KR101187726B1 - Method for measuring protein's concentration in cell solution - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모든 종류의 단백질에 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 단일 분자 수준에서 측정된 데이터에 기초하여 산출되어, 높은 신뢰도의 단백질 농도를 측정가능하게 할 뿐만 아니라, 세포 내에서 활성화된 특정 단백질의 농도를 단일 분자 수준에서 측정된 데이터에 기초하여 높은 신뢰도로 측정가능하게 하는 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for measuring protein concentration in a cell solution, and more particularly, it can be applied to all kinds of proteins as well as calculated based on data measured at the single molecule level, thereby measuring a high reliability protein concentration. In addition to making it possible, the present invention relates to a method for measuring protein concentration in a cell solution that allows the concentration of a specific protein activated in a cell to be measured with high reliability based on data measured at the single molecule level.
인체의 세포 내에서의 분석자가 원하는 특정 단백질의 농도를 측정하는 것은 해당 세포에서의 유전적 변이에 따른 암 세포로의 전환 등을 감지하거나 예측함에 있어서 매우 유용한 방법이다.Measuring the concentration of a specific protein desired by an analyst in a human cell is a very useful method for detecting or predicting the conversion to cancer cells according to genetic variation in the cell.
그러나, 종래 기술에 따른 단백질의 농도 측정 방법들은 개별적인 단백질에서만 적용되는 일반화될 수 없는 방법에 불과하거나, 그 구체적 측정 방법에 있어서도 특정 단백질에 대한 단일 분자 수준에서 측정된 데이터에 기초하여 농도를 측정하는 것이 아니었던 관계로 측정된 농도의 정확성을 신뢰할 수 없다는 문제가 있었다.However, prior art methods for measuring concentrations of proteins are merely inexplicable methods that can be applied only to individual proteins, or even in the specific methods of measuring concentrations based on data measured at the single molecule level for a particular protein. There was a problem that the accuracy of the measured concentration could not be trusted because it was not.
아울러, 암세포와 같은 특정 세포 내에서는 특정 단백질의 활성화 여부 및 활성화된 특정 단백질의 농도를 측정하는 것은 의학적 연구 및 환자 치료에 있어서 대단히 중요한 기초 자료가 되는 것임에도 불구하고 종래에는 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 빠른 시간 안에 산출할 수 있는 방법이 없었다.In addition, although the measurement of the activation of a specific protein and the concentration of a specific activated protein in a specific cell such as cancer cells is a very important basic data for medical research and patient treatment, the concentration of a specific activated protein is conventionally There was no way to calculate quantitatively in a short time.
따라서, 본 발명의 목적은, 단일 분자 수준에서 측정된 데이터에 기초하여 산출되어, 높은 신뢰도의 단백질 농도를 측정가능하게 할 뿐만 아니라, 세포 내에서 인산화된 특정 단백질의 농도를 단일 분자 수준에서 측정된 데이터에 기초하여 높은 신뢰도로 측정가능하게 하는 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법을 제공함에 있다.Therefore, the object of the present invention is calculated based on the data measured at the single molecule level, which enables not only to measure high reliability protein concentration but also to measure the concentration of specific phosphorylated protein in the cell at the single molecule level. It is to provide a method for measuring protein concentration in a cell solution that can be measured with high reliability based on the data.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법은, (a) 측정 대상 단백질에 표지자가 구비된 기준 단백질과 상기 측정 대상 단백질과 결합하는 생체 분자체가 결합된 결합 분자체의 생성을 유도하는 단계; (b) 측정 대상 단백질에 표지자가 구비된 기준 단백질과 측정 대상 단백질이 포함된 세포 용액을 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합된 세포 용액과 상기 측정 대상 단백질과 결합되는 생체 분자체를 혼합하여 상기 생체 분자체와 상기 기준 단백질이 결합된 결합 분자체의 생성을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 (a) 단계에서 생성된 결합 분자체의 개수와 상기 (c) 단계에서 생성된 결합 분자체의 개수에 기초하여 상기 측정 대상 단백질이 포함된 세포 용액에서의 상기 측정 대상 단백질의 농도를 계산하는 단계를 포함한다.Method for measuring the protein concentration in a cell solution according to the present invention for achieving the above object, (a) a binding molecular sieve is combined with a reference protein having a marker in the protein to be measured and a biomolecular sieve that binds to the protein to be measured Inducing the production of; (b) mixing a reference protein having a marker and a cell solution containing the measurement target protein to the measurement target protein; (c) mixing the mixed cell solution and the biomolecular sieve bound to the protein to be measured to induce the generation of the binding molecular sieve combined with the biomolecular sieve and the reference protein; And (d) based on the number of binding molecular sieves generated in step (a) and the number of binding molecular sieves generated in step (c) of the protein to be measured in the cell solution containing the protein to be measured. Calculating the concentration.
바람직하게는, 상기 표지자는 형광 단백질인 것을 특징으로 한다.Preferably, the marker is characterized in that the fluorescent protein.
또한, 상기 (d) 단계에서, 상기 결합 분자체의 개수는 상기 형광 단백질에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the step (d), the number of the binding molecular sieve is characterized by measuring the fluorescent signal of a specific wavelength generated by the fluorescent protein using an optical device for generating a near field.
