CN1969045A - 具有由MrgA蛋白或同源物介导的改进分泌的细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及源自亲代细胞的后代细胞,其中所述后代细胞包含至少一个编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因和/或与该编码基因可操作连接的DNA区段,其中所述基因和/或DNA区段相对于亲代细胞***作;所述后代细胞包含编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的两个或更多个拷贝;或所述后代细胞相对于亲代细胞被突变;由此所述后代细胞产生比亲代细胞更大量的MrgA蛋白或其功能同源物。
Description
技术领域
在分泌型多肽的工业生产中,所关心的是得到尽可能高的成品收率(product yield)。因此,非常理想的是从生产细胞的分泌机构中除去任何可能的瓶颈。为此,已知可有利地过量表达(overexpress)一种或多种基因,该基因编码与分泌有关的蛋白质例如,PrsA蛋白或其功能同源物(homologous)。本发明涉及过量表达MrgA蛋白或功能MrgA蛋白同源物的细胞。
背景技术
最初将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的MrgA蛋白分类为Dps(PexB)同源物,其由金属调控的氧化应激基因(metalloregulated oxidative-stress gene)(金属调控的基因(
metallo
regulated
gene))mrgA编码。枯草芽孢杆菌中MrgA蛋白的一种假设的功能是在氧化应激的条件下结合DNA并保护DNA免于损害(Chen L,Helmann JD.1 995.Bacillus subtilis MrgA is a Dps(PexB)homologue:evidence for metalloregulation of an oxidative stress gene.Mol Microbiol 18:295-300)。
枯草芽孢杆菌mrgA缺失突变株只具有分泌型蛋白质的总水平的稍稍减少,并因此大致地推断MrgA不涉及枯草芽孢杆菌中的蛋白分泌(van Wely KH,Swaving J,Klein M,Freudl R,Driessen AJ.2000.The carboxyl terminus of theBacillus subtilis SecA is dispensable for protein secretion and viability.Microbiology 146:2573-81)。
然而,本发明者已发现,如本文所说明的,MrgA实际上涉及芽孢杆菌中的分泌,而且越高的mrgA的表达导致越高的胞外酶分泌,下面通过异源alpha-淀粉酶的改进的分泌来举例说明。
发明内容
通过过量表达胞外酶,解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的alpha-淀粉酶AmyQ将严重的分泌应激(secretion stress)施加于枯草芽孢杆菌细胞,所述的alpha-淀粉酶AmyQ由细胞中质粒携带的组成型表达的基因(plasmid-bome constitutively expressed gene)编码。DNA微阵列分析显示普通应激蛋白mrgA的表达增加,作为对于施加的分泌应激的应答。
从枯草芽孢杆菌的染色体通过PCR扩增mrgA基因。以三种不同的上游PCR引物进行三个PCR反应,所述的上游PCR引物每种包含合成的不同强度的组成型启动子序列。将三个扩增的PCR片段整合入单独的枯草芽孢杆菌菌株的染色体,得到三株重组菌株,每个表达的mrgA来自天然基因座,也来自整合的mrgA拷贝,其由合成的启动子转录。
然后用质粒pKTH10转化过量表达mrgA的三株菌株和相应的对照菌株,所述的质粒pKTH10携带并组成型过量表达编码解淀粉芽胞杆菌的alpha-淀粉酶AmyQ的基因。
在200ml BPX培养摇瓶中培养1周后,测定由转化菌株分泌的AmyQ淀粉酶的收率(yield)。对于这三株MrgA过量表达的菌株中的每一株和对照菌株,将三个独立的分离物进行三次重复的分析以测定淀粉酶收率。从MrgA过量表达菌株分泌的淀粉酶的收率为27%-44%,高于来自对照菌株的收率。
因此,在第一个方面本发明涉及源自亲代细胞的后代细胞,其中
a)所述后代细胞包含至少一个编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因和/或与该编码基因可操作连接的DNA区段,其中所述基因和/或DNA区段相对于亲代细胞***作;
b)所述后代细胞包含编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的两个或更多个拷贝;或
c)所述后代细胞相对于亲代细胞被突变;
由此后代细胞产生比亲代细胞更大量的MrgA蛋白或其功能同源物。
在本上下文中,MrgA蛋白的功能同源物是蛋白,当其以较高水平在细胞中表达时,导致胞外酶,如alpha-淀粉酶的分泌与在基本相同的条件下培养的正常表达Mrg功能同源物的其他方面相同的细胞相比增加。此外,当如上所述进行比对时,MrgA蛋白的功能同源物与MrgA蛋白具有至少50%,优选55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%,或最优选99%同一性的氨基酸序列。
本发明的第二个方面涉及增强目标蛋白分泌的方法,该方法包括根据第一个方面在细胞中表达所述蛋白。
本发明的第三个方面涉及如在第一个方面限定的产生细胞方法用来产生目标蛋白,所述方法包括操纵细胞以增加MrgA蛋白或其功能同源物表达的步骤。
在第四个方面,本发明涉及产生目标蛋白的方法,其包括如下步骤:
a)培养如第一个方面限定的细胞;和
b)回收所述蛋白。
在最后的方面,本发明涉及MrgA-蛋白或其功能同源物在通过操纵或突变细胞以表达比非-操纵的或非-突变的细胞更大量的MrgA蛋白或其功能同源物来增强蛋白分泌的方法中的用途。
定义
根据本发明,所采用的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术不超过本领域的技术。在文献中完全解释了这些技术。参见,例如,Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本文称为“Sambrook等,1989”)DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I和II/D.N.Glover ed.1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984);NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds(1985));Transcription andTranslation(B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1986));Immobilized Cells和Enzymes(IRL Press,(1986));B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)。
“多核苷酸”是从5’至3’端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA,并可从天然来源分离,体外合成,或者由天然的和合成的分子的组合来制备。
“核酸分子”或“核苷酸序列”指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷;“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷;“DNA分子”)的以单链形式或双链螺旋形式存在的磷酸酯多聚体形式。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子,而且尤其是DNA或RNA分子,仅仅指该分子的初级和二级结构,并不将其限制于任何具体的三级或四级形式。因此,此术语包括尤其是以线状或环状DNA分子(例如,限制性片段)、质粒和染色体形式存在的双链DNA。在讨论具体的双链DNA分子的结构时,可根据仅以沿非转录的DNA链(即,具有与mRNA同源的序列的链)5’至3’方向给出序列的一般惯例(normal convention)在本文中描述序列。“重组DNA分子”是已经过分子生物学操作的DNA分子。
当核酸分子的单链形式可与另一核酸分子在温度和溶液离子强度的适当条件下退火(参见Sambrook等,见上文)时,核酸分子与另一个核酸分子,如cDNA,基因组DNA,或RNA是“可杂合的(hybridizable)”。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严紧性(stringency)”。
为了本发明的目的,杂交显示核苷酸序列与标记的多核苷酸探针(polynucleotide probe)杂交,所述的多核苷酸探针在非常低至非常高严紧性条件下与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交。在这些条件下与多核苷酸探针杂交的分子可使用X光片(X-ray film)或通过本领域已知的任何其它方法来检测。每当在本上下文中使用术语“多核苷酸探针”时,可理解这样的探针包含至少15个核苷酸。
在有趣的实施方案中,多核苷酸探针是SEQ ID NO:1中至少15核苷酸的片段的互补链。在另一个有趣的实施方案中,多核苷酸探针是编码SEQ IDNO:2的多肽的任何核苷酸序列的互补链中至少15核苷酸的片段。在又一个有趣的实施方案中,多核苷酸探针是SEQ ID NO:1的互补链。在又一个有趣的实施方案中,多核苷酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码区的互补链。
对于长度为至少100核苷酸的长探针,非常低至非常高的严紧性条件定义为在42℃在5X SSPE、1.0% SDS、5X登哈特溶液(Denhardt’s solution)、100μg(g)/ml剪切的和变性的鲑精DNA中预杂交和杂交,按照标准的Southern印迹步骤。优选地,至少100个核苷酸的长探针含有不多于1000个核苷酸,对于长度至少100个核苷酸的长探针,所述的载体材料最终用2×SSC,0.1%SDS,在42℃洗涤三次,每次15分钟(非常低严紧性),优选用0.5×SSC,0.1%SDS,在42℃洗涤三次,每次15分钟(低严紧性),更优选用0.2×SSC,0.1%SDS,在42℃洗涤三次,每次15分钟(中严紧性),甚至更优选用0.2×SSC,0.1%SDS,在55℃洗涤三次,每次15分钟(中-高严紧性),最优选用0.1×SSC,0.1%SDS,在60℃洗涤三次,每次15分钟(高严紧性),尤其是用0.1×SSC,0.1%SDS,在68℃洗涤三次,每次15分钟(非常高严紧性)。
虽然不是特别优选的,预期也可以使用较短的探针,例如长度大约15个核苷酸至大约99个核苷酸,如长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的探针。对于这样的短探针,严紧性条件定义为在比用根据Bolton和McCarthy计算(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)得出的Tm低5℃至10℃,在0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl pH 7.6,6mM EDTA,0.5%NP-40,1×登哈特溶液,1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate),1mM磷酸二氢钾(sodium monobasic phosphate),0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中,进行预杂交、杂交和杂交后洗涤,遵循标准的Southern印迹步骤。
对于长度大约15个核苷酸至大约99个核苷酸的短探针,将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟,并用6×SSC在低于计算的Tm5℃至10℃洗涤两次,每次15分钟。
DNA“编码序列”或“开发阅读框(ORF)”是双链DNA序列,当将其置于适当的调控序列的控制下时,其在细胞体外或体内转录并翻译为多肽。编码序列的边界(boundary)通过在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。编码序列可包括,但不限于,原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如,哺乳动物)DNA的基因组DNA序列,和甚至合成的DNA序列。如果预期将编码序列在真核细胞中表达,那么多腺苷酸化信号(polyadenylation signal)和转录终止序列将通常位于编码序列的3’。
表达载体是线状或环状的DNA分子,其包含编码目标多肽的区段,所述目标多肽与提供其转录的附加区段可操作地连接。所述附加区段可包括启动子和终止子序列,和可选的一个或多个复制起点(origin of replication)、一个或多个可选择标记(selectable marker)、增强子(enhancer)、多腺苷酸化信号等等。表达载体通常源自质粒或病毒DNA,或可包含两者的元件(element)。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列,诸如启动子、增强子、终止子等等,其提供编码序列在宿主细胞中的表达。在真核细胞中,多腺苷酸化信号是控制序列。
“分泌信号序列”是编码多肽(“分泌肽(secretory peptide)”)的DNA序列,所述多肽在细胞中合成,作为较大多肽的元件(component)指导该较大多肽通过细胞的分泌途径。通常在穿过所述分泌途径的过程中切割该较大多肽以除去分泌肽。
根据本技术领域公认的意义在本文中使用术语“启动子”,以表示基因的一部分,其含有提供结合RNA聚合酶和启动转录的DNA序列。启动子序列通常,但不总是,存在于基因的5’非-编码区(non-coding region)。
如果基因编码的多肽不再能以功能形式表达,就使染色体基因成为无功能的(non-functional)。所述的基因无功能性可通过多种如本领域已知的遗传操作(genetic manipulation)来诱导,所述遗传操作中的一些在Sambrook等,见上文中描述。基因ORF(开放阅读框)内的部分缺失常常将使基因成为无功能的,如突变一样。
本文中使用术语“染色体基因的可表达拷贝”的意思是染色体基因的ORF的拷贝,其中可表达所述ORF以产生完全功能的基因产物。可表达拷贝可不由染色体基因的天然启动子转录,而可由外源的或异源的启动子转录,或可实际上无启动子(promotorless)并且只通过来自存在于ORF 5’末端上游的基因的转录连读(transcriptional read-through)表达。预期转录连读在此的含义与本领域中普遍公认的含义相同。
“可操作连接”,当涉及DNA区段时,表示安排区段以便于它们发挥与它们预期目标一致的作用,例如在启动子启动转录并继续进行经过编码区段至终止子。
