JP2005510253A - ヒトIgλ軽鎖遺伝子を保有するトランスジェニック動物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように設計される、トランスジェニック非ヒト動物に関する。特に、本発明に従う動物は、複数の可変VH遺伝子領域およびVλ遺伝子領域を含み、かつVκ遺伝子領域を含み得る、ヒトIg遺伝子座を保有する。都合のいいことに、複数の可変領域遺伝子の含有は、その動物によって産生されるヒト抗体の多様性を増大させる。さらに、このような領域の含有は、動物のB細胞発達を高め、そして再構築する。これにより、この動物は、ヒトIgλ軽鎖を含む高親和性抗体を分泌する、豊富な成熟B細胞を保有する。
メガ塩基の大きさのヒト遺伝子座をYACにクローン化して再構築し、そしてこれをマウス生殖系列に導入し得ることは、非常に大型かまたは大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的な構成部分を明らかにするため、およびヒト疾患の有用なモデルを産生するための、強力なアプローチを提供する。さらに、このような技術(マウス遺伝視座とヒトの対応するヒト遺伝子座との置換)の利用は、発生の間のヒト遺伝子産物の発現および制御、他の系との連絡、ならびに疾患誘発および進行におけるその関係において、独特の洞察を提供し得る。
動物に挿入するための、目的の構築物に形成される。このアプローチは、以下において記載される:米国特許第5,545,807号(Suraniら)、米国特許第5,545,806号および同第5,625,825号(両方ともLonbergおよびKay,ならびにGenPharm Internationalの米国特許出願第07/574,748号(1990年8月29日出願);同第07/575,962号(1990年8月31日出願);同第07/810,279号(1991年12月17日出願);同第07/853,408号(1992年3月18日出願);同第07/904,068号(1992年6月23日出願);同第07/990,860号(1992年12月16日出願);同第08/053,131号(1993年4月26日出願);同第08/096,762号(1993年7月22日出願);同第08/155,301号(1993年11月18日出願);同第08/161,739号(1993年12月3日出願);同第08/165,699号(1993年12月10日出願);および同第08/209,741号(1994年3月9日出願);これらの開示は、本明細書により参考として援用される。以下もまた、参照のこと:国際特許出願WO94/25585号、同第WO93/12227号、同第WO92/22645号、および同第WO92/03918号、これらの開示は、その全体が、本明細書により参考として援用される。さらに以下もまた、参照のこと:Taylorら(1992)、Chenら(1993)、Tuaillonら(1993)、Choiら(1993)、Lonbergら(1994)、Taylorら(1994)、およびTuaillonら(1995)、これらの開示は、その全体が、本明細書により参考として援用される。
本発明は、実質的に完全なヒト免疫グロブリン(Ig)λ遺伝子座を保有する、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。ヒトλ遺伝子座は、ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子を、60%以上、好ましくは70%または80%以上、より好ましくは90%または95%以上、そしてさらにより好ましくは100%または約100%含む。このようなパーセンテージは、好ましくは、機能的可変領域遺伝子のパーセンテージをいい、好ましい実施形態において、動物は哺乳動物である。
本発明者らは、ヒト生殖系列λIg軽鎖遺伝子座またはその一部分を含むマウスの幾つかの系統の産生および特徴づけを、本明細書中で、記載する。本発明者らはまた、ヒト生殖系列κ軽鎖遺伝子座またはその部分およびヒト生殖系列重鎖遺伝子座またはその部分をさらに含む、トランスジェニック動物の産生も、記載する。従って、本発明は、対応するマウス遺伝子座と機能的に置き換えるための、大型の、複雑なヒトIg遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物を、提供する。本発明はまた、ヒトλ生殖系列遺伝子座を含むYACの使用、およびメガ塩基の大きさのYACのトランスジェニック動物(特にトランスジェニックマウス)への、成功した導入により、トランスジェニック非ヒト動物を、産生する方法も、提供する。本発明はまた、トランスジェニック動物を生じる胚幹細胞、および胚幹細胞を作製する方法も、提供する。本発明は、さらに、トランスジェニック動物により産生される、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体を提供し、そしてモノクローナル抗体を作製する不死化細胞(例えばハイブリドーマ)に関わる組成物および方法を、提供する。
本明細書中の用語は、概して、当業者によって理解されるような、通常の意味を有している。以下の用語は、本明細書中で使用される場合、以下のような一般的意味を有することを、意図する:
「抗体レパートリー」は、動物またはヒトにおける、それぞれ異なった抗体種の総合を意味する。抗体レパートリーにおける多様性は、特に、免疫グロブリン遺伝子組換え、免疫グロブリン遺伝子連結多様性、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、レセプター校正、および体細胞過剰突然変異から、生じる。
基礎抗体構造単位は、テトラマーを構成することで知られる。それぞれのテトラマーは、2つの同一のポリペプチド鎖の対からなり、それぞれの対は、1つの「軽鎖」(約25kDa)および1つの「重鎖」(約50〜70kDa)を有する。従って、インタクトなIgG抗体は、2つの結合部位を有する。二機能性抗体または二種特異性抗体を除き、2つの結合部位は、同一である。分泌性IgMについては、基礎単位は、二価抗体のペンタマーである。従って、5量体IgMは、それぞれ、10の結合部位を有する。分泌性IgAについては、基礎単位は、二価抗体のテトラマーである。従って、4量体IgAは、それぞれ、4つの結合部位を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う、約100から110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に最初に応答する、定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパ(κ)軽鎖およびラムダ(λ)軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー(μ)、デルタ(δ)、ガンマ(γ)、アルファ(α)、またはイプシロン(ε)に分類され、そして抗体のアイソタイプを、IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEにそれぞれ定義する。軽鎖および重鎖の内部において、可変領域および定常領域が、約12以上のアミノ酸の「J」領域によって連結され、重鎖もまた、約10以上のアミノ酸の「D」領域を含む。一般に、Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))を、参照のこと(全ての目的で、全体が参考として援用される)。それぞれの軽鎖/重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