한편, 본 발명에 따른 세포 용액에서의 인산화된 단백질 농도 측정 방법은, (a) 측정 대상 단백질의 인산화 부분을 절췌하여 합성한 인산화 처리된 펩타이드에 표지자가 구비된 기준 펩타이드와 상기 측정 대상 단백질과 결합되는 생체 분자체가 결합된 결합 분자체의 생성을 유도하는 단계; (b) 측정 대상 단백질의 인산화 처리된 펩타이드에 표지자가 구비된 기준 펩타이드와 측정 대상 단백질이 포함된 세포 용액을 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합된 세포 용액과 상기 측정 대상 단백질과 결합되는 생체 분자체를 혼합하여 상기 생체 분자체와 상기 기준 펩타이드가 결합된 결합 분자체의 생성을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 (a) 단계에서 생성된 결합 분자체의 개수와 상기 (c) 단계에서 생성된 결합 분자체의 개수에 기초하여 상기 측정 대상 단백질이 포함된 세포 용액에서의 상기 측정 대상 단백질의 농도를 계산하는 단계를 포함한다.On the other hand, the method of measuring the phosphorylated protein concentration in the cell solution according to the present invention, (a) the phosphorylated peptide synthesized by excising the phosphorylated portion of the protein to be measured is coupled to the reference peptide and the target protein having a marker Inducing the generation of a binding molecular sieve to which the biomolecular sieve is bound; (b) mixing a reference peptide having a marker and a cell solution containing the protein to be measured to the phosphorylated peptide of the protein to be measured; (c) mixing the mixed cell solution and the biomolecular sieve bound to the protein to be measured to induce the generation of the binding molecular sieve to which the biomolecular sieve and the reference peptide are bound; And (d) based on the number of binding molecular sieves generated in step (a) and the number of binding molecular sieves generated in step (c) of the protein to be measured in the cell solution containing the protein to be measured. Calculating the concentration.
바람직하게는, 상기 (b) 단계에서의 측정 대상 단백질은 인산화된 단백질인 것을 특징으로 한다.Preferably, the protein to be measured in step (b) is characterized in that the phosphorylated protein.
또한, 상기 표지자는 형광 염료인 것을 특징으로 한다.In addition, the marker is characterized in that the fluorescent dye.
또한, 상기 (d) 단계에서, 상기 결합 항체의 개수는 상기 형광 염료에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 한다.In addition, the step (d), the number of the binding antibody is characterized in that for measuring the fluorescent signal of a specific wavelength generated by the fluorescent dye using an optical device for generating a near field.
본 발명에 따르면, 모든 종류의 단백질에 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 단일 분자 수준에서 측정된 데이터에 기초하여 산출되어, 높은 신뢰도의 단백질 농도를 측정가능하게 하는 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법이 제공된다.According to the present invention, there is provided a method for measuring protein concentration in a cell solution that can be applied to all kinds of proteins as well as calculated based on data measured at the single molecule level, thereby making it possible to measure protein concentrations of high reliability. .
아울러, 본 발명에 따르면 세포 내에서 인산화된 특정 단백질의 농도를 단일 분자 수준에서 측정된 데이터에 기초하여 높은 신뢰도로 측정할 수 있게 된다.In addition, according to the present invention it is possible to measure the concentration of a specific protein phosphorylated in the cell with high reliability based on the data measured at the single molecule level.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법을 설명하는 절차 흐름도, 및
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법의 원리를 설명하는 도면, 및
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법의 원리를 설명하는 도면이다.1 is a flowchart illustrating a method of measuring protein concentration in a cell solution according to an embodiment of the present invention, and
2 and 3 are views illustrating the principle of the method for measuring protein concentration in a cell solution according to an embodiment of the present invention, and
4 is a view for explaining the principle of the protein concentration measurement method in a cell solution according to another embodiment of the present invention.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 도면들 중 동일한 구성요소들은 가능한 한 어느 곳에서든지 동일한 부호들로 나타내고 있음에 유의해야 한다. 또한 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.Hereinafter, with reference to the drawings will be described the present invention in more detail. It is to be noted that the same elements among the drawings are denoted by the same reference numerals whenever possible. In the following description, well-known functions or constructions are not described in detail since they would obscure the invention in unnecessary detail.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법을 설명하는 절차 흐름도이다. 이하에서는 도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법을 설명하기로 한다.1 is a flowchart illustrating a method for measuring protein concentration in a cell solution according to an embodiment of the present invention. Hereinafter, a method of measuring protein concentration in a cell solution according to an embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 1.
먼저, 분석자는 세포 상태에서 유전자 조작 과정을 거쳐 해당 세포 내에 존재하는 측정 대상 단백질에 형광 단백질이 발현되도록 한다(S110).First, the analyst allows the fluorescent protein to be expressed in the protein to be measured within the cell through a genetic manipulation process in the cell state (S110).
한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 형광 단백질이나 다른 형광염료를 물리 화학적인 방법에 의해서 측정 대상 단백질에 부착 또는 연결시킬 수도 있을 것이다. 본 발명에서는 전술한 S110 단계에서의 형광 단백질이 발현된 측정 대상 단백질을 기준 단백질이라고 한다.On the other hand, in the practice of the present invention, fluorescent proteins or other fluorescent dyes may be attached or linked to the protein to be measured by physicochemical methods. In the present invention, the protein to be measured in which the fluorescent protein is expressed in step S110 is referred to as a reference protein.
본 발명을 실시함에 있어서 측정 대상 단백질에는 형광 단백질 중 m-Cherry 단백질 또는 eGFP 단백질이 발현되도록 함이 바람직할 것이다.In the practice of the present invention, it will be desirable to express the m-Cherry protein or the eGFP protein in the fluorescent protein in the protein to be measured.
그 다음, 분석자는 측정 대상 단백질과 결합하는 항체를 시험관에 투입한 상태에서 항체의 농도보다 높은 농도의 기준 단백질을 시험관에 투입하여 항체와 기준 단백질의 결합을 유도한다(S120). Next, the analyst injects a reference protein having a concentration higher than that of the antibody in a test tube while injecting an antibody that binds the protein to be measured into the test tube (S120).
본 발명을 실시함에 있어서, 항체의 농도과 기준 단백질의 농도는 1:5 내지 1:10의 비율이 되도록 함이 바람직할 것이며, 또한, 측정 대상 단백질과 결합하는 생체 분자체에는, 항체 이외에도 DNA, RNA, 측정 대상 단백질과 결합하는 특정 성분을 갖는 리포좀(liposome) 등의 단백질과 결합하는 생체 분자체가 사용될 수 있을 것이다.In practicing the present invention, the concentration of the antibody and the concentration of the reference protein may be preferably in a ratio of 1: 5 to 1:10. Further, in addition to the antibody, DNA and RNA may be used for the biological molecular sieve that binds to the protein to be measured. For example, a biomolecular sieve that binds to a protein such as a liposome having a specific component that binds to the protein to be measured may be used.