当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时,编码序列“受控于”(under thecontrol)细胞中的转录和翻译控制序列,然后mRNA被trans-RNA剪接(trans-RNA splice)并翻译为由编码序列编码的蛋白。
“异源”DNA指不天然位于细胞或细胞的染色***点中的DNA。优选地,异源DNA包括和所述细胞无关(foreign to)的基因。
如本文中使用的,术语“核酸构建体”旨在表示cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA来源的任何核酸分子。术语″构建体″旨在表示核酸区段,其可为单链或双链,而且其可基于编码目标多肽的全部或部分天然存在的核苷酸序列。所述构建体可选地包含其它核酸区段。
编码本发明多肽的本发明的核酸构建体可合适地来源于基因组或cDNA,例如通过如下方法获得:制备基因组或cDNA文库并按照标准方法(参照Sambrook等,见上文)使用合成的寡核苷酸探针通过杂交来筛选编码全部或部分多肽的DNA序列。
本发明的编码多肽的核酸构建体也可通过已建立的标准方法合成制备,例如由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letters 22(1981),1859-1869描述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法,或由Matthes等,EMBO Journal 3(1984),801-805描述的方法。根据亚磷酰胺方法,例如在自动化DNA合成仪中,合成寡核苷酸,纯化、退火、连接并在合适的载体中克隆。
此外,核酸构建体可属于合成的与基因组混合,合成的与cDNA混合,或基因组与cDNA混合来源,按照标准方法通过连接来源于合成、基因组或cDNA的片段(适当地)制备,所述片段对应于整个核酸构建体的各个部分。核酸构建体也可使用特异性引物通过聚合酶链式反应来制备,例如如在US4,683,202或Saiki等,Science 239(1988),487-491中所描述的。
当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所必需的控制序列时,术语核酸构建体可与术语“表达盒(expression cassette)”同义。
术语“控制序列”在本文中定义为,包括所有对于表达核酸序列的编码序列来说必需的或有利的成分。每个控制序列对于编码所述多肽的核酸序列可为天然的或外源的。上述控制序列包括,但不限于,前导序列(leader)、聚腺苷酸化序列、前肽序列(propeptide sequence)、启动子(promoter)、信号序列(signal sequence)和转录终止子(transcription terminator)。最低限度,所述的控制序列包括启动子和转录和翻译终止信号。所述的控制序列可与接头一起提供,用于引入特异的限制酶切位点(restriction sites)以便于将所述的控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接。
控制序列可为适当的启动子序列,即被表达所述核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。所述启动子序列包含介导多肽的表达的转录和翻译控制序列(transcriptional and translational control sequence)。所述启动子可为任意核酸序列,其在选择的宿主细胞中显示转录活性,并可从编码细胞外或细胞内与所述宿主细胞同源或异源的多肽的基因中获得。
控制序列也可为合适的转录终止序列,即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止序列可操作地与编码所述多肽的核酸序列的3’末端连接。任何在选择的宿主细胞中有功能的终止子可用于本发明。
控制序列也可为聚腺苷酸化序列,即可操作地与所述核酸序列的3’末端连接的序列,而且当它被转录时,它被宿主细胞作为信号识别以将聚腺苷酸残基添加在转录的mRNA上。任何在选择的宿主细胞中有功能的聚腺苷酸化序列可用于本发明。
控制序列也可为信号肽编码区域,其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列,指导表达的多肽进入宿主细胞的细胞分泌途径(cell’s secretorypathway)。所述核酸序列的编码序列的5′末端可天然地包含信号肽编码区,该信号肽编码区天然地在翻译阅读框中与编码分泌的多肽的编码区的区段连接。或者,编码序列的5′末端可包含信号肽编码区,其对于编码分泌的多肽的编码序列的部分是外源的。外源的信号肽编码区可为必需的,其中编码序列一般不含有信号肽编码区。可替换地,所述外源的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区,以获得相对于一般与编码序列相连的天然信号肽编码区增强的胞外蛋白质的分泌。所述信号肽编码区可由以下基因获得:来自曲霉属(Aspergillus)菌种的葡糖淀粉酶(glucoamylase)或淀粉酶基因、来自根毛霉属(Rhizomucor)菌种的脂肪酶(lipase)或蛋白酶(proteinase)基因、来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的alpha-因子的基因、来自芽孢杆菌属菌种的淀粉酶或蛋白酶(protease)基因,或小牛前凝乳酶原(calf preprochymosin)基因。然而,任何指导所表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区可用于本发明。
控制序列也可为前肽编码区(propeptide coding region),其编码位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。得到的多肽被称为前酶(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或有些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的,并可通过将多肽从前多肽上催化的或自催化的(autocatalytic)切割,转化为成熟的活性多肽。所述前多肽编码区可由以下基因获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprE),枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT),酿酒酵母alpha-因子基因、或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(laccase)基因(WO95/33836)。
也可以理想地添加调控序列,其允许相对于所述宿主细胞的生长调控多肽的表达。调控***的实例是那些响应化学的或物理的刺激物(stimulus),包括调控化合物的存在,使所述基因的表达开启或关闭的调控***。原核***中的调控***包括lac,tac和trp操纵子***。在酵母中,可使用ADH2***或GAL1***。其他调控序列的实例是允许基因扩增的那些。在真核***中,这些包括二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)基因,其在甲氨喋呤(methotrexate)存在的条件下被扩增,和金属硫蛋白(metallothionein)基因,其在具有重金属下扩增。在这些情况中,将编码所述多肽的核酸序列与调控序列串联(in tandem)放置。
指导本发明基因,尤其是在细菌宿主细胞中,转录的合适启动子的实例,是从下述基因中得到的启动子:大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶(agarase)基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(alkaline protease)基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)alpha-淀粉酶(alpha-amylase)基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)alpha-淀粉酶基因(amyQ)、解淀粉芽孢杆菌BAN淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶(penicillinase)基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核beta-内酰胺酶(beta-lactamase)基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75:3727-3731),以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。其他的启动子在Scientific American,1980,242:74-94的″Useful proteins fromrecombinant bacteria″中和在Sambrook等,1989,见前文中描述。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码区为从如下基因中得到的信号肽编码区:来自芽孢杆菌NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌alpha-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)基因、解淀粉芽孢杆菌beta-内酰胺酶(beta-lactamase)基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌PrsA基因。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
本发明也涉及重组表达载体,包括本发明的核酸序列、启动子、转录和翻译终止信号。可将上述的多种核酸和控制序列结合在一起以产生重组表达载体,其可包括一个或多个方便的限制酶切位点,以允许在这些位点上***或取代编码所述多肽的核酸序列。可替换地,本发明的核酸序列可以通过将所述核酸序列或包含所述序列的核酸构建体***适于表达的载体中进行表达。在创建所述表达载体的过程中,使所述编码序列位于所述载体中,这样一来,所述的编码序列可操作地与适于表达和可能分泌的控制序列连接。
重组表达载体可为任意载体(例如,质粒或病毒),其可以方便地经过重组DNA方法,并可使所述核酸序列表达。所述载体的选择通常依赖于所述载体与被导入所述载体的宿主细胞的相容性(compatibility)。所述载体可为线状的质粒或闭合的环状质粒。所述载体可为自发复制的(autonomously replicating)载体,即作为染色体外的实体存在的载体,它的复制独立于染色体的复制,例如,质粒、染色体外的元件(element)、极微染色体(minichromosome)或人造染色体(artificial chromosome)。所述载体可包含确保自我复制(self-replication)的任何方法(means)。可替换地,所述载体可为当导入宿主细胞时被整合入基因组,并与被整合入该载体的染色体一起复制的载体。载体***可为单独的载体或质粒或共同含有待导入宿主细胞基因组的总DNA的两种或更多种载体或质粒,或转座子(transposon)。
本发明的载体优选包含一种或多种可选择的标记,其允许容易地选择转化的细胞。可选择的标记为基因,该基因的产物可提供杀虫剂(biocide)或病毒抗性(viral resistance)、抗重金属(resistance to heavy metals)、营养缺陷型的原营养(prototrophy to auxotrophs)等等。
抗生素可选择标记赋予抗如下抗生素的抗生素抗性:氨苄青霉素(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、氯霉素(chloramphenicol)、四环素(tetracycline)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)或甲氨喋呤。酵母宿主细胞的合适的标记为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。
本发明的载体优选含有元件,所述元件允许将所述载体,或所述载体的小部分,稳定整合入宿主细胞的基因组,或在所述细胞中独立于该细胞的基因组自发地复制所述载体。
当把载体,或载体的小部分,如本发明的扩增单元导入宿主细胞时,可将其整合入宿主细胞基因组。对于染色体整合,所述载体可依赖于编码多肽的核酸序列或用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合入基因组的载体的任何其它元件。
可替换地,所述的载体可包含附加的核酸序列,用于指导通过同源重组整合入宿主细胞的基因组。附加的核酸序列使所述载体在染色体的准确位置整合入宿主细胞基因组。为了提高在准确位置进行整合的可能性,所述的整合元件应优选含有足够数量的核酸,如100至1,500个碱基对,优选400至1,500个碱基对,并最优选800至1,500个碱基对,所述的核酸与对应的靶序列高度同源以增强同源重组的可能性。所述的整合元件可为与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外,所述的整合元件可为非-编码的或编码的核酸序列;适于通过同源重组进行位点特异性整合的编码序列的具体实例在WO 02/00907(Novozymes,丹麦)中给出,其在此全部并入作为参考。
在另一方面,所述载体可通过非-同源重组整合入所述宿主细胞的基因组中。这些核酸序列可为任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列,而且,此外,可为非编码或编码序列。载体、表达盒、扩增单位、基因或实际上任何限定的核苷酸序列的拷贝数是在任何时候存在于宿主细胞中的相同拷贝的数目。基因或另一个限定的染色体核苷酸序列可以以一个、两个或更多个拷贝存在于染色体上。自主复制的载体可以以每个宿主细胞一或几百个拷贝存在。
本发明的扩增单位是能整合入宿主细胞染色体的核苷酸序列,由此它可以通过重复增殖(multiplication)来增加整合在染色体上的拷贝数。该单位包含如本文定义的表达盒,其包括目标基因的至少一个拷贝和如本文中定义的,宿主细胞中染色体基因的可表达的拷贝。当把扩增单位整合入宿主细胞的染色体时,将其定义为易于通过DNA的两个直接重复区之间的同源重组复制的染色体的具体区域。由于复制过程依赖于重复区内重组的准确位点,可实际上复制导入染色体的DNA的一部分以及外源染色体本身的一部分,因此扩增单位相对于侧翼DNA的准确边界是功能限定的。此原理在Janniére等(1985,Stable Gene amplification in the chromosome of Bacillus subtilis.Gene,40:47-55),其在此并入作为参考。
