ES2928155T3 - Composición de nanoadministración peptídica que se dirige a dos receptores - Google Patents
Composición de nanoadministración peptídica que se dirige a dos receptores Download PDFInfo
- Publication number
- ES2928155T3 ES2928155T3 ES14752865T ES14752865T ES2928155T3 ES 2928155 T3 ES2928155 T3 ES 2928155T3 ES 14752865 T ES14752865 T ES 14752865T ES 14752865 T ES14752865 T ES 14752865T ES 2928155 T3 ES2928155 T3 ES 2928155T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- fam
- cgy
- peptide
- aggregate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6953—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a fibre, a textile, a slab or a sheet
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3513—Protein; Peptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un conjugado polipeptídico para uso en un método para la unión y/o internalización del conjugado polipeptídico a una célula de mamífero que tiene un receptor de transferrina (TFRC) y/o un receptor para productos finales de glucosilación avanzada (RAGE). El conjugado polipeptídico se puede usar en un método para dirigir un sistema de suministro de fármacos o un sistema de suministro de diagnóstico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición de nanoadministración peptídica que se dirige a dos receptores
La presente invención se refiere a un conjugado de polipéptido para su uso en un método dirigido a un sistema de administración de fármacos o sistema de suministro diagnóstico, que se dirige a al menos dos receptores.
ANTECEDENTES
Uno de los principales retos en la medicina es ser capaces de dirigir agentes terapéuticos al sitio de acción deseado. Si el direccionamiento específico de sitio de los fármacos se puede lograr, esto reducirá la dosis terapéutica requerida para obtener un efecto beneficioso y puede reducir eficazmente la toxicidad inducida por los fármacos y los efectos adversos. Una forma de lograr esto es usar un sistema de vehículos de fármaco en partículas para la administración y el direccionamiento de fármacos. La encapsulación o incorporación de moléculas de fármaco en ciertos vehículos de fármaco (por ejemplo, liposomas) puede obtener protección adicional contra la degradación o inactivación del fármaco de camino al sitio diana.
El rendimiento biológico de los vehículos de fármaco en partículas está controlado por una compleja matriz de factores fisicoquímicos y fisiopatológicos, dependiendo de la vía de administración. En general, las consideraciones fisicoquímicos incluyen la distribución del tamaño de partículas, la forma, la rigidez/deformabilidad y las características superficiales (por ejemplo, carga eléctrica, polímeros unidos en la superficie y su conformación, densidad superficial de los ligandos de direccionamiento). Estos factores no solo pueden, por ejemplo, modular los tiempos de circulación de los vehículos de fármaco en la sangre, sino también afectar sus patrones de deposición en tejido, el modo de entrada en las células y el tráfico intracelular. Las consideraciones biológicas que controlan el rendimiento de los vehículos de fármacos incluyen determinantes de reconocimiento fagocítico/endocítico e ingestión, el 'estado de sensibilidad' del sistema de defensa del hospedador, una amplia variedad de barreras anatómicas, fisiológicas y bioquímicas, y las vías de escape de la vasculatura. La barrera hematoencefálica (BBB) es un formidable guardián en el cuerpo, que se forma al nivel de las células endoteliales de los capilares cerebrales y esencialmente compone la principal interfase entre la sangre y el cerebro. De hecho, la BBB es el factor anatómico más importante que limita el desarrollo de nuevos fármacos y productos biológicos para el sistema nervioso central. Ha habido numerosos intentos de emplear estrategias que ayuden en el paso del fármaco a través de la BBB. Entre estos, los enfoques basados en nanotecnología han ganado una enorme importancia, ya que algunos de ellos son capaces de vencer las limitaciones inherentes al paso de la BBB, pero estos enfoques están todavía en necesidad de optimización adicional para aumentar su eficacia. Uno de los enfoques más prometedores para el direccionamiento del cerebro es la decoración superficial de vehículos en partículas con ligandos específicos para las células endoteliales capilares cerebrales, que media en la internalización y/o la transcitosis del vehículo unido. A este respecto, el documento de patente WO2011/005098 desvela ejemplos de direccionamiento de péptidos con selectividad hacia la estirpe celular endotelial de capilares cerebrales humanos hCMEC/D3, tal como el péptido Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly que se puede injertar en sistemas en partículas (por ejemplo, liposomas). Sin embargo, en una publicación posterior, van Rooy y colaboradores (European Journal of Pharmaceutical Sciences 2012, 45, 330-335) demostraron que el mismo péptido cuando se acoplaba a liposomas no aumentó significativamente la captación de liposomas por las células endoteliales capilares cerebrales diana. Por lo tanto, los autores interrumpieron el proyecto. Esto ilustra la dificultad en el diseño y la ingeniería de las partículas que pueden dirigirse eficazmente a las células endoteliales capilares cerebrales humanas y promover la internalización de agentes terapéuticos y de diagnóstico.
La presente invención ha modificado químicamente el mismo péptido anteriormente mencionado (Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly) describiendo un conjugado de polipéptido (y sus otras formas) que pueden dirigirse eficientemente a dos receptores para la unión y/o internalización. Por consiguiente, la presente invención proporciona un conjugado que se puede usar para el direccionamiento de sustancias farmacéuticamente aceptables, tales como fármacos, agentes de diagnóstico o sistemas de administración de fármacos, o agentes de diagnóstico, a ciertos tipos de células.
SUMARIO
En un aspecto de la invención, se proporciona un agregado como se define en la reivindicación 1.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un conjugado de polipéptido como se define en la reivindicación 3.
En las realizaciones, el al menos un resto es hidrófobo. En las realizaciones, el conjugado está en una forma de agregado de al menos dos moléculas del conjugado de polipéptido. En algunas realizaciones, el agregado es una partícula de al menos aproximadamente 2 nm de diámetro. En algunas realizaciones, el agregado incluye una forma de fibra en cualquier relación de aspecto. En algunas realizaciones, el agregado comprende una mezcla de partículas y fibras en forma libre, así como partículas y fibras interconectadas. También se desvelan ejemplos, en donde el al menos un resto se selecciona de: una molécula de fármaco, una molécula biológica, un agente activo superficial, una molécula hidrófoba, una molécula fluorescente y sales de los mismos. En algunos ejemplos, el al menos un resto es una molécula de fármaco y sales de la misma. En algunos ejemplos, el al menos un resto es una molécula biológica. En algunos ejemplos, el al menos un resto es un agente tensioactivo. En algunos ejemplos, el al menos un resto es una molécula fluorescente.
En algunas realizaciones, el polipéptido del conjugado comprende dos o más polipéptidos de secuencia (1), o derivados de la misma, separados por un espaciador.
En algunas realizaciones, el espaciador se selecciona de: una entidad química, enlace covalente o enlace no covalente. En algunas realizaciones, el espaciador es una entidad química. En algunas realizaciones, el espaciador es un enlace covalente. En algunas realizaciones, el espaciador se selecciona de: una entidad química, enlace covalente o enlace no covalente a enlace no covalente
En algunas realizaciones, el espaciador comprende un aminoácido o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, el conjugado de polipéptido está en una forma de nanopartículas agregadas en donde el conjugado de polipéptido está agregado en una forma cristalina.
En algunas realizaciones, el conjugado de polipéptido comprende además al menos un principio activo unido al polipéptido por uno o más enlaces no covalentes. En algunas realizaciones, el al menos un principio activo está unido al polipéptido por atrapamiento físico.
En algunas realizaciones, el resto comprende al menos un principio activo seleccionado de un componente farmacéutico activo y un agente de diagnóstico. En algunas realizaciones, el principio activo es un componente farmacéutico activo. En algunas realizaciones, el principio activo es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el principio activo se selecciona de una molécula pequeña farmacéutica activa, una proteína, un ácido nucleico, una molécula antisentido, un conjugado de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica de interés, un liposoma, nanopartículas, agentes de diagnóstico, marcadores de una enfermedad de un trastorno del sistema nervioso central, cáncer, diabetes, anticuerpos, eritrocitos, fantasmas eritrocitarios, esferoplastos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales marcados que se unen a un marcador de un trastorno del sistema nervioso central, cáncer o diabetes, y/o un fragmento de anticuerpo o anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, el principio activo es una molécula pequeña farmacéutica activa. En algunas realizaciones, el principio activo es una proteína. En algunas realizaciones, el principio activo es un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el principio activo es una molécula antisentido. En algunas realizaciones, el principio activo es un conjugado de expresión. En algunas realizaciones, el conjugado de expresión es un ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica de interés. En algunas realizaciones, el principio activo es un liposoma. En algunas realizaciones, el principio activo es una nanopartícula o nanopartículas. En algunas realizaciones, el principio activo es un agente de diagnóstico. En algunas realizaciones, el principio activo es un marcador de una enfermedad de un trastorno del sistema nervioso central. En algunas realizaciones, el principio activo es un marcador de cáncer. En algunas realizaciones, el principio activo es un marcador de diabetes. En algunas realizaciones, el principio activo es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el principio activo es un eritrocito, En algunas realizaciones, el principio activo es un fantasma eritrocitario. En algunas realizaciones, el principio activo es un esferoplasto. En algunas realizaciones, el principio activo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el principio activo es una anticuerpo monoclonal marcado. En algunas realizaciones, el principio activo es un fragmento de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el principio activo es un fragmento de un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, el polipéptido es un derivado que es al menos 90 % idéntico a la secuencia de polipéptidos (1). En algunas realizaciones, el resto es una molécula o partícula fotosensible. En algunas realizaciones, el resto está unido por un conector fotosensible al polipéptido.
En algunas realizaciones, el agregado tiene una estructura esférica. En algunas realizaciones, el agregado tiene una estructura en forma de varilla. En algunas realizaciones, el principio activo está rodeado dentro del agregado.
En algunas realizaciones, el polipéptido incluye la secuencia Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly. En las realizaciones, el polipéptido incluye un resto de cisteína adicional en el extremo N del péptido.
En un aspecto, se desvela una composición farmacéutica, que tiene un conjugado de polipéptido como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de un sólido. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de un líquido.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro de administración de un agente terapéutico, como se define en la reivindicación 15. En algunas realizaciones, el método también incluye irradiar el conjugado de polipéptido.
En algunas realizaciones, la célula de mamífero es de un tejido de mamífero seleccionado del tubo gastrointestinal, médula ósea, hígado, bazo, cerebro, riñón, pulmones, páncreas, vejiga, ojo, vasos sanguíneos normales y patológicos, y células cancerosas. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es el tubo gastrointestinal. En algunas
realizaciones, la célula de mamífero es de la médula ósea. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es del hígado. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es del bazo. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es del cerebro. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es del riñón. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es de los pulmones. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es del páncreas. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es de la vejiga. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es del ojo. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es de los vasos sanguíneos normales. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es de los vasos sanguíneos patológicos. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es de células cancerosas.
Se desvela el uso de un conjugado de polipéptido o una composición con un conjugado de polipéptido para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno o diagnóstico de un trastorno. El uso puede ser para el tratamiento de un trastorno. El uso puede ser para el diagnóstico de un trastorno.
En algunas realizaciones, el trastorno se selecciona de un trastorno del sistema nervioso central, cáncer y diabetes. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno del sistema nervioso central. En algunas realizaciones, el trastorno es cáncer. En algunas realizaciones, el trastorno es diabetes.
En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central se selecciona de depresión, demencia, enfermedades priónicas, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica y esquizofrenia. En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central es depresión. En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central es demencia. En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central es enfermedades priónicas. En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central es enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central es enfermedad de Parkinson. En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central es esclerosis múltiple. En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central es esclerosis lateral amiotrófica. En algunas realizaciones, el trastorno del sistema nervioso central es esquizofrenia.
En algunas realizaciones, el trastorno es lesión cerebral traumática. En algunas realizaciones, el trastorno es psicosis. En algunas realizaciones, el trastorno es la corea. En algunas realizaciones, el trastorno es enfermedad de Huntington. En algunas realizaciones, el trastorno es encefalopatía. En algunas realizaciones, el trastorno es epilepsia. En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad cerebrovascular. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno neurodegenerativo.
En algunas realizaciones, el trastorno es enfermedad de Lyme. En algunas realizaciones, el trastorno es poliomielitis.
En algunas realizaciones, el trastorno es cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer por carcinoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de colon, cánceres por sarcoma, sarcoma de huesos, sarcoma de cartílago, sarcoma de tejidos adiposos, cáncer en los nervios, linfoma, leucemia, tumor de células germinativas, seminoma, disgerminoma, cáncer por blastoma. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer por carcinoma. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer pancreático. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de colon. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer por sarcoma. En algunas realizaciones, el cáncer es sarcoma de huesos. En algunas realizaciones, el cáncer es sarcoma de cartílago. En algunas realizaciones, el cáncer es sarcoma de tejidos adiposos. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer en los nervios. En algunas realizaciones, el cáncer es linfoma. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es tumor de células germinativas. En algunas realizaciones, el cáncer es seminoma. En algunas realizaciones, el cáncer es disgerminoma. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer por blastoma.
En algunas realizaciones, el trastorno es diabetes. En algunas realizaciones, el trastorno es diabetes mellitus. En algunas realizaciones, el trastorno es diabetes de tipo 1. En algunas realizaciones, el trastorno es diabetes de tipo 2. En algunas realizaciones, el trastorno es diabetes gestacional.
