結合ドメインを決定した。最小結合ドメイン構築物（すなわち、Ｄｋｋ−１の、下記に太字で示した残基１３９〜２６６および下線を引いた残基９７〜２４５）には、コリパーゼ折り畳みとの配列相同性を有する第２システインリッチドメインが含まれる。
Figure 2005512508
 （ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００５７３０）（配列番号１２８）
この相同性は脂質結合機能を示唆しており、血漿膜でのＤｋｋ−１相互作用を促進する可能性がある（ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４４１：１７３−８４（１９９９））。ＬＲＰ５のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と相互作用することのできるＤｋｋ−１の相互作用ドメインは、ＬＲＰ５活性の変調およびＤｋｋ−１／ＬＲＰ５複合体形成の変調において有用な試薬である。Ｄｋｋ−１およびＤｋｋ−１相互作用タンパク質もしくはポリペプチドに対しても同様のスクリーニングを作製できる。
実施例３に記載したようにチオレドキシンＡ（ｔｒｘＡ）スカフォールド内に拘束かつ提示されたランダムペプチドのライブラリーから１組のペプチドアプタマーを同定した。ペプチドアプタマーは、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ＆Ｂｕｔｚ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７８：４２６−４３０（２０００）；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７４：５−１３（２０００）；およびＣｏｌａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５４−９（２０００）およびそれらの中で言及された参考文献によって検討されたように、分子医学にとって強力な新規ツールである。手短かには、ペプチドアプタマーはインビボで結合できる高度に特異的な試薬であることが証明されている。したがって、ペプチドアプタマーはタンパク質の機能を変調する方法を提供し、そして機能のノックダウンまたは完全消失を意味する従来型のノックアウト法の代替法として機能できる。ペプチドアプタマーは、新薬開発のための標的の妥当性確認のために有用な試薬でもあり、治療用化合物として直接に使用できる、またはドラッグデザインのために必要な基礎を提供することができる。同定されると、ペプチド挿入断片を合成して直接に使用したり、または他の担体分子中に組み込むことができる。Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ（２０００，上記参照）が検討して言及した参考文献は、ペプチドアプタマーの治療用途および診断用途を証明しており、当業者には周知であろう。
本発明のペプチドアプタマーは、Ｄｋｋ−１のそのリガンドへの結合およびそれによるＷｎｔ経路の変調における有用な試薬であり、Ｄｋｋ−１がＷｎｔ経路のＬＲＰ５変調またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質変調を阻害するのを防止するために使用できる。これらのペプチドアプタマーの配列を図３に示した（配列番号１７１〜１８８）。ペプチドアプタマーとは、チオレドキシンスカフォールドによって拘束されたペプチドを意味する。これらのアプタマーは、Ｄｋｋ−１媒介性の疾患および状態を治療するための治療薬としても意図されている。このようなアプタマーは、化学者にとって該アプタマーの模倣物化合物を構成するための有用な構造的ガイドである。
ペプチドアプタマーを、ＬＲＰ５リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）ベイト配列についても同様に開発した。これらのペプチドアプタマーの配列を図４（配列番号１８９〜１９２）に示した。これらはＤｋｋ−１をそのままに残しながらＤｋｋ−１／ＬＲＰ５結合界面を破壊するために使用できる有用な試薬である。これらはＷｎｔシグナル伝達についての比較コントロールとして使用できるので、したがってスクリーニングされるあらゆる薬物または療法の特異性についてコントロールが提供される。これらのアプタマーはさらにまたＬＲＰ媒介性の疾患および状態を治療するための有用な治療薬でもある。このようなアプタマーは、化学者にとって該アプタマーの模倣物化合物を構成するための構造的ガイドとしても使用される。
Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−１相互作用タンパク質と相互作用する３０種のタンパク質を同定し、そしてＤｋｋ−１ベイトを使用して酵母２ハイブリッドスクリーニングにおいて同定し、これらを図５に示した。これらの結果がＤｋｋ−１とＮｏｔｃｈ−２との相互作用を示唆していることが認められた。これは、ＷｎｔとＮｏｔｃｈシグナル伝達経路間でクロストークが存在することを示唆していた。例えば、プレセニリン１（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１［Ｐｓ１］）はＮｏｔｃｈプロセッシングのために必要とされ、下流Ｗｎｔ経路を阻害する。Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインはＷｎｔと相互作用すると思われる。さらに、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインは乱雑なシグナルで誘導されるプロセッシングと相互作用すると思われ、細胞内ドメインはプレセニリンと相互作用すると思われる（Ｓｏｒｉａｎｏら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５２：７８５−９４（２００１））。ＮｏｔｃｈとＷｎｔシグナル伝達との関係に関する追加の情報については、Ｗｅｓｌｅｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：５７４３−５８（１９９９）およびＡｘｅｌｒｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１８２６−３２（１９９６）を参照されたい。
Ｄｋｋ−１とコルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）との相互作用もまた認められた；これはＷｎｔとＴＧＦ−β／ＢＭＰシグナル伝達経路間にクロストークが存在することを示唆している（Ｌｅｔａｍｅｎｄｉａら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８３Ａ：Ｓ３１（２００１）；Ｌａｂｂｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８３５８−６３（２０００）；Ｎｉｓｈｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ ４０３：７８１−５（２０００）；ＤｅＲｏｂｅｒｔｉｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４５：１３８９−９７（２００１）；およびＳａｉｎｔ−Ｊｅａｎｎｅｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３７１３−８（１９９７））。ＢＭＰシグナル伝達経路は骨および結合組織の発達、修復およびホメオスタシスにおいて確定された役割を有している（「骨生物学の原理、第２版（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｊ．Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ，Ｌ．Ｒａｉｓｚ ａｎｄ Ｇ．Ｒｏｄａｎ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第９１９〜２８頁（２００２）に含まれているＲｏｓｅｎ ａｎｄ Ｗｏｚｎｅｙの「骨形態形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」の論評を参照）。コルディンは、潜伏複合体中にＢＭＰｓを隔離することによってさらに成人におけるＢＭＰシグナル伝達も変調する発生中に重要な分子である（Ｒｅｄｄｉ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．３：１−５（２００１）の中で検討されたＰｉｃｃｏｌｏら，Ｃｅｌｌ ８６：５８９−９８（１９９６）；ＤｅＲｏｂｅｒｔｉｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４５：１８９−１９７（２００１））。ＤｋｋがＬＲＰを介してＷｎｔシグナル伝達経路およびコルディンを介してＢＭＰ経路の両方により骨量変調に影響を及ぼす可能性がある。
さらに、多数の推定成長因子、成長因子関連タンパク質、および細胞外マトリックスタンパク質がＤｋｋ−１相互作用タンパク質として同定されている。Ｙ２Ｈアッセイにおいて同定されたＤｋｋ−１相互作用タンパク質に関する追加の情報は、本出願書に提供したアクセッション番号の使用を介してＰｕｂＭｅｄのような公衆が利用できるデータベースから入手できる。本発明の１つの好ましい実施形態では、これらのＤｋｋ−１相互作用タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列を使用してＤｋｋ、Ｄｋｋ−１、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはＷｎｔ活性を変調した。これらのタンパク質はＤｋｋ−１と相互作用するとして同定されたが、種々のＤｋｋタンパク質間の実質的相同性のために、そのような相互作用タンパク質は他のＤｋｋファミリーメンバーと相互作用すると想定されている。
４．アプタマー模倣物
本発明はさらにまた、Ｄｋｋ、特にＤｋｋ−１、およびＬＲＰ５ペプチドアプタマーの模倣物を提供する。そのようなアプタマーは、化学者にとって該アプタマーの模倣物化合物を構成するための有用な構造的ガイドである。該アプタマーおよびそれらの模倣物はＬＲＰ−もしくはＤｋｋ−媒介性の疾患および状態を治療するための治療薬として有用である。
５．核酸分子
本発明はさらにまた、ＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質、および／またはＬＲＰ５（さらにＬＲＰ６およびＨＢＭ）の生物学的活性を変調するためにこれらのタンパク質と相互作用するポリペプチドおよびタンパク質をコードする核酸分子を提供する。好ましい実施形態は、好ましくは単離形または精製形にある図７の核酸、図５に列挙したＤｋｋ−１相互作用タンパク質、Ｄｋｋ−１のポリペプチドアプタマー（図３−配列番号１７１〜１８８）、ＬＲＰ５（図４−配列番号１８９〜１９２）、図１２のポリヌクレオチド（配列番号１９３〜２０３）によってコードされた図１３のペプチドアプタマー（配列番号２０４〜２１４を含む）、ＬＲＰ６およびＨＢＭ、および本明細書記載した関連融合タンパク質を含むＤｋｋ−１タンパク質のフラグメントをコードする核酸を提供する。ここで使用する「核酸」は上記のようなペプチドをコードする、またはこのようなペプチドをコードする核酸配列に相補的である、または該核酸のセンスもしくはアンチセンス鎖のいずれかへハイブリダイズして適切なストリンジェンシー条件下でそれに安定性で結合し続けるＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであると定義されている。該核酸は、該ペプチド配列と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、およびより好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性を共有するポリペプチドをコードしていてよい；少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％以上もまた想定されている。特に想定されているのはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、酵素的に活性な核酸（例えば、リボザイム）、ならびに代替バックボーンに基づく核酸である、または天然原由来であろうと合成されたものであろうと選択的塩基を含んでいる。しかしこのようなハイブリダイジングもしくは相補的核酸は、さらにコードして適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、または本発明に従ったタンパク質をコードする核酸に対して相補的であるものを含むあらゆる先行技術核酸に照らして新規かつ非自明であると定義されている。
ここで使用するヌクレオチド配列との関連での用語「ハイブリダイゼーション」（ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションする）および「特異性」（〜に対して特異的）は互換的に使用される。２つのヌクレオチド配列が相互にハイブリダイズする能力は、２つのヌクレオチド配列の相補性の程度に基づいており、これは順にマッチした相補的ヌクレオチド対の分画に基づいている。所定の配列内に他の配列に相補的であるより多くのヌクレオチドがあると、１つのヌクレオチドからもう１つのヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの程度が大きくなる。ハイブリダイゼーションの程度はさらにまた温度、溶媒比、塩濃度等を含むストリンジェンシーの条件にも依存する。特に「選択的ハイブリダイゼーション」は、本発明のポリヌクレオチドのその標的へのハイブリダイゼーションの程度が完全もしくはほぼ完全な相補性を必要とするであろう条件に関連する。相補性は、本発明のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーション培地中に存在する他の核酸の結合と比較して標的ヌクレオチド配列へ特異的に結合することを保証できるように十分に高くなければならない。選択的ハイブリダイゼーションを用いると、相補性は約９０〜１００％、好ましくは約９５〜１００％、より好ましくは約１００％であろう。
「ストリンジェントな条件」とは、（１）例えば：５０℃で０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳのように洗浄のために低イオン強度および高温を使用する条件、または（２）ハイブリダイゼーション中に例えば４２℃で０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１％ポリビニルピロリドン、および７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを備える５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を含む５０％（容積／容積）ホルムアミドのようなホルムアルミドのような変性剤を使用するような条件である。別の例は、４２℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中での洗浄とともに、４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、超音波処理サケ***ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランの使用である。当業者であれば、明瞭かつ検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを入手するために適切なストリンジェンシー条件を容易に決定して変化させることができる。
ここで使用する核酸分子は、該核酸分子が実質的に核酸の起源からの他のポリペプチドをコードする汚染核酸から分離されている場合は「単離（された）」もしくは「精製（された）」と言われる。単離（された）もしくは精製（された）はさらにまた、Ｄｋｋ遺伝子を挟む周囲ゲノム配列が欠如しているＤｋｋまたはそのフラグメントをコードする核酸を含めることが意図されている。単離（された）もしくは精製（された）はさらにまた、Ｄｋｋ相互作用タンパク質遺伝子を挟む周囲ゲノム配列が欠如しているＤｋｋ相互作用タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸を含めることが意図されている。
本発明はさらにまた、コードする核酸分子のフラグメントを提供する。ここで使用するコードする核酸分子のフラグメントとは、全タンパク質コード配列の小部分を意味する。該フラグメントのサイズは、使用目的によって決定されるであろう。例えば、該フラグメントが該タンパク質の活性部分をコードするように選択される場合は、該フラグメントは該タンパク質の１つ以上の機能的領域をコードするのに十分大きいことが必要であろう。該フラグメントが核酸プローブもしくはＰＣＲプライマーとして使用される場合は、フラグメント長はプロービング／プライミング中の相当に小数の偽陽性を入手できるように選択される。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプローブもしくは特異的プライマーとして、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために使用される本発明のコードする核酸分子のフラグメント（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉらのホスホトリエステル法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１（１９８１））のような化学的技術によって、または自動合成法を使用して容易に合成できる。さらに、より大きなＤＮＡセグメントは、該遺伝子の様々なモジュラーセグメントを定義する１群のオリゴヌクレオチドの合成、その後の完全修飾遺伝子を構築するためのオリゴヌクレオチドのライゲーションのようなよく知られた方法によって容易に作製することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子はさらに、診断目的およびプローブ目的で検出可能な標識を含むように修飾できる。様々なこのような標識は当分野で知られており、本明細書記載したコードする分子と一緒に容易に使用できる。適切な標識には、ビオチン、放射標識ヌクレオチド等が含まれるが、それらに限定されない。当業者であれば、標識されたコードする核酸分子を入手するための当分野で知られている標識のいずれかを使用することができる。
翻訳中にタンパク質配列内に組み込まれたアミノ酸の欠失、付加、または変化による一次構造自体への修飾は、該タンパク質の活性を破壊せずに行うことができる。このような置換またはその他の変化は、本発明の意図された適用範囲内に含まれる核酸によってコードされたアミノ酸配列を有するタンパク質を生じさせる。
該ポリペプチドをコードする配列または相補的配列に対応するアンチセンス分子を作製することができる。ｍＲＮＡへ結合し、三重らせんを形成する、または酵素的に活性でＴＳＧ ＲＮＡを劈開するアンチセンス分子および一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を作製する方法は当分野において知られている。例えば、「アンチセンスおよびリボザイム方法論：実験手引き書（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）」（Ｉａｎ Ｇｉｂｓｏｎ編集、Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，１９９７）および「リボザイムプロトコール：分子生物学における方法（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｐｈｉｌｉｐ Ｃ．Ｔｕｒｎｅｒ編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１９９７）を参照されたい。
同様に想定されているのは、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、抑制（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する化合物の使用である。これらの化合物は、典型的には約２１〜約２５ヌクレオチドであり、短い干渉ＲＮＡもしくは短い抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としても知られている。ｓｉＲＮＡは開始二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から作製される。ｓｉＲＮＡが機能する完全メカニズムは十分には解明されていないが、これらのｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡからｄｓＲＮＡ内へ転換し、その後分解されることは知られている。好ましい形態は５’リン酸化ｓｉＲＮＡであるが、ヒドロキシル化形もまた利用できる。ｓｉＲＮＡの作製およびメカニズムに関する追加の背景情報については、一般に例えばＬｉｐａｒｄｉら，Ｃｅｌｌ １０７（３）：２９７−３０７（２００１）；Ｂｏｕｔｌａら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１（２２）：１７７６−８０（２００１）；Ｄｊｉｋｅｎｇら，ＲＮＡ７（１１）：１５２２−３０（２００１）；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．２０（２３）：６８７７−８８（２００１）；Ｈａｒｂｏｒｔｈら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４（Ｐｔ．２４）：４５５７−６５（２００１）：Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３（５５３１）：８１１−３（２００３）；およびＥｌｂａｓｈｉｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８（２００１）を参照されたい。
同様に想定されるのはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。ｓＲＮＡは上記のｓｉＲＮＡ法の修飾である。外因的に合成されたｄｓＲＮＡを胞内にトランスフェクトする代わりに、配列特異的サイレンシングはフォールドバック・ステムループ、またはヘアピンとしてＤＮＡテンプレートからのｓｉＲＮＡを安定化発現させることによって達成することができる。このアプローチはｓｈＲＮＡとして知られている。この方法は例えば試薬のＲＮａｓｅ変性、費用のかかる化学合成等のようなｓｉＲＮＡと関連する多数の問題を回避することによって哺乳動物細胞中での配列特異的遺伝子サイレンシングに起因する機能表現型の消失の解析を許容する。ｓｈＲＮＡの作製およびメカニズムに関する追加の背景情報については、例えばＹｕら，ＰＮＡＳ ９９：６０４７−６０５２（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１６：９４８−５８（２００２）；およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３（２００２）を参照されたい。哺乳動物遺伝子ノックダウン方法におけるこの方法の使用に関する追加の背景情報については、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４４６−４４８（２００２）（およびその中の参考文献）を参照されたい。
１つの好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡはＤｋｋをコードするｍＲＮＡに関するが、このとき好ましいＤｋｋはＤｋｋ−１である。また別の実施形態では、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡはＤｋｋに結合してその活性を変調する、またはＤｋｋによって変調されるタンパク質に関する；これらのタンパク質にはＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびＨＢＭならびにＷｎｔ経路の他のメンバーが含まれる。
６．他の関連核酸分子の単離
Ｄｋｋの核酸分子を同定できれば、当業者はＤｋｋファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離することができる（Ｋｒｕｐｎｉｋら，１９９９を参照）。さらに、本明細書開示した核酸分子を使用すると、当業者はＤｋｋ−１に加えてＤｋｋ−１様タンパク質をコードする核酸分子を単離することができる。本明細書開示したＤｋｋ相互作用タンパク質およびそれらの対応する核酸分子を使用すると、当業者はさらにＤｋｋ−１と相互作用する他の関連タンパク質ファミリーメンバーを単離することができる。
当業者は、ＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質のアミノ酸配列を使用して適切な細胞から作製された発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブを容易に作製することができる。典型的には、例えば精製タンパク質を用いて免疫化されたウサギのような哺乳動物からのポリクローナル抗血清（下記で説明する）またはモノクローナル抗体を使用すると、例えばヒトマクロファージライブラリーのような哺乳動物ｃＤＮＡもしくはゲノム発現ライブラリーを精査して該タンパク質ファミリーの他のメンバーについて適切なコード配列を入手することができる。クローニングされたｃＤＮＡ配列は融合タンパク質として発現させる、その自己制御配列を使用して直接的に発現させる、または所望のタンパク質の発現のために使用された特定宿主に適切な制御配列を使用した構造によって発現させることができる。
あるいはまた、本明細書記載したコード配列の一部分を合成してプローブとして使用することによりいずれかの哺乳動物からのタンパク質ファミリーのメンバーをコードするＤＮＡを回収することができる。約１８〜２０ヌクレオチド（約６〜７アミノ酸伸長をコードする）を含有するオリゴマーを作製して使用すると、ストリンジェンシー条件下、または過度なレベルの偽陽性を排除するために十分にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを達成するためにゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
さらに、オリゴヌクレオチドプライマーの対を作製すると、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてコードする核酸分子を選択的にクローン化するために使用できる。このようなＰＣＲプライマーを使用するためのＰＣＲ変性／アニール／伸長サイクルは当分野においてよく知られており、他のコードする核酸分子を単離するのに使用するために容易に適応させることができる。例えば縮重プライマーを利用すると、Ｄｋｋ−１およびＤｋｋ−１相互作用タンパク質に関連する配列を入手できる。完全に相補性ではないが、それでもまだ標的配列またはフランキング配列の一部分にハイブリダイズすることができ、それによって標的配列の全部もしくは一部分の増幅を提供するプライマーを構成することができる。約２０ヌクレオチド以下のプライマーは、好ましくは５’および／または３’末端に位置する約１〜３個のミスマッチを有している。約２０〜３０ヌクレオチドのプライマーは約３０％までのミスマッチを有しているが、それでもまだ標的配列にハイブリダイズすることができる。ミスマッチを含むプライマーのためのハイブリダイゼーション条件は、Ｍａｎｉａｔｉｓら，「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８２）に記載された方法、または既知の方法を参照することにより決定することができる。この方法を用いると様々な条件下で該プライマーがＤｋｋ−１、Ｄｋｋ−１相互作用タンパク質いずれかの配列、または関連配列へハイブリダイズする能力を決定することができる。標的配列は知られているので、ミスマッチの作用は当業者に知られている方法によって決定できる。縮重プライマーは、Ｄｋｋ−１およびＤｋｋ−１相互作用タンパク質遺伝子の推定保存アミノ酸配列に基づくであろう。
７．ポリペプチド発現のためのｒＤＮＡ分子
本発明は、さらにまたポリペプチドコーディング配列を含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。ここで使用するｒＤＮＡ分子はインサイチュで分子操作を受けているＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を作製する方法は当分野においてよく知られているが、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）を参照。好ましいｒＤＮＡ分子では、コードするＤＮＡ配列は発現制御配列および／またはベクター配列へ機能的に連結されている。
本発明のタンパク質ファミリーをコードする配列の１つがそれに機能的に連結しているベクターおよび／または発現制御配列の選択は、当分野においてよく知られているように、例えばタンパク質発現のような所望の機能的特性、および形質転換されるべき宿主細胞に直接的に依存する。本発明によって想定されるベクターは、ｒＤＮＡ分子において含まれる構造的遺伝子の少なくとも宿主染色体内への複製および／または挿入、および好ましくはさらに発現を指令することができる。
機能的に連結したタンパク質をコードする配列の発現を調節するために使用される発現制御エレメントは当分野においてよく知られており、誘導プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、およびその他の調節エレメントが含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、誘導プロモーターは例えば宿主細胞の培地中での栄養に反応性であるように、容易に制御される。好ましいプロモーターには酵母プロモーターが含まれ、これにはメタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは例えばエノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲーゼ、マルトースおよびガラクトース利用に責任を負う酵素その他のような他の糖分解酵素に対するプロモーター領域が含まれる。酵母発現に使用するために適切なベクターおよびプロモーターはさらに欧州特許第７３，６７５Ａ号に記載されている。適切な外来哺乳動物プロモーターにはＳＶ４０早期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））またはＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルス、もしくはポリオーマ由来のプロモーターを含むであろう。さらに、該構築物は該遺伝子の複数のコピーを作製できるように増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）へ結合させることができる。適切なエンハンサーおよびその他の発現制御配列については、「エンハンサーおよび真核遺伝子発現（Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８３）も参照されたい。好ましい骨関連プロモーターには、ヒトＨＢＭ、Ｚｍａｘ１／ＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６ ｃＤＮＡの発現を駆動するＣＭＶｂＡｃｔｉｎもしくはＩ型コラーゲンプロモーターが含まれる。哺乳動物発現のための他の好ましいプロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびＥＦ−１ａ（ヒト伸長因子１ａ−サブユニット）由来である。
１つの実施形態では、ベクターを含有するコーディング核酸分子は、例えば原核レプリコン、すなわちそれを用いて形質転換された細菌宿主細胞のような原核宿主細胞中で染色体外での組換えＤＮＡ分子の自立複製および維持を指令する能力を有するＤＮＡ配列が含まれる。このようなレプリコンは当分野においてよく知られている。さらに、原核細胞レプリコンを持つベクターには、さらにまたその発現が薬物耐性のような検出可能なマーカーを付与する遺伝子が含まれてよい。典型的な細菌薬物耐性遺伝子はアンピシリンまたはテトラサイクリンへの耐性を付与する遺伝子である。
原核レプリコンを含むベクターはさらにまた、例えば大腸菌のような細菌宿主細胞における遺伝子をコードする配列の発現（転写および翻訳）を指令することのできる原核もしくはバクテリオファージプロモーターを含むことができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の発生を許容するＤＮＡ配列によって形成された発現制御エレメントである。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントを挿入するために便宜的な制限酵素認識部位を含有する典型的にはプラスミドベクター中で提供される。このようなベクタープラスミドの中で典型的であるのはバイオラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リッチモンド、ＣＡ）から入手できるｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、およびファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウェイ、ＮＪ）から入手できるｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。
真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合する発現ベクターもまた、さらにまたコード配列を含有するｒＤＮＡ分子を形成するために使用することができる。真核細胞発現ベクターは当分野においてよく知られており、数種の市販入手源から入手できる。典型的には、所望のＤＮＡセグメントを挿入するための便宜的な制限酵素認識部位を含有するこのようなベクターが提供される。このようなベクターの典型的なものはｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナル・バイオテクノロジー［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］社）、ヒスチジンタグおよびペリプラスム分泌を含むベクター系、または当分野で記載されている他のベクターである。
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターはさらにまた、真核細胞において有効である選択マーカー、好ましくは薬物耐性選択マーカーを含んでいてよい。好ましい薬物耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性を生じさせる遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。あるいはまた、選択マーカーは別個のプラスミド上に存在していてよい、そして２つのベクターは宿主細胞のコトランスフェクションによって導入することができ、選択マーカーのために適切な薬物中での培養によって選択することができる。
８．外来的に供給されたｒＤＮＡ核酸分子を含有する宿主細胞
本発明はさらに、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。本発明のタンパク質の発現のために有用である真核細胞は、該細胞系が細胞培養法と適合し、発現ベクターの伝播および遺伝子産物の発現と適合する限り、限定されない。好ましい真核宿主細胞には酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サル、もしくはヒト細胞系からのような脊椎動物細胞が含まれるがそれらに限定されず、さらに例えば軟骨を備える無脊椎動物からの細胞を含むこともできる。好ましい真核宿主細胞にはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５８）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６骨芽細胞およびその他の真核組織様培養細胞系が含まれるが、それらに限定されない。
あらゆる原核宿主を使用して本発明のタンパク質をコードするｒＤＮＡ分子を発現させることができる。好ましい原核宿主は大腸菌である。
本発明の組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子を用いた適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には使用するベクターのタイプおよび利用する宿主系に依存するよく知られた方法によって遂行される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、典型的にはエレクトロポレーションおよび塩処理法が使用される；例えば、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２１１０（１９７２）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。ｒＤＮＡを含有するベクターを用いた脊椎動物細胞の形質転換に関しては、典型的にはエレクトロポレーション、カチオン性脂質もしくは塩処理法が使用される；例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照されたい。