对于自主复制,所述载体可进一步包含复制起点(origin of replication),它能够使所述载体在所述的宿主细胞中自发的复制。细菌复制起点的实例为如下质粒的复制起点:pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMbeta1。在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例为2微米(micron)复制起点、CEN6与ARS4的组合和CEN3和ARS1的组合。所述的复制起点可为具有突变的复制起点,所述突变使其在所述宿主细胞中具有温度-敏感性的功能(参见,例如,Ehrlich,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75:1433)。
本发明也涉及包含本发明的核酸序列的重组宿主细胞,其有利地用于所述多肽的重组产生。术语“宿主细胞”包括任何亲代细胞的后代,其由于复制过程中发生的突变而与亲代细胞不相同。
优选用包含本发明的核酸序列的载体转化细胞,然后将载体整合入宿主染色体。“转化”指将包含本发明的核酸序列的载体导入宿主细胞,以便于将载体保持为染色体整合体(chromosomal integrant)或保持为自我复制的染色体外载体。通常将整合看作优势,因为更可能将核酸序列稳定地保持在细胞中。
可通过如上所述的同源和非同源重组将载体整合入宿主染色体。
细菌宿主细胞的转化可,例如,通过原生质体转化(参见,例如,Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115),通过使用感受态细胞(competent cells)(参见,例如,Young和Spizizin,1961,Journal of Bacteriology81:823-829,或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of MolecularBiology 56:209-221),通过电穿孔(electroporation)(参见,例如,Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)或通过接合(conjugation)(参见,例如,Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169:5771-5278)来实现。
将上述转化的和转染的宿主细胞在允许表达所需多肽的条件下在合适的营养培养基中培养,之后从细胞或培养液中回收所得的多肽。
用于培养细胞的培养基可为适于宿主细胞生长的任何常规培养基,如含有适当补充物的基本或复合培养基。合适的培养基可从商业供应者得到,或根据公开的配方(例如,在American Type Culture Collection的目录中)进行制备。使用本领域已知的方法制备培养基(参见,例如,references for bacteria andyeast;Bennett,J.W.和LaSure,L.,editors,More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)。
如果所述多肽分泌到营养培养基中,则可直接从培养基中回收多肽,如果所述多肽不分泌,那么它可以从细胞裂解物(cell lysate)中回收。通过常规方法从培养基中回收多肽,所述常规方法包括通过离心、过滤从培养基中分离宿主细胞,通过盐(例如硫酸铵)从上清液或过滤液中沉淀蛋白质成分,通过各种层析方法(例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等,依赖于所述多肽的类型)进行纯化。
所述多肽可使用本技术领域公知的、对所述多肽具有特异性的方法进行检测。这些检测方法可包括使用特异性抗体、酶产物形成或酶底物消失。例如,酶实验(enzyme assay)可用于测定所述多肽的活性。
本发明的多肽可通过本技术领域公知的各种方法进行纯化,所述方法包括,但不限于层析法(例如,离子交换、亲和、疏水、色谱焦聚(chromatofocusing)和大小排阻)、电泳的方法(例如,制备等电聚焦(preparative isoelectricfocusing))、溶解性差异(例如,硫酸铵沉淀)、或提取(extraction)(参见,例如,Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden,editors,VCH Publishers,NewYork,1989)。
在本上下文中,术语“基本上纯的多肽”指包含至多10重量%的与其天然结合的其它多肽物质的多肽制剂(其它多肽物质的更低百分比是优选的,例如至多8重量%,至多6重量%,至多5重量%,至多4%,至多3重量%,至多2重量%,至多1重量%,和至多1/2重量%)。由此,优选基本上纯的多肽为至少92%纯,即所述多肽占制剂中存在的总多肽物质的至少92重量%,而且更高的百分比是优选的,如至少94%纯,至少95%纯,至少96%纯,至少96%纯,至少97%纯,至少98%纯,至少99%和至多99.5%纯。本文公开的多肽优选基本上纯的形式。具体地,优选本文公开的多肽为“基本上纯的形式”,即多肽制剂基本上无与其天然结合的其它多肽物质。这可以,例如通过借助已知的重组方法制备多肽来实现。本文中,术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”是同义词。
在本上下文中,两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的同源性通过参数“同一性”描述。为了本发明的目的,序列的比对和同源性分数计算可使用用于蛋白质和DNA比对的完全Smith-Waterman比对来完成。默认的评分矩阵BLOSUM50和同一性矩阵分别用于蛋白质和DNA比对。缺口(gap)的第一个残基的罚分对于蛋白质为-12,对于DNA为-16。而缺口中附加残基的罚分对于蛋白质为-2,对于DNA为-4。比对用FASTA程序包版本v20u6进行(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),″Improved Tools for Biological SequenceAnalysis″,PNAS 85:2444-2448,和W.R.Pearson(1990)″Rapid和SensitiveSequence Comparison with FASTP and FASTA″,Methods in Enzymology,183:63-98)。
可使用“ClustalW”(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.(1994)CLUSTAL W:Improving the sensitivity of progressive multiple senquencealignment through senquence weighting,position-specific gap penalties andweight matrix choice,Nucleic Acids Research 22:4673-4680)进行蛋白序列的多重比对。使用蛋白比对作为模板,用来自所述DNA序列的对应的密码子替换所述的氨基酸,可进行DNA序列的多重比对。
在本上下文中,MrgA蛋白的功能同源物是这样的蛋白,当其在细胞中以更高水平表达时,导致胞外酶,如alpha-淀粉酶的分泌与在基本上相同的条件下培养的Mrg功能同源物正常表达的细胞相比增加。此外,当如上所述进行比对时,MrgA蛋白的功能同源物与MrgA蛋白分享至少50%,优选55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%,或最优选99%的氨基酸序列同一性。
在本上下文中,术语“等位变体(allelic variant)”表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或多种可替换的形式。等位变异通过突变自然地出现,并可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是通过基因的等位变体编码的多肽。等位变体包含在本文功能同源物的定义中。
MrgA蛋白或其功能同源物可为从天然来源鉴定并分离的野生型蛋白。这样的野生型蛋白可通过本领域已知的标准方法特异地筛选。此外,可通过如J.E.Ness等Nature Biotechnology 17,893-896(1999)所述的DNA重排技术制备MrgA蛋白或其功能同源物。而且,MrgA蛋白或其功能同源物可为人工变体。所述的人工变体可通过本领域中已知的标准方法,如通过定点/随机突变构建。在本发明的一个实施方案中,氨基酸改变(在人工变体以及在野生型多肽中)属于较少天然的(minor nature),其为不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守的氨基酸取代;通常为1至大约30个氨基酸的小缺失;小氨基或羧基延伸,如氨基末端甲硫氨酸残基;多至大约20-25个残基的小接头肽(small linkerpeptide);或通过改变静电荷或其它功能,如聚-组氨酸区(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合区域(binding domain)来促进纯化的小延伸。
保守取代的实例在碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸),酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸),极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸),芳香氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸),和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)之内。通常不改变特异性活性(specific activity)的氨基酸取代是本技术领域内所公知的,并例如由H.Neurath和R.L. Hill,1979在The Proteins,Academic Press,NewYOrk中描述。最通常出现的变化是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及将它们反过来。
对于本领域的那些技术人员来说显而易见的是上述修饰可在对于分子功能关键的区域之外进行并仍得到活性多肽。因此,对于由本发明的核苷酸序列编码的多肽的活性来说必需的氨基酸残基优选不进行修饰,如取代,并可根据本领域已知的方法进行鉴定,如定点突变(site-directed mutagenesis)或丙氨酸-扫描突变(alanine-scanning mutagenesis)(参见,例如,Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)。在后一种技术中,在分子中的每个带正电荷的残基引入突变,并测定得到的突变分子的活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过三维结构分析测定,如通过核磁共振分析(nuclear magnetic resonance analysis)、结晶学(crystallography)或光亲和标记(photoaffinity labeling)这样的方法进行测定。(参见,例如,de Vos等,1992,Science 255:306-312;Smith等,1992,Journal ofMolecular Biology 224:899-904;Wlodaver等,1992,FEBS Letters 309:59-64)。
而且,可通过引入核苷酸取代来修饰编码本发明的多肽的核苷酸序列,所述核苷酸取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另一种氨基酸序列,但其符合用于产生酶的宿主生物体密码子应用(codon usage)。
将突变引入核苷酸序列以用一个核苷酸交换另一个核苷酸可通过定点突变使用本领域公知的任何方法实现。特别有用的是这样的方法,其应用具有***目标的超螺旋的双链DNA载体和含有所需突变的两个合成引物。所述寡核苷酸引物,每个与载体的相对链(opposite strand)互补,在温度循环过程中通过Pfu DNA聚合酶延伸。在掺入引物过程中,产生了含有交错的缺口(staggered nick)的突变质粒。在温度循环之后,用对于甲基化和半甲基化的DNA特异性的DpnI处理产物,以消化亲代DNA模板并选择含有突变的合成DNA。也可以使用本领域已知的其它方法。关于核苷酸取代的一般描述参见,例如,Ford等,1991,Protein Expression and Purification 2:95-107。
发明详述
本发明的第一个方面涉及源自亲代细胞的后代细胞,其中
a)所述后代细胞包含至少一个基因,该基因编码MrgA蛋白或其功能同源物和/或与所述编码基因可操作连接的DNA区段(segment),其中所述基因和/或DNA区段相对于亲代细胞***作;
b)所述后代细胞包含编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的两个或更多个拷贝;或
c)所述后代细胞相对于亲代细胞被突变;
由此所述后代细胞产生比亲代细胞更大量的MrgA蛋白或其功能同源物。
本发明的细胞产生比亲代细胞更大量的MrgA蛋白或其功能同源物。应通过在基本上相同的条件下培养本发明的细胞以及亲代细胞,并通过本领域的任何标准方法比较MrgA蛋白量来进行比较。优选本发明的细胞产生比亲代多至少5%的MrgA,更优选至少10%,还更优选至少20%,并最优选比亲代多至少50%的MrgA蛋白或其功能同源物。所述过量生产(overproduction)可通过本领域的标准方法来实现,例如,使用宿主染色体中的多拷贝(multicopy)质粒,编码MrgA或其功能同源物的基因的多个拷贝,和/或目标蛋白,与改变调控元件相结合以增加表达,例如,使用强启动子,使用多个启动子(multiple promoter),使用增强子等等。
如本发明者在本文中所显示的,当第一个方面的细胞和对应的亲代细胞两者在基本上相同的条件下培养时,第一个方面的细胞能够产生比对应的亲代细胞更大量的目标蛋白。
因此,本发明的优选实施方案涉及第一个方面的细胞,其产生比亲代细胞更大量的目标蛋白。优选目标蛋白是胞内蛋白质(intracellular protein)或胞外蛋白质(exoprotein)。优选本发明的细胞比亲代细胞分泌更大量的目标胞外蛋白质。优选本发明的细胞比亲代多分泌至少5%的胞外蛋白质,更优选至少多10%,还更优选多至少20%,并最优选比亲代多至少50%的胞外蛋白质。从每个细胞产生的或分泌的目标蛋白量可通过本领域中任何合适的方法测定;下面显示带有测定胞外蛋白质alpha-淀粉酶的分泌量的非限制性实施例。
宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。所述宿主细胞可为单细胞微生物,例如原核生物,或非单细胞的微生物,例如真核生物。有用的单细胞的细胞是细菌细胞,如***,包括但不限于,芽孢杆菌细胞,例如,嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis);或链霉菌(Streptomyces)细胞,例如,浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus);或革兰氏阴性细菌,如大肠杆菌和假单胞菌。在优选实施方案中,细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个优选实施方案中,细菌宿主细胞是原核细胞,优选革兰氏阳性原核细胞,而且更优选的细菌革兰氏阳性细胞是芽孢杆菌属的菌种,其优选自嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
