JP2004532245A - 癌を治療するための生体影響性化合物の標的送達 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、癌細胞などの病的細胞の治療において有用な生体影響性物質の分野、より具体的には標的化剤と生体影響性物質の複合体に関するものであり、この生体影響性物質は温熱増感剤、光増感剤またはアポトーシス誘導化合物である。
【背景技術】
【0002】
癌治療における2つの最も深刻な問題は、患者を衰弱させる薬剤毒性、及び多量の薬剤用量にも通常は対抗し、薬剤毒性の問題を増幅させ、死をもたらすことが多い薬剤耐性である。薬剤毒性の問題を解決するための1つの方法は、癌細胞にのみ送達させるために薬剤を標的化することである。多くの研究者は、薬剤を標的細胞に送達させるための抗体を開発するために作業しており、この手法は将来性があるが、抗体が問題を伴わないわけではない。例えば、抗体は正常な組織に結合することが多く、血管に損傷を与え(例えば血管漏出症候群)、危険なアレルギー反応(例えばアナフィラキシー)を引き起こす可能性もある。
【0003】
特許文献1〜4中に記載されたように、トランスフェリンと、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトキセレート、ビンクリスチン、6−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、及び、放射性ヨウ素の複合体の使用に関する研究も進行している。これらの特許中に記載された発明は、抗体は使用しない。その代りに正常なヒトの血管中で見られるタンパク質を使用する。このタンパク質は、鉄を送達するトランスフェリンである。正常な細胞が鉄を必要とすることは珍しいが、癌細胞は、その病気により増大した代謝速度を維持するために、多量の鉄を必要とする。癌細胞はより一層の鉄を必要とするので、癌細胞はその表面上にほぼ永続的にトランスフェリン受容体を有しているが、一方で正常な細胞は有していない。これらの発明は、トランスフェリンと結合させた抗癌剤を投与することによってこれらの受容体を利用し、これによって実質的に癌細胞の表面のみに薬剤を送達する。
【0004】
薬剤標的化は正常な細胞に危害を加えることはなく、あまり薬剤を必要とせず、薬剤毒性を大幅に低下させることができる。対照的に、標的化なしで抗癌剤を投与すると、抗癌剤は正常な細胞及び癌細胞を殺傷する。これらは免疫系の細胞、及び血液凝固の原因である系に対して特に毒性がある。従って、感染及び出血が癌患者の化学療法における主な合併症となっている。これらの合併症は、患者にとって不快であり、高価なサービス、入院、集中的なケア、及び生命維持システムを必要とする。標的送達系を使用することによって、これらの問題は大抵防ぐことができる。
【0005】
薬剤毒性の問題は、多大な医者及び看護婦の時間を消費させ、癌治療の大部分のコストの原因である。例えば、腫瘍研究者への約70%の問い合わせは、薬剤毒性の問題に関するものであることは一般的に理解されている。今日、少量の薬剤を使用すること以外には、薬剤毒性を治療するための満足の行く方法は存在しない。標的送達を行わない場合、薬剤耐性がある癌に対して少量の薬剤を使用することは無効である。標的送達では少量の薬剤を使用することができる。なぜなら、より多量の投与薬剤が、身体中に非特異的に分配されるのではなく、癌細胞に特異的に送達されるからである。この意味で、標的送達はライフルで射撃するようなものであり、一方従来の送達はショットガンで射撃するようなものである。薬剤毒性の問題の1つの解決策は、癌患者の化学療法を劇的に変えることであろう。化学療法のこのような悪影響を減らすことは、本発明の目的である。
【0006】
薬剤耐性の問題は、薬剤毒性の問題と同程度に深刻である。この問題は、治療され数ヶ月間続く無症候性の寛解期に、いかなる知られている薬剤にももはや応答しない形であって後に癌の再発が見られる患者において象徴されるものである。薬剤耐性のかかる傾向は非常に一般的であるが、多量のより強力な薬剤を使用すること以外、今日満足の行く解決策は存在せず、従って重大な薬剤毒性の問題を引き起こす可能性があり、死をもたらすことが多い。従って、薬剤耐性の問題のための解決策によって、薬剤毒性の問題が大幅に減少すると思われる。ベラパミルなどのP−糖タンパク質阻害物質(非特許文献1)、シクロスポリン(非特許文献2)及びSDZPSC833などのシクロスポリン誘導体(非特許文献3)、及びタモキシフェン(非特許文献4)の使用に、主な尽力が傾けらていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかし、これらの手法は臨床的に満足の行くものとはなっていない。なぜなら、これらによって化学療法剤の薬物動態において新しい問題がもたらされたからである(非特許文献5)。
【0008】
他の手法は、MDR可逆性薬剤の設計(非特許文献6)、P−糖タンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用(非特許文献7)、抗MDRリボザイムのレトロウイルス仲介の移動の使用(非特許文献8)、及びMDRまたはMRPポンプによって癌細胞から除去されることがない化学療法剤の設計(非特許文献9)であるが、これらの研究はいずれも、薬剤耐性の臨床的な問題のための解決策は与えていない(非特許文献10)。
【0009】
他の手法は、アルブミン(非特許文献11)、α−フェトプロテイン(非特許文献12)及びデキストラン(非特許文献13)などの大きな分子の複合体として抗癌剤を送達することによって、MDR/MRPポンプを回避することである。これらは実験的な薬剤耐性を回避するために色々と有効であるが、これらは患者においては証明されていない。
【0010】
タンパク質標的型の薬剤送達によって、薬剤耐性の問題を克服することができる。従って、本発明の他の目的は、薬剤耐性がある癌による、痛みを伴う高価な死の問題を解決することである。
【0011】
生体に影響を与える分子と結合したタンパク質の有効性は実証されてきており、前述の米国特許中に記載されている。しかしながら、癌細胞などのストレスを受けた細胞の治療における、このような複合体の有効性は、凝集した複合体の存在、あるいは、生体に影響を与える分子とタンパク質断片、または2つまたは3つのタンパク質分子の複合体の存在によって低下する。そして、タンパク質と生体に影響を与える分子の比が1:1または1:2に近づくときに、その生体に影響を与える分子に応じて大幅に向上する。これまでは、有効性が高い複合体を得ることは、生体に影響を与える分子とタンパク質の望ましい平均比を有する複合体の分画を、タンパク質断片、複数のタンパク質と結合したこのような分子、及び、複数の生体に影響を与える分子と結合したタンパク質を含む大きなサンプル、から分離させることを必要とし、これらは緩慢、冗長かつ高価なプロセスであった。タンパク質成分は所定数の生体に影響を与える分子を保有しており、均質なタンパク質−薬剤複合体を使用することによって、薬剤耐性及び薬剤感受性癌細胞の両方を、さらに効果的に殺傷することができる。これまでは、このような複合体を商業化することに関して、及び、それらを薬中に広く使用することに関し、有用な体積の有用な複合体を生成させる際の固有の出費及び無効性が問題となってきた。実質的に均質な薬剤−タンパク質複合体に関する必要性、及び有効で、正確で、コストのかからないような複合体を作製する方法に関する必要性が存在する。さらに有効な方法によって作製されるこのような均質な複合体を提供することは、本発明の1つの目的である。
【0012】
関連技術の説明
ヒト癌細胞のトランスフェリン受容体の最初の報告は、1980年のFaulk及びその同僚によるものであった(1)。以下の表中に示すように、異なるタイプのヒトの癌中の、トランスフェリン受容体の多数の報告がこの報告に続いた(2)。