形質転換に成功した細胞、すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含有する細胞は選択マーカーについての選択を含むよく知られた技術によって同定することができる。例えば本発明のｒＤＮＡ分子の導入の結果として生じた細胞は単一コロニーを作製するためにクローン化することができる。それらのコロニーからの細胞は採取し、溶解させ、そしてそれらのＤＮＡ含量を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）またはＢｅｒｅｎｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：２０８（１９８５）によって記載されているような方法を使用してｒＤＮＡの存在について試験することができる。あるいはまた、該細胞を培養してｒＤＮＡによりコードされたタンパク質を作製し、例えばいずれかの適切な免疫学的方法を使用して該タンパク質を採取してアッセイすることができる。例えばＨａｒｌｏｗら（１９８８）を参照されたい。
コード配列および非コード配列の機能を解析するために組換えＤＮＡもまた利用できる。ｍＲＮＡの翻訳を変調する配列を親和性マトリックス系で利用すると、Ｄｋｋ−１もしくはＤｋｋ相互作用タンパク質もしくは発現制御配列と関連する細胞溶解液から入手したタンパク質を精製することができる。合成オリゴヌクレオチドは、当分野において一般に知られているように、ビーズに結合させて該溶解液を用いて精査されるであろう。関連するタンパク質はその後、例えば二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムを用いて分離できよう。このように単離されたタンパク質は、さらに質量分析法またはタンパク質シーケンシング法を使用して同定できよう。その他の方法は当業者には明白であろう。
９．ｃＤＮＡまたはその他の組換え核酸を使用した組換えペプチドおよびタンパク質の生成
本発明はさらにまた、Ｄｋｋタンパク質およびそのポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子、ならびにＤｋｋ（例えば、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびＨＢＭ、図５のタンパク質のようなＤｋｋ相互作用タンパク質）および分子アナログに結合するタンパク質およびポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドには全長Ｄｋｋおよびそのポリペプチドフラグメント、Ｄｋｋ結合タンパク質およびそのポリペプチドが含まれる。好ましくは、これらのタンパク質は哺乳動物タンパク質であり、最も好ましくはヒトタンパク質およびその生物学的に活性なフラグメントである。また別の実施形態には共通ポリペプチド配列からの少なくとも約３、５、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸残基の連続アミノ酸配列を有するポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子；アミノ酸残基が該ポリペプチド配列またはそのフラグメントのＮ末端もしくはＣ末端へ、またはその中に挿入されている共通ポリペプチド配列のアミノ酸配列変異体；および他の保存残基によって置換されている共通ポリペプチド配列またはそのフラグメントのアミノ酸配列変異体が含まれる。ポリペプチドをコードする組換え核酸分子には、例えば相同的組換え、部位特異的もしくはＰＣＲ突然変異誘発による所定の突然変異を含有するもの、および脊椎動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ブタ、ラクダ、爬虫類、ヤギ、鳥類、魚類、ウシ、ヒツジ、ウマおよび非ヒト霊長類種）ならびに無脊椎動物を含むがそれらに限定されない他の動物種の組換えＤｋｋタンパク質もしくはポリペプチドフラグメント、および上記の種およびヒト配列のＤｋｋ結合タンパク質の対立遺伝子または他の天然型変異体およびホモログが含まれる。ここで同様に想定されるのは一般に知られているＤｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、もしくはそれらのフラグメントの誘導体であるが、このときＤｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、もしくはそれらのフラグメントは置換、化学的、酵素的、またはその他の適切な手段によって天然型アミノ酸以外の成分（例えば、酵素もしくはラジオアイソトープのような検出可能な成分）およびＤｋｋの可溶形を用いて共有的に修飾されている。さらにまた、本発明が内因性配列にハイブリダイズし、そしてそれでも同一ポリペプチドをコードするサイレント突然変異を含む核酸を含むことも想定されている。
Ｄｋｋ結合タンパク質、ＤｋｋのＬＲＰ５結合ドメインフラグメント、またはその他の本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、好ましくは共通生物学的活性（例えば、ＬＲＰ５、ＨＢＭもしくはＬＲＰ６との相互作用のようなＤｋｋ活性を媒介する）を共有する核酸分子である。本発明のポリペプチドには、サイレント突然変異を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド、ならびに保存的アミノ酸置換、対立遺伝子変異体、および少なくとも１つのＤｋｋ活性を維持している本明細書開示したポリペプチドの他の変異体を含む生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸が含まれる。
本発明のアミノ酸化合物は、指定されたクラスのアミノ酸残基に関して部分的に定義されるポリペプチドである。ポリペプチドホモログは以下で記載するアミノ酸クラス内の保存的アミノ酸置換を含むであろう。アミノ酸残基は、一般に以下のような４つの主要サブクラスに分類することができる。
酸性：該残基は、生理的ｐＨでのＨ+イオンの消失に起因する負電荷を有しており、そして該残基は該ペプチドが水性溶媒中にあるときにそれが生理的ｐＨで含有されているペプチドの立体構造における表面位置を探索できるように水溶液によって誘引される。
塩基性：該残基は生理的ｐＨでのＨ+イオンとのつながりに起因する正電荷を有しており、そして該残基は該ペプチドが水性溶媒中にあるときにそれが生理的ｐＨで含有されているペプチドの立体構造における表面位置を探索できるように水溶液によって誘引される。
中性／非極性：該残基は生理的ｐＨでは荷電していないが、該残基は該ペプチドが水性溶媒中にあるときにそれが含まれているペプチドの立体構造における内部位置を探索できるように水溶液によって反発される。これらの残基は「疎水性」とも表示される。
中性／極性：該残基は生理的ｐＨでは荷電していないが、該残基は該ペプチドが水性溶媒中にあるときにそれが生理的ｐＨで含有されているペプチドの立体構造における外部位置を探索できるように水溶液によって誘引される。
当然ながら、個々の残基分子の統計的集合においては、一部の分子が荷電していて一部が荷電していない、そして水性溶媒からの誘因または反発が多かれ少なかれ生じると理解されている。「荷電した」の定義に適合するためには、個々の分子の統計的有意なパーセンテージ（少なくとも約２５％）が生理的ｐＨで荷電している。極性または非極性と分類するために必要な誘因または反発の程度は任意であるので、このため本発明によって特別に想定されるアミノ酸は一方または他方であると分類されている。特別に指名されていないほとんどのアミノ酸は既知の挙動に基づいて分類できる。
アミノ酸残基はさらにまた、環状もしくは非環状、および芳香族もしくは非芳香族、残基の側鎖置換基に関する一目瞭然の分類、および小さいもしくは大きいと分類することができる。該残基は、カルボキシル炭素を含む計４個以下の炭素原子を含有する場合は小さいと見なされる。小さい残基は、当然ながら常に非芳香族である。
遺伝子をコードする第２アミノ酸プロリンは技術的には中性／非極性／大／環状および非芳香族群に含まれるが、それがペプチド鎖の第２立体構造に及ぼす既知の作用に起因して特別なケースであり、このためこの定義群には含まれない。
該遺伝子内でコードされるもののその他のアミノ酸置換基もまた本発明の範囲内のペプチド化合物に含むことができ、それらの構造にしたがってこの一般スキーム内に分類することができる。
本発明の化合物はすべて医薬上許容される塩もしくはエステルの形状であってよい。塩は例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ+2、Ｍｇ+2等であってよい；エステルは一般に１〜６個の炭素からなるアルコールのエステルである。
本発明はさらに、本明細書記載した核酸分子を使用して本発明のタンパク質を作製する方法を提供する。一般的に言って、タンパク質の組換え形の生成には典型的には以下のステップが含まれる。
第１に、例えばヒトＤｋｋまたはその他のＤｋｋ配列をコードする核酸分子のようなＤｋｋをコードする、またはＤｋｋ結合タンパク質、Ｄｋｋアプタマーまたはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸分子が入手される。特にＤｋｋ結合ペプチドのためには該ペプチドをコードするヌクレオチドがインフレーム融合の形で核酸内に組み込まれる、またはチオレドキシンコード配列へ挿入または付加される。該コード配列（ＯＲＦ）は、イントロンによって中断されないので、あらゆる宿主において直接発現させるために適している。
これらのＤＮＡは真核細胞または原核細胞のような宿主細胞内へトランスフェクトさせることができる。真核宿主には哺乳動物細胞および脊椎動物（例えば、骨芽細胞、骨肉腫細胞系、ショウジョウバエＳ２細胞、肝細胞、腫瘍細胞系およびその他のあらゆる哺乳動物の骨細胞、ならびに例えば組換えバキュロウイルスを使用したＳｆ９細胞のような昆虫細胞）が含まれる。動物細胞中のＤｋｋを変調するためには例えば、Ｉ型コラーゲンプロモーターの制御下でオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するＤＮＡ、またはオステオカルシン ヒストン、Ｉ型コラーゲン、ＴＧＦβ１、ＭＳＸ２、ｃｆｏｓ／ｃＪｕｎおよびＣｂｆａ１のような骨芽細胞プロモーターを使用できる。あるいはまた該核酸は誘導プロモーターから下流で置換することができ、これはその後脊椎動物または無脊椎動物細胞内に入れることができ、またはトランスジェニック動物モデルを作製する際に使用することができる。
あるいはまた、本発明のタンパク質およびポリペプチドは異種系において発現させることができる。ヒト細胞系ＧＭ６３７、ＳＶ−４０形質転換ヒト線維芽細胞は、トリアクチンプロモーターの制御下でＤｋｋリガンド結合ドメインコード配列を含むプラスミドを用いてトランスフェクトすることができる（Ｒｅｉｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１８５−１９３（１９９２））。このようにトランスフェクトされた細胞は、機能アッセイにおけるＤｋｋ結合ドメインの起源として使用することができよう。あるいはまた、Ｄｋｋの一部分のみ、または本明細書開示したＤｋｋ結合ペプチドのいずれかをコードするポリペプチドまたはＤｋｋ相互作用タンパク質をコードするＤｋｋアプタマーもしくはポリペプチドは単独で、または融合タンパク質の形で発現させることができる。例えばＤｋｋ由来ペプチドはＧＳＴ−またはＨｉｓ−タグ融合タンパク質として細菌（例えば、大腸菌）中で発現させることができる。これらの融合タンパク質はその後精製して、ポリクローナル抗体を生成するために使用できる、または他のＤｋｋリガンドを同定するために使用できる。
核酸コード配列は、オープンリーディングフレームをコードするタンパク質を含有する発現単位を形成するために、好ましくは上記のように適切な制御配列と機能的に連結させて配置される。該発現単位は適切な宿主を形質転換させるために使用され、形質転換された宿主は組換えタンパク質の作製を許容する条件下で培養される。任意で、組換えタンパク質は培地または細胞から単離される；該タンパク質の回収および精製は、一部の不純性を認容できる一部の場合は必要とされないことがある。
上記のステップの各々は様々な方法で実施できる。例えば、所望のコード配列はゲノムフラグメントから入手して適切な宿主中で直接に使用できる。種々の宿主中で機能的である発現ベクターの構築は、上記で記載したように適切なレプリコンおよび制御配列を使用して遂行される。制御配列、発現ベクター、および形質転換法は該遺伝子を発現させるために使用される宿主細胞のタイプに依存し、上記で詳細に考察した。適切な制限酵素認識部位は、通常入手できない場合は、これらのベクター内に挿入する切り取り可能な遺伝子を提供できるようにコード配列の末端へ付加することができる。当業者であれば、組換えタンパク質を生成するために本発明の核酸分子と一緒に使用するために当分野で知られているあらゆる宿主／発現系を容易に適応させることができる。
１０．結合パートナーを同定する方法
本発明のまた別の実施形態は、ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質の結合パートナーを単離および同定する際に使用する方法を提供する。ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのポリペプチドフラグメントは、潜在的結合パートナーとＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質との結び付きを許容する条件下で潜在的結合パートナーまたは細胞の抽出液もしくは分画と混合することができる。混合後、ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質と結び付いたペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその他の分子は該混合物から分離される。該ポリペプチドに結合した結合パートナーはその後、精製してさらに分析することができる。ＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質の結合パートナーならびにＤｋｋとその相互作用タンパク質の１つ（例えば、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、または図５に列挙したタンパク質）との相互作用を防止する物質の決定は、当分野において知られているような多数の様々な競合アッセイを使用して実施できる。例えば、本明細書記載したようなＤｋｋの最小配列を使用するとＤｋｋ−１との結合およびその逆についてＬＲＰ５（またはＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはその他のリガンド結合パートナー）と競合する抗体を同定することができる。最小Ｄｋｋ配列は９６ウェルプレート（またはその他の固体基質）の底部に結合することができ、そして抗体または他の潜在的結合物質（例えば、ポリペプチド、模倣物、ホモログ、抗体フラグメント等）を競合アッセイにおいてスクリーニングして例えばＤｋｋの天然リガンド結合パートナーよりも大きい結合親和性を備える物質を同定することができる。
本発明では、適切な細胞を使用してＬＲＰおよび／またはＤｋｋまたは相互に相互作用するタンパク質の発現についてのアッセイを作製することができる。これらの細胞は哺乳動物、酵母、真菌またはウイルスから作製されても、引き出されてもよい。本発明のために適切な細胞は、検出可能なＤｋｋ−ＬＲＰ（またはＨＢＭ）相互作用、および好ましくは、Ｄｋｋ−１−ＬＲＰ５とＤｋｋ−１−ＨＢＭとの示差的相互作用を示すことのできる細胞が含まれるが、それらに限定されない。所望のアッセイのためには、細胞タイプは様々であってよい。数種の実施形態では、例えばヒト骨芽細胞（例えば、ｈＯＢ−０３−ＣＥ６）または骨肉腫細胞（例えば、Ｕ２ＯＳ）のような骨細胞が好ましい。追加のｈＯＢ細胞はｈＯＢ−０３−Ｃ５、ｈＯＢ−０２−０２、およびｈＯＢ−０１−Ｃ１−ＰＳ−０９細胞（ＡＴＣＣ：アメリカンタイプカルチャーコレクション、マナサス、ＶＡにＰＴＡ−７８５の名称で保管されている）と呼ばれる不死化前骨細胞性細胞系である。骨肉腫細胞の例にはＳａｏＳ２、ＭＧ６３およびＨＯＳ ＴＥ８５が含まれるであろう。不死化とは、実質的に無制限の細胞分割能力を備える持続的かつ永続的に確立された細胞培養を意味する。すなわち、該細胞は実質的に無制限に、すなわち少なくとも６ヵ月間は高速成長条件下で、好ましくはより緩徐な成長条件下ではるかに長期間にわたって培養することができ、かつルーチンの細胞培養技術を使用して高速かつ持続的に繁殖させることができる。あるいはまた言い換えれば、好ましい細胞は少なくとも約１００、１５０または２００集団倍加期間にわたって培養することができる。これらの細胞は正常ヒト骨芽細胞に特徴的なタンパク質の補体を生成することができ、骨芽細胞分化を行うことができる。これらは例えば、ホルモン、サイトカイン、および成長因子のような様々な物質への骨芽細胞感受性の細胞培養試験に、または組織療法において使用できる。検出可能なＤｋｋ−ＬＲＰ（またはＨＢＭ）相互作用を示すＨＥＫ ２９３細胞のような一定の非骨細胞もまた本発明のアッセイのために有用である。
結合パートナーを同定かつ単離するためには、全Ｄｋｋタンパク質（例えば、ヒトＤｋｋ−１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ３４６５１）またはＤｋｋ相互作用タンパク質（一部のＤｋｋ−１相互作用タンパク質についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は図５に示した）を使用できる。あるいはまた該タンパク質のポリペプチドフラグメントを使用できる。該タンパク質の適切なフラグメントにはいずれかのＤｋｋまたはＤｋｋインタラクター配列の少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０以上の連続アミノ酸残基が含まれる。Ｄｋｋの好ましい配列にはシステインリッチドメイン（例えば、Ｄｋｋ−１のＣｙｓ−１およびＣｙｓ−２）の一方もしくは両方の一部もしくは全部またはＤｋｋ−１のアミノ末端での保存配列が含まれる（Ｋｒｕｐｎｉｋら，Ｇｅｎｅ ２３８：３０１−３１３（１９９９）を参照）。あるいはまた、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭまたはＤｋｋ−１と相互作用する図５に示したもののような他のＤｋｋ相互作用タンパク質の部分を使用してＤｋｋ活性を変調する物質を同定かつ単離することができる。あるいはまた、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭまたはＤｋｋ−１と相互作用する図５に示したもののような他のＤｋｋ相互作用タンパク質のペプチドアプタマーを使用してＤｋｋ活性を変調する物質を同定かつ単離することができる。
ここで使用する細胞抽出液とは、溶解または破壊された細胞から作製される調製物もしくは分画を意味する。細胞抽出液を入手するためには様々な方法を使用できる。細胞は、物理的または化学的破壊方法のいずれかを使用して破壊することができる。物理的破壊法の例には、超音波処理および機械的剪断が含まれるがそれらに限定されない。化学的溶解法の例には界面活性剤溶解法および酵素溶解法が含まれるがそれらに限定されない。当業者であれば、細胞抽出液を作製するための方法を本発明方法に使用するための抽出液を入手するために容易に適応させることができる。
細胞の抽出液が作製されると、該抽出液は本発明のタンパク質と、該タンパク質と該結合パートナーとの結び付きが発生できる条件下で混合される。様々な条件を使用できるが、最も好ましいのはヒト細胞の細胞形質中で見いだされる条件に密接に近似する条件である。浸透圧、ｐＨ、温度、および使用される細胞抽出液の濃度のような特徴は該タンパク質と該結合パートナーとの結び付きを最適化するように変化させることができる。
適切な条件下で混合した後、結合複合体は該混合物から分離される。該混合物を分離するためには様々な技術を利用できる。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体を使用すると結合パートナー複合体を免疫沈降させることができる。あるいはまた、クロマトグラフィーおよび密度／沈殿物遠心分離のような標準化学的分離技術も使用できる。例えば、本発明のタンパク質はＨｉｓタグのような親和性タグを用いて発現させられる。Ｈｉｓ標識タンパク質およびあらゆる結合分子を維持してＮｉ−ＮＴＡカラムから選択的に溶出することができる。
該抽出液中で見いだされた、結び付いていない細胞成分を除去した後、該結合パートナーは従来型方法を使用して複合体から分離することができる。例えば、該分離は該混合物の塩濃度もしくはｐＨを変化させることによって遂行できる。
混合抽出液から結び付いた結合パートナー対を分離するのに役立つように、本発明のタンパク質は固体支持体上に固定することができる。例えば、該タンパク質はニトロセルロースマトリックスまたはアクリルビーズに付着されてもよい。該タンパク質の固体支持体への付着は該抽出液中で見いだされた他の成分からペプチド／結合パートナー対を分離する際に役立つ。同定された結合パートナーは単一タンパク質であっても、２個以上のタンパク質から形成された複合体であってもよい。
あるいはまた、本発明の核酸分子はＹ２Ｈ系に使用できる。Ｙ２Ｈ系は他のタンパク質パートナー対を同定するために使用されてきており、本明細書記載した核酸分子を使用するために容易に適応させることができる。Ｙ２Ｈ系を実施かつ使用するための方法はよく知られている。例えば、酵母２ハイブリッド系（Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐａｕｌ Ｌ．Ｂａｒｔｅｌら編集、オックスフォード、１９９７）の中のＦｉｎｌｅｙら，「遺伝的調節ネットワークの２ハイブリッド解析（Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」；酵母２ハイブリッド系（Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐａｕｌ Ｌ．Ｂａｒｔｅｌら編集、オックスフォード、１９９７）の中のＭｅｉｊｉａ Ｙａｎｇ，「２ハイブリッドアッセイにおけるコンビナトリアルペプチドライブラリーの使用（Ｕｓｅ ｏｆ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ）」；Ｇｉｅｔｚら，「関心タンパク質と相互作用するタンパク質の同定：酵母２ハイブリッド系の適用（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｍｏｌ．＆ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：６７−９（１９９７）；Ｋ．Ｈ．Ｙｏｕｎｇ，「酵母２ハイブリッド：相互作用が多いほど、所要時間が少なくなる（Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ：Ｓｏ Ｍａｎｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｉｎｓ，（ｉｎ） ｓｏ Ｌｉｔｔｌｅ Ｔｉｍｅ）」，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８：３０２−３１１（１９９８）；Ｒ．Ｂｒｅｎｔら，「２ハイブリッド法を用いて遺伝子および対立遺伝子機能を理解する（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ａｌｌｅｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３１：６６３−７０４（１９９７）および米国特許第５，９８９，８０８号を参照されたい。図５に同定したＤｋｋ−１相互作用タンパク質はベイトとしてＤｋｋ−１を使用するＹ２Ｈ相互作用系を使用して同定した。
Ｄｋｋモジュレーターについての１つの好ましいインビトロ結合アッセイは、ＤｋｋのＬＲＰ結合ドメインと１つ以上の候補結合標的もしくは基質との混合物を含むであろう。該混合物を適切な条件下で培養した後、候補モジュレーターと結合しているＤｋｋまたはそのフラグメントが存在するかどうかを決定するであろう。無細胞結合アッセイのためには、１つ以上の成分は通常は標識を含んでいる、またはそれに結合している。該標識は例えば放射能、発光、光学もしくは電子密度等のような直接検出、または例えばエピトープタグ、酵素等のような間接的検出を提供することができる。該標識の性質および他のアッセイ成分に依存する標識を検出するために様々な方法を使用できる。例えば、固体基質に結合している標識を検出できる、または該標識を含有する結合複合体の一部分を該固体基質から分離して、その後に該標識を検出できる。蛍光共鳴エネルギー転移を利用すると２つの標識分子の相互作用を監視できる。例えば、Ｄｋｋ上の蛍光標識およびＬＲＰ５またはその可溶性フラグメント上の例えば細胞外ドメインのような別の標識は、近傍にあるときは蛍光共鳴エネルギーを交換して、これら２つの分子が結合していることを示すであろう。Ｄｋｋに対する好ましい結合パートナーはＤｋｋとＬＲＰ５との親和性を増加または減少させ、これは蛍光分光計において容易に観察されるであろう。あるいはまた、ＢＩＡｃｏｒｅ（ウプサラ、スウェーデン）によって製造された表面プラズモン共鳴検出器のような機器を使用すると固定標的との相互作用を観察することができる。当業者であればこの目的に使用できる多数の他の方法を知っている。
これにより、本発明は本発明のポリペプチドを含む候補を、これらの候補が貴重な薬物リードであると同定する活性についてスクリーニングする方法を提供する。その他の適切な方法は当分野においても知られており、アフリカツメガエル卵母細胞注入試験およびＴＣＦルシフェラーゼアッセイを含めてここで使用するために適している。
その他のアッセイを使用すると、Ｗｎｔ経路におけるＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質の活性ならびにＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質がＷｎｔ経路に及ぼす変調剤の影響を同定することができる。これには、Ｗｎｔシグナル伝達変調を監視するための例えばアフリカツメガエル胚アッセイおよびＴＣＦルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイが含まれる。
アフリカツメガエル胚はＷｎｔシグナル伝達の変調を評価するための情報を提供するインビボアッセイ系である。Ｗｎｔシグナル伝達経路の一定のＷｎｔｓまたはその他のアクチベーターの異所性発現は、前神経板の分岐を生じさせる。この分岐は重複体軸を生じさせ、これは胚発生中のＷｎｔシグナル伝達にとっての役割を示唆している（ＭｃＭａｈｏｎら，Ｃｅｌｌ ５８：１０７５−８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌら，Ｃｅｌｌ ６７：７４１−５２（１９９１））。これらの最初の観察以降、アフリカツメガエル胚アッセイはＷｎｔシグナル伝達経路の変調を評価するためのアッセイ系として広範囲に使用されてきた。本発明の１つの好ましい実施形態は図６に示した。
アフリカツメガエル発現のための構築物は当分野でよく知られているように作製できる。例えば、アフリカツメガエル卵母細胞注入実験において使用するｍＲＮＡのインビトロ生成を促進するために様々なｃＤＮＡがベクターｐＣ３２+内へ工学的に作製されてきた（Ｔｕｒｎｅｒら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．８：１４３４−１４４７（１９９４））。ＤＮＡ挿入断片はベクターＳＰ６プロモーターに関してセンス方向においてサブクローニングされる。該挿入断片の下流では、該ベクターはＳＶ４０ウイルスポリアデニル化シグナルおよびＴ３プロモーター配列（すなわち、アンチセンスｍＲＮＡの生成のために）を提供する。構築物は様々なＤｋｋファミリーメンバー、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、Ｄｋｋ−１インタラクター等に対して生成することができる。構築物は、酵母スクリーニングにおいて同定されたペプチドアプタマーをコードする核酸配列を含有するｐＣＳ２+内で生成できよう。これらの配列は、該ペプチドアプタマーが該細胞から翻訳および分離されることを保証するために５’合成翻訳開始配列、その後に正規シグナル配列へ融合させられるであろう。
これらの構築物が作製されると、その後はｍＲＮＡを合成してアフリカツメガエル卵母細胞内へ注入することができる。アフリカツメガエル胚内へ顕微注入するためのｍＲＮＡは、テンプレートとして上記のｐＣ３２+ベクター内のｃＤＮＡ構築物を使用するインビトロ転写によって生成される。実質的にＭｏｏｎら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ−Ｊ．ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：７６−８９（１９８９）、およびＰｅｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３６：６５７−６２（１９９１）に記載されているように、様々な量のＲＮＡを４−もしくは８細胞アフリカツメガエル胚の腹側割球内に注入することができる。
以前のデータは、Ｗｎｔ５ａの存在下でＬＲＰ５の発現がアフリカツメガエル胚中でＷｎｔ誘導性重複体軸形成を生じさせることを証明している（Ｔａｍａｉら，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：５３０−５３５（２０００））。Ｄｋｋ−１およびＤｋｋ−２、およびＤｋｋ−１相互作用タンパク質がインビボのＬＲＰ５−媒介性Ｗｎｔ反応を変調する際の役割は、例えばアフリカツメガエル胚を使用して解析できる。さらに、ペプチドアプタマー、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、または上記の組合せは同様の方法で評価できる。
観察された表現型の特異性を確認するために、ＲＮＡを背側割球に注入する実験もまた実施できる。例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはｌａｃＺのようなマーカー遺伝子を実験ＲＮＡと一緒に共注入する細胞系統追跡実験もまた実施できる。マーカー遺伝子発現の検出はマイクロインジェクションの標的細胞を同定して作用機序の解明に役立つであろう。上記に列挙したＷｎｔシグナル伝達成分に加えて、ＨＢＭがＷｎｔ経路に作用する時点についても解析できる。これは種々のドミナントネガティブ構築物の共注入によって実施できる。例えば、ドミナントネガティブＴＣＦ−３構築物は、観察された体軸重複（およびＷｎｔ活性化）がβ−カテニン−ＴＣＦ反応を解して媒介されるのを証明するのに有用であろう。もしそうであれば、このような構築物は観察された重複体軸表現型を無効にすると予想されるであろう。また別の例には、ドミナントネガティブＤｓｈ構築物が含まれる。ＤｓｈはＷｎｔシグナル伝達経路においてはるかに上流であるので、ドミナントネガティブ構築物はＷｎｔ反応の活性化および観察された体軸重複を無効にするはずである。そうでなければ、これは体軸重複が相違するシグナル伝達経路を介して誘導されることを示唆するであろう。
注入されたアフリカツメガエル胚のマーカー遺伝子は以下のように解析できる。マーカー遺伝子解析のためには、代表的胚はステージ１０．５（受精１１時間後）に採取する。ＲＮＡは標準プロトコールにしたがって胚から抽出かつ精製する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８６年，７．１６）。マーカー遺伝子には以下のものが含まれよう：Ｓｉａｍｏｉｓ（すなわち、Ｗｎｔ反応性遺伝子）、Ｘｎｒ３（すなわち、Ｗｎｔ反応性遺伝子）、ｓｌｕｇ（すなわち、神経堤マーカー）、Ｘｂｒａ（すなわち、早期中胚葉マーカー）、ＨＮＫ−１（すなわち、外胚葉／神経堤マーカー）、内皮（すなわち、内胚葉）、ＸＩｈｂｏｘ８（すなわち、膵臓）、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４（すなわち、早期中胚葉）、ＸＬＲＰ６（すなわち、母体および接合体発現、カエルにおいてはＬＲＰ６ホモログでもある）、ＥＦ−１（すなわち、コントロール）およびＯＤＣ（すなわち、コントロール）。マーカー遺伝子の誘導はＲＴ−ＰＣＲ／ＴａｑＭａｎ（登録商標）によって解析および定量される。
このタイプのマーカー解析は、シグナル伝達摂動の直接的結果として胚内で極めて初期に生じる遺伝子発現における変化を監視するために極めて優れている。より組織もしくは空間的に制限された方法での遺伝子発現における変化を監視する他の実験を構成できるであろう。その例にはトランスジェニックアフリカツメガエルモデルの生成が含まれる。例えば、Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５およびＨＢＭ発現は各々中胚葉または体節中で一過性に遺伝子発現を指令する短尾もしくは心臓アクチンプロモーターの制御下で生じることができよう。これらのトランスジェニックアフリカツメガエルの表現型解析はマーカー遺伝子解析／転写プロファイリング（制限された組織源から）および外組織の組織学的検査を含むであろう。
Ｗｎｔシグナル伝達活性、Ｄｋｋ活性およびＤｋｋ相互作用タンパク質活性を監視するためには、実施例７に記載したようなＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイ系もまた使用できる。ＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイのための構築物は当分野においてよく知られているように作製できる。例えば、ＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチド、特にＬＲＰ５／ＬＲＰ６は他の中で分泌のための標的ペプチドへのＫｏｚａｋおよびシグナル配列を使用してｐｃＤＮＡ３．１内で発現させることができる。
構築物が作製されると、骨芽細胞およびＨＥＫ２９３細胞のような細胞をウェルプレート内に播種し、構築物ＤＮＡ、ＣＭＶ β−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡ、およびＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーターＤＮＡを用いてトランスフェクトする。その後これらの細胞を溶解させ、Ｄｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、または例えば抗体のような他の分子がＷｎｔシグナル伝達に影響を及ぼすかどうかを決定するためにβ−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ活性について評価される。
Ｗｎｔシグナル伝達活性、Ｄｋｋ活性、およびＤｋｋ相互作用タンパク質活性を監視するための追加のアッセイには以下が含まれる。
レポーター遺伝子活性によって可視化されるような他のＷｎｔ反応性転写因子、ＬＥＦの変調。１つの例には、ルシフェラーゼレポーター遺伝子へ融合したＬＥＦ１プロモーター領域の活性化が含まれる（Ｈｓｕら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４８０７−１８（１９９９））。
細胞増殖、細胞周期もしくはアポトーシスにおける変化。Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｃｅｌｌ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８：１３４９−５８（１９９７）を含むＷｎｔ媒介性細胞形質転換を記載した多数の例がある。
Ｗｎｔ活性化のインジケーターとしての脱リン酸化β−カテニンの安定化および細胞局在化（Ｓｈｉｍｉｚｕら，１９９７）。
正規または非正規経路のどちらかを通してＷｎｔシグナル伝達をアッセイする追加の方法は、当業者には明白であろう。
１１．Ｄｋｋおよび／またはＬＲＰ５タンパク質および／またはＤｋｋ相互作用タンパク質をコードする核酸の発現を変調する物質を同定する方法
本発明のまた別の実施形態はＤｋｋをコードする核酸の発現を変調する物質を同定する方法を提供する。このようなアッセイは、本発明の核酸の発現レベルにおける変化を監視するために利用できるあらゆる手段を利用できる。ここで使用する物質は、細胞中での核酸の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる場合は、Ｄｋｋの発現を変調すると言われる（例えば、ｍＲＮＡ）。
１つのアッセイフォーマットでは、Ｄｋｋ（またはＤｋｋの活性を変調するタンパク質）をコードする核酸といずれかのアッセイ可能な融合パートナーとのレポーター遺伝子融合を含有する細胞系を作製できる。ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むがそれらに限定されない多数のアッセイ可能な融合パートナーが知られており、容易に入手できる（Ａｌａｍら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：２４５−２５４（１９９０））。レポーター遺伝子融合を含有する細胞系は、その後適切な条件下および時間で試験される物質へ曝露させられる。該物質へ曝露させられたサンプルとコントロールサンプルとの間でのレポーター遺伝子の示差的発現は、Ｄｋｋをコードする核酸またはＤｋｋ活性を変調する他のタンパク質の発現を変調する物質を同定する。このようなアッセイは、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６活性さえがＤｋｋ活性を調節することによって変調するかどうかを決定するために同様に使用できる。