La presente divulgación se refiere a un conjugado de polipéptido para su uso en un método de unión y/o internalización del conjugado de polipéptido en una célula de mamífero que tiene un receptor de transferrina (TFRC) y/o receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE), comprendiendo el método las etapas de a. proporcionar
i. un conjugado de polipéptido que comprende un polipéptido unido a al menos un resto, en donde la secuencia de polipéptidos es
Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly (1), o un derivado que es al menos 80 % idéntico a una secuencia de polipéptidos (1),
o sales o ésteres farmacéuticamente aceptables del mismo y
ii. una célula de mamífero que tiene un TFRC y/o RAGE,
b. permitir la interacción del conjugado de polipéptido con la célula de mamífero que tiene TFRC y/o RAGE, y
c. unir el conjugado al TFRC y/o RAGE, y/o internalización del conjugado de polipéptido o un componente del mismo en la célula de mamífero que tiene el TFRC y/o RAGE.
La capacidad de la secuencia de polipéptidos (1) o derivados de la misma para interactuar con el receptor de TFRC y/o RAGE hace posible unir o internalizar un conjugado que comprende la secuencia de polipéptidos (1) o derivados de la misma en una célula de mamífero que tiene el receptor de TFRC y/o receptor de RAGE. En los ejemplos desvelados en el presente documento, el resto asociado a la secuencia de polipéptidos (1) puede ser biológico, químico o una entidad de partícula, que se puede usar o para fines terapéuticos o diagnósticos, o ambos. En ciertos ejemplos, el resto se libera del polipéptido para ejercer un efecto biológico en el interior de una célula. Alternativamente, el resto puede ser liberado fuera de la célula. Puesto que los receptores de TFRC y/o RAGE están presentes solo en algunas células, esto hará posible dirigir los restos específicamente hacia células que expresan estos receptores.
El conjugado de polipéptido proporciona medios para su uso como principio de direccionamiento en el tratamiento, la profilaxis y el diagnóstico de un trastorno asociado al sistema nervioso central y/o un tejido maligno que lleva células que expresan TFRC y/o RAGE en su membrana plasmática. La parte de péptido del conjugado desempeña una función importante en la interacción con TFRC y/o RAGE mediante la formación de puentes salinos, interacciones electrostáticas, enlace de hidrógeno, interacciones de van der Waals y/o hidrófobas.
Puesto que los receptores de RAGE se expresan en células que revisten la barrera hematoencefálica, el conjugado de péptido es capaz de atravesar esta barrera. Como se infiere por la obtención de imágenes de células individuales en tiempo real, estas células captan el conjugado de polipéptido (o sus otras formas del mismo) a través de diferentes modos de procesos de internalización en de minutos a horas después de la unión inicial del conjugado de péptido con los receptores correspondientes.
Con el fin de que el polipéptido sea capaz de unirse al TFRC y/o RAGE, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 12, 13, 14 aminoácidos al polipéptido correspondiente a un 80 %, 87 % y 93 % de identidad con la secuencia de polipéptidos (1). En un aspecto de la invención, el derivado es al menos 90 % idéntico a la secuencia de polipéptidos (1). El número total de aminoácidos del polipéptido puede ser superior a los aminoácidos de secuencia (1) o derivados de la misma, tal como 16, 17 o 18 aminoácidos.
En otro aspecto de la invención, el conjugado de polipéptido está en una forma agregada antes de la interacción del conjugado de polipéptido con la célula de mamífero que tiene el TFRC y/o RAGE, en donde el agregado es como se define en la reivindicación 1. La forma agregada es relativamente estable a las condiciones externas, de manera que el conjugado será menos vulnerable a la degradación.
En particular, el agregado puede ser una partícula de al menos 2 nm de diámetro. La partícula puede tener cualquier forma física o forma adecuada, que incluye una forma de fibra en cualquier relación de aspecto. Las partículas se autoagregan para ocultar el resto en el interior de un núcleo o rodeado por fibras. La ocultación del resto en el interior de una partícula lo aísla de células no diana. Por lo tanto, las células que no alojan receptores de TFRC y/o RAGE pueden no verse afectados y ser menos vulnerables a los efectos adversos del resto. Los restos del conjugado se consideran el "núcleo" de una partícula, mientras que el polipéptido en cualquier forma se considera la "corteza".
Los conjugados de péptido forman las nanopartículas estructuradas en núcleo-corteza con un núcleo hidrófobo que comprende el resto y una corteza de péptido hidrófilo que comprende los aminoácidos desde el péptido (1) dispuestos hacia los alrededores. Esta estructura se puede desplegar además en una estructura terciaria. En una realización particular, donde el resto o núcleo hidrófobo es un fluoróforo (por ejemplo, FAM) la concentración de agregación crítica (CMC) es 2,8 pM. Por encima de la CMC, el conjugado de péptido puede autoensamblarse y formar una red de partículas y fibras, que es una mezcla de partículas y fibras en forma libre o partículas y fibras interconectadas. En esta realización particular, los tamaños de partículas formados tienen un diámetro hidrodinámico en el intervalo de 70 - 170 nm a pH fisiológico como se ha determinado por análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).
La versatilidad de la tecnología hace posible diseñar una variedad de conjugados que se pueden usar para cualquier fin médico o no médico. En el campo médico, la invención proporciona un método general para el transporte de restos a células que alojan TFRC y RAGE. Por lo tanto, según un aspecto de la invención, el conjugado de polipéptido se proporciona en forma agregada en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica se puede usar para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades.
Una vez el conjugado de polipéptido ha elegido el tejido de interés, el efecto farmacéutico o de diagnóstico puede tener lugar debido a la unión y/o internalización de propiedades del conjugado de péptido o una molécula de fármaco llevada por el conjugado de péptido.
En una realización, el polipéptido o derivados del mismo pueden acoplarse por un espaciador a uno o más polipéptidos del polipéptido (1), o derivados del mismo. En una realización particular, el polipéptido (1) se acopla a otro polipéptido (1), formando así un dímero formado de los polipéptidos. Sorprendentemente, la presente invención muestra además un conjugado que comprende un dímero del polipéptido que tiene mayor unión y afinidad por células que expresan
TRFC y/o RAGE. La mayor unión y/o la mayor afinidad sirve para facilitar la transferencia del resto y así potenciar la unión y/o internalización.
El espaciador puede ser una entidad química, enlace covalente o enlace no covalente. En un ejemplo específico, el espaciador comprende un resto de aminoácido, tal como un resto de glicina o serina o un derivado del mismo, o cualquier otra estructura química, tal como enlaces amida.
En otra realización, el polipéptido está unido a al menos un resto por un conector, que puede ser una entidad química o un enlace covalente. La presencia del conector hace posible de una forma conveniente producir una variedad de conjugados diferentes, que se pueden usar para diferentes fines, tales como diferentes enfermedades.
Como se desvela en el presente documento, el polipéptido (1) se puede acoplar directamente al resto con un enlace covalente, o el conector puede comprender un resto de aminoácido que contiene azufre, tal como cisteína o metionina, o un derivado del mismo. En realizaciones de la invención, el resto hidrófobo está unido al polipéptido por un resto de cisteína. Cuando un resto de aminoácido que contiene azufre se usa, hace posible acoplar dos componentes al mismo polipéptido. Los dos componentes incluyen al menos un resto como se usa en el presente documento, sin embargo, ambos componentes pueden ser restos, por lo que se duplica el efecto. El otro componente puede ser compuestos activos diferentes, marcadores, moléculas fluorescentes, etc., específicamente, uno de los componentes puede ser un liposoma.
Un principio activo se define como un constituyente de un fármaco del que depende en gran medida la acción terapéutica característica de la sustancia. El principio activo se selecciona de un grupo de moléculas pequeñas farmacéuticas activas, proteínas, ácidos nucleicos que incluyen moléculas de ARNip y moléculas antisentido, conjugados de expresión que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica de interés, liposomas, nanopartículas, agentes de diagnóstico, marcadores de una enfermedad de trastorno del sistema nervioso central, cáncer o diabetes, anticuerpos, eritrocitos, fantasmas eritrocitarios, esferoplastos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales marcados que se unen a un marcador de un trastorno del sistema nervioso central, cáncer o diabetes, y/o un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal.
En una realización preferida, el conjugado de polipéptido puede dirigirse al tubo gastrointestinal, la médula ósea, el hígado, el bazo, el cerebro, el riñón, los pulmones, el páncreas, la vejiga, el ojo, vasos sanguíneos normales y patológicos y/o células cancerosas.
Se contempla que el conjugado de polipéptido se puede administrar como una composición sólida a un paciente en necesidad del mismo, por ejemplo, en una forma de comprimido o de cápsula. También se contempla que el conjugado de polipéptido se puede administrar como una composición en disolución/suspensión a un paciente en necesidad del mismo.
En una realización particular, el resto es una molécula o partícula fotosensible. Las moléculas o partículas fotosensibles unidas al conjugado de polipéptido son capaces de dirigirse a células y así se pueden usar en herramientas funcionales, terapéuticas y/o de diagnóstico. Las moléculas fotosensibles pueden comprender fluoróforos, tales como cianina o derivados de la misma, preferentemente Cy3 o Cy5, amidito de fluoresceína (FAM), o rodamina.
En una realización más particular, el resto se une por un conector fotosensible al polipéptido, permitiendo la liberación de los componentes del conjugado de polipéptido tras la exposición a irradiación. El conjugado de polipéptido en la célula se puede exponer a irradiación con longitudes de onda en el intervalo de 400-800 nm durante un tiempo específico (por ejemplo, hasta 10 min) activando la unión el fotosensible, por lo que se libera el resto. La longitud de onda elegida depende de la elección del fluoróforo y está dentro de la habilidad en la técnica. El conector fotosensible puede ser un puente de disulfuro acoplado a cianina por un enlace covalente en un complejo de Cy3-ARNip:FAM-polipéptido. Cuando se irradia con luz que tiene una longitud de onda de 488 nm, el Cy3-ARNip se disocia del polipéptido marcado con FAM. Otros conectores fotosensibles pueden ser biotina, 2-nitrobencilo, ésteres fenacílicos o similares.
En otra realización, el conjugado de polipéptido puede estar agregado en una forma cristalina.
El conjugado de polipéptido se puede usar para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno, en donde el trastorno se puede seleccionar de, pero no se limita a, los grupos que consisten en un trastorno del sistema nervioso central, cáncer, diabetes, cardiovascular, inflamatorio o diagnóstico, así como condiciones cosméticas, tales como arrugas, alergias o cualquier otro problema de la piel. El conjugado de polipéptido se puede usar como una herramienta de diagnóstico para diagnosticar un trastorno del sistema nervioso central, cáncer o trastornos de diabetes o cualquier otro trastorno.
El trastorno del sistema nervioso central se puede seleccionar del grupo que consiste en depresión, demencia, enfermedades priónicas, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, esquizofrenia, enfermedad de Lyme, poliomielitis, lesión cerebral traumática, psicosis, corea, enfermedad de Huntington, encefalopatía, epilepsia, enfermedades cerebrovasculares, trastornos neurodegenerativos y cáncer del sistema nervioso central, el cáncer se puede seleccionar de cáncer por carcinoma, es decir, mama, próstata, pulmón, páncreas, y cáncer de colon, cáncer por sarcoma, es decir, hueso, cartílago, grasa y cáncer de los nervios, cáncer por
linfoma y leucemia, tumor de células germinativas, es decir, cáncer por seminoma o disgerminoma, cáncer por blastoma, diabetes, es decir, la diabetes mellitus se puede seleccionar de tipo 1, tipo 2, diabetes gestacional.
Se contempla que el conjugado de polipéptido se puede usar en una composición farmacéutica donde la composición farmacéutica comprende el conjugado de péptido y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, el término "conjugado de polipéptido" se debe entender como un polipéptido de la invención que está unido a un resto (el término "resto" se debe entender como se define en el presente documento) y que se une a TFRC y/o RAGE in vitro y/o in vivo.
Como se usa en el presente documento, el término "resto" se refiere a una o dos o más parte(s) de un conjugado de polipéptido (el término "conjugado de polipéptido" se debe entender como se define en el presente documento) en el que algo se puede separar de la parte de polipéptido del conjugado de polipéptido tal como, pero no se limita a, un aminoácido, un ácido nucleico, un liposoma y/o molécula fotosensible.
Como se usa en el presente documento, el término "receptor de transferrina" (TFRC) se refiere a una glicoproteína de la membrana conocida por mediar en la captación celular del hierro de una glicoproteína plasmática, la transferrina. La captación del hierro de la transferrina implica la unión de la transferrina al TFRC y la internalización de la transferrina dentro de una vesícula endocítica por endocitosis mediada por receptor. El hierro es liberado de la proteína por una disminución en el pH endosómico. Con la excepción de células altamente diferenciadas, los TFRC se pueden expresar en todas las células, pero sus niveles varían enormemente. Los TFRC se expresan altamente sobre células eritroides inmaduras, tejido placentario y células que se dividen rápidamente, tanto normales como malignas (Ponka P and Nam C: The transferrin receptor: role in health and disease: 1999, 31:1111-1137). El término "receptor de transferrina" también se puede referir a una proteína de fusión del receptor de transferrina.