시험관 내에서의 항체와 기준 단백질의 리액팅 과정을 수 분에서 1시간 정도거친 후에 시험관 내의 혼합 용액을 2차 항체가 붙어있는 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol:PEG) 코팅처리된 퀄츠 슬라이드(Quartz Slide)인 기판에 공급함으로써, 항체를 기판에 부착한다(S130).After reacting the antibody and reference protein in vitro for several minutes to 1 hour, the mixed solution in the tube is a polyethylene slide (Quartz Slide) coated with polyethylene glycol (PEG) coated with a secondary antibody. By supplying to the antibody, the antibody is attached to the substrate (S130).
한편, 전술한 S120 내지 S130 단계를 실행함에 있어서, 분석자는 전술한 바와 같이 시험관 내에서의 항체와 기준 단백질의 리액팅 과정을 통해 결합을 유도한 후에 결합된 항체를 기판에 부착할 수도 있지만, 본 발명을 실시함에 있어서는, 도 2에서와 같이 2차 항체(secondary antibody) 위에 부착되어 있으며, 기준 단백질과 결합되는 1차 항체(primary antibody)가 부착된 기판에 기준 단백질을 공급함으로써, 1차 항체와 기준 단백질의 결합을 유도할 수도 있을 것이다.On the other hand, in performing the above-described step S120 to S130, the analyst may induce binding through the reaction process of the antibody and the reference protein in vitro as described above, and then attach the bound antibody to the substrate. In the invention, as shown in Figure 2 attached to a secondary antibody (secondary antibody), as shown in Figure 2, by supplying the reference protein to the substrate to which the primary antibody (primary antibody) attached to the reference protein attached, It may also induce binding of the reference protein.
그 다음, 분석자는 근접장을 발생시키는 광학장치인 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행함으로써, 분석자는 형광 단백질에 의한 파장 변화로부터(즉, 형광 단백질로부터 발생하는 개개의 단분자 신호를 측정하여) 기판상에 부착된 항체들 중에서 형광 단백질이 발현된 기준 단백질과 결합된 결합 항체(결합 분자체)의 개수를 측정한다(S140).The analyst then performs surface observation of the substrate using a total reflection microscope, an optical device that generates near-fields, so that the analyst can measure the wavelengths caused by the fluorescent protein (i.e. by measuring the individual monomolecular signals generated from the fluorescent protein). Among the antibodies attached on the substrate, the number of binding antibodies (binding molecular sieves) bound to the reference protein expressing the fluorescent protein is measured (S140).
분석자는 전술한 S140 단계에서 측정한 결합 항체의 개수를 기준 결합수로서 기록하여 둔다.The analyst records the number of binding antibodies measured in step S140 described above as a reference binding number.
한편, 분석자는 전술한 S110 단계를 반복하여 기준 단백질을 다시 제조하며, 다시 제조된 기준 단백질과 분석자가 그 농도를 측정하려고 하는 측정 대상 단백질이 포함되어 있는 특정 세포의 세포 용액을 혼합하여 혼합된 세포 용액을 제조한다(S150).Meanwhile, the analyst repeats the above-described step S110 to manufacture the reference protein again, and mixes the mixed cell solution of the prepared protein and the cell solution of the specific cell containing the target protein to be measured by the analyzer. To prepare a solution (S150).
여기서, 특정 세포의 세포 용액은 특정 세포의 세포질 원액, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석된 세포 원액이 될 수 있을 것이며, 혼합 세포 용액을 제조함에 사용되는 특정 세포는 암환자의 암세포 조직에서 추출한 세포가 될 수 있을 것이다.Herein, the cell solution of a specific cell may be a cytoplasmic solution of a specific cell, a cell stock solution, a diluted cytoplasmic stock solution, or a diluted cell stock solution, and the specific cells used to prepare the mixed cell solution may be used in cancer cell tissues of cancer patients. It could be the extracted cells.
한편, 전술한 S150 단계에서 혼합된 세포 용액을 제조함에 있어서 투입되는 기준 단백질은 전술한 S120 단계에서 시험관에 투입된 기준 단백질과 동일한 농도로 투입되어야 한다.On the other hand, the reference protein introduced in the preparation of the cell solution mixed in step S150 described above should be added at the same concentration as the reference protein introduced into the test tube in step S120 described above.
그 다음 분석자는 측정 대상 단백질과 결합하는 항체인 전술한 S120 단계에서의 항체와 동일한 항체를 동일한 농도로 시험관에 투입한 상태에서 전술한 S150 단계에서 제조된 혼합 세포 용액을 시험관에 투입하여 항체와 혼합한다(S160).Next, the analyst puts the mixed cell solution prepared in step S150 into the test tube and mixes the antibody with the same antibody as the antibody in step S120 described above, the antibody binding to the protein to be measured, in the same concentration. (S160).
시험관 내에서의 항체와 기준 단백질의 리액팅 과정을 이전과 동일한 시간으로서, 20 내지 30분간 거침으로써 항체와 기준 단백질의 결합 또는 항체와 특정 세포에 포함되어 있는 측정 대상 단백질의 결합을 유도한다(S170).The reaction process of the antibody and the reference protein in vitro is performed at the same time as before, for 20-30 minutes to induce binding of the antibody and the reference protein or binding of the antibody and the protein to be measured included in the specific cell (S170). ).
이 경우에 형광 단백질이 발현되어 있는 기준 단백질과 형광 단백질이 발현되어 있지 않은 측정 대상 단백질은 일정한 농도의 항체과 경쟁적으로 결합을 하게 되므로, 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도가 높을수록 측정 대상 단백질이 기준 단백질과 항체의 결합을 방해하는 정도가 높아지게 되어, 기준 단백질과 결합하는 항체의 개수가 줄어들게 될 것이다.In this case, the reference protein in which the fluorescent protein is expressed and the protein to be measured in which the fluorescent protein is not expressed are competitively bound to antibodies of a constant concentration. Therefore, the higher the concentration of the protein to be measured in a specific cell, the higher the protein to be measured. The degree of interference with the binding of the reference protein and the antibody will be increased, and the number of antibodies binding to the reference protein will be reduced.