B細胞の発達は、骨髄において、D遺伝子とJ遺伝子との間の欠失組換えを用いて、始める。その後、V遺伝子が、DJを再結合してVDJを形成する。このVDJは、転写され、スプライシングされたVDJCμ転写物を、産生する。転写物が読み取り枠内である場合、次いで、μ鎖が、翻訳によって合成される。同様に、そして一般に、VHDJHの再結合およびμ鎖と軽鎖の代替物との対形成の後で、Ig軽鎖遺伝子座は、V遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを再編成する。骨髄における成功したB細胞の発達は、細胞表面上にIgMκまたはIgMλを発現するB細胞を生じる。マウスにおいて、B細胞の95%がIgMκを発現し、5%がIgMλを発現する:ヒトにおいては、およそB細胞の60%がIgMκを発現し、40%がIgMλを発現する。
ヒトλIg遺伝子座は0.9Mbにおよぶ。ここには、約69のVλ遺伝子セグメントが存在し、その36は読み取り枠を有する。これらのうち30は、ヒト末梢血リンパ球(PBL)由来の転写物において検出されている。Vλ遺伝子は、3つのクラスターに別れる(5’から3’に向かって、Cクラスター、Bクラスター、およびAクラスターと名付けられる)。クラスターAは、14の機能するVλ遺伝子セグメントを含み、発現するレパートリーの62%に相当する。クラスターBは、11の機能するVλ遺伝子セグメントを含み、発現するレパートリーの33%に相当する。そして、クラスターCは、5の機能するVλ遺伝子セグメントを含み、発現するレパートリーの5%に相当する。発現されたレパートリーは、ヒトPBLによって発現されるレパートリーにおけるVλ遺伝子の発現の頻度に基づく。例えば、Ignatovichら,J.Mol.Biol.,268:69−77(1997)(本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。10のVλ遺伝子ファミリーが、これらのクラスターに存在する。最も大きなファミリーであるVλIIIは、23のメンバーを有し、そのうちの8が機能する。ヒトλ遺伝子座において、7つのJλ−Cλ対が存在し、そのうち4つが機能する。
マウス抗体またはラット抗体のヒト患者への投与は、通常、効果がない。何故なら、抗体中のマウス由来の配列またはラット由来の配列の存在は、抗体の迅速なクリアランスか、または抗体に対する免疫応答の産生が、患者によって導かれるからである。ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変領域および/または定常領域を保有する抗体に関わる問題の中のいくつかを避ける。ヒト由来の細胞を使用するヒトモノクローナル抗体の作製は問題があったため、ヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物を開発することが、望ましかった。
本発明の一実施形態において、本発明は、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を含むYACを、提供する。一般に、YACは、酵母セントロメア、複製起点、テロメア、および目的のDNAを含む。種々のセントロメアまたはテロメア(特に、酵母第4染色体および酵母第5染色体由来のセントロメア)が使用され得る。一般に、YACは、選択可能マーカーを有し、このマーカーは、YACが組み込まれている細胞の選択またはスクリーニングを可能にする。一実施形態において、HPRT遺伝子(より具体的にはヒトHPRT遺伝子)が、選択可能マーカーとして使用され得る。何故なら、HPRT遺伝子は、YACを有するHPRT欠失ES細胞を、効果的に選択させるからである。他の、使用され得る公知の選択可能マーカーまたはスクリーニング可能マーカーとしては、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、fl−gal、およびGPTが、挙げられる。
Birrenら,Genome Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)において、見出され得る。Vol.3,Chapter5(本明細書中で、参考として援用される)を参照のこと。
本発明はまた、ヒトλ軽鎖遺伝子座を、非ヒト宿主細胞および非ヒト動物に導入する方法も、提供する。ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を有するYACは、酵母スフェロプラスト:ES細胞融合、微小注入実験およびリポフェクションなどの種々の方法により、宿主細胞(例えば、ES細胞または卵細胞)に導入され得る。例えば、実施例3およびBirrenら(既出)pp.546−550を、参照のこと。好ましい実施形態において、本発明は、目的のYACを含む酵母細胞が、ES細胞と融合する方法を提供する。ES細胞へのYACの導入の後、細胞は、本明細書の以下の教示に従い当該分野に公知の方法を使用して、細胞のゲノムへのYACの組込みについて、選択されるか、またはスクリーニングされる。
選択およびスクリーニングの後、ES細胞は、本発明のトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。後述の実施例3を参照のこと。一実施形態において、宿主動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ウマ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはモルモットから選択されるトランスジェニック動物である。好ましい実施形態において、宿主動物は、マウスである。別の実施形態において、宿主動物は、動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座において1つ以上の遺伝的損傷を含む、トランスジェニック動物である。より好ましい実施形態において、宿主動物は、Xenomouse(登録商標)系統である。
a.融合条件下において、(a)実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分、および選択可能マーカーを含むYACを組込んでいる酵母スフェロプラストと、(b)宿主動物のES細胞を、合わせる工程;
b.選択可能マーカーを組込んでいるES細胞を選択し、それによりヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を選択する工程であって、ここで、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分および選択可能マーカーは、胚幹細胞のゲノム内に組込まれる、工程:
c.選択されたES細胞を、宿主胚盤胞に送達し、この胚盤胞を偽妊娠動物レシピエントに移植する工程;
d.胚盤胞を発生させ、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を有するキメラ動物を産生する工程;および
e. キメラ動物を、同種の動物と交配させ、トランスジェニック動物を産生する工程であって、このトランスジェニック動物が、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分をキメラ動物から受け継いでいる、工程。
組込まれたヒトλ軽鎖遺伝子座を有する宿主動物は、機能する抗体を産生することに関する、必要な酵素および他の因子を提供する。従って、生殖系列再編成、スプライシング、体細胞変異などと関わるこれらの酵素および他の因子は、宿主において働き、実質的に内因性抗体が存在しない状態において、完全なトランスジェニック抗体を、作製する。