Como se usa en el presente documento, el término "receptor para productos finales de glicación avanzada" (RAGE) se refiere a un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, codificado en la región de la clase III del complejo mayor de histocompatibilidad. El receptor para productos finales de glicación avanzada se expresa altamente solo en el pulmón en niveles fácilmente medibles, pero aumenta rápidamente en sitios de inflamación, en gran medida en células inflamatorias y epiteliales. Se encuentra o como una proteína unida a la membrana o como proteína soluble que es notablemente regulada por incremento por estrés en el endotelio, células de músculo liso, miocitos cardíacos, tejido neural (incluyendo SNC y cerebro) y células mononucleares, por lo que se regula su metabolismo y se potencia su funcionalidad de barrera central (Louis J et al: RAGE (Receptor for Advanced Glycation End products), RAGE Ligands, and their role in Cancer and Inflammation, Journal of Translational Medicine 2009, 7:17 y P. Alexiou et al: A Multi-Ligand Receptor Unveiling Novel Insights in Health and Disease, Current Medicinal Chemistry 2010, 17: 2232 2252). El término "receptor para productos finales de glicación avanzada" también se puede referir a una proteína de fusión del receptor para productos finales de glicación avanzada.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" significa un compuesto que consiste en aminoácidos que están unidos por medio de enlaces peptídicos, por ejemplo, enlace amida covalente formado por pérdida de una molécula de agua entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de un segundo aminoácido.
Como se usa en el presente documento, el término "nanopartícula" significa una partícula con un diámetro entre 0,1 y 1000 nm, por ejemplo liposomas, micelas de polímero, complejos de polímero-ADN, nanoesferas, nanofibras. Todas estas nanopartículas se conocen en la técnica. La superficie de dichas nanopartículas se modifica frecuentemente por PEGilación, es decir, el polietilenglicol (PEG) se une a la superficie de las nanopartículas.
Como se usa en el presente documento, el término "idéntica" o "identidad" significa que un alineamiento de dos secuencias dentro de un tramo de un número de aminoácidos definido (en la presente invención: 15 aminoácidos) comprende el número indicado de aminoácidos idénticos, es decir, el término "idéntico" o "identidad" es igual al número de correspondencias exactas en un alineamiento de una secuencia de aminoácidos de la presente invención y una secuencia o longitud de aminoácidos diferente. Una correspondencia exacta ocurre cuando la secuencia de aminoácidos tiene restos de aminoácidos idénticos en el mismo solapamiento de posiciones. En una realización, la identidad se puede expresar en porcentaje dividiendo el número de correspondencias exactas entre la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos y convirtiendo el resultado en porcentaje.
Como se usa en el presente documento, el término "célula de mamífero" incluye células in vitro, que incluye células cultivadas, y/o células in vivo de animales de importancia económica, tales como animales bovinos, ovinos y porcinos, especialmente los que producen carne, así como animales domésticos, animales deportivos, animales de zoológico y seres humanos, siendo preferidos los últimos.
El término "composición farmacéutica" engloba un producto que comprende un vehículo opcional que comprende componentes inertes.
Como se usa en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a fisiológicamente bien tolerado por un mamífero o humano.
Como se usa en el presente documento, el término "espaciador", por ejemplo un enlace peptídico o un aminoácido, un péptido conector entre al menos dos secuencias de polipéptidos de polipéptido (1).
Como se usa en el presente documento, el término "conector" significa una estructura que une un péptido según la invención y una sustancia farmacéuticamente aceptable (el término "sustancia farmacéuticamente aceptable" se debe entender como se define en el presente documento) por enlaces covalentes o no covalentes. El término "enlace" incluye, pero no se limita a: un péptido conector, un enlace de carbohidrógeno, estreptavidina-biotina, polietilenglicol (PEG), un puente disulfuro y/o conector coordinado con metal.
Como se usa en el presente documento, el término "liposoma" incluye cualquier estructura compuesta de una bicapa lipídica que encierra uno o más volúmenes, en donde el volumen puede ser un compartimento acuoso. El liposoma consiste en una o más bicapas lipídicas que incluyen, pero no se limitan a, bicapa de fosfolípidos o bicapa de tensioactivo no iónico. Los liposomas que consisten en una bicapa de fosfolípidos pueden comprender fosfolípidos derivados naturalmente con cadenas mixtas de lípidos (como, por ejemplo, fosfatidiletanolamina), pero no se limitan a estos componentes. Los liposomas incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, espumas, micelas, exosomas, vesículas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares. El término "liposoma" también incluye los denominados "liposomas de circulación prolongada" que consisten en polímeros solubles en agua (por ejemplo, polietilenglicol, PEG) unidos a la superficie de liposomas convencionales compuestos de una mono- o bicapa lipídica que encierra un volumen (por ejemplo, los denominados liposomas PEGilados).
T ras la preparación de los liposomas, el liposoma se puede dimensionar para lograr un intervalo de tamaños deseados y distribución relativamente estrecha de los tamaños de liposomas. Por ejemplo, para la administración al cerebro, los liposomas deben ser preferentemente inferiores a aproximadamente 1,0 pm de diámetro, más preferentemente 75 -400 nm, más preferentemente 100 - 200 nm, que permite que la suspensión de liposomas se esterilice por filtración. Los métodos de acoplamiento de péptidos a liposomas según la presente invención puede implicar cualquier reticulación covalente entre un lípido liposómico y un péptido.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es una ilustración esquemática del conjugado de polipéptido.
La Fig. 2 es una ilustración esquemática de un modelo de autoagregación de nanopartículas de FAM-CGY usando el software ChemBioOffice donde el polipéptido se une a FAM. Se ilustra además cómo el conjugado de péptido se autoensambla en una forma de nanopartícula o de fibra a través de la formación de puentes disulfuro, enlace de hidrógeno, posibles puentes salinos e interacción hidrófoba que incluye interacciones n-n.
La Fig. 3 representa el análisis de tamaño de nanopartículas por Nanosight Particle Tracking (NTA) de diferentes concentraciones de péptido FAM-CGY en agua MQ. También se muestra un fotograma de vídeo de NTA representativo correspondiente (B). Los números arábigos en la esquina inferior izquierda del fotograma de vídeo es el número de partículas peptídicas.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra la relación entre la concentración de péptidos, la concentración de partículas y el tamaño. El CGY-péptido está con y sin FAM en el extremo amino.
La Fig. 5 es un gráfico que muestra el efecto del pH sobre el tamaño y la concentración de los agregados de péptidos FAM-CGY. Se prepararon disoluciones 5 pM del péptido FAM-CGY en tampón HEPES 10 mM, los valores de pH se ajustaron con HCl 1 M o NaOH 1 M.
Fig. 6. Caracterización de las nanopartículas peptídicas de FAM-CGY, a. medición de la concentración de agregación crítica, b. representación por microscopía de fuerza atómica (AFM) de péptidos FAM-CGY agregados que muestran una red de estructuras globulares y de fibra, c. gráfico de distribución del tamaño de partículas medido por NTA, y d. espectros de CD de UV lejano del péptido FAM-CGY a diversos pH.
Fig. 7 Microscopía de fluorescencia de células vivas de captación de células hCMEC/DE3 de diferentes variaciones de péptidos CGY marcados con FAM. a. 5'-FAM 10 pM (control negativo), b. péptido CGY marcado en 5' 5 pM (FAM-CGY), c. péptido CGY marcado en 3' 5 pM (Cg Y-FAM), d. FAM-d-CGY 5 pM, e. FAM-CGY 5 pM combinado 1, f. FAM-CGY 5 pM combinado 2. Las células hCMEC/DE3 se incubaron con diferentes variaciones de péptidos CGY marcados con FAM durante 24 h, y se lavaron 3 veces con PBS. El núcleo se tiñó con Hoechst 33342 (5 pg/ml), barras insertadas = 50 pm.
Fig. 8 Microscopía de fluorescencia de células individuales y vivas que muestran captación de células hCMEC/DE3 de diferentes variaciones de péptidos CGY marcados con FAM. Las células se tiñeron con CellLight® Actin-RFP y Hoechst 33342. Barras insertadas = 20 pm.
Fig. 9 Cuantificación de la captación de péptidos CGY marcados con FAM en diferentes estirpes celulares por citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Las células se incubaron con 5 pM de diferentes variaciones de péptidos CGY marcados con FAM a 37 °C durante 24 h.
Fig. 10 Dosis y captación vesicular dependiente del tiempo del péptido FAM-CGY en células hCMC/DE3. Las células se trataron con diversas concentraciones de péptido FAM-CGY que variaban desde 0-20 pM y se tiñeron con Hoechst 33342. a. Microscopía de fluorescencia después de 24 h. b. Las células hCMC/D3 se sometieron a nanopartículas FAM-CGY 5 pM y se estudiaron con microscopía de fluorescencia en diferentes intervalos de tiempo desde 0-48 horas, y c. cuantificación de la captación de péptido de (a) por FACS, y d. cuantificación de la captación de (c) por FACS. Las células se tiñeron con CellLight® Actin-RFP y Hoechst 33342, barras insertadas = 20 pm.
Fig. 11 Influencia de diversos inhibidores endocíticos sobre la captación de células hCMEC/D3 de nanopartículas peptídicas FAM-CGY. a. Análisis de FACS de células hCMEC/D3 incubadas con nanopartículas peptídicas FAM-CGY o transferrina en presencia diferentes inhibidores. El gráfico muestra las intensidades de fluorescencia medias de uno de tres experimentos independientes realizados por duplicado. FAM-d-CGY y transferrina también se eligieron como controles para realizar los experimentos de inhibición. b. Muestra la influencia de la morfología sobre la captación de células hCMEC/D3 de nanopartículas peptídicas FAM-CGY en presencia de diversos inhibidores por microscopía de fluorescencia. Inhibidor dependiente de energía: 2-desoxi-D-glucosa 1 mM (DOG) y NaN3 1 mM. Inhibidor de la macropinocitosis: wortmanina (WOR) 10 pM. Inhibidor de la endocitosis en fase fluida: nocodazol (NOC) 20 pM. Inhibidor dependiente de clatrina: clorpromazina (CPZ) 30 pM. Inhibidor medicado con caveolas: N-etilmaleimida 5 pM (NEM). Endocitosis dependiente de caveolas: indometacina (IMC) 200 pM. El núcleo de las células se tiñó con Hoechst 33342, barras insertadas = 25 pm.
La Fig. 12 es un gráfico que ilustra un experimento de activación del complemento. Los productos de activación del complemento a. SC5d-9, b. C5a y c. C3a se cuantificaron en suero humano sano después de la incubación del péptido CGY, FAM-CGY y FAM-d-CGY a baja y alta concentración. Se presentan el ruido de fondo y el control positivo (Zymosan) para cada producto. La activación del complemento y la fijación es un proceso fundamental que contribuye a la depuración de macrófagos de nanopartículas inyectadas por vía intravenosa. Por consiguiente, los estudios de activación del complemento en suero humano se realizaron con bajas y altas concentraciones de péptido FAM-CGY y otros péptidos (CGY, FAM-d-CGY) para la comparación. Las nanopartículas FAM-CGY no tuvieron efecto significativo sobre el nivel de productos de activación del complemento SC5d-9, C5a y C3a. Las respuestas fueron relativamente bajas, y próximas a la activación de fondo. Solo se observó un ligero nivel de activación del complemento en comparación con el control positivo (Zymosan). No hubo diferencias sistemáticas entre la activación por debajo y por encima de CMC. Conclusión: Es poco probable que las nanopartículas FAM-CGY induzcan reacciones inmunitarias mediadas por el complemento tras la inyección intravenosa.
La Fig. 13 es una transferencia Western y gráfico que muestra la cuantificación de la expresión de TFRC en diferentes estirpes celulares: estirpe celular endotelial cerebral humana (hCMEC/D3), estirpe celular endotelial mamaria humana (MCF-10A), estirpe celular de cáncer de mama humano (MCF-7), estirpe celular de carcinoma epitelial humano (HeLa), células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y células de carcinoma de pulmón humano (H1229).
La Fig. 14 es un gráfico que muestra la captación de FAM-CGY cuantificado por FACS. Se incubaron células MCF-7 y MCF-10A con diferente concentración de FAM-CGY como se indica durante 24 h y se estudió por microscopía de fluorescencia (no mostrado).
La Fig. 15 es un gráfico que muestra el nivel de competición por la unión a TFRC de nanopartículas de FAM-CGY y diferentes concentraciones de transferrina (62,5, 250 nM o 500 nM) analizado por microscopía de fluorescencia (no mostrado) y cuantificado por FACS.
La Fig. 16 muestra el bloqueo de la captación de nanopartículas de FAM-CGY después de la atenuación de la expresión de TFRC. a. muestra una expresión de TFRC regulada por disminución después del uso de un reactivo de transfección comercial el complejo de la amina siPORT/ARNip de TFRC durante 72 h en células hCMEC/D3 y un ARNip inespecífico (Controlip) como control positivo. b. Muestra el bloqueo de la captación de nanopartículas de FAM-CGY en células hCMEC/D3 reguladas por disminución por TFRC. Las células con baja expresión de TFRC y las células de transfección con Controlip se incubaron con nanopartículas de FAM-CGY 5 pM y transferrina 62,5 nM (control positivo) durante 16 h, respectivamente, las nanopartículas de FAM-CGY y la captación de transferrina se detectaron por microscopía de fluorescencia (no mostrada) y b. se cuantificó por FACS. Núcleos de células teñidos con Hoechst 33342, barras insertadas = 50 pm.