【0013】
【表1】
【0014】
正常な細胞及び癌細胞上のトランスフェリン受容体
ヒトの癌のすべてが上方制御型トランスフェリン受容体を有しているかどうか、あるいは正常な細胞すべてが下方制御型トランスフェリン受容体を有しているかどうかに関する試験は1つも存在していないが、多くの方面からのデータによって、両方の質問に対する答えはイエスであることが示唆される。例えば、未熟な赤血球(すなわち正赤芽球及び網状赤血球)はその表面上にトランスフェリン受容体を有しているが、成熟した赤血球は有していない(17)。循環性単球も上方制御型トランスフェリン受容体を有しておらず(18)、クッパー細胞を含めたマクロファージは、赤血球貪食というトランスフェリン非依存性の方法によって、その鉄の大部分を得る(19)。実際、in vivoでの試験によって、血漿トランスフェリンから細網内皮系に入る鉄はほとんどないことが示される(概要に関しては、(20)を参照のこと)。マクロファージのトランスフェリン受容体は、γ−インターフェロンなどのサイトカインによって(21)、おそらく細胞内寄生虫を殺傷するための鉄摂取制限機構として(22)下方制御される。
【0015】
休止状態のリンパ球では、トランスフェリン受容体が下方制御されるだけでなく、トランスフェリン受容体の遺伝子は測定不能である(23)。対照的に、刺激されたリンパ球では、トランスフェリン受容体がG1後期に上方制御される(24)。受容体の発現は、c−myc原腫瘍遺伝子の発現の後に起こり、IL−2受容体の上方制御が続き(25)、鉄摂取制御型のタンパク質結合活性の測定可能な増加が伴い(26)、トランスフェリン受容体のmRNAを安定化させる(27)。これはT及びBリンパ球の両方に当てはまり(28)、IL−2依存性の応答である(29)。
【0016】
トランスフェリンの受容体の上方制御をもたらす細胞の刺激としては、経験するストレスからのものであること、例えばウイルスまたは原生動物因子によって及び癌細胞によって侵入された細胞によるものであることが知られている。
【0017】
正常な細胞及び腫瘍細胞のトランスフェリン受容体の上方及び下方制御は、抗原またはレクチン刺激の試験(すなわち受容体の上方制御)、及びレチノイン酸を使用する分化モデルの試験(30〜33)(すなわち受容体の下方制御)によって示されてきている。これらの実験モデルからの基準データによって、大部分の正常の、成体の、休止状態のヒト細胞の原形質膜からの、これらの受容体が下方制御されることが示唆される(34)。例外としては、母胎児関門及びそのトランスフェリン受容体が豊富な合胞体栄養細胞(35)、血液脳関門及びそのトランスフェリン受容体が豊富な毛細管内皮細胞(36)、及び血液精巣関門及びそのトランスフェリン受容体が豊富なスルトリ細胞(37)を含めた、循環関門系である。
【0018】
実験動物におけるトランスフェリン−薬剤複合体
トランスフェリン−薬剤複合体の有効性は、いくつかの動物モデルにおいて調査されてきている。例えば、トランスフェリンとジフテリア毒素の複合体によって、第14日にヌードマウス中の異種移植によるグリオーマが95%減少し、グリオーマは第30日まで再発することはなかった(74)。グルタルアルデヒドで調製したトランスフェリン−ドキソルビシン複合体は、ヒト中皮腫細胞による死からヌードマウスを救済すること、ドキソルビシンのみで処理した動物と比較して大幅に寿命が長いことが見出されている(75)。さらに、トランスフェリンは、ビオチン−ストレプトアビジン技術を使用することによって単純ヘルペスチミジンキナーゼに結合しており、これらの複合体は、転移性K562腫瘍細胞を接種したヌードマウスの寿命を大幅に延ばした(76)。最後に、ヌードマウスにおけるヒトトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の最大耐量は、複合体に関して20mg/kg(iv)、遊離薬剤に関してわずか8mg/kg(iv)であることが見出されている(41)。
【0019】
ヒト患者におけるトランスフェリン−薬剤複合体
トランスフェリン−薬剤複合体の2つの臨床報告が存在する。1990年に発表された1件目の報告は、1日当たり1mgのグルタルアルデヒドで調製したトランスフェリン−ドキソルビシン複合体を用いた静脈内注射によって5日間治療した7人の急性白血病患者の予備試験であった。これらの低い用量によって毒性的な影響はなく、7人の患者の末梢血液中の白血病細胞の数は、治療後10日以内に86%減少した(77)。さらに、治療の前後に骨髄生検を調べることによって評価したように、疾患が拡大することはなかった。
【0020】
1997年にNIHから発表された2件目の報告は、ジフテリア毒素の遺伝的変異体のチオエーテル結合トランスフェリン複合体で治療した再発性の脳癌を有する15人の患者に関するものであった(44)。高流量の隙間へのミクロ注入によって複合体が送達され、これによって霊長類の脳内において最小の炎症応答で、放射標識したトランスフェリンの有効な灌流が生み出されることが示されてきている(78)。磁気共鳴映像法によって、完全に寛解した2症例を含めて、15人中9人の患者の腫瘍体積が少なくとも50%減少したことが明らかになった(44)。
【0021】
試験群(患者12人)及びプラシーボ群(患者11人)に無作為化した、卵巣癌が進行した23人の患者の、未発表の臨床試験が存在する。試験群には、1ヶ月の治療サイクルの第15日〜第19日に、1日当たり1mgのドキソルビシンに等しいトランスフェリン−ドキソルビシン複合体を与えた。診断と無作為化の間の時間が18ヶ月のとき、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体で治療した患者の生存率のコックス回帰の推定値によって、有意な差が明らかになった。
【0022】
他の未発表の試験は、従来のプロトコルによって治療しても応答がない右心房の肉腫からの転移性疾患を有する22才の男性である。彼の肺には転移性病巣が充満しており、このとき彼の内科医である父親は、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体を使用するために、FDAからINDを得て、2000年8月に治療を開始した。11月までに肺は転移性病巣が実質的に除去され、1月までには腫瘍の放射線による形跡がなかった。彼は現在(2002年5月)健康であり、トランスフェリン−ドキソルビシンのみが与えられている。
【0023】
薬剤の標的送達には、少量の薬剤を使用しながら有効性を高め、これによって毒性を低下させ、正常な細胞に対する損傷をあまり引き起こさないという利点があり、これらすべてによってコストが効果的に減少し、患者のケアの質が向上する。標的送達によって、薬剤の細胞への非特異的な侵入によって活性化される、薬剤耐性も回避される(79)。トランスフェリン−薬剤複合体は、受容体に特異的な経路によって特異的に細胞に侵入することができるので(80,81)、これらは耐性細胞中の輸送ポンプなどの、薬剤耐性機構の周辺を通される。
【0024】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体は、多剤耐性細胞を効果的に殺傷することが1992年に報告された(82)。この発見は1993年に確認され(83)、1994(84)、1996(85)及び2000(86)に、いくつかのタイプの薬剤耐性細胞に広がった。興味深いことに、固形担体に固定されたドキソルビシンは、ドキソルビシン耐性細胞に対して有効であることも示されてきている(60,87)。実際、いくつかのペプチドベクターの1つを用いたドキソルビシンのベクター化が、多剤耐性を克服する際に有効であるという、概念が生じている(88)。
【0025】