本発明のトランスジェニック動物、またはこれに由来するBリンパ球は、ヒトλ軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体を産生するために、使用され得る。さらに、本発明の動物に由来するBリンパ球は、モノクローナル抗体を産生する細胞株を作製するために使用され得る。一実施形態において、Bリンパ球は、不死化される。不死化は、当該分野で公知の任意の手段によって達成され得る。この手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない:骨髄腫細胞との融合によるハイブリドーマの産生;癌原遺伝子を用いたトランスフェクション;腫瘍ウイルスによる感染;および腫瘍抑制遺伝子の不活性化。不死化細胞は、抗体の産生のために連続的な培養により増殖させられ得るか、あるいは、目的の抗体を含む腹水の産生のために適した宿主動物の腹膜に導入され得る。
a. 本明細書中に記載されるトランスジェニック動物を、目的の抗原を用いて免疫する工程;
b. このトランスジェニック動物において、この抗原に対する免疫応答を誘導する工程;
c. このトランスジェニック動物からBリンパ球を単離する工程;
d. このBリンパ球を不死化する工程;
e. 個々の不死化Bリンパ球のモノクローナル集団を作製する工程;および
f. この不死化Bリンパ球をスクリーニングし、抗原に対する抗体を同定する工程、
を、包含する、方法。
これらの組み合わせで、含まれ得る。従って、一例として、VH遺伝子座、Vκ遺伝子座およびVλ遺伝子座のいずれかの配列部分全体が、使用され得るか、もしくは、VH遺伝子座、Vκ遺伝子座およびVλ遺伝子座における種々のV遺伝子は、全体の配列編成を維持しつつ、省略され得るか、または、VH遺伝子座、Vκ遺伝子座およびVλ遺伝子座におけるV遺伝子は、再配列され得る。好ましい実施形態において、挿入された遺伝子座全体が、実質的に、ヒトにおいて見出されるような生殖系列構造において、提供される。VH遺伝子座、Vκ遺伝子座およびVλ遺伝子座由来の遺伝子の様々な群を含むことは、増大された抗体特異性、および結局は増大された抗体親和性に導く。
本発明は、トランスジェニック動物から単離された核酸分子を提供し、ここで、この単離された核酸分子は、ヒトλ軽鎖ポリペプチドまたはその抗原結合部位をコードする。好ましい実施形態において、この核酸分子は、ヒトλ軽鎖を産生するBリンパ球またはその子孫細胞から単離される。好ましい実施形態において、Bリンパ球の子孫細胞は、ハイブリドーマである。別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、ヒト抗体の1〜3の間のCDR領域をコードする配列を含む。好ましい実施形態において、単離された核酸は、ヒトλ軽鎖ポリペプチドまたは目的の特定の抗原に結合するその抗原結合部分をコードする。
ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の部分および全てのVλおよびCλについてのプローブを含むYACは、Medical Research Center(MRC,Edinburgh,UK)から得た。L1 YACおよびL2 YACを、最初に、以下の目的で分析した:(1)正確なヒト免疫グロブリンλ遺伝子座の存在を確認するため;(2)免疫グロブリンλ遺伝子配列の安定性を評価するため;(3)免疫グロブリンλ遺伝子配列の方向付けの決定するため;(4)YACにおける酵母マーカーの存在を確認するため。
生殖系列ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の全体を単一のYAC上で再構築するため、L2 YAC配列を、L1 YAC配列と、適切な向きで再結合しなければならなかった。λ遺伝子座におけるヌクレオチドに番号をつけるため、完全なヌクレオチド配列(Kawasaki(既出))を使用した。Kawasakiのコンティーグ地図に、Genbank(Awww.ncbi,nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html)からアクセスし、近接の1Mbの核酸配列内に、ベクターNTIソフトウェア(InforMax,North Bethesda,MD)を用いて再集合させた。この配列は、第一Vλ遺伝子の5’およそ125kbを含み、そして3’エンハンサーまでを含む。
第一工程は、L2 YACを、L1 YACとの組換えに適切な、短縮されたアームを含むように、改変する工程であった。図2を参照のこと。本発明者らは、L2 YACの5’末端および3’末端の両方についての標的ベクター(それぞれpYAC−5’およびpYAC−3’)を構築し、115kbのYACを形成した。
L2 YACを含む酵母を、pYAC−5’標的ベクターおよびpYAC−3’標的ベクターを用いて、形質転換させた。酵母を、まずSC−URA液体培地中で24時間、30℃でインキュベートし、次いで、YPDA培地中で4〜5時間、30℃でインキュベートした。細胞を、BamHI直鎖化pYAC−3’およびpYAC−5’由来の5kb BamHI/FseIフラグメント(URAアーム)と同時に、LiAc形質転換手順を使用して、形質転換した。Scheistlら,Curr.Genet.16:339−346(1989)を、参照のこと。形質転換株を、SC−LYS寒天培地上でプレート培養(室温で4〜5日、クローンが出現するまでインキュベートする)した。
YAC6−23を、YPH925株(MATa ura3−52 lys2−801 ade2−101 his3,ATCC #90834)内に送達した。YPH925および6−23YAC(MATa)を、YPDAプレート上で、およそ1cm2のパッチに、30℃で一晩増殖させた。翌朝、これらをYPDAプレート上で合わせ、30℃で6時間、増殖させた。生じた一倍体と二倍体との混合物を、SC−URA−LYS−HISプレートに移した。このプレートは、生じた二倍体ではなく、両一倍体に対する選択を提供する(一倍体中の2つのHIS対立遺伝子の相補性による)。この細胞を、個々のコロニーが現れるまで、2日間30℃でインキュベートした。6つの独立したコロニーを選び出し、YPDAプレート上のおよそ1cm2のパッチで増殖させ、一晩インキュベートし、胞子形成プレート上にレプリカをプレート培養し、そして室温で4〜5日インキュベートした。Birrenら(既出)Vol.3,pp.495−501を、参照のこと。
ES細胞への導入およびトランスジェニックマウスの生殖系列への導入の後に、免疫グロブリンλYACのコピーの数を決定するため、短縮されたbcl−a遺伝子もまた、pYAC−5’の中にクローン化させた。遺伝子を、配列5’−GGGGTATTTGTGGAATTACTT−3’の第一プライマー、および配列5’−CCCATCTGGATTTCTAAGTGA−3’の第二プライマーを使用したマウスDNAのPCR増幅により、得た。PCR増幅された産物を、次いで、pCR2.1クローニングベクターに、クローン化させた。bcl−a遺伝子を含むプラスミドを、次いで、NsiIを用いて切断し、NsiI−NsiIフラグメントを捨て、そしてこのプラスミドを連結させ、173bp bcl−a配列を作製した。pCR2.1における分断されたbcl−a遺伝子の向きを、制限切断分析により、決定した。