Fig. 17 Las nanopartículas de FAM-CGY compitieron con diferentes concentraciones de sustrato de receptor de RAGE o péptido amiloide-p, y fueron a-g. analizadas por microscopía de fluorescencia, y h. cuantificadas por FACS.
La Fig. 18 muestra a. la expresión de RAGE regulada por disminución usando el reactivo de transfección comercial el complejo de la amina siPORT/ARNip de RAGE durante 72 h en células hCMEC/D3 y el ARNip inespecífico (Controlip) como control. b. muestra el bloqueo de la captación de nanopartículas de FAM-CGY en células hCMEC/D3 atenuadas por RAGE. Las células de baja expresión de RAGE y las células de transfección con Controlip se incubaron con nanopartículas de FAM-CGY 5 pM y péptido amiloide-p 250 nM (control positivo)
durante 16 h, respectivamente, se detectaron las nanopartículas de FAM-CGY y la captación de péptido amiloidep por microscopía de fluorescencia (no mostrada).
Fig. 19 Las nanopartículas de FAM-CGY compitieron conjuntamente con transferrina, péptido RAGE o péptido amiloide-p y se analizaron por a. microscopía de fluorescencia y se cuantificaron por b-c. FACS.
Fig. 20 Tráfico en tiempo real de nanopartículas de endocitosis de FAM-CGY. Se tiñeron células hCMEC/D3 con aglutinina de germen de trigo (WGA)-Texas Red®-X y Hoechst 33342. Los recuadros blancos insertados son aumentos de la imagen. Las flechas indican las nanopartículas peptídicas que se unen a la membrana de la superficie celular o que acaban de cruzar la membrana celular. Barras insertadas = 10 pm.
Fig. 21 Ilustración esquemática del mecanismo de internalización de las nanopartículas de FAM-CGY en células hCMEC/D3 basado en experimentos de microscopía de fluorescencia usando endosomas tempranos CellLight®-RFP, lisosomas-RFP, Golgi-RFP y retículo endoplásmico (RE)-RFP para teñir los orgánulos celulares (no mostrados). La nanopartícula peptídica se une 1 a la superficie celular con alta afinidad. Después de ser internalizada por endocitosis mediada por receptor de transferrina 2 en endosomas tempranos, las nanopartículas peptídicas se transportaron de los endosomas tempranos a los lisosomas y luego se liberaron 4 en el citosol. Los experimentos no aclaran si las nanopartículas peptídicas se transportaron dentro del ER y el aparato de Golgi.
Fig. 22 Caracterización de complejos de ARNip/FAM-CGY. a. NTA de complejos de ARNip/FAM-CGY. b. Distribución de tamaño de complejos de ARNip/FAM-CGY medida por NTA.
Fig. 23 Imagen de microscopía electrónica de transmisión de complejos de fibra de FAM-CGY/Cy3-ARNip con una longitud promedio de 297±87 nm y anchura de 50±11 nm.
Fig. 24 Imagen de microscopía electrónica de transmisión de complejos de nanopartículas de FAM-CGY/ARNc (ARN circular) con un diámetro promedio de 180±29.
Fig. 25 Estudios de eficiencia de transfección de complejos de ARNip/FAM-CGY. a. Supresión de la expresión del receptor de transferrina por diferentes cantidades de ARNip de TFRC con o sin formación de complejos con FAM-CGY. Se midió la expresión del receptor de transferrina 72 h después de la transfección. b. Regulación por disminución dependiente del tiempo del receptor de transferrina por complejos de TFRC de ARNip/FAM-CGY.
Fig. 26 Evaluación de la viabilidad celular tras el tratamiento de células con el péptido fluorescente (a) o complejo de ARNip/FAM-CGY (b) durante 24 h, determinado por ensayo de LDH (n=6). Fondo: células sin tratar. Para examinar la citotoxicidad del péptido y el complejo de ARNip/FAM-CGY, las células hCMEC/D3 se incubaron con concentraciones 1, 2, 5, 10, 20 pM del péptido y diferentes relaciones de complejos de ARNip/FAM-CGY (8:5, 16:5 o 24:5) durante 24 h, la viabilidad de las células sin tratamiento se usó como control. La citotoxicidad se midió por un ensayo de LDH. El ensayo de LDH mide la integridad de la membrana en función de la cantidad de LDH citoplásmico fugado en el medio.
Fig. 27 Investigación de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en células hCMEC/D3 tras la incubación con péptido FAM-CGY o complejo de ARNip/FAM-CGY. Las células hCMEC/D3 se incubaron con concentraciones 2, 5, 10 o 20 pM del péptido FAM-CGY durante a. 8 horas o b. 24 horas o c. diferente formulación de complejo de ARNip/FAM-CGY durante 24 horas. Se monitorizó el OCR en tiempo real usando XF Analyser (Seahorse Bioscience) y los datos se corrigieron a partir de aquí para números de células. Las células sin tratar y las células incubadas con diferentes diluciones (100 veces o 300 veces) de amina o grupo ARNip/amina se usaron como controles. d. Curva patrón que muestra la relación lineal entre valores de absorbancia de la tinción con violeta cristal y números de células de hCMEC/D3.
Fig. 28 Bloqueo de la captación de péptido amiloide-p por nanopartículas de FAM-CGY analizado por microscopía de fluorescencia (no mostrada) y cuantificada por FACS. a. muestra un diagrama del número de cifras de células verdes de células que tienen FAM-CGY unido. b. muestra un diagrama del número de cifras de células rojas de células que tienen amiloide-p unido.
Fig. 29 Ilustración esquemática de una liberación desencadenada por luz del método in vitro de nanopartículas de FAM-CGY de vesículas del compartimento al citoplasma usando una longitud de onda específica de luz. b. Imagen de microscopía de fluorescencia de células hCMEC/D3 expuestas a luz de 488 nm en momentos de tiempo 0, 2, 2,30, 4 o 6 minutos. Las células se incubaron con nanopartículas de FAM-CGY durante 24 h a 37 °C.
Fig. 30 Liberación desencadenada por luz de nanopartículas de FAM-CGY de vesículas del compartimento al citoplasma. Células hCMEC/D3 expuestas a luz de 488 nm a 0, 4, 8, 10, 11, 13 o 14 minutos. Las células se incubaron con nanopartículas de FAM-CGY durante 24 h a 37 °C antes de la exposición a la luz.
Fig. 31 Imagen de microscopía de fluorescencia de liberación controlada dependiente de energía de nanopartículas de FAM-CGY de vesículas del compartimento al citoplasma. Las células hCMEC/D3 se expusieron a microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC), y longitudes de onda de 488 (verde),
405 (azul) o 635 (roja) nm en tiempos diferentes; 0, 4, 5 o 6 min para la luz verde, 0 o 30 para DIC, 0, 4, 12 o 20 min para la luz azul y 0 o 30 para la luz roja. Debido a la falta de liberación desencadenada por la luz después de DIC y luz roja, las células se expusieron a continuación a luz verde durante 4 y 6 minutos para liberar las nanopartículas de FAM-CGY. Todas las células se incubaron con nanopartículas de FAM-CGY durante 24 h a 37 °C antes de la exposición a la luz.
Fig. 32 Imagen de microscopía de fluorescencia de liberación desencadenada por luz in vitro de ARNip por nanopartículas de FAM-CGY en el citoplasma. La intensidad de fluorescencia del péptido FAM-CGY, Cy3-ARNip y Hoechst 33342 (tinción del núcleo) en el citoplasma se mide a lo largo de la línea blanca en la imagen. Las células hCMEC/D3 se incubaron con el complejo de nanopartículas fotosensibles Cy3-ARNip/FAM-CGY a 37 °C durante 24 h y se expusieron a la luz de 488 nm a 0, 4 y 6 minutos.
Fig. 33 Secuencia de la secuencia de péptidos FAM-CGY y FAM-GYR-GYR de a. péptido FAM-CGY y b. FAM-GYR-GYR, y modelos de minimización de energía molecular correspondiente usando el software ChemBioOffice.
Fig. 34 Imágenes de microscopía de fluorescencia de la captación vesicular dependiente de la dosis del péptido FAM-CGY y FAM-GYR-GYR en células hCMEC/D3. Las células se trataron con concentraciones de 1,2, 5 o 10 pM de FAM-CGY y FAM-GYR-GYR y se tiñeron con Hoechst 33342 antes de la microscopía de fluorescencia después de 24 h (a) (barras insertadas = 25 pm).
Fig. 35 Comparación de la captación de péptido FAM-CGY y FAM-GYR-GYR por células hCMEC/D3. Las células se trataron con concentraciones de 1, 2, 5 o 10 pM de FAM-CGY y FAM-GYR-GYR y la captación de péptidos se cuantificó por FACS.
Fig. 36 Influencia de diversos inhibidores de la endocitosis en la captación de células hCMEC/D3 del péptido FAM-GYR-GYR. Análisis de FACS de células hCMEC/D3 incubadas con el péptido FAM-GYR-GYR en presencia de inhibidores: Inhibidor dependiente de la energía: 2-desoxi-D-glucosa (DOG) 1 mM y NaN3 1 mM. Inhibidor de la macropinocitosis: wortmanina (WOR) 10 pM. Inhibidor de la endocitosis de fase fluida: nocodazol (NOC) 20 pM. Inhibidor dependiente de clatrina: clorpromazina (CPZ) 30 pM. Inhibidor dependiente de caveolas: N-etilmaleimida (NEM) 5 pM. Endocitosis dependiente de caveolas: indometacina (IMC) 200 pM. El gráfico muestra las intensidades de fluorescencia medias de uno de tres experimentos independientes realizados por duplicado.
Fig. 37 Imágenes de microscopía de fluorescencia que muestran el tráfico intracelular del péptido FMA-GYR-GYR en diferentes orgánulos después de 4 h de incubación. Los orgánulos celulares hCMEC/D3 fueron marcados con endosomas tempranos CellLight®-RFP, lisosomas-RFP, Golgi-RFP y retículo endoplásmico (ER)-RFP, respectivamente, y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342.
Fig. 38 Imagen de microscopía de fluorescencia de la transfección del complejo Cy3-ARNip/FAM-GYR-GYR de células hCMEC/D3. Las células se incubaron con el complejo Cy3-ARNip/FAM-GYR-GYR como se indica a 37 °C durante 1 h o 4 h. El núcleo celular se tiñó con Hoechst 33342.
Fig. 39 Gráfico de barras que muestra la unión de F-liposoma solo, F-liposoma-CGY, F-liposoma-FAM-CGY, F-liposoma-CGY-FAM o conjugados de F-liposoma-FAM-CGY mezclado 2 con células hCMEC/D3. Las células se analizaron por FACS. Los liposomas en a. se marcaron con fosfolípido fluorescente RED y b. con fosfolípido fluorescente verde.
La Fig. 40 es un gráfico que muestra la distribución de tamaños de ácido caprílico conjugado con el péptido CGY como se mide por análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).
La Fig. 41-44 son los resultados de estudios que ilustran la formación de complejos peptídicos basados en péptidos CGY unidos a rodamina (Rh-CGY).
La Fig. 41a muestra un perfil de distribución de tamaños típico del autoensamblaje de péptido Rh-CGY (10 pM) determinado por NTA. La Fig. 41b muestra la captación del autoensamblaje de péptido Rh-CGY en células hCMEC/D3.
La Fig. 42 es una transferencia Western que muestra los complejos peptídicos en un estudio de Rh-CGY.
La Fig. 43a es un histograma que representa un perfil de distribución de tamaños típico de especies complejas de Rh-CGY (10 pM) con péptido Fa M-(C)-NAP (10 pM) determinado por NTA. La Fig. 43b muestra la morfología del complejo peptídico Rh-CGY/FAM-(C)-NAP observado por microscopía electrónica. El péptido Rh-CGY/FAM-(C)-NAP se autoensambla conjuntamente en nanopartículas y fibras. La Fig. 43c muestra la intensidad intracelular de cargas suministradas en células hCMEC/D3 por los nanosistemas basados en péptidos Rh-CGY usando análisis de FASC. La Fig.43d es un gráfico de puntos típico resultante de un experimento de clasificación celular asistido por fluorescencia del péptido Rh-CGY y FAM-(C)-NAP después de tratar células hCMEC/D3 con FAM-(C)-NAP 10 pM, complejo Rh-CGY 10 pM/ FAM-(C)-NAP 10 pM y Rh-CGY 10 pM durante 24 h. La Fig. 43e es una fotografía de imágenes de microscopía de células vivas de las células del estudio de la Fig. 43d.