시험관 내에서의 리액팅 과정 후에 분석자는 시험관 내의 혼합 용액을 기판에 공급함으로써, 전술한 S130 단계에서와 같이 항체를 기판에 부착시킨다(S180).After the reaction in vitro, the analyst supplies the mixed solution in the test tube to the substrate, thereby attaching the antibody to the substrate as in step S130 described above (S180).
한편, 전술한 S160 단계 내지 S180 단계를 실시함에 있어서, 전술한 바와 같이 시험관 내에서 혼합 세포 용액과 항체를 혼합을 통해 항체와 기준 단백질의 결합 또는 항체와 특정 세포에 포함되어 있는 측정 대상 단백질의 결합을 유도할 수도 있지만, 분석자가 전술한 S120 내지 S130 단계를 수행함에 있어서, 도 2에서와 같은 기판에 기준 단백질을 공급함으로써, 1차 항체(primary antibody)와 기준 단백질의 결합을 유도하는 방법을 사용한 경우에는, 시험 조건을 동등하게 하기 위해 이번에도 분석자는 전술한 S160 단계 내지 S180 단계를 실시함에 있어서, 도 2에서와 같이 준비된 기판에 혼합 세포 용액을 공급함으로써, 도 3의 좌측에서와 같이 형광 단백질이 발현되어 있는 기준 단백질과 형광 단백질이 발현되어 있지 않은 측정 대상 단백질의 일정 개수의 1차 항체와의 경쟁적 결합을 유도할 수도 있을 것이다.Meanwhile, in the steps S160 to S180 described above, as described above, the antibody and the reference protein are combined or the antibody and the protein to be included in the specific cell are mixed by mixing the mixed cell solution and the antibody in vitro. However, in performing the above-described steps S120 to S130, the analyst may use a method of inducing binding of the primary antibody and the reference protein by supplying a reference protein to the substrate as shown in FIG. 2. In this case, in order to equalize the test conditions, the analyst also supplies the mixed cell solution to the substrate prepared as shown in FIG. A certain number of first terms of the reference protein expressed and the protein to be measured without the fluorescent protein expressed Competitive binding with might be induced.
그 다음, 분석자는 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행함으로써, 형광 단백질에 의한 파장 변화로부터 기판상에 부착된 항체들 중에서 형광 단백질이 발현된 기준 단백질과 결합된 결합 항체의 개수를 측정한다(S190).The analyst then performs a surface observation of the substrate using a total reflection microscope to determine the number of binding antibodies bound to the reference protein expressing the fluorescent protein among the antibodies attached to the substrate from the wavelength change by the fluorescent protein ( S190).
분석자는 전술한 S190 단계에서 측정한 결합 항체의 개수를 측정 결합수로서 기록하여 둔다.The analyst records the number of binding antibodies measured in step S190 described above as the number of measurement binding.
즉, 형광 단백질이 발현된 기준 단백질이 아무런 경쟁이 없는 상태에서 항체와 결합한 수인 전술한 S140 단계에서의 기준 결합수(R), 전술한 S120 단계에서의 기준 단백질의 농도(X')와 기준 단백질이 특정 세포 내에 존재하는 측정 대상 단백질과 경쟁하는 상태에서 항체와 결합한 수인 측정 결합수(r)에 기초하여, 분석자는 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도(X)를 계산할 수 있게 된다(S195).That is, the reference binding number (R) in step S140 described above, the reference protein concentration (X ') in step S120 described above, and the reference protein, the number of binding of the reference protein expressing the fluorescent protein with the antibody without any competition. Based on the measurement binding number (r), which is the number of binding to the antibody in the state of competing with the measurement target protein present in this specific cell, the analyst can calculate the concentration (X) in the specific cell of the measurement protein (S195). ).
구체적으로, 일반적으로 항체에는 두 개의 라이트 체인(light chain)이 구비되어 있는 관계로, 도 3의 우측에서와 같이 두 개의 라이트 체인 중 어느 하나에만 기준 단백질이 결합되더라도, 해당 항체는 전술한 S190 단계에서 분석자의 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰 수행시에 측정 결합수(r)로 계산된다.Specifically, in general, since the antibody is provided with two light chains, even if the reference protein is bound to only one of the two light chains as shown in the right side of FIG. Calculated as the measurement coupling number (r) at the time of performing the surface observation of the substrate using the analyzer's total reflection microscope.
즉, 항체에 구비된 두 개의 라이트 체인 모두에 각각 특정 세포 내에 존재하는 측정 대상 단백질이 결합된 경우에만 해당 항체는 전술한 S190 단계에서 분석자는 전반사 현미경을 이용하여 기판의 표면 관찰을 수행시에 측정 결합수(r)로 계산되지 않게 된다.That is, the antibody is measured only when both of the two light chains included in the antibody are bound to the protein to be measured in a specific cell, respectively, in step S190, when the analyst performs surface observation of the substrate using a total reflection microscope. It is not counted as the coupling number r.
여기서, 항체에 구비된 두 개의 라이트 체인 모두에 각각 특정 세포 내에 존재하는 측정 대상 단백질이 결합될 확률값(P)는 하기의 수학식 1로서 표현된다.Here, the probability value P at which the protein to be measured to be present in each specific cell is bound to both light chains provided in the antibody is expressed as Equation 1 below.
상기 수학식 1에서 X'은 S120 단계에서의 기준 단백질의 농도, X는 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도가 된다. X'은 단백질의 농도를 측정하는 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다.In Equation 1, X 'is the concentration of the reference protein in step S120, X is the concentration in a specific cell of the protein to be measured. X 'can be measured by various methods of measuring the concentration of a protein.
한편, 상술한 기준 결합수(R)와 측정 결합수(r)의 비율인 "r/R"은 하기의 수학식 2와 같이 나타낼 수 있다.Meanwhile, "r / R", which is the ratio of the reference coupling number R and the measurement coupling number r, may be expressed by Equation 2 below.
상기 수학식 1과 수학식 2를 연립하면 하기의 수학식 3이 산출된다.When Equation 1 and Equation 2 are combined, Equation 3 below is calculated.