非ヒト動物ES細胞を、YACを保有する酵母スフェロプラストと融合させ、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を有するES細胞を作製することは、内因性HPRT機能について陰性であるES細胞における選択のための哺乳類選択可能マーカー(例えば、HPRT)を含むYACにより、容易にされる。従って、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のマウスES細胞への導入の、効果的な検出を支持するYACを作製するため、HPRTをL1 YACに導入するための標的ベクターを、構築した。選ばれた戦略はまた、最も5’側のVλ遺伝子(Vλ1〜Vλ27)の直ぐ上流の、およそ22kbの領域の標的化により、L1 YACの短縮を生じる。ADE選択可能マーカーおよびHPRT選択可能マーカーを含むpREPプラスミド(Mendezら,Genomics 26:294−307(1995))を、BamHIを用いて部分的に切断し、突出末端をKlenowを用いて埋めて平滑末端を作り、再連結させた。消失したBamHI部位を、BamHIおよびNotIを用いた切断により、決定した。ADE2遺伝子およびHPRT遺伝子を、BamHI/NotIカセットとして、pYAC−5’のBamHI/NruI部位にクローン化させた。
完全なヒト生殖系列免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含むYACを、6−23株をHPRTおよびbcl−aを含むL1 YACを含む酵母クローン(上述)と接合させることにより、産生した。酵母細胞を、SC−HIS−LYS−ADE上にプレート培養して一倍体を除去し、そしてクローンを選び出し、PFGEおよびサザンブロット分析により、(実施例1において上で記載したように)解析した。この分析は、両YACが存在することを明らかにし、そして全てのλ遺伝子エレメントが存在することを確認した。完全なヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含むYACの産生のための減数***を誘導するため、胞子形成プレート上で増殖した二倍体を、次いで、SC−ADE−LYS+CYH+CANプレートに移した。Birrenら(既出)Vol.3,pg.495を参照のこと。
酵母クローンのスフェロプラストを、Zymolyase 20T(1.5mg ml−1)を用いて産生し、次いで、3B1ES細胞と融合し、ES/酵母細胞融合体(ESY)を作製した(例えば、Jakovitsら,Nature 362:255−8(1993)およびWO98/24893号において、記載される。これらは両方とも、本明細書中において、参考として記載される)。細胞を、HAT培地を用いて、融合後48時間から、選択を始めた。クローンを選び出し、広げた。ES細胞株を、次いで、サザンブロットによって、ヒトIgλYACの存在および完全性について、上の実施例2において作製されたYACにまたがるプローブを用いて、分析した。
ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子、κ軽鎖遺伝子、およびλ軽鎖遺伝子、ならびに実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスを作製するために、実施例3において記載される方法により作製されたトランスジェニックマウスを、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびκ軽鎖遺伝子を含み、かつ実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を有するマウスと、交配させた。使用され得るマウスとしては、XenoMouse I系統(例えば、Greenら,Nature Genetics 7:13−21(1994)およびWO98/24893を参照)、L6系統(例えば、WO98/24893号を参照)、XenoMouseIIa系統(例えば、WO98/24893号を参照)および認識不能交換領域を含むマウス(例えば、WO00/76310号)が、挙げられる(これらの文献はすべて、参考として援用される)。米国特許第5,939,598号および同第6,162,963号も、参照のこと(両方とも、参考として援用される)。F1世代のマウスは、1リットルの混合された遺伝子型を含んだ。さらなる交配を行い、望ましい遺伝子型を得た。ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子、κ軽鎖遺伝子、およびλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスを、XenoMouse−KLと名付けている。ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスを、XenoMouse−Lと名付けている。
別の実施形態において、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびλ軽鎖遺伝子、インタクトなマウスκ鎖遺伝子またはλ鎖遺伝子、ならびに実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびκ軽鎖遺伝子またはλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスが、作製される。実施例3において記載された方法により作製されたトランスジェニックマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子および実質的に不活性化された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子を含むマウスと、交配させられる。これらのマウスは、例えば、米国特許第5,939,598号および同第6,162,963号に記載される。F1世代のマウスは、1リットルの混合された遺伝子型を含んだ。望ましい遺伝子型を得るために、さらなる交配が行われ得る。
さらにXenoMouse−KLトランスジェニックマウスを特徴付けるため、末梢血液および脾臓リンパ球が、8〜10週齢のマウスおよびコントロールから、単離される。この細胞は、Lympholyte M(Accurate)(San Diego,CA)上で精製され、そして精製された抗マウスCD32/CD16 Fc レセプター(Pharmingen,#553142)(San Diego,CA)で処理され、Fcレセプターへの非特異的結合を遮断される。次に、細胞は、種々の抗体を用いて染色され、FACS Vantage(Becton Dickinson,CELLQuest software)にて分析される。XenoMouse−KL細胞を染色するために使用される抗体のパネルとしては、以下が挙げられる:Cy−5標識ラット抗マウスCD19(Caltag,#RM7706);FITC標識抗ヒトIgM(Pharmingen,#555782);PE標識抗ヒトIgM(PharMingen,#34155X);FITC標識抗ヒトIgλ(PharMingen,#555796);PE標識抗ヒトIgκ(PharMingen,#555792);FITC標識抗マウスIgλ(Pharmingen,#553434)。
ヒト抗体の決定のためのELISAを、非免疫化マウス血清において、行った。免疫アッセイにおけるより詳しい情報および手順については、E.Harlowら,Antibodies:A Laboratory Manual,Capter14,“Immunoassay”,Pages 553−614,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1988)(本明細書中で参考として援用される)を、参照のこと。
(免疫化およびハイブリドーマ産生)
6週齢のXenoMouse G2−κ/λの4匹の群を、組換えヒトMCP−1または107ヒトCEM細胞のどちらかを10μg用いて、足裏において皮下的に免疫化した。6週齢のXenoMouse G1−κ/λの4匹の群を、組換えMN−Fcを10μg用いて、足裏において皮下的に免疫化した。抗原を、最初の免疫化のためにTitermax Gold(Sigma;かt。#T2684)、および追加の免疫のためにalum(リン酸アルミニウムゲルアジュバント;Superfos Biosector a/s,E.M.Sargent Pulp and Chemical Co.,Clifton,NJ,cat#1452−250により、配布される)において、従来技術に従い、乳化した(Harlowら(既出)pages 53−138(本明細書中で参考として援用される)などに記載される)。免疫化を、週に2回ずつ3週間、少なくとも5ブースター免疫(boost)、行った。