La Fig. 44a representa el perfil de distribución de tamaños típico del complejo peptídico Rh-CGY (10 pM)/FAM-GYR (5 pM) determinado por NTA. La Fig. 44b muestra la morfología del complejo peptídico Rh-CGY/FAM-GYR observado por microscopía electrónica. La Fig. 44c es un gráfico de puntos típico resultante de un experimento de clasificación celular asistido por fluorescencia del péptido Rh-CGY y FAM-GYR después de tratar células hCMEC/D3 con FAM-GYR 5 pM, complejo Rh-CGY10 pM / FAM-GYR 5 pM y Rh-CGY 10 pM durante 24 h. La Fig. 44d es una fotografía de imágenes de microscopía de células vivas de las células del estudio de la Fig. 44c.
La Fig. 45 muestra fotografías de células hCMEC/d3 en un estudio que investiga la transfección de ácidos nucleicos mediada por péptidos dobles.
La Fig. 46 muestra imágenes de fluorescencia de órganos de ratones que participaron en estudios in vivo de la localización de péptidos.
La Fig. 47 son fotografías de células de cerebro de ratones que participaron en estudios in vivo de localización de conjugados de péptidos.
La Fig. 48 muestra las estructuras de agregados de conjugados de péptidos. Las Fig. 48a-b son imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) de especies de FAM-CGY (5 pM) en ausencia y presencia de ARNip 24 nM (en este caso, dirigido contra el receptor de transferrina), respectivamente. El recuadro en la Fig. 48b es la micrografía electrónica de transmisión de complejos de FAM-CGY/ARNip elípticamente formados que muestra la presencia de algunas estructuras de tipo fibras alargadas en el núcleo de partículas. El tamaño medio equivalente esférico de las nanopartículas es 169 ± 51 nm, basado en mediciones de al menos 100 imágenes individuales. La Fig. 48c-g muestra una visión general de una red de nanopartículas-fibras de péptidos (48c), un componente típico de nanopartículas de núcleo-corteza de la red (48d), una nanopartícula de núcleo-corteza con proyecciones de tipo pelo alargadas (48e) y vistas ampliadas de componentes de fibra retorcidos (48f-g). El tamaño medio medido de las nanopartículas de núcleo-corteza fue 116 ± 22 nm (basado en mediciones de al menos 100 imágenes de nanopartículas seleccionadas al azar).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Esta sección describe la presente invención en mayor detalle usando una ilustración esquemática de un conjugado de polipéptido y ejemplos de conjugado de polipéptidos y su uso en un método para la unión y/o internalización del conjugado de polipéptido con una célula de mamífero que tiene un receptor de transferrina (TFRC) y/o receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE). Sin embargo, esto ni mucho menos limita el alcance de la presente invención.
La Figura 1 muestra un dibujo esquemático de un conjugado de polipéptido con un resto 1 y conectado a un conector 2. Un segundo resto 5 se puede unir al conector 2. El conector también se une a la secuencia de polipéptidos Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly 3 que se puede conectar a uno o más polipéptidos 3 por un espaciador 4. En realizaciones de la invención, el conector es un resto de cisteína en el extremo N del polipéptido.
Ejemplos
Ejemplo 1: Autoensamblaje del conjugado de polipéptido
Se diseñaron péptidos mezclados y péptidos marcados con fluorescencia y se sintetizaron como se muestra en la Tabla 1. Para investigar si el conjugado de polipéptido puede autoensamblarse, se empleó la tecnología de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para detectar la agregación de péptidos. Brevemente, se preparó 1 ml de disoluciones de péptidos con diferentes concentraciones (0,5, 1, 2,5 y 5 pM) diluyendo las disoluciones madre de péptidos (500 pM) con agua MQ e incubando durante 30 min a temperatura ambiente. Las mediciones de NTA se realizaron con un NanoSight LM20 (NanoSight Ltd., Amesbury, Reino Unido) equipado con una cámara de muestra con un láser azul de 405 nm y una junta tórica de fluoroelastómero Viton. Las muestras de péptido se inyectaron en la cámara de muestra con jeringas estériles (BO Discardit II, New Jersey, EE. UU.) hasta que el líquido llegó a la punta de la boquilla. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente. Para el efecto del pH del ensamblaje de péptidos FAM-CGY, la disolución madre de FAM-CGY (500 pM) se diluyó en 5 pM con tampón HEPES 10 mM donde los valores de pH se ajustaron con HCI 1 M o NaOH 1 M, respectivamente.
FAM-CGY se autoensambla en nanopartículas y fibras como se muestra en la Figura 2. El tamaño de las nanopartículas de FAM-CGY autoensambladas es 2-200 nm dependiendo de la concentración de conjugado de péptido.
Tabla 1
Ejemplo 2: Unión específica a y captación celular de CGY-péptido marcado con FAM por células hCMEC/D3
Para evaluar la función del receptor de transferrina en la captación de nanopartículas de FAM-CGY, se incubaron células hCMEC/D3 con tanto transferrina como nanopartículas de FAM-CGY en el experimento de competición (Figura 15).
La determinación de la internalización de los péptidos de fluorescencia en células hCMEC/D3 por citometría de flujo (FACS) se realizó del siguiente modo. Se sembraron células (2x104/cm2) en placas de 24 pocillos (Corning, NY) y se cultivaron 2 días a 37 °C y 5 % de CO2 para alcanzar 60 %-70 % de confluencia. Las células se lavaron 3 veces con PBS precalentado y se añadieron 200 pl de péptidos marcados con fluorescencia 5 pM (diluidos en suero que contiene medio celular). Después de 24 h de incubación a 37 °C con 5 % de CO2 , cada cámara se lavó con PBS precalentado 3 veces y se incubó con medio de crecimiento celular nuevo. El núcleo celular se tiñó con colorante Hoechst 34580 (5 ug/ml), la membrana celular se tiñó con Texas Red®-X aglutinina de germen de trigo (5 ug/ml). Las nanopartículas de FAM-CGY compitieron con diferentes concentraciones de transferrina o se añadieron con los péptidos en diferentes concentraciones que variaron desde 62,5 - 500 nM y se analizaron por microscopía de fluorescencia y se cuantificaron por FACS.
La obtención de imágenes de células vivas se realizó en un microscopio de campo amplio (Leica AF6000LX, Alemania) usando un objetivo de aceite de 63x con 1,6 aumentos y filtros GFP (Ex BP 470/40, Em BP 525/50), Cy3 (Ex BP 555/25, Em b P 605/52) y A4 (Ex BP 360/40, Em 470/40). Las células tratadas se lavaron entonces 3 veces con PBS precalentado, y se recogieron por tripsinación. Se analizó un total de 10.000 células por citometría de flujo (análisis celular FACS ArrayTM, BD, EE. UU.).
El experimento de competición muestra que la captación de las nanopartículas de FAM-CGY se reduce significativamente al aumentar la concentración de transferrina, lo que indica que las nanopartículas de FAM-CGY compiten fuertemente con la transferrina por la unión al receptor de transferrina.
Ejemplo 3: Unión específica y captación celular de péptido CGY marcado con FAM a las células hCMEC/D3
Para evaluar la función de RAGE en la captación de nanopartículas de FAM-CGY, se trataron conjuntamente células hCMEC/D3 con el péptido RAGE o amiloide-p y nanopartículas de FAM-CGY en experimentos de competición (Figura 17).
La determinación de la internalización del péptido de fluorescencia en células hCMEC/D3 por citometría de flujo (FACS) se realizó del siguiente modo. Se sembraron en placa de 24 pocillos (Corning, NY) células (2x104/cm2) y se cultivaron 2 días a 37 °C y 5 % de CO2 para alcanzar 60 %-70 % de confluencia. Las células se lavaron 3 veces con PBS precalentado y se añadieron 200 pl de péptidos marcados con fluorescencia 5 pM (diluidos en suero que contiene medio celular). Después de 24 h de incubación a 37 °C con 5 % de CO2 , cada cámara se lavó 3 veces con PBS precalentado y se incubó con medio de crecimiento celular nuevo. El núcleo celular se tiñó con colorante Hoechst 34580 (5 ug/ml), se tiñó la membrana celular con aglutinina de germen de trigo Texas Red®-X (5 ug/ml). Las
nanopartículas de FAM-CGY (5 pM) compitieron con diferentes cantidades de péptido RAGE o péptido amiloide-p (5, 10 o 20 pg) y se analizaron por microscopía de fluorescencia (datos no mostrados) y se cuantificaron por FACS (Figura 17).
La obtención de imágenes de células vivas se realizó en un microscopio de campo amplio (Leica AF6000LX, Alemania) usando un objetivo de aceite de 63x con 1,6 aumentos y filtros GFP (Ex BP 470/40, Em BP 525/50), Cy3 (Ex BP 555/25, Em b P 605/52) y A4 (Ex BP 360/40, Em 470/40). Las células tratadas se lavaron entonces 3 veces con PBS precalentado, y se recogieron por tripsinación. Se analizó un total de 10.000 células por citometría de flujo (análisis celular FACS ArrayTM, BD, EE. UU.).
El experimento de competición muestra que la captación de las nanopartículas de FAM-CGY se reduce significativamente al aumentar la concentración de péptido RAGE o de amiloide-p, lo que indica que las nanopartículas de FAM-CGY compiten fuertemente con el péptido RAGE y el amiloide-p por la unión al receptor de RAGE.
Ejemplo 4: Experimentos de atenuación génica de TFRC
Se reguló por disminución la expresión del receptor de transferrina (TFRC) usando un reactivo de transfección comercial complejo de siPORT Amine/ARNip de TFRC para estudiar el posible bloqueo de la captación de nanopartículas de FAM-CGY en células hCMEC/D3. El reactivo de transfección comercial el complejo de siPORT Amine/ARNip de TFRC se incubó durante 72 h en células hCMEC/D3 que incluyen un ARNip no específico (Controlip) como control. Las células de baja expresión de TFRC y la células de transfección con Controlip se incubaron con nanopartículas de FAM-CGY 5 pM y transferrina 62,5 nM (control positivo) durante 16 h, respectivamente. Las nanopartículas de FAM-CGY y la captación de transferrina se detectó por microscopía de fluorescencia (no mostrada) y FACS (Figura 16).
La captación de nanopartículas de FAM-CGY se reduce notablemente en células hCMC/DE3 atenuadas en TFRC hasta casi el mismo nivel que la captación de transferrina. Por tanto, TFRC funciona como un receptor para la unión y captación de nanopartículas de FAM-CGY.
Ejemplo 5: Experimentos de atenuación génica de RAGE
Se reguló por disminución la expresión RAGE usando el reactivo de transfección comercial el complejo de la amina siPORT/ARNip de RAGE para estudiar el posible bloqueo de la captación de nanopartículas de FAM-CGY en células hCMEC/D3. El reactivo de transfección comercial el complejo de la amina siPORT/ARNip de RAGE se incubó durante 72 h en células hCMEC/D3 que incluyen un ARNip no específico (Controlip) como control. Las células de baja expresión de TFRC y las células de transfección con Controlip se incubaron con nanopartículas de FAM-CGY 5 pM y amiloide-p 250 nM (control positivo) durante 16 h, respectivamente. Las nanopartículas de FAM-CGY y la captación de péptidos RAGE se detectó por microscopía de fluorescencia (no mostrada) y FACS (Figura 18).
La captación de nanopartículas de FAM-CGY se reduce notablemente en células hCMC/DE3 atenuadas por RAGE hasta casi el mismo nivel que la captación de amiloide-p. Por lo tanto, RAGE sirve de receptor para las nanopartículas de FAM-CGY.
Ejemplo 6: Formación del complejo de ARNip/FAM-CGY
Se añadieron diferentes tasas molares de ARNip a la disolución de péptidos FAM-CGY (50 pM/l) gota a gota en solución salina y se incubaron durante 30 min. Entonces la disolución de mezcla se diluyó con medio de células hCMEC/D3 sin suero hasta una concentración de péptido final 5 pM. Se emplearon microscopía de fuerza atómica (AFM) (Figura 22a), el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Figura 22b), la microscopía de fluorescencia (no mostrada), la tecnología de dispersión dinámica de luz (DLS) (no mostrada) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Figura 23) para caracterizar el complejo de ARNip/FAM-CGY. Los complejos con ARN circular (ARNci) y FAM-CGY también se estudiaron usando TEM (Figura 24). Brevemente, se añadió una gota de la disolución final de Cy3-ARNip/FAM-CGY sobre el portaobjetos de vidrio (VWR del microscopio) y se dejó secar al aire a temperatura ambiente durante 30 min. Se obtuvieron imágenes de los complejos de Cy3-ARNip/FAM-CGY por microscopía fluorescente (Leica AF6000LX, Alemania) usando un objetivo de aceite 100x TlRF con 1,6 de aumento y filtros GFP (Ex BP 470/40, Em BP 525/50) y Cy3 (Ex BP 555/25, Em BP 605/52). El tamaño y la carga superficial de las nanopartículas peptídicas de FAM-CGY y el complejo de ARNip/FAM-CGY se investigaron usando un goniómetro Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, RU) que contenía una fuente de láser de He-Ne (A=633 nm, potencia de salida 22 mW). Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25 °C. Se realizaron tres mediciones cada una con 30 subseries para cada muestra y los resultados se muestran en la Tabla 2.
