JP2005137376A - マクロカプセル化分泌腺細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、親水性ゲル剤中における分泌腺細胞のマクロカプセル化、マクロカプセル化された分泌腺細胞を使用する治療法、およびマクロカプセル化による分泌腺細胞の保存に関する。
【選択図】 図1
Description
従って、本発明の課題は、宿主の分泌腺細胞の機能劣化によって発生した状態を治療するため、動物に移植可能な分泌腺細胞マクロビードを提供することにある。
図1及び図2は、アガロース被覆アガロース−コラーゲン脾臓島マクロビードを示す。
図3は、アガロース被覆アガロース−コラーゲン脾臓島マクロビードを移植された糖尿病のマウスのグルコースレベルを示す。
図4は、アガロース被覆ゲル状脾臓島マクロビードを移植された糖尿病のマウスのグルコースレベルを示す。
図5は、アガロース被覆アガロース・マクロビードを移植された糖尿病のマウスのグルコースレベルを示す。
図6は、フリーな脾臓島を移植された糖尿病のマウスのグルコースレベルを示す。
図7は、アガロース被覆アガロース−コラーゲン脾臓島マクロビードとフリーな脾臓島とを移植された糖尿病のマウスのグルコースレベルを示す。
図8は、正常マウスと、ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスと、腎臓カプセルにおいて他家移植を受けたストレプトゾトシン誘発糖尿病マウス”(KCTマウス)”と、アガロース被覆アガロース−コラーゲン分泌腺細胞マクロビードと、アガロース被覆ゲル状分泌腺細胞マクロビードと、アガロース被覆アガロース分泌腺細胞マクロビードとを受けたストレプトゾトシン誘発糖尿病マウス(これらを”ビード・マウス”と総称する)とのグルコース許容度を示す。
本発明は、生物学的剤、及び、好ましくは、親水性ゲル状材中における分泌腺細胞のマクロカプセル化、前記マクロカプセル化された、好ましくは分泌腺細胞である生物学的剤を使用する治療方法、そして、マクロカプセル化による分泌腺細胞の保存とに関する。前記親水性ゲル材は、アガロース、コラーゲン−アガロースの組合せ、及びゼラチン・スポンジアガロースを含む。以下、ゼラチン・スポンジをゲルフォームという。
脾臓島の分離
ゴトウ等、Transplantation 40:437(1985)に記載されている方法を改変した方法により、ラットから脾臓島を分離した。
コラーゲナーゼ溶液(コラーゲナーゼ Type XI,Sigma Chemical,セントルイス、MO;2mg/mlのシグマを含有する1mg/ml、Type V、牛血清アルブミンと1mg/mlのCaCl2)をcommon胆管を介して脾臓に注入した(ゴトウ等、Transplantation 40:437(1985)前出)。脾臓を取り出し、氷上に保持したフラスコ中で収集した。4匹のラットからの脾臓が収集されたところで、このフラスコを、38℃の水浴中に30分間載置した。その結果得られた消化組織を、低温(8℃)のHBSS(ハンクの平衡塩溶液)中で4回洗浄した。
A.アガロース被覆アガロース−コラーゲン脾臓島マクロビードの製造
実施例Iの方法によって得た1000の脾臓島を、胎児ウシ血清を除いて実施例Iに記載したものと同じRPMI完全培地中で4回洗浄した。これらの脾臓島を、つぎに、50μlの燐酸緩衝塩類中の1%の不完全コラーゲン溶液を有するチューブに添加して脾臓島を懸濁した。RPMI又はMEM(minimal essential培地)のいずれかにおいて調合され60℃に維持された100ulの1%低粘度アガロース(Sigma Type XII)溶液を、前記コラーゲン−脾臓島懸濁液に添加した。前記チューブの内容物を、つぎに、直ちに、1つの大きなドロップとして、室温に維持された殺菌ミネラル・オイル又はテフロン(登録商標)上に移した。1分間後、前記ドロップは、半固形のマクロビードになり、これを次に、37℃でRPMI抗生物質培地に移した。これらのマクロビードを同じ培地で3回洗浄し、すべてのオイルを除去した。最後に、これらを完全培地(37℃)で2回すすぎ、5%の二酸化炭素を含有する加湿雰囲気中にて37℃で一晩培養した。この時間の間、前記コラーゲンが重合化し、脾臓島がコラーゲンファィバ上に残った。
まず、ゼラチン・スポンジ(ゲルフォーム)の3mm2の小片を、RPMI完全培地中に浸漬した。培地を絞り出し、ゲルフォームを1分間放置した。実施例Iによって製造された1,000の脾臓島を、RPMI抗生物質培地によって4回洗浄した。次に、これらを、10μlのRPMI抗生物質培地中で懸濁した。これらを細先のプラスチック製ピペットで、前記ゲルフォームの表面上に移して、ここで広げた。20秒後、前記ゲルフォームをローリングして球状にした。50μlの5%アガロースを、前記球の表面に注ぎ、脾臓島マクロビードを作った。
実施例Iの方法によって得た1000の脾臓島を、まず、RPMI抗生物質培地中で4回洗浄した。これらの脾臓島を、つぎに、50μlのRPMI抗生物質培地を含むチューブに添加して脾臓島を懸濁した。100μlの1%のアガロース溶液を前記チューブに添加した。このチューブの全内容物を、つぎに、直ちに、1つの大きなドロップとして、殺菌ミネラル・オイル又はテフロン(登録商標)上に移した。1分間後、前記ドロップは、マクロビードに固形化した。このマクロビードを、37℃に維持されたRPMI抗生物質培地に移した。次に、マクロビードを同じ培地で3回洗浄することによってオイルを除去し、更に、RPMI完全培地によって2回すすいだ。これらのビードを、5%の二酸化炭素を含有する加湿雰囲気中にて37℃で一晩培養した。
A.レシピエント・マウス及びドナー・マウス
使用したマウスは、C57BL/6及びBALB/c種であった。レシピエント・マウスを、一回のストレプトゾトシンの注射(170−200mg/kg)によって糖尿病化した。