トランスフェリン−薬剤複合体の作製。
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体を作製するための方法は、1984年に最初に発表され(38)、その後トランスフェリン−薬剤複合体を作製するための方法の多くの報告が存在しており、そのうちのいくつかを以下の表中に挙げる。
【0026】
【表2】
【0027】
ドキソルビシンのトランスフェリン複合体は、グルタルアルデヒド仲介のシッフ塩基形成を使用することによって作製されてきており(56,57)、これによってトランスフェリンのε−アミノ酸のリジン基とドキソルビシンの3’アミノ酸位置の間に、酸耐性の結合が形成される。このようなドキソルビシンの複合体は、原形質膜仲介の機構によって癌細胞を殺傷することができる(概要に関しては、(58)を参照のこと)。DNA挿入はドキソルビシンによる細胞死の確立された機構であるが、細胞表面上の受容体に結合することができる、タンパク質と結合した固定型ドキソルビシンは、原形質膜仲介の機構を活性化させて、細胞を殺傷する(59,60)。従って、ドキソルビシンとトランスフェリン複合体は、ドキソルビシン及びトランスフェリン受容体の両方にと関連がある原形質膜仲介の機構を活性化させることによって、細胞を殺傷するようである。
【特許文献1】
米国特許第5,108,987号
【特許文献2】
米国特許第5,000,935号
【特許文献3】
米国特許第4,895,714号
【特許文献4】
米国特許第4,886,780号
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【課題を解決するための手段】
【0028】
標的化剤−薬剤複合体には薬剤の送達法を変える一般的な可能性、ならびに癌患者への薬剤の送達法を変える具体的な可能性があることは明らかである。本発明では、トランスフェリン、セルロプラスミンなどの非抗体タンパク質、トランスコバラミンなどのビタミン結合タンパク質、ホルモン、ソマトスタチン、サイトカイン、低密度リポタンパク質、成長因子、成長因子様分子を、抗癌性化合物と組み合わせて標的化剤として使用する。トランスフェリン及びトランスコバラミンは、薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞に化合物を送達させるための優れた担体であるので、本発明の標的送達系は、温熱増感剤、光増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択される抗癌性化合物に結合した、トランスフェリンまたはトランスコバラミンからなることが好ましい。
【0029】
本発明は、標的化剤と抗癌剤の複合体に関する。本発明の標的化剤には、トランスフェリン、セルロプラスミン、ソマトスタチン、ビタミン、トランスコバラミンなどのビタミン結合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、低密度リポタンパク質、成長因子様分子、葉酸様分子及び成長因子があるが、これらだけには限られない。抗癌剤には、ヘマトポルフィリン及び少量のベラパミルなどの温熱増感剤、デフェロキサミンなどのアポトーシス誘導化合物、及びポルフィマーナトリウム(profimer sodium)、メタテトラヒドロキシフェニルクロリン、及びヘマトポリフィリン誘導体などの光増感剤があるが、これらだけには限られない。標的化剤は、トランスフェリンまたはトランスコバラミンであることが好ましい。抗癌剤と標的化剤は、連結基によって結合していることが好ましい。適切な連結基には、グルタルアルデヒド(非特許文献14)、ジスルフィド結合(非特許文献15)、及びベンゾイルヒドラゾン(非特許文献16)があるが、これらだけには限られない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0030】
トランスフェリン−温熱増感剤複合体
温熱療法は単独で、あるいは化学療法及び放射線療法と組み合わせて、癌治療において広く使用されている(非特許文献17)。組み合わせ治療では、温熱療法剤(41〜45℃)は、有効な放射線増感剤であることが示されてきている(非特許文献18)。熱によって、ブレオマイシン(非特許文献19)、カルボプラチン(非特許文献20)、ドキソルビシン(非特許文献21)、及びシスプラチン(非特許文献22)などの、いくつかの抗癌剤の細胞毒性効果が高まる。温熱療法は、いくつかの療法に耐性がある悪性腫瘍において使用され(非特許文献23)、高温(50℃を超える)での温熱療法が、従来の侵襲的手術の代替法として、選択的に組織を破壊するために使用されてきている(非特許文献24)。
【0031】
温熱療法の有効性は、療法による温度上昇を局在させ維持するための能力に強く依存する(非特許文献24)。より良い結果を得るために、いくつかの技法を使用して、組織中での制御された温度上昇が生み出されている。これらの技法のいくつかは、YAGレーザー(非特許文献25)、無線周波数(非特許文献26)、超音波(非特許文献24)、及びマイクロ波(非特許文献27)の使用に関するものである。温熱療法は高温においてより有効であるが、熱による損傷から健康な組織を保護するための必要性によって、その使用は制限される。
【0032】
通常の体温では毒性ではないいくつかの化合物においては、熱は毒性を誘発する。この一例としてはヘマトポルフィリンである。この分子は、41.5℃では強力な温熱(または温熱療法)増感剤であり、その増感能力は用量依存式に増大する(非特許文献28)。温熱(または温熱療法)増感剤の他の例は、42℃での少量のベラパミルの使用である(非特許文献29)。温熱増感剤が局所の温度を上昇させることはない。熱の存在下で高い局所毒性を生み出すことによって、これらは機能する。
【0033】
体温より高い温度で毒性を生み出す非毒性化合物、または高温においてその毒性が高まる毒性化合物を癌細胞のみに送達させることができる場合、温熱療法をさらに有効に使用して、癌を治療することができると思われる。このような標的送達系は健康な組織に損傷を与えることはないと思われ、組織は高温の影響のみを受けると思われる。
【0034】
本発明によって、高温で癌細胞に関する毒性が非常に高い化合物を、選択的に送達させる方法が導入される。この標的送達系は、温熱(または温熱療法)増感剤の担体としての、トランスフェリンの使用を含む。
【0035】
温熱増感剤の標的送達の使用によって、温熱療法そのもの、あるいは他の治療と組み合わせた温熱療法の結果がさらに有効となると思われる。なぜなら、温熱増感剤の毒は、癌細胞中に濃縮させることができるからである。このようにして、健康な組織の損傷は最小限である。なぜなら、大部分の増感剤は比較的低い温度(例えば41〜42℃)で働くことができるからである。
【0036】
トランスフェリンは、薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞に化合物を送達させるための優れた担体なので、本発明の標的送達系は、温熱増感剤と結合したトランスフェリンからなる。ヒト患者において使用するためのトランスフェリンは市販されている(例えばFinnish Red Crossから)。トランスフェリンと他の化合物を結合させるために、グルタルアルデヒド結合(非特許文献14)、ジスルフィド結合(非特許文献15)、及びベンゾイルヒドラゾン結合(非特許文献16)などの、いくつかの結合法が使用されてきている。さまざまな結合手順によって、広範囲の増感剤をトランスフェリンに結合させることができ、増感剤とトランスフェリン分子の永続性または解離性の結合がもたらされる。選択した温熱増感剤にトランスフェリンが結合した後に、例えばクロマトグラフィー及び/または透析技法を使用することによって、非結合成分から複合体を分離しなければならない。適切な温熱増感剤の例には、ドキソルビシン、シスプラチン及びヘマトポリフィリンがあるが、これらだけには限られない。
