JP2008200004A - 組換え微生物 - Google Patents
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Abstract
生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法の提供。
【解決手段】微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入し、且つabrB遺伝子、dltA遺伝子、dltB遺伝子、dltC遺伝子、dltD遺伝子、dltE遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子を欠失又は不活性化してなる微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【選択図】なし
Description
さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168(非特許文献1)、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655(非特許文献2)、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。
しかしながら、上記のような取り組みにも関わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではない。
しかしながら、かかる微生物では、1菌体当たりに導入される複数個のプラスミドの個数を制御するのが困難であり、また生産培養中にプラスミドの脱落がしばしば起こるという問題があり、実用的ではない。
更に前記報告において、prsA遺伝子断片を挿入したクローニングベクターpHP13は枯草菌プラスミドpTA1060の複製機能を含んでおり(非特許文献4)、pTA1060の枯草菌1ゲノム当たり、つまり1菌体当たりにおけるコピー数は平均5.2であることが報告されている(非特許文献5)。
すなわち、前記報告における目的タンパク質の増加量は野生株の生産量の1〜5倍であることから、導入したprsA遺伝子1個あたりの生産増加量は野生株生産量の約0.2〜1倍であり、充分な効果が得られているとは言えない。
また、dltA、dltB、dltC、dltD、dltEの各遺伝子は同一オペロンに属しており、細胞壁及び細胞膜中に存在するテイコ酸へのD-アラニン付加に関与することが知られている。また、その機能の阻害によりタンパク質の分泌が改善されることが報告されている(非特許文献8〜10)。
Nature,390,249,1997 Science,277,1453,1997 Mol. Microbiology, 8,:727 (1993) Mol. Gene. Genet., 209:335 (1987) Plasmid, 18:8 (1987) Mol. Microbiol., 7:337 (1993) Cell Mol. Life Sci., 59:392 (2002) J. Biol. Chem., 270:15598 (1995) Microbiology, 145:3409 (1999) Appl. Environ. Microbiol., 68:227 (2002)
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開(http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
なお、ここで、配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、1若しくは数個、好ましくは1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
なお、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、prsA遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に同じ機能を有し、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有すると考えられるタンパク質をいう。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。
ここで用いる導入用DNA断片は、親微生物ゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片(以下、断片(1))と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片(以下、断片(2))の間に、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片(以下、断片(3))、prsA遺伝子断片(以下、断片(4))、及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片(以下、断片(5))を挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片(1)〜断片(5)の5断片を調製する。
この際、例えば、断片(1)の下流末端に断片(3)の上流側10〜30塩基対配列、断片(4)の上流末端に断片(3)の下流側10〜30塩基対配列、断片(4)の下流末端に断片(5)の上流側10〜30塩基対配列、更に断片(2)の上流側に断片(5)の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる(図1)。
斯かる遺伝子の欠失又は不活性化は、上記各遺伝子単独の欠失又は不活性化でもよいし、2種以上を組み合わせてもよい。また当該遺伝子以外の遺伝子の強化や欠失又は不活性化を併せて行っても良い。尚、遺伝子の欠失や不活性化には、当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。
本発明の欠失又は不活性化される好適な遺伝子として、abrB遺伝子、dltB遺伝子、dltD遺伝子若しくはdltABCDE遺伝子群又はこれらに相当する遺伝子若しくは遺伝子群が挙げられる。
また、枯草菌においてdltA、dltB、dltC、dltD、dltEの各遺伝子は同一オペロンに属しており、細胞壁及び細胞膜中に存在するテイコ酸へのD-アラニン付加に関与する遺伝子である。
枯草菌のabrB遺伝子、dltA遺伝子、dltB遺伝子、dltC遺伝子、dltD遺伝子、dltE遺伝子の遺伝子番号及び機能を表4にまとめて示した。
が、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。
例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株(FERM BP-7875)、KSM-64株(FERM BP-2886)由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号5で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、又は配列番号7で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。
さらに、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開(http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
次いで調製したコンピテントセル懸濁液(SPII培地における培養液)100μLに各種DNA断片を含む溶液(SOE−PCRの反応液等)5μLを添加し、37℃で1時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、1.5%寒天)に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするPCRによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法(J. Bacteriol. 93, 1925 (1967))、エレクトロポレーション法(FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))のいずれかによって行った。
以下の様に、prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った(図2参照)。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Em2-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片(A)、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片(B)をPCRにより増幅した。またプラスミドpMUTIN4(Microbiology. 144, 3097 (1998))を鋳型として、表1に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン(Em)耐性遺伝子を含む1.3kb断片(C)をPCRにより増幅した。
次いで、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表1に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を(A)(B)(C)の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し(spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結)、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片(D)を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Em2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片(E)、及びamyE遺伝子の3’側領域を含む1.0kb断片(F)をPCRにより増幅した。
次いで、得られた(E)(F)(D)3断片を混合して鋳型とし、表1に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を(E)(D)(F)の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.3kbのDNA断片(G)を得た。
得られた4.3kbのDNA断片(G)を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン(1μg/mL)とリンコマイシン(25μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示すamyEfw2とprsA/Em2-R、及びprsA/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.4kb及び3.3kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をprsA-Ka株と命名した。
実施例1にて得られたprsA-Ka株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-K38株(FERM BP-6946)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ(特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001)をコードする配列番号3で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片(H)を増幅した。またバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片(I)を増幅した。