FAM-CGY forma nanopartículas esféricas estables y en forma de varillas con ARNip que tienen un diámetro promedio de 168±12 nm para las partículas esféricas analizadas por NTA y para fibras una longitud de 297±87 nm analizadas por TEM 23), que es ligeramente mayor que las nanopartículas de FAM-CGY descritas anteriormente. Estos resultados son similares a la caracterización por dispersión dinámica de luz (DLS), donde las partículas de ARNip/FAM-CGY están en el intervalo de tamaño de 170-180 nm y muestran una carga superficial ligeramente positiva con potenciales zeta que varían desde 5,57±0,87 hasta 1,27±0,38 mV.
Tabla 2. El tamaño y el potencial zeta de las nanopartículas de FAM-CGY y complejos de ARNip/FAM-CGY caracterizados por dispersión dinámica de luz (DLS).
Ejemplo 7: Transfección de células hCMC/DE3 con complejo de Cy3-ARNip/FAM-CGY
Para confirmar la tasa de transfección celular, se incubaron diferentes relaciones molares de ARNip marcado con fluorescencia de Cy3 (Cy3-ARNip) con péptido FAM-CGY para formar poliplejos, y se añadió a células hCMEC/D3 (datos no mostrados). Se añadieron diferentes tasas molares de Cy3-ARNip al péptido FAM-CGY gota a gota en solución salina y se incubaron durante 30 min. Entonces la disolución de mezcla se diluyó con medio hCMEC/D3 de células normales hasta una concentración final de péptido FAM-CGY 5 pM (5000 nM). Las células se incubaron con diferentes tasas de complejo de Cy3-ARNip/FAM-CGY como se indica a 37 °C durante 24 h. El núcleo celular se marcó con Hoechst 33342 (azul), barras insertadas = 50 pm.
El complejo de Cy3-ARNip/FAM-CGY presenta captación celular significativa por células hCMEC/D3 en todas las relaciones molares en comparación con Cy3-ARNip solo.
Ejemplo 8: Transfección de células hCMC/DE3 con complejo de Cy3-ARNip/FAM-CGY
Se investigó la eficacia de ARNip sometiendo células hCMEC/D3 a complejos de TFRC funcionales de ARNip/FAM-CGY (Figura 23).
Las distribuciones intracelulares de ARNip complejado con las nanopartículas de FAM-CGY se observaron por microscopía fluorescente usando ARNip marcado con Cy3-fluorescencia. Se realizaron experimentos de silenciamiento génico in vitro en células hCMEC/D3 usando el ARNip de TFRC y un ARNip mezclado como controles negativos. El nivel de expresión de TFRC en células hCMEC/D3 tratadas con diferentes formulaciones de ARNip/FAM-CGY se investigó por transferencia Western.
Las células tratadas con los complejos de ARNip mezclados no dan lugar a silenciamiento génico significativo incluso cuando se usa ARNip hasta 24 nM mezclado con FAM-CGY o la amina siPORT (Amina). A diferencia, la expresión génica de TFRC se reduce ligeramente por complejos de ARNip de TFRC/FAM-CGY que contienen ARNip 8 nM. Cuando se usa ARNip de TFRC hasta 24 nM, los complejos de ARNip de TFRC/ FAM-CGY inhiben eficientemente la expresión génica de TFRC hasta el 32,4 % después de 72 h de transfección. El sistema de administración de ARNip/FAM-CGY mostró una mejor eficiencia de silenciamiento que ARNip/Amina que conduce a 45,5 % de atenuación de TFRC. Además, la transfección del complejo de ARNip/ FAM-CGY depende del tiempo. Después de 24 horas y 48 horas, solo se detecta un 20 % de atenuación de la expresión génica, mientras que después de 72 horas se observa significativamente más atenuación.
Ejemplo 9: Citotoxicidad de Cy3-ARNip/FAM-CGY
La citoxicidad del péptido FAM-CGY y el complejo de ARNip/ FAM-CGY se evaluó por ensayo de lactasa deshidrogenasa (LDH) (Figura 26). Las células hCMEC/D3 se incubaron con diferentes concentraciones del péptido (desde 1 hasta 20 pM) y diferentes formulaciones de complejos de ARNip/FAM-CGY durante 24 h. La viabilidad de las células sin tratamiento se usó como control. El ensayo de LDH tiene medios para medir la integridad de la membrana en función de la cantidad de LDH citoplásmico fugado al medio. En comparación con el control en la Figura 26a, la fuga de LDH al medio para los grupos tratados con diferentes concentraciones del péptido no aumentó significativamente. Por lo tanto, no se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados con FAM-CGY, FAM-d-CGY y CGY-FAM. Se observó un 30 % de fuga de LDH en células tratadas con ARNip/grupo amina, que indicó que era más tóxico que los complejos de ARNip/FAM-CGY.
Estos resultados indican que no se observó una significativa citotoxicidad para el péptido FAM-CGY o los complejos de ARNip/FAM-CGY.
Ejemplo 10: Liberación de ARNip desencadenada por la luz
Para evaluar la liberación intracelular de ARNip cargado sobre nanopartículas de FAM-CGY por iluminación, se complejo Cy3-ARNip con FAM-CGY en la relación molar de 1:200 (Cy3-ARNip: FAM-CGY) en 50 gl de solución salina a una concentración de FAM-CGY 20 gM. Después de 30 min de incubación, el complejo de Cy3-ARNip/FAM-CGY se diluyó con 150 gl de 5 % de medio celular de FBS a una concentración final de FAM-CGY 5 gM. Las células hCMEC/D3 se sembraron en portaobjetos de cámara Lab-Tek de 8 pocillos (Nunc, Naperville, IL) (2x104 /cm2) y se cultivaron durante 24 h. Entonces se lavaron las células con PBS precalentado y se trataron con 200 gl de complejos. Después de 24 h de incubación, los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (5 gg/ml) durante 10 min y las células se aclararon tres veces con PBS precalentado. Las células irradiadas con luz de 488 nm en diferentes momentos de tiempo 0, 2, 2,30, 4 o 6 minutos pasaron a través de la lente objetivo 63x, y las imágenes se registraron cada una a 30 s por microscopía fluorescente usando filtros GFP (Ex BP 470/40, Em BP 525/50), Cy3 (Ex BP 555/25, Em BP 605/52) y A4 (Ex BP 360/40, Em 470/40), respectivamente. La intensidad de fluorescencia del péptido FAM-c Gy , Cy3-ARNip y Hoechst 33342 (núcleo) en el citoplasma a lo largo del área específica se cuantificó por el software LAS AF Lite 6.0 (Leica, Alemania) (Figura 29).
FAM-CGY se libera de vesículas internalizadas después de entre 2,5 y 4 minutos de exposición a la luz.
Ejemplo 11: Preparación de liposomas
Se produjeron F-liposomas que consistían en fosfolípidos, colesterol y líquido de acoplamiento funcionalizado (MPB-PE) en una relación molar de DPPC:colesterol:DSPE-PEG:DSPE-PEG-MPB en una relación de 7:2,5:0,025:0,025 a partir de películas de lípido hidratadas con PBS. La concentración final fue 10 gmoles de lípido/ml de tampón. La hidratación se realizó en un baño de agua a 56 °C durante 30 min. Las vesículas multilaminares resultantes se extruyeron (prensa extrusora LiposoFast) 21 veces a través de un filtro de policarbonato (Avanti) con un tamaño de poro de 100 nm. El tamaño de los liposomas se determinó por NanoSight LM20 (NanoSight, Amesbury, Reino Unido). Los liposomas se marcaron con fosfolípido fluorescente rojo (16:0 de Liss Rhod PE [1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonilo) (sal de amonio)]) o fosfolípido fluorescente verde (18:1 de PE CF [1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(carboxifluoresceína) (sal de amonio)]).
Acoplamiento de péptidos a liposomas
Los péptidos (péptido CGY o péptido GYR-GYR (que es un dímero de péptido CGY)) se redujeron usando Bond-Breaker TCEP 2 mM (Pierce) bajo una atmósfera de nitrógeno durante 1 h a 37 °C. Después de la filtración en gel usando una columna Sepharose CL-4B, para retirar el TCEP. El péptido reducido se incubó con liposomas preformados que contenían maleimida (la relación molar entre fosfolípidos y péptido era 1 gmol con respecto a 1 nmol) bajo una atmósfera de nitrógeno durante la noche a temperatura ambiente. Los grupos maleimida sin reaccionar se inactivaron por incubación con cisteína 0,5 mM durante 30 min a temperatura ambiente. Para retirar los péptidos no conjugados, la mezcla se centrifugó 3 veces a 75.000 rpm durante 30 min a 4 °C y se resuspendió en PBS. Entonces, la concentración de fosfolípidos se midió nuevamente, y para medir indirectamente la cantidad de péptidos que se había unido a los liposomas, la concentración de péptido en sobrenadante se midió por el método de ensayo de Bradford. El liposoma conjugado se caracterizó por SDS-PAGE y la medición del tamaño por el instrumento NanoSight.
Estudio de captación de péptidos conjugados por FACS
Las células usadas fueron la línea celular endotelial de cerebro humano hCMEC/D3, se cultivaron en medio de crecimiento endotelial 2 (EGM-2, Lonza, RU) complementado con suero bovino fetal (FBS) 5 %, hidrocortisona 1,4 gM, factor de crecimiento de fibroblastos básico 1 ng/ml, penstrep 1 % y HEPES 10 nM en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos. Las células se usaron al 70 % de confluencia (células correspondientes a 6x104 a 8x104 células), se incubaron con liposomas marcados con 0,2 gmoles de fosfolípido marcado fluorescentemente con ROJO o VERDE (F-liposoma) y que llevan el conjugado de péptido o liposomas unidos a CGY fluorescente o CGY mezclado (por ejemplo, FAM-CGY, CGY-FAM y FAM-CGY mezclado 2). Los liposomas se añadieron a las células (en 200 gl de medio) y después de la incubación durante la noche, las células se lavaron con 1 % de BSA en PBS, luego se desprendieron de las placas de cultivo celular usando tripsina (Sigma-Aldrich, Inc). Las células se analizaron por citometría de flujo (FACS Calibur, Becton Dickinson) (Figura 39).
F-liposoma y FAM unido al péptido CGY o péptidos GYR-GYR en cualquier posición se unen a células hCMEC/D3 en un mayor número que el control y F-liposoma solo.
Ejemplo de referencia 12: Experimentos con péptido doble FAM-GYR-GYR
Se investigó la diferente captación celular de péptidos FAM-CGY y FAM-GYR-GYR en células hCMEC/D3 por citometría de flujo (FACS). Se sembraron células hCMEC/D3 (2x104/cm2) en placa de 24 pocillos (Corning, NY) y se cultivaron 2 días a 37 °C y 5 % de CO2 para alcanzar 60 %-70 % de confluencia. Las células se lavaron 3 veces con PBS precalentado. Los experimentos de captación de péptidos se iniciaron añadiendo 200 gl de un intervalo de FAM-CGY y FAM-GYR-GYR en diferentes concentraciones (1-10 gM/l, diluido en suero que contiene medio celular). El péptido doble contiene la secuencia Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly y opcionalmente tiene un resto de cisteína aminoterminal.
Después de 24 h de incubación a 37 °C con 5 % de CO2, cada cámara se lavó con PBS precalentado 3 veces, y se recogió por tripsinación. Se analizó un total de 10.000 células por citometría de flujo (FACS ArrayTM Cell Analysis, BO, EE. UU.) (Figura 35).
El péptido FAM-GYR-GYR/estructuras muestran captación considerablemente mayor por células hCMEC/D3 en comparación con el péptido FAM-CGY en todas las concentraciones probadas. El péptido doble muestra excelente unión a diana, incluso elevada cuando se compara con la secuencia individual y permite la administración de mayores moléculas (por ejemplo, ADN). Los ensayos ilustrados utilizaron un péptido doble con un resto de glicina entre los dos elementos de la secuencia de péptidos, pero se pueden usar otros conectores de aminoácidos, u otras moléculas conectoras distintas de aminoácidos, para crear dicha molécula.
Ejemplo de referencia 13: Transfección del complejo de Cy3-ARNip/FAM-GYR-GYR en células hCMEC/D3
Se complejó Cy3-ARNip con FAM-GYR-GYR en una relación molar de 1:200 (Cy3-ARNip: FAM-CGY) en 50 gl de solución salina a una concentración de 20 gM/l de FAM-GYR-GYR. Después de 30 min de incubación, el complejo de Cy3-ARNip/FAM-GYR-GYR se diluyó con 150 gl de 5 % de medio celular de FBS hasta una concentración final de 5 gM/l de FAM-GYR-GYR. Las células hCMEC/D3 se sembraron en portaobjetos de cámara Lab-Tek de 8 pocillos (Nunc, Naperville, IL) (2x104/cm2) y se cultivaron durante 24 h. Entonces se lavaron las células con PBS precalentado y se trataron con 200 gl de complejos de Cy3-ARNip/FAM-GYR-GYR. Después de 1 o 4 h de incubación, los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (5 gg/ml) durante 10 min y las células se aclararon tres veces con PBS precalentado. Finalmente, las células se observaron con un microscopio de fluorescencia de Leica (Leica AF6000LX, Alemania) usando un objetivo de aceite TIRF 63x y filtros GFP (Ex BP 470/40, Em BP 525/50), Cy3 (Ex BP 555/25, Em BP 605/52) y A4 (Ex BP 360/40, Em 470/40), respectivamente (Figura 36).