追加のアッセイフォーマットを使用して１つ以上の物質が単独もしくはＤＫｋおよびＬＲＰ５のようなＤｋｋ、および／または例えば図５に同定されたもののようなＤｋｋ相互作用タンパク質をコードする核酸の発現を変調する能力を監視することができる。例えば、ｍＲＮＡ発現は本発明の核酸へのハイブリダイゼーションによって直接に監視することができる。細胞系は適切な条件下および時間で試験される物質へ曝露させられ、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡがＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ＮＹ，１９９５）；Ｍａｎｉａｔｉｓら，「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８２）；および「分子生物学におけるショートプロトコール：分子生物学における最新プロトコールからの方法の概論（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９９年４月）に開示される方法のような標準方法によって単離される。
該物質に曝露させた細胞とコントロール細胞との間のＲＮＡ発現レベルにおける差を検出するためのプローブは本発明の核酸から作製できる。不可欠ではないが、高ストリンジェンシーの条件下で標的核酸とのみハイブリダイズするプローブを構成することが好ましい。高度に相補的核酸ハイブリッドだけが高ストリンジェンシーの条件下で形成される。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーがハイブリッドを形成するために２本の核酸鎖間に存在しなければならない相補性の量を決定する。ストリンジェンシーはプローブ：標的ハイブリッドと潜在的プローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性における差を最大化するように選択しなければならない。
プローブは、当分野において知られている方法を通して本発明の核酸から構成できる。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含量およびプローブ長はその標的配列に結合するプローブに影響を及ぼすことができる。プローブ特異性を最適化する方法は一般に利用できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）もしくはＡｕｓｕｂｅｌら「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ＮＹ，１９９５）を参照されたい。
ハイブリダイゼーション条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５）によって記載されているもののような既知の方法を使用して、各プローブに適合するように修正される。全細胞ＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡに富むＲＮＡのハイブリダイゼーションはいずれかの利用可能なフォーマットで遂行できる。例えば、全細胞ＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡに富むＲＮＡは固体支持体へ付着させ、該固体支持体を該プローブが特異的にハイブリダイズする条件下で本発明の少なくとも１つの核酸配列、または１つの核酸配列の一部分を含んでいる少なくとも１つのプローブへ曝露させることができる。あるいはまた、本発明の少なくとも１つの配列、または１つの配列の一部分を含んでいる核酸フラグメントを例えば多孔性ガラスウェハーのような固体支持体に付着させることができる。ガラスもしくはシリカウェハーは、その後付着させた配列が特異的にハイブリダイズする条件下でサンプルからの全細胞ＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡへ曝露させることができる。このようなガラスウェハーおよびハイブリダイゼーション法は広く利用可能であり、例えばＢｅａｔｔｉｅ（ＷＯ９５／１１７５５号）に開示されている。所定のプローブが未処理細胞集団および該物質に曝露させた細胞集団からのＲＮＡサンプルに特異的にハイブリダイズする能力を試験することによって、Ｄｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、および／またはＬＲＰ５をコードする核酸の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする物質を同定できる。
マイクロアレイテクノロジーおよび転写プロファイリングは、推定ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質を変調する化合物の影響を解析するために使用できる方法の例である。転写プロファイリングのためには、Ｄｋｋ相互作用タンパク質を変調する物質である本発明で同定されたＤｋｋ相互作用タンパク質（例えば、図５に同定されたもの）、および該物質に曝露されなかった同一タイプの細胞からのｍＲＮＡのようなインビボで潜在Ｄｋｋ変調剤へ曝露させた細胞からのｍＲＮＡは逆転写させて多数の遺伝子からのＤＮＡを含有するチップへハイブリダイズさせ、それによって該物質を用いて処理された、および処理されていない細胞中の遺伝子発現と比較することができよう。例えば推定Ｄｋｋ変調剤が細胞内のＤｋｋの発現をダウンレギュレートする場合は、一定の患者集団においては該物質の使用が望ましくない可能性がある。転写プロファイリングの追加の方法およびマイクロアレイの使用のためには、例えばＬｉｚａｒｄｉ（２０００）へ発行された米国特許第６，１２４，１２０号を参照されたい。
ＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質を変調する化合物またはＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質がＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭもしくはＷｎｔ経路の変調に及ぼす作用をスクリーニングする追加の方法にはタンパク質検出のためのＴａｑＭａｎ ＰＣＲ、従来型逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、下流代理マーカー（すなわち、Ｗｎｔ反応性遺伝子）における変化、および抗Ｄｋｋウェスタンブロットの使用が含まれる。その他の方法は当業者には容易に明白であろう。
１２．Ｄｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、またはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭの少なくとも１つの活性を変調する物質を同定する方法
本発明のまた別の実施形態は、Ｄｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、および／またはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭタンパク質の少なくとも１つの活性を変調する物質を同定する、または好ましくはＤｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質複合体もしくはＬＲＰ５（またはＬＲＰ６／ＨＢＭ）／Ｄｋｋ複合体、またはＤｋｋの生物学的に活性なフラグメント（例えば、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭに結合するドメインを含んでいる）またはＤｋｋ相互作用タンパク質複合体の１つの活性を特異的に変調する物質を同定する方法を提供する。このような方法またはアッセイは当分野で知られているような所望の活性を監視または検出するあらゆる手段を利用できる（例えば、Ｗｕら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：１６１１−４（２０００）；Ｆｅｄｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９４６５−７２（１９９１）；Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８９：１５１−３（１９９９）；Ｓｈｉｂａｔａら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９６：２４３−６（２０００）；Ｗａｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：１８４３−８（２０００）；およびＧｌｉｎｋａら，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３５７−６２（１９９８）を参照されたい）。Ｄｋｋを変調する可能性がある物質には、例えばＤｋｋ−１を誘導できる癌抑制タンパク質であるｐ５３が含まれる。ＤＮＡの損傷もまたｐ５３の安定化および活性化を介してＤｋｋ−１発現をアップレギュレートすることが観察されている（Ｗａｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：１８４３−４８（２０００））；およびＳｈｏｕら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：８７８−８９（２００２））。さらにＦｅｄｉら（１９９９）は、Ｄｋｋ−１がＮＩＨ−３Ｔ３細胞のＷｎｔ２−誘導発癌性形質転換を遮断できることを証明したと言われている。さらにその上、Ｄｋｋ発現を発達中の骨格においてＢＭＰシグナル伝達により変調できることが示唆されている（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．１：４２３−３４（２００１）；およびＧｒｏｔｅｗｏｌｄら，ＥＭＢＯ Ｊ．２１：９６６−７５（２００２））。Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄらはさらに、ＵＶ照射およびその他の遺伝毒性刺激を含むストレスシグナルに反応して変化したＤｋｋ発現レベルについて述べている。彼らは、Ｄｋｋ発現が前アポトーシス性であると提案している。高骨量を付与するＨＢＭ構築物を発現する動物においては、骨芽細胞アポトーシス作用の低下が観察された。そこでＨＢＭおよびＨＢＭ様変異体はプログラムされた細胞死におけるＤｋｋの役割を制御／変化させる可能性がある。Ｄｋｋ活性を変調する可能性がある他の物質には、図５に同定されたＤｋｋ相互作用タンパク質が含まれる。
１つの実施形態では、試験される物質へ曝露させられている１つの細胞集団の相当量のＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質が曝露させられていないコントロール細胞集団と比較される。抗体を使用して相違する細胞集団における該タンパク質の示差的発現を監視することができる。細胞系もしくは細胞集団は適切な条件下および時間で試験される物質へ曝露させられる。細胞溶解液は曝露させた細胞系もしくは細胞集団およびコントロールの曝露させられていない細胞系もしくは細胞集団から作製できる。細胞溶解液はその後、当分野でよく知られているようにプローブを用いて解析される。例えばＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）およびＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，「抗体を使用する：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）を参照されたい。
例えばＤｋｋのＮ末端およびＣ末端フラグメントは、細菌中で発現させてこれらのフラグメントに結合するタンパク質を検索するために使用できる。例えばＤｋｋのＮ末端もしくはＣ末端領域（またはＤｋｋ−１の生物学的に活性なドメイン）へのＨｉｓタグもしくはＧＳＴ融合のような融合タンパク質または全Ｄｋｋタンパク質を作製できる。これらの融合タンパク質は、例えばＴａｌｏｎもしくはグルタチオン−セファロースビーズへ結合させ、その後Ｄｋｋへ結合する分子を同定するために細胞溶解液を用いて精査できる。溶解させる前に、これらの細胞は精製Ｗｎｔタンパク質、ＲＮＡ、またはＷｎｔシグナル伝達またはＷｎｔ経路の下流エレメントと相互作用するタンパク質を変調できる薬物を用いて処理することができる。融合タンパク質に結合している溶解液タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解させ、単離し、例えば当分野で知られているようにタンパク質順または質量分析法によって同定することができる。例えば、「タンパク質精製用途：実践アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）（Ｓｉｍｏｎ Ｒｏｅ編集、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）およびＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）の中の「タンパク質精製の指針（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」を参照されたい。
Ｄｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、またはＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの複合体の活性は、ＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質（例えば、図５に示したもの）および／またはＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を変調する化合物によって影響を受ける可能性がある。本発明はこれらの化合物の発見および特性解析のための方法および研究用ツールを提供する。ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質および／またはＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用はインビボおよびインビトロにおいて監視できる。Ｄｋｋ−ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ複合体の安定性を変調する化合物は可能性のある治療用化合物である。インビトロ法の例には以下のものが含まれる：プラズモン共鳴分析法観察を実施するためにバイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）によって製造されたような機器のために構成されたセンサーチップへのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ、Ｄｋｋ、またはＤｋｋ相互作用タンパク質の結合。この方法では、Ｄｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、またはＬＲＰ５／６の１つを含むチップが最初に複合体を形成することを許容する条件下で他のチップへ曝露させられる。試験化合物が導入され、機器の出力シグナルは該試験化合物が発揮したいずれかの作用の指標を提供する。この方法によって、化合物を迅速にスクリーニングすることができる。また別のインビトロ法は、ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲ法によって例示される（Ｓｈｕｋｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：１５３１−４（１９９６））。手短かにはＤｋｋ−１結合ドメインおよび／またはＬＲＰ５もしくは６ＬＢＤが発現させられ、標識培地中での発現によって15Ｎ標識タンパク質として精製される。標識タンパク質は、ＮＭＲサンプルチューブ内の溶液中で複合体を形成させられる。試験化合物の存在下および不在下での異核相関スペクトルが試験化合物との相互作用および該複合体のタンパク質−タンパク質界面での変化に関する個々の残基レベルでのデータを提供する。当業者であれば、例えば親和性キャピラリー電気泳動法（Ｏｋｕｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１０５７−６２（２００１）；Ｖｅｒｇｕｎ ａｎｄ Ｃｈｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９：２７０−７（１９９９））、蛍光分析法、電子常磁性共鳴法等のような、複合体の変調を監視できる、および／または複合体形成に対する結合親和性を測定できる多数の他のプロトコールを知っている。
Ｄｋｋ／ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ複合体の変調を監視するためのインビトロプロトコールには酵母２ハイブリッドプロトコールが含まれる。酵母２ハイブリッド法を使用すると、Ｄｋｋの融合タンパク質とＬＲＰリガンド結合ドメインとの複合体の形成によって活性化された遺伝子の発現を監視することによってインビボでの複合体の変調を監視することができる。相互作用ＤｋｋおよびＬＲＰ ＬＢＤドメインをコードする本発明に従った核酸がベイトおよびプレイプラスミド内に組み込まれる。Ｙ２Ｈプロトコールは１つ以上の試験化合物の存在下で実施される。該複合体の変調は、該複合体活性化遺伝子の発現における変化によって観察される。当業者には、試験化合物を該アッセイに直接添加できる、またはタンパク質の場合、ベイトおよびプレイ化合物と一緒に酵母内で共発現させることができる。同様に、ＤｋｋおよびＤｋｋ相互作用タンパク質の融合タンパク質はさらにまたＹ２Ｈスクリーニングにおいて使用してＤｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質複合体を変調する他のタンパク質を同定することができる。
これらのようなアッセイプロトコールを方法中使用すると、Ｄｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質および／またはＤｋｋ／ＬＲＰ５／６複合体を変調する化合物、薬物治療法について、このような変調が競合的結合によって、または結合部位でＬＲＰ５／６もしくはＤｋｋのいずれかの構造を変化させることによって、またはタンパク質−タンパク質界面を安定化もしくは脱安定化させることによって発生するかどうかをスクリーニングすることができる。ペプチドアプタマーは競合的に結合するが、立体効果によって変化した結合部位構造の導入もまた可能であることを予想できる。
１２．１ 抗体および抗体フラグメント
ＤｋｋまたはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにこれらの抗体のフラグメントは、当分野においてよく知られているように作製できる。例えば、適切な宿主動物は適切な免疫プロトコールおよび本発明のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を使用して免役することができる。免疫に使用するためのペプチドは、典型的には約８〜４０残基長である。必要または所望であれば、ポリペプチド免疫原を適切な担体へ抱合させることができる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のような担体、またはその他の担体タンパク質を用いて免疫原性抱合体を作製する方法は当分野においてよく知られている（Ｈａｒｌｏｗら，１９８８を参照）。一部の状況では、例えばカルボジミド試薬を使用した直接抱合が有効なことがある；他の例では、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ロックフォード、ＩＬによって供給されるもののような連結試薬が該ポリペプチドもしくはハプテンへの接近可能性を提供するために望ましいことがある。ハプテンペプチドは、例えば担体への連結を促進するためにシステイン残基を含むアミノもしくはカルボキシ末端のどちらかで伸長させることができる、またはシステイン残基を割り込ませることができる。免疫原の投与は一般に、当分野において一般に理解されているように、概して適切な時間に渡る注入および適切なアジュバントを使用して実施される。免疫スケジュール中には、抗体形成の妥当性を決定するために抗体の力価が取得される。
抗ペプチド抗体は、例えばＤｋｋ−１、もしくはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭを含むいずれかのＤｋｋの配列に由来するペプチドのような合成ペプチドを使用して生成することができる。合成ペプチドは長さが２〜３アミノ酸と小さくてよいが、好ましくは少なくとも３、５、１０、または１５アミノ酸残基長以上である。このようなペプチドは、ＤＮＡＳｔａｒのようなプログラムを使用して決定できる。これらのペプチドは標準方法を使用してＫＬＨへ結合されており、ウサギのような動物内へ免役することができる。ポリクローナル抗Ｄｋｋもしくは抗ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭペプチド抗体は、例えば共有的に結合したペプチドを含有するＡｃｔｉｇｅｌビーズを使用して精製できる。
この方法で精製されたポリクローナル抗血清は一部の適用には十分であるが、医薬組成物のためにはモノクローナル調製物の使用が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞系は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎの標準方法または一般に知られているように、リンパ球もしくは脾臓細胞の不死化を実施する修飾を使用して作製できる（例えば、Ｈａｒｌｏｗら，１９８８および１９９８を参照）。所望の抗体を分泌する不死化細胞系は、抗原がペプチドハプテン、ポリペプチドもしくはタンパク質であるイムノアッセイによってスクリーニングすることができる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養が同定されると、該細胞はインビトロまたは腹水中での生成のいずれかで培養できる。
所望のモノクローナル抗体はその後培養上清から、または腹水上清から回収される。免疫学的に有意な部分を含有するモノクローナル抗体のフラグメントはＤｋｋ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして使用できる。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのＦａｂ、ｓｃＦＶ、Ｆａｂ’のような免疫学的反応性フラグメントの使用はしばしば、特に治療状況においては、これらのフラグメントが全免疫グロブリンより概して免疫原性が低いので好ましい。
抗体もしくはフラグメントは、さらにまた最新テクノロジーを使用して組換え手段によって生成できる。ＤｋｋもしくはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭの所望の領域へ特異的に結合する領域はまた、多数の種起源を用いたキメラの状況において生成することができる。このように作り出された抗体試薬は診断的に、またはＤｋｋ活性の刺激薬または阻害薬としての使用のために想定されている。
１つの実施形態では、Ｄｋｋに対する抗体は高度の、すなわち１０-5〜１０-9Ｍの範囲内の親和性でＤｋｋに結合する。好ましくは、抗Ｄｋｋ抗体はキメラ、霊長類、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）、ヒトもしくはヒト化抗体を含んでいる。同様に、本発明は抗体フラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆｖ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびその凝集体の使用を含んでいる。
また別の実施形態は、ＤｋｋまたはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭを認識するキメラ抗体を想定している。キメラ抗体とは、非ヒト可変領域およびヒト定常領域、最も典型的には齧歯類可変領域およびヒト定常領域を備える抗体を意味することが意図されている。
「Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体」とは、例えばＣＤＲのような霊長類可変領域およびヒト定常領域を備える抗体を意味する。好ましくは、このような霊長類可変領域は旧世界ザル由来である。
「ヒト化抗体」とは、実質的にヒトフレームワークおよび定常領域、および非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を備える抗体を意味する。「実質的に」とは、ヒト化抗体が典型的に少なくとも数個のドナーフレームワーク残基（すなわち、ＣＤＲが由来する非ヒト親抗体の）を維持しているという事実を意味する。
キメラ、霊長類、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）、ヒト化およびヒト抗体を生成する方法は当分野においてよく知られている。それらの全部が参照することにより組み込まれる例えばＱｕｅｅｎらに発行された米国特許第５，５３０，１０１号；Ｗｉｎｔｅｒらに発行された米国特許第５，２２５，５３９号；各々ＢｏｓｓらおよびＣａｂｉｌｌｙらに発行された米国特許第４，８１６，３９７号および第４，８１６，５６７号を参照されたい。
ヒト定常領域の選択は、主題抗ＤｋｋまたはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ抗体の治療有効性にとって重要な可能性がある。１つの好ましい実施形態では、主題抗ＤｋｋまたはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ抗体は、ヒト、γ１もしくはγ３定常領域および、より好ましくはヒトγ１定常領域を含むであろう。
ヒト抗体を作製する方法も知られており、例えばＳＣＩＤマウス、およびインビトロ免疫における産生が含まれる。
主題抗ＤｋｋまたはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ抗体は様々な投与形路、典型的には非経口的に投与できる。これは静脈内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内を含むことが意図されるが、静脈内注入による投与が好ましい。
抗ＤｋｋまたはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ抗体は治療用途のために標準方法によって、例えば無菌食塩水、無菌緩衝水、プロピレングリコールおよびそれらの組合せのような医薬上許容されるバッファーの添加によって作製される。
有効量は、多数の要素の中でも特異的抗体、患者の状態、年齢、体重、またはいずれかの他の治療に依存する。典型的な有効量は、約０．００１〜約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、より好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、および最も好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲内である。
このような投与は、投与される用量および患者の反応に依存して、例えば週１回、隔週、または月１回のような様々のプロトコールによって実行できる。同様に、このような投与と他の両方を結合することが望ましいことがある。
図５に同定したもののようなＤｋｋ−１相互作用タンパク質に対する抗体もまた本発明によって想定されており、上記の方法論で言及したＤｋｋ−１抗体に類似して使用できる。
本発明の抗体は、実験的スクリーニングにおいて、診断試薬として、および治療用組成物として利用できる。
１２．２ 化学ライブラリー
これらの方法によってアッセイできる物質は、無作為に選択でき、または合理的に選択もしくは構成できる。ここで使用するように、１つの物質が、該物質がＤｋｋ−１単独、Ｄｋｋ−１相互作用タンパク質単独の関連に含まれる特異的配列を考慮に入れずに、またはそれらの関連基質、結合パートナー等を用いて無作為に選択される場合は、無作為に選択されると言われる。無作為に選択された物質の例は、化学ライブラリーもしくはペプチドコンビナトリアルライブラリーの使用、または生物の成長用ブロスの使用である。
本発明の物質は、例えばペプチド、小分子、ビタミン誘導体、ならびに炭水化物であってよい。当業者であれば、本発明の物質の構造的性質に関して制限がないことを容易に認識することができる。
１２．３ ペプチド合成
本発明のペプチド物質は、当分野で知られているような標準固相（もしくは液相）ペプチド合成法を使用して作製できる。さらに、これらのペプチドをコードするＤＮＡは市販で入手できるオリゴヌクレオチド合成用機器を使用して合成でき、標準組換え製造システムを使用して組換え的に製造できる。非核酸コード化アミノ酸を含めなければならない場合には、固相ペプチド合成法を使用したポリペプチドの製造が不可避である。
１３．Ｄｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、Ｄｋｋ／Ｄｋｋ相互作用複合体、またはＤｋｋ／ＬＲＰ５もしくはＤｋｋ／ＬＲＰ６複合体の少なくとも１つの活性を変調する物質の使用
ＬＲＰ５、Ｄｋｋ、およびＤｋｋ相互作用タンパク質のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはポリペプチドのような本発明のタンパク質および核酸は、他のＷｎｔ経路媒介性活性の骨量変調および脂質変調に関係している。ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質、または例えばＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質の少なくとも１つの活性の各々アゴニストおよびアンタゴニストのような物質の発現を変調（すなわち、アップレギュレートおよびダウンレギュレート）する物質を使用すると、ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質の機能および活性と関連する生物学的および病理学的プロセスを変調することができる。
ここで使用するような被検対象は、本発明のタンパク質によって変調される病理学的もしくは生物学的プロセスの変調を必要とする哺乳動物である限り、好ましくはあらゆる哺乳動物であってよい。用語「哺乳動物」とは、哺乳類のクラスに属する個体を意味する。本発明は、特にヒト被検対象の治療において有用である。
ここで使用するようなＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質によって媒介される生物学的および病理学的プロセスにはＤｋｋのＤｋｋ相互作用タンパク質への結合、ＤｋｋからＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６への結合またはそれらからの遊離、ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質ｍＲＮＡ合成の阻害または活性化、またはＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６媒介性Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質変調性阻害の阻害が含まれる。さらに例えばアルカリホスファターゼ活性、オステオカルニン産生、または無機物化のような他の骨関連マーカーが観察されてもよい。
病理学的プロセスとは、有害な作用を産生する生物学的プロセスのカテゴリーを意味する。例えば、ＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６および／またはＤｋｋおよび／またはＤｋｋ相互作用タンパク質の発現または発現のアップレギュレーションは一定の疾患もしくは病理学的状態と結び付いていることがある。ここで使用するように、ある物質は該物質が統計的有意（ｐ＜０．０５）に被検対象におけるプロセスを規定レベルから変化させる場合に病理学的プロセスを変調すると言われる。例えば、該物質は該物質が投与された被検対象においてそのタンパク質によって媒介されたプロセスの程度もしくは重症度を低下させることができる。例えば、１つの疾患もしくは病理的状態は、本発明のタンパク質の該発現もしくは少なくとも１つの活性を何らかの方法で低下もしくは変調する物質の投与によって防止できる、または疾患の進行を変調できる。
ＬＲＰ５／６およびＤｋｋは骨量変調において直接的および間接的の両方で関わっているので、本発明の１つの実施形態は骨の状態もしくは疾患を診断する方法としてＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質発現を使用することである。一定のマーカーは、特異的Ｗｎｔシグナル伝達状態（例えば、ＴＣＦ／ＬＥＦ活性化）関連している。骨の状態についての診断検査には、サンプルまたはその抽出液を、ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質核酸（すなわち、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、オリゴマーまたはそのフラグメントまたはＴＣＦ／ＬＥＦ調節発現のタンパク質産物の存在について、検査するステップを含むことができる。例えば、標準インサイチュハイブリダイゼーションまたはその他のイメージング技術を利用するとＷｎｔシグナル伝達の産物を観察することができる。
本発明は、さらに骨の発達または骨量減少状態を変調する方法に関する。骨量減少の阻害は、ＬＲＰ５／６媒介性Ｗｎｔシグナル伝達経路における変化を阻害もしくは変調することによって達成できる。例えば、ＬＲＰ５活性の不在には低い骨量が結び付いていることがある。ＬＲＰ５の活性増加には高い骨量が結び付いていることがある。このため、ＬＲＰ５活性の変調は順に骨の発達を変調するであろう。アゴニストおよびアンタゴニストを介してのＤｋｋ／ＬＲＰ５／６もしくはＤｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質複合体の変調は骨の発達を調節する方法の１つの実施形態である。このような骨の発達の変調は例えばＤｋｋ／ＬＲＰ（５／６）タンパク質複合体、Ｄｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質複合体の活性の阻害、ＬＲＰ５遺伝子のアップレギュレートされた転写またはＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質ｍＲＮＡの翻訳の阻害の結果として生じることがある。
本発明の物質は、単独で、または特定の病理学的プロセスを変調する他の物質と併用して提供することができる。ここで使用するように、２種の物質は該２種の物質が同時に投与される場合、または該２種の物質が同時に機能するような方法で独立して投与される場合に併用投与できると言われる。
本発明の物質は、経口、皮下（ｓｃ）、静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、経皮もしくは舌下経路を介して投与できる。あるいはまた、または同時に、投与は経口経路であってもよい。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしある場合は併用療法の種類、治療頻度および所望の効果の性質に依存する。
本発明は、さらにまた本発明のタンパク質の発現もしくは少なくとも１つの活性を変調する１つ以上の物質を含有する組成物を提供する。個体の必要は様々であるが、各構成要素の有効量の最適範囲の決定は当業者の技術の範囲内にある。ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質活性を媒介する有効成分の典型的な用量は、約０．０００１〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）を含む。好ましい用量は、約０．００１〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）を含む。最も好ましい用量は、約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇ（体重）を含む。体重が７０ｋｇの平均的なヒトでは、該範囲は約７μｇ〜３．５ｇ、より好ましい範囲は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇであろう。
製薬学的有効成分に加えて、本発明の組成物は作用部位への送達のために医薬上使用できる調製物への活性化合物の加工処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な医薬上許容される担体を含むことができる。非経口投与のために適切な調製物には、例えば水溶性塩のような水溶性形にある活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、適切な油性注射用懸濁剤としての該活性化合物の懸濁液を投与することができる。適切な脂肪親和性溶媒もしくはビヒクルの例には、例えばゴマ油、もしくは合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド類）のような脂肪油が含まれる。水性注射用懸濁剤は例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む該懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてよい。任意で、該懸濁剤は安定剤も含んでいてよい。細胞内へ送達するために該物質を封入するためにはリポソームおよびその他の非ウイルスベクターを使用することもできる。