【0037】
トランスフェリン−光増感剤複合体
癌の光化学療法は、光力学療法(PDT)と呼ばれることが多い。この形の療法は1970年代後期に生じ、局在する手術不能な病巣の治療の代替形として登場した(非特許文献30)。この療法は、代謝的変化を必要とする可能性がある腫瘍を局在させる物質(例えばプロドラッグ)の投与に関するものであり(非特許文献31)、後に特定の波長の光線によって物質が活性化される(非特許文献32)。これによって、血栓症(非特許文献35)及びアポトーシス(非特許文献36)による、腫瘍壊死(非特許文献34)を開始させる一重項酸素(非特許文献33)の生成などの、一連の光化学的及び光生物学的反応の生成がもたらされる。
【0038】
1990年代のPDTの進展には、より長い波長を吸収し活性化のためのエネルギーをあまり必要とせず、より深く透過することができ、さらに有効な光増感剤の開発が含まれている。難しい幾何形状の照明を可能にする、新しい光ファイバーも開発されてきており、小さく、安値でさらに可動的なレーザーがより容易に入手可能になってきている。この研究及び開発によってPDTが、癌の初期治療のため、及び大きな腫瘍の外科的減少法を補助するための、より広く使用される治療用の物理的療法に進化している。
【0039】
PDTによる治療は、基底細胞癌(非特許文献37)、リンパ腫(非特許文献38)、胃癌(非特許文献39)、及び白血病(非特許文献40)を含めた、広範囲のさまざまな癌において使用されてきている。実際、最近の報告では、FDAに承認された光増感剤Photofrin(ポルフィマーナトリウム)によって治療されてきている60タイプを超える癌を挙げている。癌治療におけるその使用に加えて、皮膚科学(非特許文献41)、眼科学(非特許文献42)においてもPDTが使用されてきており、近年PDTは、血管形成手順において使用されてきている(非特許文献43)。
【0040】
FDAの承認を得るための最初の光増感剤は、カナダのQLT Photo Therapeuticsによって製造されたPhotofrinであった。他の広く研究されている光増感剤は、アミノレブリン酸である。臨床試験中の他の分子は、Pharmacia/UpjohnによってPurlytinとして製造されたクロリン光増感剤である、SnET2である。また、他の化合物としては、Scotia PharmaceuticalsによってFoscanとして製造された、メタテトラヒドロキシフェニルクロリンである、mTHPCがある。黄斑変性は、ヘマトポリフィリン誘導体である光増感剤Verteporfinを使用することによって阻害されてきている。光増感剤として使用されたこれらの及びいくつかの他の化合物は、Stewart及びその同僚(非特許文献44)、及び、Dougherty及びその同僚によって(非特許文献45)報告されてきている。
【0041】
トランスフェリン受容体の存在は、Faulk及びその同僚によって非特許文献46中に最初に記載されたように、主に腫瘍細胞の表面に限られるので、光増感剤の担体としてトランスフェリンを使用することによって、薬剤が癌細胞のみを標的とすることがほぼ保証され、従ってPDTの影響を腫瘍に、腫瘍のみに局在させることができる。正常な細胞の付随的な損傷を最小限にすることに加えて、トランスフェリンの複合体としての光増感剤薬剤の標的化によって、低用量の薬剤の使用が可能になり、いくつかの薬剤の副作用は低下するであろう。例えば、Photoprinで治療した何人かの患者が遭遇する太陽光感受性は用量関連の問題である。
【0042】
トランスフェリンの複合体としての光増感剤薬剤の、癌細胞の表面上のトランスフェリン受容体への送達を標的化する本発明は、担体の生物学的性質に由来する、いくつかの利点を有する。これらの最も重要なものは、血液脳関門を交差するトランスフェリン薬剤複合体の性質である(非特許文献47)。この性質は、血液脳関門の微小循環をもたらす内皮細胞の管腔表面上のトランスフェリン受容体の通常の存在によって、分子に与えられる(非特許文献48)。
【0043】
血液循環からの分子をトランスフェリンの複合体として脳に送達させるために、これらが使用されてきており(非特許文献49)、これによって脳癌を有する患者におけるPDTの標的型の使用が可能である。
【0044】
トランスフェリンを光増感剤薬剤の理想的な担体として位置付けているトランスフェリンの他の生物学的性質として、それがトランスフェリン受容体と結合した後に細胞中に貪食されることがある(非特許文献50)。この性質によって、光増感剤を癌細胞の内部に局在させることができ、これによって薬剤が濃縮され、殺傷が増大する。この点において、トランスフェリンのドキソルビシン複合体は、10倍高濃度の遊離ドキソルビシンによって殺傷されないドキソルビシン耐性癌細胞を殺傷するために使用されてきていることと関連がある(非特許文献51)。
【0045】
以下の検討では、トランスフェリンは標的化タンパク質の例示的なものである。トランスフェリンは正常な血液の血漿から単離させることができ、American及びFinnish Red Crossを含めた任意のいくつかの会社から購入することができ、あるいは組み換え技術から調製することができる(非特許文献52)。
【0046】
薬剤とトランスフェリンとの複合体を形成するためには、トランスフェリン分子を、それを光増感剤薬剤に結合させるために調製するような方法で改変しなければならない。例えば、トランスフェリンをチオール化して、薬剤のマレイミド誘導体を形成することができる(非特許文献16)。結合の正確な方法は、トランスフェリンと結合する光増感剤の化学的性質に依存する。例えば、Photofrinは、エステル及びエーテル結合を含むポリポルフィリンであり、1タイプの担体(非特許文献53)、グルタルアルデヒド及びその他の二官能性試薬を使用することによってトランスフェリンに結合することができるNH2基を含む他の薬剤が、ジスルフィド結合を必要とすることが示唆されている(非特許文献54)。広くさまざまな結合手順によって、広範囲の光増感剤薬剤をトランスフェリンに結合させることができ、トランスフェリン分子と薬剤の永続性または解離性の結合がもたらされる(非特許文献55)。どのような手順を使用しても、結合反応の後には、薬剤−タンパク質複合体を、好ましくはクロマトグラフィーまたは透析技法を使用することによって、非結合薬剤及び/または遊離タンパク質から分離しなければならない。
【0047】
トランスフェリン−アポトーシス誘導化合物複合体
癌の鉄摂取制限型の細胞毒性に関する機構は、プログラムされた細胞死の増強である。デフェロキサミンは、ヒト骨髄白血病細胞のアラビノシド仲介のアポトーシスを増大させることが見出されている(非特許文献56)。アポトーシスに関する主用経路は、カルシウム仲介の下流のシグナリング、次にプログラムされた細胞死に関する表面受容体CD95のリガンド結合を含むという、重要な証拠が存在している(非特許文献57)。同様に、トランスフェリン受容体は、細胞内の遊離カルシウム濃度を増大させることによって、それ自体の循環のためにシグナル伝達分子として機能する(非特許文献58)。総合的に考察すると、これらの一見無関係な観察結果によって、薬剤耐性癌細胞における、カルシウム、鉄、及びトランスフェリン受容体の間の、これまで記載されなかった関係が示される。
【0048】