Este ensayo demuestra que el complejo de Cy3-ARNip/FAM-GYR-GYR se internaliza en células hCMEC/D3.
Ejemplo 14: Unión de un resto hidrófobo a una nanopartícula formada de péptidos
Se sintetizó péptido CGY conjugado con ácido caprílico (caprílico-CGY) se sintetizó por un método en fase sólida. Los péptidos se purificaron por HPLC preparativa y se caracterizaron por HPLC analítica y espectrometría de masas (Mw=1946,29, pureza: 98,26 %). Los péptidos liofilizados se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) con una concentración de péptido de 500 gM y se guardaron a -80 °C. Para el autoensamblaje, la disolución madre 500 gM de caprílico-CGY se diluyó en agua MQ con la concentración final de 5 gM y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. El tamaño del autoensamblaje de caprílico-CGY se realizó por análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (LM20, NanoSight, Amesbury, Reino Unido) con una cámara de muestra con un láser azul de 405 nm y una junta tórica de fluoroelastómero Viton. Como se observa en la Figura 41, el tamaño medio de autoensamblaje es 117 ± 74 nm y con una moda de 86 nm.
Ejemplo 15: Rodamina como fármaco o molécula fluorescente unida a un péptido
Se formaron complejos peptídicos por adición de gotas de cargas (FAM-(C)-NAP, FAM-GYR, FAM-NAP, FAM) a péptido CGY conjugado con rodamina 80 gM (Rh-CGY) o péptido CGY 80 gM (Tabla X) en agua MilliQ (MQ) con volumen de líquido equiparable y se incubaron durante 60 min. La mezcla se diluyó con agua MQ hasta una concentración final de péptido Rh-CGY o CGY de 10 gM. Los complejos peptídicos se caracterizaron por NTA para tamaño y microscopía electrónica (EM) para morfología. También se empleó transferencia Western para detectar enlace disulfuro, que se forma entre la carga y el péptido Rh-CGY o péptido CGY. Brevemente, el péptido o las muestras de complejo se cargaron sobre 10 % de minigeles Bis-Tris (Invitrogen, CA, EE. UU.) y se sometieron a electroforesis. Las muestras separadas se transfirieron electroforéticamente a membranas de PVDF usando un dispositivo de transferencia en gel iBlotTM (Life Technologies, EE. UU.). Las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente en 3 % de BSA/TBST (cloruro sódico 137 mM, Tris 20 mM, 0,1 % de Tween-20, pH 7,6), y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo HRP-anti-fluoresceína de cabra (diluido 1:1000 en 2 % de BSA/TBST). Para la detección, las membranas se incubaron con Novex® ECL Chemiluminescent Substrate Reagent Kit (Invitrogen, CA, EE. UU.).
Administración de péptidos a células hCMEC/D3. Se realizaron experimentos de administración in vitro en células hCMEC/D3. Brevemente, los complejos peptídicos se prepararon en primer lugar con concentración de Rh-CGY 80 gM o péptido CGY80 gM, y se diluyeron con medio celular hasta péptido Rh-CGY o CGY 10 gM. Las disoluciones de complejo se añadieron a células hCMEC/D3 tras 24 h de incubación. Se obtuvieron imágenes de células vivas por microscopía de campo amplio, y se cuantificó la intensidad de fluorescencia intercelular por FACS.
Para investigar el efecto del bloque hidrófobo FAM en el autoensamblaje de péptidos, se eligió otro fluoróforo, rodamina B, para conjugar con el péptido CGY en el extremo amino, que se llamó Rh-CGY (masa molecular 2244,69 g/mol). La medición de NTA indicó que Rh-CGY también se puede autoensamblar fácilmente. La Fig.41 representa la distribución del tamaño de Rh-CGY supermolecular con pico estrecho y una débil fracción de cola. El tamaño promedio de Rh-CGY supermolecular fue 131 ± 60 nm con un tamaño modal de 94 nm (Fig. 41a). También el supermolecular de Rh-CGY puede entrar eficientemente en las células hCMEC/D3 (Fig. 41b). Para investigar la funcionalidad del péptido Rh-CGY, una carga modelo de péptido FAM-(C)-NAP se seleccionó para el ensamblaje conjunto con el péptido Rh-CGY. A partir de los datos de la transferencia Western, el péptido FAM-(C)-NAP forma enlace disulfuro con el péptido RhCGY (Fig. 42). Los carriles de la transferencia Western son los siguientes: Carril 1: péptido Rh-CGY, Carril 2: péptido FAM-(C)-NAP, Carril 3: péptido CGY, Carril 4: péptido FAM-GYR, Carril 5: complejo peptídico Rh-CGY/ FAM-(C)-NAP, Carril 6: complejo peptídico Rh-CGY/ FAM-g Yr , Carril 7: complejo peptídico CgY/ FAM-(C)-NAP.
Debido a este enlace disulfuro y la interacción n -n entre el fluoróforo de FAM y la rodamina, el péptido FAM-(C)-NAP puede formar un complejo estable con el péptido Rh-CGY. El tamaño promedio es 99 ± 41 nm (Fig. 43a). La mezcla de Rh-CGY y FAM-(C)-NAP se autoensambló en no solo las nanopartículas, sino también en fibras basadas en la observación de EM (Fig. 43b). Con la ayuda del péptido Rh-CGY, el péptido FAM-(C)-NAP puede ser fácilmente suministrado en células hCMEC/D3 (Fig. 43c, d, e). Cuando el péptido FAM-(C)-NAP se mezcló con el péptido CGY, también pudo formar un enlace disulfuro con el péptido CGY (Fig. 42).
Sin embargo, esta mezcla no puede formar partículas y la mezcla de FAM-(C)-NAP y el péptido CGY no puede suministrar el péptido FAM-(C)-NAP en las células (Fig. 43c). Cuando el aminoácido cisteína se borró de la secuencia del péptido FAM-(C)-NAP, el péptido FAM-NAP fue escasamente captado por las células hCMEC/D3 (Fig. 43c). Cuando se incubó conjuntamente con el péptido Rh-CYG, no formó enlace disulfuro con el péptido Rh-CGY. El péptido FAM-NAP no atravesó eficientemente la membrana celular incluso después de incubarse conjuntamente con el péptido Rh-CGY (Fig. 43c). Estas observaciones indicaron que la formación del enlace disulfuro es un factor clave para administrar el péptido FAM-(C)-NAP en las células. Esto se puede realizar más fácilmente con la inclusión de un resto de cisteína, y dicha inclusión puede ser en muchos puntos diferentes de la secuencia, que incluye en el extremo N, en el extremo C, o internamente.
En otro caso, el péptido FAM-GYR puede formar un complejo estable de partículas/fibras con el péptido Rh-CGY con el tamaño medio de 82 ± 43 nm (Fig. 44a,b). El péptido FAM-GYR atrapado en el péptido Rh-CGY se suministró significativamente en células hCMEC/D3 en comparación con el péptido FAM-GYR solo (Fig. 44c, d). El péptido FAM-GYR no contiene la cisteína, y no puede formar el enlace disulfuro para que se reticule con el péptido Rh-CGY (Fig. 42). Pero la principal secuencia de FAM-GYR fue la misma con el péptido Rh-CGY, el aminoácido en FAM-GYR y el péptido Rh-CGY, tal como Arg, Trp, pueden interactuar entre sí para formar el enlace de hidrógeno y la interacción nn. Este resultado demostró que la mezcla peptídica Rh-CGY/FAM-GYR se puede autoensamblar en complejos estables incluso sin el enlace disulfuro (Fig. 44a,b). Las células se marcaron con Hoechst 33342 (azul).
Para demostrar aún más este concepto, el fluoróforo FAM solo se incubó conjuntamente con el péptido Rh-CGY. FAM no se puede atrapar en los complejos peptídicos Rh-CGY. La mezcla de FAM y el péptido Rh-CGY puede no potenciar la captación de FAM en células hCMEC/D3 (Fig. 43c). Esto sugiere que la secuencia del péptido FAM-GYR es específica para formar partículas estables con el péptido Rh-CGY y mejorar la captación en células hCMEC/D3. El péptido Rh-CGY se puede ensamblar conjuntamente con el péptido de carga con propiedades específicas para fabricar un complejo estable de nanopartículas/fibra debido a la formación de enlace disulfuro o enlace hidrógeno e interacción n-n, y la administración del péptido de carga en células hCMEC/D3. El péptido Rh-CGY es un posible candidato del sistema de administración basado en péptidos para la enfermedad del SNC.
Ejemplo de referencia 16: Transfección de plásmidos mediada por péptido doble
Para evaluar la transfección génica mediada por péptido doble (DP), se mezclaron diferentes concentraciones de DP y cantidades constantes del plásmido de expresión pcDNA3.1NT-GFP (0,3 pg) (se investigó la relación de cambio péptido/ADN de 1:10, 1:20 y 1:40 en este estudio) en 50 pl de medio libre de suero, y los complejos se formaron durante 1 h a temperatura ambiente, después de que se añadieran otros 150 pl de medio libre de suero (el volumen total de complejo de péptido/ADN fue 200 pl). Las células cultivadas hCMEC/D3 (2x104 células) se revistieron con 200 pl de complejo de péptido/ADN, seguido por incubación durante 4 h a 37 °C en 5 % de atmósfera de CO2. Entonces se lavaron los cultivos una vez con medio libre de suero y se transfirieron para completar el medio que contenía 5 % de suero para el crecimiento. Después de 48 h, las expresiones génicas de GFP se monitorizaron por microscopía de fluorescencia. Se realizaron transfecciones mediadas por Lipofectamine®2000 como se describe por el protocolo del fabricante (Life Technologies, CA, EE. UU.).
Puesto que el péptido doble (DP) tiene cuatro aminoácidos de carga positiva en cada molécula de péptido, es posible que el DP se una con el ADN por interacción electrostática y forme un complejo estable. Para probar la posibilidad de la administración génica mediada por DP, se mezcló DP con ADN de plásmido que codifica GFP en diferentes relaciones de carga de 10:1 a 40:1. La transfección se realizó con diferentes relaciones de carga de péptido/ADN en células hCMEC/D3, y se evaluaron las eficiencias de transfección usando análisis microscópico de fluorescencia de la expresión de GFP. Los resultados mostraron que el DP fue capaz de mediar en la translocación de plásmidos en células cuando las relaciones de carga de péptido/ADN son superiores a 20 (Fig. 45). Y la eficiencia de transfección de péptido/ADN con la relación de carga 40:1 fue comparable a la del reactivo de transfección comercial Lipofectamine® 2000 basado en la intensidad de la señal de microscopía de fluorescencia. Pero en comparación con DP, Lipofectamine® 2000, el sistema de administración génica basado en lípidos catiónicos, puede conducir a mayor citotoxicidad. Los resultados indicaron que el DP es un posible y seguro sistema de administración de plásmido para el direccionamiento del cerebro. Las células se marcaron con Hoechst 33342 (azul).
Ejemplo 17: Direccionamiento del cerebro in vivo
Ratones BALB/c sin pelo recibieron 5 pM de péptido FAM-CGY o 10 pM de péptido Rh-CGY (la concentración final en sangre) por vía intravenosa y se sometieron a obtención de imágenes ópticas en diversos momentos de tiempo después de la inyección. La obtención de imágenes de fluorescencia in vivo se realizó usando el IVIS Imaging System 200 Series y se analizó usando el software IVIS Living Imaging 3.0 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, EE. UU.). Se usaron conjuntos optimizados de filtros GFP o Dsred para adquirir la fluorescencia de péptidos FAM-CGY o Rh-CGY in vivo, respectivamente. Después de registrarse imágenes del cuerpo completo del ratón, los ratones se sacrificaron y los órganos se diseccionaron y se sometieron a obtención de imágenes de fluorescencia ex vivo. Los datos en la Figura 46 muestran el direccionamiento del cerebro de la invención descrita, así como la localización en órganos del sistema reticuloendotelial (hígado, bazo). La acumulación en el riñón puede representar conjugados de una sola cadena (puesto que están en equilibrio con nanopartículas). También aparece cierta acumulación en el pulmón (no mostrada).
Ejemplo 18: Secciones de cerebro en ratón inyectado con péptido
Los órganos se fijaron en una disolución de PBS de 4 % de paraformaldehído durante la noche. Después de eso, las muestras se colocaran en 15 % de sacarosa en disolución de PBS durante 12 h, que luego se sustituyó con 30 % de sacarosa durante 24 h. Las muestras se incorporaron entonces en el compuesto Tissue Tek O.C.T. (Mc Cormick, EE. UU.) y se congelaron a -60 °C en isopentano. Las secciones congeladas, 7 mm de espesor, se prepararon con un criotomo y se tiñeron con 10 pg/ml de DAPI durante 10 min. Después del lavado con PBS, las secciones se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados en la Fig.47 muestran señales fluorescentes en el tejido cerebral, representando la coloración verde el péptido marcado y siendo el azul DAPI.