상기 수학식 3에서 R은 상술한 기준 결합수, r은 측정 결합수, X'은 S120 단계에서의 기준 단백질의 농도, X는 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도가 된다. R과 r은 전술한 S140 단계 및 S190 단계에서 각각 분석자에 의해 측정된다.In Equation 3, R is the reference bond number described above, r is the measurement bond number, X 'is the concentration of the reference protein in step S120, X is the concentration in the specific cell of the protein to be measured. R and r are measured by the analyst in steps S140 and S190 described above, respectively.
즉, 상기 수학식 1에 X'값, R값, 및 r값을 대입함으로써, 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도(X)가 산출된다.That is, the concentration (X) in the specific cell of the protein to be measured is calculated by substituting the X 'value, the R value, and the r value in the above formula (1).
한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 효소를 이용하여 두 개의 라이트 체인을 분리하여 항체가 하나의 라이트 체인만을 구비하도록 할 수 있을 것이며, 이 경우에는 항체에 특정 세포 내에 존재하는 측정 대상 단백질이 결합될 확률값(P)는 하기의 수학식 4로서 표현될 것이다.Meanwhile, in the practice of the present invention, two light chains may be separated using an enzyme so that the antibody has only one light chain, and in this case, the antibody to be measured in the specific cell is bound to the antibody. The probability value P will be expressed as Equation 4 below.
기준 결합수(R)와 측정 결합수(r)의 비율인 "r/R"은 상기의 수학식 2와 같이 나타낼 수 있으므로, 수학식 4와 수학식 2를 연립하면 하기의 수학식 5가 산출된다.Since "r / R", which is the ratio of the reference coupling number R and the measurement coupling number r, may be expressed as in Equation 2, Equation 5 and Equation 2 below are calculated. do.
즉, 라이트 체인이 각각 분리되어 단일의 라이트 체인을 구비하는 항체를 이용하여 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도(X)를 산출하는 경우에는 상기 수학식 5에 X'값, R값, 및 r값을 대입함으로써, 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도(X)를 산출하게 된다.That is, when the light chains are separated from each other and the concentration (X) in a specific cell of the protein to be measured is calculated using an antibody having a single light chain, X ', R, and By substituting the r value, the concentration (X) in the specific cell of the protein to be measured is calculated.
한편, 전술한 본 발명의 원리를 이용하여 분석자가 분석 대상 세포 내에 포함된 인산화된 특정 단백질의 농도를 측정하기 위해서는 인산화된 특정 단백질과 결합하는 특성을 가진 항체를 사용해야 한다.On the other hand, in order to measure the concentration of the specific phosphorylated protein contained in the cell to be analyzed by the analyst using the above-described principles of the present invention, an antibody having a property of binding to the specific phosphorylated protein should be used.
또한, 이를 위해서는 전술한 S170 단계에서 일정한 개수의 항체를 두고서 측정 대상 단백질(인산화된 단백질)과 경쟁적으로 결합을 하는 기준 단백질은 표지자를 구비해야 할 뿐만 아니라, 분석 대상 세포 내에서 자연적으로 인산화된 측정 대상 단백질과 동일한 결합 조건을 구비할 수 있도록 인산화 처리가 되어 있어야 한다.In addition, for this purpose, the reference protein competitively binding to the protein to be measured (phosphorylated protein) with a certain number of antibodies in step S170 described above should not only have a marker, but also naturally phosphorylated in the cell to be analyzed. Phosphorylation should be performed to have the same binding conditions as the protein of interest.
이러한 이유에서 기준 단백질은 인산화된 단백질을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 본 발명에서는 인산화된 기준 단백질과 동일한 기능을 수행할 수 있도록, 측정 대상 단백질이 활성화되는 경우에 인산화되는 특정 아미노산에 대한 정보에 기초하여, 인산화되는 해당 아미노산을 중심으로 대략 전후 10여 개의 아미노산이 결합된 펩타이드를 합성 제작하고, 해당 아미노산에 인위적인 인산화 처리를 하는 방법을 사용하였다. 아울러, 본 발명에서는 해당 펩타이드의 말단에는 형광 염료 처리를 통해 표지자를 구비하도록 한다.For this reason it would be desirable to use phosphorylated proteins as reference proteins. However, in the present invention, about 10 amino acids before and after the phosphorylated amino acid based on the information about the specific amino acid that is phosphorylated when the protein to be measured is activated so as to perform the same function as the phosphorylated reference protein. This conjugated peptide was synthesized and used to artificially phosphorylate the amino acid. In addition, in the present invention, the end of the peptide is provided with a marker through fluorescent dye treatment.
즉, 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질 농도 측정 방법에서는 상술한 인산화 처리된 펩타이드가 도 1에서의 기준 단백질의 역할을 수행하게 되며, 이를 통해 분석자는 분석 대상 세포 또는 세포 용액 내의 활성화된 단백질의 농도를 측정할 수 있게 된다.That is, in the protein concentration measuring method according to another embodiment of the present invention, the above-mentioned phosphorylated peptide plays the role of the reference protein in FIG. 1, through which the analyst analyzes the activated protein in the cell or cell solution to be analyzed. The concentration can be measured.
이하에서는 도 1에서의 측정 대상 단백질이 인산화된 단백질이고, 도 1에서의 기준 단백질이 형광 염료 처리 및 인산화 처리된 펩타이드인 기준 펩타이드인 경우에서의 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질 농도 측정 방법을 도 1에서의 각 단계에 따라 기술하기로 한다.Hereinafter, a method for measuring protein concentration according to another embodiment of the present invention when the protein to be measured in FIG. 1 is a phosphorylated protein and the reference protein in FIG. 1 is a reference peptide that is a fluorescent dye-treated and phosphorylated peptide. Each step in FIG. 1 will be described.