異種移植時に、実施例II(A),II(B),及びII(C)の脾臓島マクロビードを、夫々、RPMI抗生物質培地を有する別々のプレートにそっと移した。すべての血清タンパク質を除去するため、前記培地を3回取り替えた。糖尿病レシピエント・マウスを、アベルチンによって麻酔した。中線切開によって、1つの脾臓島マクロビードを自由な腹膜腔に導入した。コントロール・マウスは、フリー・ドナー・脾臓島とともに、空のマクロビードi.p.(経腹膜)、フリーな脾臓島i.p.又は空のマクロビートを受け取った。
移植の約70−84日後、グルコース許容度テストを行った。グルコース溶液(体重1kg当り1.0g)を、6時間絶食させた(午前9時から午後3時)マウスに経腹膜注入した。注入の前と後との両方において(0,30,60及び120分間)、血液サンプルを採取して、ExacTech Pen Sensorを使用してプラズマグルコースレベルを測定した。
脾臓島マクロビードの移植直後において、STZ糖尿病ストレプトゾトシン誘発C57B/6マウスの非絶食プラズマグルコースレベルを、図3及び4に示す。アガロース被覆、アガロース−コラーゲン脾臓島マクロビード及びアガロース被覆、ゲルフォーム脾臓島マクロビードのレシピエント・マウスは、60日間以上、正常グリセミック状態を維持し、この期間中、これらのマウスの体重は、平均で3グラム増加した。アガロース被覆、アガロース脾臓島マクロビードを移植した場合、6匹中2匹の動物は、移植後21−33日で正常グリセミック状態になり(図5)、その後、オイグリセミック状態を維持した。その他のすべての移植動物は、オイグリセミック状態を達成することができなかった。空のマクロビード(n=6)は、血液グルコースに影響を与えなかった。
脾臓島の貯蔵期間の延長
完全RPMI培地中で、37℃で4週間培養した実施例I(A),(B)及び(C)によって作ったマクロカプセル化ビードの、生体内および生体外の長期保存性をテストした。その結果、4週間培養されたマクロカプセル化脾臓島は、1日間培養したものと機能的に類似していることが判った。
Claims (23)
- 以下の工程を有する、アガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビードの製造方法、
(a)分泌腺細胞をアガロース中に懸濁させる工程、
(b)前記工程(a)の懸濁分泌腺細胞からマクロビードを形成する工程、
(c)前記工程(b)のマクロビードを加湿空気中にて培養する工程、
(d)前記工程(c)のマクロビードをアガロースで被覆して、アガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビードを得る工程。 - 前記工程(d)は、前記工程(c)の固体マクロビードを5%のアガロース中でローリングする工程と、このローリングされた固体マクロビードをミネラル・オイルに接触させる工程と、前記ローリングされたマクロビードを洗浄して、前記アガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビードを形成する工程とを有する、請求項1の方法。
- 前記分泌腺細胞は、脾臓島である請求項1の方法。
- 前記脾臓島は、ヒト脾臓島である請求項3の方法。
- 前記脾臓島は、ウシ脾臓島である請求項3の方法。
- 前記脾臓島は、ブタ脾臓島である請求項3の方法。
- 前記マクロビードは、約50,000〜約700,000の脾臓島を有している請求項3の方法。
- アガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビード。
- 前記分泌腺細胞は、脾臓島である請求項8のアガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビード。
- 前記脾臓島は、ヒト脾臓島である請求項9のアガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビード。
- 前記脾臓島は、ウシ脾臓島である請求項9のアガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビード。
- 前記脾臓島は、ブタ脾臓島である請求項9のアガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビード。
- 分泌腺細胞の機能劣化によって引き起こされた症状を有する患者を治療するためのアガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビードであって、治療有効量が前記患者に移植される、分泌腺細胞マイクロビード。
- 前記症状は、インスリン依存糖尿病である請求項13の分泌腺細胞マイクロビード。
- 前記分泌腺細胞は、脾臓島である請求項14の分泌腺細胞マイクロビード。
- 前記脾臓島は、ヒト脾臓島である請求項15の分泌腺細胞マイクロビード。
- 前記脾臓島は、ブタ脾臓島である請求項15の分泌腺細胞マイクロビード。
- 前記脾臓島は、ウシ脾臓島である請求項15の分泌腺細胞マイクロビード。
- 前記分泌腺細胞は、腹膜腔に載置される請求項15の分泌腺細胞マイクロビード。
- それぞれが約50,000〜約70,000の脾臓島を有する約5〜約10が挿入される請求項15の分泌腺細胞マイクロビード。
- 以下の工程を有する、分泌腺細胞を保存する方法、
(a)アガロース被覆、アガロース分泌腺細胞マクロビードを形成する工程、
(b)前記分泌腺細胞マクロビードを培養する工程。 - 前記分泌腺細胞は、脾臓島である請求項21の方法。
- 前記脾臓島は、24℃又は37℃で培養される請求項22の方法。
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