カルシウムとトランスフェリン受容体の間の関係を調べるために、トランスフェリン受容体の調節に対するカルシウムチャンネル阻害剤の影響を、薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞の療法において試験した。これらの実験の結果によって、有機(例えばベラパミル)及び無機(CdCl2)カルシウムチャンネル遮断剤の両方が、トランスフェリン受容体の制御に対して特異な影響を引き起こすことが示される。例えば、両タイプのチャンネル遮断剤が受容体の下方制御を開始させたが、薬剤感受性細胞よりも薬剤耐性細胞において、より一層の下方制御が観察された。下方制御の半減期は約8時間であったので、表面受容体の減少はエキソサイトーシスの阻害から生じたわけではなかった。遊離鉄またはトランスフェリン結合鉄を加えることも、トランスフェリン受容体の下方制御に対して特異な影響があった。影響は類似していたがさらに顕著であった。すなわち、鉄で下方制御された受容体が薬剤感受性細胞よりも薬剤耐性細胞上にはるかに多く、カルシウムチャンネル遮断剤とほぼ同じ半減期を生み出した。鉄及びカルシウムチャンネル遮断剤を加えることによって、細胞の生存能力に影響を与えることはなかった。
【0049】
前述の発見を考慮して、他の実験系を行うことで、デフェロキサミンによって鉄を制限することが薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞に対して特異な影響があるかどうかを検討した。これらの実験の結果、低濃度のデフェロキサミンは、薬剤感受性細胞及び薬剤耐性細胞のトランスフェリン受容体を上方制御したが、高濃度のデフェロキサミンは、薬剤耐性細胞によるトランスフェリン受容体の発現を低下させることが明らかになり、生存能力の実験では、高濃度によって薬剤感受性細胞ではなく薬剤耐性細胞が殺傷されたことが示された。例えば、所与の濃度のデフェロキサミン中での48時間後に、薬剤感受性細胞は93%の生存能力を示したが、わずかに16%の薬剤耐性細胞が生存していた。これら3つの異なるタイプの実験を要約することによって、薬剤耐性細胞中でのトランスフェリン受容体調節の著しい不安定性が明らかになり、鉄が欠乏することによって薬剤耐性細胞の死がすぐに引き起こされたことが示された。
【0050】
本発明は、癌患者中の薬剤耐性細胞を、標的化し殺傷するための方法である。好ましい実施形態では、鉄キレート剤を薬剤耐性癌細胞に向ける薬剤担体の複合体を作製する。トランスフェリンは、鉄キレート剤を送達するのに充分適合する通常の血液中のタンパク質である。なぜなら腫瘍細胞は、その表面上にトランスフェリン受容体を有しており、通常、成体、休止状態の細胞は有していないからである(非特許文献14)。トランスフェリンと結合することができ薬剤耐性癌細胞に送達することができる多くの鉄キレート剤が存在するが(非特許文献59)、デフェロキサミンの化学的性質によって、それはトランスフェリンへの結合に充分適合したものとなっている(非特許文献60)。グルタルアルデヒド(非特許文献61)、ジスルフィド結合(非特許文献54)、及びベンゾイルヒドラゾン結合(非特許文献16)だけには限られないがこれらを含めた、標的化剤と他の化合物を結合させるための、いくつかの複合または結合手順が考えられる。
【0051】
広くさまざまな結合手順によって、広範囲の鉄キレート剤を標的化タンパク質に結合させることができ、細胞毒性薬剤とタンパク質分子の永続性または解離性の結合がもたらされる(非特許文献55)。この結合反応の後に、薬剤−タンパク質複合体を、好ましくはクロマトグラフィーまたは透析手順を使用することによって、非結合薬剤及び遊離タンパク質から分離することができる。
【0052】
複合手順の技術的な詳細は変わる可能性があるが、複合体は癌細胞に関する結合及び殺傷実験において活性がなければならず、多数の正常な細胞に結合したり、あるいはこれらを殺傷してはならない。これらの実験を考慮すると、本発明の複合体を作製するための好ましい方法は、以下のプロセスである。
【0053】
所定のモル比を有する多量の均質なトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の合成を、ドキソルビシン(DOX)の3’アミノ位置のアミノ基のみを使用して化学量論的に行って、DOXの生理食塩水溶液を、DMSOなどの溶媒を含むグルタルアルデヒド(GLU)の生理食塩水溶液、または他の適切な凍結保存液に一滴ずつ加えることにより、GLUの2つの反応基の1つと反応させて、DOXとGLUのモル比1:1の最終濃度にした。生成したDOX−GLUの溶液を、暗所において室温で3時間攪拌した。
【0054】
遊離DOXも遊離GLUも含まないDOX−GLUの最終溶液を生成するために、DOXとGLUのモル濃度は前述の反応と同じであった。しかしながら、1つのGLUが2つのDOXと反応してDOX−GLU−DOXが生成する場合、溶液中に遊離GLUが存在する可能性があるが、一価のDOXを二価のGLUの溶液に一滴ずつ加えることによって生じる質量作用動態により、この可能性は最小限になる。これらの反応物の体積は制限されないので、多量の均質なDOX−GLUを調製することができる。
【0055】
トランスフェリン(TRF)の生理食塩水溶液に一滴ずつ加えることによって、DOX−GLUを標的化タンパク質と複合させた。トランスフェリンは鉄を含まないか(アポトランスフェリン)、あるいは鉄が飽和していてよい(ハロトランスフェリン)。DOXとTRFの所望のモル比を、TRFの体積を適切に調節することによって得た。生成したTRF−GLU−DOXの溶液を、暗所において室温で20時間攪拌した。DOXとGLUの反応とは異なり、DOX−GLUとTRFの反応は1つの結合部位に限られない。なぜなら、DOX−GLUのGLU成分は、TRF分子中のいくつかのε−アミノ酸のリジン基の、任意の1つと反応することができるからである。
【0056】
TRFに結合するDOX分子の数を、計算によって決定した。例えば、DOX−GLUとTRFの最初の比が7.2:1.0であった場合、TRF−GLU−DOXの最終溶液は、TRF1分子当たり2.5個のDOX分子を含むと思われる。しかしながら、DOX−GLUとTRFの最初の比が4.0:1.0であった場合、TRF−GLU−DOXの最終溶液は、TRF1分子当たり1.4個のDOX分子を含むと思われる。同様に、DOX−GLUとTRFの最初の比が2.5:1.0であった場合、TRF−GLU−DOXの最終溶液は、TRF1分子当たり0.9個のDOX分子を含むと思われる。このようにして、DOXとTRFが所定の比である多量のTRF−GLU−DOXを必要に応じて与えることができる。
【0057】
複合体反応における他のステップは、エタノールアミン、または任意の過剰な連結基を除去するのに適した他の物質の添加、次に遠心分離及び透析であった。DOXとTRFの反応は理論上はGLUをすべて消費するが、エタノールアミンを最終反応混合物に加えて、任意の利用可能なGLUを結合させた。この反応は、暗所において30分間続けた。最終溶液を2000rpmで10分間の遠心分離にかけ、100倍過剰の生理食塩水で6時間かけて2回透析し、同じ過剰のHepes緩衝生理食塩水で3回透析し、生成したTRF−GLU−DOX複合体が、使用するために用意された。
【0058】
複合体の生化学的特性:
(39)に記載されたのと同様にHPLC及びポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することによって、TRF−GLU−DOX複合体の均質性を検討することができる。(89)に記載されたのと同様に分光光度法を使用することによっても、DOXとTRFの分子比を検討することができる。これらの技法によって、TRF−GLU−DOX複合体の一貫した均一性が繰り返し明らかになっている。さらにクロマトグラフィーは、これらの複合体の調製では必要とされない。なぜなら、凝集体または断片が存在しないからである。これによって多量の均質なトランスフェリン−薬剤複合体を作製することができ、収率が上がりコストは低下する。
【0059】