먼저, 분석자는 전술한 바와 같이 측정 대상 단백질이 활성화되는 경우에 인산화되는 특정 아미노산에 대한 정보에 기초하여, 인산화되는 해당 아미노산을 중심으로 대략 전후 10여개의 아미노산이 결합된 펩타이드를 제작하고, 해당 아미노산에 인위적인 인산화 처리를 하고, 인산화 처리된 펩타이드의 말단에는 형광 염료 처리를 함으로써 기준 펩타이드를 생성한다(S110). First, as described above, the analyst prepares a peptide in which approximately 10 amino acids are combined before and after the amino acid to be phosphorylated based on the information on a specific amino acid that is phosphorylated when the protein to be measured is activated. Artificial phosphorylation treatment is performed on the end of the phosphorylated peptide to generate a reference peptide by fluorescent dye treatment (S110).
그 다음, 분석자는 기준 펩타이드 및 인산화된 측정 대상 단백질과 결합하는 항체를 시험관에 투입한 상태에서 항체의 농도보다 높은 농도의 기준 단백질을 시험관에 투입하여 항체와 기준 단백질의 결합을 유도한다(S120). Next, the analyst injects the reference peptide having a concentration higher than the antibody concentration into the test tube while injecting the antibody that binds the reference peptide and the phosphorylated protein to be measured (S120). .
본 발명을 실시함에 있어서, 항체의 농도과 기준 펩타이드의 농도는 1:5 내지 1:10의 비율이 되도록 함이 바람직할 것이며, 또한, 인산화된 측정 대상 단백질과 결합하는 생체 분자체에는, 항체 이외에도 DNA, RNA, 측정 대상 단백질과 결합하는 특정 성분을 갖는 리포좀(liposome) 등의 단백질과 결합하는 생체 분자체가 사용될 수 있을 것이다.In the practice of the present invention, the concentration of the antibody and the reference peptide should be in a ratio of 1: 5 to 1:10, and in addition to the antibody, the biomolecular sieve that binds to the phosphorylated measurement target protein may contain DNA in addition to the antibody. Biomolecular sieves that bind to proteins, such as liposomes having specific components that bind to RNA, RNA, and the protein to be measured may be used.
시험관 내에서의 항체와 기준 펩타이드의 리액팅 과정을 20 내지 30분간 거친 후에 시험관 내의 혼합 용액을 2차 항체가 부착된 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol:PEG) 코팅처리된 퀄츠 슬라이드(Quartz Slide)인 기판에 공급함으로써, 항체를 기판에 부착한다(S130).After reacting the antibody and the reference peptide in vitro for 20 to 30 minutes, the mixed solution in the tube is supplied to a substrate which is a polyethylene slide coated with polyethylene glycol (PEG) coated with a secondary antibody. Thus, the antibody is attached to the substrate (S130).
한편, 여기서도 전술한 S120 내지 S130 단계를 실행함에 있어서, 분석자는 도 2에서와 같이 2차 항체(secondary antibody) 위에 부착되어 있으며, 기준 펩타이드와 결합되는 1차 항체(primary antibody)가 부착된 기판에 기준 펩타이드를 공급함으로써, 1차 항체(primary antibody)와 기준 펩타이드의 결합을 유도할 수도 있을 것이다.On the other hand, also in the above-described step S120 to S130, the analyst is attached on the secondary antibody (secondary antibody), as shown in Figure 2, on the substrate attached to the primary antibody (primary antibody) attached to the reference peptide By supplying a reference peptide, one may induce binding of the primary antibody with the reference peptide.
그 다음, 분석자는 근접장을 발생시키는 광학장치인 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행함으로써, 분석자는 형광 염료에 의한 파장 변화로부터(즉, 형광 단백질로부터 발생하는 개개의 단분자 신호를 측정하여) 기판상에 부착된 항체들 중에서 형광 염료가 부착된 기준 펩타이드와 결합된 결합 항체(결합 분자체)의 개수를 측정한다(S140).Next, the analyst performs surface observation of the substrate using a total reflection microscope, an optical device that generates near-fields, so that the analyst can measure the wavelengths caused by the fluorescent dye (i.e. by measuring the individual monomolecular signals generated from the fluorescent protein). Among the antibodies attached on the substrate, the number of binding antibodies (binding molecular sieves) bound to the reference peptide to which the fluorescent dye is attached is measured (S140).
분석자는 전술한 S140 단계에서 측정한 결합 항체의 개수를 기준 결합수로서 기록하여 둔다.The analyst records the number of binding antibodies measured in step S140 described above as a reference binding number.
한편, 분석자는 전술한 S110 단계를 반복하여 기준 펩타이드를 다시 제조하며, 다시 제조된 기준 펩타이드와 분석자가 그 농도를 측정하려고 하는 인산화된 측정 대상 단백질이 포함되어 있는 특정 세포의 세포 용액을 혼합하여 혼합된 세포 용액을 제조한다(S150).Meanwhile, the analyst repeats the above-described step S110 to manufacture the reference peptide again, and mixes and mixes the prepared cell peptide and the cell solution of the specific cell containing the phosphorylated measurement protein to be analyzed by the analyzer. Prepare the prepared cell solution (S150).
여기서, 특정 세포의 세포 용액은 특정 세포의 세포질 원액, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석된 세포 원액이 될 수 있을 것이며, 혼합 세포 용액을 제조함에 사용되는 특정 세포는 암환자의 암세포 조직에서 추출한 세포가 될 수 있을 것이다.Herein, the cell solution of a specific cell may be a cytoplasmic solution of a specific cell, a cell stock solution, a diluted cytoplasmic stock solution, or a diluted cell stock solution, and the specific cells used to prepare the mixed cell solution may be used in cancer cell tissues of cancer patients. It could be the extracted cells.
한편, 전술한 S150 단계에서 혼합된 세포 용액을 제조함에 있어서 투입되는 기준 펩타이드는 전술한 S120 단계에서 시험관에 투입된 기준 펩타이드와 동일한 농도로 투입되어야 한다.On the other hand, the reference peptide to be added in the preparation of the cell solution mixed in step S150 described above should be added at the same concentration as the reference peptide introduced into the test tube in step S120 described above.
그 다음 분석자는 인산화된 측정 대상 단백질과 결합하는 항체인 전술한 S120 단계에서의 항체와 동일한 항체를 동일한 농도로 시험관에 투입한 상태에서 전술한 S150 단계에서 제조된 혼합 세포 용액을 시험관에 투입하여 항체와 혼합한다(S160).Next, the analyst put the mixed cell solution prepared in step S150 into the test tube while the same antibody as the antibody in step S120 described above, which is an antibody binding to the phosphorylated measurement protein, was added to the test tube. It is mixed with (S160).