优选实施方案涉及本发明的细胞,其为细菌细胞,优选原核细胞,更优选革兰氏阳性细胞,并最优选芽孢杆菌属;还更优选其为选自如下的菌种:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
对于宿主细胞来说,目标蛋白可为内源性或外源性的,其可为同源蛋白质或异源蛋白质。
优选实施方案涉及细胞,其中所述目标蛋白是蛋白酶(protease)、脂肪酶(lipase)、角质酶(cutinase)、淀粉酶(amylase)、半乳糖苷酶(galactosidase)、支链淀粉酶(pullulanase)、纤维素酶、葡糖异构酶(glucose isomerase)、蛋白二硫化物异构酶(protein disulphide isomerase)、CGT′ase(环糊精葡萄糖酸转移酶(cyclodextrin gluconotransferase))、肌醇六磷酸酶(phytase)、葡糖氧化酶(glucoseoxidase)、葡糖基转移酶(glucosyl transferase)、乳糖酶(lactase)、胆红素氧化酶(bilirubin oxidase)、木聚糖酶(xylanase)、抗原微生物(antigenic microbial)或原生动物蛋白质(protozoan protein)、细菌蛋白毒素、微生物表面、或病毒蛋白质。
将MrgA蛋白的进化同源物,等位变体,人工变体,重排的变体,菌种变体等等,全部称为“功能同源物”或本说明中的the MrgA蛋白,而且本发明人预见所述的功能同源物蛋白将在本发明的细胞中将是同样有效的。
具体地,优选实施方案涉及细胞,其中MrgA蛋白或其功能同源物包含氨基酸序列,其与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少70%同一性,优选与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%或甚至99%同一性。
另一个优选实施方案涉及本发明的细胞,其中MrgA蛋白或其功能同源物包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列组成。
又一个优选实施方案涉及本发明的细胞,其包含编码MrgA蛋白或其功能同源物的多核苷酸的至少一个外源拷贝,所述MrgA蛋白或其功能同源物包含氨基酸序列,该序列与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少70%同一性,优选与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%或甚至99%同一性。
在优选实施方案中,本发明的细胞包含编码MrgA蛋白或其功能同源物的多核苷酸的至少一个外源拷贝,所述MrgA蛋白或其功能同源物包含SEQID NO:2中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列组成。
优选的细胞包含多核苷酸的至少一个外源拷贝,所述多核苷酸:
a)包含多核苷酸序列,该序列与SEQ ID NO:1中所示的序列是至少70%相同的;优选与SEQ ID NO:1中所示的序列是至少75%、80%、85%、90%、95%、97%或甚至99%相同的;或
b)在中严紧性条件下,优选在中-高严紧性条件下,并更优选在高严紧性条件下,与SEQ ID NO:1中所示的序列杂交。
如上所述,和本文中的举例说明,一个优选实施方案涉及细胞,其中编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的至少一个外源拷贝由一个或多个异源和/或人工启动子转录。
在优选的细胞中,编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的至少一个外源拷贝被整合入细胞的基因组;或存在于染色体外的构建体,优选质粒。
本发明的另一个方面涉及增强目标蛋白生产的方法,该方法包括在第一个方面的细胞中表达所述蛋白。
本发明的又一个方面涉及产生如第一个方面中定义的细胞的方法,用于产生目标蛋白,所述方法包括操作细胞以增加MrgA蛋白或其功能同源物表达的步骤。
在本发明的产生方法中,使用本领域已知的方法在适于产生多肽的营养培养基中培养细胞。例如,所述细胞可通过摇瓶培养、小-规模或大-规模发酵(包括连续的、批式的、补料分批的或固态的发酵),在实验室或工业发酵罐中,在合适的培养基中和允许所述多肽表达和/或分离的条件下进行培养。所述的培养使用本技术领域公知的方法,在合适的包含碳源和氮源和无机盐的营养培养基中发生。合适的培养基可从商业供应者得到,或可根据发表的组合物(例如,在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果所述多肽分泌到营养培养基中,那么可直接从培养基中回收多肽,如果所述多肽不分泌,那么它可以从细胞裂解物(cell lysate)中回收。
可使用本技术领域公知的、对所述多肽具有特异性的方法进行检测多肽。这些检测方法可包括应用特异性抗体、酶产物形成或酶底物消失。例如,蛋白酶分析可用于测定所述多肽的活性,如本文所述。
可通过本技术领域公知的各种方法纯化多肽,所述方法包括,但不限于色谱法(例如,离子交换、亲和、疏水、色谱焦聚和大小排阻)、电泳的方法(例如,制备等电聚焦(preparative isoelectric focusing))、溶解性差异(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、离心、过滤、提取、喷雾-干燥、蒸发、沉淀或提取(参见,例如,Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden,editors,VCHPublishers,New York,1989)。
在第三方面的方法的优选实施方案中,经过操作的细胞比未操作的亲代细胞产生更大量的目标蛋白。优选目标蛋白是胞内蛋白质或胞外蛋白质。
另一个优选实施方案涉及第三方面的方法,其中所述方法包含如下步骤:
a)从亲代细胞中鉴定编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因;和
b)操作所述细胞以增加在步骤(a)中鉴定的基因的表达,由此操作的后代细胞比未操作的细胞表达更大量的MrgA蛋白或其功能同源物。
实施例
材料和方法
菌株
枯草芽孢杆菌168:F.Kunst等″The complete genome sequence of theGram-positive bacterium Bacillus subtilis″.Nature(1997)390:249-256.
枯草芽孢杆菌AN53:具有整合入amyE基因座的质粒pKTH10和P920mrgA的枯草芽孢杆菌168(本发明)。
枯草芽孢杆菌AN36:具有整合入amyE基因座的质粒P920mrgA的枯草芽孢杆菌168(本发明)。
枯草芽孢杆菌AN42:具有整合入amyE基因座的质粒p740mrgA的枯草芽孢杆菌168(本发明)。
枯草芽孢杆菌AN50:具有整合入amyE基因座的质粒p726mrgA的枯草芽孢杆菌168(本发明)。
枯草芽孢杆菌AN55:具有整合入amyE基因座的质粒pKTH10和P740mrgA的枯草芽孢杆菌168(本发明)。
枯草芽孢杆菌AN57:具有整合入amyE基因座的质粒pKTH10和P726mrgA的枯草芽孢杆菌168(本发明)。
枯草芽孢杆菌AN83:具有质粒pKTH10的枯草芽孢杆菌168(本发明)。
枯草芽孢杆菌AN214:枯草芽孢杆菌168(pel::PconsBAN)
枯草芽孢杆菌AN217:枯草芽孢杆菌168(pel::PconsBAN;amyE::P726mrgA)
枯草芽孢杆菌AN218:枯草芽孢杆菌168(pel::PconsBAN;amyE::P740mrgA)
枯草芽孢杆菌AN219:枯草芽孢杆菌168(pel::PconsBAN;amyE::P920mrgA)
如Yasbin,R.E.,Wilson,G.A.和Young,F.E.(1975)Transformation andtransfection in lysogenic strain of Bacillus subtilis:evidence for selective inductionofprophage in competent cells.J.Bacteriol,121:296-304所述,制备并转化感受态细胞。
质粒
pKTH10:Vehmaanpera J,Steinborn G, Hofemeister J.:”Geneticmanipulation of Bacillus amyloliquefaciens.”J Biotechnol.1991.19(2-3):221-40。此质粒组成型表达解淀粉芽孢杆菌alpha-淀粉酶(AmyQ)。
pDG268neo:此质粒是pDG268衍生物,其不能在枯草芽孢杆菌中复制(Antoniewski,C.,Savelli,B.,和Stragier,P.,1990,J.Bact 172)。该质粒含有紧接于sfiI和BamHI限制酶识别序列的氯霉素(cam)抗性标记,其侧翼与枯草芽孢杆菌的amyE基因座的“5’”和“’3”部分相连。此质粒用于将MrgA表达盒和cam标记通过双同源重组交换导入枯草芽孢杆菌的amyE基因座。pDG268neo的序列在SEQ ID NO:3中显示。
pAN213:此质粒是pDG268衍生物(Antoniewski,C.,Savelli,B.,和Stragier,P.,1990,J.Bact 172),其不能在枯草芽孢杆菌中复制。该质粒含有紧接于sacII和StyI限制酶识别序列的红霉素抗性标记。所有此序列的侧翼与枯草芽孢杆菌168的果胶酸裂合酶(pectate lyase)(pel)基因座的“5’”和“’3”部分相连。
pAN213ban:使用引物AN162和AN163c通过PCR从枯草芽孢杆菌的染色体扩增amyQ基因。上游引物(AN162)编码合成的启动子PconsBAN。用限制酶sacII和MluI切割PCR产物并连接入pAN213的大SacII-MluI片段,得到质粒pAN213ban。此质粒用于将AmyQ表达盒和erm标记通过双交换事件(double cross-over event)引入枯草芽孢杆菌168的pel基因座。pAN213ban的序列在SEQ ID NO:16中显示。
p920mrgA:使用引物p920mrgaF2(SEQ ID NO:4)和MBmrgaR2(SEQID NO:5)通过PCR从枯草芽孢杆菌的染色体扩增mrgA基因。上游引物(p920mrgaF2;SEQ ID NO:4)包括合成的组成型启动子P920(SEQ ID NO:6)。用限制酶SfiI和BamHI切割SEQ ID NO:7所示的PCR产物并连接入pDG268neo的大SfiI-BamHI片段,得到质粒p920mrgA。
p740mrgA:使用引物p740mrgaF2(SEQ ID NO:8)和MBmrgaR2(SEQID NO:5)通过PCR从枯草芽孢杆菌的染色体扩增mrgA基因。上游引物(p740mrgaF2;SEQ ID NO:8)包括合成的组成型启动子P740(SEQ ID NO:9)。用限制酶SfiI和BamHI切割SEQ ID NO:10所示的PCR产物并连接入pDG268neo的大SfiI-BamHI片段,得到质粒p740mrgA。
p726mrgA:使用引物p726mrgaF2(SEQ ID NO:11)和MBmrgaR2(SEQID NO:5)通过PCR从枯草芽孢杆菌的染色体扩增mrgA基因。上游引物(p726mrgaF2;SEQ ID NO:11)包括合成的组成型启动子P726(SEQ ID NO:12)。用限制酶SfiI和BamHI切割SEQ ID NO:13所示的PCR产物并连接入pDG268neo的大SfiI-BamHI片段,得到质粒p726mrgA。
引物:
P920mrgaF(SEQ ID NO:4):ctgaggccaattaggccaagtttattcttgacattagggaacatgcatgatat
aataggtaaagtaaacagatcacaaggaggacgttatc
P740mrgaF(SEQ ID NO:8):ctgaggccaattaggcccggaagtttgttgacacagctccaggatacaaat
ataatgggtcgactaaacagatcacaaggaggacgttatc
P726mrgaF(SEQ ID NO:11):ctgaggccaattaggccgaggtgagatttgacactagtaggctacgggac
tataatgcgggaagtaaacagatcacaaggaggacgttatc
MBmrgaR2(SEQ ID NO:5):tgaaggatccacgcgtccagcagacagaaagcag
AN162(SEQ ID NO:14):
agactgtccgcggtgtaaaaaataggaataaaggggggttgacattattttactgatatgtataatataatttgtataagaaaatgag
AN163c(SEQ ID NO:15):gcatacacgcgttgtcacacctgatgccgacc
一般分子生物学方法
除非另外提及,使用分子生物学的标准方法进行DNA操作和转化(Sambrook等(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,Cold SpringHarbor lab.,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel,F.M.等(eds.)″Current protocolsin Molecular Biology″.John Wiley和Sons,1995;Harwood,C.R.,和Cutting,S.M.(eds.)″Molecular Biological Methods for Bacillus″.John Wiley和Sons,1990)。
用于DNA操作的酶根据供应商的说明书使用(例如限制性内切酶、连接酶等可由New England Biolabs,Inc.得到)。
培养基
LB琼脂(如Ausubel,F.M.等(eds.)″Current protocols in MolecularBiology″.John Wiley和Sons,1995所述)。
LBP是补加0.05M磷酸钾,pH 7.0的LB琼脂。
LBPG是补加0.5%葡萄糖和0.05M磷酸钾,pH 7.0的LB琼脂。
LBPSK是补加0.05M磷酸钾,pH 7.0和1%脱脂乳(skimmed milk)的LB琼脂。
BPX培养基在EP 0 506 780(WO 91/09129)中描述。
发酵
评价淀粉酶收率的发酵在具有100ml BPX的摇瓶中在37℃、300rpm进行7天。收获10ml的培养体积并在10,000g离心以去除细胞和碎片。将澄清的上清液用于测定alpha-淀粉酶活性。
alpha-淀粉酶活性实验