他のタイプのトランスフェリン−薬剤複合体における、TRF及びDOXの損失によって引き起こされる犠牲は、それらを使用する障害となっている。例えば、DOX及びTRFの収率は、薬剤及び/またはタンパク質を変えるチオール化(44)などの手法を経由することによって低下する。使用される溶媒系(86)、又は、酸安定性及び酸不安定性の連結を作製するために使用するクロマトグラフィー(41)によっても収率は低下する。DOXとTRFの間に結合したGLUは酸安定性であり(89)、本発明に従って作製したTRF−DOX複合体中のDOX及びTRFの収率は高い。実際、他の手順(38,39,40)と比較すると、本発明のTRFの収率はほぼ2倍であり(90%と50%)、DOXの収率は5倍増大する。
【0060】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体を作製するために知られている手法は、トランスフェリン1分子当たりの薬剤分子の数が所定の割合よなる均質な複合体を多量に生成することができない。さらに、他の手法はクロマトグラフィーを使用して凝集体を除去し、均質な複合体中に豊富な分画を採取する。これらの手順は収率を低下させ、コストを増大させ、分子比を予め決定する能力を欠いている。
【0061】
他の手順は、1ミリリットルのトランスフェリン(0.5mM)と1ミリリットルのデフェロキサミン(8.5mM)を150mMの塩化ナトリウム中で4分間混合し、次いで150mMの塩化ナトリウム中に21.5mMのグルタルアルデヒド1ミリリットルを加え、4分間混合することである。前述の反応は結合手順であり、150mMの塩化ナトリウム及び10mMのHepes緩衝液(pH8)の中に37.2mMのエタノールアミン0.8ミリリットルを加え、4分間攪拌することによって、これを停止させる。次いで混合物(3.8ミリリットル)を透析チューブに移し(分子量カットオフ12,000〜14,000)、暗所において5℃で3時間かけて、0.5リットルのHepes緩衝生理食塩水に対して透析した。この透析は、フレッシュなHepes緩衝生理食塩水を用いて、少なくとも1度は繰り返さなければならない。次いで混合物を4℃において1600gで10分間遠心分離にかけ、その上澄みは、Hepes緩衝生理食塩水中で事前に平衡状態にし、ブルーデキストラン、トランスフェリン及びシトクロムCに関して5℃で目盛り調整した、Sepharose CL−4Bの2.6×34cmカラム上で、1時間あたりの流速22ミリリットルでクロマトグラフィーにかける。カラムからの溶出を280nmで監視し、3.8ミリリットルの分画を回収した。それぞれの分画中のトランスフェリン及びデフェロキサミンの濃度は、トランスフェリンに関しては280nm、デフェロキサミンに関しては365nmを使用することによって決定した、トランスフェリン及びデフェロキサミンの標準曲線からの逐次近似値によって計算する。わずかな改変によって、この結合手順を使用して、疎水性逆相シデロホアのタンパク質複合体などの、他の鉄キレート剤の標的化タンパク質複合体を作製することができる。
【0062】
複合体の特性決定
純粋な薬剤−タンパク質複合体を単離した後、それらをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特定し、それらの分子量を決定し、タンパク質1分子あたりの薬剤分子の数を決定する。トランスフェリン1分子あたりの薬剤分子の正確な数は、吸光光度技法だけには限られないがこれを含めた任意の適切な技法を使用して、決定することができる。官能性薬剤とタンパク質の比は、約0.1:1.0と3.0:1.0の間である(非特許文献14)。複合体を調べて、それらが腫瘍細胞の表面上の受容体に結合するかどうかを決定し、複合体が正常な細胞ではなく癌細胞を殺傷するかどうかを決定する。癌細胞に結合し正常な細胞には結合しない複合体のみを、薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞を使用する毒性試験用に選択する。結合試験はフローサイトメトリーまたは任意の他の適切な方法を使用して行うことができ、殺傷試験はミクロ培養技法を使用して、同数の癌細胞を殺傷するのに必要とされる薬剤−タンパク質複合体中の薬剤の濃度と比較して、癌細胞の培養物50%を殺傷するのに必要とされる遊離薬剤の濃度を決定することによって行うことができる。温熱増感剤の複合体を試験するときは、MITテトラゾリウム非色アッセイ(非特許文献62)を使用することによって毒性試験を行う。これらの毒性試験によって、薬剤感受性及び薬剤耐性細胞の熱感度を最大にするための、最も有効なトランスフェリン増感剤比及び複合体の最適濃度が決定される。薬剤−タンパク質複合体中の薬剤と比較して、約10倍を超える遊離薬剤が、同数の細胞を殺傷するために必要とされる。
【0063】
前述の記載はトランスフェリンが送達可能なタンパク質であることを指すが、細胞上の受容体部位に結合することができる他のタンパク質が、身体中に存在することが知られている。このような受容体部位が癌細胞中において活性化され、正常な細胞中では不活性である場合、このような受容体部位に結合する任意のタンパク質または他の分子(すなわちリガンド)を使用して、本発明で使用する薬剤を送達することができる。このような結合タンパク質の一例はトランスコバラミンであり、これはビタミンB12を、癌細胞を含めた細胞上のトランスコバラミン受容体に送達させる(非特許文献63)。低密度リポタンパク質は、光増感剤クロリンに結合し、網膜芽腫細胞上の低密度リポタンパク質受容体を標的としている、他のリガンドである(非特許文献64)。
【0064】
薬剤−タンパク質複合体を作製し、精製し、特徴付けし、細胞の結合性及び殺傷性を確認した後、かつ結合性及び殺傷性の実験によって、複合体が正常な細胞ではなく癌細胞に結合しそれを殺傷することが示されるとき、次いでその複合体を等分し滅菌する。セシウム照射装置を使用することなどによって照射に曝すこと、またはMillipore濾過法を使用することだけには限られないが、これらを含めた任意の適切な方法によって、滅菌法を行うことができる。
【0065】
本発明の他の態様に従って、鉄含有トランスフェリン、及びトランスフェリンと温熱増感剤、光増感剤またはアポトーシス誘導化合物のいずれかの複合体を含む、腫瘍を治療するための試薬キットを提供する。トランスフェリン受容体を有する患者の正常な細胞は、光増感剤、温熱増感剤またはアポトーシス誘導化合物の複合体を投与する前に、これらの受容体を鉄含有トランスフェリンで飽和させることによって、複合体の影響に対して保護することができる。
【0066】
本発明は、トランスフェリンといくつかの異なる光増感剤、温熱増感剤及び/またはアポトーシス誘導化合物の複合体を、前記腫瘍細胞の一部分に別々に投与することを含む、抗癌剤に対する腫瘍細胞の感受性を判定するための方法も提供する。いくつかのこのような異なる複合体を含む試薬キットを、この目的のために提供することができる。腫瘍細胞が本発明の複合体を非常に急速に取り込むことが、見出されてきている。これは、患者からの除去の約数時間以内に、一定範囲のトランスフェリンと異なる抗癌剤の複合体に対して、腫瘍細胞を試験することができることを意味する。このような方法によって、腫瘍細胞の単離後できるだけ早く、所与の患者に最も有効な化学療法剤を決定することができると思われる。
【0067】
本発明の複合体は、有効な量で動物に投与する。癌の治療においては、有効な量とは、腫瘍の大きさを減少させ、腫瘍の増殖を遅らせ、転移を予防または阻害し、あるいは冒された動物の平均余命を延ばす、ための有効な量を含む。本発明は、癌を治療する方法であって、癌が白血病癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、胃腸癌、鼻咽頭部癌、頸部癌、肉腫、メラノーマ、リンパ腫/メラノーマ、グリオーム、または星状細胞腫であってよいが、これらだけには限られない方法を提供する。複合体に関する用量は、患者の年齢、体重、及び状態、及び抗癌剤の薬物動態を考慮して、決定することができる。有効な治療のために必要とされる複合体の量は、抗癌剤を単独で使用するのに必要な量未満であろう。