本発明による全身性投与のための医薬調製物は、経口、非経口、または局所（ｔｏｐ）投与のために作製することができる。実際に、これら３つのタイプの調製物を使用すると該有効成分の全身性投与を同時に達成することができる。
もしかすると、ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質に結合する、またはＤｋｋ／ＬＲＰ５もしくはＤｋｋ／ＬＲＰ６もしくはＤｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質複合体を変調するあらゆる化合物は治療用化合物である可能性がある。本発明の１つの実施形態では、本発明によるペプチドもしくは核酸アプタマーが治療用組成物中に使用される。このような組成物は、アプタマー、または修飾されていない、もしくは修飾されているＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６フラグメントを含んでいてよい。また別の実施形態では、該治療用化合物はＤｋｋ−１相互作用タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメントを含んでいる。
核酸アプタマーは、例えば該アプタマーの取り込みもしくは安定化を促進する可能性のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような担体分子への化学結合によって組成物中に使用されてきた。ＲＮＡへ負荷されたジアルキルグリセロール部分はリポソーム中に該アプタマーを包埋するので、したがって該化合物を安定化させる。化学的置換（すなわち、ＲＮＡ中でリボースの２’−ＯＨ基を２’−ＮＨ基へ変化させるとリボヌクレアーゼ耐性を付与する）およびキャッピング等の組み込みは崩壊を防止できる。数種のこのような技術はＢｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ（Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７４：３−１３（２０００））の中でＲＮＡアプタマーについて考察されている。
ペプチドアプタマーは、アプタマー発現を指示する発現ベクターを、例えばレトロウイルス送達、送達複合体内へのＤＮＡの封入もしくは単純に裸のＤＮＡの注射によるように罹患組織内へ導入することにより治療用途に使用できる。または、アプタマー自体もしくは合成アナログは薬物として直接に使用できる。ポリマーおよび脂質中への封入もまた送達に役立つことがある。治療薬および診断薬としてのペプチドアプタマーの使用は、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｙｌｅｒ ａｎｄ Ｂｕｔｚ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：４２６−４３０（２０００）によって検討されている。
本発明のまた別の態様では、本発明の拘束されたペプチドアプタマーの構造を例えばＮＭＲもしくはＸ線結晶学によって決定できる（Ｃａｖａｎａｇｈら，「タンパク質ＮＭＲ分光法：原理および実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６；Ｄｒｅｎｔｈ，「タンパク質Ｘ線結晶学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ−Ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９」。好ましくは、構造は標的タンパク質との複合体中で決定される。その後、該アプタマーの三次元構造の機能的エレメントの位置にしたがって小分子アナログが構成される（「ドラッグデザインにおける分子モデリングに関するガイドブック（Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」，Ｃｏｈｅｎ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６；「分子モデリングおよびドラッグデザイン（分子および構造生物学におけるトピックス）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）），Ｖｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇａｒｄｎｅｒ編集，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）。したがって、本発明はＤｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、Ｄｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質複合体およびＤｋｋ／ＬＲＰ複合体の活性を変調する有効かつ特異的薬物を構成するための方法を提供する。本発明のペプチドアプタマーの小分子模倣物は本発明の範囲内に含まれる。
本発明の方法を実践する際には、本発明の化合物は単独でもしくは組み合わせて、または他の治療薬もしくは診断薬と組み合わせて使用できる。一定の好ましい実施形態では、本発明の化合物は概して許容される医学実践にしたがってこれらの状態に対して典型的に処方される他の化合物と一緒に併用投与することができる。例えば、本発明の化合物は骨量減少を治療するための他の治療薬と併用して投与できる。骨量減少媒介物質には、例えばビスホスホネート製剤（例えば、アレンドロン酸、クロドロン酸、エチドロン酸、パミドロン酸、リセドロン酸およびチルドロン酸）、ビタミンＤおよびビタミンＤアナログ、カテプシンＫインヒビター、ホルモン剤（例えば、カルシトニンおよびエストロゲン）、および選択的エストロゲン受容体変調剤もしくはＳＥＲＭ（例えば、ラロキシフェン）、のような骨吸収インヒビターおよび例えば甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）のような骨形成物質が含まれる。
さらに想定されるのは、Ｄｋｋ−１を調節する物質と例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター（すなわち、Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標）のようなスタチン類およびＢａｙｃｏｌ（登録商標）、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標）、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）およびＺｏｃｏｒ（登録商標）のような他のインヒビター）、胆汁酸金属イオン封鎖剤（例えば、Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標）およびＷｅｌｃｈｏｌ（登録商標））、フィブリン酸誘導体（Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標）、Ｌｏｐｉｄ（登録商標）、Ｔｒｉｃｏｒ（登録商標））、およびニコチン酸のような脂質濃度を調節する物質との併用である。
本発明の化合物は通常は脊椎動物において、および好ましくはヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスのような哺乳動物においてインビボで、またはインビトロで利用できる。
１４．トランスジェニック動物
Ｄｋｋおよび／またはＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６および／または例えば図５に示したもののようなＤｋｋ相互作用タンパク質を条件付きで発現するトランスジェニック動物モデルを作製することができる。これらの動物は、Ｄｋｋ−１／Ｄｋｋ−１相互作用タンパク質の相互作用および／またはＬＲＰ５／Ｄｋｋ相互作用の生理学的作用について試験するための研究用ツールとして使用できる。あるいはまた、Ｄｋｋ単独のまたはＨＢＭのトランスジェニック形に加えてトランスジェニック形を発現する、またはＤｋｋ相互作用タンパク質単独のもしくはＤｋｋのトランスジェニック形に加えて発現するトランスジェニック動物を作製することができる。ＨＢＭもしくはＬＲＰ５を発現するトランスジェニック動物をＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質を発現するトランスジェニック動物と交配させると、両方の所望の遺伝子を発現するヘテロ接合体ならびにホモ接合体動物を得ることができる。
Ｄｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質もしくはＬＲＰ５／Ｄｋｋ相互作用活性をインビトロで変調する候補化合物の有効性を決定するための研究用ツールとして役立たせるために、Ｄｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質もしくはＤｋｋ／ＬＲＰ５相互作用活性をインビボで直接変調させるための動物モデルを作製できる。例えばトランスジェニックマウスのような動物は、例えばヒトＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質、または条件付きであってよいマウスＤｋｋもしくはＤｋ相互作用タンパク質をコードする遺伝子のノックアウト（ＫＯ）を発現するトランスジェニックマウスを作るために使用される技術を使用して作製できる。ノックイン動物には遺伝子が導入されている動物および以前にノックアウトされた遺伝子が動物内に再導入されている動物が含まれる。その他のトランスジェニック動物は、骨量の発達および減少ならびに脂質濃度の調節に該遺伝子が及ぼす作用を試験するためにＤｋｋもしくはＤｋ相互作用タンパク質の誘導形を用いて作製できる。これらの動物はさらにまたＤｋｋもしくはＤｋ相互作用タンパク質の変調の長期的作用を試験するためにも使用できる。ペプチドアプタマーを発現する、またはＲＮＡアプタマーを産生するトランスジェニック動物を作製することもできる。トランスジェニックベクターは組織特異的プロモーターを使用することによって組織特異的方法での発現を指令できる。１つの好ましい実施形態では、ペプチドアプタマー融合タンパク質は骨特異的プロモーターを使用して発現させられる。このような系は、ＤｋｋもしくはＤｋ相互作用タンパク質活性の組織特異的ノックアウトを提供できる。
トランスジェニック動物を作製するための一般的方法は当分野において知られており、例えば「トランスジェニック動物科学における戦術（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，（Ｇｌｅｎｎ Ｍ．Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｒｏｂｌ編集，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９５）；「トランスジェニック動物テクノロジー：実験ハンドブック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」，（Ｃａｒｌ Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９４）；「トランスジェニック動物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ）」，（Ｌｏｕｉｓ Ｍａｒｉｅ Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ編集，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；「トランスジェニックマウスにおけるサイトカインの過剰発現およびノックアウト（Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ）」，（Ｃｈａｉｍ Ｏ．Ｊａｃｏｂ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９４）；「マイクロインジェクションおよび胚発生：戦術およびプロトコール（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ）（Ａｎｇｅｌ Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ ａｎｄ Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｒａｎｃａ編集，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９８）；および「マウス胚の操作：実験マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，（Ｂｒｉｇｉｄ Ｈｏｇａｎら編集，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）に記載されている。
１５．ペプチドおよびヌクレオチドアプタマーならびにペプチドアプタマー模倣物
また別の実施態様は、Ｄｋｋと相互作用する、ＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６との相互作用からＤｋｋを遮断する、またはいずれか他のＤｋｋリガンド相互作用を遮断する、または例えば図５に示したもののようなＤｋｋ相互作用タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングするためのペプチドおよびヌクレオチドアプタマーテクノロジーの使用を想定している。ペプチドアプタマーは、その中で可変ペプチドドメインが足場タンパク質から表示される分子である。チオレドキシンＡ（ｔｒｘＡ）は、一般にスカフォールドのために使用される。ペプチド挿入断片はｔｒｘＡの触媒部位を破壊する。ペプチドアプタマーを拘束および／または提示する足場タンパク質として多数のタンパク質も使用できることは認識されている。拘束されたペプチドアプタマーを表示できた他の足場タンパク質にはスタフィロコッカスヌクレアーゼ、プロテアーゼインヒビターのエグリンＣ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄｅａアルファアミラーゼインヒビターのＴｅｎｄａｍｉｓｔａｔ、Ｓｐ１、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒら，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７８：１０５−１１（２００１）において検討された）、およびファージ表示のためのスタフィロコッカスもしくはＭ１３からのＳ１ヌクレアーゼが含まれよう。アプタマーを固定させてその生体活性形態で提示できるあらゆる分子が適切であろう。
その後、アプタマーはインビトロおよびインビボの所定の標的タンパク質へ特異的に結合して、それらの標的タンパク質の機能を選択的に遮断する能力を有することができる。ペプチドアプタマーは、所望の標的タンパク質へのインビボ結合能力に基づいて無作為化発現ライブラリーから選択される。手短かには標的タンパク質（例えば、Ｄｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、またはＬＲＰ５／６）は異種ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）へ連結していて、酵母試験菌株中でベイトとして発現する。付随して、異種転写活性化ドメイン（ＡＤ）へ連結されている足場タンパク質配列内に挿入された無作為化配列の種々のペプチド（例えば、１６−ｍｅｒ）をコードするライブラリーはベイトとして発現する。ペプチドが標的タンパク質に結合すると、機能的転写因子が再構成され、その中でＢＤおよびＡＤが相互作用タンパク質によって一緒に架橋される。この転写因子はその後、マーカー遺伝子のプロモーターを活性化させることができ、マーカー遺伝子は比色酵素アッセイまたは成長選択によって監視できる。追加の変化、調製方法およびスクリーニング法は、例えばＨｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：４２６−４３０（２０００）に記載されている。
ヌクレオチドアプタマーについては例えばＢｒｏｄｙら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：５−１３（２０００）に記載されている。ヌクレオチドアプタマーを作製および使用する追加の方法にはＳＥＬＥＸ、すなわち指数的濃縮によるリガンドの体系的進化が含まれる。ＳＥＬＥＸは選択された標的分子のオリゴヌクレオチドリガンドを単離するプロセスである（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０（１９９０）；米国特許第５，４７５，０９６号、第５，５９５，８７７号、および第５，６６０，９８５号を参照されたい）。Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄらが記載しているように、ＳＥＬＥＸは標的分子を１プールの様々な配列のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）と混合するステップと；標的とオリゴヌクレオチドとの間で形成された複合体を維持するステップと；標的と結合するオリゴヌクレオチドを回収するステップと；ＲＮＡからＤＮＡへ逆転写するステップと；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＮＡを増殖するステップと；増幅したＤＮＡをＲＮＡ内へ転写させるステップと；および常に増加し続ける結合ストリンジェンシーを用いて該サイクルを繰り返すステップと、を含む。各サイクルのために３回の酵素反応が必要とされる。標的に対する高親和性および高特異性を有するアプタマーを単離するには、通常は１２〜１５サイクルを要する。アプタマーは、同一条件下で意図された標的物質には結合できるが他の分子には結合することができないオリゴヌクレオチドである。
また別の参考文献では、Ｂｏｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６（１９９０）はＴｕｅｒｋ ａｎｄ ＧｏｌｄらのＳＥＬＥＸ法とは各サイクルに対して酵素反応が１回しか必要とされない（すなわちＰＣＲ）点で相違するプロセスを記載しているが、それはＢｏｃｋ’ｓ法における核酸ライブラリーがＲＮＡの代わりにＤＮＡから構成されるためである。Ｂｏｃｋらの方法を用いた高い特異性および親和性のアプタマーを同定および単離するためには、まだクロマトグラフィーカラムにおいて反復サイクルを必要とする。
その他のヌクレオチドアプタマー法には、Ｃｏｎｒａｄら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：３３６−３６７（１９９６）によって記載された方法が含まれる。Ｃｏｎｒａｄらはアプタマーを単離するための様々な方法を記載しているが、それらはすべて標的結合リガンドを濃縮するために反復サイクルを使用し、そして大量の精製標的分子を必要とする。より近年に記載されたヌクレオチドアプタマーを作製して使用する方法には、米国特許第６，１８０，３４８号；第６，０５１，３８８号；第５，８４０，８６７号；第５，７８０，６１０号、第５，７５６，２９１号および第５，５８２，９８１号に記載されている方法が含まれるがそれらに限定されない。
もしかすると、ＤｋｋもしくはＤｋ相互作用タンパク質に結合する、またはＤｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはＤｋｋ／ＬＲＰ５またはＤｋｋ／ＬＲＰ６複合体を変調するあらゆる化合物は治療用化合物である可能性がある。本発明の１つの実施形態では、本発明によるペプチドもしくは核酸アプタマーが治療用組成物に使用される。このような組成物は、アプタマー、または修飾されていない、もしくは修飾されたＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６フラグメントを含んでいてよい。
核酸アプタマーは、例えば該アプタマーの取り込みもしくは安定化を促進できるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような担体分子への化学的結合によって組成物中に使用されてきた。ＲＮＡへ取り付けられたジアルキルグリセロール部分はリポソーム内に該アプタマーを包埋する、したがって該化合物を安定化するであろう。化学置換（すなわち、ＲＮＡ中でリボースの２’−ＯＨ基を２’−ＮＨ基へ変化させるステップはリボヌクレアーゼ耐性を付与する）およびキャッピング等を組み込むことにより崩壊を防止できる。数種のこのような技術はＢｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７４：３−１３（２０００）においてＲＮＡアプタマーのために考察されている。
ペプチドアプタマーは、例えばレトロウイルス送達、送達用複合体中へのＤＮＡの封入もしくは単純に裸のＤＮＡ注射によるような罹患組織内へのアプタマー発現を指示する発現ベクターの導入によって治療用途に使用することができる。または、アプタマー自体もしくは合成アナログを薬物として直接に使用できる。ポリマーおよび脂質中への封入は送達に役立つ可能性がある。治療薬および診断薬としてのペプチドアプタマーの使用についてはＨｏｐｐｅ−Ｓｙｌｅｒ ａｎｄ Ｂｕｔｚ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：４２６−４３９（２０００）によって検討されている。
本発明のまた別の態様では、本発明の拘束されたペプチドアプタマーの構造は、例えばＮＭＲまたはＸ線結晶学によって決定できる（Ｃａｖａｎａｇｈら，「タンパク質ＮＭＲ分光法：原理および実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６；Ｄｒｅｎｔｈ，「タンパク質Ｘ線結晶学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ−Ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９）。好ましくは、構造は標的タンパク質との複合体中で決定される。その後、該アプタマーの三次元構造の機能的エレメントの位置にしたがって小分子アナログが構成される（「ドラッグデザインにおける分子モデリングに関するガイドブック（Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」，Ｃｏｈｅｎ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６；「分子モデリングおよびドラッグデザイン（分子および構造生物学におけるトピックス）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ））」．Ｖｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇａｒｄｎｅｒ編集，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）。したがって、本発明はＤｋｋ、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、Ｄｋｋ／Ｄｋｋ相互作用タンパク質複合体およびＤｋｋ／ＬＲＰ複合体の活性を変調する有効かつ特異的薬物を構成するための方法を提供する。本発明のペプチドアプタマーの小分子模倣物は本発明の範囲内に含まれる。
１６．ＨＢＭ活性を有するＬＲＰ５／ＬＲＰ６の代替変異体
ＬＲＰ５／Ｚｍａｘ１第１βプロペラモジュールの構造モデルはＳｐｒｉｎｇｅｒら（１９９８），Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８３：８３７−８６２におけるモデル予測に基づいて生成された。該モデルに基づいて、一定のアミノ酸残基がＬＲＰ５／ＨＢＭ／Ｚｍａｘ１の重要な変異体であると同定された。以下の３つのカテゴリーはそのような変異体の例を提供する。
β−プロペラの形状は、内側へ傾斜した側面および中央部で抜けた穴を備えるディスクに似ている。残基１７１は、プロペラモジュール１のブレード４内のドメインの外面もしくは上面上のループ中にある。そこで他のブレード内の構造的に等価の位置にある変化した残基；ならびに結合ポケットへわずかにより内側にある残基を含むが、それでもまだ表面に接近しやすい変異体は、ＬＲＰ５／ＨＢＭによる骨量変調の試験、骨量障害の治療薬および治療法の開発、および本発明のその他の目的のために本発明の重要な実施形態である。以下はそのような変異体の例である：
Ａ２１４Ｖ（ブレード５内の１７１に等価の位置；アラニンは他のプロペラでは保存されていない）、
Ｅ１２８Ｖ（ブレード３内の１７１に等価の位置；グルタミン酸塩は他のプロペラでは保存されていない）、
Ａ６５Ｖ（ブレード２内の１７１に等価の位置；アラニンはプロペラ１〜３では保存されているが、４では保存されていない）、
Ｇ１９９Ｖ（ブレード５内の接近可能な内側位置；グリシンはプロペラ１〜３では保存されているが、４では保存されていない）、および
Ｍ２８２Ｖ（ブレード１内の接近可能な内側位置；メチオニンはプロペラ１〜３では保存されているが、４では保存されていない）。
ＬＲＰ５／Ｚｍａｘ１は４つのβ−プロペラ構造を有する；最初の３つのβ−プロペラモジュールはヒトＬＲＰ５／Ｚｍａｘ１における残基１７１に対応する位置でグリシンを保存している。このため他のプロペラにおいて等価の位置でバリンを有する変異体は本発明の重要な実施形態である。次の変異体は、ＬＲＰ５／ＨＢＭによる骨量変調の試験、骨量障害の治療薬および治療法の開発、および本発明のその他の目的のために有用である：Ｇ４７９Ｖ、Ｇ７８１Ｖ、およびＱ１０８７Ｖ。
Ｇ１７１Ｖ ＨＢＭ多型は、β−プロペラ１の「占有空間」を生じさせ、バリン残基からの側鎖は開放結合ポケット内へ突き出し、もしかするとリガンド／タンパク質相互作用を変化させる。グリシン残基はＬＲＰ５／Ｚｍａｘ１プロペラ１、２および３で保存されているが、グルタミンはプロペラ４で保存されている。このため次のＬＲＰ５／ＨＢＭの変異体は、ＬＲＰ５／ＨＢＭによる骨量変調の試験、骨量障害の治療薬および治療法の開発、および本発明のその他の目的のために重要な本発明の実施形態である：
Ｇ１７１Ｋ（荷電側鎖を導入する）、
Ｇ１７１Ｆ（環状側鎖を導入する）、
Ｇ１７１Ｉ（分岐状側鎖を導入する）、および
Ｇ１７１Ｑ（プロペラ４残基を導入する）。
さらに、ＬＲＰ６はＬＲＰ５／Ｚｍａｘ１の最も近いホモログである。ＬＲＰ６はもしＺｍａｘ１と同一でなければ類似すると予想されるβ−プロペラ構造を有する。ヒトＬＲＰ５／Ｚｍａｘ１におけるグリシン１７１に対応する位置はヒトＬＲＰ６のグリシン１５８である。したがって、ＬＲＰ６の対応する変異体は、ＬＲＰ５／Ｚｍａｘ１をその関連ファミリーメンバーと比較した特異性についての試験、骨量障害の治療薬および治療法の開発、および本発明のその他の目的のための本発明の重要な実施形態である。詳細には、例えばヒトＬＲＰ６の残基１５８、および他の種のＬＲＰ６ホモログの類似の変種の構造的に等価の位置でのグリシンからバリンへの置換は重要な研究用ツールを表している。
ＬＲＰ５の部位特異的変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ特定部位の突然変異誘発性キット（製品番号２００５１６、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、ＣＡ）を使用して製造業者のプロトコールにしたがって全長ヒトＬＲＰ５ ｃＤＮＡ中で生成された。変異体配列は相補的合成オリゴヌクレオチドを使用して導入された。
Figure 2005512508
Figure 2005512508
すべての構築物は、人工的に作り出された修飾だけが遺伝子内に存在することを保証するために検証された配列であった。検証されると、各変異体はＵ２ＯＳ細胞中でのＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイで機能的に評価された（本質的には実施例７に記載した通り）。例えばアフリカツメガエル胚アッセイ（本質的には実施例６に記載した通り）、またはＷｎｔシグナル伝達、Ｄｋｋ変調または同化骨作用を評価するための他のアッセイのような他の機能的評価も実施できよう。これらの変異体のＤｋｋ、ＬＲＰ相互作用タンパク質、Ｄｋｋ相互作用タンパク質、または先行物のいずれかへのペプチドアプタマーへの結合もまた例えば２ハイブリッド系（本出願書で記載した酵母におけるような）、またはその他の方法のような様々な方法で調査できよう。
図２４は、ＬＲＰ５のプロペラ１におけるＧ１７１Ｆ突然変異の作用を示している。この突然変異はＨＢＭのＧ１７１Ｖ置換と同一位置である。Ｇ１７１Ｆの発現はＨＢＭ作用を生じさせる。すなわち、Ｗｎｔの存在下では、Ｇ１７１ＦはＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーター構築物を活性化させることができる。実際に、Ｇ１７１ＦはＬＲＰ５もしくはＨＢＭのいずれよりも大きく該レポーターを活性化する可能性がある。さらに、Ｄｋｋ１およびＷｎｔ１の存在下では、Ｇ１７１ＦはＤｋｋによる変調に対してＬＲＰ５よりも感受性が低い。これらのデータは、Ｇ１７１Ｆ変異体がＨＢＭと類似する方法でＷｎｔシグナル伝達を変調することを例証している。さらに、このデータは１７１でのＨＢＭのバリン残基がＨＢＭ作用を生じさせることのできる１７１での唯一の修飾ではないことを確証している。同様に、これらのデータはＬＲＰ５のプロペラ１がＷｎｔ経路活性を変調すること；Ｄｋｋ変調に反応すること、およびＨＢＭ作用を生成させる能力において果たす重要な役割を支持している。
図２５は、ＬＲＰ５のプロペラ１におけるＭ２８２Ｖ突然変異の作用を示している。Ｍ２８２発現はＨＢＭ作用を生じさせる。つまり、Ｗｎｔの存在下では、Ｍ２８２はＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーター構築物を活性化することができる。さらにＤｋｋ１およびＷｎｔ１の存在下では、Ｍ２８２ＶはＤｋｋによる変調に対してＬＲＰ５よりも感受性が低い。これらのデータは、Ｍ２８２Ｖ変異体がＨＢＭと類似する方法でＷｎｔシグナル伝達を変調することを証明している。さらに、このデータはＬＲＰ５のプロペラ１における他の残基の修飾がＨＢＭ作用を生じさせることを確証している。
これらのデータはプロペラ１におけるＨＢＭ突然変異の「占有空間」モデルを支持しており、プロペラ１の多重突然変異がＨＢＭ作用を生成できることを証明している；オリジナルのＧ１７１Ｖ ＨＢＭ突然変異のこの能力は独特ではない。さらに、プロペラ１における様々な摂動はＤｋｋ活性を変調できる。
これらのデータは、ＬＲＰシグナル伝達のＤｋｋ変調の分子機序を例示している。本明細書開示した方法および米国特許出願第６０／２９０，０７１号に開示された方法を使用すると、包括的な突然変異体パネルの生成によりＷｎｔシグナル伝達のＤｋｋ変調において機能するＬＲＰ内の残基が解明されるであろう。Ｄｋｋ活性を変調するＬＲＰ５およびＬＲＰ６のこのような変異体およびそれらをＬＲＰ５およびＬＲＰ６から区別する残基は小分子化合物、抗体、ペプチドアプタマー、またはその他の物質による治療的介入点である。さらに、各ＨＢＭ作用突然変異／多型のモデルはＨＢＭ模倣物剤の合理的ドラッグデザインに使用できる。
これらは本発明をより明確に記載するために提示したほんの少数の例示的実施例である。アッセイにおいてＨＢＭ活性を示したＬＲＰ５の変異体にはＧ１７１Ｆ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１ＱおよびＡ２１４Ｖが含まれる。明らかに、他の変異体も本発明の範囲に想定することができる。さらに、ＨＢＭを本発明の方法に挙げた場合は必ず、ＨＢＭ生物学的活性を示すＬＲＰのあらゆるそのような代替変異体もまた本発明のクレームに含まれていると理解されなければならない。
１７．スクリーニングアッセイ
２ハイブリッド系は、タンパク質：タンパク質相互作用を試験するために極めて有用である。例えばＣｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９５７８−８２（１９９１）；Ｆｉｅｌｄｓら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：２８６−９２（１９９４）；Ｈａｒｐｅｒら，Ｃｅｌｌ ７５：８０５−１６（１９９３）；Ｖｏｊｔｅｋら，Ｃｅｌｌ ７４：２０５−１４（１９９３）；Ｌｕｂａｎら，Ｃｅｌｌ ７３：１０６７−７８（１９９３）；Ｌｉら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：９５７−６３（１９９３）；Ｚａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３０８−１３（１９９３）；Ｇｏｌｅｍｉｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３００６−１４（１９９２）；Ｓａｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９２３８−４２（１９９４）；Ｃｏｇｈｌａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１０８−１１１（１９９５）；Ｋａｌｐａｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２００２−６（１９９４）；Ｈｅｌｐｓら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４０：９３−８（１９９４）；Ｙｅｕｎｇら，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ．８：２０８７−９（１９９４）；Ｄｕｒｆｅｅら，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ．７：５５５−５６９（１９９３）；Ｐａｅｔｋａｕら，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ．８：２０３５−４５）；Ｓｐａａｒｇａｒｅｎら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２６０９−１３（１９９４）；Ｙｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２６２９−３３（１９９４）；および米国特許第５，９８９，８０８号；第６，２５１，６０２号；および第６，２８４，５１９号を参照されたい。
該系の変種は、クローン相互作用タンパク質に対する酵母ファージミド（例えば、Ｈａｒｐｅｒ，「細胞相互作用および発生：実践アプローチ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」，１５３−１７９（１９９３）；Ｅｌｌｅｄｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１７３１−５（１９９１））またはプラスミド（Ｂａｒｔｅｌ，１９９３およびＢａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ １４：９２０−４（１９９３））；Ｆｉｎｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１２９８０−４（１９９４）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため、ならびに既知のタンパク質対について試験するために利用できる。
２ハイブリッド系の成功は、例えばＧＡＬ４のような多数の転写因子のＤＮＡ結合およびポリメラーゼ活性化ドメインを分離して、再結合させて機能性を回復することができるという事実に依存している（Ｍｏｒｉｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２１５７−６３（１９９３））。これらの実施例は酵母系における２ハイブリッドスクリーニングを記載しているが、例えば哺乳動物細胞系のような他の系においても２ハイブリッドスクリーニングを実施できると理解されている。このため本発明は、酵母２ハイブリッド系の使用に限定されておらず、このような他の系も含んでいる。
例えばＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ｌａｃＺ，ＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ＨＩＳ３もしくはＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ＵＲＡ３（Ｂａｒｔｅｌ，「細胞相互作用および発生：実践アプローチ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」，１５３−１７９（１９９３）；Ｈａｒｐｅｒら，Ｃｅｌｌ ７５：８０５−１６（１９９３）；Ｆｉｅｌｄｓら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：２８６−９２（１９９４））のような様々なレポーター遺伝子カセットの統合コピーを備える酵母株は各々が相違する融合タンパク質を発現する２つのプラスミドを用いて共形質転換される。１つのプラスミドはタンパク質「Ｘ」と例えばＧＡＬ４酵母転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインとの融合をコードするが（Ｂｒｅｎｔら，Ｃｅｌｌ ４３：７２９−３６（１９８５）；Ｍａら，Ｃｅｌｌ ４８：８４７−５３（１９８７）；Ｋｅｅｇａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：６９９−７０４（１９８６））、他方もう１つのプラスミドはタンパク質「Ｙ」とＧＡＬ４のＲＮＡポリメラーゼ活性化ドメイン（Ｋｅｅｇａｎら，１９８６）との間の融合をコードする。これらのプラスミドは例えばｌａｃＺのようなその調節領域がＧＡＬ４結合部位を含んでいるレポーター遺伝子を含有する酵母株内へ形質転換される。タンパク質ＸおよびＹが相互作用すると、それらは２個のＧＡＬ４成分を転写を活性化させるために十分な近傍に持ち込むことによって機能的なＧＡＬ４転写アクチベータータンパク質を再構成する。ベイトおよびプレイタンパク質の役割は交互に切り替えることができるので、したがって本発明の実施形態は両方の代替配置を想定かつ含んでいることはよく理解される。