通过采用酶比色测试(enzymatic colorimetric test)的方法以4,6-亚乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-alpha,D-麦芽七糖苷(4,6-ethylidene(G7)-p-nitrophenyl(G1)-alpha,D-maltoheptaoside)(ethylidene-G7PNP)为底物测定alpha-淀粉酶活性(Boehringer Mannheim,Germany art.1442309)。在具体设定的条件(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下,1mg给定的α-淀粉酶将水解一定量的底物并将产生黄颜色。在405nm测定颜色强度,测定的吸光度与在给定的条件组下所述的alpha-淀粉酶的活性直接成正比。
实施例1
使用引物p920mrgaF2(SEQ ID NO:4)和MBmrgaR2(SEQ ID NO:5)通过PCR从枯草芽孢杆菌的染色体扩增mrgA基因。上游引物(p920mrgaF2)包括组成型合成的启动子P920(SEQ ID NO:6)。用限制酶SfiI和BamHI切割PCR产物(SEQ ID NO:7)并连接入pDG268neo的大SfiI-BamHI片段,得到质粒p920mrgA。将材料和方法部分所述的p920mrgA的连接混合物通过转化导入枯草芽孢杆菌168菌株,并将转化体铺在补加6microg/ml氯霉素的LBPSK培养基平板上以选择整合体(integrants)。在这些平板上生长的转化体已通过单交换事件(Cam+kan+)或双交换事件(cam+kan-)在amy基因座整合了质粒。将转化体在具有和不具有20microg/ml卡那霉素的LBPSK/cam培养基上重新划线。已发生双交换事件的菌株是cam+kan-。这些菌株不再显示标志性的(tell-tale)清亮区(clearing zone);这表示在amy基因中的整合和amy基因的破坏已经发生。整合的位点通过PCR验证,mrgA的整合的拷贝通过序列分析验证,并且将该菌株命名为AN36。用组成型表达解淀粉芽孢杆菌的alpha-淀粉酶AmyQ的质粒pKTH10转化AN36。得到的菌株命名为AN53。来自AN53的淀粉酶的收率从三个独立的分离物三次重复测定,并与来自对照菌株AN83的淀粉酶的收率进行比较。结果在表1中显示;从合成启动子组成型表达mrgA的AN53菌株具有增加的alpha-淀粉酶收率,其平均比对照菌株AN83高13%,所述对照菌株AN83只包含mrgA基因的野生型拷贝。
表1.来自AN53的淀粉酶的产率从三个独立的分离物三次重复测定,并与来自对照菌株AN83的淀粉酶的收率进行比较。也显示了每个菌株的平均收率。Nd:未测定。
菌株 | 淀粉酶活性(相对的) | 平均 | 平均(以%表示) |
AN53-1.1 | 15.7 | 13.5 | 113% |
AN53-1.2 | 15.8 | ||
AN53-1.3 | 14.9 | ||
AN53-2.1 | 12.5 | ||
AN53-2.2 | 8.65 | ||
AN53-2.3 | Nd | ||
AN53-3.1 | Nd | ||
AN53-3.2 | Nd | ||
AN53-3.3 | Nd | ||
AN83-1.1 | 10.6 | 11.9 | 100% |
AN83-1.2 | 15.7 | ||
AN83-1.3 | 13.8 | ||
AN83-2.1 | 8.7 | ||
AN83-2.2 | 7.72 | ||
AN83-2.3 | 10.1 | ||
AN83-3.1 | 14.1 | ||
AN83-3.2 | Nd | ||
AN83-3.3 | 14.6 |
实施例2
使用引物p740mrgaF2(SEQ ID NO:8)和MBmrgaR2(SEQ ID NO:5)通过PCR从枯草芽孢杆菌的染色体扩增mrgA基因。上游引物(p740mrgaF2)包括组成型合成的启动子P740(SEQ ID NO:9)。用限制酶SfiI和BamHI切割PCR产物(SEQ ID NO:10)并连接入pDG268neo的大SfiI-BamHI片段,得到质粒p740mrgA。将材料和方法部分所述的p740mrgA的连接混合物通过转化导入枯草芽孢杆菌168菌株,并将转化体铺在补加6microg/ml氯霉素(cam)的LBPSK培养基平板上以选择整合体。在这些平板上生长的转化体已通过单交换事件(Cam+kan+)或双交换事件(cam+kan-)在amy基因座整合了质粒。将转化体在具有和不具有20microg/ml卡那霉素的LBPSK/cam培养基上重新划线。已发生双交换事件的菌株是cam+kan-。这些菌株不再显示标志性的清亮区;这表示在amy基因中的整合和amy基因的破坏已经发生。整合的位点通过PCR验证,mrgA的整合的拷贝通过序列分析验证,并且将该菌株命名为AN42。用组成型表达解淀粉芽孢杆菌的alpha-淀粉酶AmyQ的质粒pKTH10转化AN42。得到的菌株命名为AN55。来自AN55的淀粉酶的收率从三个独立的分离物三次重复测定,并与来自对照菌株AN83的淀粉酶的收率进行比较。结果在表2中显示;从合成启动子组成型表达mrgA的AN55菌株具有增加的alpha-淀粉酶收率,其平均比对照菌株AN83高21%,所述对照菌株AN83只包含mrgA基因的野生型拷贝。
表2.来自AN55的淀粉酶的产率从三个独立的分离物三次重复测定,并与来自对照菌株AN83的淀粉酶的收率进行比较。也显示了每个菌株的平均收率。Nd:未测定。
菌株 | 淀粉酶活性(相对的) | 平均 | 平均(以%表示) |
AN55-1.1 | 11.5 | 14.4 | 121% |
AN55-1.2 | 10.8 | ||
AN55-1.3 | 13.3 | ||
AN55-2.1 | 17.4 | ||
AN55-2.2 | 17.3 | ||
AN55-2.3 | 15.6 | ||
AN55-3.1 | 11.2 | ||
AN55-3.2 | 14.8 | ||
AN55-3.3 | 18.1 | ||
AN83-1.1 | 10.6 | 11.9 | 100% |
AN83-1.2 | 15.7 | ||
AN83-1.3 | 13.8 | ||
AN83-2.1 | 8.7 | ||
AN83-2.2 | 7.72 | ||
AN83-2.3 | 10.1 | ||
AN83-3.1 | 14.1 | ||
AN83-3.2 | Nd | ||
AN83-3.3 | 14.6 |
实施例3
使用引物p726mrgaF2(SEQ ID NO:11)和MBmrgaR2(SEQ ID NO:5)通过PCR从枯草芽孢杆菌的染色体扩增mrgA基因。上游引物(p726mrgaF2)包括组成型合成的启动子P726(SEQ ID NO:12)。用限制酶SfiI和BamHI切割PCR产物(SEQ ID NO:13)并连接入pDG268neo的大SfiI-BamHI片段,得到质粒p726mrgA。将材料和方法部分所述的p726mrgA的连接混合物通过转化导入枯草芽孢杆菌168菌株,并将转化体铺在补加6microg/ml氯霉素的LBPSK培养基平板上以选择整合体。在这些平板上生长的转化体已通过单交换事件(Cam+kan+)或双交换事件(cam+kan-)在amy基因座整合了质粒。将转化体在具有和不具有20microg/ml卡那霉素的LBPSK/cam培养基上重新划线。已发生双交换事件的菌株是cam+kan-。这些菌株不再显示标志性的清亮区;这表示在amy基因中的整合和amy基因的破坏已经发生。整合的位点通过PCR验证,mrgA的整合的拷贝通过序列分析验证,并且将该菌株命名为AN50。用组成型表达解淀粉芽孢杆菌的alpha-淀粉酶AmyQ的质粒pKTH10转化AN50。得到的菌株命名为AN57。来自AN57的淀粉酶的收率从三个独立的分离物三次重复测定,并与来自对照菌株AN83的淀粉酶的收率进行比较。结果在表3中显示;从合成启动子组成型表达mrgA的AN57(AN55)菌株具有增加的alpha-淀粉酶收率,其平均比对照菌株AN83高40%,所述对照菌株AN83只包含mrgA基因的野生型拷贝。
表3.来自AN57的淀粉酶的产率从三个独立的分离物三次重复测定,并与来自对照菌株AN83的淀粉酶的收率进行比较。也显示了每个菌株的平均收率。Nd:未测定。
菌株 | 淀粉酶活性(相对的) | 平均 | 平均(以%表示) |
AN57-1.1 | 15.5 | 16.6 | 140% |
AN57-1.2 | 10.6 | ||
AN57-1.3 | 17.3 | ||
AN57-2.1 | 17.4 | ||
AN57-2.2 | 20.7 | ||
AN57-2.3 | 13.9 | ||
AN57-3.1 | 15.1 | ||
AN57-3.2 | 17 |
AN57-3.3 | 22 | ||
AN83-1.1 | 10.6 | 11.9 | 100% |
AN83-1.2 | 15.7 | ||
AN83-1.3 | 13.8 | ||
AN83-2.1 | 8.7 | ||
AN83-2.2 | 7.72 | ||
AN83-2.3 | 10.1 | ||
AN83-3.1 | 14.1 | ||
AN83-3.2 | Nd | ||
AN83-3.3 | 14.6 |
实施例4
将在材料和方法部分描述的pAN213ban通过转化导入枯草芽孢杆菌168菌株,并将转化体铺在补加5microg/ml红霉素的LBPGS培养基平板上以选择整合体。在这些平板上生长的转化体已通过单交换事件(erm+kan+)或双交换事件(erm+kan-)在pel基因座整合了质粒。将转化体在具有和不具有20microg/ml卡那霉素的LBPGS/erm培养基上重新划线。已发生双交换事件的菌株是erm+kan-。这些菌株显示大于野生型的清亮区,作为PconsBAN-amyQ整合和表达的指示。整合的位点通过PCR验证。将得到的菌株命名为AN214。用来自AN214的染色体DNA转化AN50,并将具有基因型(pel::PconsBAN,erm;amyE::P726mrgA,cam)的转化体在平板上划线。通过PCR验证得到的菌株并命名为AN217。来自AN217的淀粉酶的收率从四个独立的分离物两次重复测定,并与来自对照菌株AN214的淀粉酶的收率进行比较(表4)。
表4.来自AN217的淀粉酶的产率从四个独立的分离物两次重复测定,并与来自对照菌株AN214的淀粉酶的收率进行比较。
菌株 | 淀粉酶活性(相对的) | 平均 | |
AN214-1.1 | 10.5 | 14.0 | 100% |
AN214-1.2 | 10.9 | ||
AN214-2.1 | 14.5 | ||
AN214-2.2 | 13.6 | ||
AN214-3.1 | 14.6 |
AN214-3.2 | 16.1 | ||
AN214-4.1 | 14.1 | ||
AN214-4.2 | 17.9 | ||
AN217-1.1 | 17.1 | 16.7 | 119% |
AN217-1.2 | 16.5 | ||
AN217-2.1 | 14.9 | ||
AN217-2.2 | 14.6 | ||
AN217-3.1 | 19.1 | ||
AN217-3.2 | 18.1 | ||
AN217-4.1 | 16.2 | ||
AN217-4.2 | 17.2 |
实施例5
用来自AN214的染色体DNA转化AN36,并将具有基因型(pel::PconsBAN,erm;amyE::P920mrgA,cam)的转化体在平板上划线。通过PCR验证得到的菌株并命名为AN219。用来自AN214的染色体DNA转化AN42,并将具有基因型(pel::PconsBAN,erm;amyE::P740mrgA,cam)的转化体在平板上划线(score)。通过PCR验证得到的菌株并命名为AN218。来自AN214、AN218和AN219的淀粉酶的收率从每个菌株的四个独立分离物两次重复测定(表5)。
表5.来自AN214、AN218和AN219的淀粉酶相对平均收率,从每个菌株的四个独立的分离物两次重复测定。
菌株 | 淀粉酶活性 |
AN214 | 100 |
AN218 | 107 |
AN219 | 106 |
序列表
<110>诺维信公司
<120>具有由MrgA蛋白或同源物介导的改进分泌的细胞
<130>10527.204-WO
<160>16
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>815
<212>DNA
<213>枯草杆菌(Bacillus subtilis)168
<220>
<221>misc_feature
<222>(201)..(659)
<223>MrgA编码序列
<400>1
aagaatttgc gatacccgat cggaaagggc atcaagctca ccctgctgtt ccgatcgctt 60
tttccttggt ctgcgtggga gtctatcctg aagaaaaagc tattcagctg atctaaatta 120
taattattat aatttagtat tgatttttat ttagtatatg atataattaa gtcaacagat 180
cacaaggagg acgttatctt atgaaaactg aaaacgcaaa aacaaatcaa acattagttg 240
agaattcact gaacacacaa ttatcaaact ggtttctttt atactctaag ctccaccgtt 300
tccattggta tgtgaaaggg cctcatttct ttacattgca cgagaaattt gaagaacttt 360
atgaccatgc ggctgaaaca gtggatacca tcgctgagcg cctgctggcg attggcggac 420
agcctgttgc cacagtgaaa gaatacactg agcatgcatc tatcacagac ggcggaaacg 480
aaacatcagc atcagaaatg gtacaagcat tggtaaacga ctacaaacaa atcagcagcg 540
aatctaaatt cgtgatcggc ctggctgaag aaaatcaaga caatgcgaca gcggacttgt 600
ttgtcggatt aattgaagaa gttgaaaaac aagtgtggat gctttcctct tatttagggt 660
aacaaaaaag ctgaacctta atcgggttca gctttttgtt ttttcttagc ttgaactgct 720
ttctgtctgc ttggtcagtg ttgcgttcaa cgttttcgtt tttccctttc gcagcacttg 780
gattgttgtt ttatctccga cttttaagtc tttgt 815
<210>2
<211>153
<212>PRT
<213>枯草杆菌(Bacillus subtilis)168
<220>
<221>肽
<222>(1)..(153)
<223>MrgA蛋白
<400>2
Met Lys Thr Glu Asn Ala Lys Thr Asn Gln Thr Leu Val Glu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Asn Thr Gln Leu Ser Asn Trp Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu His
20 25 30
Arg Phe His Trp Tyr Val Lys Gly Pro His Phe Phe Thr Leu His Glu
35 40 45
Lys Phe Glu Glu Leu Tyr Asp His Ala Ala Glu Thr Val Asp Thr Ile