【0068】
本発明の薬剤組成物は、経口、局所、直腸、膣内、肺経路、例えばエアロゾルの使用を含めたいくつかの経路によって投与することができ、また、これらによるものだけには限られない。更に、腹腔内、動脈内または静脈内を含めて非経口的に、投与することができ、また、これらによるものだけには限られない。組成物は単独で投与することができ、あるいは標準的な薬剤慣習に従って、薬剤として許容可能な担体または賦形剤と組み合わせることができる。経口形態の投与に関しては、錠剤、カプセル、薬用ドロップ、トローチ、粉末、シロップ、エリキシル、水溶液及び懸濁液などの形で、組成物を使用することができる。非経口投与に関しては、複合体の滅菌溶液を通常作製し、その溶液のpHは適切に調整し緩衝させる。静脈内の使用に関しては、溶質の全体濃度を制御して、調製物を等張にしなければならない。眼部の投与に関しては、軟膏または滴眼可能な液体を、アプリケータまたは滴眼びんなどの当分野で知られている、眼部送達系によって送達させることができる。肺への投与に関しては、エアロゾルの形成を可能にするための適切な、希釈剤及び/または担体が選択されるであろう。本発明の複合体は非経口的に、すなわち静脈内または腹腔内に、注入または注射によって投与することが好ましい。
【0069】
本発明の好ましい実施形態を、以下に記載する。変更形態及び変形形態が可能であり、それらはすべて本特許請求の範囲内に入ると考えられることは、以下の記載を読んだ後には、当業者には明らかであろう。
【0070】
実施例1
均質なトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の作製
所定のモル比を有する多量の均質なトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の合成を、ドキソルビシン(DOX)の3’アミノ位置のアミノ基のみを使用して化学量論的に行い、グルタルアルデヒド(GLU)の2つの反応基の1つと反応させた。最初のステップとして、氷冷水浴中においてGLUを一滴ずつDMSOに加えた。次のステップは、DOXの生理食塩水溶液を、GLU+DMSOの生理食塩水溶液に一滴ずつ加えて、DOXとGLUのモル比が1:1である最終濃度にした。生成したDOX−GLUの溶液を、暗所において室温で3時間攪拌した。
【0071】
遊離DOXも遊離GLUも含まないDOX−GLUの最終溶液を生成するために、DOXとGLUのモル濃度は前述の反応と同じであった。しかしながら、1つのGLUが2つのDOXと反応してDOX−GLU−DOXが生成する場合、溶液中に遊離GLUが存在する可能性があるが、一価のDOXを二価のGLUの溶液に一滴ずつ加えることによって生じる質量作用動態により、この可能性は最小限になる。これらの反応物の体積は制限されないので、多量の均質なDOX−GLUを調製することができる。
【0072】
その後DOX−GLUを、トランスフェリン(TRF)の生理食塩水溶液に一滴ずつ加えた。TRFは鉄を含まないか(アポトランスフェリン)、あるいは鉄が飽和していてよい(ハロトランスフェリン)。DOXとTRFの所望のモル比を、TRFの体積を適切に調節することによって得た。生成したTRF−GLU−DOXの溶液を、暗所において室温で20時間攪拌した。DOXとGLUの反応とは異なり、DOX−GLUとTRFの反応は1つの結合部位に限られない。なぜなら、DOX−GLUのGLU成分は、TRF分子中のいくつかのε−アミノ酸のリジン基の、任意の1つと反応することができるからである。
【0073】
TRFに結合するDOX分子の数を、第2のステップで決定した。例えば、DOX−GLUとTRFの最初の比が7.2:1.0であった場合、TRF−GLU−DOXの最終溶液は、TRF1分子当たり2.5個のDOX分子を含むと思われる。しかしながら、DOX−GLUとTRFの最初の比が4.0:1.0であった場合、TRF−GLU−DOXの最終溶液は、TRF1分子当たり1.4個のDOX分子を含むと思われる。同様に、DOX−GLUとTRFの最初の比が2.5:1.0であった場合、TRF−GLU−DOXの最終溶液は、TRF1分子当たり0.9個のDOX分子を含むと思われる。このようにして、DOXとTRFが所定の比である多量のTRF−GLU−DOXを、必要に応じて与えることができる。
【0074】
反応生成物中に残っている任意の過剰なGLUは、エタノールアミンを加え、次に遠心分離及び透析することによって除去することができる。DOXとTRFの反応は理論上はGLUをすべて消費するが、エタノールアミンを最終反応混合物に加えて、任意の利用可能なGLUを結合させた。この反応は、暗所において30分間続けた。最終溶液を2000rpmで10分間の遠心分離にかけ、100倍過剰の生理食塩水で6時間かけて2回透析し、同じ過剰のHepes緩衝生理食塩水で3回透析し、生成したTRF−GLU−DOX複合体が、使用するために用意された。
【0075】
複合体に関する生化学的な特性決定:
HPLC及びポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することによって、TRF−GLU−DOX複合体の均質性を決定することができる。分光光度法を使用することによっても、DOXとTRFの分子比を決定することができる。これらの技法によって、TRF−GLU−DOX複合体の一貫した均一性が繰り返し明らかになっている。さらにクロマトグラフィーは、これらの複合体の調製では必要とされない。なぜなら、凝集体または断片が存在しないからである。これによって多量の均質なトランスフェリン−薬剤複合体を作製することができ、収率が上がりコストは低下する。
【0076】
他のタイプのトランスフェリン−薬剤複合体における、TRF及びDOXの損失によって引き起こされる犠牲は、それらを使用する障害となっている。例えば、DOX及びTRFの収率は、薬剤及び/またはタンパク質を変えるチオール化(44)などの手法を経由することによって低下する。使用される溶媒系(86)、又は、酸安定性及び酸不安定性の連結を作製するために使用するクロマトグラフィー(41)によっても収率は低下する。DOXとTRFの間に結合したGLUは酸安定性であり、本発明に従って作製したTRF−DOX複合体中の、DOX及びTRFの収率は高い。実際、他の知られている手順と比較すると、TRFの収率はほぼ2倍であり(90%と50%)、DOXの収率は5倍増大する。
【0077】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体を作製するための公知の手法は、トランスフェリン1分子当たりの薬剤分子の数が所定の割合である、多量の均質な複合体を生成することができない。さらに、他の手法はクロマトグラフィーを使用して、凝集体を除去し、均質な複合体中に豊富な分画を採取する。これらの手順は収率を低下させ、コストを増大させ、分子比を予め決定する能力を欠いている。
【0078】
実施例2
トランスフェリン−アポトーシス誘導化合物(デフェロキサミン)複合体の作製
グルタルアルデヒド(GLU)を、氷冷水浴中においてDMSOに一滴ずつ加え、次にデフェロキサミン(DEF)の生理食塩水溶液を、GLU+DMSOの生理食塩水溶液に一滴ずつ加えて、DEFとGLUのモル比が2:1である最終濃度にした。生成したDEF−GLUの溶液を、暗所において室温で3時間攪拌した。
【0079】