どちらのハイブリッドタンパク質単独も該レポーター遺伝子の転写を活性化させることができないはずであるが、それはＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは活性化機能を提供せず、活性化ドメインハイブリッドはＧＡＬ４結合部位に局在できないためである。２つの試験タンパク質の相互作用はＧＡＬ４の機能を再構成し、該レポーター遺伝子の発現を生じさせる。該レポーター遺伝子カセットはそれらのＴＡＴＡボックスの５’末端へクローン化されたＧＡＬ４ ＤＮＡ認識部位（Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４４０−８（１９８４）；Ｌｏｒｃｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：８２１−８２４（１９８４））を含有する最小プロモーターから構成される。転写活性化は、例えばＵＲＡ３（ウラシル選択）またはＨＩＳ３（ヒスチジン選択）のような転写産物についての栄養素要求性選択を許容する特定栄養素が欠如している最小培地上でのβ−ガラクトシダーゼの発現または形質転換体の成長のどちらかを測定することによってスコア付けする。例えばＢａｒｔｅｌ，１９９３；Ｄｕｒｆｅｅら，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ．７：５５５−５６９（１９９３）；Ｆｉｅｌｄｓら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１０：２８６−９２（１９９４）；および米国特許第５，２８３，１７３号を参照されたい。
一般に、これらの方法は酵母細胞の核内のハイブリッドとして発現する相互作用について試験される２つのタンパク質が含まれる。これらのタンパク質の１つは転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合しており、もう１つは転写活性化ドメイン（ＡＤ）へ融合している。これらのタンパク質が相互作用すると、それらはＤＢＤのための結合部位を含有する１つ以上のレポーター遺伝子を活性化する機能的転写因子を再構成する。Ｄｋｋ−１またはＤｋｋ−１／ＬＲＰ５のために使用されている代表的２ハイブリッドアッセイについては以下の実施例の項で提示する。
Ｄｋｋ−１相互作用のための２ハイブリッドアッセイ系を作製するためのまた別の方法は当業者には明白であろう。例えば、「酵母２ハイブリッド系（Ｔｈｅ Ｙｅａｔｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）」（Ｐａｕｌ Ｌ．Ｂａｒｔｅｌら編集、Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７）の中のＦｉｎｌｅｙら，「遺伝調節ネットワークの２ハイブリッド解析（Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」；「酵母２ハイブリッド系（Ｔｈｅ Ｙｅａｔｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）」（Ｐａｕｌ Ｌ．Ｂａｒｔｅｌら編集、Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７）の中のＭｅｉｊｉａ Ｙａｎｇ，「２ハイブリッドアッセイにおけるコンビナトリアルペプチドライブラリーの使用（Ｕｓｅ ｏｆ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ）」；Ｇｉｅｔｚら，「関心タンパク質と相互作用するタンパク質の同定：酵母２ハイブリッド系の適用（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：Ａｐｐｒｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｍｏｌ．＆ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：６７−９（１９９７）；Ｋ．Ｈ．Ｙｏｕｎｇ，「酵母２ハイブリッド：相互作用が多いほど所要時間が短くなる（Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ：Ｓｏ Ｍａｎｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，（ｉｎ） ｓｏ Ｌｉｔｔｌｅ Ｔｉｍｅ）」，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８：３０２−３１１（１９９８）；Ｒ．Ｂｒｅｎｔら，「２ハイブリッド法を用いた遺伝子および対立遺伝子の機能の理解（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ａｌｌｅｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３１：６６３−７０４（１９９７）を参照されたい。タンパク質ネットワークが活性化ドメイン−融合ライブラリーの段階的スクリーニングを実施することによって解明できることは理解されるであろう。
これ以上説明せずとも、当業者には、先行の説明および下記の例示的実施例を使用すれば本発明の化合物を作製かつ利用し、本明細書主張した方法を実行することができると考えられる。このため以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を特別に指示しており、決して本開示の残りの部分を限定するものと見なされてはならない。
［実施例］
本発明を、例示するために提供されており、いかなる意味でも本発明を限定することは意図されていない以下の実施例を参照しながら説明する。当分野でよく知られている標準的技術または下記に詳細に説明する技術を利用した。
以下に参照したプロトコールのルーチン実践については、当業者は本出願書に言及した参考文献ならびに、継続的に更新されており、広範囲にわたって利用でき、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により発行されたいくつかの最新プロトコールガイドを参照されたい。生命化学においては、「最新プロトコール」は分子生物学、免疫学、ヒト遺伝学、タンパク質科学、サイトメトリー、神経科学、薬物学、細胞生物学、毒物学、および核酸科学における包括的マニュアルを発表している。その他の情報源は当業者にはよく知られている。
ＬＲＰ５リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）ベイト配列を使用した酵母２ハイブリッドスクリーニング
ヒト骨芽細胞ライブラリー（すなわち、ＨＯＢ０３Ｃ５、Ｂｏｄｉｎｅ ａｎｄ Ｋｏｍｍ，Ｂｏｎｅ ２５：５３５−４３（１９９９））によって記載されているようなヒト骨芽細胞系からのカスタムＧｉｂｃｏ生成Ｙ２Ｈ適合ｃＤＮＡライブラリー）に対するスクリーニングにおいて、Ｄｋｋ−１との相互作用を同定した。このスクリーニングのために使用したＬＲＰ５リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）ベイトを図２ＢおよびＣに示した。基本プロトコールは以下の通りである：
関心ベイトを含有する酵母株のオーバーナイト培養は、３０℃で２％グルコースを含有する適切な選択培地２０ｍＬ中で増殖させる。このオーバーナイト培養は４０ｍｇ／Ｌのアデニンを補給したＹＰＤｍｅｄｉａ内へ倍率１０倍に希釈し、３０℃で４時間増殖させる。
各交配事象については冷凍プレイライブラリーのアリコートを３０℃で５時間にわたり１５０ｍＬのＹＡＰＤ培地中で増殖させる。
各培養のＯＤ６００を測定することによって計算した適切な量を試験管内に結合する。スクリーニングすべき二倍体の数は、典型的には関心プレイライブラリー内に最初に存在するクローンの数の１０倍である。交配効率が最小２０％であると想定して、ベイトを含有する多数のハプロイド細胞およびプレイを含有するとして５０回（すなわち１０回の被覆に２０％交配効率をかけた数）をあらゆる所定の交配事象に使用する。混合物を４７ｍｍ、０．４５ｍｍ無菌Ｍｅｔｒｉｃｅｌフィルター膜（Ｇｅｌｍａｎ社）に通して濾過する。
無菌ピンセットを用いて、このフィルターを１００ｍｍ2ＹＡＰＤ寒天プレート上に細胞の側を上に向けて移し、フィルター下の全気泡を除去する。このプレートは室温で一晩培養する。
このフィルターを無菌ピンセットを用いて５０ｍＬＦａｌｃｏｎ管に移し、細胞を再懸濁させるために２％グルコースを含有する１０ｍＬ ＳＤ培地を添加する。細胞を含まないフィルターを取り除き、細胞懸濁液を２，０００×ｇで５分間回転させる。
細胞を２％グルコースを含有する１０ｍＬ ＳＤ培地中に再懸濁させる。１００μＬのアリコートを滴定のために別に取り置く。
細胞は適切な選択培地を含有する大きな正方形のプレート上にプレーティングし、３〜５日間３０℃で培養する。
交配効率を計算してスクリーニングされる二倍体の総数を決定するために、滴定のために取り置いた１００μＬのアリコートを希釈し、種々の選択培地上にプレーティングした。交配効率は二倍体／ｍＬの数をベイトまたはプレイどちらかの最小数の半数体／ｍＬによって割り、そして１００をかけることによって計算する。例えば、ベイトを含有する１，０００万個の半数体とプレイを含有する１，２００万個の半数体を交配することによって２００万個の二倍体を入手した場合は、交配効率は２００万を１，０００万で割ると０．２となることにより計算され、１００をかけると２０％となる。上記の条件下での典型的な交配効率は約２０〜約４０％の範囲内である。交配事象においてスクリーニングした二倍体の総数は、二倍体／ｍＬの数に典型的には約１０であるプレーティングしたｍＬの総数をかけることによって入手する。
［相互作用タンパク質の対を含有するコロニーの単離］
相互作用選択（大きな正方形の）プレートからの酵母コロニーは無菌爪楊枝を用いて採集し、適切な選択培地を含有するプレート上にパッチし、３０℃で２日間培養する。
さらに酵母の純度を保証するために、これらのプレートは同一培地を含有する別のプレート上に複製し、さらに２日間３０℃で培養する。
酵母パッチは無菌爪楊枝を用いてこすり取り、２％グルコース液体培地とともに１００μＬのＳＤ−Ｌ−Ｗ−Ｈを含有する９６ウェルフォーマットプレート内に置いた。
このプレートの半量を保管のために５０μＬの４０％グリセロールを含有する９６ウェルプレートへ移す。残り半分は複製およびガラクトシダーゼ活性アッセイ（下記を参照）のために取り置く。
細胞はマスタープレートを作製するために２％グルコースプレートを用いてＳＤ−Ｌ−Ｗ−Ｈプレート上に複製し、３０℃で２日間培養する。マスタープレートは様々な選択的培地上で複製し、各相互作用の強度をスコア付けする。
細胞はさらにコロニーＰＣＲについてのみプレイベクターのために選択した培地上で複製し、３０℃で２日間培養する。
［ガラクトシダーゼ活性アッセイ］
９６ウェルプレートからの１０μＬ（上記から取り置いた）は、１００μＬ ＳＤおよび２％グルコース培地を含有する別の９６ウェルプレート内に移す。細胞密度は分光光度計を使用してＯＤ600で測定すると、ＯＤ600は通常は０．０３〜０．１である。５０μＬのガラクトシダーゼ反応混合液（Ｔｒｏｐｉｘ）は照度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｌｕｍｉｃｏｕｎｔ）のために特別構成されたマイクロプレート（Ｍａｒｓｈ社）へ添加する。その後５０μＬの希釈細胞を添加し、ピペッティングにより混合する。この反応液を室温で６０〜１２０分間培養する。相対光度単位（ＲＬＵｓ）は照度計によって読み取る。各プレートは、関心ベイトおよび空プレイベクターを含有する二倍体酵母によって構成されたネガティブコントロールを含有する。陽性とスコア付けされるためには、試験された二倍体はネガティブコントロールの少なくとも２倍の高さのＲＬＵ数を有していなければならない。
最小相互作用ドメインマッピング
酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）相互作用タンパク質のまた別の解析には、相互作用の原因となるタンパク質モチーフの解離が含まれる。Ｙ２Ｈスクリーニングにおいて同定された複数のクローンの配列アライメントは、この相互作用の原因となる最小共通領域を同定するのに役立つことができる。適切なクローンが欠如している場合は、相互作用ドメインの欠失マッピングが必要である。
クローニングのために適切な制限酵素認識部位を含有するＰＣＲプライマーは、関心タンパク質（ベイトまたはプレイ）の複数のサブドメインを被覆するように構成されている。相互作用のクローニング、シーケンシング、酵母形質転換、交配およびスコア付けに含まれる方法は、分子生物学および遺伝子工学の当業者によって容易に実施される。
［材料および方法］
最小相互作用ドメイン：プライマーは、プールされたＺｍａｘ１／ＬＲＰ５リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）ベイト：ＬＢＤ１（Ｌｅｕ９６９−Ｐｒｏ１３７６）およびＬＢＤ４（Ａｒｇ１０７０−Ｐｒｏ１３７６）を用いて一次骨芽細胞株（ＨＯＢ０３Ｃ５）ライブラリーをスクリーニングすることによって単離されたＤｋｋ−１クローンのＰＣＲのために構成された。５’〜３’方向に与えられるプライマーは次の通りであった。
Figure 2005512508
ＰＣＲは、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して実施した。ＰＣＲ産物はゲル精製し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩを用いて消化し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩを用いて線形化されているｐＰＣ８６（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）へ連結させた。クローンを回収し、構造が予想された通りであり、Ｇａｌ４活性化ドメインおよびＤｋｋ−１がインフレームであることを確定するためにシーケンシングした。Ｄｋｋ−１のＯＲＦはヒトＤｋｋ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＭ＿００５７３０）におけると同様にＭｅｔ１−Ｈｉｓ２６６であった。
使用したクローンは次の通りであった：Ｄ５（Ｆ１／Ｒ３：Ａｓｎ３４−Ｈｉｓ２６６）、Ｄ４（Ｆ１／Ｒ２：Ａｓｎ３４−Ｃｙｓ２４５）、Ｄ３（Ｆ１／Ｒ１：Ａｓｎ３４−Ｌｙｓ１８２）、Ｄ９（Ｆ２／Ｒ３：Ｃｙｓ９７−Ｈｉｓ２６６）、Ｄ１２（Ｆ３／Ｒ３，ｖａｌ１３９−Ｈｉｓ２６６）、Ｄ１４（Ｆ４／Ｒ３：Ｇｌｙ１８３−Ｈｉｓ２６６）、Ｄ８（Ｆ２／Ｒ２：Ｃｙｓ９７−Ｃｙｓ２４５）、およびＤ１１（Ｆ３／Ｒ２：Ｖａｌ１３９−Ｃｙｓ２４５）。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４は各々フォワードプライマー１、２、３および４を意味する。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々リバースプライマー１、２および３を意味する。
これらのクローンは酵母内に形質転換させ、ｐＤＢｌｅｕ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ｐＤＢｌｅｕＬＢＤ１、およびｐＤＢｌｅｕＬＢＤ４を含有する３つの酵母株の各々と交配させた。陽性相互作用は適切な選択培地上でのハイブリッドの増殖によって検出した。
［結果］
最小相互作用ドメイン：図６は、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ８、Ｄ９およびＤ１２の二倍体中で増殖が観察されたが、Ｄ３、Ｄ１１およびＤ１２のハイブリッドでは増殖が観察されなかったことを示している。カルボキシ末端（Ｃ−末端）欠失は、可能性のあるＮ−グリコシル化部位（Ａｒｇ２４６−Ｈｉｓ２６６）を含有するＤｋｋ−１のＣ−末端アミノ酸はＺｍａｘ１／ＬＲＰ５ ＬＢＤベイトとの相互作用のためには必要ではないが、Ｃｙｓ２ドメイン、Ｇｌｙ１８３−Ｃｙｓ２４５は必要とされることを示す。Ｎ末端欠失はさらにまた、２つのシステインドメイン間の領域、すなわちＶａｌ１３９〜Ｌｙｓ１８２もまた必要であることも証明した。２つの最小相互作用ドメイン構築物が単離された：Ｄ１２（Ｖａｌ１３９−Ｈｉｓ２６６）およびＤ８（Ｃｙｓ９７−Ｃｙｓ２４５）。Ｄｋｋ−１相互作用物質に対して類似の構築物を作製できよう。
Ｄｋｋ−１に対するペプチドアプタマー配列についての酵母２ハイブリッドスクリーニング
［ペプチドアプタマーライブラリーの構築］
古典的酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）アッセイを使用して関心タンパク質標的（もしくはベイト）へ結合するキメラタンパク質を同定するための手段を提供するペプチドアプタマーライブラリーであるＴｐｅｐを構築した。該Ｔｐｅｐライブラリーは、大腸菌チオレドキシン（ｔｒｘＡ）のジスルフィドループの状況内でＳ．セレヴィシエＧａｌ４活性化ドメインへのＣ末端融合として発現した拘束されたランダムペプチドから構成されるコンビナトリアルアプタマーライブラリーである。ＴｐｅｐライブラリーはｔｒｘＡ足場タンパク質を含有する制限酵素修飾組換えＹ２ＨプレイベクターであるｐＰＣ８６（Ｇｉｂｃｏ社）を使用して生成した。
［アプタマーコード配列の生成］
アプタマーコード配列は以下の通り生成した。適切な制限酵素認識部位によって取り囲まれた適切な１６アミノ酸のＤＮＡをコードするランダム伸長はセミランダムオリゴヌクレオチド合成法によって生成した。合成オリゴヌクレオチドはＰＣＲ増幅し、制限消化し、ｔｒｘＡ足場タンパク質内の許容部位内へクローン化した。クローニング戦術は、ランダムオリゴヌクレオチド配列が足場タンパク質コード配列とインフレームとなるように挿入し、足場タンパク質−アプタマーキメラの発現を生じさせることであった。足場タンパク質はそれ自体が、標準のＹ２Ｈアッセイにおいてアプタマーが発現して機能的となるのに適切なｐＰＣ８６ベクター内で、Ｇａｌ４の活性化ドメインとインフレームである。アプタマーを作製するためのまた別の方法は当業者には明白であろう。
［ｔｒｘＡコード配列を含有する許容組換えｐＰＣ８６ベクターの生成］
第１に、ｐＰＣ８６のＧａｌ４（Ｇｉｂｃｏ社）の活性化ドメイン内に位置するＲｓｒＩＩ制限酵素認識部位を部位特異的突然変異誘発（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（商標）キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）によって排除した。Ｇａｌ４の活性化ドメインのアミノ酸配列はこの修飾によって変化しなかった。相違する制御相互作用の強度はこの修飾によって変化していないことが検証された。
第２に、大腸菌 ｔｒｘＡコード配列をＲｓｒＩＩ修飾ｐＰＣ８６のＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位内へクローン化した。次にＥｃｏＲＩおよびＳｐｅｌ部位をｔｒｘＡ ＲｓｒＩＩ部位内へ導入した。該ペプチドアプタマーをコードするオリゴヌクレオチドを結果として生じたベクターのＥｃｏＲＩおよびＳｐｅｌ部位内へクローン化した。
Ｄｋｋ−１相互作用タンパク質のための酵母２ハイブリッドスクリーニング
Ｄｋｋ−１相互作用タンパク質を同定するために酵母２ハイブリッドスクリーニングにおいてＤｋｋ−１ベイト配列を利用した。Ｙ２Ｈについての方法は、ＬＲＰベイトの代わりに図２ＣからのＤｋｋ−１ベイトを使用したこと以外は実施例１で使用した方法と同様に実施した。スクリーニングはＨｅｌａおよび胎児脳ライブラリー（Ｉｎｆｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールズバッド、ＣＡ）を使用して実施した。多数のライブラリーを使用して追加のＤｋｋ−１相互作用タンパク質を同定し、その他のライブラリーで見いだされた相互作用を確証した。
これらのＹ２Ｈスクリーニングで明らかになったＤｋｋ−１相互作用タンパク質のリストを図５に列挙した。
Ｄｋｋ−１ベイトスクリーニングで同定された相互作用タンパク質は、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ相互作用および／またはＷｎｔシグナル伝達を変調する可能性があるより複雑な相互作用を決定するために、ＬＲＰベイトおよびその他のＤｋｋ−１相互作用タンパク質を用いる他のＹ２Ｈスクリーニングにおいて使用できる。
［抗体の生成］
以下の抗体生成実施例の各々では、これらの線状ペプチドの合成に続いて２匹のニュージーランドウサギ内への注入が行われる。引き続いてのブーストおよびブリードは標準１０週間プロトコールにしたがって行われる。エンドユーザーは５ｍｇのペプチド、ブリード前のアリコート、２匹のウサギ各々からのほぼ８０ｍＬの粗血清を受け取り、ＥＬＩＳＡ滴定データを入手する。
［ＬＲＰ５多型特異的抗体の生成］
ＨＢＭ多型対野生型ＬＲＰ／Ｚｍａｘを区別する抗体を入手するために次のペプチドに対する抗体を生成した：ＭＹＷＴＤＷＶＥＴＰＲＩＥ（配列番号１２３）（突然変異体ペプチド）およびＭＹＷＴＤＷＧＥＴＰＲＩＥ（配列番号１２４）（陰性選択のための野生型ペプチド）。免疫蛍光試験データは、親和性精製後の抗体がＨＢＭには特異的であるがＬＲＰ５を認識しないことを確証した（図１７）。
［ＬＲＰ５単一特異的抗体の生成］
ＬＲＰ５単一特異的ポリクローナル抗体を以下のＬＲＰ５のアミノ酸配列に対して生成した：ペプチド１（ａ．ａ．２６５−２７７）−ＫＲＴＧＧＫＲＫＥＩＬＳＡ（配列番号１２５）、ペプチド２（ａ．ａ．１１７８−１１９４）−ＥＲＶＥＫＴＴＧＤＫＲＴＲＩＱＧＲ（配列番号１２６）、およびペプチド３（ａ．ａ．１３５２−１３７５）−ＫＱＱＣＤＳＦＰＤＣＩＤＧＳＤＥ（配列番号１２７）。免疫蛍光により生成したこれらの抗体がＬＲＰ５を検出することを確証した。
［Ｄｋｋ−１単一特異的ポリクローナル抗体の生成］
Ｄｋｋ−１単一特異的ポリクローナル抗体を以下のＤｋｋ−１のアミノ酸配列に対して生成した：ヒトＤｋｋ−１のペプチド１（ａ．ａ．７１−８５）−ＧＮＫＹＱＴＩＤＮＹＱＰＹＰＣ（配列番号１１８）、ペプチド２（ａ．ａ．１６５−１８６）−ＬＤＧＹＳＲＲＴＴＬＳＳＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧ（配列番号１１９）、ペプチド３（ａ．ａ．２４６−２６６）−ＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ（配列番号１２０）、ペプチド４（ａ．ａ．１４７−１６１）−ＲＧＥＩＥＥＴＩＴＥＳＦＧＮＤ（配列番号１２１）、およびペプチド５（２３２−２５０）−ＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤ（配列番号１２２）。図２６は、選択した様々なペプチドの位置、それらとＤｋｋ−１アミノ酸配列および生成したポリクローナル抗体との関係を示している。
ウェスタンブロットは、ペプチド２（抗体番号５５２１）（図２７）および４（抗体番号７４３９７）（図２８）に対して生成した抗体がＤｋｋ−１に向かって特異的であることを証明した。図２７は、非トランスフェクト２９３細胞または抗Ｖ５抗体によって免疫沈降させたＤｋｋ１−Ｖ５を用いてトランスフェクトした２９３細胞からの馴化培地（ＣＭ）５００μＬを使用したウェスタンブロットを示している。ビーズ溶出液は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した（図２７のレーン４、５）。両方のサンプル（図２７のレーン２、３）およびＤｋｋ１−ＡＰトランスフェクト２９３細胞（図２７のレーン６）からの馴化培地２０μＬを追加してゲル状で分離した。ウェスタンブロットは、抗体の抗−Ｖ５／ＡＰ（１：１０，０００）およびＡｂ＃５５２１（１０μｇ／ｍＬ）を使用して実施した。Ａｂ＃５５２１は馴化培地からＤｋｋ１−Ｖ５およびＤｋｋ１−ＡＰを検出した。
図２８は、Ａｂ＃７４３９７を使用したウェスタンブロットの結果を示している。抗体抗−Ｖ５／ＡＰは１：４，０００の希釈率で試験し、Ａｂ＃７４３９７は１：５００の希釈率で試験した。Ａｂ＃７４３９７は馴化培地および免疫沈降馴化培地のどちらにおいてもＤｋｋ１−Ｖ５を検出することができた。
抗体＃５５２１および＃７４３９７を用いて入手した結果を下記の表にまとめた。
Figure 2005512508
アフリカツメガエル胚アッセイにおけるＷｎｔ媒介性シグナル伝達に外因性Ｄｋｋ−１が及ぼす作用
アフリカツメガエル胚は、Ｗｎｔシグナル伝達の変調を評価するために情報を提供する明確に確立されたインビボアッセイ系である（ＭｃＭａｈｏｎら，Ｃｅｌｌ ５８：１０７５−８４（１９８９）；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｈａｒｌａｎｄ，１９９１；Ｗｏｄａｒｚ ａｎｄ Ｎｕｓｓｅ １９９８における検討）。
Ｗｎｔシグナル伝達経路の修飾は、４細胞もしくは８細胞ステージで腹側割球内へのＲＮＡ注入後に背側化表現型（重複体軸）について胚を検査することによって可視化できる。分子レベルでは、表現型は１０．５ステージの胚における種々のマーカー遺伝子の発現について探索することによって解析できる。このようなマーカーには一般的内胚葉、中胚葉、および外胚葉マーカーならびに種々の組織特異的転写体が含まれるであろう。
解析はＲＴ−ＰＣＲ／ＴａｑＭａｎ（登録商標）によって実施でき、全胚組織についてまたはより限定された方法（顕微解剖）で実施できる。この系は極めて柔軟性かつ高速であるので、例えばＨＢＭおよび相違するＷｎｔｓもしくはＷｎｔアンタゴニストのような転写体の組み合わせを注入することによって、Ｗｎｔ経路におけるＨＢＭの機序を分析することができる。さらに、Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５およびＨＢＭがＷｎｔシグナル伝達を単独、または他の構成要素と組み合わせてＷｎｔシグナル伝達を示差的に変調するかどうかを決定するために調査が実施される。これまでに実施された試験は、ＬＲＰ６単独またはＬＲＰ５＋Ｗｎｔ５ａがこの系において体軸重複（背側化）を誘導できることを証明している（Ｔａｍａｉら，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：５３０−３５（２０００））。
［アフリカツメガエル発現のための構築物（ベクターｐＣＳ２+）］
ベクターｐＣＳ２+を使用して構築物を作製した。ＤＮＡ挿入断片はベクターＳＰ６プロモーターに対してセンス方向にサブクローニングした。ｐＣＳ２+ベクターはＳＶ４０ウイルスポリアデニル化シグナルおよび該挿入断片の下流のＴ３プロモーター配列（アンチセンスｍＲＮＡを生成するため）を含有している。
全長Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５およびＨＢＭ ＯＲＦ ｃＤＮＡ：挿入断片ｃＤＮＡはＢｇ／ＩＩ−ＥｃｏＲＩによって全長ｃＤＮＡレトロウイルス構築物（最適化Ｋｏｚａｋ配列を備える）から単離し、ｐＣＳ２+ベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位内へサブクローニングした。
全長ＸＷｎｔ８：このｃＤＮＡはオリゴ１４４８４（配列番号１６２）（５’−ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＴＣ−３’）および１１４４８７（配列番号１６３）（５’−ＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧ−３’）を使用してアフリカツメガエル胚ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅させた。オリゴは５’末端にコンセンサスＫｏｚａｋ配列を備えＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｘ５７２３４から決定されるようなＯＲＦを増幅するように構成した。ＰＣＲは次の条件を使用して実施した：９６℃、４５秒間；６３℃、４５秒間；７２℃、２分間、３０サイクル。生じたＰＣＲ産物は精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｆｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．社）内へサブクローニングし、配列を検証し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを用いて消化した。この挿入断片をＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位でベクター内にサブクローニングした。
全長Ｗｎｔ５ａ：マウスＷｎｔ５ａ ｃＤＮＡクローンは、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（レイクプラシッド、ＮＹ）から購入し、ベクターのＥｃｏＲＩ部位内へサブクローニングした。シーケンシングにより挿入断片の方向を確証した。
全長ヒトＤｋｋ−１：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１２７５６３を備えるヒトｃＤＮＡは公衆データベースで入手できた。この配列を用いて、開始ＡＴＧのすぐ上流のコンセンサスＫｏｚａｋ配列を備えるオープンリーディングフレームを増幅するためにＰＣＲプライマーを構成した。オリゴ１１７１６２（配列番号１６４）（５’−ＣＡＡＴＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ−３’）および１１７１６３（配列番号１６５）（５’−ＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＡ−３’）を使用してＰＣＲによりヒト子宮ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。生じたＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｆｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．社）内へサブクローニングし、配列を検証し、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩを用いて消化した。この挿入断片はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位でｐＣＳ２+ベクター内へサブクローニングした。
全長ヒトＤｋｋ−２：Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５／ＨＢＭ相互作用の分子のＤｋｋファミリーとの特異性を調査するためにヒトＤｋｋ−２をコードする全長ｃＤＮＡを単離した。Ｄｋｋ−１はＺｍａｘ／ＬＲＰ５／ＨＢＭの潜在的結合パートナーとして酵母中で同定した。Ｄｋｋ−１は、さらに文献においてＷｎｔシグナル伝達経路のアンタゴニストであると証明されているが、Ｄｋｋ−２はそうではない（Ｋｒｕｐｎｉｋら，１９９９）。Ｄｋｋ−２全長ｃＤＮＡはＤｋｋファミリーとのＺｍａｘ／ＬＲＰ５／ＨＢＭ相互作用の特異性および生物学的有意性を識別するためのツールとして機能する（例えば、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、Ｄｋｋ−４、Ｓｏｇｇｙ、それらのホモログおよび変異体等）。Ｄｋｋ−２についてのヒトｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４４２１）は公衆データベースで入手できた。この配列を用いて、開始ＡＴＧのすぐ上流のコンセンサスＫｏｚａｋ配列を備えるオープンリーディングフレームを増幅するためにＰＣＲプライマーを構成した。オリゴ５１４０９（配列番号１６６）（５’−ＣＴＡＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＡＴＧＣＧＧ−３’）および５１４１１（配列番号１６７）（５’−ＧＡＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＴＧＧ−３’）を使用してＰＣＲによりヒト胚および脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。生じたＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ内へサブクローニングし、配列を検証し、そしてＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩを用いて消化した。この挿入断片はＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位でｐＣＳ２+ベクター内へサブクローニングした。
全長ＬＲＰ６は、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化によってｐＥＤ６ｄｐｃ４ベクターから単離した。全長ｃＤＮＡはｐＣＳ２+のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ部位内へ再構築した。挿入断片の方向はＤＮＡシーケンシングによって確証した。
［ｍＲＮＡ合成およびマイクロインジェクションプロトコール］
アフリカツメガエル胚内へ顕微注入するためのｍＲＮＡは、テンプレートとして上記のｐＣＳ２+ベクター内のｃＤＮＡ構築物を使用してインビトロ転写によって生成した。ＲＮＡはＳｐ６ポリメラーゼ反応のためのＡｍｂｉｏｎ ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｃａｐｐｅｄ ＲＮＡ転写キット（製品番号１３４０）を使用して製造業者の取扱説明書にしたがって合成した。ＲＮＡ産物は無菌ガラス蒸留水中で最終量を５０μＬとし、製造業者の取扱説明書にしたがって放射標識ＲＮＡ精製Ｇ５０−ＳｅｐｈａｄｅｘのためのＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｒｏｃｈｅ社、製品番号１２７４０１５）に通して精製した。生じた溶出液を最終的にフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを用いて抽出し、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を使用してイソプロパノール沈降させた。最終ＲＮＡ量は約５０μＬであった。ＲＮＡ濃度は２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度値によって決定した。ＲＮＡ完全性は変性（ホルムアルデヒド）アガロースゲル電気泳動法の臭化エチジウム染色によって可視化した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。種々の量のＲＮＡ（２ｐｇ〜１ｎｇ）を４細胞もしくは８細胞アフリカツメガエル胚の腹側割球内に注入した。これらのプロトコールは、Ｍｏｏｎら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ−Ｊ．ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：７６−８９（１９８９）、およびＰｅｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３６：６５７−６２（１９９１）に記載されている。
［重複体軸についてのスクリーニング］
インビトロ転写ＲＮＡを精製し、４細胞もしくは８細胞（受胎約２時間後）アフリカツメガエル胚の腹側割球内に注入した。ステージ１０．５（受胎約１１時間後）で、注入した胚を計７２時間培養し、その後重複体軸（背側化）の存在についてスクリーニングした（図７）。ポジティブコントロール（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら，１９９１）としてのＸＷｎｔ８注入（２〜１０ｐｇ）胚およびネガティブコントロールとしての水注入または非注入胚を使用して、公表されているＺｍａｘ（ＬＲＰｔ５）＋Ｗｎｔ５ａ（各々、５００および２０ｐｇ）が体軸重複を誘導できるという観察所見を複製した。Ｗｎｔ５ａ（２０ｐｇ）単独では体軸重複を誘導できなかった（以前にＭｏｏｎら（１９９３）によって報告されたように）。さらにまた注入したＲＮＡの量が胚発生を混乱させないことを証明するためにネガティブコントロールとしてＧＦＰ ＲＮＡ（１００〜７７０ｐｇ）も注入した（図示していない）。驚くべきことに、ＨＢＭ＋ＷＮｔ５ａ（各々、５００および２０ｐｇ）はＺｍａｘ／ＬＲＰ５）＋Ｗｎｔ５ａに比較してこの表現型の約３．５倍強力な反応を産生したが（フィッシャーの直接確率検定によりｐ＝０．０４３）、これはＨＢＭ突然変異がＷｎｔ経路を活性化していることを示唆している（図８および９）。ＨＢＭ／Ｗｎｔ５ａ胚はさらにまたＺｍａｘ（ＬＲＰ５）／Ｗｎｔ５ａ胚より「前方化」していると思われるが、これも同様に機能獲得性突然変異を示唆している。
Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５媒介性およびＨＢＭ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達の変調剤としてのＤｋｋ−１の役割を調査した。文献での報告は、以前にアフリカツメガエルおよびマウスＤｋｋ−１がアフリカツメガエル系における正規Ｗｎｔ経路のアンタゴニストであると特性解析している（Ｇｌｉｎｋａら，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３５７−３６２（１９９８））。ヒトＤｋｋ−１構築物を使用して、我々の構築物が機能的であることを確証するため、そしてマイクロインジェクションのためのＲＮＡの最適量を同定するために用量反応アッセイを実施した。２５０ｐｇ／胚のｈＤｋｋ−１ ＲＮＡを使用して、９０％（ｐ＜０．００１）を超える胚が公表された報告書からの予想に比較して拡大前方構造（大きな頭部）を示すことが観察された（図１０）。
Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５もしくはＨＢＭの存在下でのＷｎｔシグナル伝達のｈＤｋｋ−１変調のメカニズムについても調査した。いずれのｈＤｋｋ−１が存在しない場合は、ＨＢＭ＋Ｗｎｔ５ａがＺｍａｘ／ＬＲＰ５＋Ｗｎｔ５ａより強力なＷｎｔシグナル伝達のアクチベーターであることを確証した（ｐ＜０．０５）。興味深いことに、ｈＤｋｋ−１（２５０ｐｇ）の存在下では、Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は抑制されたが（ｐ＜０．０５）、ｈＤｋｋ−１はＨＢＭ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を抑制することはできなかった（ｐ＜０．０１）（図１１）。この観察所見の特異性は、さらにＤｋｋファミリーの他のメンバー、他のＷｎｔ遺伝子、ＬＲＰ６、また別のＺｍａｘ／ＬＲＰ５突然変異体、およびペプチドアプタマーを調査することによって取り扱うことができる。
ＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイにおいてＷｎｔシグナル伝達に外因性ＤｋｋおよびＬＲＰ５が及ぼす作用
Ｗｎｔ活性は分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰｓ）、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｗｎｔ阻害因子−１およびＤｋｋ−１を含む多数のタンパク質によって相殺され得る（Ｋｒｕｐｎｉｋら，１９９９）。Ｄｋｋファミリーのタンパク質はＤｋｋ−１〜４およびＳｏｇｇｙ、Ｄｋｋ−３様タンパク質から構成される。Ｄｋｋ−１およびＤｋｋ−４はＷｎｔ媒介性アフリカツメガエル胚発生を相殺するが、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３およびＳｏｇｇｙは相殺しないことが証明されている。Ｗｎｔタンパク質と直接相互作用することによってＷｎｔ活性を相殺するこれらのタンパク質の多数とは相違して、Ｄｋｋ−１は近年同定された２つのＷｎｔコ受容体であるＬＲＰ５およびＬＲＰ６へ結合することによって機能する（Ｍａｏら，２００１；Ｂａｆｉｃｏら，２００１）。この相互作用の詳細については、本発明者らおよびＭａｏらによって、ＬＲＰ６の欠失構築物を使用して試験されており、これはＥＧＦリピート３および４がＤｋｋ−１相互作用にとって重要であることを証明した。そこで、２つのＤｋｋタンパク質、Ｄｋｋ−１およびＤｋｋ−２の活性が種々のＷｎｔメンバーであるＬＲＰ５、ＬＲＰ６、およびＨＢＭと呼ばれるＬＲＰ５の突然変異体形を用いて試験された。本発明では、ＬＲＰ５とＨＢＭとの間でＷｎｔ媒介性シグナル伝達へのＤｋｋ作用に関して何らかの機能的相違が存在するかどうかについて探索する。ＨＢＭ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を模倣する因子を同定するために、Ｄｋｋ−１ペプチド、拘束ＬＲＰ５ペプチドアプタマー、拘束Ｄｋｋ−１ペプチドアプタマーおよびＤｋｋ−１に対するポリクローナル抗体（上記実施例５中）を含む種々の試薬を開発した。
［方法］
種々のＬＲＰ５拘束ペプチドを開発した。詳細には、ＬＲＰ５のＬＢＤと相互作用する４つのペプチド（図４、図１２における構築物ＯＳＴ２５９〜２６２）およびＬＲＰ５の細胞形質ドメインと相互作用する３つのペプチド（図１２における構築物ＯＳＴ２６６からＯＳＴ２６８）である。さらに２つのＤｋｋ−１ペプチドを開発した：Ｄｋｋ−１アミノ酸１３９〜２６６および９６〜２４５に対応し、ＬＲＰ５と相互作用するＤｋｋ−１の最小領域（図６）を含有する図１２における構築物ＯＳＴ２６４およびＯＳＴ２６５。ＬＲＰ５ ＬＢＤ相互作用タンパク質およびＤｋｋ−１ペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを分泌についてペプチドを標的とするためにＫｏｚａｋおよびシグナル配列を添加してｐｃＤＮＡ３．１内へサブクローニングした。ＬＲＰ５の細胞形質ドメインと相互作用する３つのペプチドをコードする構築物もまたｐｃＤＮＡ３．１内にサブクローニングした。しかしこれら後者の構築物はシグナル配列を含有していない。
Ｗｙｅｔｈ Ａｙｅｒｓｔ（フィラデルフィア、ＰＡ）によって開発されたＨＯＢ−０３−ＣＥ６細胞を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳ、１×ペニシリンストレプトマイシン、および１×Ｇｌｕｔａｍａｘ−１を含有する増殖培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２フェノールレッド無含有）１ｍＬ中に１ウェル当たり１５０，０００ｃｅｌｌｓで２４ウェルプレートに播種し、３４℃で一晩培養した。翌日、０．３５μｇ／ウェルのＬＲＰ５、ＨＢＭ、またはコントロールプラスミドＤＮＡ（空ベクターｐｃＤＮＡ３．１）およびＷｎｔ１もしくはＷｎｔ３ａプラスミドＤＮＡのどちらかと一緒にＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｆｉｔｒｏｇｅｎ社）中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）を使用して（製造業者の説明通りに、Ｉｎｆｉｔｒｏｇｅｎ社）該細胞をトランスフェクトした。ＬＲＰ６プラスミドＤＮＡ（０．３５μｇ／ウェル）またはコントロールｐＥＤｄｐｃ４空ベクターを用いて同様の実験を実施した。さらにこれらの群各々を３群に分け、それらに０．３５μｇ／ウェルのＤｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、またはｐｃＤＮＡ３．１コントロールＤＮＡを添加した。すべてのウェルは、０．０２５μｇ／ウェルのＣＭＶ β−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡおよび０．３５μｇ／ウェルの１６×ＴＣＦ（ＡＳ）−ルシフェラーゼレポーターＤＮＡ（Ｒｅｍｅｓｈ Ｂｈａｔ，Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ（フィラデルフィア、ＰＡ）によって開発された）を用いてトランスフェクトした。４時間のインキュベーション後、細胞をすすぎ洗い、各ウェルに１ｍＬの新鮮増殖培地を添加した。細胞を３４℃で一晩培養し、その後洗浄して培地を取り替えた。細胞をさらに３７℃で１８〜２４時間培養した。その後細胞は５０μＬ／ウェルの１×溶解用バッファーを用いて溶解させた。抽出液は、５μＬ抽出液＋５０μＬβ−ガラクトシダーゼ希釈液を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｇａｌａｃｔｏ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｄｉｌｕｅｎｔ＆Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ，Ｔｒｏｐｉｘ社）について、および２０μＬの抽出液を使用してルシフェラーゼ活性（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）についてアッセイした。
Ｕ２ＯＳヒト骨肉腫細胞もまた利用した。Ｕ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ）は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳ、１×ペニシリンストレプトマイシン、および１×Ｇｌｕｔａｍａｘ−１を含有する増殖培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ）２００μＬ中に１ウェル当たり３０，０００ｃｅｌｌｓで９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｆｉｔｒｏｇｅｎ社）と交換し、０．００５μｇ／ウェルのＬＲＰ５、ＨＢＭ、ＬＲＰ６またはコントロールプラスミドＤＮＡ（空ベクターｐｃＤＮＡ３．１）およびＷｎｔ１（０．００２５μｇ／ウェル）もしくはＷｎｔ３ａ（０．００２５μｇ／ウェル）プラスミドＤＮＡのどちらかと一緒にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）を使用して（製造業者の説明通りに、Ｉｎｆｉｔｒｏｇｅｎ社）細胞をトランスフェクトした。さらに１６ｘ−（ＡＳ）ＴＣＦ−ＴＫホタル−ルシフェラーゼ（Ｒａｍｅｓｈ Ｂｈａｔ、 ＷＨＲＩ、Ｗｙｅｔｈ社）およびコントロールＴＫ−ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を全実験で各々０．３μｇ／ウェルおよび０．０６μｇ／ウェルで共トランスフェクトした。さらにこれらの群各々をその後異なる群に分け、それらに０．０５μｇ／ウェルのＤｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ１−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、突然変異体Ｄｋｋ−１（Ｃ２２０Ａ）、ＳｏｇｇｙもしくはｐｃＤＮＡ３．１コントロールＤＮＡを添加した。他の実験では、細胞はＬＲＰ５−相互作用アプタマー（０．０５μｇ／ウェル）とともに０．００５μｇ／ウェルのＬＲＰ５、０．００２５μｇ／ウェルのＷｎｔ１もしくはＷｎｔ３ａ（０．００２５μｇ／ウェルのコントロールｐｃＤＮＡ３．１を使用）を用いて共トランスフェクトした。細胞をさらに３７℃で１８〜２０時間培養した。培地を除去した。細胞をさらに３７℃で１８〜２０時間培養した。培地を除去した。その後細胞は１００μＬ／ウェルの１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）のＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＤＬＲキット、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を用いて溶解させた。これらの溶解液２０μＬをＤＬＲキットのＬＡＲＩＩ試薬と結合し、Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ社）機器内でＴＣＦ−ホタルルシフェラーゼシグナルについてアッセイした。ホタル示度を測定した後、クエンチャーおよびｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのための基質を含有するＤＬＲキットの１００μＬの「Ｓｔｏｐ ａｎｄ Ｇｌｏ」試薬を各ウェルに添加した。直ちにＴｏｐ Ｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ社）機器を使用してｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ示度を測定した。ＴＣＦ−ホタルルシフェラーゼ対コントロールｒｅｎｉｌｌａ示度の比率は各ウェルについて計算し、全データにおいて３ウェル以上の平均比率を表示した。
［結果］
これらの実験の結果は、Ｗｎｔ１およびＬＲＰ５の存在下でＤｋｋ−１がＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性を統計的有意に相殺したことを示している（図１４）。これとは顕著に対照的に、Ｄｋｋ−１はＨＢＭ／Ｗｎｔ１媒介性ＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性には全く影響を及ぼさなかった（図１４）。同様の実験で、Ｄｋｋ−１はさらにＬＲＰ５／Ｗｎｔ３ａを相殺することはできたが、ＨＢＭ／Ｗｎｔ３ａ媒介性ＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性を相殺することはできなかった（図１５）。これらの結果は、ＨＢＭ突然変異がＨＯＢ０３ＣＥ６骨芽細胞におけるＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａシグナル伝達のアンタゴニストとしてＤｋｋ−１を不活性にすることを指摘している。Ｗｎｔ１を用いた他の実験では、Ｄｋｋ−１はＬＲＰ５もしくはＨＢＭ媒介性ＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性に何の影響も及ぼさなかった（図１４）。これとは対照的に、Ｗｎｔ３ａの存在下でＬＲＰ５もしくはＨＢＭのどちらかを用いた場合、Ｄｋｋ−２はＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性を相殺することができた（図１５）。これらの後者の結果は、ＨＢＭ突然変異がＷｎｔ３ａの存在下ではＤｋｋ−２の作用に影響を及ぼさないことを指摘している。さらにまたＨＯＢ−０３−ＣＥ６細胞中の密接に関連するＬＲＰ６ ｃＤＮＡを使用して実験を実施した。これらの実験では、ＬＲＰ６／Ｗｎｔ１およびＬＲＰ６／Ｗｎｔ３ａ媒介性ＴＣＦ−ルシフェラーゼはＬＲＰ５と同様の方法で調節された。詳細には、Ｄｋｋ−１はＬＲＰ６／Ｗｎｔ１媒介性ＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性を相殺したが、Ｄｋｋ−２は作用を及ぼさなかった（図１４）。しかし、Ｄｋｋ−２とＬＲＰ５／Ｗｎｔ３ａとの作用と同様に、Ｄｋｋ−２はＬＲＰ６／Ｗｎｔ３ａ媒介性ＴＣＦ−ルシフェラーゼ活性を相殺することができた（図１５）。
Ｕ２ＯＳ細胞における結果は、Ｗｎｔ３ａの存在下でのＷｎｔシグナル伝達のＯＳＴ２６２ ＬＲＰ５ペプチドアプタマー活性化の力強い作用を証明している（図１６）。これらの機能的重要性は、アフリカツメガエルアッセイにおいてＬＲＰ５ペプチドアプタマーを用いて下記の実施例１１で証明された結果によって確証された。このような結果は、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭシグナル伝達に小分子が及ぼす作用はＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイを使用して検出できることを肯定的に証明している。
これらのデータは、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａシグナル伝達を相殺するＤｋｋ−１の能力に関してＬＲＰ５とＨＢＭとの間には機能的相違があることを証明している。これらのデータおよびＤｋｋ−１がＬＲＰ５と直接的に相互作用することを証明した以前のデータは、Ｄｋｋ−１がＨＢＭ／Ｗｎｔシグナル伝達を相殺できないことの原因は、一部にはＨＢＭ表現型に帰せられることを示唆している。これらの実験はさらに、ＨＢＭ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を模倣するＬＲＰ５リガンドまたはＬＲＰ５とのＤｋｋ−１相互作用を遮断する因子について種々の分子（例えば、小分子、アプタマー、ペプチド、抗体、ＬＲＰ５相互作用タンパク質またはＤｋｋ−１相互作用タンパク質等）を試験する能力を証明している。
酵母２ハイブリッド相互作用トラップ
Ｄｋｋ−ＬＲＰ相互作用の小分子インヒビター（もしくは部分的インヒビター）は、極めて素晴らしい骨形成性治療薬である可能性がある。この重要なタンパク質−タンパク質相互作用を調査するための１つの方法は、上記に説明し、当分野でよく知られているＹ２Ｈ技術を実質的に使用することである。例えばＬＲＰ５ ＬＢＤのようなＬＲＰ５の領域は、Ｄｋｋと機能的に相互作用することが見いだされている。この相互作用を、ベイトおよびプレイが相互作用する場合にのみ活性化される例えばｌａｃＺもしくはルシフェラーゼのような当分野でよく知られているレポーターエレメントを使用して定量した。Ｙ２Ｈアッセイを使用して、ＬＲＰ−Ｄｋｋ相互作用を変調する化合物についてスクリーニングした。このような変調は、より弱いもしくは崩壊した相互作用を意味するレポーターエレメント活性化の減少、またはより強力な相互作用を意味するレポーターエレメント活性化の増強によって視認できるであろう。そこで、Ｙ２Ｈアッセイを高スループット・スクリーニング技術として使用すると、Ｄｋｋと潜在的治療薬として機能する可能性があるＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を破壊または増強する化合物を同定することができる。
例えば、相互作用Ｔｒａｐ法は下記のように使用できる。例えばＬＲＰ５ ＬＢＤをＬｅｘＡと融合させ、Ｄｋｋ−１をＧａｌ４−ＡＤもしくはＢ４２のどちらかと融合させた。ＬＲＰ５ ＬＢＤ−ＬｅｘＡベイトおよびＧａｌ４−ＡＤ−Ｄｋｋプレイを用いると、バックグラウンドの２０倍を超えるｌａｃＺレポーターの活性化（単一ＬｅｘＡオペレーターの制御下）を検出した。ＬＲＰに結合できないＤｋｋ−１突然変異体（Ｃ２２０Ａ）を用いると、酵母中ではこの相互作用は減少し、この相互作用および系の特異性を証明した（図１８）。結果として、ＬＲＰとＤｋｋとの間のこの相互作用を変調する小分子を同定することができる。
細胞に基づく機能的高スループットアッセイ
高スループットアッセイを開発するために、Ｕ２ＯＳ細胞およびＨＥＫ２９３細胞中の外因性ＬＲＰ５／６の低レベル発現を利用して実施例７に記載したＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイを修正した。しかし、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６細胞および、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭが発現するかどうかに依存してＤｋｋへの示差的反応を示す他のあらゆる細胞を使用できる。Ｕ２ＯＳ（ヒト肉芽腫）およびＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）細胞を使用して、ＴＣＦ−ルシフェラーゼおよびｔｋ−Ｒｅｎｉｌｌａレポーターエレメント構築物をＷｎｔ３ａ／１およびＤｋｋと一緒に共トランスフェクトした。外因性ＬＲＰ５／６を使用して、Ｗｎｔ３ａ単独はＴＣＦレポーター遺伝子活性化を刺激することができた。Ｗｎｔ３ａ／Ｗｎｔ１およびレポーター（ＴＣＦ−ｌｕｃｉおよびｔｋ−Ｒｅｎｉｌｌａ）を用いてＤｋｋを共トランスフェクトすると、Ｄｋｋはレポーターエレメント活性を抑制する。さらにＷｎｔ３ａ／Ｗｎｔ１によって活性化されたＴＣＦ−ｌｕｃｉシグナルはＷｎｔ３ａ／Ｗｎｔ１およびレポーターを含有する細胞へＤｋｋ富裕馴化培地を添加することにより抑制できる。このアッセイは、さらにＤｋｋ１の点突然変異構築物（Ｃ２２０Ａ）によってＴＣＦ−レポーター阻害の欠如によって妥当性が確認される。
該レポーターのＤｋｋ媒介性回帰はトランスフェクトしたＤｋｋ ｃＤＮＡの濃度または添加されたＤｋｋ馴化培地の量に依存する。さらに、Ｄｋｋ媒介性レポーター抑制は、Ｕ２ＯＳもしくはＨＥＫ２９３細胞のＬＲＰ５、ＬＲＰ６、およびＨＢＭ ｃＤＮＡのコトランスフェクションによって変化させることができる。一般に、Ｕ２ＯＳ細胞はＨＥＫ２９３細胞中よりもＤｋｋ媒介性レポーター抑制への大きな感受性を示す。Ｕ２ＯＳ細胞中では、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ ｃＤＮＡのトランスフェクションはＷｎｔ３ａ／Ｗｎｔ１トランスフェクションの不在下でＴＣＦ−ｌｕｃｉの中等度の活性化を引き起こす。この活性化は、おそらくはＵ２ＯＳ細胞中に存在する外因性Ｗｎｔｓを利用する。この条件下で、Ｄｋｋ１はＴＣＦ−ｌｕｃｉを抑制することができ、ＬＲＰ５とＨＢＭとの間の示差的シグナルを示す。Ｗｎｔ３ａ／Ｗｎｔ１を共トランスフェクトすることによって、本アッセイではＴＣＦ−ｌｕｃｉシグナルの一般的増加が生じる。さらに、ＬＲＰ５とＨＢＭ ｃＤＮＡ発現ならびにＬＲＰ５とＬＲＰ６ ｃＤＮＡとの間に起因するレポーターのＤｋｋ媒介性示差的抑制を検出することができる。この抑制はＬＲＰ６とでは最大、ＬＲＰ５とでは中等度、そしてＨＢＭ ｃＤＮＡ発現とでは最小である。さらに、このアッセイはＬＲＰ５相互作用ペプチドアプタマー（図４）、Ｄｋｋ１相互作用アプタマーおよびＤｋｋ−１の結合ドメインの機能的影響（図６；図１２および１３のＯＳＴ２６４および２６５）を検出できる。
ＤｋｋおよびＷｎｔ３ａ両方の存在を原因として抑制されたＷＮｔ−ＴＣＦシグナルを備えるこの系を使用すると、ＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーターを活性化し、それによりＷｎｔ経路のＤｋｋ媒介性抑制を和らげる化合物を探索することによって、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ変調を変化させることのできた化合物をスクリーニングすることができる。このように同定された化合物は、ＨＢＭ模倣物として機能して、例えば骨形成性治療薬として有用である可能性がある。この高スループットスクリーニングから生成したデータを図１９〜２１に示した。図１９は、Ｄｋｋ１がＵ２ＯＳ骨細胞中でＷｎｔ３ａ媒介性シグナル伝達を抑制することを証明している。図２０は、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、およびＨＢＭの間の機能的差を証明している。Ｄｋｋ−１はＬＲＰ６およびＬＲＰ５を抑制するが、Ｕ２ＯＳ細胞中のＨＢＭ生成Ｗｎｔ１シグナル伝達にほとんど、または全く影響を及ぼさない。図２１は、種々のＤｋｋファミリーメンバー、およびＤｋｋ−１、突然変異Ｄｋｋ−１（Ｃ２２０Ａ）、Ｄｋｋ−１−ＡＰ（アルカリホスファターゼを用いて修飾された）、Ｄｋｋ−３およびＳｏｇｇｙを含む修飾されたＤｋｋｓの示差的作用を示している。
ＤＫＫ／ＬＲＰ５／６／ＨＢＭ ＥＬＩＳＡアッセイ
ＬＲＰへのＤｋｋの結合を調査するためのさらなる方法はＥＬＩＳＡアッセイによるものである。このアッセイの可能性のある２つの順列を例示する。ＬＲＰ５は組織培養プレートウェルのような固体表面に固定した。当業者であれば、例えばナイロンもしくはニトロセルロース膜、シリコーンチップ、ガラススライド、ビーズ等のような他の支持体を利用できることを認識するであろう。この実施例では、使用したＬＲＰ５の形状は実質的にＬＲＰ５の細胞外ドメインがヒトＩｇＧのＦｃ部分へ融合している融合タンパク質であった。ＬＲＰ５−Ｆｃ融合タンパク質は安定細胞系からのＣＨＯ細胞抽出液中で生成した。ＬＲＰ５−Ｆｃ融合タンパク質は抗ヒトＦｃ抗体を介して、または例えばタンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇ被覆プレートによって固体表面上に固定化した。このプレートをその後洗浄して結合していないタンパク質を除去した。分泌Ｄｋｋタンパク質もしくは分泌Ｄｋｋ−エピトープタグ付きタンパク質（または精製Ｄｋｋもしくは精製Ｄｋｋ−エピトープタグ付きタンパク質）を含有する馴化培地をウェル内でインキュベートし、Ｄｋｋもしくはエピトープタグのどちらかに対する抗体を使用してＬＲＰへのＤｋｋの結合を調査した。ＤＫｋ−Ｖ５エピトープタグ付きタンパク質は、アルカリホスファターゼタグ付き抗Ｖ５抗体を使用して検出されるであろう。
あるいはまたＤｋｋタンパク質は例えばアルカリホスファターゼのような検出マーカーへ直接融合することができよう。この場合、Ｄｋｋ−ＬＲＰ相互作用の検出は引き続いての抗体に基づく実験を行わずに直接に調査できる。結合したＤｋｋはアルカリホスファターゼアッセイにおいて検出される。Ｄｋｋ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質が固定化されたＬＲＰ５に結合している場合は、アルカリホスファターゼ活性は比色計の読み出しから検出されるであろう。結果として、この系を使用すると小分子化合物がＤｋｋのＬＲＰへの結合を変化させる能力をアッセイできる。化合物をプレートの各ウェルにＤｋｋ（もしくはエピトープタグ付きＤｋｋ）と一緒に添加すると、適切なインキュベーション時間および洗浄後にウェル内に存在する結合したＤｋｋのシグナル強度に基づいてそれらの化合物がＤｋｋとＬＲＰとの相互作用を変調する能力をスコア付けすることができる。このアッセイは、未標識Ｄｋｋまたは第２のタイプのエピトープタグ付きＤｋｋを用いて低温競合実験を実施することによって校正できる。Ｄｋｋ−ＬＲＰ相互作用を変調できるあらゆる小分子は適切な治療薬候補、より好ましくは骨形成性治療薬候補である可能性がある。
アフリカツメガエルにおけるペプチドアプタマーの機能的評価
拘束ペプチドアプタマー構築物ＯＳＴ２５８〜２６３（２５８はシグナル配列を単独で含有し、２６３は無関係の拘束ペプチドを含有している）（図１２および１３）を使用して、制限エンドヌクレアーゼ消化によってベクターを線状化し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡを生成したこと以外は、実質的に実施例７に記載した通りにＲＮＡを生成した。
アプタマーＲＮＡは、実施例７のプロトコールを使用して１割球当たり２５０ｐｇで注入した。Ｗｎｔシグナル伝達は、アプタマー２６１を用いて、およびより強力には２６２を用いて胚背側化（重複体軸）によって視認されたように、活性化された。このアッセイの結果は図２２および２３に示した。これらの結果は、アプタマー２６１および２６２がおそらくＬＲＰのＬＢＤへの結合によって、それによりＤｋｋによるＬＲＰ媒介性シグナル伝達の変調を防止することによってＷｎｔシグナル伝達を活性化できることを示唆している。
本発明のアプタマーはＨＢＭ模倣物として機能することができる。アフリカツメガエル系では、それらはすべて単独でＷｎｔシグナル伝達を誘導することができる。それらはさらにまた、ペプチドが特異的アミノ酸レベルでどのようにＬＲＰと相互作用してＷｎｔシグナル伝達を変調できるのかについての理解を強化することによって合理的ドラッグデザインのためのツールとして機能する可能性がある。したがって、治療薬としてそれらの作用を模倣する小分子を構成することができるであろう。さらに、このアッセイで陽性であると同定されたアプタマーは単独で治療用分子として使用できる可能性がある。
均一性アッセイ
タンパク質−タンパク質相互作用における摂動を調査するための極めて優れた方法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）による方法である。ＦＲＥＴは、蛍光分子であるドナーが極めて近位にあるアクセプター発色団分子へエネルギーを転移させる量子力学的プロセスである。この系はＬＲＰ５とＡｘｉｎとの分子間相互作用について特性解析するために文献で使用され成功が得られている（Ｍａｏら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：８０１−８０９）。このような試験では多数の異なる蛍光タグを利用することができ、関心タンパク質に蛍光標識するためには数種の方法がある。例えば、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）およびＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）は各々がドナーおよびアクセプターとして使用できる。ドナーおよびアクセプターを備える融合タンパク質は、人工的に作製し、発現させ、そして精製することができる。
例えば、ＣＦＰおよび精製Ｄｋｋタンパク質へ融合した精製ＬＲＰタンパク質、またはその部分もしくはドメイン、またはＹＦＰへ融合した各々ＤｋｋもしくはＬＲＰと相互作用するそれらの部分もしくはドメインは標準的アプローチを使用して生成および精製することができる。ＬＲＰ−ＣＦＰおよびＤＫｋ−ＹＦＰが極めて近位に存在する場合、ＣＦＰからＹＦＰへのエネルギーの転移はＣＦＰ発光の減少およびＹＦＰ発光の増加を生じさせるであろう。エネルギーは４５０ｎｍの励起波長で供給され、エネルギー転移は４８０ｎｍおよび５７０ｎｍの発光波長で記録した。ＹＦＰ発光対ＣＦＰ発光の比率はＬＲＰとＤｋｋとの相互作用における変化の測定基準を提供する。この系は、Ｄｋｋ−ＬＲＰタンパク質−タンパク質相互作用を変化させる可能性がある小分子化合物をスクリーニングするために適している。この相互作用を破壊する化合物は、ＹＦＰ発光対ＣＦＰ発光の比率における低下によって同定されるであろう。ＬＲＰ−Ｄｋｋ相互作用を変調するこのような化合物は、候補ＨＢＭ模倣物分子と見なされるであろう。該化合物のこれ以上の特性解析は、該化合物がＷｎｔシグナル伝達へ及ぼす作用を解明するためにＴＣＦ−ルシフェラーゼまたはアフリカツメガエル胚アッセイを使用して実施できる。
上記の実施例では精製された成分を使用する無細胞液相アッセイを説明してきたが、細胞に基づく同様のアッセイも実施できよう。例えば、ＬＲＰ−ＣＦＰ融合タンパク質は細胞中で発現できる。その後、Ｄｋｋ−ＹＦＰ融合タンパク質は精製タンパク質または馴化培地のどちらかとして細胞に添加できよう。ＬＲＰとＤｋｋとの相互作用は上記の通りに監視する。
本明細書言及したすべての参考文献は、事実上その全体が参照することにより本明細書組み込まれる。以下の特許出願もまた事実上その全体が参照することにより本明細書組み込まれる：２００１年５月１１日に提出された米国特許出願第６０／２９０，０７１号；２０００年４月５日に提出された米国特許出願第０９／５４４，３９８号；２０００年４月５日に提出された米国特許出願第０９／５４３，７７１号；第０９／５７８，９００；１９９９年１月１３日に提出された米国特許出願第０９／２２９，３１９号；１９９８年１月１３日に提出された米国仮出願６０／０７１，４４９号；および２０００年６月２１日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１６９５１号；２００２年５月１３日に提出された「骨量および脂質濃度を変調するＨＢＭ変異体（ＨＢＭ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｔｈａｔ Ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｓｓ ａｎｄ Ｌｉｐｉｄ Ｌｅｖｅｌｓ）」と題する国際ＰＣＴ出願；および２００２年５月１３日に提出された「骨量変調のトランスジェニック動物モデル（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｓｓ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」と題する国際ＰＣＴ出願。さらに、本出願は、事実上それらの本文が参照することによりその全体が本明細書組み込まれる２００１年５月１７日に提出された米国仮出願第６０／２９１，３１１号；２００２年２月１日に提出された第６０／３５３，０５８号；および２００２年３月４日に提出された第６０／３６１，２９３号への優先権を主張する。
Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成要素の略図である。略図の入手先：ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｍｕｓｓｅ／ｐａｔｈｗａｙｓ／ｃｅｌｌ２．ｈｔｍｌ 図２Ａ〜Ｃは、タンパク質−タンパク質相互作用に対する酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーニングに利用されるベイト配列（配列番号１６８〜１７０）の図である。 Ｄｋｋ−１ベイト配列を用いてＹ２Ｈスクリーニングで同定されたペプチドアプタマー挿入配列（配列番号１７１〜１９２）の表である。 ＬＲＰ５リガンド結合ドメインベイト配列を使用してＹ２Ｈスクリーニングにおいて同定されたペプチドアプタマー挿入配列の表である。 Ｄｋｋ−１ベイト配列を使用してＹ２Ｈスクリーニングにおいて同定されたタンパク質の表である。これらのタンパク質はそれらの核酸およびアミノ酸アクセッション番号の両方によって同定される。 Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５の最小相互作用ドメインマッピングスクリーニングの結果の図である。一番上は、シグナル配列の位置、およびシステインリッチドメイン１および２を示しているＤｋｋ−１のマップ。下方は、図２のＬＲＰ５ ＬＢＤベイトであるＬＢＤ１およびＬＢＤ４を使用して試験したドメインの範囲。右には実験で観察された結合結果のスコア付けが示されている。 Ｗｎｔ活性についてのアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚アッセイの図解である。 アフリカツメガエル胚アッセイにおいてＷｎｔシグナル伝達にＺｍａｘ／ＬＲＰ５およびＨＢＭが及ぼす作用の図である。 アフリカツメガエル胚アッセイにおいて２次的な体軸形成の誘導にＺｍａｘ／ＬＲＰ５およびＨＢＭが及ぼす作用の図である。 正規Ｗｎｔ経路の抑制にヒトＤｋｋ−１が及ぼす作用の図である。 Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５およびＨＢＭ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達にヒトＤｋｋ−１が及ぼす作用の図である。 ＬＲＰ５結合ペプチドアプタマー、Ｄｋｋ−１ペプチドおよびコントロール構築物についてのｐｃＤＮＡ３．１構築物の名称およびヌクレオチド配列（配列番号１９３〜２０３を含む）である。 図１２における対応するＬＲＰ５結合ペプチド、Ｄｋｋ−１ペプチドアプタマーおよびコントロール構築物についてのアミノ酸配列（配列番号２０４〜２１４を含む）である。 ＨＯＢ０３ＣＥ６細胞中のコ受容体ＬＲＰ５、ＨＢＭ、およびＬＲＰ６によるＷｎｔ１シグナル伝達にＤｋｋ−１およびＤｋｋ−２が及ぼす作用の図である。 ＨＯＢ０３ＣＥ６細胞中のコ受容体ＬＲＰ５、ＨＢＭ、およびＬＲＰ６によるＷｎｔ３ａシグナル伝達にＤｋｋ−１およびＤｋｋ−２が及ぼす作用の図である。 Ｕ２ＯＳ細胞中のＷｎｔ３ａの存在下でＬＲＰ５−ＬＢＤペプチドアプタマー２６２がＷｎｔシグナル伝達を活性化させることを示した図である。 ＬＲＰ５およびＨＢＭウイルス感染細胞中にＨＢＭ突然変異を含む配列（ａ．ａ．１６５〜１７７）へ生成された抗体の示差的結合を示した図である。 変異体Ｄｋｋ−１（Ｃ２２０Ａ）はＬＲＰ５に結合することができないＹ２Ｈ相互作用トラップから生成したデータの図であり、ＬＲＰおよびＤｋｋ相互作用に小分子が及ぼす作用を検出する能力のウィンドウを示した図である。 高スループットスクリーニングのために細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイを使用してＤｋｋ−１がＵ２ＯＳ骨細胞中のＷｎｔ３ａ媒介性Ｗｎｔシグナル伝達を抑制するのを示した図である。 高スループットスクリーニングのために細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイを使用すると、Ｗｎｔ１−ＨＢＭ生成シグナル伝達はＵ２ＯＳ骨細胞中のＤｋｋ−１によって効果的に阻害されないが、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６−媒介性シグナル伝達は効果的に阻害されることを示した図である。 高スループットスクリーニングのための細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＴＣＦシグナルがＷｎｔ ＤＮＡトランスフェクションを行わずにＤｋｋ−１およびＤｋｋ−１−ＡＰによって変調できることを示した図である。 ＬＲＰｔ−ＬＢＤからのアプタマー２６１および２６２を使用してＷｎｔシグナル伝達を活性化したアフリカツメガエルアッセイにおける形態学的結果を示した図である。 ＬＲＰ５−ＬＢＤアプタマー２６１および２６２がその他のＬＲＰ５アプタマーにわたってＷｎｔシグナル伝達を誘導することを証明した図である。 ＬＲＰ５中の突然変異Ｇ１７１ＦがＨＢＭ活性に一致するＬＲＰ５よりも大きなＷｎｔ経路の活性化を生じさせることを示した図である。 ＬＲＰ５中の突然変異Ｍ２８２ＶがＵ２ＯＳ細胞中のＨＢＭ活性と一致するＷｎｔ経路の活性化を生じさせることを示した図である。 ポリクローナル抗体を生成するために選択されたＤｋｋ−１の種々のペプチドのアミノ酸配列、それらとＤｋｋ−１アミノ酸配列との関係および生成したポリクローナル抗体の同一性を示した図である。 Ｄｋｋ−１のアミノ酸１６５〜１８６に対するポリクローナル抗体＃５５２１が馴化培地からＤｋｋ１−Ｖ５およびＤｋｋ１−ＡＰを検出できることを証明しているウェスタンブロットの図である。 アミノ酸１４７〜１６１に対するポリクローナル抗体＃７４３９７が馴化培地(conditioned medium)および免疫沈降馴化培地のどちらにおいてもＤｋｋ１−Ｖ５を検出できることを証明しているウェスタンブロットの図である。
【配列表】
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508
Figure 2005512508