50 55 60
Ala Glu Arg Leu Leu Ala Ile Gly Gly Gln Pro Val Ala Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Thr Glu His Ala Ser Ile Thr Asp Gly Gly Asn Glu Thr Ser
85 90 95
Ala Ser Glu Met Val Gln Ala Leu Val Asn Asp Tyr Lys Gln Ile Ser
100 105 110
Ser Glu Ser Lys Phe Val Ile Gly Leu Ala Glu Glu Asn Gln Asp Asn
115 120 125
Ala Thr Ala Asp Leu Phe Val Gly Leu Ile Glu Glu Val Glu Lys Gln
130 135 140
Val Trp Met Leu Ser Ser Tyr Leu Gly
145 150
<210>3
<211>8644
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pDG268neo
<400>3
aacaaaattc tccagtcttc acatcggttt gaaaggagga agcggaagaa tgaagtaaga 60
gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat aaggagtgtc aagaatgttt 120
gcaaaacgat tcaaaacctc tttactgccg ttattcgctg gatttttatt gctgtttcat 180
ttggttctgg caggaccggc ggctgcgagt gctgaaacgg cgaacaaatc gaatgagctt 240
acagcaccgt cgatcaaaag cggaaccatt cttcatgcat ggaattggtc gttcaatacg 300
ttaaaacaca atatgaagga tattcatgat gcaggatata cagccattca gacatctccg 360
attaaccaag taaaggaagg gaatcaagga gataaaagca tgtcgaactg gtactggctg 420
tatcagccga catcgtatca aattggcaac cgttacttag gtactgaaca agaatttaaa 480
gaaatgtgtg cagccgctga agaatatggc ataaaggtca ttgttgacgc gcggccgcgg 540
atccatacac aaaaaaacgc tgtgcccttt aaccgcacag cgttttttta ttgattaacg 600
cgttgccgct tctgcgttaa caagtccgct tccatacaag ttcgtgcttc ctaaactagt 660
tgccgtattc tttagatgat ttcgaatttg tacattagac caagatgggt tcttttgttt 720
aacaagggcg gccgcacctg caacatgagg agtagccatc gatgtaccgt ttaagctggc 780
atatgttgaa cctgggtatg tgctctgcac gtttaccccg ggtgcgacaa tgtcaaggcc 840
tgcgccatac tgtgaaaagc tagcgcggtt gttgttttga tcagtagctc cgactgccat 900
tgcgttcgca tagcgcgccg gatagctgat tgagcctgca cctgaattcc cagatgccgc 960
tacaacaaga acgcctctag aagtcgcgct attaacagct tgctcgagtg tggcacttgg 1020
cgaagggctt cctaaactca aattagcaac gtgcatgcca ttgttccctg cccattccaa 1080
tccttgggca atcgagctga ccgaacctga accgctcgcc cctaggactt taacagcgta 1140
tagctcagcg ctcggcgcta cgccaagaac gccaatcgaa ttgtttaaag cagcgatcgt 1200
cccggccaca tgcgtgccat gcccattccc atcttgagtc gacggttccc ctggtacaaa 1260
gcttgcgcca ccacgaatat ttagatctgg atgagtggat atccctgtat cgaggacagc 1320
aacttttaca ccagaacctg tcaatccacg gttatgggca gctggggctt gcacacggct 1380
aattccccat ggtaccgatt gcgccattgt cgttacttct gcatcctctt caatataaga 1440
aatcgctgga tcgagttcaa gcgcgtccac atcttctggg cttaactcaa cggataaaac 1500
aggaatcgtt tcaaattcat gaagcaattc aatttcgact tcctcttcct cagagagaat 1560
ggcgacctcg tcatttgcct ctacttgttc tacaaactca ctgacagctt cctgctcatt 1620
aaagccaatt aaatattttt cttttgcttc ttcagcagcc gatgcgatcg atgaactaaa 1680
agcaacagaa atgagtagtg cggtgcttgc gacaattttc cccaacggtt tcttcattcg 1740
gtttccctcc tcatttttat agagctccat aatacataat tttcaaactg ataaaatgat 1800
ttttcataaa tccattagac ggtgcaaata tatgttttta atgttcttcg tttttaggca 1860
tccctccttt caagataaat aatttataca ctattctatt ggaatcttaa tcattccaat 1920
agaaaaatat gtaatgatta taaataagtc gcttcttatc ataaatatat ttacatattc 1980
atttaatact acatcatgtt aggtatagta aggctatcaa gggtgtctta atttctactt 2040
gtaacaatgt attggcatat tatatattga attgagaaaa ttaaatacag cgataattca 2100
catgaacaag ttcattggta gttatatttt caaattttca aggttgtgct tgtatgtcat 2160
tctatagtta gataagcatt tgaggtagag tccgtccgaa tatatttgta atctgaagaa 2220
ggttcaaaca tatttctata taacgtattc tttttttgta gttcttactt ttgaggggcg 2280
ttacaattca aagatattat ctttaattaa gcttaacatt aataattctt caattgcaac 2340
aaaaaaagca cttttatcta aggtttcatc ttacgtttcg agggcccctc cattttctta 2400
tacaaattat attatacata tcagtaaaat aatgtcaacc cccctttatt cctttttttt 2460
acacagcgga cagtctggac agcaggccct taaggccaat tctcatgttt gacagcttat 2520
catcggcaat agttaccctt attatcaaga taagaaagaa aaggattttt cgctacgctc 2580
aaatccttta aaaaaacaca aaagaccaca ttttttaatg tggtctttat tcttcaacta 2640
aagcacccat tagttcaaca aacgaaaatt ggataaagtg ggatattttt aaaatatata 2700
tttatgttac agtaatattg acttttaaaa aaggattgat tctaatgaag aaagcagaca 2760
agtaagcctc ctaaattcac tttagataaa aatttaggag gcatatcaaa tgaactttaa 2820
taaaattgat ttagacaatt ggaagagaaa agagatattt aatcattatt tgaaccaaca 2880
aacgactttt agtataacca cagaaattga tattagtgtt ttataccgaa acataaaaca 2940
agaaggatat aaattttacc ctgcatttat tttcttagtg acaagggtga taaactcaaa 3000
tacagctttt agaactggtt acaatagcga cggagagtta ggttattggg ataagttaga 3060
gccactttat acaatttttg atggtgtatc taaaacattc tctggtattt ggactcctgt 3120
aaagaatgac ttcaaagagt tttatgattt atacctttct gatgtagaga aatataatgg 3180
ttcggggaaa ttgtttccca aaacacctat acctgaaaat gctttttctc tttctattat 3240
tccatggact tcatttactg ggtttaactt aaatatcaat aataatagta attaccttct 3300
acccattatt acagcaggaa aattcattaa taaaggtaat tcaatatatt taccgctatc 3360
tttacaggta catcattctg tttgtgatgg ttatcatgca ggattgttta tgaactctat 3420
tcaggaattg tcagataggc ctaatgactg gcttttataa tatgagataa tgccgactgt 3480
actttttaca gtcggttttc taatgtcact aacctgcccc gttagttgaa gaaggttttt 3540
atattacagc tccagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca 3600
ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac 3660
ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga 3720
ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc 3780
aacctactac tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgacatgga 3840
tgagcgatga tgatatccgt ttaggctggg cggtgatagc ttctcgttca ggcagtacgc 3900
ctcttttctt ttccagacct gagggaggcg gaaatggtgt gaggttcccg gggaaaagcc 3960
aaataggcga tcgcgggagt gctttatttg aagatcaggc tatcactgcg gtcaatagat 4020
ttcacaatgt gatggctgga cagcctgagg aactctcgaa cccgaatgga aacaaccaga 4080
tatttatgaa tcagcgcggc tcacatggcg ttgtgctggc aaatgcaggt tcatcctctg 4140
tctctatcaa tacggcaaca aaattgcctg atggcaggta tgacaataaa gctggagcgg 4200
gttcatttca agtgaacgat ggtaaactga caggcacgat caatgccagg tctgtagctg 4260
tgctttatcc tgatgatatt gcaaaagcgc ctcatgtttt ccttgagaat tacaaaacag 4320
gtgtaacaca ttctttcaat gatcaactga cgattacctt gcgtgcagat gcgaatacaa 4380
caaaagccgt ttatcaaatc aataatggac cagacgacag gcgtttaagg atggagatca 4440
attcacaatc ggaaaaggag atccaatttg gcaaaacata caccatcatg ttaaaaggaa 4500
cgaacagtga tggtgtaacg aggaccgaga aatacagttt tgttaaaaga gatccagcgt 4560
cggccaaaac catcggctat caaaatccga atcattggag ccaggtaaat gcttatatct 4620
ataaacatga tgggagccga gtaattgaat tgaccggatc ttggcctgga aaaccaatga 4680
ctaaaaatgc agacggaatt tacacgctga cgctgcctgc ggacacggat acaaccaacg 4740
caaaagtgat ttttaataat ggcagcgccc aagtgcccgg tcagaatcag cctggctttg 4800
attacgtgct aaatggttta tataatgact cgggcttaag cggttctctt ccccattgag 4860
ggcaaggcta gacgggactt accgaaagaa accatcaatg atggtttctt ttttgttcat 4920
aaatcagaca aaacttttct cttgcaaaag tttgtgaagt gttgcacaat ataaatgtga 4980
aatacttcac aaacaaaaag acatcaaaga gaaacatacc ctgcaaggat gctgatattg 5040
tctgcatttg cgccggagca aaccaaaaac ctggtgagac acgccttgaa ttagtagaaa 5100
agaacttgaa gattttcaaa ggcatcgtta gtgaagtcat ggcgagcgga tttgacggca 5160
ttttcttagt cggtaacaat cctcgttaaa ggacaaggac ctgagcggaa gtgtatcgta 5220
cagtagacgg agtatactag tatagtctat agtccgtgga attattatat ttatctccga 5280