並列条件:電圧=50V、時間=50秒
膜破壊:電圧=3000V、時間=30マイクロ秒
融合後保持時間:3秒
電気細胞融合後、細胞懸濁液を、滅菌条件下で融合チャンバから注意深く取り除き、そして同量(またはそれ以上)のハイブリドーマ培地を含む滅菌チューブに移し、15〜30分間、37℃のインキュベーター内でインキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化した。細胞を、少量の1/2強度HA培地中に、穏やかに完全に再懸濁し、96ウェルプレートにつき5×106B細胞、そしてウェルにつき200μlの容量でプレート培養するために、1/2HA培地を用いて、適切な容量に調整した。細胞を、96ウェル内にピペット滴下した。7日目または10日目に、培地100μlをそれぞれのウェルから除き、100μlの1/2HA培地と置換した。あるいは、リンパ球は、ポリエチレングリコール融合を通して、骨髄腫細胞と融合され、上述のように、HAT選択を受け得る(G.Galfreら,Methods Enzymol.73:3−46(1981))。
CD147−Fc(2μg/ml、CEM群について)、MCP−1(2μg/ml)およびMN−his(2μg/ml)を50μl/ウェル用いて、コーティング緩衝液(0.1M カーボネート緩衝液、pH9.6,NaHCO3)中でコートし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、洗浄緩衝液(0.05% Tween 20 PBS中)を用いて、プレートを3回洗浄した。それぞれのウェルに、ブロッキング緩衝液(0.5% BSA、0.1% Tween 20、0.01% チメロサール)を200μl/ウェル加え、そして室温で一時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで、それぞれのプレートに、50μl/ウェルのハイブリドーマ培養上清、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールを加え、室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで、それぞれのプレートに、100μl/ウェルの検出抗体GT抗huIgGfc−HRP(Caltag,Act.#H10507)を加え、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで、それぞれのプレートに、100μl/ウェルの現像液(10ml 基質緩衝液、1mg OPD(o−フェニルエデジアミン、Sigma Cat No.P−7288)、10μl 30% H2O2(Sigma))を加えた(この溶液は使用前に新しく作った)。反応を10分間進め(コントロールウェルが辛うじて色を呈し始めるまで)、次いで、50μl/ウェルの停止液(2M H2SO4)を、加えた。OD値を、ELISAプレートリーダー上で、波長492nmで読んだ。
ゲノムDNAを、ES細胞株および3B1細胞株から、Gross−Bellardら(Gross−Bellard,M.,Oudet,P.,およびChambom,P.,Isolation of high molecular weight DNA from mammalian cells Eur.J.Biochem.36:32−38(1973))の方法に従ったフェノール/クロロホルム抽出によって、調製した。XenoMouse系統由来のゲノムDNAを、QIAGEN DNeasy 96 tissue kit(QIAGEN Cat.No.69582)を使用して、尾の断片から抽出した。それぞれのサンプルの10μgを、EcoRI(Vλプローブを用いたハイブリダイゼーション用)、PvuIIおよびPstI(Cλプローブ用)およびSacI(λ3’エンハンサープローブ用)を用いて切断した。切断されたDNAのサンプルを、0.7%アガロースゲル(SEAKEM ME,FMC)上で、0.5×Tris/ホウ酸塩/EDTA(TBE)緩衝液中で、16時間泳動した。DNAをGENESCREEN(NEN Life Science)ナイロンメンブレンに、標準的アルカリトランスファー法により、トランスファーした。DNAプローブ(以下で示される)を、High Prime kit(Roche Cat.No.1585592)を使用して放射性標識した。ハイブリダイゼーションを、65度で時間行った。低ストリンジェンシー洗浄を、65℃で1×SSC、0.1%SDS溶液を使用して、1時間行った。2回の高ストリンジェンシー洗浄を、0.1×SSC、0.1%SDS中で、65℃で行った。洗浄したメンブレンを、−70℃で、裏に増感紙をあて、X線フィルム(Eastman Kodak,Rochester,NY)に晒した。
XenoMouse KLを、種々の抗原を用いて免疫化した。XenoMouseにより産生された抗体を、特徴付け、どの抗体がκ軽鎖を有するか、およびどの抗体がλ軽鎖を有するかを、決定した。産生された種々の抗体におけるκ軽鎖とλ軽鎖の比率は、XenoMouseによって産生された抗体において、およそ60:40であると予想される。なぜなら、ヒトにおいて、およそ40%の抗体がλ軽鎖を含み、60%の抗体が、κ軽鎖を含むためである。驚くべきことに、幾つかの抗原およびXenoMouse系統について、Igλが、いくつかの免疫応答を支配していた。表3(Igλ優性応答を太字で示す)を、参照のこと。
Claims (81)
- V領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物。
- ヒトλ軽鎖遺伝子座の一部分を含むトランスジェニック動物であって、該一部分が、該遺伝子座の少なくとも500kbを含む、トランスジェニック動物。
- 前記動物が実質的に不活性化された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合またはホモ接合である、請求項1または2に記載のトランスジェニック動物。
- 前記動物が実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合またはホモ接合である、請求項1または2に記載のトランスジェニック動物。
- 前記動物が実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合またはホモ接合である、請求項1または2に記載のトランスジェニック動物。
- 前記動物がさらにヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、該遺伝子座がV領域遺伝子、D領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子またはそれらの一部分を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記動物がさらにヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、該遺伝子座がV領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子またはそれらの一部分を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記ヒトλ軽鎖遺伝子座が前記トランスジェニック動物によって発現され得る、請求項1〜7のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記トランスジェニック動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記トランスジェニック動物がマウスである、請求項1〜9のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記トランスジェニック動物が、前記ヒトλ軽鎖遺伝子座をVJ組換えのために標的化する、請求項1〜10のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が前記トランスジェニック動物によって発現され得る、請求項6に記載のトランスジェニック動物。