Claims (114)

  1. 被検対象におけるＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ活性を調節する方法であって、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ活性を調節するための有効量でＤｋｋ活性を変調する組成物を投与するステップを含む方法。
  2. ＤｋｋがＤｋｋ−１である請求項１、２４、２８、３３、３６、３７、４８、６４、６５、９３、９８、１０１、１０５、１０７、１１１、または１１２のいずれかの方法。
  3. ＤｋｋがＤｋｋ−１であり、Ｄｋｋ活性が阻害される請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  4. Ｄｋｋ活性が骨量および／または脂質濃度を変調する請求項１または２４の方法。
  5. 骨量を増加させる、および／または脂質濃度を低下させる請求項４の方法。
  6. 骨量における増加が骨折率の低下、骨強度の増加、骨密度の増加、骨塩密度の増加、骨梁連結性の増加、骨梁密度の増加、皮質骨密度の増加、骨径の増加、および無機質骨含量の増加のうちの１つ以上を介して決定される請求項５の方法。
  7. 前記組成物がＤｋｋ相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  8. 前記組成物が、１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ分子を含む請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  9. 前記組成物がＤｋｋペプチドアプタマーを含む請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  10. 前記組成物がＤｋｋペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  11. 前記組成物がＤｋｋのＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭへの結合を阻害する請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  12. 前記組成物がＤｋｋのＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭへの結合を増強する請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  13. 前記組成物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  14. 前記組成物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  15. 前記組成物がＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントのＤｋｋへの結合を阻害する請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  16. 前記組成物がＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントのＤｋｋへの結合を増強する請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  17. 前記被検対象が脊椎動物または無脊椎動物である請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  18. 前記被検対象が哺乳動物である請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  19. 前記被検対象が、イヌ、ネコ、ヒツジ、霊長類、ウマ、ブタ、ヤギ、ラクダ、鳥類、ウシ、または齧歯動物である請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  20. 前記霊長類がヒトである請求項１９の方法。
  21. 前記組成物がＬＲＰ５ペプチドアプタマーを含む請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  22. 前記ペプチドアプタマーがＯＳＴ２６２（配列番号２０８）である請求項２１の方法。
  23. 前記組成物がＬＲＰ５抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントを含む請求項１、２４、２８、または３３のいずれかの方法。
  24. 被検対象におけるＤｋｋ−Ｗｎｔ経路活性を調節する方法であって、Ｄｋｋ−Ｗｎｔ経路活性を調節するための有効量でＤｋｋ活性を変調する組成物を投与するステップを含む方法。
  25. Ｗｎｔが１つ以上のＷｎｔ１〜Ｗｎｔ１９である請求項２４、１０１又は１０７の方法。
  26. ＷｎｔがＷｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ又はＷｎｔ１０ｂである請求項２５の方法。
  27. Ｄｋｋ活性を変調する、またはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとのＤｋｋ相互作用を変調する前記組成物がＷｎｔシグナル伝達を変調するための有効量で投与される請求項２４の方法。
  28. 被検対象において骨量を変調する方法であって、前記被検対象における骨量を変調するための有効量でＤｋｋ活性またはＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭとのＤｋｋ相互作用を変調する組成物を前記被検対象に投与するステップを含む方法。
  29. 骨量を増加させる請求項２８の方法。
  30. 骨量における増加が骨折率の低下、骨強度の増加、骨密度の増加、骨塩密度の増加、骨梁連結性の増加、骨梁密度の増加、皮質骨密度の増加、骨径の増加、および無機質骨含量の増加のうちの１つ以上を介して決定される請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記被検対象が、骨の発達障害、骨折、年齢関連性骨量減少、軟骨形成異常、薬物誘発性骨障害、骨の高度の代謝回転、高カルシウム血症、骨化過剰症、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨粗鬆症、ぺージェット病、変形性関節症、およびくる病からなる群から選択される骨量障害を有する請求項２８ないし３６の方法。
  32. ＬＲＰ５、ＬＲＰ６若しくはＨＢＭとのＤｋｋ相互作用又はＤｋｋ活性を変調する前記組成物が骨梁および／または皮質組織の量を変調するための有効量で投与される請求項２８の方法。
  33. 被検対象における脂質濃度を変調する方法であって、前記被検対象における脂質濃度を変調するための有効量でＤｋｋ活性またはＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭとのＤｋｋ相互作用を変調する組成物を前記被検対象に投与するステップを含む方法。
  34. 脂質濃度を低下させる請求項３３の方法。
  35. 前記被検対象が脂質変調障害を有し、前記脂質変調障害が心臓状態、アテローム性動脈硬化症、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性アポタンパク質ＣＩＩ欠損症、家族性３型高リポタンパク血症、家族性高コレステロール血症、家族性高トリグリセリド血症、多種リポタンパク型高脂血症、透析および／または糖尿病を原因とする脂質濃度上昇、および病因不明の脂質濃度上昇からなる群から選択される請求項３３又は３６の方法。
  36. 被検対象における低骨量もしくは高骨量および／または高脂質もしくは低脂質濃度を診断する方法であって、前記被検対象が（ａ）高骨量もしくは低骨量および／または（ｂ）高脂質もしくは低脂質濃度を有するかどうかを決定するために、前記被検対象におけるＤｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭおよび／またはＨＢＭ様変異体の発現を検査するステップと、Ｄｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはＨＢＭ様変異体が過剰もしくは過小発現しているかどうかを決定するステップとを含む方法。
  37. ＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭとＤｋｋとの相互作用、またはＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントとＤｋｋとの相互作用を変調する化合物をスクリーニングする方法であって
    （ａ）ＤｋｋおよびそのＬＲＰ５、ＬＲＰ６および／またはＨＢＭ結合フラグメントを化合物に曝露させるステップと、
    （ｂ）前記化合物がＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントとのＤｋｋ相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
    を含む方法。
  38. 前記変調が、前記化合物がＤｋｋまたはそのＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭ結合フラグメントに結合するかどうかによって決定される請求項３７の方法。
  39. ＤｋｋまたはそのＬＲＰ結合フラグメントが基質に付着される請求項３７の方法。
  40. 前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む請求項３７の方法。
  41. 前記化合物がＤｋｋペプチドアプタマーを含む請求項３７または４８の方法。
  42. 前記化合物がＤｋｋペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項３７または４８の方法。
  43. 前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項３７または４８の方法。
  44. 前記化合物がＬＲＰ５ペプチドアプタマーを含む請求項３７または４８の方法。
  45. 前記ペプチドアプタマーがＯＳＴ２６２（配列番号２０８）である請求項４４の方法。
  46. 前記化合物がＬＲＰ５抗体を含む請求項３７または４８の方法。
  47. 前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物である請求項３７または４８の方法。
  48. ＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを１つの化合物に曝露させるステップと、
    （ｂ）前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントに結合したかどうかを決定するステップと、
    （ｃ）前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質とＤｋｋとの相互作用を変調するかどうかをさらに決定するステップと
    を含む方法。
  49. 前記Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントが基質に付着される請求項４８の方法。
  50. ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ活性変調化合物とそのための医薬上許容される担体とを含む組成物。
  51. 前記ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ活性変調化合物が、Ｄｋｋに結合する化合物を含んでおり、それによりＤｋｋとＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭとの相互作用を変調する請求項５０の組成物。
  52. 前記ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ変調化合物が、１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質およびそのＤｋｋ結合フラグメントを含む請求項５０の組成物。
  53. 前記ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ変調化合物が、Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントに結合するモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントである請求項５０の組成物。
  54. 前記モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体、または二重特異性抗体である請求項５３の組成物。
  55. 前記ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ変調化合物が、１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ分子を含む請求項５０の組成物。
  56. 前記ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ変調化合物が、Ｄｋｋペプチドアプタマーを含む請求項５０の組成物。
  57. 前記ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ変調化合物が、Ｄｋｋペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項５０の組成物。
  58. 前記ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ変調化合物が、Ｄｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項５０の組成物。
  59. 前記ＬＲＰ５、ＬＲＰ６またはＨＢＭ変調化合物が、Ｄｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項５０の組成物。
  60. 前記化合物がＬＲＰ５ペプチドアプタマーを含む請求項５０の組成物。
  61. 前記ペプチドアプタマーがＯＳＴ２６２である請求項６０の組成物。
  62. 前記化合物がＬＲＰ５抗体を含む請求項５０の組成物。
  63. Ｄｋｋ活性を変調する化合物とそのために医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
  64. ＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
    （ａ）第１蛍光タグを使用してＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭ蛍光融合タンパク質を作製するステップと、
    （ｂ）第２蛍光タグを含むＤｋｋ融合タンパク質を作製するステップと、
    （ｃ）試験化合物を添加するステップと、
    （ｄ）前記化合物がＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を変調するかどうかを決定するために蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）または生物蛍光共鳴エネルギー転移法（ＢＲＥＴ）を使用して蛍光タグ発光の比率における変化を評価するステップと
    を含む方法。
  65. Ｄｋｋタンパク質に対する結合パートナーを同定する方法であって、
    （ａ）１つ以上のＤｋｋタンパク質またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合フラグメントを潜在的結合パートナーへ曝露させるステップと、
    （ｂ）前記潜在的結合パートナーがＤｋｋタンパク質またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
    を含む方法。
  66. Ｄｋｋ相互作用タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸とインフレームであるＧａｌ４もしくはＬｅｘＡの活性化ドメインとインフレームである足場タンパク質をコードする核酸を含むＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーをコードする核酸。
  67. 請求項６６の核酸を含むベクター。
  68. 前記足場タンパク質がｔｒｘＡである請求項６６の核酸。
  69. その自然環境における細胞外相互作用を通して結合するペプチド結合対の第１のペプチドと第２のペプチドとの結合相互作用に及ぼす化合物の変調活性を検出する方法であって、
    （ｉ）
    ａ）転写活性化タンパク質ＤＮＡ結合ドメインへ結合した第１のペプチドまたはそのセグメントを含む第１の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    ｂ）転写活性化タンパク質転写活性化ドメインへ結合した第２のペプチドまたはそのセグメントを含む第２の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    （このとき第１のペプチドまたはそのセグメントと第２のペプチドまたはそのセグメントとの結合は転写活性化タンパク質を再構成する）、
    ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントと（このとき前記レポーターエレメントの発現は選択された表現型を生じる）、
    を含む少なくとも１つの真核細胞を培養するステップと、
    （ｉｉ）前記真核細胞を化合物の存在下で前記選択された表現型を検出するために適合する条件下で培養するステップと、
    （ｉｉｉ）前記化合物が前記選択された表現型を生成する前記レポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって前記化合物が前記ペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと（このとき、（１）前記第１のペプチドはＤｋｋペプチドであり、第２のペプチドはＬＲＰ５、ＨＢＭ、ＬＲＰ６およびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭのＤｋｋ結合部分から選択されたペプチドである、または（２）前記第１のペプチドはＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントであり、前記第２のペプチドはＤｋｋペプチドである）、
    を含む方法。
  70. 前記真核細胞が酵母細胞である請求項６９の方法。
  71. 前記酵母細胞がサッカロミセスである請求項７０の方法。
  72. サッカロミセス細胞がサッカロミセス・セレヴィシエである請求項７１の方法。
  73. ＤｋｋがＤｋｋ−１であり、前記化合物が１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを含む請求項６９の方法。
  74. 前記化合物がアッセイに直接的に添加される請求項７３の方法。
  75. 前記化合物が前記第１および第２のペプチドに加えて前記真核細胞によって組換え的に発現させられる請求項７３の方法。
  76. 前記化合物がＤｋｋペプチドアプタマーを含む請求項６９の方法。
  77. 前記化合物がＤｋｋペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項６９の方法。
  78. 前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項６９の方法。
  79. 前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項６９の方法。
  80. 真核細胞がさらに、転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列、およびレポーターエレメントをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択された少なくとも１つの内因性ヌクレオチド配列を含んでおり、前記内因性ヌクレオチド配列の少なくとも１つが突然変異もしくは欠失によって不活化されている請求項６９の方法。
  81. 前記ペプチド結合対がリガンドと前記リガンドが結合する受容体とを含む請求項６９の方法。
  82. 前記転写活性化タンパク質がＧａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳動物核受容体である請求項６９の方法。
  83. 前記異種融合タンパク質の少なくとも１つが自己複製プラスミドから発現させられる請求項６９の方法。
  84. 前記ＤＮＡ結合ドメインが転写活性化タンパク質の異種ＤＮＡ結合ドメインである請求項６９の方法。
  85. 前記ＤＮＡ結合タンパク質が哺乳動物ステロイド受容体および細菌ＬｅｘＡタンパク質からなる群から選択される請求項８４の方法。
  86. 前記レポーターエレメントがｌａｃＺ、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド、およびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される請求項６９の方法。
  87. 前記レポーターエレメントがｌａｃＺである請求項８６の方法。
  88. 前記試験サンプルがＬＲＰ５ペプチドアプタマーを含む請求項６９の方法。
  89. 前記ペプチドアプタマーがＯＳＴ２６２（配列番号２０８）である請求項８８の方法。
  90. 前記試験サンプルがＬＲＰ５抗体を含む請求項６９の方法。
  91. Ｄｋｋ−１が組織特異的な方法でノックアウトされているトランスジェニック動物。
  92. 前記組織特異性が骨組織、癌組織、または肝組織である請求項９１のトランスジェニック動物。
  93. Ｄｋｋ活性を変調する潜在的化合物を同定するための方法であって、
    ａ）１つの化合物の存在下および不在下において、１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントと、Ｄｋｋまたはそのフラグメントとの結合に及ぼす影響を測定するステップと、
    ｂ）１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントとＤｋｋまたはそのフラグメントとの間の結合を変調する化合物を、潜在的Ｄｋｋを変調する化合物であると同定するステップと
    を含む方法。
  94. 図３（配列番号１７１〜１８８）または図４（配列番号１８９〜１９２）のペプチドアプタマー。
  95. 以下の１つ以上のアミノ酸配列のペプチドＧＮＫＹＱＴＩＤＮＹＱＰＹＰＣ（配列番号１１８）、ＬＤＧＹＳＲＲＴＴＬＳＳＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧ（配列番号１１９）、ＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ（配列番号１２０）、ＲＧＥＩＥＥＴＩＴＥＳＦＧＮＤ（配列番号１２１）、ＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤ（配列番号１２２）、ＭＹＷＴＤＷＶＥＴＰＲＩＥ（配列番号１２３）、ＭＹＷＴＤＷＧＥＴＰＲＩＥ（配列番号１２４）、ＫＲＴＧＧＫＲＥＩＬＳＡ（配列番号１２５）、ＥＲＶＥＫＴＴＧＤＫＲＴＲＩＱＧＲ（配列番号１２６）、ＫＱＱＣＤＳＦＰＤＣＩＤＧＳＤＥ（配列番号１２７）、またはＡｓｎ３４−Ｈｉｓ２６６（配列番号１１０）、Ａｓｎ３４−Ｃｙｓ２４５（配列番号１１１）、Ａｓｎ３４−Ｌｙｓ１８２（配列番号１１２）、Ｃｙｓ９７−Ｈｉｓ２６６（配列番号１１３）、Ｖａｌ１３９−Ｈｉｓ２６６（配列番号１１４）、Ｇｌｙ１８３−Ｈｉｓ２６６（配列番号１１５）、Ｃｙｓ９７−Ｃｙｓ２４５（配列番号１１６）、もしくはＶａｌ１３９−Ｃｙｓ２４５（配列番号１１７）からなる群から選択されるＤｋｋ−１アミノ酸配列を認識して結合する抗体もしくは抗体フラグメント。
  96. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項９５の抗体もしくは抗体フラグメント。
  97. 前記抗体がポリクローナル抗体である請求項９５の抗体もしくは抗体フラグメント。
  98. ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調するＤｋｋ相互作用タンパク質を同定する方法であって、
    （ａ）Ｄｋｋおよび潜在的Ｄｋｋ相互作用タンパク質ｍＲＮＡをアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）割球内へ注入するステップと、
    （ｂ）体軸重複を評価する、またはマーカー遺伝子発現を解析するステップと、
    （ｃ）体軸重複またはマーカー遺伝子発現における変化を引き出す組成物を、ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調するＤｋｋ相互作用タンパク質であると同定するステップと
    を含む方法。
  99. ＨＢＭ、ＬＲＰ５／６、いずれかのＷｎｔ、Ｗｎｔアンタゴニスト、Ｗｎｔ経路変調剤、またはこれらの組み合わせのｍＲＮＡが、アフリカツメガエル割球内に共注入される請求項９８の方法。
  100. 解析されるマーカー遺伝子がＳｉａｍｏｉｓ、Ｘｎｒ３、ｓｌｕｇ、Ｘｂｒａ、ＨＮＫ−１、ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｎ、Ｘｌｈｂｏｘ８、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＸＬＲＰ６、ＥＦ−１またはＯＤＣである請求項９８の方法。
  101. ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調するＤｋｋ相互作用タンパク質を同定するための方法であって、
    （ａ）Ｄｋｋおよび潜在的Ｄｋｋ相互作用タンパク質を含有する構築物を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
    （ｂ）Ｗｎｔ反応性プロモーターへ連結したレポーター遺伝子の発現における変化を評価するステップと、
    （ｃ）Ｄｋｋ構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかのタンパク質をＤｋｋ相互作用タンパク質であると同定するステップと
    を含む方法。
  102. 前記細胞が、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６、ＨＥＫ２９３、またはＵ２ＯＳ細胞である請求項１０１の方法。
  103. 前記Ｗｎｔ反応性プロモーターがＴＣＦまたはＬＥＦである請求項１０１の方法。
  104. 前記細胞が、ＣＭＶ β−ガラクトシダーゼを用いて共トランスフェクトされる請求項１０１の方法。
  105. ＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
    （ａ）ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭを固体表面へ固定化するステップと、
    （ｂ）分泌Ｄｋｋタンパク質もしくは分泌エピトープタグＤｋｋおよび試験化合物を用いて固体表面を処理するステップと、
    （ｃ）Ｄｋｋもしくはエピトープタグに対する抗体を使用して、またはエピトープタグの活性を直接に測定するステップによって、前記化合物がＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの間の結合を変調するかどうかを決定するステップと
    を含む方法。
  106. エピトープタグが、アルカリホスファターゼ、ヒスチジンまたはＶ５タグである請求項１０５の方法。
  107. ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
    （ａ）ＤｋｋおよびＷｎｔタンパク質を含有する構築物を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
    （ｂ）Ｗｎｔ反応性プロモーターへ連結したレポーターエレメントの発現における変化を評価するステップと、
    （ｃ）Ｄｋｋ構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかの化合物をＤｋｋ／Ｗｎｔ相互作用を変調する化合物であると同定するステップと
    を含む方法。
  108. ＷＮｔ３ａおよびＷｎｔ１構築物が、前記細胞内へ共トランスフェクトされる請求項１０７の方法。
  109. 前記細胞が、Ｕ２ＯＳ、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６、またはＨＥＫ２９３細胞である請求項１０７の方法。
  110. 使用されるレポーターエレメントが、ＴＣＦ−ルシフェラーゼ、ｔｋ−Ｒｅｎｉｌｌａ、またはその組み合わせである請求項１０７の方法。
  111. 哺乳動物におけるＤｋｋ−媒介性活性を変調する化合物を試験する方法であって、
    （ａ）（１）調節可能な１つ以上のＤｋｋ遺伝子、（２）Ｄｋｋ遺伝子のノックアウト、もしくは（３）１つ以上のＤｋｋ遺伝子のノックインを有する１群のトランスジェニック動物を提供するステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）におけるトランスジェニック動物群に対して各々第２群のコントロール動物を提供するステップと、
    （ｃ）骨量または脂質濃度を変調する潜在的Ｄｋｋ変調化合物へトランスジェニック動物群および対照動物群を曝露させるステップと、
    （ｄ）トランスジェニック動物群と対照動物群とを比較し、そして前記化合物が対照動物群に比してトランスジェニック動物における骨量または脂質濃度に及ぼす作用を決定するステップと
    を含む方法。
  112. ＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを１つの化合物へ曝露させるステップと、
    （ｂ）前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
    を含む方法。
  113. 前記変調が、前記化合物が前記Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントに結合するかどうかによって決定される請求項１１２の方法。
  114. 図３（配列番号１７１〜１８８）または図４（配列番号１８９〜１９２）に示した配列を認識して結合する抗体もしくは抗体フラグメント。
JP2002588934A 2001-05-17 2002-05-17 Ｄｋｋ媒介性相互作用を変調する試薬および方法 Withdrawn JP2005512508A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29131101P 2001-05-17 2001-05-17
US35305802P 2002-02-01 2002-02-01
US36129302P 2002-03-04 2002-03-04
PCT/US2002/015982 WO2002092015A2 (en) 2001-05-17 2002-05-17 Reagents and methods for modulating dkk-mediated interactions