cgatattctc atcagtgaaa tccagctgga gttctttagc aaattttttt attagctgaa 5340
cttagtatta gtggggccgc tgataattac taatactagg agaagttaat aaatacgtaa 5400
ccaacatgat taacaattat tagaggtcat cgttcaaaat ggtatgcgtt ttgacacatc 5460
cactatatat ccgtgtcgtt ctgtccactc ctgaatccca ttccagaaat tctctagcga 5520
ttccagaagt ttctcagagt cggaaagttg accagacatt acgaactggc acagatggtc 5580
ataacctgaa ggaagatctg attgcttaac tgcttcagtt aagaccgaag cgctcgtcgt 5640
ataacagatg cgatgatgca gaccaatcaa catggcacct gccattgcta cctgtacagt 5700
caaggatggt agaaatgttg tcggtccttg cacacgaata ttacgccatt tgcctgcata 5760
ttcaaacagc tcttctacga taagggcaca aatcgcatcg tggaacgttt gggcttctac 5820
cgatttagca gtttgataca ctttctctaa gtatccacct gaatcataaa tcggcaaaat 5880
agagaaaaat tgaccatgtg taagcggcca atctgattcc acctgagatg cataatctag 5940
tagaatctct tcgctatcaa aattcacttc caccttccac tcaccggttg tccattcatg 6000
gctgaactct gcttcctctg ttgacatgac acacatcatc tcaatatccg aatagggccc 6060
atcagtctga cgaccaagag agccataaac accaatagcc ttaacatcat ccccatattt 6120
atccaatatt cgttccttaa tttcatgaac aatcttcatt ctttcttctc tagtcattat 6180
tattggtcca ttcactattc tcattccctt ttcagataat tttagatttg cttttctaaa 6240
taagaatatt tggagagcac cgttcttatt cagctattaa taactcgtct tcctaagcat 6300
catggtctca cttttccact ttttgtcttg tccactaaaa cccttgattt ttcatctgaa 6360
taaatgctac tattaggaca cataatatta aaagaaaccc ccatctattt agttatttgt 6420
ttagtcactt ataactttaa cagatggggt ttttctgtgc aaccaatttt aagggttttc 6480
aatactttaa aacacataca taccaacact tcaacgcacc tttcagcaac taaaataaaa 6540
atgacgttat ttctatatgt atcaagataa gaaagaacaa gttcaaaacc atcaaaaaaa 6600
gacacctttt caggtgcttt ttttatttta taaactcatt ccctgatctc cccatactcc 6660
tccaatccaa agctatttag aaagattact atatcctcaa acaggcggta accggcctct 6720
tcatcgggaa tgcgcgcgac cttcagcatc gccggcatgt ccccctggcg gacgggaagt 6780
atccagctcg aggtcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 6840
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 6900
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 6960
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 7020
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 7080
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 7140
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 7200
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 7260
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 7320
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 7380
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 7440
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 7500
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 7560
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 7620
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 7680
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 7740
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 7800
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 7860
atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 7920
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 7980
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 8040
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 8100
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 8160
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa 8220
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 8280
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 8340
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 8400
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 8460
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 8520
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 8580
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcaag 8640
aatt 8644
<210>4
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p920mrgaF2
<400>4
ctgaggccaa ttaggccaag tttattcttg acattaggga acatgcatga tataataggt 60
aaagtaaaca gatcacaagg aggacgttat c 91
<210>5
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物MBmrgaR2
<400>5
tgaaggatcc acgcgtccag cagacagaaa gcag 34
<210>6
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子P920
<400>6
aagtttattc ttgacattag ggaacatgca tgatataata ggtaaagta 49
<210>7
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子920与mrgA的PCR产物
<400>7
ctgaggcctt aagggccaag tttattcttg acattaggga acatgcatga tataataggt 60
aaagtaaaca gatcacaagg aggacgttat cttatgaaaa ctgaaaacgc aaaaacaaat 120
caaacattag ttgagaattc actgaacaca caattatcaa actggtttct tttatactct 180
aagctccacc gtttccattg gtatgtgaaa gggcctcatt tctttacatt gcacgagaaa 240
tttgaagaac tttatgacca tgcggctgaa acagtggata ccatcgctga gcgcctgctg 300
gcgattggcg gacagcctgt tgccacagtg aaagaataca ctgagcatgc atctatcaca 360
gacggcggaa acgaaacatc agcatcagaa atggtacaag cattggtaaa cgactacaaa 420
caaatcagca gcgaatctaa attcgtgatc ggcctggctg aagaaaatca agacaatgcg 480
acagcggact tgtttgtcgg attaattgaa gaagttgaaa aacaagtgtg gatgctttcc 540
tcttatttag ggtaacaaaa aagctgaacc ttaatcgggt tcagcttttt gttttttctt 600
agcttgaact gctttctgtc tgcttgacgc gtggatcctt ca 642
<210>8
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p740mrgaF2
<400>8
ctgaggccaa ttaggcccgg aagtttgttg acacagctcc aggatacaaa tataatgggt 60
cgactaaaca gatcacaagg aggacgttat c 91
<210>9
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子P740
<400>9
cggaagtttg ttgacacagc tccaggatac aaatataatg ggtcgagta 49
<210>10
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子740与mrgA的PCR产物
<400>10
ctgaggcctt aagggcccgg aagtttgttg acacagctcc aggatacaaa tataatgggt 60
cgagtaaaca gatcacaagg aggacgttat cttatgaaaa ctgaaaacgc aaaaacaaat 120
caaacattag ttgagaattc actgaacaca caattatcaa actggtttct tttatactct 180
aagctccacc gtttccattg gtatgtgaaa gggcctcatt tctttacatt gcacgagaaa 240
tttgaagaac tttatgacca tgcggctgaa acagtggata ccatcgctga gcgcctgctg 300
gcgattggcg gacagcctgt tgccacagtg aaagaataca ctgagcatgc atctatcaca 360
gacggcggaa acgaaacatc agcatcagaa atggtacaag cattggtaaa cgactacaaa 420
caaatcagca gcgaatctaa attcgtgatc ggcctggctg aagaaaatca agacaatgcg 480
acagcggact tgtttgtcgg attaattgaa gaagttgaaa aacaagtgtg gatgctttcc 540
tcttatttag ggtaacaaaa aagctgaacc ttaatcgggt tcagcttttt gttttttctt 600
agcttgaact gctttctgtc tgcttgacgc gtggatcctt ca 642
<210>11
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p726mrgaF2
<400>11
ctgaggccaa ttaggccgag gtgagatttg acactagtag gctacgggac tataatgcgg 60
gaagtaaaca ga tcacaagg aggacgttat c 91
<210>12
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子P726
<400>12
gaggtgagat ttgacactag taggctacgg gactataatg cgggaagta 49
<210>13
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子P726与mrgA的PCR产物
<400>13
ctgaggcctt aagggccgag gtgagatttg acactagtag gctacgggac tataatgcgg 60
gaagtaaaca gatcacaagg aggacgttat cttatgaaaa ctgaaaacgc aaaaacaaat 120
caaacattag ttgagaattc actgaacaca caattatcaa actggtttct tttatactct 180
aagctccacc gtttccattg gtatgtgaaa gggcctcatt tctttacatt gcacgagaaa 240