시험관 내에서의 항체와 기준 펩타이드의 리액팅 과정을 이전과 동일한 시간으로서, 20 내지 30분간 거침으로써 항체와 기준 펩타이드의 결합 또는 항체와 특정 세포에 포함되어 있는 인산화된 측정 대상 단백질의 결합을 유도한다(S170).The reaction process of the antibody and reference peptide in vitro is performed at the same time as before, for 20-30 minutes to induce binding of the antibody and the reference peptide or binding of the phosphorylated protein of interest contained in the antibody and specific cells. (S170).
이 경우에 인산화 처리된 기준 펩타이드와 인산화된 측정 대상 단백질은 일정한 농도의 항체과 경쟁적으로 결합을 하게 되므로, 인산화된 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도가 높을수록 인산화된 측정 대상 단백질이 기준 펩타이드와 항체의 결합을 방해하는 정도가 높아지게 되어, 기준 단백질과 결합하는 항체의 개수가 줄어들게 될 것이다.In this case, the phosphorylated reference peptide and the phosphorylated measurement protein are competitively bound to a constant concentration of antibody. Therefore, the higher the concentration of the phosphorylated measurement protein in a specific cell, the higher the phosphorylated measurement protein is compared with the reference peptide. The higher the degree of interference with the binding of the antibody, the less the number of antibodies binding to the reference protein.
시험관 내에서의 리액팅 과정 후에 분석자는 시험관 내의 혼합 용액을 기판에 공급함으로써, 전술한 S130 단계에서와 같이 항체를 도 4에서와 같이 기판에 부착시킨다(S180).After reacting in vitro, the analyst supplies the mixed solution in vitro to the substrate, thereby attaching the antibody to the substrate as shown in FIG. 4 (S180).
한편, S160 단계 내지 S180 단계를 실시함에 있어서, 전술한 바와 같이 시험관 내에서 혼합 세포 용액과 항체를 혼합을 통해 항체와 기준 펩타이드의 결합 또는 항체와 특정 세포에 포함되어 있는 인산화된 측정 대상 단백질의 결합을 유도할 수도 있지만, 분석자가 전술한 S120 내지 S130 단계를 수행함에 있어서, 도 2에서와 같은 기판에 기준 펩타이드를 공급함으로써, 1차 항체(primary antibody)와 기준 단백질의 결합을 유도하는 방법을 사용한 경우에는, 시험 조건을 동등하게 하기 위해 이번에도 분석자는 전술한 S160 단계 내지 S180 단계를 실시함에 있어서, 도 2에서와 같이 준비된 기판에 혼합 세포 용액을 공급함으로써, 도 4에서와 같이 형광 염료(Cys)가 부착되어 있으며 인산화 처리(P)된 기준 펩타이드와 인산화된 측정 대상 단백질 간의 일정 개수의 1차 항체와의 경쟁적 결합을 유도할 수도 있을 것이다.On the other hand, in the steps S160 to S180, as described above, the combination of the antibody and the reference peptide or a combination of the phosphorylated measurement protein contained in the antibody and the specific cell through mixing the mixed cell solution and the antibody in vitro However, in performing the steps S120 to S130 described above, the analyst may supply a reference peptide to the substrate as shown in FIG. 2, thereby inducing binding of the primary antibody to the reference protein. In this case, in order to equalize the test conditions, the analyst also supplies the mixed cell solution to the substrate prepared as shown in FIG. A number of primary terms between the reference phosphorylated (P) and the phosphorylated protein to be measured Competitive binding with might be induced.
그 다음, 분석자는 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행함으로써, 기준 펩타이드에 부착된 형광 염료에 의한 파장 변화로부터 기판상에 부착된 항체들 중에서 기준 펩타이드와 결합된 결합 항체의 개수를 측정한다(S190).The analyst then performs a surface observation of the substrate using a total reflection microscope to determine the number of binding antibodies bound to the reference peptide among the antibodies attached to the substrate from wavelength changes by fluorescent dyes attached to the reference peptide ( S190).
여기서도, 분석자는 전술한 S190 단계에서 측정한 결합 항체의 개수를 측정 결합수로서 기록하여 둔다.Here too, the analyst records the number of binding antibodies measured in the above-described step S190 as the number of measurement bindings.
즉, 기준 펩타이드가 아무런 경쟁이 없는 상태에서 항체와 결합한 수인 전술한 S140 단계에서의 기준 결합수(R), 전술한 S120 단계에서의 기준 펩타이드의 농도(X')와 기준 펩타이드가 특정 세포 내에 존재하는 인산화된 측정 대상 단백질과 경쟁하는 상태에서 항체와 결합한 수인 측정 결합수(r)에 기초하여, 분석자는 인산화된 측정 대상 단백질의 특정 세포 내에서의 농도(X)를 계산할 수 있게 된다(S195).That is, the reference binding number (R) in step S140 described above, the reference peptide concentration (X ′) in step S120 described above, and the reference peptide are present in a specific cell, in which the reference peptide binds to the antibody without any competition. Based on the measurement binding number (r), which is the number of binding to the antibody in the state of competing with the phosphorylated protein to be measured, the analyst can calculate the concentration (X) in a specific cell of the phosphorylated protein to be measured (S195). .
구체적으로, 도 4에서와 같이 항체에는 통상 두 개의 라이트 체인(light chain)이 구비되어 있는 관계로, 두 개의 라이트 체인 중 어느 하나에만 기준 펩타이드가 결합되더라도, 해당 항체는 전술한 S190 단계에서 분석자의 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰 수행시에 측정 결합수(r)로 계산된다.Specifically, as shown in FIG. 4, since the antibody is usually provided with two light chains, even if the reference peptide is bound to only one of the two light chains, the antibody is analyzed by the analyzer at step S190. When performing surface observation of the substrate using a total reflection microscope, it is calculated as the number of measurement bonds r.