Ejemplo 19: Obtención de imágenes de las estructuras agregadas del conjugado de péptido
El análisis de microscopía de fuerza atómica (AFM) de FAM-CGY reveló la presencia de una nanopartícula heterogénea y el sistema de red de 'nanopartículas-fibra', donde algunas nanopartículas interceptan fibras o se reticulan por las fibras (Fig. 48a). La nanopartícula puede ser percibida como sitios de nucleación donde aparecen varias estructuras de 'tipo nanofibra' de dimensiones y altura variables. Debido a la naturaleza heterogénea de la red, se empleó análisis de seguimiento de , nanopartículas (NTA) para la posible determinación de la distribución del tamaño y el recuento de las especies observadas en la nanopartícula y el sistema de red de 'nanopartículas-fibra'.
La investigación por microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la red de 'nanopartículas-fibra' mostró que las estructuras de tipo 'esféricas' son de la morfología de 'núcleo-corteza' (Fig. 48c-g). El componente de núcleo (Fig. 4a1) es lo más probablemente un ensamblaje de unímeros, dímeros y/u oligómeros condensados de diferentes disposiciones (por ejemplo, dímeros con disposiciones antiparalelas) y susceptible a crecimiento adicional a través de múltiples fuerzas interactivas, que con el tiempo forma proyecciones alargas de 'tipo pelo' del componente de corteza (Fig. 4a3, 4b1 y 4b2). Son visibles diferentes morfologías de red de nanofibras, predominantemente de arquitecturas alargadas retorcidas que emanan del componente de corteza de las estructuras de 'núcleo-corteza' (Fig. 48c, e-g).
Claims (17)
1. Un agregado que comprende al menos dos moléculas de un conjugado de polipéptido, en donde el conjugado de polipéptido comprende:
un polipéptido, que tiene una secuencia de polipéptidos (1): Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly, o un derivado de la misma que tiene al menos 12 aminoácidos idénticos a la secuencia de polipéptidos (1), en donde el polipéptido se une o interactúa con un receptor de transferrina (TFRC) o un receptor para producto final de glicación avanzada (RAGE);
un resto de cisteína en el extremo N del polipéptido; y
un resto hidrófobo, que está unido al polipéptido por el resto de cisteína; y sales o ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos; en donde
el agregado comprende un núcleo que comprende los restos hidrófobos, y una corteza que comprende aminoácidos de los polipéptidos dispuestos hacia los alrededores;
y en donde el agregado es obtenible por autoensamblaje del conjugado de polipéptidos para ocultar los restos hidrófobos en el interior del núcleo.
2. El agregado de la reivindicación 1, en donde el resto hidrófobo es amidita de fluoresceína (FAM), rodamina (Rh), una cianina, Cy3, Cy5, o ácido caprílico.
3. Un conjugado de polipéptido que comprende:
un polipéptido, que tiene una secuencia de polipéptidos (1): Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly, o un derivado de la misma, que es al menos 12 aminoácidos idéntica a la secuencia de polipéptidos (1), en donde el polipéptido se une o interactúa con un receptor de transferrina (TFRC) o un receptor para producto final de glicación avanzada (RAGE);
un resto de cisteína en el extremo N del polipéptido; y
un resto hidrófobo, que está unido al polipéptido por el resto de cisteína, en donde el resto hidrófobo es FAM, Rh, una cianina, Cy3, Cy5, o ácido caprílico; y
sales o ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos;
en donde el conjugado de polipéptido es adecuado para el autoensamblaje en un agregado que comprende al menos dos moléculas de dicho conjugado de polipéptido, en donde el agregado comprende un núcleo que comprende los restos hidrófobos, y una corteza que comprende aminoácidos de los polipéptidos dispuestos hacia los alrededores;
y en donde el agregado es obtenible por autoensamblaje del conjugado de polipéptidos para ocultar los restos hidrófobos en el interior del núcleo.
4. El agregado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o el conjugado de polipéptido de la reivindicación 3, en donde el polipéptido tiene la secuencia de polipéptidos (1): Gly-Tyr-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ile-Arg-Gly-His-Trp-Ala-Pro-Gly.
5. El agregado de una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 4, o el conjugado de polipéptido de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, que comprende dos o más polipéptidos de secuencia (1), o derivados de la misma, que tienen al menos 12 aminoácidos idénticos a la secuencia de polipéptidos (1), separados por un espaciador.
6. El agregado o conjugado de polipéptido de la reivindicación 5, en donde el espaciador es un enlace peptídico, aminoácido o péptido.
7. El agregado o conjugado de polipéptido de la reivindicación 6, en donde el espaciador es un resto de glicina.
8. El agregado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 o 4-7, o el conjugado de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende al menos un principio activo unido al polipéptido por uno o más enlaces no covalentes.
9. El agregado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-8, que tiene una estructura esférica o en forma de varilla.
10. El agregado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-9, que es una partícula de al menos 2 nm de diámetro.
11. El agregado de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-10, en donde un principio activo está atrapado físicamente dentro del agregado.
12. El agregado o conjugado de polipéptido de la reivindicación 8, o el agregado de la reivindicación 11, en donde el principio activo se selecciona del grupo que consiste en moléculas pequeñas farmacéuticas activas, proteínas, ácidos nucleicos que incluyen moléculas de ARNip y moléculas antisentido, conjugados de expresión que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica de interés, liposomas, nanopartículas, agentes de diagnóstico, marcadores de una enfermedad de un trastorno del sistema nervioso central, cáncer o diabetes, anticuerpos, eritrocitos, fantasmas eritrocitarios, esferoplastos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales marcados que se unen al marcador de un trastorno del sistema nervioso central, cáncer o diabetes, y un fragmento de anticuerpo o anticuerpo monoclonal.
13. El conjugado de polipéptido o agregado de la reivindicación 12, en donde el principio activo es ARNip, ADN o Cy3-ARNip.
14. Composición farmacéutica que comprende el conjugado de polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8 o 12-13, o agregado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-13, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
15. Un método de administración in vitro de un conjugado de polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 8 o 12-13, o un agregado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 o 4-13, a una célula de mamífero que expresa un receptor de transferrina (TFRC) y/o receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE) sobre su membrana plasmática, método que comprende:
(a) proporcionar el conjugado de polipéptido o el agregado, y
(b) poner en contacto dicho conjugado de polipéptido o agregado con una célula de mamífero que expresa TFRC y/o RAGE sobre su membrana plasmática.
16. El método de la reivindicación 15, en donde la célula de mamífero es de un tejido de mamífero seleccionado del grupo que consiste en tubo gastrointestinal, médula ósea, hígado, bazo, cerebro, riñón, pulmones, páncreas, vejiga, ojo, vasos sanguíneos normales y patológicos, y células cancerosas.
17. El agregado de la reivindicación 8 o la reivindicación 11, en donde el principio activo es un componente farmacéutico activo, para su uso como un medicamento.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA201370453 | 2013-08-19 | ||
PCT/EP2014/067651 WO2015024931A1 (en) | 2013-08-19 | 2014-08-19 | Peptidic nanodelivery composition targeting two receptors |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2928155T3 true ES2928155T3 (es) | 2022-11-15 |
Family
ID=51359400
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES14752865T Active ES2928155T3 (es) | 2013-08-19 | 2014-08-19 | Composición de nanoadministración peptídica que se dirige a dos receptores |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US9981047B2 (es) |
EP (1) | EP3035969B1 (es) |
DK (1) | DK3035969T3 (es) |
ES (1) | ES2928155T3 (es) |
WO (1) | WO2015024931A1 (es) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3035969B1 (en) * | 2013-08-19 | 2022-08-03 | S.M. Discovery Holdings Inc. | Peptidic nanodelivery composition targeting two receptors |
WO2018152326A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Denali Therapeutics Inc. | Engineered transferrin receptor binding polypeptides |
BR112022012230A2 (pt) | 2019-12-23 | 2022-08-30 | Denali Therapeutics Inc | Variantes de progranulina |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001026704A2 (en) | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Yehuda Yarmut | Targeted drug activation |
CN100558903C (zh) | 2000-11-29 | 2009-11-11 | Pci生物技术联合股份有限公司 | 将分子输递进胞质溶胶的光化学内化法 |
AU2002236499A1 (en) | 2000-11-30 | 2002-06-11 | Uab Research Foundation | Receptor-mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor |
US7001991B2 (en) | 2001-05-15 | 2006-02-21 | Faulk Pharmaceuticals, Inc. | Targeted delivery of bioaffecting compounds for the treatment of cancer |
WO2007134151A2 (en) | 2006-05-10 | 2007-11-22 | Smithkline Beecham Corporation | Composition and method for increasing cell permeability of a compound |
EP2089419A2 (en) | 2006-10-27 | 2009-08-19 | Zapaloid Limited | Inhibition of beta-amyloid aggregation |
WO2011005098A1 (en) * | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Abbott Healthcare Products B.V. | Peptide ligands for targeting to the blood-brain barrier |
WO2011009624A1 (en) | 2009-07-22 | 2011-01-27 | Cenix Bioscience Gmbh | Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes |
EP3035969B1 (en) * | 2013-08-19 | 2022-08-03 | S.M. Discovery Holdings Inc. | Peptidic nanodelivery composition targeting two receptors |
-
2014
- 2014-08-19 EP EP14752865.7A patent/EP3035969B1/en active Active
- 2014-08-19 US US14/912,997 patent/US9981047B2/en active Active
- 2014-08-19 ES ES14752865T patent/ES2928155T3/es active Active
- 2014-08-19 DK DK14752865.7T patent/DK3035969T3/da active
- 2014-08-19 WO PCT/EP2014/067651 patent/WO2015024931A1/en active Application Filing
-
2018
- 2018-05-29 US US15/991,738 patent/US11000599B2/en active Active
-
2021
- 2021-04-02 US US17/301,430 patent/US11730820B2/en active Active
-
2023
- 2023-08-18 US US18/452,479 patent/US20240131174A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9981047B2 (en) | 2018-05-29 |
EP3035969A1 (en) | 2016-06-29 |
US20210290773A1 (en) | 2021-09-23 |
EP3035969B1 (en) | 2022-08-03 |
US20160271269A1 (en) | 2016-09-22 |
US20240131174A1 (en) | 2024-04-25 |
US11730820B2 (en) | 2023-08-22 |
WO2015024931A1 (en) | 2015-02-26 |
US20200069813A1 (en) | 2020-03-05 |
DK3035969T3 (da) | 2022-10-24 |
US11000599B2 (en) | 2021-05-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Albertazzi et al. | Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells | |
Byeon et al. | Doxorubicin-loaded nanoparticles consisted of cationic-and mannose-modified-albumins for dual-targeting in brain tumors | |
Zong et al. | Synergistic dual-ligand doxorubicin liposomes improve targeting and therapeutic efficacy of brain glioma in animals | |
Tang et al. | A stabilized retro-inverso peptide ligand of transferrin receptor for enhanced liposome-based hepatocellular carcinoma-targeted drug delivery | |
Han et al. | Peptide-conjugated PAMAM for targeted doxorubicin delivery to transferrin receptor overexpressed tumors | |
Shim et al. | Reduced graphene oxide nanosheets coated with an anti-angiogenic anticancer low-molecular-weight heparin derivative for delivery of anticancer drugs | |
Wen et al. | Utilizing viral nanoparticle/dendron hybrid conjugates in photodynamic therapy for dual delivery to macrophages and cancer cells | |
Haque et al. | Nanostructure-based drug delivery systems for brain targeting | |
US11730820B2 (en) | Peptidic blocks for nucleic acid delivery | |
Sigg et al. | Stimuli-responsive codelivery of oligonucleotides and drugs by self-assembled peptide nanoparticles | |
Verderio et al. | Delivering colloidal nanoparticles to mammalian cells: a nano–bio interface perspective | |
Liu et al. | A bacteria deriving peptide modified dendrigraft poly-l-lysines (DGL) self-assembling nanoplatform for targeted gene delivery | |
Narang et al. | Targeted delivery of small and macromolecular drugs | |
Zhang et al. | Mitophagy induced by nanoparticle–peptide conjugates enabling an alternative intracellular trafficking route | |
Bian et al. | Awakening p53 in vivo by D-peptides-functionalized ultra-small nanoparticles: Overcoming biological barriers to D-peptide drug delivery | |
US20160312218A1 (en) | System for co-delivery of polynucleotides and drugs into protease-expressing cells | |
Gonzalez-Valdivieso et al. | Self-assembling ELR-based nanoparticles as smart drug-delivery systems modulating cellular growth via Akt | |
US9784730B2 (en) | Nanoparticle for targeting brain tumors and delivery of O6-benzylguanine | |
Pereira-Silva et al. | Nanomedicine in osteosarcoma therapy: Micelleplexes for delivery of nucleic acids and drugs toward osteosarcoma-targeted therapies | |
WO2013059617A1 (en) | Liposome compositions and methods of use | |
US20190192686A1 (en) | Targeted nanodroplet emulsions for treating cancer | |
Nieland et al. | Engineered EVs designed to target diseases of the CNS | |
Tan et al. | Rapid endolysosomal escape and controlled intracellular trafficking of cell surface mimetic quantum-dots-anchored peptides and glycopeptides | |
Shim et al. | Comparative study of cathepsin B-cleavable linkers for the optimal design of cathepsin B-specific doxorubicin prodrug nanoparticles for targeted cancer therapy | |
Abakumova et al. | Barnase-Loaded Vaterite Nanoparticles Functionalized by EpCAM Targeting Vectors for the Treatment of Lung Diseases |