tttgaagaac tttatgacca tgcggctgaa acagtggata ccatcgctga gcgcctgctg 300
gcgattggcg gacagcctgt tgccacagtg aaagaataca ctgagcatgc atctatcaca 360
gacggcggaa acgaaacatc agcatcagaa atggtacaag cattggtaaa cgactacaaa 420
caaatcagca gcgaatctaa attcgtgatc ggcctggctg aagaaaatca agacaatgcg 480
acagcggact tgtttgtcgg attaattgaa gaagttgaaa aacaagtgtg gatgctttcc 540
tcttatttag ggtaacaaaa aagctgaacc ttaatcgggt tcagcttttt gttttttctt 600
agcttgaact gctttctgtc tgcttgacgc gtggatcctt ca 642
<210>14
<211>88
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AN162
<400>14
agactgtccg cggtgtaaaa aataggaata aaggggggtt gacattattt tactgatatg 60
tataatataa tttgtataag aaaatgag 88
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AN163c
<400>15
gcatacacgc gttgtcacac ctgatgccga cc 32
<210>16
<211>8152
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pAN213ban
<400>16
ccgcggtgta aaaaatagga ataaaggggg gttgacatta ttttactgat atgtataata 60
taatttgtat aagaaaatga gagggagagg aaacatgatt caaaaacgaa agcggacagt 120
ttcgttcaga cttgtgctta tgtgcacgct gttatttgtc agtttgccga ttacaaaaac 180
atcagccgta aatggcacgc tgatgcagta ttttgaatgg tatacgccga acgacggcca 240
gcattggaaa cgattgcaga atgatgcgga acatttatcg gatatcggaa tcactgccgt 300
ctggattcct cccgcataca aaggattgag ccaatccgat aacggatacg gaccttatga 360
tttgtatgat ttaggagaat tccagcaaaa agggacggtc agaacgaaat acggcacaaa 420
atcagagctt caagatgcga tcggctcact gcattcccgg aacgtccaag tatacggaga 480
tgtggttttg aatcataagg ctggtgctga tgcaacagaa gatgtaactg ccgtcgaagt 540
caatccggcc aatagaaatc aggaaacttc ggaggaatat caaatcaaag cgtggacgga 600
ttttcgtttt ccgggccgtg gaaacacgta cagtgatttt aaatggcatt ggtatcattt 660
cgacggagcg gactgggatg aatcccggaa gatcagccgc atctttaagt ttcgtgggga 720
aggaaaagcg tgggattggg aagtatcaag tgaaaacggc aactatgact atttaatgta 780
tgctgatgtt gactacgacc accctgatgt cgtggcagag acaaaaaaat ggggtatctg 840
gtatgcgaat gaactgtcat tagacggctt ccgtattgat gccgccaaac atattaaatt 900
ttcatttctg cgtgattggg ttcaggcggt cagacaggcg acgggaaaag aaatgtttac 960
ggttgcggag tattggcaga ataatgccgg gaaactcgaa aactacttga ataaaacaag 1020
ctttaatcaa tccgtgtttg atgttccgct tcatttcaat ttacaggcgg cttcctcaca 1080
aggaggcgga tatgatatga ggcgtttgct ggacggtacc gttgtgtcca ggcatccgga 1140
aaaggcggtt acatttgttg aaaatcatga cacacagccg ggacagtcat tggaatcgac 1200
agtccaaact tggtttaaac cgcttgcata cgcctttatt ttgacaagag aatccggtta 1260
tcctcaggtg ttctatgggg atatgtacgg gacaaaaggg acatcgccaa aggaaattcc 1320
ctcactgaaa gataatatag agccgatttt aaaagcgcgt aaggagtacg catacgggcc 1380
ccagcacgat tatattgacc acccggatgt gatcggatgg acgagggaag gtgacagctc 1440
cgccgccaaa tcaggtttgg ccgctttaat cacggacgga cccggcggat caaagcggat 1500
gtatgccggc ctgaaaaatg ccggcgagac atggtatgac ataacgggca accgttcaga 1560
tactgtaaaa atcggatctg acggctgggg agagtttcat gtaaacgatg ggtccgtctc 1620
catttatgtt cagaaataag gtaataaaaa aacacctcca agctgagtgc gggtatcagc 1680
ttggaggtgc gtttattttt tcagccgtat gacaaggtcg gcatcaggtg tgacaacgcg 1740
tgatccagac cagttccctg agcttccgtc agtcggatcc cattgcggaa aatagtcata 1800
ggcatcctgg aattcaatgt tgcgaataat gacgttatca ctcttgattt ggaagtttcc 1860
tcccacgact ttagcgttag tccctgaacc gacgatcgtc gtgtttgcag ggatatccac 1920
catgacccgt gctttttggt ttttctgaga gcgtgctctc gcttcttctt gtgttcccga 1980
cggctctttt ttgccccatg tgctaggatc ataggctttc aaatatttgt ccaaatcata 2040
ctccggatct ttatagtcat ttaggccaag cggcttcaga ttgtcatcca cgttcatgtc 2100
aatcgttccc ttgatataaa tgatttttgg cgttgtgttc gtttccttcc ctaatgccga 2160
gacaagctgg tttctgttgc tgacggtata cacatttgag gaggatgctt ttgatccgcc 2220
tgtcgtgccg gtcgagtacg cgccccagcc atcattggat cccaacgtct ggtggcctaa 2280
atcagctgcg ttcgcgccag ctggagtcaa tcctaaaaac aaagccgtag ctaacatcaa 2340
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 2400
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Claims (26)
1.源自亲代细胞的后代细胞,其中
a)所述后代细胞包含至少一个基因,该基因编码MrgA蛋白或其功能同源物和/或与所述编码基因可操作连接的DNA区段,其中所述基因和/或DNA区段相对于亲代细胞***作;
b)所述后代细胞包含编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的两个或多个拷贝;或
c)所述后代细胞相对于亲代细胞被突变;
由此所述后代细胞产生比亲代细胞更大量的MrgA蛋白或其功能同源物。
2.权利要求1的细胞,其产生比亲代细胞更大量的目标蛋白;优选所述目标蛋白是胞内蛋白质或胞外蛋白质。
3.权利要求1或2的细胞,其为细菌细胞,优选原核细胞,更优选革兰氏阳性细胞,并最优选属于芽孢杆菌属。
4.权利要求3的细胞,其属于选自如下的菌种:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
5.权利要求2-4中任一项的细胞,其中所述目标蛋白是同源或异源的。
6.权利要求2-5中任一项的细胞,其中所述蛋白是蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半乳糖苷酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡糖异构酶、蛋白二硫化物异构酶、CGT′ase(环糊精葡萄糖酸转移酶)、肌醇六磷酸酶、葡糖氧化酶、葡糖基转移酶、乳糖酶、胆红素氧化酶、木聚糖酶、抗原微生物或原生动物蛋白质、细菌蛋白毒素、微生物表面蛋白或病毒蛋白。
7.权利要求1-6中任一项的细胞,其中MrgA蛋白或其功能同源物包含氨基酸序列,其与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70%同一性,优选与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%或甚至99%同一性。
8.权利要求1-7中任一项的细胞,其中MrgA蛋白或其功能同源物包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
9.权利要求1-8中任一项的细胞,其包含编码MrgA蛋白或其功能同源物的多核苷酸的至少一个外源拷贝,所述MrgA蛋白或其功能同源物包含氨基酸序列,该序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70%同一性,优选与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%或甚至99%同一性。
10.权利要求1-9中任一项的细胞,其包含编码MrgA蛋白或其功能同源物的多核苷酸的至少一个外源拷贝,所述MrgA蛋白或其功能同源物包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的细胞,其包含多核苷酸的至少一个外源拷贝,所述多核苷酸:
a)包含多核苷酸序列,该序列与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少70%同一性;优选与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%或甚至99%同一性;或
b)在中严紧性条件下,优选在中-高严紧性条件下,并更优选在高严紧性条件下,与SEQ ID NO:1中所示的序列杂交。
12.权利要求1-11中任一项的细胞,其中编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的至少一个外源拷贝由一个或多个异源和/或人工启动子转录。
13.权利要求1-12中任一项的细胞,其中编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的至少一个外源拷贝被整合入细胞的基因组。
14.权利要求1-12中任一项的细胞,其中编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因的至少一个外源拷贝存在于染色体外的构建体,优选质粒。
15.用于增强目标蛋白分泌的方法,该方法包括在任一项前述权利要求的细胞中表达所述蛋白。
16.产生如权利要求1-14中任一项限定的细胞的方法,用于产生目标蛋白,所述方法包括操作细胞以增加MrgA蛋白或其功能同源物表达的步骤。
17.权利要求16的方法,其中所述细胞比非操作的亲代细胞产生更大量的目标蛋白;优选所述目标蛋白为胞内蛋白质或胞外蛋白质。
18.权利要求16或17的方法,其中所述方法包含如下步骤:
a)从亲代细胞中鉴定编码MrgA蛋白或其功能同源物的基因;和
b)操作所述细胞以增加在步骤(a)中鉴定的基因的表达,由此操作的后代细胞比未操作的细胞表达更大量的MrgA蛋白或其功能同源物。
19.权利要求16-18中任一项的方法,其中的细胞是细菌细胞,优选所述细胞是原核细胞,更优选革兰氏阳性细胞,并最优选所述细胞属于芽孢杆菌属。
20.权利要求19的方法,其中所述细胞属于选自以下的菌种:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
21.权利要求16-20中任一项的方法,其中所述目标蛋白是蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半乳糖苷酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡糖异构酶、蛋白二硫化物异构酶、CGT′ase(环糊精葡萄糖酸转移酶)、肌醇六磷酸酶、葡糖氧化酶、葡糖基转移酶、乳糖酶、胆红素氧化酶、木聚糖酶、抗原微生物或原生动物蛋白质、细菌蛋白毒素、微生物表面蛋白或病毒蛋白。
22.产生目标蛋白的方法,其包括如下步骤:
a)培养如权利要求2-14中任一项限定的细胞;和
b)回收蛋白质。
23.权利要求22的方法,其中所述细胞是细菌细胞,优选原核细胞,更优选革兰氏阳性细胞,并最优选属于芽孢杆菌属。
24.权利要求23的方法,其中所述细胞属于选自如下的菌种:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
25.权利要求22-24中任一项的方法,其中所述目标蛋白是蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半乳糖苷酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡糖异构酶、蛋白二硫化物异构酶、CGT′ase(环糊精葡萄糖酸转移酶)、肌醇六磷酸酶、葡糖氧化酶、葡糖基转移酶、乳糖酶、胆红素氧化酶、木聚糖酶、抗原微生物或原生动物蛋白质、细菌蛋白毒素、微生物表面蛋白或病毒蛋白。
26.MrgA-蛋白或其功能同源物在用于通过操作和突变细胞以表达比未操作或未突变的细胞更大量的MrgA蛋白或其功能同源物来增强蛋白产生的方法中的用途。
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