JP5140313B2 - 組換え微生物 - Google Patents
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Description
、安定に生存が可能であるため、枯草菌の例のような多くの代謝関連遺伝子を必ずしも必要としないものと考えられる。
Kunst,F.,et al.,Nature,390,249-256,1997
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示したptsG-AFとptsG-A/CmR、及びptsG-B/CmFとptsG-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のptsG遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(A)、及び下流に隣接する1.0kb断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194(J.Bacteriol.,158,543,1984)を鋳型とし、表2に示したCmFWとCmRVのプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.9kb断片(C)を調製した。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、ptsG-AFとptsG-BRのプライマーを用いてSOE−PCRを行ない、3断片を(A)-(C)-(B)の順になる様に結合させ、2.9kbのDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに、得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってptsG遺伝子の構造遺伝子(ORF)内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された、目的とする遺伝子不活性化株であることを確認した。
一方、実施例1と同様にして表2に示したプライマーセット(遺伝子名-AFと遺伝子名-A/CmR、遺伝子名-B/CmFと遺伝子名-BR、CmFWとCmRV)を用いて欠失用DNA断片を調製し、ゲノム上のargH遺伝子(BG12571)、asnO遺伝子(BG12240)、asnH遺伝子(BG11116)、proJ遺伝子(BG12658)、rocA遺伝子(BG10622)、rocF遺伝子(BG10932)、rocG遺伝子(BG10621)、sucC遺伝子(BG12680)、sucD遺伝子(BG12681)の一部がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換した、或いは構造遺伝子(ORF)内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された、目的とする遺伝子欠失株(不活性化株)を作製した。さらに、得られた変異株が目的とする遺伝子欠失株(不活性化株)であることを実施例1と同様の方法にて確認した。
実施例1〜2にて得られた各遺伝子欠失株、遺伝子不活性化株及び対照として枯草菌168株に、Bacillus属細菌 KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)をコードするDNA断片(3.1kb)が、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた形質転換株を5mLのLB培地で30℃にて15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6mLを30mLの2xL−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を、上記特許文献に記載の方法、またはp-nitrophenyl-β-cellotrioside(生化学工業)を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度(420nm)の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表3に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株、不活性化株を用いた場合、対照の168株(野生型)の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
実施例1〜2にて得られた各遺伝子欠失株、遺伝子不活性化株及び対照として枯草菌168株に、Bacillus clausii KSM-K16株(FERM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,43,473,1995)をコードするDNA断片(1.3kb)が、Bacillus属細菌 KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)のプロモーター領域をコードするDNA断片(0.6kb)の下流に連結したDNA断片を、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI−BglII制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法にて導入した。これによって得られた形質転換株を実施例3で示した条件にて培養を行ない、培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を上記文献記載の方法、またはSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide(ペプチド研究所)を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度(420nm)の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。この結果、表4に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株、不活性化株を用いた場合、対照の168株(野生型)の場合と比較して高いアルカリプロテアーゼの分泌生産が認められた。
Claims (8)
- 枯草菌遺伝子sucC、sucD、asnO若しくはargHのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか1以上の遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
- 微生物がバチルス属(Bacillus)細菌である請求項1記載の組換え微生物。
- バチルス(Bacillus)属細菌が枯草菌(Bacillus subtilis)である請求項2記載の組換え微生物。
- 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域のいずれか1以上の領域を結合した請求項1〜3のいずれか1項記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域を結合した請求項4記載の組換え微生物。
- 分泌シグナル領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項4又は5記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である請求項4〜6のいずれか1項記載の組換え微生物。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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