- 前記ヒトκ遺伝子座が前記トランスジェニック動物によって発現され得る、請求項7に記載のトランスジェニック動物。
- 前記ヒトλ遺伝子座が発現に効果的である、請求項1〜13のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記実質的に不活性化された内因性遺伝子座が、遺伝子損傷導入の結果である、請求項3〜5のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記遺伝子損傷が前記内因性遺伝子座のJ領域内である、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
- 前記内因性軽鎖遺伝子座の前記実質的不活性化が、遺伝子損傷を該内因性軽鎖遺伝子座の定常領域内に含む、請求項4〜5のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記ヒトλ軽鎖遺伝子座が600kbと0.9Mbとの間である、請求項2に記載のトランスジェニック動物。
- 前記ヒトλ軽鎖遺伝子座が700kbと0.9Mbとの間またはそれ以上であり、かつ完全なヒトIgλ遺伝子座を含む、請求項2に記載のトランスジェニック動物。
- 前記ヒトλ軽鎖遺伝子座が800kbと0.9Mbとの間またはそれ以上であり、かつ完全なヒトIgλ遺伝子座を含む、請求項2に記載のトランスジェニック動物。
- トランスジェニック動物であって、以下:
a. 実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座;
b. 実質的に不活性化された内因性κ軽鎖遺伝子座;
c. V領域遺伝子、D領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、ヒト重鎖遺伝子座;
d. V領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、ヒトκ軽鎖遺伝子座;および
e. V領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座;
を、含むトランスジェニック動物。 - 請求項21に記載のトランスジェニック動物であって、再構築された一次Bリンパ球および二次リンパ球の集団をさらに含み、ここで、該集団のレベルが、野生型動物のレベルの5〜20%、野生型動物のレベルの20〜40%、野生型動物のレベルの40〜60%、野生型動物のレベルの60〜80%、野生型動物のレベルの80〜100%、および野生型動物のレベルの100〜200%からなる群から選択される、トランスジェニック動物。
- トランスジェニック動物由来の抗原に対するヒト抗体を含む抗血清を産生する方法であって、該方法は、以下:
a. 請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物を、該抗原を用いて免疫する工程;
b. 該トランスジェニック動物において、該抗原に対する免疫応答を誘導する工程;および
c. 該トランスジェニック動物から血清を回収する工程、
を、包含する、方法。 - トランスジェニック動物由来の抗原に対するヒト抗体を単離する方法であって、該方法は、以下:
a. 請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物を、該抗原を用いて免疫する工程;
b. 該トランスジェニック動物において、該抗原に対する免疫応答を誘導する工程;
c. 該トランスジェニック動物から血清を回収する工程;および
d. 該トランスジェニック抗体を該血清から精製する工程、
を、包含する、方法。 - 請求項24の方法により得られる抗体であって、該抗体が1×10−7M、1×10−8M、1×10−9M、1×10−10M、1×10−11M、1×10−12Mおよび1×10−13M、からなる群から選択される値より低い、解離定数を有する、抗体。
- 抗原に対するヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントを産生する細胞株を産生する方法であって、該方法は、以下:
a. 請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物を、該抗原を用いて免疫する工程;
b. 該トランスジェニック動物において、該抗原に対する免疫応答を誘導する工程;
c. 該トランスジェニック動物からBリンパ球を単離する工程;
d. 該Bリンパ球を不死化する工程;
e. 個々の該不死化Bリンパ球のモノクローナル集団を作製する工程;および
f. 該不死化Bリンパ球をスクリーニングし、該抗原に対する抗体を同定する工程、
を、包含する、方法。 - 前記不死化細胞が、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、サル細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、モルモット細胞、または鳥細胞の由来である、請求項26に記載の方法。
- 請求項26または請求項27に記載の方法により産生される、単離されたモノクローナル抗体。
- 請求項1〜27のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物に由来する、一次細胞またはその子孫細胞。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物に由来する、不死化細胞またはその子孫細胞。
- 請求項29または請求項30に記載の不死化細胞またはその子孫細胞であって、該不死化細胞がBリンパ球起源の細胞である、不死化細胞またはその子孫細胞。
- 請求項31に記載の不死化細胞またはその子孫細胞であって、該不死化細胞がハイブリドーマである、不死化細胞またはその子孫細胞。
- V領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座を含む、トランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが、該ヒトλ軽鎖遺伝子座をVJ組換えのために標的化し、そして、ここで該トランスジェニックマウスが、該ヒトλ軽鎖遺伝子座を発現し得る、トランスジェニックマウス。
- ヒトλ軽鎖遺伝子座の一部分を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該一部分が該遺伝子座の少なくとも500kbを含み、ここで、該トランスジェニックマウスが、該ヒトλ軽鎖遺伝子座をVJ組換えのために標的化し、そして、ここで該トランスジェニックマウスが、該ヒトλ軽鎖遺伝子座を発現し得る、トランスジェニックマウス。
- トランスジェニック動物を産生する方法であって、該方法は、以下:
a. (1)YACが組み込まれた酵母スフェロプラストであって、該YACは、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座または該ヒトλ軽鎖遺伝子座の少なくとも500kbを含むその一部分、および選択可能なマーカーを含む、酵母スフェロプラストを、(2)宿主動物の胚幹細胞と融合条件下で合わせる工程であって、それによって該ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分および選択可能なマーカーが該胚幹細胞のゲノム中に組み込まれる、工程;
b. 該選択可能マーカーが組み込まれた胚幹細胞を選択する工程であって、それにより、該ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその一部分を含む細胞を選択する工程;
c. 該選択された胚幹細胞を宿主胚盤胞内に送達し、該胚盤胞を偽妊娠動物レシピエントに移植する工程;
d. 該胚盤胞を発生させ、該ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を有するキメラ動物を産生する工程;および
e. 該キメラ動物を、同種の動物と交配させ、該キメラ動物から該ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分が遺伝した該トランスジェニック動物を産生する工程、
を、包含する、方法。 - 前記選択可能マーカーが、HPRT遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、fl−gal、またはGPTである、請求項35に記載の方法。
- 前記胚幹細胞が、内因性重鎖、κ軽鎖および/またはλ軽鎖の発現を欠損する、請求項35に記載の方法。
- 前記交配させる工程が、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分についてヘテロ接合のトランスジェニック動物を産生し、そして該ヘテロ接合動物が、ヒトλ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合の別のトランスジェニック動物と交配され、ヒトλ軽鎖遺伝子座についてホモ接合のトランスジェニック動物を産生する、請求項35に記載の方法。
- 前記YACが、600kbと0.9Mbとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記YACが、700kbと0.9Mbとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記YACが、800kbと0.9Mbとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む、請求項35に記載の方法。
- 請求項35〜41のいずれか1項に記載の方法によって産生されるトランスジェニック動物。
- 前記トランスジェニック動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥からなる群から選択される、請求項42に記載のトランスジェニック動物。
- 実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を含む非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞であって、該部分が、該ヒトλ軽鎖遺伝子座の少なくとも500kbを含む、非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 請求項44に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞であって、さらに、該非ヒト胚幹細胞または該その子孫細胞の1つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子座のJ領域および/または定常領域において、
遺伝的損傷を含む、非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。 - 前記遺伝的損傷がヒト免疫グロブリン配列の挿入である、請求項45に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 前記遺伝的損傷が、選択可能マーカー遺伝子により、1つ以上の前記内因性免疫グロブリン遺伝子座の標的化された破壊から生じる、請求項45に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 前記選択可能マーカー遺伝子が、HPRT遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、fl−gal、またはGPTである、請求項47に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 前記遺伝的損傷が1つ以上の前記内因性免疫グロブリン遺伝子座の欠失を含む、請求項45に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 前記幹細胞またはその子孫細胞が前記遺伝的損傷についてホモ接合である、請求項46に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 前記遺伝的損傷が免疫グロブリン重鎖J領域内である、請求項46に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 前記遺伝的損傷が、相同組換えによる、前記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部分の、前記実質的に完全なヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座との置換を含む、請求項46に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 前記非ヒト胚幹細胞または前記その子孫細胞の、免疫グロブリン遺伝子座の内因性の両コピーにおける遺伝的損傷を含み、該遺伝的損傷が、該免疫グロブリン遺伝子座の両コピーの再編成不能を生じる、請求項46に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
- 一次親と二次親を交雑させる工程、およびその子孫を回収する工程を包含する、トランスジェニック動物を産生する方法であり、ここで、該一次親が、以下:
a. 実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座;
b. 実質的に不活性化された内因性κ軽鎖遺伝子座;
c. V領域遺伝子、D領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含むヒト重鎖遺伝子座;および
d. V領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含むヒトκ軽鎖遺伝子座、
を、含み、ここで、該二次親が、V領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座を含み、ここで、該子孫が、以下:
a. 実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座;
b. 実質的に不活性化された内因性κ軽鎖遺伝子座;
c. V領域遺伝子、D領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含むヒト重鎖遺伝子座;
e. V領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含むヒトκ軽鎖遺伝子座;および