DEF−GLUを、トランスフェリン(TRF)の生理食塩水溶液に一滴ずつ加えた。TRFは鉄を含まないか(アポトランスフェリン)、あるいは鉄が飽和していてよい(ハロトランスフェリン)。DEFとTRFの所望のモル比を、TRFの体積を適切に調節することによって得た。生成したTRF−GLU−DEFの溶液を、暗所において室温で20時間攪拌した。DEFとGLUの反応とは異なり、DEF−GLUとTRFの反応は1つの結合部位に限られない。なぜなら、DEF−GLUのGLU成分は、TRF分子中のいくつかのε−アミノ酸のリジン基の、任意の1つと反応することができるからである。
【0080】
TRFに結合するDEF分子の数を、DEF−GLUをTRFに加える間に決定した。例えば、DEF−GLUとTRFの最初の比が7.2:1.0であった場合、TRF−GLU−DEFの最終溶液は、TRF1分子当たり2.5個のDEF分子を含むと思われる。しかしながら、DEF−GLUとTRFの最初の比が4.0:1.0であった場合、TRF−GLU−DEFの最終溶液は、TRF1分子当たり1.4個のDEF分子を含むと思われる。同様に、DEF−GLUとTRFの最初の比が2.5:1.0であった場合、TRF−GLU−DEFの最終溶液は、TRF1分子当たり0.9個のDEF分子を含むと思われる。このようにして、DEFとTRFが所定の比である多量のTRF−GLU−DEFを、必要に応じて与えることができる。
【0081】
通常は、エタノールアミンを反応生成物に加えて、次に遠心分離及び透析を行う。DEFとTRFの反応は理論上はGLUをすべて消費するが、エタノールアミンを最終反応混合物に加えて、任意の利用可能なGLUを結合させる。
【0082】
この反応は、暗所において30分間続ける。最終溶液を2000rpmで10分間の遠心分離にかけ、100倍過剰の生理食塩水で6時間かけて2回透析し、同じ過剰のHepes緩衝生理食塩水で3回透析し、生成したTRF−GLU−DEF複合体は、使用するために用意される。
【0083】
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Claims (25)
- 標的化剤及び生体影響性物質を含む実質的に均質な複合体であって、前記生体影響性物質が光増感剤、温熱増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択され、前記標的化剤がトランスフェリン、ソマトスタチン、上皮成長因子、葉酸及びトランスコバラミンからなる群から選択され、かつ二量体、三量体及び凝集体を実質的に含まない複合体。
- 標的化剤がトランスフェリンである、請求項1に記載の複合体。
- 生体影響性物質が光増感剤である、請求項1に記載の複合体。
- 光増感剤がポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸、メタテトラヒドロキシフェニルクロリン及びヘマトポリフィリン誘導体からなる群から選択される、請求項3に記載の複合体。
- 生体影響性物質が温熱増感剤である、請求項1に記載の複合体。
- 温熱増感剤がヘマトポリフィリン、ベラパミル、ベロマイシン、カルボプラチン、ドキソルビシン、及びシスプラチンからなる群から選択される、請求項5に記載の複合体。
- 生体影響性物質がアポトーシス誘導化合物である、請求項1に記載の複合体。
- アポトーシス誘導化合物がデフェロキサミンである、請求項7に記載の複合体。
- 所定の薬剤対タンパク質の比を有する複合体を作製するための方法であって、
a)薬剤の溶液をモル過剰の連結分子の溶液に一滴ずつ加えて、それぞれの薬剤分子を1つの連結分子に連結させて薬剤/連結分子の組み合わせにする工程であって、前記薬剤分子がデフェロキサミンであるときは、2つの薬剤分子が1つの連結分子に結合する工程と、
b)薬剤/連結分子の組み合わせをタンパク質に加えて、所定の薬剤対タンパク質の比を有する複合体を生成させる工程、を含み、
かつ、前記薬剤は温熱増感剤、光増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択される方法。 - 任意の過剰な連結分子を除去する工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 連結分子がグルタルアルデヒド、ベンゾイルヒドラゾン、マレインイミド及びN−ヒドロキシスクシンイミドからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 薬剤がポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸、メタテトラヒドロキシフェニルクロリン、ヘマトポリフィリン誘導体、ヘマトホスフィリン、ベラパミル、ドキソルビシン、シスプラチン、及びデフェロキサミンからなる群から選択される請求項9に記載の方法。
- 病的細胞を治療するための試薬キットであって、
鉄含有トランスフェリン及びタンパク質標的化剤及び生体影響性物質を含む複合体を含み、
かつ、前記生体影響性物質が温熱増感剤、光増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択されるキット。 - 抗癌剤に対する腫瘍細胞の感受性を判定するための試薬キットであって、
タンパク質標的化剤及び抗癌剤をそれぞれ含む2つ以上の複合体を含み、前記抗癌剤が温熱増感剤、光増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択され、
かつ前記複合体が異なる抗癌剤を有するキット。 - 温熱療法の影響を受けやすい腫瘍を選択的に治療するための方法であって、
前記抗癌剤が温熱増感剤である、抗腫瘍有効量の請求項1に記載の複合体を前記腫瘍を有する患者に投与すること
及び
前記腫瘍において制御された温度上昇を生み出すことを含む方法。 - 温熱増感剤がヘマトポリフィリン、ベラパミル、ベロマイシン、カルボプラチン、ドキソルビシン、及びシスプラチンからなる群から選択される請求項15に記載の方法。
- 制御された温度上昇が、YAGレーザー、無線周波数または超音波に腫瘍を曝すことよって生み出される請求項15に記載の方法。
- 光力学療法の影響を受けやすい病的細胞を選択的に治療するための方法であって、
前記抗癌剤が光増感剤である、抗腫瘍有効量の請求項1に記載の複合体を腫瘍を有する患者に投与すること、及び
前記腫瘍を適切な波長の光に曝して前記光増感剤を活性化させることを含む方法。 - 光増感剤がポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸、メタテトラヒドロキシフェニルクロリン、及びヘマトポリフィリン誘導体からなる群から選択される請求項18に記載の方法。
- 鉄摂取制限療法の影響を受けやすい腫瘍を選択的に治療するための方法であって、腫瘍を有する患者に抗腫瘍有効量の請求項1に記載の複合体を投与することを含み、かつ前記抗癌剤が鉄を制限するアポトーシス誘導化合物である方法。
- 遊離鉄またはトランスフェリン結合鉄を患者に投与することをさらに含む請求項20に記載の方法。
- 鉄を制限する前記アポトーシス誘導化合物がデフェロキサミンである請求項20に記載の方法。
- 標的細胞を選択的に治療するための方法であって、標的細胞と請求項1に記載の複合体と接触させること、かつ抗癌剤がアポトーシス誘導化合物であることを含む方法。
- 遊離鉄またはトランスフェリン結合鉄を標的細胞に投与することをさらに含む請求項23に記載の方法。
- 薬剤耐性標的細胞を選択的に治療するための方法であって、
請求項1に記載の複合体において、前記抗癌剤が光増感剤及び温熱増感剤からなる群から選択される複合体と標的細胞を接触させること、及び
前記標的細胞を制御された温度上昇または適切な波長の光に曝すことを含む方法。
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