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008302849A Division JP2009142274A (ja) 2001-05-17 2008-11-27 Ｄｋｋ媒介性相互作用を変調する試薬および方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2005512508A true JP2005512508A (ja) 2005-05-12

Family

ID=27404041

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002588934A Withdrawn JP2005512508A (ja) 2001-05-17 2002-05-17 Ｄｋｋ媒介性相互作用を変調する試薬および方法
JP2008302849A Pending JP2009142274A (ja) 2001-05-17 2008-11-27 Ｄｋｋ媒介性相互作用を変調する試薬および方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008302849A Pending JP2009142274A (ja) 2001-05-17 2008-11-27 Ｄｋｋ媒介性相互作用を変調する試薬および方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1395285A4 (ja)
JP (2) JP2005512508A (ja)
AU (1) AU2002342734B2 (ja)
BR (1) BR0209836A (ja)
CA (1) CA2446582A1 (ja)
IL (1) IL158750A0 (ja)
WO (1) WO2002092015A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012526139A (ja) * 2009-05-07 2012-10-25 ノバルティス アーゲー Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１もしくはＤｉｃｋｋｏｐｆ−４または両方に対する結合分子の組成物および使用方法

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60235524D1 (de) 2002-04-17 2010-04-15 Deutsches Krebsforsch Verfahren zum Screening einer Substanz zur Modulierung der wnt -Signalkaskade.
US8124087B2 (en) 2002-12-05 2012-02-28 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods of controlling bone loss by inhibiting DKK1
AU2003302926A1 (en) * 2002-12-05 2004-06-30 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas System Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
US7642238B2 (en) * 2002-12-05 2010-01-05 Shaughnessy John D Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
WO2005009346A2 (en) * 2003-06-24 2005-02-03 Mirus Corporation Inhibition of gene function by delivery of polynucleotide-based gene expression inhibitors to mammalian cells in vivo
US8367822B2 (en) 2003-09-22 2013-02-05 Enzo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US8637506B2 (en) 2003-09-22 2014-01-28 Enzo Biochem, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
US7622553B2 (en) 2003-11-17 2009-11-24 Merck & Co., Inc. Rhesus monkey dickkopf-1, nucleotides encoding same, and uses thereof
WO2005049797A2 (en) 2003-11-17 2005-06-02 Merck & Co., Inc. Cynomolgus monkey dickkopf-4, nucleotides encoding same, and uses thereof
US9052324B2 (en) 2004-05-19 2015-06-09 Enzo Biochem, Inc. Compounds and assays for controlling Wnt activity
MX2007001221A (es) * 2004-08-04 2007-03-23 Amgen Inc Anticuerpos para proteina dickkopf-1 (dkk-1).
WO2006015497A1 (en) * 2004-08-13 2006-02-16 Val-Chum, S.E.C. Methods of use of a dkk1 protein, immunogenic polypeptides thereof, nucleic acid encoding the dkk1 protein or polypeptides, or ligands thereof for detecting tumors; and for eliciting immune response against tumors
WO2008097510A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Merck & Co., Inc. Antibodies specific for dkk-1
EP2209491B1 (en) * 2007-11-02 2015-10-28 Novartis AG Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (lrp6)
AR075989A1 (es) 2009-04-10 2011-05-11 Lilly Co Eli Anticuerpo dkk -1 (dickkopf-1) humano disenado por ingenieria
KR101471239B1 (ko) * 2009-05-12 2014-12-09 화이자 인코포레이티드 항-ｄｋｋ-1 항체의 차단 및 그의 용도
CN102985441B (zh) 2010-02-19 2015-04-22 俄克拉何马大学董事会 抑制Wnt信号传导途径的单克隆抗体及其制备方法和用途
BR112012022044A2 (pt) 2010-03-24 2020-08-25 Genentech Inc ''anticorpo,imunoconjugado,formulação farmacêutica,uso do anticorpo,método de tratamento,anticorpo biespecifico isolado e célula hospedeira''.
BR112012028326A2 (pt) 2010-05-06 2017-03-21 Novartis Ag anticorpo multivalente isolado, anticorpos biparatópicos isolados, ácido nucleico, vetor, composição farmacêutica, método de obtenção dos referidos anticorpos, bem como uso do dos mesmos
EP4234698A3 (en) 2010-05-06 2023-11-08 Novartis AG Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) antibodies
EP3252075A1 (en) 2011-11-04 2017-12-06 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs
CN107760686B (zh) * 2016-08-23 2021-04-16 上海伯豪医学检验所有限公司 Dkk-1蛋白的核酸适配体及其应用
CN110709102A (zh) * 2017-03-24 2020-01-17 耶鲁大学 低密度脂蛋白受体相关蛋白5抑制阻抑肿瘤形成
MY200744A (en) 2017-05-31 2024-01-13 Boehringer Ingelheim Int Gmbh Polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998046743A1 (en) * 1997-04-15 1998-10-22 The Wellcome Trust Limited As Trustee To The Wellcome Trust Novel ldl-receptor
JP2004537289A (ja) * 2001-05-11 2004-12-16 ゲノム　セラピューティックス　コーポレーション 骨量および脂質レベルを調整するｈｂｍ変異型

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1161445A2 (en) * 1999-03-05 2001-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human dickkopf-related protein and nucleic acid molecules and uses therefor
WO2001077327A1 (en) * 2000-04-05 2001-10-18 Genome Therapeutics Corporation THE HIGH BONE MASS GENE OF 11q13.3
CN100469792C (zh) * 2000-05-26 2009-03-18 奥赛恩特药品公司 通过Zmax1或HBM基因调节脂质水平
WO2002066509A2 (en) * 2001-02-16 2002-08-29 Genentech, Inc. Treatment involving dkk-1 or antagonists thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998046743A1 (en) * 1997-04-15 1998-10-22 The Wellcome Trust Limited As Trustee To The Wellcome Trust Novel ldl-receptor
JP2004537289A (ja) * 2001-05-11 2004-12-16 ゲノム　セラピューティックス　コーポレーション 骨量および脂質レベルを調整するｈｂｍ変異型

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012526139A (ja) * 2009-05-07 2012-10-25 ノバルティス アーゲー Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１もしくはＤｉｃｋｋｏｐｆ−４または両方に対する結合分子の組成物および使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR0209836A (pt) 2004-12-07
JP2009142274A (ja) 2009-07-02
WO2002092015A3 (en) 2003-10-23
CA2446582A1 (en) 2002-11-21
IL158750A0 (en) 2004-05-12
WO2002092015A2 (en) 2002-11-21
EP1395285A2 (en) 2004-03-10
EP1395285A4 (en) 2005-06-01
AU2002342734B2 (en) 2007-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7700101B2 (en) Reagents and method for modulating Dkk-mediated interactions
JP2009142274A (ja) Ｄｋｋ媒介性相互作用を変調する試薬および方法
AU2002342734A1 (en) Reagents and methods for modulating Dkk-mediated interactions
Nakashiba et al. Netrin-G1: a novel glycosyl phosphatidylinositol-linked mammalian netrin that is functionally divergent from classical netrins
US7416849B2 (en) HBM variants that modulate bone mass and lipid levels
Shah et al. PLEKHA4/kramer attenuates dishevelled ubiquitination to modulate Wnt and planar cell polarity signaling
JP2009510002A (ja) 反発誘導分子（ｒｇｍ）タンパク質ファミリーのタンパク質の結合ドメイン、及びその機能的断片、及びそれらの使用
JPH09505735A (ja) ｐ５３−結合性ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
US20090226463A1 (en) Novel method of modulating bone-related activity
JP2001502924A (ja) Ｓｍａｄ７およびその使用
Bennett et al. Odor-evoked gene regulation and visualization in olfactory receptor neurons
EP2091556B1 (en) Non-human animal comprising a mutation in the sreb2/gpr85 gene as animal model of metabolic disease
JP2004507236A (ja) 骨粗鬆症の診断および治療に有用な調節遺伝子および系
JP2018528213A (ja) 新規なｉｇｆｒ様レセプター及びその使用
US8062851B2 (en) FIAT nucleic acids and proteins and uses thereof
JP5378202B2 (ja) 脳・神経に特異的あるいは神経分化に特異的なバイオマーカー
JP2003526369A (ja) 新規ポリヌクレオチドおよび同一物をコードする核酸
JP2003510071A (ja) Ｐ−糖タンパク質およびその使用
US7238799B2 (en) Mustang, a gene and nuclear protein
US20070298026A1 (en) Methods for Identifying Treatment and Inducing Infertility Using Smc1-Beta
Jia et al. A novel protein involved in heart development in Ambystoma mexicanum is localized in endoplasmic reticulum
Zürner The Liprin-α protein family
JP2003116582A (ja) 新規生理活性ペプチドおよびその用途
Zakrzewicz Functional analysis of RACK1 as a novel interaction partner of BMPRII in pulmonary arterial hypertension
JP2005204557A (ja) 変形性関節症関連遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050304

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080527

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080821

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080828

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080929

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081006

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081027

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081104

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20081127

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20081128

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090417

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090817

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20090818

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20091029

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20100312

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110805

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110811

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110906

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110912

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20111006

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20111012

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20111122