f. V領域遺伝子、J領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座、
を、含む、トランスジェニック動物を産生する方法。 - 請求項54に記載の方法により産生される、トランスジェニック動物。
- 前記トランスジェニック動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である、請求項54に記載の方法により産生されるトランスジェニック動物。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物から単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、ヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする、核酸分子。
- 請求項57に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、前記ヒトλ軽鎖を産生するBリンパ球またはその子孫細胞から単離された、核酸分子。
- 前記Bリンパ細胞の前記子孫細胞がハイブリドーマである、請求項58に記載の単離された核酸分子。
- 請求項57に記載の単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、前記ヒト抗体の1〜3の間のCDR領域を、コードする配列を含む、核酸分子。
- 請求項57〜60のいずれか一項に記載の核酸分子またはそのフラグメントを含む、ベクター。
- 請求項61に記載のベクターであって、該ベクターが、前記核酸分子に作動可能に連結された発現制御配列をさらに含む、ベクター。
- ヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物から単離された核酸分子であって、ここで、該軽鎖が、目的の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖である、核酸分子。
- 請求項63に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、前記ヒトλ軽鎖または前記その抗原結合部位を産生するBリンパ球またはその子孫細胞から単離された、核酸分子。
- 請求項64に記載の単離された核酸分子であって、前記Bリンパ球の前記子孫細胞がハイブリドーマである、核酸分子。
- 請求項63に記載の単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、前記ヒト抗体の1〜3の間のCDR領域を、コードする配列を含む、核酸分子。
- 請求項63〜66のいずれか1項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項67に記載のベクターであって、該ベクターが、さらに前記核酸に作動可能に連結された発現制御配列を含む、ベクター。
- 単離された宿主細胞であって、該細胞は、以下:
a) ヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする、請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物から単離された核酸分子であって、ここで、該軽鎖が、目的の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖である、核酸分子;または
b) 該核酸分子を含むベクター、
を、含む、細胞。 - 単離された宿主細胞であって、該細胞は、以下:
a) ヒト重鎖またはその抗原結合部位およびヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする、請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物から単離された核酸分子であって、ここで、該重鎖および該軽鎖が、目的の抗原に特異的に結合する抗体を形成する、核酸分子;または
b) 該核酸分子を含むベクター、
を、含む、細胞。 - 請求項69または請求項70に記載の単離された細胞であって、該細胞が、ハイブリドーマ細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、および哺乳類細胞からなる群から選択される、細胞。
- 請求項71に記載の細胞であって、該哺乳類細胞が、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、サル細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、モルモット細胞、または鳥細胞である、細胞。
- 請求項71に記載の細胞であって、該哺乳類細胞が、HeLa細胞、NIH 3T3細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞、VERO細胞、CV−1細胞、NS/0細胞、またはCOS細胞である、細胞。
- トランスジェニックマウスから同定され、そして目的の抗原に特異的に結合する、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖もしくはその抗原結合部位、または該ヒト免疫グロブリンλ軽鎖もしくはその該抗原結合部位およびヒト免疫グロブリン重鎖もしくはその抗原結合部位の両方を、組換え的に産生する方法であって、請求項69〜73のいずれか1項に記載の宿主細胞を、前記核酸分子が発現する条件下で培養する工程を包含する、方法。
- 請求項63に記載の核酸分子を含む、非ヒトトランスジェニック動物であって、該非ヒトトランスジェニック動物が該核酸分子を発現する、トランスジェニック動物。
- 目的の抗原に特異的に結合するヒト抗体の、免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合部位をコードする単離された核酸分子、および免疫グロブリンλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする単離された核酸分子を含む、非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物が該核酸分子を発現する、トランスジェニック動物。
- 請求項75〜76のいずれか1項に記載の非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である、トランスジェニック動物。
- 請求項75〜76のいずれか1項に記載の非ヒトトランスジェニック動物であって、前記単離された核酸分子またはその部分の発現から生じるヒト抗体が、該動物のBリンパ球細胞またはその子孫細胞由来の細胞の表面上で発現する、トランスジェニック動物。
- 請求項75〜76のいずれか1項に記載の非ヒトトランスジェニック動物であって、前記単離された核酸分子またはその部分の発現から生じるヒト抗体が、該動物のリンパ液、血液、乳、唾液、または腹水に分泌される、トランスジェニック動物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物であって、該トランスジェニック動物の集団の少なくとも95%が、少なくとも3世代にわたってヒトλ軽鎖遺伝子座を維持する、トランスジェニック動物。
- 請求項21に記載のトランスジェニック動物であって、該トランスジェニック動物の集団の少なくとも95%が、少なくとも3世代にわたって、前記ヒトλ軽鎖遺伝子座、該ヒトλ軽鎖遺伝子座および前記ヒト重鎖遺伝子座を維持する、トランスジェニック動物。
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