즉, 항체에 구비된 두 개의 라이트 체인 모두에 각각 특정 세포 내에 존재하는 인산화된 측정 대상 단백질이 결합된 경우에만 해당 항체는 전술한 S190 단계에서 분석자는 전반사 현미경을 이용하여 기판의 표면 관찰을 수행시에 측정 결합수(r)로 계산되지 않게 된다.That is, only when both the light chains included in the antibody are bound to the phosphorylated measurement protein present in a specific cell, the antibody is analyzed by the total reflection microscope in step S190. It is not calculated as the measurement coupling number r.
여기에서도, 항체에 구비된 두 개의 라이트 체인 모두에 각각 특정 세포 내에 존재하는 측정 대상 단백질이 결합될 확률값(P)는 상기 수학식 1로서 표현될 것이다.Here, the probability value P at which the protein to be measured to be present in each specific cell is bound to both light chains included in the antibody will be expressed as Equation 1 above.
즉, S195 단계와 관련하여, 수학식 1 내지 수학식 5에 기초하여 전술한 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 농도 측정 방법에서 농도 산출 과정은 본 발명의 다른 실시예에 따른 인산화된 단백질 농도 측정 방법에서도 동일하게 적용될 것이다.That is, in relation to step S195, the concentration calculation process in the protein concentration measuring method according to an embodiment of the present invention described above based on Equation 1 to Equation 5 is measured by the phosphorylated protein concentration according to another embodiment of the present invention The same applies to the method.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예 및 응용예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 응용예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안될 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the present invention.
Claims (7)
(b) 측정 대상 단백질에 표지자가 구비된 기준 단백질과 측정 대상 단백질이 포함된 세포 용액을 혼합하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 혼합된 세포 용액과 상기 (b) 단계에서의 상기 측정 대상 단백질과 결합되는 생체 분자체를 혼합하여 상기 생체 분자체와 상기 기준 단백질이 결합된 결합 분자체의 생성을 유도하는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계에서 생성된 결합 분자체의 개수와 상기 (c) 단계에서 생성된 결합 분자체의 개수에 기초하여 상기 측정 대상 단백질이 포함된 세포 용액에서의 상기 측정 대상 단백질의 농도를 계산하는 단계
를 포함하며,
상기 (a) 단계에서의 결합에 제공되는 상기 기준 단백질의 농도와 상기 (b) 단계에서의 상기 세포 용액에 혼합되는 상기 기준 단백질의 농도는 동일하고,
상기 (a) 단계에서의 결합에 제공되는 생체 분자체의 농도와 상기 (c) 단계에서의 상기 세포 용액에 혼합되는 상기 생체 분자체의 농도는 동일하며,
상기 표지자는 형광 단백질이고,
상기 (d) 단계에서, 상기 결합 분자체의 개수는 상기 형광 단백질에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 것인 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법.
(a) inducing the generation of a binding molecular sieve in which a reference protein provided with a marker in the protein to be measured and a biomolecular sieve binding to the protein to be measured are bound;
(b) mixing a reference protein having a marker and a cell solution containing the measurement target protein to the measurement target protein;
(c) mixing the cell solution mixed in the step (b) and the biomolecular sieve bound to the protein to be measured in the step (b) to generate the binding molecular sieve combined with the biomolecular sieve and the reference protein Deriving; And
(d) the concentration of the target protein in the cell solution containing the target protein based on the number of binding molecular sieves generated in step (a) and the number of binding molecular sieves generated in step (c) Step to calculate
Including;
The concentration of the reference protein provided for binding in step (a) and the concentration of the reference protein mixed in the cell solution in step (b) are the same,
The concentration of the biomolecular sieve provided for binding in step (a) and the concentration of the biomolecular sieve mixed in the cell solution in step (c) are the same,
The marker is a fluorescent protein,
In the step (d), the number of the binding molecular sieve is measuring the protein concentration in the cell solution is to measure the fluorescent signal of a specific wavelength generated by the fluorescent protein using an optical device for generating a near field.
(b) 측정 대상 단백질의 인산화 처리된 펩타이드에 표지자가 구비된 기준 펩타이드와 측정 대상 단백질이 포함된 세포 용액을 혼합하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 혼합된 세포 용액과 상기 (b) 단계에서의 상기 측정 대상 단백질과 결합되는 생체 분자체를 혼합하여 상기 생체 분자체와 상기 기준 펩타이드가 결합된 결합 분자체의 생성을 유도하는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계에서 생성된 결합 분자체의 개수와 상기 (c) 단계에서 생성된 결합 분자체의 개수에 기초하여 상기 측정 대상 단백질이 포함된 세포 용액에서의 상기 측정 대상 단백질의 농도를 계산하는 단계
를 포함하며,
상기 표지자는 형광 염료이고,
상기 (d) 단계에서, 상기 결합 분자체의 개수는 상기 형광 염료에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 것인 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법.
(a) inducing the phosphorylated peptide synthesized by extracting the phosphorylated portion of the protein to be measured to induce the generation of a binding molecular sieve in which a reference peptide having a marker and a biomolecular sieve coupled to the protein to be measured are bound;
(b) mixing a reference peptide having a marker and a cell solution containing the protein to be measured to the phosphorylated peptide of the protein to be measured;
(c) mixing the cell solution mixed in step (b) and the biomolecular sieve bound to the protein to be measured in step (b) to generate the binding molecular sieve in which the biomolecular sieve and the reference peptide are bound. Deriving; And
(d) the concentration of the target protein in the cell solution containing the target protein based on the number of binding molecular sieves generated in step (a) and the number of binding molecular sieves generated in step (c) Step to calculate
Including;
The marker is a fluorescent dye,
In the step (d), the number of the binding molecular sieve is measuring the protein concentration in the cell solution is to measure the fluorescent signal of a specific wavelength generated by the fluorescent dye using an optical device for generating a near field.
상기 (b) 단계에서의 측정 대상 단백질은 인산화된 단백질인 것인 세포 용액에서의 단백질 농도 측정 방법.
The method of claim 4, wherein
The method of measuring the protein concentration in the cell solution is the protein to be measured in step (b) is a phosphorylated protein.
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