次いで、得られた(H)(I)の2断片を混合して鋳型とし、表1に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片(J)を得た。得られた2.2kbのDNA断片(J)をシャトルベクターpHY300PLK(ヤクルト)のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
実施例1にて得られたprsA-Ka株及び対照として枯草菌168株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの15ppmテトラサイクリンを含む2xL−マルトース培地に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。
培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。培養上清中のアミラーゼの活性測定にはリキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素):R2(アミラーゼ基質)=5:1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
図3に基づいて、ゲノム中abrB遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法を説明する。尚、abrB遺伝子は対数増殖期から定常期へと移行する間の遷移期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得等に関与する様々な遺伝子発現の制御に重要な役割を果たす転写因子をコードする。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したabrB-FW及びabrB/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のabrB遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(A)をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、abrB/Cm-F及びabrB-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のabrB遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片(B)をPCRにより増幅した。
さらに、プラスミドpC194 DNAを鋳型とし、表1に示したcatf及びcatrのプライマーセットを用いて、0.85kbのクロラムフェニコール(Cm)耐性遺伝子領域(C)をPCRにより調製した。
次に、図3に示すように、得られた1.0kb断片(A)、1.0kb断片(B)及びCm耐性遺伝子領域(C)の3断片を混合して鋳型として、表1に示したabrB-FW2及びabrB-RV2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片(A)、Cm耐性遺伝子領域(C)、1.0kb断片(B)の順に含まれる2.8kbのDNA断片(D)を得た。
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片(D)を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール(10μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってabrB遺伝子がCm耐性遺伝子に置換していることを確認した。
以上のようにして、abrB遺伝子欠失株(ΔabrB株)を構築した。また上記形質転換における168株に替えて実施例1にて構築したprsA-Ka株を用いることにより、prsA-Ka株ゲノム中のabrB遺伝子をCm耐性遺伝子にて置換した菌株(prsAKΔabrB株)を構築した。
実施例3に示したabrB遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、168株ゲノム中のdltB遺伝子、dltD遺伝子、及びdltABCDE遺伝子群のクロラムフェニコール耐性遺伝子による置換を行い、dltB遺伝子欠失株(ΔdltB株)、dltD遺伝子欠失株(ΔdltD株)、及びdltABCDE遺伝子群欠失株(ΔdltA-E株)を構築した。各菌株の構築には表1に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔabrB株の構築に用いたプライマーとの対応を表3に示した。尚、dltA、dltB、dltC、dltD、dltEの各遺伝子は同一オペロンに属しており、細胞壁及び細胞膜中に存在するテイコ酸のテイクロン酸への変換に関与することが知られている。各遺伝子の機能を表4に示した。
実施例3及び4にて構築した菌株に、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を導入し、得られた菌株を10mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養後、培養液0.05mLを50mLの15ppmテトラサイクリンを含むCSL発酵培地に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。
尚、対照として枯草菌168株及び実施例1にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。
培養後の培養液上清中のアミラーゼアルカリアミラーゼ活性を測定したところ、図4に示した様に、prsAKΔabrB株及びprsAKΔdltA-E株においてprsA-Ka株より高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、それぞれの株のprsA-Ka株に対する生産量の増加(図4の斜線部分に相当)は、ΔabrB株、ΔdltB株、ΔdltD株、及びΔdltA-E株の各々で示された枯草菌168株に対する生産量増加(図4の黒塗りで示す部分に相当)より顕著であった。即ち、prsAKΔabrB株及びprsAKΔdltA-E株では、prsA遺伝子発現強化と各々の遺伝子(群)欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。
バチルス セレウス(Bacillus cereus)由来のprsA遺伝子(配列番号55)は、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子である。実施例1の方法と同様の方法にて、バチルス セレウス(Bacillus cereus)由来prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った。
すなわち、バチルス セレウス(Bacillus cereus)から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したBce/PVG-FとBce/emf2-Rのプライマーセットを用いてバチルス セレウス(Bacillus cereus)由来prsA遺伝子を含む0.9kb断片(A)をPCRにより増幅した。また実施例1にて構築したprsA-Ka株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したamyEfw2とPVG-R、及びemf2とamyErv2のプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む領域が連結した1.2kb断片(B)、及びエリスロマイシン耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3’側領域が連結した2.3kb断片(C)をPCRにより増幅した。
次いで、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表1に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を(B)(A)(C)の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にバチルス セレウス(Bacillus cereus)由来prsA遺伝子が連結し、更にその下流にエリスロマイシン耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.3kbのDNA断片(D)を得た。得られた4.3kbDNA断片(D)を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsAbc-K株を構築した。
次いで、実施例3と同様の方法にて、prsAbc-K株のゲノム上よりabrB遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換したprsAbcKΔabrB株を構築した。
構築した上記prsAbc-K株及びprsAbcKΔabrB株について、実施例2と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株とΔabrB株についても評価を行った。
Claims (11)
- 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入し、且つabrB遺伝子、dltA遺伝子、dltB遺伝子、dltC遺伝子、dltD遺伝子、dltE遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子を欠失又は不活性化してなる微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
- 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が、枯草菌のspoVG遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子由来のものである請求項1項記載の組換え微生物。
- abrB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化するものである請求項1又は2記載の組換え微生物。
- dltB遺伝子、dltD遺伝子若しくはdltABCDE遺伝子群又はこれらに相当する遺伝子若しくは遺伝子群を欠失又は不活性化するものである請求項1又は2記載の組換え微生物。
- 微生物がバチルス(Bacillus)属細菌である請求項1〜4のいずれか1項記載の組換え微生物。
- バチルス(Bacillus)属細菌が枯草菌(Bacillus subtilis)である請求項5記載の組換え微生物。
- 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シグナル領域のいずれか1以上の領域を結合した請求項1〜6のいずれか1項記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域を結合した請求項7記載の組換え微生物。
- 分泌シグナル領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項7又は8記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号5で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号7で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である請求項7〜9のいずれか1項記載の組換え微生物。
- 請求項1〜10のいずれか1項記載の組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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